FI76374C - Endoproteinas-lys-c som erhaolles ur bakterier och foerfarande foer tillvaratagning av denna. - Google Patents

Description

7 6 3 7 4

Bakteereista saatava endoproteinaasi-lys-C ja menetelmä sen taiteenottamiseksi Määrätyistä kohdista pilkkovilla endoproteinaaseilla on teknistä ja tieteellistä mielenkiintoa eri tarkoituksiin, erityisesti proteiinien ja peptidien halutuksi pilkkomiseksi, erityisesti sekvenssimäärityksen puitteissa. Siten tunnetaan ennestään sienistä endoproteinaasi, joka pilkkoo peptidisidoksen lysiinin aminopäässä. Tämä entsyymi on kuitenkin vaikeasti saatavissa eikä sitä sen vuoksi ole käytettävissä halutussa määrin. Nyt on bakteereista löydetty yhtä spesifinen entsyymi, joka on tunnistettu endoprotei-naasi-lys-C:ksi ja joka ominaisuuksiltaan selvästi eroaa muista bakteeriperäisistä proteaaseista.

Keksinnön mukainen uusi bakteereista saatava endoproteinaasi-lys-C tunnetaan siitä, että se muodostuu ketjusta, jonka mo-lekyylipaino on 35 000-38 000 Daltonia, sen pH-optimi on arvossa 7,7 ja että aprotiniini ehkäisee, mutta alfa^-makro-globuliini, alfa^-antitrypsiini ja etyleenidiamiinietikka-happo eivät ehkäise sen vaikutusta.

Keksinnön mukaisella entsyymillä on taipumusta aggregoitumi-seen ei-pelkistävissä olosuhteissa, jolloin etupäässä muodostuu tetrameerejä, joiden molekyylipaino on noin 150 000 D ja oktameerejä, joiden molekyylipaino on noin 300 000 D, jotka ovat entsymaattisesti aktiivisia.

Uuden entsyymin pH-optimi on, kuten yllä on todettu, arvossa 7,7, määritettynä 37°C:ssa atsokoll-menetelmällä.

Elektrofokusoinnissa entsyymi hajoaa lukuisiin nauhoihin, jotka ulottuvat koko pH-alueen yli. Tästä voidaan päätellä, että kyseessä on glykoproteiini, joten entsyymin isosähköi-nen piste ei ole määritettävissä.

76374 2

Kuten yllä todettiin, ei alfa2~makroglobuliinilla, alfa^- antitrypsiinillä ja etyleenidiamiinitetraetikkahapolla -2 (EDTA:11a) ole alle lO M pitoisuudessa ehkäisevää vaikutusta. Bentsamidiini sen sijaan ehkäisee pitoisuudessa 2,5 mmoolia noin 50 %:sesti ja korottamalla bentsamidiinipitoi-suutta voidaan saavuttaa 70 %:nen ehkäisy. Aprotiniinilla saadaan täydellisen ehkäisevä vaikutus.

Uuden entsyymin substraattispesifisyys ilmenee taulukosta 1. Sen spesifinen aktiviteetti nousee tosyyli-glykyyli-prolyyli-lysyyli-p-nitroanilidilla 25°C:ssa mitattuna noin 25 yksik-köön/mg tai noin 50 atsokoll-yksikköön/mg entsyymiä 37°C:ssa.

Päin vastoin kuin lysobakteerilla saatu proteinaasi II,ei keksinnön mukainen entsyymi pilko aminohakuisesti vaan karboksyylihakuisesti lysiinin kohdalla. Korkea spesifisyys ilmenee myös sinä vähäisenä nauhalukumääränä, joka esiintyy tällä entsyymillä saadun fibriini-pilkkoutumistuotteen geeli-kromatografiässä.

