JPH11501047A

JPH11501047A - カゼインホスホペプチド、これを含むカゼイン及びこれらの製造方法

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Publication number: JPH11501047A
Application number: JP8528299A
Authority: JP
Inventors: ハン、サン・キー; シン、ユー・チョル
Original assignee: ハン、サン・キー
Priority date: 1995-03-23
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 1999-01-26
Anticipated expiration: 2016-03-22
Also published as: CN1182435A; AU5124696A; CN1136228C; KR0140248B1; CA2216250A1; KR960034216A; AU714587B2; US5834427A; EP0815130A1; DE69627839D1; EP0815130B1; DE69627839T2; JP3128244B2; DK0815130T3; CA2216250C; WO1996029340A1

Abstract

(57)【要約】本発明は新規のアミノ酸配列を有するホスホペプチド（ＣＰＰ）及びそれを含むカゼインに関し、これは、通常のＣＰＰのＮ末端から２５番目のＡｒｇがＣｙｓに置換されており、ジスルフィド結合によって二量体を形成するＣＰＰをいう。対応するＤＮＡ配列では、シトシンはチミンに置換され、アルギニン（Ａｒｇ）からシステイン（Ｃｙｓ）へのアミノ酸置換が生じる。ＣＣＰ又はそれを含むカゼインは、動物でのミネラルの可溶化能とその吸収能を改良する。ＣＰＰ又はそれを含むベータカゼインＨは、食料、飲料、医薬、化粧品に添加され、動物におけるミネラル吸収を促進する有効量で与えられる。ベータカゼインＨ又は本発明のＣＰＰを含む経口組成物及び医薬的に許容可能なキャリヤーは象牙質の過敏症を減少させ又は緩和することができる。

Description

【発明の詳細な説明】カゼインホスホペプチド、これを含むカゼイン及びこれらの製造方法発明の分野本発明は、一般に新規なアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチド、これを含むベータカゼインＨ及びこれらの製造方法に関する。特に、本発明は、動物の消化管中でミネラルを可溶化して、その吸収を促進する新規なアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチドに関する。従来技術の説明肥満は、現代人の健康を脅かす最も重大な危険のひとつであり、ビタミン及びミネラルが不足している高カロリー食品や飲料によるところが大きい。このようなバランスの悪い食品は成人の病気、例えば骨粗しょう症の原因となることが知られている。バランスの取れた食品を製造するために、多くの研究者が１以上の不足ミネラルを食品へ添加するように試みてきた。しかしながら、このような試みの殆どは、１つのミネラルの添加が動物中での他のミネラルの吸収阻害又は減少を引き起こすため、不成功となっていた。従って、食品へミネラルを添加することなく、動物でのミネラル吸収を増やすことが望まれていた。一般に、ミネラルは、動物へ吸収されるために可溶性状態を維持しなければならない。しかしながら、動物において成分が小腸を経て移動する場合、そのｐＨが中性からアルカリ状態へシフトする。小腸でのｐＨの変化によって、ミネラルの大部分が不溶性となり、沈殿を引き起こす。カルシウム吸収に関しては、カルシウムが小腸を経て移動するとき、カルシウムの可溶性部分が、その中のｐＨの上昇に反比例して減少する。カゼインは牛やヒトの乳中に含まれるある種の蛋白質であり、α、β及びγ型が報告されている。特に、β−カゼインはＡ¹，Ａ²，Ａ³，Ｂ，Ｃ及びＤ変異体を有し、その一次構造は既に報告されている（W.N.Eigalら、Nomenclature of P roteins of Cow's Milk(5th Revision)、J.Dairy Sci.,vol.67,No.8,pp1607-8(1 984)。更に、カゼインホスホペプチド（以下、“ＣＰＰ”と表す）は、乳中に豊富なカゼインに含まれている。最近、ＣＰＰは動物でのミネラル吸収率を増加し得る重要な物質と認識されている。