KR0145801B1 - 페니실리움 씨트리넘으로부터 유래한 신규의 아미노펩티다제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 페니실리움 씨트리넘(Penicillium citrinum)으로부터 유래한 신규의 아미노펩티다제 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 상기 아미노 펩티다제는 천연 상태의 분자량이 59 내지 61KD이고, pH 8.0 내지 10.0, 온도 45 내지 50℃에서 최적 활성을 나타내며, 효소 활성 유지에 코발트 이온을 필요로 한다.

Description

페니실리움 씨트리넘 (Penicillium citrinum)으로부터 유래한 신규의 아미노펩티다제

제 1 도는 페니실리움 씨트리넘의 세포 분쇄액 아미노 펩티다제를 S-세파로즈 칼럼 크로마토그래피로 분리한 크로마토그램을 나타낸 것이고;

제 2 도는 페니실리움 씨트리넘의 세포 분쇄액으로부터 분리한 아미노 펩티다제를 전기영동(SDS-PAGE)하여 분자량을 확인한 결과를 나타낸 것이고;

제 3 도는 젤 여과 칼럼 크로마토그래피에 의해 천연형 아미노 펩티다제의 분자량을 결정한 결과를 나타낸 것이고;

제 4 도는 pH 변화에 따른 아미노펩티다제의 활성 변화를 나타낸 것이고;

제 5 도는 온도변화에 따른 아미노펩티다제의 활성변화를 나타낸 것이고;

제 6 도는 인간 성장 호르몬의 N-말단 메티오닌기를 아미노펩티다제로 제거한 것을 나타낸 것이다.

본 발명은 페니실리움 씨트리넘(Penicillium citrinum)으로부터 유해한 신규의 아미노펩티다제 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

아미노펩티타제는 여러 종류의 미생물, 동물세포 등에서 발견되며 그의 주 기능은 세포내 대사과정에서 생성되는 불필요한 단백질의 아미노산을 하나씩 유리시키는 작용을 하는 것으로 알려져 있으나 그 이외의 정확한 생리적 기능은 아직까지 알려져 있지 않다. 아미노펩티다제는 대체적으로 활성유지를 위해 칼슘, 마그네슘, 구리, 아연 및 코발트 등과 같은 2가 금속이온을 선택적으로 요구하는 메탈로프로테아제(metallo-protease)계열에 속하며 이러한 금속 이온에 대한 선택적 요구성은 아미노펩티다제마다 차이가 있다. 또한, 아미노펩티다제는 활성을 위해 2개 내지 12개의 단량체(monomer)가 비공유 결합하여 구성된 거대분자(subunit aggregate)를 요구하는 효소가 있는 반면, 단량체만으로도 아미노펩티다제 활성을 나타내는 것도 상당히 많이 보고 되어 있다. (Allen Taylor, Trends in Biochemical Sciences, 18, 167-171(1993)). 이효소들은 일반적으로 30 내지 70℃의 온도에서 활성을 보유하는 공통점이 있는 반면, 종에 따라 여러 가지 다른 특성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

론카리 및 주버(G.Roncari and H.Zuber, Method in Enzymology, 19, 544(1970))는 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)로부터 특성이 약간씩 다른 3가지의 아미노 펩티다제를 발견하여 보고하였고, 우와지마 등(Takayuri Uwajima, et al., Agr, Biol. Chem., 37(12), 2727(1973))은 스트렙토마이세스 펩티도파시엔스(Streptomyces peptidofaciens) KY2389로부터 유래한 칼슘을 요구하는 아미노펩티다제의 물리화학적 성질을 보고하였다.

스펀진과 블럼버그(Anya Spungin and Shmaryahu Blumberg, Eur. J. Biochem., 183. 471-477(1989))는 토양에서 분리한 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)의 배양액을 열처리, 바이오겔 P-4 겔 여과(Bio-Gel P-4 gel filtration) 및 DEAE-세파로즈 이온 교환 크로마토그래피의 과정으로 N-말단 서열이 Ala-Pro-Asp-Ile-Pro-Leu으로 시작되며 SDS-PAGE에 의한 분자량은 약 33KD인 아미노펩티다제를 분리하였다. 이러한 각종 아미노펩티다제는 엑소펩티다제에 속하며 기질 단백질의 N-말단으로부터 순차적으로 아미노산을 유리시키는 성질을 가지고 있다.