Taulukko 1

Endoproteinaasi-lys-C:n substraattispesifisyys

Substraatti Endoproteinaasi-lys-C

_aikaansaa hajoamisen

Atsokoll +

Kaseiini +

Fibrinogeeni +

Hemoglobiini + TLME ++

Kromotsyymi PL ++ S 2251R ++

Tos-Arg-Me

Kromotsyymi TH

BAEE

Leu-pNA

Lys-pNA

ATEE

Insuliinin B-ketju + 3 76374

Lyhenteet: TLME = tosyyli-lysyyli-metyyliesteri BAEE = bentsoyyli-arbinyyli-etyyliesteri ATEE = arginyyli-tyrosyyli-etyyliesteri

Kromotsyymi PL = tosyyli-glykyyli-prolyyli-lysyyli-p-nitro- anilidi

Kromotsyymi TH = tosyyli-glykyyli-proplyyli-arginyyli-p- nitroanilidi

D

S 2251 = valyyli-leukyyli-lysyyli-p-nitroanilidi

Taulukosta 2 ilmenee keksinnön mukaisen entsyymin ja aikaisemmin lysobakteerista löydetyn proteaasin välinen ero.

i , 76374

α, - tic t <υ I

DP3 P I P 44 Φ 3 φ p

3 E C O P 3 P ,β P :3 P

p p p c >i£t ε o 44 β ι ε >1 Ο >i P Ρ >i :(0 C (0 C) 6 P >i c p c e»(0ö -η λ -η ίο >1 co •γη·η(0 <0Λί(0·Η ε ε ρ μ λ ε Ρ Ρ ο W Φ (0 π3 :iu tJ> -—' Ο Ο 3 >ι 3 β Ρ β 3 3 β β β ρ >( 0)1-1(03 Ρ 3 Ρ Ρ φ Ή Ρ 3 β 3 ρ Ρ 3 3 Ρ φ β φ Ρ Ρ Ε 3 >1 φ 44 Ρ 0)44440 3 3 3 3 3 3 44 >1 Ρ Ο 3 -Η Ρ 3 -Η (0 3 Ο) ·Η

3 ΗΛ Φ 3 C Id Μ > C C

Ρ (0 Ρ Μ ο 0) β o -rl O -rl ·Η -rl ·η

ΜΗ (0 <0 ·Η Ή ·ι~> * φ β 41 (0 01 >ι·Η C C

Η Ρ 44 >1 ο Ο :(0 ·Η ·Η ο -Ρ -Ρ ·Η ·Η :(0 m p +j μ^ερωρ^ΰ-ρ-ρ-Η-Ηε Q) 3 β ·Ρ ΌΟιΡΦ>ιΌΡΦΡ3 3 3 Ρ Οι Φ0)Ρ >1 (0 >1 0) >1 >ι Ο ·Ρ ® Ο >ι ΪΡ >ι u)l s ·(-> φ w ρ ρ ρ ρ a αρ - ρ j pip H O Ή •P (fl P 3 ε (0 Oi 3 tn 3 o 3 -P Q) rH φ

β Ρ H -P

3 0 3 O

44 Ρ Ρ β β Ρ 0) O 0) o o o

El E -ρ -Ρ I

OP I 3 3 -H

•ρ β ·Ρ ·Ρ E EC

Ρ P 44 3 Φ φ -H

44 -p 44 3 Ρ P -H

3 Ρ β 3 β β Ρ Φ Φ ·Ρ β 3 3 Φ os en ιλ ρ &η Ε-ι co ~ Ο II ·Ρ ο Ο -Η ·Η I rH η

β Ρ Ό 3 Φ Q I

cm Ρ φ φ Μ φ w

3 φ ϋ) 3 Q tnO

O O tr» —'—’ -p I O Ή 44 -P — ~ O O W O >1

44 P Q P tnQ-HQOPP

3 >1 p 3 p O 33 u Ρ ΪΡ O O P O 3 — O n 3 344 O O 03030 O QO· e 3 Φ O O O Ό O Ρ β O oo Ό β Oi EP H ΟΟβ·Ρ ΙΦ-ΡΦ O O σ' 3'^'Φ3Γ'ΌΡΟθ) S (N rH JilDHEft ,—100 " β ‘ r

0 (N en O

Ρ P CM 00 Φ · · E rH en en 3 cm m en β · i · · i 1 H’ H* H1 O · W oo oo oo u H 3 H H >i Ή

•H ·Ρ I

I I 3 3 -H

β β 3 3 3 φ φ 3 3 3 β β β β 3 •Η *Ρ -Η ·Η Ρ β Ρ 3 Ρ φ φ -Η Ρ 3 Ρ -Η Ρ Ρ φ >ι 3 >ι 3 Ο Ο Ρ >ι β >ι 3 Ρ Ρ Ο rH -H rH 3 Cl α Ρ ι φ ι φ α 3 Ρ 3 Ρ Ρ Ρ 0 Ρ Ο Ρ Ο I ΙΌ Ρ Ρ Φ Ρ Ρ Ρ β 3 Dj λ Di <! <C ω 5 76374