ＣＰＰ又はこれを含むカゼインが、ミネラル例えばカルシウム及び鉄を水溶液中に可溶化する潜在的な能力を有しているので、動物におけるミネラルの栄養失調を治療し又は緩和するために、ＣＰＰの使用によるバランスの取れた食物若しくは飲料を製造する多くの試みが成された。 βカゼインのＡ¹、Ａ²、Ａ³、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの変異体に関係なく、それらの構造及びそれらから生成されるＣＰＰのアミノ酸構造には、同一のものが保持されており、その配列を以下に示す：ここで、Ｓｅｒ（ｐ）はリン酸化されたセリンを表す。上記に示されるように、通常のＣＰＰは２５アミノ酸を有し；３つの連続したホスホセリンとその後に続く２つのグルタミン酸残基が強い負電荷領域を形成し、これにより、カルシウムに対する活性部位がもたらされる(Naito、“The Mech anism of Enhancement in Instestinal Calcium Absorption with Phosphopepti des Derived during Casein Digestion”、J.of Japanese Nutr.and Food,Vol.3 9,No.6,pp.433-439(1986)。Naitoは、ＣＰＰは動物の小腸におけるＦｅ吸収とＣａ吸収とを促進すると示唆している。ＣＰＰを含むカゼインがカルシウムと共に動物に与えられると、可溶性カルシウムが、カルシウムのみの供給と比較して、動物の小腸において顕著に増加することが知られている。カルシウム吸収では、上部小腸管中に能動輸送が優勢になる一方で、受動輸送が密度勾配に基づいて下部小腸管中に優勢となる。また、ビタミンＤ及びラクトースは、動物でのカルシウム吸収を更に促進することが示唆されている。カルシウムの吸収率が動物の小腸上部、即ち、十二指腸で一番高いが、成分の滞留時間が短時間であるので、その中でのカルシウム全吸収量は比較的低い。これに対して、食物の滞留時間が長いため、小腸下部にあるの回腸は、大部分のカルシウムが吸収される重要な部位である。事実、ラットでは、回腸で６２又は８８％のカルシウムが吸収され、回腸を切除した人体のカルシウムの吸収は顕著に減少する。従って、ＣＣＰがカルシウムの吸収において重要な役割をしていることが理解される（Satoら、“Casein phosphopeputide contributing to an absorption of Ca in dairy product”、Chemistry and Biology，Vol.23 ,No.7,p.418(1985)。 Satoらは、カゼイン中のリン酸残基の役割を確かめるために、一連の実験を行ったと、更に報告した。実験では、４つの商品ラット群に、リン酸化カゼイン、脱リン酸化カゼイン、グルテン及びゼラチンをそれぞれ含む食物が与えられた。その結果、リン酸化カゼインを与えたラット群は、動物中の小腸管内において、最も大量の可溶性カルシウムの量と、最も高いカルシウム吸収率を示した。また、トリプシン消化によって牛乳からＣＰＰを生成することができる（Satoら、“ The Necessity for the Phosphate Portion of Casein Molecule to Enhance Ca Absorption from the Small Intestine,”Agric.Bilo.Chem.,Vol.47,No.10,pp2 415-7(1983)。乳からカゼインを抽出するため、Gordonは、乳から脂肪を除去し、得られた物にｐＨが４．６になるまで塩酸を添加し、沈殿したカゼインを遠心分離して、得られた物を脱水及び凍結乾燥に付すことを含む方法を開示した(W.G.Gordonら、F undamentals of Diary Chemistry,2th ed.,AVI Publishing Co.(1974))。また、 Spe11acyは、Streptococcus lactis（ストレプトコッカス・ラクティス）から生成された乳酸を添加することによって、乳からのカゼインを沈殿する方法を提案した(J.R.Spellacy,Casein,Dried and Condensed Whey,Lithotype Process Co.( 1953))。Foxは、乳からのカゼインを沈殿させるためにレンネットを添加する技術を教示した(K.K.Fox,Byproducts from Milk,2thed.,AVI Publishing Co.,(1 970))。上記のようにして得られたカゼインから、通常のＣＰＰの生成するための種々の方法が報告されている。Petersonは、カゼインをトリプシン加水分解に付し、加水分解物のｐＨを４．