이러한 사실들에 근거하여 본 발명자들은 새로운 아미노 펩티다제를 개발하기 위한 연구를 거듭한 끝에 페니실리움 씨트리넘의 세포분쇄액으로부터 아미노펩티다제의 활성이 증가함을 발견하고 그로부터 종래에 알려진 아미노펩티다제와는 현저히 다른 특성을 보이는 새로운 아미노펩티다제를 분리하고 그의 성질을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 페니실리움 씨트리넘으로부터 유래한 신규의 아미노펩티다제를 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 아미노펩티다제는 SDS-PAGE상에서의 분자량이 63내지 66KD이고 천연상태의 분자량은 59 내지 61KD인 단순 사슬(single chain)구조의 아미노펩티다제로서, 유전자 재조합 단백질의 N-말단에 있는 메티오닐기를 선택적으로 절단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 합성기질을 이용한 실험에서, 루이신에 대해서는 특이적으로 작용하나, 라이신과 같은 염기성 아미노산, 글리신과 같은 극성 아미노산, 및 루이신과 같은 비극성 아미노산으로서 고리 구조를 가지고 분자구조가 비표적 큰 아미노산에 대해서는 반응이 제한적으로 진행되므로 본 발명의 아미노펩티다제는 통상적으로 루이신 아미노 펩티다제로 분류할 수 있다.

본 발명의 아미노펩티다제는 pH8.0 내지 10.0 더욱 바람직하게는 pH 8.5 내지 9.0에서 최적의 활성을 나타낸다. 또한, 최적의 활성을 유지하는 온도범위는 35 내지 53℃이며 가장 높은 활성을 나타내는 온도범위는 45 내지 50℃이다. 2가 코발트 이온과 같은 금속이온의 존재가 활성유지에 긴요하며, 이같은 금속 이온이 이.디.티.에이(EDTA) 또는 1,10-페난트롤린(1,10-phenanthroline)등과 같은 물질과 착화합물을 형성하게 활성을 잃는 메탈로 프로테아제이다.

본 발명의 아미노펩티다제는 페니실리움 씨트리넘(IFO 6352)의 세포분쇄액으로부터 얻을 수 있으며, 예를 들면, 상기 세포 분쇄액을 원심분리하여 얻은 상층액을 농축한 후 황산 암모늄으로 용해시킨후 상기 용액을 S-세파로즈 수지등을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피 및 S-200 칼럼 등을 이용한 젤 여과 크로마토그래피 과정을 거치게 함으로써 고순도로 정제된 아미노 펩티다제를 얻을 수 있다.

이와 같은 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 그러나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 %는 별도의 언급이 없는 한 고체/고체는 중량/중량, 고체/액체는 중량/부피, 액체/액체는 부피/부피 %를 각각 나타낸다.

[참조예 1] 페니실리움 씨트리넘의 배양

우선 종 배양을 위하여 1% 글루코스, 1% 박토-펩톤, 0.5% 효모엑기스 및 0.2% 인산 이수소 칼륨(최종 pH 6.5 내지 7.0)으로 조성된 멸균 배지 200㎖를 500㎖용량의 플라스크에 넣고 동일 배지로 제조된 아가 플레이트(agar plate)에서 생성된 페니실리움 씨트리넘 균사체 조각(slice)을 접종하여 30℃에서 3일간 배양하였다. 그후, 5ℓ 용량이 발효기를 이용하여 본 배양을 실시하였는데, 종 배양 배지와 조성이 동일한 발효배지 3ℓ를 발효기에 넣고 이에 상기에서 수득한 종 배양액 200㎖를 접종하여 30℃에서 450rpm, 1vvm의 조건으로 2일간 통기 교반 배양하였다.

