JP3234222B2 - カゼインからのホスホペプチドの生成 - Google Patents
カゼインからのホスホペプチドの生成Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、カゼインから抗食原性質及び他の性質を有
するホスホペプチドの生成に関する。
するホスホペプチドの生成に関する。
発明の背景 オーストラリア特許第593365号において、本発明者
は、カゼインのトリプシン消化により放される多くのホ
スホペプチドのうち４種が虫歯予防（歯−崩壊−阻害）
活性を有することを記載している。それらのペプチドは
すべて、次の活性配列−Ser（Ｐ）−Ser（Ｐ）−Ser
（Ｐ）−Glu−Glu−を含み、そして、αS1（59−79）配
列番号２（T1），β（２−25）配列番号３（T2），αs2
（46−70）配列番号４（T4）及びαs2（２−21）配列番
号７（T3）に対応する。虫歯予防性ホスホペプチドの製
造について記載される方法は、選択的沈殿法及びイオン
交換クロマトグラフィーである。それらの方法はそれら
のペプチドのひじょうに純粋な調製物を生成するが、そ
れらは、それらの費用及び必要とされる技術熟練のレベ
ルにより酪農産業において一般的に受け入れられていな
い。
は、カゼインのトリプシン消化により放される多くのホ
スホペプチドのうち４種が虫歯予防（歯−崩壊−阻害）
活性を有することを記載している。それらのペプチドは
すべて、次の活性配列−Ser（Ｐ）−Ser（Ｐ）−Ser
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交換クロマトグラフィーである。それらの方法はそれら
のペプチドのひじょうに純粋な調製物を生成するが、そ
れらは、それらの費用及び必要とされる技術熟練のレベ
ルにより酪農産業において一般的に受け入れられていな
い。
最近、膜限外濾過が牛乳処理のために酪農産業におい
て広く受け入れられた。アメリカ特許第4,358,465号，
第4,361,587号及び第4,495,176号（Bruleなど）は、栄
養食物としてカゼインホスホペプチドの製造のための限
外濾過法を記載する。この方法は、調製物に多量の非−
虫歯予防性ホスホペプチドの存在により、虫歯予防性ホ
スホペプチドの製造のためには適切でないことがわかっ
ている。
て広く受け入れられた。アメリカ特許第4,358,465号，
第4,361,587号及び第4,495,176号（Bruleなど）は、栄
養食物としてカゼインホスホペプチドの製造のための限
外濾過法を記載する。この方法は、調製物に多量の非−
虫歯予防性ホスホペプチドの存在により、虫歯予防性ホ
スホペプチドの製造のためには適切でないことがわかっ
ている。
AU−B66783/81及び51491/85（Bruleなど）において
は、栄養補足物として使用するためのホスホペプチドの
抽出法が開示されており、ここで二価カチオン形成凝集
体が、上記目的のために選択された所望するホスホペプ
チドを抽出するために、限外濾過、それに続く水による
ダイアフィルトレーションと組合して使用されている。
この方法は同様に、虫歯予防性ホスホペプチドの生成の
ためには不適切である。なぜならば、水によるダイアフ
ィルトレーションは、虫歯予防性ホスホペプチドの凝集
破壊をもたらすからである。
は、栄養補足物として使用するためのホスホペプチドの
抽出法が開示されており、ここで二価カチオン形成凝集
体が、上記目的のために選択された所望するホスホペプ
チドを抽出するために、限外濾過、それに続く水による
ダイアフィルトレーションと組合して使用されている。
この方法は同様に、虫歯予防性ホスホペプチドの生成の
ためには不適切である。なぜならば、水によるダイアフ
ィルトレーションは、虫歯予防性ホスホペプチドの凝集
破壊をもたらすからである。
発明及び目的の要約 限外濾過を用いてカゼインから選択されたホスホペプ
チドを調製するための方法を提供することが本発明の目
的である。
チドを調製するための方法を提供することが本発明の目
的である。
本発明は、選択されたホスホペプチドの調製方法を提
供し、ここでその方法とは、溶液におけるカゼインの可