７に調節し、未反応のカゼインを除去し、加水分解物の上澄みにＢａＣｌ₂とエタノールを添加して、ＣＰＰを回収することを含む方法を教示した(R.F.Petersonら、J.Amer.Chem.Soc.,Vol.80,p.95(1958))。 Naitoは、消化酵素によってカゼインを消化し、セファデックスＧ−２５のゲル−濾過によって粗ＣＰＰを消化して、イオン交換樹脂に粗混合物を通すことによりＣＰＰを精製することを含むＣＰＰの製造方法を示した(Naitoら、Agric.Bi ol.Chem.,Nol.38.p1543(1974))。また、米国特許第4,361,587号は、カゼインを酵素的加水分解に付し、得られた加水分解物を回収し、該加水分解物を一次膜限外濾過に付し、固着物を回収し、その中に含まれているホスホペプチドを離解し、離解されたホスホペプチドを含む固着物を二次膜限外濾過に付すことを含むホスホペプチド製造方法を開示している。日本特許公開昭59-159703号は、カゼインをトリプシン加水分解に付して、ＣＰＰを生成し、得られた加水分解物に二価の第２鉄イオンを加えてＣＰＰを沈澱及び回収する方法を開示している。更に、韓国特許公開第93-10190号は、Streptococcus faccalisvar（ストレプトコッカス・ファカリス・バール）溶解物から得られた蛋白質分解酵素の使用を説明している。カゼイン又はＣＣＰは、種々の目的に広く用いられている。そのミネラル吸収効果を用いることによって、日本特許公開平5-336894号は、ＣＰＰに富んだ健康食品を開示している。日本特許公開平5-176712号は、ＣＰＰとアルカリホスファターゼを含む食品をも教示している。更に、日本特許公開平4-299942号は、ＣＰＰを含む鳥の改良飼料を示している。ＰＣＴ公開ＷＯ94/00146号及び米国特許第5,015,628号は共に、歯石及び歯過敏症を予防し又は緩和するためのＣＰＰを含む経口組成物を示唆している。更に、日本特許公開平1-269499号は、ＣＰＰを含む皮膚又はヘアケア製品の製造方法を教示している。ここで挙げられた全ての文献の開示を援用して本文の一部とする。本発明の要約本発明者らは、ＣＰＰと関連して小腸のミネラル吸収を促進するように努力して、ついに、通常のＣＰＰのものとは異なる構造及びアミノ酸配列を有する新規のＣＰＰを見出した。本発明のＣＰＰの新規なアミノ酸配列は、配列番号１と本文中で呼ばれ、これは、２８アミノ酸を有し、ここで、通常のＣＰＰのＮ末端から２５番目のＡｒｇがＣｙｓに置換されている。対応するＤＮＡ配列では、シトシンがチミンと置換して、アルギニン（Ａｒｇ）からシステイン（Ｃｙｓ）へのアミノ酸置換が生じている。本発明の他の態様では、本発明者らにより「ベータカゼインＨ」と名付けられた即席の(instant)ＣＰＰを含む新規なカゼインを提供することである。したがって、本発明の目的は、配列番号１のアミノ酸配列を有する新規なＣＰＰを提供することである。本発明の他の目的は、配列番号１のアミノ酸配列を有する本発明のＣＰＰを含む新規なベータカゼインＨを提供することである。本発明の更に他の目的は、ＣＰＰ及びベータカゼインのそれぞれの製造方法を提供することである。本発明のまた他の目的は、本発明のＣＰＰまたはベータカゼインを含む種々の有用な目的のための組成物を提供することである。図面の簡単な説明本発明の他の目的、特徴及び利益は、下記の添付図面と組み合わせた好適実施形態の下記の説明から明らかとなるであろう：図１は、本発明によるベータカゼインＨについての電気泳動の写真である。図２（a）は、陰イオン交換カラムを通した後のカゼインの、ベータカゼインピークを示すクロマトグラムである；図２（ｂ）は、第一陽イオン交換カラムを通した後の図２（ａ）のベータカゼインの特異的なベータカゼインＨピークを示すクロマトグラムである；図２（ｃ）は、第二陽イオン交換カラムを通した後の図２（ｂ）のベータカゼインの特異的なベータカゼインＨピークを示すクロマトグラムである；図３は、本発明によるＣＰＰの特異的ピークを示すＨＰＬＣクロマトグラムである；そして、図４は、本発明によるＣＰＰのＤＮＡの一部を示すダイアフラムである。好適実施態様の詳細な説明蛋白質とミネラルは、一般に、互いに結合をする傾向があり、このようなカップリングの型及び強さは、それらの高次構造、即ち、２次、３次構造に大きく影響を受けている(Naito、“The Mechanism of Enhancement in Intestinal Calsi um Absorption with Phosphopeptides Derived during Casein Digestion,”J.o f Japanese Nutr.and Food,Vol.39,No.6 p433,436,(1986))。