JPS5928394B2 - バクテリアからのエンドプロテイナ−ゼ−Ｌｙｓ−Ｃ、その取得法及びプロテイン及びペプチドの配列順序決定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 種々の目的、特にプロティン及びペプチドの所定位置の
分解にとって、例えば配列順序決定の分野において、一
定の位置で分解するエンドプロテイナーゼは工業的にも
学術的にも重要である。

すでにリジンのＣ末端でペプチド結合を分解する糸状菌
からのエンドプロテイナーゼは公知である。

しかしながらこの酵素は手にはいりに＜＜、従って要求
の程度にまにあわない状態である。

ところが、エンドプロテイナーゼーＬｙｓ−Ｃとして特
徴付けられる、同様な特異性の酵素がバクテリア中に見
い出され、これは他のバクテリアプロテアーゼとは明ら
かに異なる特性を有する。

本発明によるバクテリアからの新規のエンドプロテイナ
ーゼ−Ｌｙｓ Ｃは分子量３５０００〜３８０００ド
ルトンの連鎖からなり、至適ｐＨ７，７を有し、アプロ
チニンにより阻害され、アルファ２−マクログロブリン
、α、アンチトリプシン及びエチレンジアミン四酢酸に
より阻害されないということを特徴とする。

本発明による酵素は非還元条件下では凝集の傾向を示し
、この際酵素活性である分子量約１５００００ドルトン
のテトラマー及び約３０００００ドルトンのオクタマー
が形成する。

新規酵素の至適ｐＨは、アゾコール（Ａｚｏｃｏｌｌ）
法により３７℃で測定を行ない前記のようにｐＨ７，７
である。

電気分離法（Ｅｌｅｋｔｒｏｆｏｋｕｓｓｉｅｒｕｎｇ
）においてこの酵素は多くの帯域に分離し、これはほ
とんど全ｐＨ範囲に広がる。

この挙動はこれがグリコプロティンであることを示し；
酵素の等電点を決めることはできない。

すでに記載したように、アルファ、−マクログロブリン
、α１−アンチトリプシン及びエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）は最高で１０ モルまで阻害しない。

それに反しベンズアミジンは２．５ミＩＪモルで約５０
係を阻害し、ベンズアミジン濃度の上昇により７０係の
阻害を達成できる。

アプロチニンは完全な阻害を示す。

新しい酵素の基質特異性を第１表に示す。

２５℃でトシル−グリコシループロリル−リシル−ｐ−
ニトロアニリドを用いて測定したその比活性は約２５０
７ｍ９であるか、又は３７℃で約５０アヅコール単位／
〜酵素であった。

記載のりゾバクターからのプロテア−ゼ■と異なり本発
明による酵素はリジンのアミン位でなくて、カルボキシ
位で分解する。

この高い特異性はこの酵素で得られるフィブリン−分解
生成物のゲル−クロマトグラフィーにおいて表われるわ
ずかな数のバンドを示す。

第２表には従来リゾバクター中に見い出されたプロテア
ーゼに対する本発明酵素の差を示す。

本発明による酵素は、これら酵素を十分な量で形成する
微生物の培養液から、特にリゾバクチリアル（Ｌｙｓｏ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ）目の微生物、その中でも特にリ
ゾバクターセ−（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）科
、例えばリゾバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ）属〔
ミキソバクター（Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ ）とも言う〕
の微生物の培養液から常用の酵素精製法、例えば硫酸ア
ンモニウム分別、アセトン分別及びモレキュラーシーブ
・クロマトグラフィーによりほとんどの不純物から遊離
する。

他のプロテアーゼの分離は本発明により担体固定アルフ
ァ、−マクログロブリン−金属錯体での処理により達成
される。

この際、酵素精製にとって新規の方法は除去することの
困難な不純物、特に随伴プロテアーゼを分離し、一方本
発明によるエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃは溶液中に残
り、単離することができる。

本発明によるエンドプロテア−ゼＬｙｓ−Ｃの取得法は
、濾過し、又は自体公知法で精製した好適なバクテリア
株の培養液を担体固定アルファ２−マクログロブリン−
金属−錯体上でクロマトグラフィーにかけ、この酵素を
濾液から取得することよりなる。