溶性一価カチオン塩を完全に消化し、前記消化された溶
液における少なくとも選択されたホスホペプチドの凝集
を引き起こすために二又は三価金属イオンを導入し、そ
して前記凝集されたホスホペプチドを保持するように選
択された分子量排除限界を有するフィルターを通して前
記凝集イオンを含む溶液を、多量の残存するホスホペプ
チド及び非−リン酸化ペプチドを通しながらダイアフィ
ルトレートする段階を含んで成る。
供し、ここでその方法とは、溶液におけるカゼインの可
溶性一価カチオン塩を完全に消化し、前記消化された溶
液における少なくとも選択されたホスホペプチドの凝集
を引き起こすために二又は三価金属イオンを導入し、そ
して前記凝集されたホスホペプチドを保持するように選
択された分子量排除限界を有するフィルターを通して前
記凝集イオンを含む溶液を、多量の残存するホスホペプ
チド及び非−リン酸化ペプチドを通しながらダイアフィ
ルトレートする段階を含んで成る。
Bruleなどにより記載される方法においては、その目
的は、栄養物として使用するためにカゼインから広範囲
のホスホペプチドを得ることである。従って、Bruleな
どは、残りのホスホペプチド及び非−リン酸化ペプチド
の通過をダイアフィルトレーション工程の間、可能にし
ながら、選択されたホスホペプチドが溶液から濾過され
ることを確保するために、加水分解されたカゼイン化合
物が、凝集イオンの存在下でダイアフィルトレートされ
るべきことについて教授していない。これは、所望する
ホスホペプチドに富んでいる（90％w/w以上）調製物を
もたらす産業的に許容される抽出方法の使用を可能にす
るので、技術的な有意な進歩を表わす。
的は、栄養物として使用するためにカゼインから広範囲
のホスホペプチドを得ることである。従って、Bruleな
どは、残りのホスホペプチド及び非−リン酸化ペプチド
の通過をダイアフィルトレーション工程の間、可能にし
ながら、選択されたホスホペプチドが溶液から濾過され
ることを確保するために、加水分解されたカゼイン化合
物が、凝集イオンの存在下でダイアフィルトレートされ
るべきことについて教授していない。これは、所望する
ホスホペプチドに富んでいる（90％w/w以上）調製物を
もたらす産業的に許容される抽出方法の使用を可能にす
るので、技術的な有意な進歩を表わす。
本発明の好ましい形においては、選択されたホスホペ
プチドは上記に言及される虫歯予防性ホスホペプチドで
あり、そして上記の方法の濾過段階の間に採用された分
子排除限界は10,000〜20,000の範囲内に実質的に入る。
プチドは上記に言及される虫歯予防性ホスホペプチドで
あり、そして上記の方法の濾過段階の間に採用された分
子排除限界は10,000〜20,000の範囲内に実質的に入る。
カゼインの可溶性一価カチオン塩、たとえばカゼイン
ナトリウム又はカゼインカリウムは、0.1〜50％w/wの範
囲内に実質的に入る濃度で溶液に存在し、これは好まし
くは、タンパク質分解酵素、たとえばトリプシン及びキ
モトリプシンを用いて又は化学的手段、たとえば臭化シ
アンにより消化される。酵素：カゼインの比は、1:1000
〜1:10（w:w）の範囲であるが、しかしこれは上記に定
義されたようにカゼインの完全な消化を可能にするため
に選択される。加水分解のpHは好ましくは、酵素が完全
にカゼインの消化を可能にするために最適に調節される
べきである。温度はまた、完全な消化のために最適化さ
れるべきであるが、しかし温度誘発分解（脱アミノ反
応、脱リン酸化及びペプチド分解）は最少化されるべき
である。最適温度は約20℃〜60℃である。
ナトリウム又はカゼインカリウムは、0.1〜50％w/wの範
囲内に実質的に入る濃度で溶液に存在し、これは好まし
くは、タンパク質分解酵素、たとえばトリプシン及びキ
モトリプシンを用いて又は化学的手段、たとえば臭化シ
アンにより消化される。酵素：カゼインの比は、1:1000
〜1:10（w:w）の範囲であるが、しかしこれは上記に定
義されたようにカゼインの完全な消化を可能にするため
に選択される。加水分解のpHは好ましくは、酵素が完全
にカゼインの消化を可能にするために最適に調節される
べきである。温度はまた、完全な消化のために最適化さ