アミノ酸配列及び一次構造の違いにより、本発明のＣＰＰ及びこれを含むベータカゼインは、小腸管においてカルシウムを含むミネラルの改良された可溶化能を示し、これにより、動物でのミネラル吸収の促進が自然と必然的に起こる。本発明によれば、配列番号１の新規なアミノ酸配列を有する新規なＣＰＰが提供される。この配列では、通常のＣＰＰの２５番目のＡｒｇがＣｙｓに置換されている。更に、新規ＣＰＰは、２５番目のシステインの後にイソロイシン（Ｉｌｅ）、アスパラギン（Ａｓｎ）及びリジン（Ｌｙｓ）の３アミノ酸を有し、従って、本発明のＣＰＰは、２８アミノ酸を有している。Ｃｙｓによって、新しいＣＰＰはジスルフィド結合により互いに二量体を形成する傾向にある。既に示唆したように、３つの一連のホスホセリン（１７番目から１９番目）と、２つのグルタミン酸残基（２０番目と２１番目）は、強い負電荷領域を形成し、これは、カルシウムについての活性部位を提供する（Naito、前述）。新規ＣＰＰの二量体が３つのホスホセリンと２つのグルタミン酸の上述の活性領域の安定性を保守し、これにより、本発明のＣＰＰはミネラルの改良された可溶化能を有していることが理解される。本発明のＣＰＰが２８アミノ酸残基を有している一方で、特にＮ末端から３番目のＬｅｕ及び４番目のＧｌｕの間と、６番目のＬｅｕ及び７番目のＡｓｎの間で、蛋白質分解性の加水分解があると疑われている。従って、２種のフラグメントが動物の小腸内で生成され得、即ち、このうちの１つはＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕを除いた２５残基であり、他方はＮ末端からＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ −Ｇｌｕ−Ｌｅｕ残基が除去された２２残基を有している。しかしながら、加水分解により生成されたどの種のフラグメントであっても、それらが活性部位（１７番目から２１番目の残基）を有している間は、小腸でミネラルを可溶化するＣＰＰ機能を有している。従って、配列番号１のペプチド配列における活性部位（１７番目から２１番目）及び２５番目のＣｙｓを含む如何なるフラグメントも、本発明の範囲内に入るべきであることは明らかである。本発明では、ミネラルに対する活性部位を有する本発明のＣＰＰを含むベータカゼインＨが提供され、ベータカゼインＨはまた、そのため、動物において小腸でミネラルを可溶化する。本発明のＣＰＰ又はベータカゼインＨは、例えば、そのアルカリ金属、アルカリ土類金属又は遷移金属塩の形態で用いられ得ることに注意すべきである。典型例は、ナトリウム、カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸フッ化カルシウム、第２鉄、亜鉛、カリウム及びマグネシウム塩である。本発明の他の態様では、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＰＰを含むベータカゼインＨの製造方法を提供することであり、この方法は、ベータカゼインＨを含む乳を選択し、この乳に酸又はレンネットを添加して沈殿させ、そして、沈殿したベータカゼインＨを回収することを含む。この方法では、ベータカゼインＨを含む乳の選択は、図１に示される特徴的なバンドを示す電気泳動によって実施される。好ましく乳に添加される酸の代表例には、塩酸及び乳酸が含まれる。クロマトグラフィによって、沈殿したベータカゼインＨを回収することができる。陰イオン交換クロマトグラフィ、それから陽イオン交換クロマトグラフィを連続して行うことが好ましい。本発明の更に他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチドの製造方法を提供することであり、この方法は、ベータカゼインＨを選択し、ベータカゼインＨに１以上のプロテアーゼを添加することによる加水分解に付し、１以上の無機イオンを加水分解物に添加してペプチドを沈殿させ、そして、沈殿したカゼインホスホペプチドを回収することを含む。ベータカゼインＨを、電気泳動の結果である図１に示されるような独特なバンドによって同定することができる。上記の方法では、種々のプロテアーゼを用いることができ、この典型例には、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、プロナーゼ及びテルモリジン(thermolysin)が含まれる。