[참조예 2] 효소 활성 측정

정제된 아미노펩티다제의 효소활성은 플레이더러(Pfleiderer, Meth, Enzymol, 19, 514-521(1970))의 방법에 따라 측정하였다. 효소활성도 1 단위(unit)는 100mM 트리스(pH 8.0), 1% DMSO(dimethylsulfxide: 미국 시그마(sigma)사에서 구입)에 용해된 루이신 파라니트로아닐리드(L-Leucine-paranitroanilide, L-Leu-pNA; 미국 시그마사에서 구입)를 기질로 한 완충용액 1㎖에 아미노펩티다제를 가하여 37℃에서 1분동안 반응시켰을 때 405nm에서 흡광도를 1변화시키는 효소의 양으로 정의하였다.

[실시예 1] 아미노펩티다제의 분리 및 정제

참조예 1에서 수득한 배양액 약 3ℓ를 와트만 1호(Whatman No.1)필터로 여과하여 얻은 약 200g의 페니실리움 씨트리넘 세포를 50mM 인산나트륨 및 1mM PMSF(phenylmethylsulfonylfluoride)를 포함하는 완충용액(pH 6.8) 1.5ℓ에 현탁시킨 후 200㎖ 용량의 베드비이터로 100㎖씩 2분간 세포를 분쇄하였다. 상기에서 얻은 세포분쇄액 2200㎖를 원심분리(Rotor JA14, 12000rpm, 30분, 15℃)하여 상층액을 취하고 아미콘 농축기(Amicon Spiral Catridge, 분자량 컷오프 : 10KD를 사용하여 약 650㎖의 부피까지 농축하였다.

상기 농축액에 최종농도가 30%가 되게 황산 암모늄 분말을 가하여 1시간동안 녹인 후 30분간 원심분리(JA14, 12000rpm, 15℃)하여 약 700㎖의 상층액을 얻었다. 상층액을 한외여과막(Amicon사 제품)을 이용하여 200㎖까지 농축한 후, 상기와 동일한 완충용액 20ℓ에 충분히 투석하고, 동일 완충용액으로 평형화한 S-세파로즈 칼럼(2.5cm x 10cm, Pharmacia)에 흡착시킨 다음, 50mM, 100mM 및 200mM 농도의 염화나트륨을 포함하는 상기 완충용액으로 세척하여 아미노 펩티다제를 용출시켰다.

용출된 아미노펩티다제를 10㎖용량의 농축기(Amicon Stirred Cell, MWCO 3KD)를 이용하여 0.5㎖까지 농축하고, 이를 100mM 트리스(pH 8.0) 및 6M 우레아를 포함하는 완충용액으로 평형화한 S-200 칼럼(1.2cm x 50cm)을 통해 젤 여과 칼럼 크로마토그래피하였다. 아미노펩티다제의 활성을 지닌 분획은 전체부피의 33% 내지 40% 사이에서 용출되었으며 전기영동(SDS-PAGE)을 통한 은 염색법으로 순도 99%의 아미노펩티다제임을 확인하였다.

[실시예 2] 아미노펩티다제의 특성 조사

1) 분자량 측정

제조된 아미노펩티다제의 분자량을 측정하기 위하여 이를 SDS-PAGE하여 그 결과를 제 2 도에 나타내었다. 제 2 도는 표준 단백질의 분자량과 최종적으로 정제된 아미노펩티다제의 환원된 상태에서의 분자량을 나타낸 것으로서 정제된 아미노펩티다제는 분자량이 약 63-66KD임을 확인하였다.

아미노펩티다제의 천연상태에서의 분자량을 측정하기 위하여 바이오실(Bio-Sil^TM) SEC-125(600mm x 7.5mm, Bio-Rad)칼럼을 사용하여 HPLC 젤 여과 칼럼 크로마토그래피를 실시하였다. 분자량 결정의 표준 단백질로는 아프로티닌(aprotinin, 6.5KD), 사이토크롬 C(cytochrome C, 12.4KD) 탄산 탈수효소(carbonic anhydrase : 29KD) 및 소 혈청 알부민(bovine serum albumin,66KD)을 사용하여 분자량의 표준 곡선을 결정하였다. 동일한 조건에서 아미노 펩티다제의 분배계수를 다음 식에 따라 측정하고 이로부터 아미노펩티다제의 분자량이 59KD 내지 61KD 범위에 드는 것을 확인하였다.