れるべきであるが、しかし温度誘発分解（脱アミノ反
応、脱リン酸化及びペプチド分解）は最少化されるべき
である。最適温度は約20℃〜60℃である。
本発明の好ましい形においては、消化の後、HClが室
温で添加され、約pH4.7にされ、そしてすべての沈殿物
（これは最少であるべきである）が除去される。次に、
CaCl2が約1.0％w/vのレベルまで上清液に添加される。
1.0％w/vのカルシウム（II）の存在下でのホスホペプチ
ドが凝集する、虫歯予防性ホスホペプチド（すなわち配
列−Ser（Ｐ）−Ser（Ｐ）−Ser（Ｐ）−Glu−Glu−を
含む）は、好ましくは1.0％w/vのCaCl2溶液による10,00
0分子量排除限界フィルターを通しての広範なダイアフ
ィルトレーションにより小さな非−虫歯予防性ホスホペ
プチドから分離されるヘキサマーを形成する。膜フィル
ターの好ましい分子量排除限界は、10,000以下ではなく
又は約20,000以上であるべきでない。CaCl2溶液又はい
くらかの他の適切な二価／三価の金属イオン、たとえば
亜鉛（II）又は鉄（III）の添加は、虫歯予防性ホスホ
ペプチド凝集体の結合性を維持するためにダイアフィル
トレーションのために必要であり、従って非−虫歯予防
性ホスホペプチドから虫歯予防性ホスホペプチドの分離
を可能にする。
温で添加され、約pH4.7にされ、そしてすべての沈殿物
（これは最少であるべきである）が除去される。次に、
CaCl2が約1.0％w/vのレベルまで上清液に添加される。
1.0％w/vのカルシウム（II）の存在下でのホスホペプチ
ドが凝集する、虫歯予防性ホスホペプチド（すなわち配
列−Ser（Ｐ）−Ser（Ｐ）−Ser（Ｐ）−Glu−Glu−を
含む）は、好ましくは1.0％w/vのCaCl2溶液による10,00
0分子量排除限界フィルターを通しての広範なダイアフ
ィルトレーションにより小さな非−虫歯予防性ホスホペ
プチドから分離されるヘキサマーを形成する。膜フィル
ターの好ましい分子量排除限界は、10,000以下ではなく
又は約20,000以上であるべきでない。CaCl2溶液又はい
くらかの他の適切な二価／三価の金属イオン、たとえば
亜鉛（II）又は鉄（III）の添加は、虫歯予防性ホスホ
ペプチド凝集体の結合性を維持するためにダイアフィル
トレーションのために必要であり、従って非−虫歯予防
性ホスホペプチドから虫歯予防性ホスホペプチドの分離
を可能にする。
数体積の1.0％CaCl2w/vが虫歯予防性ホスホペプチド
の90％以上の純度を達成するために膜フィルターに通さ
れた後、虫歯予防性ホスホペプチドを含む超保持物が、
所望によりカルシウムを除去するために1,000分子量排
除限界フィルターを通して水によりダイアフィルトレー
トされ得る。次に、その保持物が濃縮され、そして噴霧
乾燥される。
の90％以上の純度を達成するために膜フィルターに通さ
れた後、虫歯予防性ホスホペプチドを含む超保持物が、
所望によりカルシウムを除去するために1,000分子量排
除限界フィルターを通して水によりダイアフィルトレー
トされ得る。次に、その保持物が濃縮され、そして噴霧
乾燥される。
虫歯予防性ホスホペプチド調製物（ACPP）のカルシウ
ム、亜鉛及び鉄の塩が、カルシウムACPPの10％w/v溶液
を低いpH、すなわちpH2にHClにより酸性化することによ
って、ナトリウム塩に転換される。1,000分子量排除限
界フィルターを通して広範なダイアフィルトレーション
の後、その保持物がNaOHによりpH7.0に中和され、そし
て次に、同じフィルターを通して水によりダイアフィル
トレートされ、過剰の塩化ナトリウムが除去される。
ム、亜鉛及び鉄の塩が、カルシウムACPPの10％w/v溶液
を低いpH、すなわちpH2にHClにより酸性化することによ
って、ナトリウム塩に転換される。1,000分子量排除限
界フィルターを通して広範なダイアフィルトレーション
の後、その保持物がNaOHによりpH7.0に中和され、そし
て次に、同じフィルターを通して水によりダイアフィル
トレートされ、過剰の塩化ナトリウムが除去される。
カルシウムACPPは、CaCl2及びNa2HPO4の添加によりリ