プロテアーゼは、好ましくは、カゼインの０．００１重量％から２重量％の範囲の量で混合される。無機イオンは、Ｆｅ、Ｃａ、Ｂａ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎ及びＣｏからなる群より選択される。とりわけ第２鉄イオンが、ＦｅＣｌ₃を供給源として用いられることが好ましい。無機イオンの濃度が上昇すると、沈殿物の量が増加する；しかしながら、ＣＰＰの純度は悪化するかもしれない。従って、無機イオンの好ましい濃度は、５から５０ｍＭの範囲である。エタノールを無機イオンと共に添加した場合には、ＣＰＰの沈殿が効率よく行われる。無機イオンの添加の代わりに、加水分解物をＨＰＬＣ又はゲル濾過クロマトグラフィのようなクロマトグラフィに付すことができる。これらに加えて、本発明によるＣＰＰは、配列番号１のアミノ酸配列を参照して化学的に合成することにより生成することができる。更に、配列番号１の遺伝情報を有する微生物を、従来のトランスフォーメーション方法によって作製し、創製ＣＰＰを生成させることができる。その上、牛以外の動物、例えばヒツジ及びヤギに、配列番号１の遺伝情報を導入してトランスジェニック動物を作製することができる。本目的のＣＰＰ又はベータカゼインＨがベータカゼインＨを含む乳から生成されるので、ベータカゼインＨを大量に含む乳を生成する必要がある。この目的のために、ベータカゼインＨを含む乳の生成方法が提供され、この方法は、ベータカゼインＨを含む乳を生成する牛個体を選択し、この牛を、多量の乳を分泌する他の牛と交配させてＦ１子孫を得て、このＦ１子孫からベータカゼインＨを含む乳を生成する雌牛を選択し、この雌牛からベータカゼインＨを含む乳を抽出することを含む。ベータカゼインＨの牛個体の選択のために、牛から抽出されたＤＮＡを含む物質例えば、血液、組織及び精液をＤＮＡについて解析し、本文中で配列番号１と呼ばれる配列と比較する。前述したように、電気泳動を乳について行って、図１に示されるような独特のバンドを見つけることもできる。ベータカゼインＨについて選択された牛は、それから多くの乳を生成する他の牛種、例えばホルスタイン種と交配される。これから得られたある子孫（Ｆ１）が、所望されるベータカゼインＨを含む乳を生成するベータカゼインＨの遺伝情報を有することが分かった。従って、選択された個々の改良牛は、高い生産率でベータカゼインＨを含む乳を生成し、これは、本発明のベータカゼインＨの大量生成に最も好適である。従って、本発明は、ＣＰＰ又はベータカゼインＨと、食用キャリヤーとを含む健康食品若しくは飲料用の組成物を提供する。この組成物は、更に、ミネラル吸収を増進するためにビタミンＤ及びラクトースを含むことができる。この組成物は、動物にミネラルを供給するために、好ましくはミネラル、例えばイオン及びカルシウムを含み得る。組成物の例には、乳、乳児用及び患者用粉乳、ヨーグルト（液状、クリーム状又は凍結型）、チーズ、離乳食、菓子、製パン、アイスクリーム、豆腐、キャンディ、氷菓類、油脂と蜂蜜の菓子(oil-and-honeypastry) 、チョコレート、カラメル、天然若しくは人工ジュース、かまぼこ、機能性飲料（等張スポーツ飲料）、粉末茶、マヨネーズ、ドレッシング等が含まれる。特に、本発明によるＣＰＰ又はベータカゼインＨは、それに対してアレルギーを有する乳児若しくは成人用のラクトースを含む食料品に添加することが好ましい。本発明の更に他の態様では、動物でのミネラル栄養失調に起因した疾患を予防、治療又は緩和するために有効な量の配列番号１のアミノ酸配列を有するベータカゼインＨ若しくはＣＰＰと、医薬的に許容可能なキャリヤーとを含む医薬組成物が提供される。ミネラル栄養失調に起因する疾患例えば、骨粗しょう症又は貧血は、上記医薬組成物を経口投与することによって治療又は緩和できる。医薬組成物中のＣＰＰ又はベータカゼインＨは、一日当たり０．１ｇから１００ｇの量で投与され得る。組成物は、好ましくはミネラル例えば鉄又はカルシウムを含み得る。本発明は更に、本発明のＣＰＰ又はベータカゼインＨと医薬的に許容可能なキャリヤーとを含む経口組成物を提供する。経口組成物は、カゼイン若しくはＣＰＰの水性、水性−アルコール若しくはアルコール溶液又は分散物を、マウスウオッシュ、歯磨き剤、練り歯磨き、歯磨き粉、ジェル、ロゼンジ、タブレット、チューイングガム又は他の経口組成物に適用可能な形態で含む。調製物のｐＨは、好ましくは２から１０の範囲である。好ましい経口組成物は、また有効量のホスファターゼ阻害剤又はホスホペプチド安定化剤例えば、カラギーナン及び陰イオン性ポリマーを含み得る。