前記のアルファ２−マクログロブリン−金属−錯体にお
いて金属はＺｎ、Ｃｏ、Ｎｉ又は／及びＣｕの群の二価
の金属からなる。

この錯体の利用及びその製造は特開昭５７−７９８８３
号明細書（特願昭５６−１４１１１５号明細書）中に詳
細に記載されている。

すでに記載したように、担体固定アルファ、−マクログ
ロブリン−金属−錯体での本発明の処置を直接培養液か
ら行なうことができる。

しかし、有利にはプロティンを他の物質から分離し、予
備分別を実施するのが有利である。

培養濾液からのプロティンの分離は有利に硫酸アンモニ
ウムでの沈殿により行なうこともできるし、又はその中
に含有される活性プロティンの酵素活性に影響を与えな
い、その他の常用のプロティン沈殿剤を使用することも
できる。

硫酸アンモニウムの添加において、これを有利に２．５
〜３．５モル、特に３〜３．２モルの濃度まで加える。

この際生じた沈殿を分離し、例えば濾過すると、この沈
殿は全活性を有する。

水でとかし、残りの硫酸アンモニウムを透析により除去
した後、このようにして得られた溶液をアルファ、−マ
クログロブリン−金属−錯体−クロマトグラフィーにか
けるか、又は更に予備精製することもできる。

更に予備精製が所望であれば、有利に硫酸アンモニウム
分別を実施することができ、この際２モル〜３モルの硫
酸アンモニウム濃度で沈殿したフラクションは所望の活
性を保持する。

この際、硫酸アンモニウムを第１工程で０．７〜１．３
モルまで添加し、この沈殿を分離し、次いで硫酸アンモ
ニウム濃度を３モル、有利に２，２５〜２．３２モルに
高め、この際得られた活性沈殿を常法で分離し、透析に
より、残った硫酸アンモニウムを除く。

このようにして得られた溶液を、アルファ、−マクログ
ロブリン−金属−錯体処理しない場合、更にアセトン分
別及びモレキュラーシーブ・クロマドグラフィーを予め
行なうこさもできる。

アセトン分別の場合０．３〜１，５容量、有利に０．５
〜１，２容量アセトンを添加することにより沈殿させ、
沈殿を分離し、更に１．２容量アセトンを加え、沈殿を
分離し、これを緩衝液ｐＨ７，５〜９中に溶かす。

緩衝液の濃度は有利に０．０１〜０．０５モルの間であ
る。

残りのアセトンを除去するための透析、及び場合により
得られた溶液の濃縮後、モレキュラーシーブ、例えば架
橋デキストラン、例えばセファデックス−Ｇ−１００を
介してクロマトグラフィーを行ない、この際所望の活性
はカラムから始めに溶離され、一方公知のＡＬ−１プロ
テイナーゼＩは最後の方に溶離される。

この溶離液を場合により濃縮後、担体固定アルファ、−
マクログロブリン−金属−錯体を介してクロマトグラフ
ィーにかけ、この際所望のエンドプロテイナーゼーＬｙ
ｓ−Ｃが通過する。

この溶離を０．０３〜０．０８モルの緩衝液濃度でｐＨ
範囲７．０〜８．５中で行なうのが有利である。

この範囲で作用する常用の緩衝液が好適であり、トリス
緩衝液、へペス（Ｈｅｐｅｓ、’緩衝液及び燐酸塩緩衝
液が有利である。

良好な結果はｐＨ６，５〜９及び緩衝剤含量０．０１〜
０．１モルで得られる。

この溶離液は純粋なエンドプロテイナーゼーＬｙｓ
Ｃ及び緩衝剤を含有し、直接凍結乾燥を行なうことがで
きる。

本発明による新規酵素は特にプロティン及びペプチドの
配列順序決定に使用可能である。

その非常に特異的な分解活性の故に、例えば凝血障害、
もしくはプロティン鎖の分解が放客される他の疾病にお
ける治療にも使用することができる。

次に本発明による新規酵素の特性をまとめて記載する。

１）活性（比活性）及び作用 比活性二基質としてトシル−グリシル−プロリル−リシ
ル−ｐ−ニトロアニリドを用いて測定。

２５℃にＴ ２５Ｕ／１ｎ９ ３７℃にて ５０Ｕ／ｌ１１ｇ 作用：リジン基のカルボキシル基末端でプロティンを分
解。

２）基質特異性 第１表参照 ３） ｐＨ値 基質をアゾコールとして 最適なｐＨ範囲ニア、５〜８ 安定なｐＨ範囲：６．５〜９ これらの値は基質によりその都度変わる。

至適ｐＨ：３７℃で７．７ ４）活性の測定法 例２参照 ５）温度範囲（活性に関して） 酵素はかなり熱安定性と思われるが、測定は２つの常用
の測定温度（２５℃及び３７℃）でのみ行なった。