ン酸カルシウムACPPに転換され、ここでCa/Pの最終比は
1.67である。ペプチドαS1（59−79）は21Ca及び13PO4
を結合できる。上記工程の濾液は、サイズ及び電荷−基
礎の分離技法による他の生物活性カゼインペプチドの精
製のために適切であり、そして微生物の増殖培地とし
て、虚弱後の栄養補足物として又は窒素肥料として使用
され得る。
ン酸カルシウムACPPに転換され、ここでCa/Pの最終比は
1.67である。ペプチドαS1（59−79）は21Ca及び13PO4
を結合できる。上記工程の濾液は、サイズ及び電荷−基
礎の分離技法による他の生物活性カゼインペプチドの精
製のために適切であり、そして微生物の増殖培地とし
て、虚弱後の栄養補足物として又は窒素肥料として使用
され得る。
本発明の好ましい態様が、次の例により記載されるで
あろう。
あろう。
例 カゼインナトリウムを、牛乳を0.1MのHClによりpH4.7
まで酸性化し、そしてその沈殿物をNaOHによりpH7.0ま
で中和することによって調製した。カゼインナトリウム
の10％w/v溶液を調製し、そしてpH8.0に調整した。トリ
プシン（Novo）を0.2％w/vまで添加し、そしてその加水
分解は、NaOHの一定した添加によるpH8.0への調整によ
り50℃で完結まで進行せしめた。次に、溶液のpHを、5M
のHClによりpH4.7に調整し、そして沈殿物を室温での遠
心分離により除去した。上清液を８ミクロンのフィルタ
ーを通してマイクロ濾過し、そして次にNaOHによりpH7.
0に中和し、そしてCaCl2を1.0％w/vのレベルまで添加し
た。次に、その溶液を、Amicon YM10（10,000分子量排
除限界）を通して1.0％w/vのCaCl2の３〜５体積により
ダイアフィルトレートした。次に、保持物を、Amican Y
M1フィルター（1,000分子量排除限界）を通して１体積
の蒸留／脱イオン水により洗浄した。この調製物の個々
のペプチドを、イオン交換FPLC及び逆相HPLCにより前記
特許に記載されるようにして分離し、そしてSer（Ｐ）
残基のＳ−エチルシステインへの転換の後、アミノ酸組
成及び配列分析により固定した。調製物の分析は表１に
示される。ペプチド％ w/w αS2（１−21）（配列番号８） 0.8 β（１−25）（配列番号１） 22.3 αS2（２−２）（配列番号７）（T3） 5.7 β（２−25）（配列番号３）（T2） 17.9 αS1（59−79）（配列番号２）（T1） 21.4 デサミド74α（59−79）（配列番号５） 6.3 αS2（46−70）（配列番号４）（T4） 6.8 デサミド74,78αS1（59−79）（配列番号６） 6.4 αS1（43−79）（配列番号９） 3.3 NAP＊ 9.1＊ NAP＝非−虫歯予防性ペプチド この調製物は、前記特許に記載される４種の虫歯予防
性ホスホペプチドを含み〔β（２−25）,T2,αS1（59−
79）,T1,αS2（２−21）,T3及びαS2（46−70）,T4〕、
それらはトリプシンにより不完全に加水分解されたペプ
チドに関連し〔αS2（１−21），β（１−25）及びαS1
（43−79）〕、そして温度誘発脱アミド化に起因するα
S1（59−79），デスアミド74及びデスアミド74,78の２
種の脱アミド化形の重要でないレベルにも関し、これ
は、高い温度及び極端なpHによりカゼインナトリウムの
商業的製造において高い程度生じ、但し、脱アミド化さ
れた形の存在は、虫歯予防性ホスホペプチドの活性に対
して効果を有さない。その虫歯予防性ホスホペプチド
は、生成されるペプチドの90.9％w/wであった。
まで酸性化し、そしてその沈殿物をNaOHによりpH7.0ま
で中和することによって調製した。カゼインナトリウム
の10％w/v溶液を調製し、そしてpH8.0に調整した。トリ
プシン（Novo）を0.2％w/vまで添加し、そしてその加水
分解は、NaOHの一定した添加によるpH8.0への調整によ
り50℃で完結まで進行せしめた。次に、溶液のpHを、5M
のHClによりpH4.7に調整し、そして沈殿物を室温での遠
心分離により除去した。上清液を８ミクロンのフィルタ
ーを通してマイクロ濾過し、そして次にNaOHによりpH7.