本発明のＣＰＰ又はこれを含むカゼインは、動物のミネラル吸収を促進するために有効な量の組成物、即ち、皮膚若しくはヘアケア製品、又は供給組成物と、食用キャリヤーとに添加され得る。動物でのミネラルを可溶化する有効な能力のために、本発明のＣＰＰ又はベータカゼインＨを含む本組成物は、通常のＣＰＰ又はカゼインを含む従来の組成物よりも改良された効果を示す。ＣＰＰ又はベータカゼインＨが高いミネラル可溶化効果を有するので、上述の全ての目的に用いられることは勿論、これを含む製品を一層効果的にする。以下の実施例は、説明のためにのみ与えられるものであり、本発明の範囲を制限することを意図していない。実施例１：本発明によるベータカゼインＨの製造牛乳を５,０００ＲＰＭで２０分間遠心分離して上澄みの脂肪層を除去した。得られた物を、澱粉ゲル(Connought Medical Research Lab.)に添加し、８５０ｍｌの蒸留水、１００ｍｌの酢酸及び５０ｍｌのギ酸を含む緩衝液（ｐＨ１．５）を用いて、１５０Ｖで１２時間の間電気泳動した。ゲルを、１０％のニグロシン溶液で３０分間染色し、次いで、５０％メタノールを添加して５時間脱色した。得られた電気泳動写真を図１に示し、ここで、ベータカゼインＨを特異的なバンドで同定した。ベータカゼインＨを含むことがわかった上記の牛乳を、それから遠心分離して、上澄みの脂肪層を除去した。カゼイン蛋白質を、塩酸を添加して沈澱させて乾燥(free-drying)した。１０ｇのカゼインを、２０ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して陰イオン交換カラム（モデル：Pharmacia Co.社製のＭｏｎｏＱ５／５）に通すことによって、精製ベータカゼインを得た。クロマトグラムは、図２（ａ）に示されている。得られたベータカゼインを、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を使用して、第一陽イオン交換カラム（モデル：Pharmacia Co.社製のＭｏｎｏＳ５／５）に付して、ベータカゼインＨを得た。結果を図２（ｂ）に示す。第二陽イオン交換カラムを行い、ベータカゼインＨ１．５ｇを、純性形態で収穫した。クロマトグラムを図２（ｃ）に示す。実施例２：本発明のＣＰＰのトリプシン加水分解による製造実施例１で得られたベータカゼインＨに、０．０１重量％のトリプシン（Sigm a Co.製）を添加した。混合物をリン酸緩衝液に溶解して、１２時間３７℃の温度で加水分解した。反応終了後、加水分解物を３０分間９０℃まで加熱して、その中の酵素を不活化した。混合物のｐＨを４．６に調整して、それから未反応沈殿物を除去した。加水分解物を、アセトニトリル緩衝液を使用してＨＰＬＣ（ＲＰ−カラム、Merk社製)に付し、純性ＣＰＰ（純度９９％）を得た。クロマトグラムを図３に示す。ここで、本発明によるベータカゼインＨの特異的ピークが示されている。精製されたＣＰＰは凍結乾燥され、それから蛋白質配列決定器（Applied-Bio SystemCo.）に付して、配列番号１のアミノ酸配列を得た。実施例３：本発明のＣＰＰの第２鉄イオン添加による製造実施例１と同一の方法で得られた１０ｇのベータカゼインＨと０．１ｇのトリプシンを、１００ｍｌのリン酸に溶解して、３７℃で１２時間加水分解した。得られた溶液にＦｅＣｌ₃を添加して、溶液のＦｅ³⁺濃度を２０ｍＭとし、５０％（ｖ／ｖ）のエタノールをそこに添加して、ペプチドを沈殿させた。従って、沈殿したペプチドを凍結乾燥し、それからゲル濾過クロマトグラフィに付して、１．２ｇのＣＰＰ（純度９０％）を得た。実施例４：ベータカゼインＨのＤＮＡ分析韓国牛から２０ｍｌの血液を採血し、それからSambrook(Sambrookら、Molecul ar Cloning,Cold Spring Harbor Lab.Press(1989))の慣用の方法によってＤＮＡを精製した。ベータカゼイン中の置換アミノ酸を含むＤＮＡフラグメントを増幅するために、Bosingが報告(Bosingら、Complete Nucleotide Sequence of the Bovine Be t a-casein Gene,Aust,J.Biol.Sci.,Vol.41,p.527(1988))した方法を参照して、プライマーを作製した。作製されたプライマーの配列は次の通りである。０.５μｇの精製ＤＮＡ、０.５μｇの各プライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、５μｌのｄＮＴＰ、５μｌの１０×緩衝液、１μｌのＴａｇポリメラーゼ（１ユニット）及び３３μｌの蒸留水を混合した。