JPH0413697A - 生理活性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はキモトリブシン阻害作用等を示す生理活性ペプ
チドに関するものである。

［従来の技術］ 微生物、各種臓器或は培養基等よりペプチド結合を有す
る種々の物質を分離・精製する場合、或は微生物を培養
してタンパク質等を作らせる場合、更に生体に対して各
種生理活性ペプチドを作用させる場合等において、プロ
テアーゼが存在することによってタンパク質の収率が低
下したり、或は目的タンパク質が全く得られなかったり
といったことはしばしば経験するところである。そこで
このような場合には温度を上げる・下げる、或は塩を加
える等の手段によってプロテアーゼ活性を抑制したり、
若しくは失活させるというようなことが行なわれている
。しかしこれらの方法ではプロテアーゼと同様にペプチ
ド結合を有するタンパク質である目的物質も何らかの影
響を受けることは避けられず、例えば微生物にタンパク
質を作らせる場合などでは微生物の生育が阻害されるこ
とも多い。

［発明が解決しようとするｌＩ題］ 上記の問題を解決するにはプロテアーゼだけに働く阻害
剤、即ちプロテアーゼインヒビターを利用することが考
えられる。

［課題を解決するための手段］ 本発明の生理活性ペプチドは次に示す理化学的特性を有
するものであることに要旨がある。

分子量：　ＳＤＳ電気電気心動る測定で約１０，４００
ＨＰＬＣによる測定で約１０，９００ 等電点：　７．１２ 生理活性：キモトリブシン阻害活性を有する［作用及び
実施例］ 本発明の生理活性物質は先側大学家蚕遺伝子資源センタ
ーが系統保存している家１ｊ蝕助１す吸口ｉ１０の血漿
より精製することができたもので、次のような理化学的
物性により特定することができる。

１）分子量：　ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
法による測定で約１０，４００．　ＨＰ　Ｌ　Ｃによる
測定で約１０．９（１Ｇ。

２）等電点：　７．１２ ３）Ｎ末端からの２０アミノ酸の推定１次構造：＾５ｐ
−Ｌｙｓ−ｆ’ｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−＾ｒｇ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−＾５ｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｙ４）生理活性：キモトリブシン阻害活性を示す。

（カゼインを基質に用いてＫｉ±１，３３μＭ） 更に実施例において示す様に優れた熱安定性及びｐＨ安
定性も有している。また生理活性においてもキそトリプ
シン阻害活性以外の生理活性も有することが期待されて
いる。

本発明の生理活性ペプチド（以下Ｃｌ−１と略す）は家
蚕血漿を原料とし、常法により精製して得ることができ
る。例えば、硫安塩析後、ＤＥＡＥ或はＣＭ−イオン交
換クロマトグラフィー及びキモトリブシンを用いたアフ
ィニティークロマトグラフィーを組み合せることによっ
て高純度に精製できる。更にアミノ酸のＮ−末端からの
一次構造が決定されたので、遺伝子を取り出すこと（単
離すること）が出来るようになり、遺伝子組み換え技術
を応用して大量生産することも可能である。

以下、実施例に基づいて具体的に説明する。

実施例１ く精製方法〉 匡對 シ」互び二μどユ１１０の幼虫５齢３日に血漿を採取し
、遠心分離によって血液細胞を取り除いたもの。

延ＩＬ近 上記家蚕血漿２０１１に硫酸アンモニウムを加え７０％
飽和で沈澱した沈澱物を遠心分離した。得られた沈澱物
に少量の０．０５Ｍクエン酸−クエン酸ナトリウムＩ！
衝液（ｐｕ４．ｓ）を加え溶解させた後、同緩衝液に対
して透析した。