６）ｐＨ，温度等による失格の条件： 測定せず ７）阻害／活性化／安定化 阻害される：アプロチニンにより（１ｏｏ％）ベンズア
ミジンにより（７０％まで） 阻害されない：α２−マクログロブリン、α。

−アンチトリプシン、ＥＤＴＡにより 活性剤：実験は行なったが未知 安定剤：実験は行なったが未知 ８）精製法 明細書中第９頁第１行〜１７行及び例１参照９）分子量 ３５０００〜３８０００ ドルトン １０）結晶構造及び元素分析 自己溶解のために現在実験不可能。

ディスク−電気泳動も自己溶解のために多くのバンドを
示す。

次に、実施例につき本発明による酵素の取得及びその決
定を詳細に説明する。

例１ リゾバククー・エンチモゲンスｓｓｐ、エンチモゲンス
（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｓ ｓｓ
ｐ。

ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｓ）ＤＳＭ １８９５ （ＡＴＣＣ
２７７９６）からのエンドプロテイナーゼーＬｙｓ−Ｃ
の取得出発物質：リゾバクター培養濾液２０６１リゾバ
クター培養液２０６１にゆっくりと固体硫酸アンモニウ
ムを３〜３２モルまで加え沈殿させる。

少量のフレーク状沈殿を濾過する。フィルター上の沈殿
物を少量の蒸留水に溶かし、固体硫酸アンモニウムを０
．９モル（１３〜３モル）まで加えて析出させ、遠心分
離する。

上澄液に硫酸アンモニウムを２２５〜２．３２モルまで
加えて沈殿させ、沈殿を濾過又は遠心分離し、これを蒸
留本釣４００ｍ１に溶かし、流水通水に対して透析する
。

透析液を一２０°Ｃの冷アセトン０．５〜１．２容量と
混合し、遠心分離する。

上澄液（透明）に更にアセトン１．２容量（出発容量か
ら計算）を加え、これを出来るだけ濃縮した状態で０．
０２５モルトリス緩衝液、ｐＨ９に溶かし、同じ緩衝液
１０１に対して透析する。

透析液を次の寸法のセファデックス−Ｑ−１００−カラ
ムにかける： 直径５ ｃｒｎ、長さ１５０ｃｒｒＬ１カラム容量約２
．９１０このカラムを０．０２５モルトリス緩衝液ｐＨ
９，０で平衡とし、溶離後同じ緩衝液で後洗浄する。

リゾバクタープロテアーゼがはじめに溶離する。

溶離後に固体硫酸アンモニウムを加え、３２モルとし、
析出させ、遠心分離する。

濃縮し溶解した沈殿を０．０５モルトリス緩衝液ｐＨ８
，０に対し透析する。

アガロースに共有結合するアルファ、−マクログロブリ
ン−Ｚｎ−錯体を更に精製するために使用する。

この相持材料１１０ｍ１をカラム（直径３α、長さ１７
．５Ｃｒｎ）中に充填し、０．０５モルトリス緩衝液、
ｐＨ８０で通過液中にプロティンが全く見い出されなく
なるまで洗浄する。

透析液を溶離させ、０．０５モルトリス緩衝液、ｐＨ８
，０で後洗浄する。

プロテア−ゼーＬｙｓ−Ｃは通過する。

通過液を０．０５モルグリシン、ｐＨ８，０で透析し、
同じ緩衝液で０．４ ｍ９ ／′ｒｎｌに希釈し、凍結
乾燥する。

全収量ニブロチイン５０〜１４０〜 プロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ６〜２３Ｕ／Ｉｎ９クロモチ
ームＴＨ活性〈０．２係 例２ エンドプロテイナーゼＬｙｓ Ｃの測定溶液の製造： １、 ０．０２５モルトリス緩衝液、０．００１モルＥ
ＤＴＡ、ｐＨ７，７ トリス緩衝剤０．３０３ ｇ、ＥＤＴＡ ３７．２ ｍ
ｇを２回蒸留した本釣８０ｍ１中に溶かし、２ＮＨＣ１
でｐＨを７．７に調節し、１００ｍ１に充填する。