混合物を９４℃の温度で５分間加熱して、ＤＮＡを変性させた。その後、９４℃で６０秒、５７℃で６０秒、７２ ℃で６０秒のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）サイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ反応が完了した後、５分間の伸長時間を行って、増幅されたＤＮＡフラグメント由来の二重螺旋を形成させた。増幅ＤＮＡを、２％のアガロース（Gibco Co.）を用いた電気泳動により精製し、それから自動ＤＮＡ配列決定器(Applied Bio System Co.)によってＤＮＡ配列を解析した。置換アミノ酸残基を有するＣＰＰの部分の解析は、下記に示されている。ＤＮＡ配列の分析図を図４に示す。上記に示されるように、エクソン５の１３番目塩基がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に置換され、これは、本発明のＣＰＰにおいてアミノ酸がＡｒｇからＣｙｓに置換されたことを示す。実施例５：ベータカゼインＨの動物分泌による大量生産動物分泌のやり方によるベータカゼインＨの大量生産のために、実施例４に示されたような方法によって同定されたベータカゼインの遺伝情報を有する韓国雄牛（Ａ¹Ｈ型）を、５頭のホルスタイン雌牛（Ａ¹Ａ¹型の２頭、Ａ¹Ａ²型の２頭、Ａ²Ａ²型の１頭）と交配し、雄２頭、雌３頭の子牛が生まれた。３頭の雌子牛のＤＮＡ解析を行い、雌子牛（Ａ¹Ｈ）１頭と雄子牛（Ａ²Ｈ）１頭のベータカゼインＨが、異形接合体(Heterozygote)であることがわかった。従って、ベータカゼインＨ（Ａ¹Ｈ型）の遺伝情報を有する得られた雌子牛（Ｆ１）を、生まれたから２８箇月間飼育して孕ませた。そこから生成された牛乳には、１日約４．５Ｋｇの収率でベータカゼインＨを含有することがわかった。これは、この雌牛（Ｆ１）の牛乳生産率が、従来の韓国牛のベータカゼインＨよりも３倍高いことを示した。実施例６：in vivoでのカルシウムの可溶化効果についての効率テスト平均体重約１２０ｇの４０匹のＷｉｓｔｅｒ系のラットを、粗蛋白２４重量％、粗脂肪５重量％、澱粉６０重量％、粗繊維５重量％、ミネラル５重量％、ビタミン１重量％からなる調節食料を１週間与え、２４時間絶食させた。これらのラットを１群当たり１０頭ずつ４個の群に分けた。第１の群のラットには、１０重量％のベータカゼインＨを含む調節食料を１．５時間与えた。第２の群のラットには、１０重量％の通常のベータカゼインを含む調節食料を１．５時間与えた。第３の群のラットには、１重量％の本発明のＣＰＰを含む調節食料を１．５時間与えた。第４の群のラットには、１重量％の従来のＣＰＰを含む調節食料を１．５時間与えた。全てのラットには、出来る限り多く、調節食料を自由に供給した。上記供給が完了した１時間後に、全てのラットを麻酔して、小腸を抽出した。小腸を生理食塩水によって洗浄し、それから、上部と下部との２つの部分に分けた。これにより、小腸管内の内容物を単離して均質化、遠心分離した。上澄み中のカルシウムを原子吸光分析器(Perkin Elmer Co.)によって３回測定した。その結果を下記表１に表示する。表１及び表２に示されるように、ベータカゼインＨを与えた第１群のラットの可溶性カルシウムの平均濃度は５８．４８ｐｐｍであり、これは、従来のカゼインを与えた第２群のラットのものよりも約１５％増加した量である。また、本発明のＣＰＰを与えた第３群のラットの可溶性カルシウムの平均濃度は６８．２０ｐｐｍであり、これは、従来のＣＰＰを与えた第４群のラットのものよりも２３％増加した量である。従って、本発明のＣＰＰ及びベータカゼインＨは、通常のカゼイン及びＣＰＰよりも、in vivoで予期しない驚くべきカルシウム可溶化効果を有していることが示された。本発明を好ましい実施態様に基づいて説明したが、本発明の範囲内から逸脱することなく、多くの変更及び改変がなされ得ることは、当業者にとって明らかであるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ２３Ｌ 1/304 Ａ２３Ｌ 1/304 Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ０７Ｋ 1/18 38/17 ＡＣＫ 1/26 Ｃ０７Ｋ 1/18 1/30 1/26 Ａ６１Ｋ 37/16 ＡＣＫ 1/30 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号１のアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチド。２．配列番号１のアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチドを含むベータカゼインＨ。３．配列番号１のアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチドを含むベータカゼインＨの製造方法であって、前記ベータカゼインＨを含有する乳を選択し、前記乳を酸またはレンネットを添加して沈澱させ、そして、配列番号１のアミノ酸を有するカゼインホスホペプチドを含む沈殿したベータカゼインＨを回収することを含む方法。４．請求項３記載の配列番号１のアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチドを含むベータカゼインＨの製造方法であって、ベータカゼインＨを含む前記乳の選択が、電気泳動によって行われる方法。５．請求項３記載の配列番号１のアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチドを含むベータカゼインＨの製造方法であって、沈殿したベータカゼインＨの回収が、陰イオン交換クロマトグラフィにより行われ、引き続いて陽イオン交換クロマトグラフィにより行われる方法。６．配列番号１のアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチドの製造方法であって、請求項３に記載の方法に従ってベータカゼインＨを得て、前記ベータカゼインＨを、１以上のプロテアーゼを添加することによって加水分解に付し、得られた加水分解物に１以上の無機イオンを添加してペプチドを沈殿させ、そして、沈殿カゼインホスホペプチドを回収することを含む方法。７．請求項６記載の配列番号１のアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチドの製造方法であって、前記プロテアーゼが、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、プロナーゼ及びサーモリジンから構成された群から選択される方法。８．請求項６記載の配列番号１のアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチドの製造方法であって、前記無機イオンがＦｅ、Ｃａ、Ｂａ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎ及びＣｏからなる群から選択される方法。９．請求項８記載の配列番号１のアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチドの製造方法であって、前記無機イオンが、ＦｅＣｌ₃を供給源として使用するＦｅイオンである方法。１０．請求項６記載の配列番号１のアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチドの製造方法であって、前記無機イオンと共にエタノールを添加することを更に含む方法。１１．配列番号１のアミノ酸配列を有するカゼインホスホペプチドを含むベータカゼインＨを含む乳の製造方法であって、ベータカゼインＨを含む乳を生成する牛個体を選択し、前記牛と大量の乳を分泌する牛とを交配してＦ１子孫を得て、前記Ｆ１子孫からベータカゼインＨを含む乳を生成する雌牛を選択し、そして、前記ベータカゼインＨを含む乳を、前記雌牛から抽出することを含む方法。１２．請求項１１のベータカゼインＨを含む牛乳の製造方法であって、前記交配が韓国国産牛とホルスタイン牛との間で実施される方法。１３．ヒトにおいてカルシウム吸収を促進する有効量の配列番号１のアミノ酸配列を有するベータカゼインＨ又はカゼインホスホペプチドと、食用キャリヤーとを含む健康食品又は飲料用の組成物。１４．前記カルシウム及び鉄を更に含む請求項１３記載の組成物。１５．前記ビタミンＤ及びラクトースを更に含む請求項１４記載の組成物。１６．乳、乳児用及び患者用粉乳、ヨーグルト（液状、クリーム状若しくは凍結乾燥型）、チーズ、離乳食、菓子、製パン、アイスクリーム、豆腐、キャンディ、氷菓類、油脂と蜂蜜の菓子、チョコレート、カラメル、天然若しくは合成ジュース、かまぼこ、機能性飲料（等張性スポーツ飲料）、粉末茶、マヨネーズ又はドレッシングを含む請求項１４記載の組成物。１７．象牙質過敏症の治療用の経口組成物であって、象牙質過敏症を減少させる若しくは緩和する量の配列番号１のアミノ酸配列を有するベータカゼインＨ若しくはカゼインホスホペプチドと、医薬的に許容可能なキャリヤーとを含む組成物。