0に中和し、そしてCaCl2を1.0％w/vのレベルまで添加し
た。次に、その溶液を、Amicon YM10（10,000分子量排
除限界）を通して1.0％w/vのCaCl2の３〜５体積により
ダイアフィルトレートした。次に、保持物を、Amican Y
M1フィルター（1,000分子量排除限界）を通して１体積
の蒸留／脱イオン水により洗浄した。この調製物の個々
のペプチドを、イオン交換FPLC及び逆相HPLCにより前記
特許に記載されるようにして分離し、そしてSer（Ｐ）
残基のＳ−エチルシステインへの転換の後、アミノ酸組
成及び配列分析により固定した。調製物の分析は表１に
示される。ペプチド％ w/w αS2（１−21）（配列番号８） 0.8 β（１−25）（配列番号１） 22.3 αS2（２−２）（配列番号７）（T3） 5.7 β（２−25）（配列番号３）（T2） 17.9 αS1（59−79）（配列番号２）（T1） 21.4 デサミド74α（59−79）（配列番号５） 6.3 αS2（46−70）（配列番号４）（T4） 6.8 デサミド74,78αS1（59−79）（配列番号６） 6.4 αS1（43−79）（配列番号９） 3.3 NAP＊ 9.1＊ NAP＝非−虫歯予防性ペプチド この調製物は、前記特許に記載される４種の虫歯予防
性ホスホペプチドを含み〔β（２−25）,T2,αS1（59−
79）,T1,αS2（２−21）,T3及びαS2（46−70）,T4〕、
それらはトリプシンにより不完全に加水分解されたペプ
チドに関連し〔αS2（１−21），β（１−25）及びαS1
（43−79）〕、そして温度誘発脱アミド化に起因するα
S1（59−79），デスアミド74及びデスアミド74,78の２
種の脱アミド化形の重要でないレベルにも関し、これ
は、高い温度及び極端なpHによりカゼインナトリウムの
商業的製造において高い程度生じ、但し、脱アミド化さ
れた形の存在は、虫歯予防性ホスホペプチドの活性に対
して効果を有さない。その虫歯予防性ホスホペプチド
は、生成されるペプチドの90.9％w/wであった。
純粋なαS1−カゼインがカゼインの代わりに使用され
る場合、αS1（59−79）が、加水分解条件に依存して、
このペプチドの少量の脱アミド化された形を伴ってこの
方法により得られるであろう。純粋なβ−カゼインが使
用される場合、β（１−25）及びβ（２−25）のみがこ
の方法を用いて得られるであろう。
る場合、αS1（59−79）が、加水分解条件に依存して、
このペプチドの少量の脱アミド化された形を伴ってこの
方法により得られるであろう。純粋なβ−カゼインが使
用される場合、β（１−25）及びβ（２−25）のみがこ
の方法を用いて得られるであろう。
粗酵素が使用される場合（たとえばパンクレアチ
ン）、９種の列挙されるホスホペプチドのわずかな切断
（Ｎ−及びＣ−未満）が生じる。この切断が単にわずか
である限り、活性の損失は存在しない。実際、パクレア
チンは、精製されたトリプシンに比較される場合、重量
に基づいてわずかに高い比活性を有する調製物を生成す
る。
ン）、９種の列挙されるホスホペプチドのわずかな切断
（Ｎ−及びＣ−未満）が生じる。この切断が単にわずか
である限り、活性の損失は存在しない。実際、パクレア
チンは、精製されたトリプシンに比較される場合、重量
に基づいてわずかに高い比活性を有する調製物を生成す
る。
前記特許のペプチドT1〜T4を含む、９種のペプチドの
配列、及び上記に言及される他のペプチドが、次の列挙
される配列に詳しく記載される。
配列、及び上記に言及される他のペプチドが、次の列挙
される配列に詳しく記載される。
配列の列挙 （１）一般情報： （ｉ）出願者:REYNOLDS,ERIC CHARLES （ii）発明の名称：カゼインからのホスホペプチドの
製造 （iii）配列の数:9 （iv）通信先： （Ａ）住所： （Ｂ）通り： （Ｃ）町： （Ｄ）州： （Ｅ）国： （Ｆ）郵便番号： （ｖ）コンピューター読み取りフォーム： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC COMPATIBLE （Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェアー:WORD PERFECT （vi）現在の出願日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）前の出願日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）アトニー／エージェント情報： （Ａ） （Ｂ） （Ｃ） （ix）電信情報： （Ａ） （Ｂ） （Ｃ） （２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:25 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:15 （Ｄ）他の情報：後翻訳的にリン酸化されたセリン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:17 （Ｄ）他の情報：後翻訳的にリン酸化されたセリン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:18 （Ｄ）他の情報：後翻訳的にリン酸化されたセリン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:19 （Ｄ）他の情報：後翻訳的にリン酸化されたセリン （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ピログルタメート （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報：一定量がこの形で存在するであろ
う （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:6 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:8 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:9 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:10 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:17 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:24 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:14 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:16 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:17 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:18 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:25 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:11 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:12 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:13 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:16 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:6 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:8 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:9 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:10 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:17 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:6 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:8 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:9 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:10 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:17 