그 결과는 제 3 도에 나타내었으며, 이 결과와 전기 영동의 결과를 비교 분석하면 아미노펩티다제는 단량체 구조임을 알 수 있다.

2) 최적 pH 범위 측정

아미노펩티다제의 최적 pH는 pH7 내지 pH 10 구간에서 효소활성의 상대적인 비가 최적이 되는 pH를 결정하는 방법으로 측정하였다. 최적 pH 결정에 사용된 완충용액은 100mM 트리스이었으며 그 결과 본 발명에 따른 아미노펩티다제는 pH 8.0 내지 pH 10.0, 특히 pH 8.5 내지 pH 9.0에서 효소 활성이 가장 최적임을 확인하여 이를 제 4 도에 나타내었다.

3) 최적 온도 범위 측정

또한 아미노펩티다제 활성을 위한 최적 온도 조건을 확인하기 위해 25℃부터 시작하여 5℃ 간격으로 아미노펩티다제의 활성을 측정하였다. 각각의 온도에서 아미노펩티다제를 충분히 반응 완충용액에서 배양시킨 다음 L-Leu-pNA를 첨가하여 효소 활성도를 측정하는 방법으로 35 내지 55℃ 범위내에서 활성을 유지하고 45 내지 50℃범위에서는 최적의 활성을 보임을 확인하여 그 결과를 제 5 도에 나타내었다.

4) 아미노펩티다제 활성에 대한 용매의 영향

아미노펩티다제와 용매의 혼합물의 최종 농도를 아래 표 1에 명시된 것과 같은 농도가 되게 하고 혼합물을 저온실에서 24시간동안 방치시켜서 아미노펩티다제를 각 용매에 충분히 노출시켰다. 혼합물에 잔존하는 아미노펩티다제의 활성 측정을 위해 100mM 트리스(pH 8.0) 완충용액하에 L-Leu-pNA를 첨가하여 37℃에서 반응시켰다.

용매에 따른 아미노펩티다제의 활성은 용매를 처리하지 않은 아미노펩티다제의 활성을 100%로 하여 비교하고 그 결과를 표 1에 나타내었다. 그 결과를 보면, 아미노펩티다제는 1% 아세트산에 의한 산성 조건하에서는 활성을 96%나 소실하는 것으로 보아 낮은 pH는 활성유지에 치명적이며 분자내의 디설파이드 결합(disulfide bridge)이 활성유지에 필수적임을 머캅토에탄올 처리로부터 알 수 있었다. 1mM EDTA 처리에 의해 활성이 60%가 소실되며 2mM 1.10-페난트롤린 처리에 의해 활성이 94%나 소실되는 것으로 보아 메탈로-프로테아제(metallo-protease)임을 알 수 있었다.

5) 금속 이온 요구성 조사

아미노펩티다제의 활성유지에 관련된 금속이온의 종류를 확인해 보기 위한 실험은 다음과 같이 실시하였다. 아미노펩티다제에 1M EDTA 최종농도 10mM이 되도록 가하여 저온실에 2일간 방치한 후 완충액(10mM EDTA)에 충분히 투석하고 다시 센트리콘(Amicon, 미국)을 이용하여 100mM 트리스(pH 8.0) 완충용액으로 교환한 다음 다양한 금속이온을 최종 농도가 1mM이 되게 첨가한 반응용기에서 각각 동일한 양을 반응시켰다. 이때 EDTA를 처리하지 않은 동일한 양의 효소가 나타내는 활성을 100%로 하여 활성을 비교하고 그 결과를 표 2에 나타내었다. 코발트이온이 아미노펩티다제의 활성을 복구하는데 90%까지 기여함을 알았고 코발트이온이 아미노 펩티다제의 활성유지에 필수적임을 알 수 있었다.