２、クロモチーム−ＰＬ（１４フィクロモル／ｍｌ）ク
ロモチーム−ＰＬ９１１１ｇを２回蒸留した水１ｍｌ中
に溶かす。

３、エンドプロテイナーセ−Ｌｙｓ−Ｃ−溶液凍結乾燥
品１０〜を２回蒸留したＨ２Ｏ１Ｔｉｌ中に溶かす。

使用前に溶液１で１ ： １００に希釈する。

実施： ４０５ｎｍ１１ｃｒＩｌ半微量キユベツト、２５℃、テ
スト容量ＬＯ７ｍｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ リジン基のカルボキシル末端でプロティンを分解し
   、基質としてアゾコールを使用した場合の安定なｐＨ範
   囲は６５〜９で、最適なｐＨ範囲は７．５〜８であり、
   至適ｐＨは７．７であり、分子量３５０００〜３８００
   ０ドルトンの連鎖からなり、アプロチニンにより阻害さ
   れ、アルファ、−マクログロブリン、Ｃ１−アンチトリ
   プシン及びエチレンジアミン四酢酸により阻害されない
   、バクテリアからのエンドプロテイナーゼーＬｙｓ
   Ｃ８２リジン基のカルボキシル末端でプロティンを分解
   し、基質としてアゾコールを使用した場合の安定なｐＨ
   範囲は６．５〜９で、最適なｐＨ範囲は７．５〜８であ
   り、至適ｐＨは７．７であり、分子量３５０００〜３８
   ０００ドルトンの連鎖からなり、アプロチニンにより阻
   害され、アルファ２−マクログロブリン、Ｃ１−アンチ
   トリプシン及びエチレンジアミン四酢酸により阻害され
   ない、バクテリアからのエンドプロテイナーゼーＬｙｓ
   −Ｃを取得するために、濾過又は常法により予備精製
   された、微生物リゾバクター・エンチモゲンス５ｕｂｓ
   ｐ−エンチモゲンスＤＳＭ１８９５（ＡＴＣＣ２７７９
   ６）の培養液を担体に固定されたアルファ、−マクログ
   ロブリン−金属−錯体を介してクロマトグラフィーを行
   ない、濾液から酵素を取得することを特徴とするエンド
   プロテイナーゼーＬｙｓ Ｃの取得法。 ３０．０１〜０，１モル緩衝液、ｐＨ６，５〜９、中で
   クロマトグラフィーを行なう特許請求の範囲第２項記載
   の方法。 ４ リゾバクテリア培養体からの培養液を使用する特許
   請求の範囲第２項又は第３項記載の方法。 ５ 濾過した培養液からプロティンを硫酸アンモニウム
   により沈殿させ、この沈殿物を新たに１．３モル〜３モ
   ルの硫酸アンモニウムに溶解することにより分別し、こ
   の範囲で不溶性のフラクションを水にとかし、透析した
   後、１．２〜２．４容量のアセトンで分別する特許請求
   の範囲第２項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ６ アセトン分別の沈殿を溶かした後モレキュラー・シ
   ーブを介してクロマトグラフィーにかけ、クロマトグラ
   フィーの始めに溶離するプロティンフラクションをアル
   ファ２−マクログロブリン−金属−錯体−クロマトグラ
   フィーにかける特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ７ リジン基のカルボキシル末端でプロティンを分解し
   、基質としてアゾコールを使用した場合の安定なｐＨ範
   囲は６．５〜９で、最適なｐＨ範囲は７．５〜８であり
   、至適ｐＨは７．７であり、分子量３５０００〜３８０
   ００ドルトンの連鎖からなり、アプロチニンにより阻害
   され、アルファ、−マクログ吊プリン、α、−アンチト
   リプシン及びエチレンジアミン四酢酸により阻害されな
   い、バクテリアからのエンドプロテイナーゼーＬｙｓ
   −Ｃを使用することを特徴とするプロティン及びペプチ
   ドの配列順序決定法。