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （xi）配列：配列番号6: （２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:20 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:7 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:8 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:9 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:15 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （xi）配列：配列番号7: （２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:8 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:9 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:10 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:16 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （xi）配列：配列番号8: （２）配列番号９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:37 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:4 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:6 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:22 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:24 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:25 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:26 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:33 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （xi）配列：配列番号9:
製造 （iii）配列の数:9 （iv）通信先： （Ａ）住所： （Ｂ）通り： （Ｃ）町： （Ｄ）州： （Ｅ）国： （Ｆ）郵便番号： （ｖ）コンピューター読み取りフォーム： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC COMPATIBLE （Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェアー:WORD PERFECT （vi）現在の出願日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）前の出願日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）アトニー／エージェント情報： （Ａ） （Ｂ） （Ｃ） （ix）電信情報： （Ａ） （Ｂ） （Ｃ） （２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:25 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:15 （Ｄ）他の情報：後翻訳的にリン酸化されたセリン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:17 （Ｄ）他の情報：後翻訳的にリン酸化されたセリン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:18 （Ｄ）他の情報：後翻訳的にリン酸化されたセリン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:19 （Ｄ）他の情報：後翻訳的にリン酸化されたセリン （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ピログルタメート （Ｂ）位置:1 （Ｄ）他の情報：一定量がこの形で存在するであろ
う （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:6 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:8 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:9 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:10 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:17 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:24 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:14 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:16 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:17 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
ン （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ホスホセリン （Ｂ）位置:18 （Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリ
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ン （xi）配列：配列番号9:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レイノルズ，エリック チャールズ オーストラリア国，ビクトリア 3000, メルボルン，エリザベス ストリート 711，ロイヤル デンタル ホスピタル オブ メルボルン，ザ ユニバーシテ ィ オブ メルボルン，シー／オー ス クール オブ デンタル サイエンス (56)参考文献 特開 昭53−123922（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−257853（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−257854（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−503459（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/47 C07K 1/34 C07K 7/08 C12P 21/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (12)
- 【請求項１】虫歯予防性ホフホペプチドの調製方法であ
って、溶液におけるカゼインの可溶性一価カチオン塩を
完全に消化し、10％w/vのカゼイン消化物中に１％w/vの
CaCl2を含有する溶液の金属イオン濃度に等しい金属イ
オン濃度で前記消化された溶液に二又は三価金属イオン
を加えて、前記消化された溶液における虫歯予防性ホス
ホペプチドの凝集を引き起こし、そして前記凝集された
ホスホペプチドを含有する溶液を、前記虫歯予防性ホス
ホペプチドを保持するように選択された分子量排除限界
を有するフィルターを通して、複数倍の体積の前記金属
イオンの溶液を用いて、多量の残りのホスホペプチドを
濾液中に通過させながらダイアフィルトレートし、ダイ
アフィルトレーションの間、前記金属イオン濃度を10％
w/vカゼイン消化物中に１％w/vのCaCl2を含有する溶液
のレベルに等しいレベルに維持する工程を含んで成る方
法。 - 【請求項２】前記選択されたホスホペプチドが虫歯予防
性ホスホペプチドであり、そして前記濾過段階の間に採
用される分子量排除限界が10,000〜20,000の範囲内に実
質的に入る請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】前記カゼインの可溶性一価カチオン塩が0.