6) 기질특이성 조사

아미노펩티다제의 기질특이성은 시그마사(Sigma, 미국)에서 구입한 합성 기질을 사용하여 측정하였다. 루이신, 메티오닌, 알라닌, 글리신-페닐알라닌, 라이신, 글리신, 글리신-프롤린, N-벤조일-발린-글리신-아르기닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린-루이신-아르기닌의 파라니트로아닐리드를 각각 최종 농도가 1mM이 되게 하여 100mM 트리스(pH8.0) 완충용액 중에서 아미노펩티다제와 37℃에서 반응시켰다. 기질에 따른 아미노펩티다제의 활성은 루이신-파라니트로아닐리드의 가수분해율을 100%로 하여 각 기질의 상대적 가수분해율을 비교함으로써 확인하였고 그 결과는 다음의 표 3에 나타내었다. 그 결과 아미노펩티다제는 L-Met에 대한 선택성이 다른 기질에 비해 매우 높은 것으로 나타났으며 이로 보아 본 발명의 아미노펩티다제는 단백질의 N-말단 메티오닌을 제거하는데 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

7) 아미노펩티다제 활성에 대한 효소억제제의 영향

일정량의 아미노펩티다제를 표 4에서 명시된 각 억제제들의 최종 농도에 해당하는 양과 혼합하여 37℃에서 20분간 사전에 반응시킨 후 각각에 최종 농도가 1mM인 L-Leu-pNA를 첨가하여 효소활성을 측정하였다. 그 결과 아미노펩티다제의 전형적인 억제제인 베스타틴 처리에 활성이 거의 소실됨을 발견하였다.

본 발명에서 제조된 아미노펩티다제로 유전자 재조합 메티오닐 인간 성장 호르몬의 N-말단 메티오닌기를 선택적으로 제거하는 실험을 실시하였다. 본 실시예에서 사용된 재조합 메티오닐 인간 성장 호르몬은 대한민국 특허출원 제 90-3465호에 명시된 방법으로 정제된 것이고, 그의 N-말단 아미노산 서열은 Met-Phe-Pro-Thr-Ile이다.

5단위의 아미노펩티다제와 1㎎의 인간 성장 호르몬을 반응 완충용액(100mM 트리스(pH 8.0), 1mM PMSF, 0.02% 나트륨 아지드(sodium azide))에 넣고 센트리콘(Centricon, Amicon)을 이용하여 충분히 투석시키고 37℃에서 15시간동안 반응시켰다. 이를 동일 완충용액으로 다시 투석시켜 5시간동안 추가로 반응을 진행하고 총 20시간이 경과하였을 때 반응을 중지하였다. 인간 성장 호르몬과 아미노펩티다제를 분리하기 위해 반응액을 50mM 인산 나트륨(pH 6.8) 완충용액에 투석한 다음 동일 완충용액으로 평형된 S-세파로즈 칼럼에 통과시켜서 인간 성장 호르몬을 회수하였다. 분리된 인간 성장 호르몬을 다시 순수한 물로 충분히 투석하고 아미노산 서열 분석법(김정호 외 3, 화학과 공업의 진보, vol. 31, No.6, 434-441(1991))에 의해 인간 성장 호르몬의 N-말단 아미노산을 조사한 결과, 첫 번째 아미노산은 페닐알라닌이고 두 번째 아미노산은 플롤린임을 확인하여 이를 제 6 도에 각각 나타내었다. 상기 결과로부터 본 발명의 아미노펩티다제가 루이신 아미노펩티다제의 전형적인 특성인 X-Pro 정지신호를 인지하는 것으로 확인할 수 있었다.

Claims (2)

1. 페니실리움 씨트리넘(Penicillium citrinum)으로부터 유래한, SDS-PAGE상에서의 분자량이 63 내지 66KD이고 천연상태의 분자량이 59 내지 61KD이며, pH 8.0내지 pH10.0에서 최적의 활성을 나타내고, 효소 활성유지에 코발트 이온을 필요로 하며, 45 내지 50℃범위에서 최적의 활성을 나타내는 아미노펩티다제.
2. 페니실리움 씨트리넘(Penicillium citrinum)을 배양하여 배양된 세포를 분쇄하고, 상기 세포 분쇄액을 원심분리하여 상충액을 얻고, 상기 상충액에 황산 암모늄을 용해시키고, 상기 황산 암모늄 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 및 젤 여과 크로마토그래피 함을 포함하는, 제 1 항의 아미노펩티다제의 제조방법.