Keksinnön mukaista entsyymiä saadaan sellaisten mikro-organismien viljelmäliemistä, jotka muodostavat tätä entsyymiä riittävässä määrin, erityisesti Lysobacterales-lahkosta ja näistä edullisesti Lysobacteraceae-suvusta, esimerkiksi lajista Lysobacter (myös myksobakteeriksi kutsuttu) tavanomaisella entsyymin puhdistusmenetelmällä, kuten ammoniumsulfaattifraktioinnilla, asetonifraktioinnil-la ja molekyyliseulakromatografialla vapaana useimmista epäpuhtauksista. Muiden proteaasien erottaminen onnistuu keksinnön mukaisesti käsittelemällä kantajaan kiinnitetyllä alfa2-makroglobuliini-metallikompleksilla. Tällä entsyymi-puhdistuksessa uudella menettelytavalla erotetaan vaikeasti poistettavat epäpuhtaudet, erityisesti kuitenkin mukana seuraavat proteaasit, kun taas keksinnön mukainen endoprotei-naasi-lys-C jää liuokseen ja voidaan erottaa siitä.

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä endoprotei-naasi-lys-C ottamiseksi talteen on siten tunnusomaista, että kromatografoidaan suodatettua tai sinänsä tunnetulla menetelmällä puhdistettua sopivan bakteerikannan viljelmälientä kantajalle kiinnitetyllä alfa2-makroglobuliini-metalli-kompleksilla ja otetaan entsyymi talteen suodatteesta.

Edellä mainitussa alfa2-makroglobuliini-metallikompleksissa on metalli kaksiarvoinen sinkki, koboltti, nikkeli ja/tai kupari. Näiden kompleksien käyttöä ja niiden valmistusta on selostettu saksalaisessa patenttihakemuksessa P 30 34 043.3 lähemmin.

Kuten jo todettiin, voidaan keksinnön mukainen käsittely kantajaan kiinnitetyllä alfa2-makroglobuliini-metallikomplek-silla toteuttaa suoraan viljelyliemellä. On kuitenkin edullista ensin erottaa proteiinit muista aineista ja suorittaa esifraktionointi.

Proteiinien erottaminen viljelysuodoksesta suoritetaan edullisesti saostamalla ammoniumsulfaatilla joskin voidaan myös 6 76374 käyttää muita tavanomaisia proteiinin saostamisaineita, jotka eivät haittaa muiden siinä olevien aktiivisten proteiinien entymaattista aktiviteettia. Ammoniumsulfaattia lisättäessä lisätään sitä edullisesti väkevyyteen 2,5-3,5 M, edullisesti 3-3,2 M. Tällöin muodostuva sakka erotetaan, esimerkiksi poistetaan suodattamalla ja sisältää koko halutun aktiviteetin. Esiliuotuksen ja jäännösammoniumsulfaatin edullisen poistamisen jälkeen dialyysillä, voidaan näin saatu liuos saattaa alttiiksi joko alfa2“makrobloguliini-metallikompleksikromatografialle tai lisäesipuhdistukselle.

Mikäli vielä halutaan esipuhdistaa, suoritetaan edullisesti ammoniumsulfaattifraktionointi, jolloin ammoniumsulfaatti-pitoisuuksien 2 ja 3 M välillä saostuva fraktio sisältää halutun aktiviteetin. Tällöin lisätään edullisesti ensimmäisessä vaiheessa ammoniumsulfaattia 0,7-1,3 M, erotetaan sakka ja nostetaan ammoniumsulfaattipitoisuus arvoon 3 M, edullisesti arvoon 2,25-2,32 M, ja erotetaan saatu aktiivinen sakka tavanomaiseen tapaan ja puhdistetaan dialyysillä jäljellä olevasta ammoniumsulfaatista.