イオン　　カラムクロマトグラフィー 前記クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液で平衡化させ
たＣＭ−５ｅｐｈａｄａｘ　Ｃ５０（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社製）カラム（２Ｘ　４０　Ｃｍ）に、硫安分画によ
って得た活性画分を通し、同緩衝液で洗浄後同緩衝液に
溶かしたＮａＣ１のＯ〜０．５Ｍの直線的濃度勾配によ
り溶出し、０．２６〜０．３８Ｍ　ＮａＣ１の範囲で溶
出するＣｌ−１の活性画分を得た。溶出パターンを第１
図に示す、濃縮後０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７，４）に対して透析し、遠心分離により上清を得
た。

アフィニティーカラムクロマトグラフィー前記リン酸ナ
トリウム［衝液で平衡化させたキそトリプシン結合５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カ
ラム（１ｘ　１０　ｃｍ）に前記上清を通し、同緩衝液
で洗浄した。０．１　Ｍ酢酸ナトリウム＆ｌ衝液（ＭＣ
ＩでｐＨ１，０に調整。０．５Ｍ　ＮａＣ１及び４ＭＵ
ｒｅａ含有）で溶出し、精製Ｃｌ−１を得た。溶出パタ
ーンを第２図に示す。

３４１表に各精製段階での体積、総タンパク質量、比活
性、総キモトリブシン阻害活性及び回収率を示す、尚、
キモトリブシン阻害活性の測定、Ｃｌ−１であることを
確認するための電気泳動及び活性染色は下記の方法で行
った。

〈実験方法〉 キモトリブシン阻害活　の測 Ｋｕｎｉｔｚらの方法（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、
３０，２９１−３１０゜１９４７）に基づいて行なった
。

試料溶液０．１　ｍｌを０．２２ｍ１のキそトリプシン
溶液（２００ｐｍｏｌｅ）に加え３７℃で１０分間イン
キュベーションした後、予め緩衝液に溶解したＨａｍｍ
ａｒｓｔｅｎカゼインを終濃度で３０　ｍｇ／ｍｌにな
る様に加えた。この時の反応液量は０．３２ｍ１とした
。

３７℃で１０分間反応させた後、トリクロロ酢酸を最終
で５％になるように加え、反応を停止し、反応液を遠心
分離した後、上滑の２８０ｎｍにおける吸光度（Ａｚａ
ｏ）を測定した。試料溶液を加えないものについても同
様の測定を行ない、試料溶液を加えないもののＡ２ａ０
をＡ１加えたもののＡ　２ａＯをＢとした場合、阻害活
性は（Ａ−Ｂ）／ＡＸ１００で表わされる。即ち、上述
した反応条件で４０　ｐｍｏｌｅのキモトリブシンを５
０％阻害する活性量をキモトリブシンインヒビタ−１隼
位（ｕ）　　とした。

アクリルアミドゲル　　泳動 Ｄａｖｉｓ、Ｂ、Ｊ、ａｎｄ　０ｒｎｓｔｅｉｎ、Ｌ、
らの方法（＾ｎｎ。

Ｎ、Ｙ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、１２１．＾ｒｔ　２，３２
１−３４９，４０４−４２７．１９１３４）に準じて行
なった。

活性染色 Ｌｌｒｉｅｌ　とＢ＠ｒｇｅｓの方法（Ｎａｔｕｒｅ　
２１８，５７８−５８０１９＋１８）により実施した。

この方法ではキモトリブシンの活性を示す部位が染色さ
れるので、染色されない部位、すなわちキモトリブシン
インヒビターの存在する部位は活性染色されずに白く抜
けることから、キモトリブシンインヒビターの存在部位
が明らかとなる。

第１表に示したように、原料より約２０％の回収率で、
比活性が約９４２倍を示す迄に精製された。尚、精製品
の比活性は１４，７１０ｕ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであ
った。

実施例２ く理化学的性質〉 実施例１で得た精製品を用いて次の分析及び試験を行な
った。

北上１ １）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測
定 Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ、２２７；６８０
，１９７０　）により１２．５％ｇｅｌｓＤｓ電気泳動
を行なった結果を第３図に示す、還元状態での分子量が
約１０，４００であることがわかった。