1〜50％w/w内に入る濃度で溶液に存在する請求の範囲第
１又は２項記載の方法。 - 【請求項４】前記消化段階が、タンパク質分解酵素を用
いて行なわれ、そして溶液中のタンパク質分解酵素：カ
ゼインの可溶性一価カチオン塩の比が、カゼイン塩の完
全な消化を可能にするために選択される1:1000〜1:10
（w:w）の範囲内に入る請求の範囲第1,2または３項記載
の方法。 - 【請求項５】前記溶液のpH及び温度がカゼイン塩の完全
な消化を可能にするために調節される請求の範囲第１〜
４項のいづれか１項記載の方法。 - 【請求項６】前記溶液の温度が20℃〜60℃の範囲内に入
る請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】請求の範囲第１〜６項のいずれか１項の方
法であって、さらにpHを4.7に調整するために溶液に無
機酸を添加し、いづれかの生成される沈殿物を除去し、
前記消化された溶液における少なくとも選択されたホス
ホペプチドの凝集を引き起こすためにCaCl2を1.0％w/v
のレベルまで添加し、そして前記溶液から凝集されたホ
スホペプチドを、10,000〜20,000の範囲内にある分子量
排除限界を有するフィルターを通して前記CaCl2を含む
溶液を、濾液中に多量の残りのホスホペプチド及び非−
リン酸化ペプチド及び溶液を通しながら、ダイアフィル
トレーションを包含する濾過により分離し、ダイアフィ
ルトレーションの間の前記金属イオン濃度を凝集された
ホスホペプチドを凝集された形に維持するのに有効なレ
ベルに維持することを含んで成る方法。 - 【請求項８】前記カゼインの可溶性一価カチオン塩が、
カゼインナトリウム及びカゼインカリウムから選択され
る請求の範囲第１〜７項のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】前記タンパク質分解酵素がパンクレアチ
ン、トリプシン、ペパイン、キモトリプシン及びその混
合物から選択される請求の範囲第１〜８項のいずれか１
項記載の方法。 - 【請求項１０】前記金属イオンがカルシウム、鉄及び亜
鉛から成る群から選択される請求の範囲第１〜９項のい
ずれか１項記載の方法。 - 【請求項１１】前記消化段階の後に、さらに 消化された溶液を酸性化して、沈殿物を生成させ、 消化された溶液を遠心分離して上清液を生成させ、 次に沈殿物を除去し、 次に上清液をミクロ濾過し、そして 次に上清液に前記金属イオンを加える段階を含んでなる
請求の範囲第10項記載の方法。 - 【請求項１２】前記金属イオンが、消化された溶液への
CaCl2の添加により生成したカルシウムイオンであっ
て、前記ダイアフィルトレーション段階がさらに、10,0
00〜20,000の範囲内にある分子量排除限界を有するフィ
ルターを通して、前記CaCl2を含む溶液を、濾液中に多
量の残りのホスホペプチド及び非−リン酸化ペプチド及
び溶液を通しながらダイアフィルトレートする段階を含
んで成る請求の範囲第11項記載の方法。
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