Mikäli näin saatua liuosta ei saateta altiiksi alfa2-makro-globuliini-metallikompleksikäsittelylle, voidaan siihen vielä liittää asetonifraktiointi ja molekyyliseulakromatografia. Asetonifraktiointitapauksessa saostetaan lisäämällä 0,3-1,5 tilavuutta, edullisesti 0,5-1,2 tilavuutta asetonia, erotetaan sakka ja lisätään vielä 1,2 tilavuutta asetonia, erotetaan sakka ja liuotetaan se puskuriin pH 7,5-9. Puskuri-pitoisuus on edullisesti 0,01-0,05 M. Jäännösasetonin poistamiseksi suoritetun dialyysin ja saadun liuoksen mahdollisen haihduttamisen jälkeen voidaan kromatografoida molekyyli-seulalla, esimerkiksi verkkoutetulla dekstraanilla, kuten Sephadex-G-100:11a, jolloin haluttu aktiviteetti eluoidaan ensin kolonnista, kun taas tunnettu AL-1 proteinaasi I eluoidaan vasta lopussa. Eluaatti kromatografoidaan, mahdollisesti väkevöittämisen jälkeen, kantajalle kiinnitetyllä alfa2-makroglobuliini-metallikompleksilla, jolloin etsitty 7 76374 endoproteinaasi-lys-C menee läpi. Eluointi tapahtuu edullisesti pH-alueella 7,0-8,5 puskuriväkevyydessä 0,03-0,08 M. Tavanomaiset tällä alueella toimivat puskuriaineet ovat sopivia, edullisia ovat tris-puskuri, hepes-puskuri ja fosfaatti-puskuri. Hyviä tuloksia saadaan pH-arvossa 6,5-9 ja puskuripitoisuudessa 0,01-0,1. Eluaatti sisältää puhdasta endoproteinaasi-lys-C:tä ja puskuria ja voidaan suoraan lyofilisoida.

Keksinnön mukainen uusi entsyymi on erityisen käyttökelpoinen proteiinin ja peptidien sekvenssimäärityksessä. Johtuen hyvin spesifisestä hajotusaktiviteetista voidaan sitä myös käyttää terapeuttisesti, esimerkiksi hyytymishäiriöissä tai muissa sairauksissa, joissa pyritään proteiiniketjujen pilkkoutumiseen.

Alla olevissa esimerkeissä havainnollistetaan keksinnön mukaisen entsyymin talteenottoa ja sen määritystä.

Esimerkki 1

Endoproteinaasi-lys-C:n talteenotto Lysobacter enzymogenes enzymogenes-kannasta DSM 1895 (ATCC 27796)_ Lähtömateriaali: 206 litraa lysobakteeri-vi1jelmäsuodosta 206 litraa lysobakteeri-viljelmäsuodosta saostettiin hitaasti 3-3,2 M ammoniumsulfaattia. Vähäinen höytälemäinen sakka poistettiin suodattamalla. Suodattimena oleva sakka liuotettiin pienellä määrällä tislattua vettä ja saostettiin 0,9 M (1,3-3 M) kiinteää ammoniumsulfaattia ja sentrifugoi-tiin. Jäännös saostettiin vielä 2,25-2,32 M ammoniumsulfaa-tista ja sakka suodatettiin tai sentrifugoitiin, liuotettiin se noin 400 ml:aan tislattua vettä ja dialysoitiin virtavalla vesijohtovedellä.

Dialysaattiin lisättiin 0,5-1,2 tilavuutta -20°C:sta kylmää asetonia ja poistettiin sentrifugoimalla. Jäännökseen (kirkas) lisättiin vielä 1,2 tilavuutta (lähtötilavuudesta β 76374 laskettuna) asetonia, sentrifugoitiin sakka pois ja liuotettiin se niin väkevänä kuin mahdollista 0,025 M:llä tris, pH 9 ja dialysoitiin 10 litralla samaa puskuria.

Dialysaatti otettiin Sephadex-G-100-kolonnille, jolla oli seuraavat mitat: 0 5 cm, pituus 150 cm, kolonnitilavuus noin 2,9 litraa.

Kolonni tasapainotettiin 0,025 Millä tris, pH 9,0 ja pestiin Saimalla puskurilla panostamisen jälkeen.

Aluksi eluoitiin lysobakteeri-proteaasia.

Eluaatti saostettiin kiinteällä 3,2 M ammoniumsulfaatilla ja sentrifugoitiin. Väkevänä saatu sakka dialysoitiin 0,05 Millä tris, pH 8,0.