２）ＨＰＬＣ（非還元状態）による測定ＴＳＫｇｅｌ　
Ｇ　３０００５１　［東ソー■製、カラム（８×３０（
１＋＋ａ）］を用いて実施した結果を第４図に示す、非
還元状態（自然な状態）での分子量が約１０．９００で
あることがわかった。

以上の結果よりＣｌ−１は単量体であると推定される。

！１羞 ＾膳ｐｈｏｌｉｎｅ　　（ファルマシア社製）（２％Ｖ
／Ｖ　）を用いた６、４％ポリアクリルアミドゲルによ
るｐＨ３，５−１０のｐＨ勾配を持つ等電点ゲル電気泳
動を行ない（３００Ｖ、５ｈｒ）　、活性染色により泳
動位置を求めた。一方、同様に泳動した別のゲルを５鳳
■ずつスライスしてｐＨを測定し、泳動位置からキモト
リブシンインヒビターの等電点を求めた。結果を第５図
に示す０等電点は７．１２であることがわかった。

Ｎ末　からの２０アミノ酸の１次構 エドマン分解により１次構造を決定した。まず、アミノ
アシド　シークエンサー８９０　Ｍ／Ｅ（ベックマン社
製）を使用してフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）　
話導体を得、該銹導体をＯＤＳカラム（４，６Ｘ　２　
ｓ　Ｏｍｍ）　　［東ソー■製、１２０Ｔ］を用いたＨ
ＰＬＣにより同定し、Ｎ末端側２０残基のアミノ酸の１
次構造を決定した。

推定される１次構造は下言己の通りであった。

＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−ＧＩｎ−Ａｌ
ｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−＾５ｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ− 二エム鼠立逝 Ｍｏｏｒｅ　ａｎｄ　５ｔｅｉｎらの方法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６；８１９，１９６
３）に準じて行なう。即ち、精製された試料に０゜０５
％メルカプトエタノールを含むＦ　ｅ　Ｆｒｅｅの６Ｎ
−ＨＣＩを加え、１１０℃で２４時間加水分解した後、
アミノ酸自動分析計［日立■製、アミノアシドアナライ
ザー型６５５Ａ］を用いて構成アミノ酸比を求めた。Ｈ
ＰＬＣによる分子量の測定結果をもとに、各アミノ酸数
を推定した。結果を第２表に示す。

第２表より明らかなようにＭｅｔを含有していないとい
う特徴を有している。

第 表 １）ＨＰＬににより測定された分子量（１０，９００）
から推定したアミノ酸個数 ［キモトリブシンに対する阻害活性］ キモトリブシン（２００ｐｍｏｌｅ）に種々の量のｃｒ
−ｔを加え３７℃で１０分間インキュベーションした後
、カゼインを基質に用いてキモトリブシン活性を測定し
た。測定結果をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋの逆数
プロットにして第６図に示す０図より求められたＣｌ−
１のＫｉ値は１．３３μＭであった。

［キモトリブシンに対する１００％阻害比］キモトリブ
シン（２００ｐｍｏｌｅ）に種々の量のＣｌ−１を加え
３７℃で１０分間インキュベーションした後、カゼイン
を基質に用いてキモトリブシン活性を測定した。第７図
に阻害されたキモトリブシン量とＣｌ−１の量の関係を
示す。実験に使用したキモトリブシン（牛膵臓由来、Ｅ
Ｃ３４，２１，１）の分子量が２５，２００であるので
、ＨＰＬＣより推定された分子量１０，９００のＣｌ−
１のキモトリブシンに対する１００％阻害比［Ｉ／Ｅ］
はモル比で２．０８：１である。