Agaroosiin kovalenttisesti sitoutunutta alfa2-makroglobulii-ni-sinkkikompleksia käytettiin jatkopuhdistukseen. 110 ml tätä kantaja-ainetta pantiin halkaisijaltaan 3 cm:n suuruiseen kolonniin, jonka pituus oli 17,5 cm ja pestiin 0,05 Millä tris, pH 8,0, kunnes mitään proteiinia ei tullut ulos.

Sen jälkeen käsiteltiin dialysaattia ja pestiin jälkeen päin 0. 05 Millä tris, pH 8,0. Proteinaasi-lys-C virtasi läpi.

Läpivirtaus dialysoitiin 0,05 Millä glysiiniä, pH 8,0 ja laimennettiin 0,4 mg/ml samalla puskurilla ja lyofilisoitiin. Kokonaissaanto: noin 50-140 mg proteiinia 6-23 yksikköä/mg proteinaasi-lys-C kromozym TH aktiviteettia alle 0,2%.

Esimerkki 2

Endoproteinaasi-lys-C;n määritys Liuoksen valmistus: 1. 0,025 M tris, 0,001 M EDTA, pH 7,7 0,303 g tris, 37,2 mg EDTA liuotettiin noin 80 ml:aan kaksi kertaa tislattua vettä ja pH sovitettiin arvoon 7,7 2 N HCl 9 76374 ja täytettiin 100 ml:aan.

2. Chromozym-PL (14 yUM/ml) 9 mg Chromozym-PL liuotettiin 1 ml:aan kaksi kertaa tislattua vettä.

3. Endoproteinaasi-lys-C-liuos 10 mg lyofilisaattia liuotettiin yhteen ml:aan kaksi kertaa tislattua vettä. Ennen käyttöä laimennettiin liuoksella 1 1:100.

Toteutus: 405 nm 1 cm puolimikrokyvetti 25°C testitilavuus 1,07 ml

Ryvettiin pipetoitiin:

Liuosta 1 1 ml

Liuosta 2 0,05 ml sekoitus, noin 2 minuuttia lämpötilan säätö 25°C.

Liuos 3 0,02 ml sekoitus, lineaarisesta faasista laskettiin noin 5 minuutin jälkeen Δ E/min.

Laskenta: AE/min x 1,07 . ioo = yksikköä/ml endoproteinaasi-lys-C.

10,4 x 0,02

Claims (6)

76374

1. Bakteereista saatava endoproteinaasi-lys-C, tunnettu siitä, että se muodostuu ketjusta, jonka molekyylipaino on 35 000 - 38 000 Daltonia, sillä on pH-optimiarvo 7,7 ja että aprotiniini ehkäisee, mutta alfa -makroglobuliini, alfa - 2 1 antitrypsiini ja etyleenidiamiinitetraetikkahappo eivät ehkäise sen vaikutusta ja että se pilkkoo lysiinin C-päätteisessä päässä sekä että se on saatavissa bakteerikannasta Lysobacter enzymogenes ATCC 27796.

2. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen endoproteinaasi-lys-C :n ottamiseksi talteen, tunnettu siitä, että suodatettua tai tavanomaisilla menetelmillä esipuhdistettua sopivan bakteerikannan viljelmälientä kromatografoidaan kantajaan kiinnitetyllä alfa^-makroglobuliini-metallikompleksilla ja että entsyymi otetaan talteen suodatteesta.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatografoidaan 0,01-0,1 M puskurissa, jonka pH on 6,5-9.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään Lysobacterales-viljelystä saatua viljelmälientä.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 2-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini saostetaan vi1jelmäliemestä ammoniumsulfaatilla, sakka fraktioidaan uudelleenliuotuksen jälkeen 1,3 ja 3 M ammoniumsulfaatin välillä ja että tällä välillä liukenematon fraktio liuotetaan veteen ja asetonilla suoritetun dialyysin jälkeen fraktioidaan 1,2 ja 2,4 tilavuuden asetonia välillä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asetoni-fraktioinnin sakka liuotuksen jälkeen kromatografoidaan molekyyliseulalla ja kromatografoinnin alussa eluoitu proteiinifraktio saatetaan alttiiksi alfa -makro-globuliini-metallikompleksikromatografialie. n 76374