生理活性 種々のプロテアーゼにＣｌ−１を反応させた後のプロテ
アーゼの残存活性を測定した。尚夫々のプロテアーゼの
使用量及び活性測定法は下記第３表の通りである。

第　　３　　表 果 表 結果を第４表に示す。

Ｃｌ−１はキモトリブシンに対して阻害活性を示し、他
のプロテアーゼに対しては殆んど阻害活性を示さなかっ
た。

ＬＪＪＱ【牲 ｐＨ２〜１２で室温に２４時間放置した後、キモトリブ
シンインヒビター活性がどのように変化するかを調べた
結果を第８図に示す。尚、本反応に用いた緩衝液は、ｐ
Ｈ２〜３はグリシン−塩酸緩衝液を、ｐＨ４〜５は酢酸
Ｍ衝液を、ｐＨ６〜７はリン酸緩衝液を、ｐＨ８〜９は
トリス−塩酸緩衝液を、ｐＨ１０〜１１はグリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液を、ｐＨ１２はグリコール−水酸
化ナトリウム緩衝液を夫々使用した。

図より、安定性が最も悪いと考えられるｐＨ２付近にお
いても８０％の阻害活性を維持しており、この生理活性
ペプチドが優れたｐＨ安定性を示すことがわかる。

旌支定旦 この生理活性ペプチドをリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に
溶解し、種々の温度で１０分間加熱処理した後の残存活
性を調べた。結果を第９図に示す。図より、９０℃で１
０分間処理を行なってもなお７０％のキモトリブシン阻
害活性が維持されており、本生理活性ペプチドが優れた
耐熱性を有していることがわかる。

５ｈｉｆｆ反応（Ｚａｃｃｈａｒｉａｓ、Ｒ，Ｊ、、Ｍ
ｏｒｉｓｓｏｎ、Ｊ、Ｈ。

ａｎｄ　Ｗｏｏｄｌｏｃｋ、Ｊ、Ｊ、、Ａｎａｌ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、、３１，１４８゜１９６９）が陰性であり
、またＣｌ−１を電気泳動後、１＃ｅｓｔｅｒｎ　ｂｌ
ｏｔで膜に移し、蛍光標識レクチン［Ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｉｎ　Ｌｅｃｔｉｎ　Ｋｉｔ　Ｉ（ベクター社製）
〕と反応させても蛍光バンドが無かった（陰性であった
）ことから、本生理活性ペプチドに糖鎖の結合はないと
考えられる。

［発明の効果］ 本発明のキモトリブシン阻害活性を有する生理活性ペプ
チドは上記のように優れたｐ）（安定性及び熱安定性を
有しており、その活性を種々の分野に応用できる。例え
ばペプチド結合を有する物質の生産及び精製の際に加え
ると収量を上げることができ、ペプチド結合を有する生
理活性物質と共存させることにより生理活性物質を経口
投与することができる可能性がある。

【図面の簡単な説明】

第１図はＣＭカラムクロマトグラフィーの溶出パターン
、第２図はアフィニティカラムクロマトグラフィーの熔
出パターン、第３図はＳＤＳ電気電気上動る分子量測定
結果を示す図、第４図はＨＰＬＣによる分子量測定結果
を示す図、第５図は等電点電気泳動の結果を示すグラフ
、第６図はＣｌ−１のカゼインを基質に用いた時のキモ
トリブシンの阻害活性を表わすグラフ、第７図はキモト
リブシンＩＭに対するＣｌ−１の阻害モル比［１／Ｅ］
を表わすグラフ、第８図はＣｌ−１のｐＨ安定性を示す
グラフ、第９図はＣｌ−１の熱安定性を示すグラフであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 　次に示す理化学的特性を有するものであることを特徴
   とする生理活性ペプチド。 分子量：ＳＤＳ電気泳動による測定で約１０，４００Ｈ
   ＰＬＣによる測定で約１０，９００ 等電点：７．１２ 生理活性：キモトリブシン阻害活性を有する