FI76374C - Endoproteinas-lys-c som erhaolles ur bakterier och foerfarande foer tillvaratagning av denna. - Google Patents
Endoproteinas-lys-c som erhaolles ur bakterier och foerfarande foer tillvaratagning av denna. Download PDFInfo
- Publication number
- FI76374C FI76374C FI812726A FI812726A FI76374C FI 76374 C FI76374 C FI 76374C FI 812726 A FI812726 A FI 812726A FI 812726 A FI812726 A FI 812726A FI 76374 C FI76374 C FI 76374C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- alpha
- macroglobulin
- solution
- precipitate
- lys
- Prior art date
Links
- 108010030544 Peptidyl-Lys metalloendopeptidase Proteins 0.000 title claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 4
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims description 3
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims description 3
- 150000004696 coordination complex Chemical class 0.000 claims description 3
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 3
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 241000863030 Lysobacter enzymogenes Species 0.000 claims description 2
- 241000947909 Xanthomonadales Species 0.000 claims description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 3
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YWAVLHZJMWEYTA-YDALLXLXSA-N ATEE Chemical compound O.CCOC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YWAVLHZJMWEYTA-YDALLXLXSA-N 0.000 description 2
- 108010027805 Azocoll Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010074800 chromozym PL Proteins 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- XWVNOUSQIVZZJK-ZDUSSCGKSA-N methyl (2s)-6-amino-2-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]hexanoate Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)OC)NS(=O)(=O)C1=CC=C(C)C=C1 XWVNOUSQIVZZJK-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- PEHDMKYTTRTXSH-UHFFFAOYSA-N n-[6-amino-1-(4-nitroanilino)-1-oxohexan-2-yl]-1-[2-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)NCC(=O)N1C(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)CCC1 PEHDMKYTTRTXSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- VJZRBVVLWLEXBB-VROPFNGYSA-N (2s)-n-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]-1-[2-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxamide;hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)NCC(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)CCC1 VJZRBVVLWLEXBB-VROPFNGYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010068307 Alpha-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000002572 Alpha-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000622007 Crotalus adamanteus Snake venom metalloproteinase adamalysin-2 Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010019957 Escherichia coli periplasmic proteinase Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 241000863031 Lysobacter Species 0.000 description 1
- 241000863434 Myxococcales Species 0.000 description 1
- GEJCIRQLMVVEDX-UHFFFAOYSA-N OOPO Chemical compound OOPO GEJCIRQLMVVEDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001453327 Xanthomonadaceae Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 108010018472 chromozym TH Proteins 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 125000001288 lysyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
7 6 3 7 4
Bakteereista saatava endoproteinaasi-lys-C ja menetelmä sen taiteenottamiseksi Määrätyistä kohdista pilkkovilla endoproteinaaseilla on teknistä ja tieteellistä mielenkiintoa eri tarkoituksiin, erityisesti proteiinien ja peptidien halutuksi pilkkomiseksi, erityisesti sekvenssimäärityksen puitteissa. Siten tunnetaan ennestään sienistä endoproteinaasi, joka pilkkoo peptidisidoksen lysiinin aminopäässä. Tämä entsyymi on kuitenkin vaikeasti saatavissa eikä sitä sen vuoksi ole käytettävissä halutussa määrin. Nyt on bakteereista löydetty yhtä spesifinen entsyymi, joka on tunnistettu endoprotei-naasi-lys-C:ksi ja joka ominaisuuksiltaan selvästi eroaa muista bakteeriperäisistä proteaaseista.
Keksinnön mukainen uusi bakteereista saatava endoproteinaasi-lys-C tunnetaan siitä, että se muodostuu ketjusta, jonka mo-lekyylipaino on 35 000-38 000 Daltonia, sen pH-optimi on arvossa 7,7 ja että aprotiniini ehkäisee, mutta alfa^-makro-globuliini, alfa^-antitrypsiini ja etyleenidiamiinietikka-happo eivät ehkäise sen vaikutusta.
Keksinnön mukaisella entsyymillä on taipumusta aggregoitumi-seen ei-pelkistävissä olosuhteissa, jolloin etupäässä muodostuu tetrameerejä, joiden molekyylipaino on noin 150 000 D ja oktameerejä, joiden molekyylipaino on noin 300 000 D, jotka ovat entsymaattisesti aktiivisia.
Uuden entsyymin pH-optimi on, kuten yllä on todettu, arvossa 7,7, määritettynä 37°C:ssa atsokoll-menetelmällä.
Elektrofokusoinnissa entsyymi hajoaa lukuisiin nauhoihin, jotka ulottuvat koko pH-alueen yli. Tästä voidaan päätellä, että kyseessä on glykoproteiini, joten entsyymin isosähköi-nen piste ei ole määritettävissä.
76374 2
Kuten yllä todettiin, ei alfa2~makroglobuliinilla, alfa^- antitrypsiinillä ja etyleenidiamiinitetraetikkahapolla -2 (EDTA:11a) ole alle lO M pitoisuudessa ehkäisevää vaikutusta. Bentsamidiini sen sijaan ehkäisee pitoisuudessa 2,5 mmoolia noin 50 %:sesti ja korottamalla bentsamidiinipitoi-suutta voidaan saavuttaa 70 %:nen ehkäisy. Aprotiniinilla saadaan täydellisen ehkäisevä vaikutus.
Uuden entsyymin substraattispesifisyys ilmenee taulukosta 1. Sen spesifinen aktiviteetti nousee tosyyli-glykyyli-prolyyli-lysyyli-p-nitroanilidilla 25°C:ssa mitattuna noin 25 yksik-köön/mg tai noin 50 atsokoll-yksikköön/mg entsyymiä 37°C:ssa.
Päin vastoin kuin lysobakteerilla saatu proteinaasi II,ei keksinnön mukainen entsyymi pilko aminohakuisesti vaan karboksyylihakuisesti lysiinin kohdalla. Korkea spesifisyys ilmenee myös sinä vähäisenä nauhalukumääränä, joka esiintyy tällä entsyymillä saadun fibriini-pilkkoutumistuotteen geeli-kromatografiässä.
Taulukko 1
Endoproteinaasi-lys-C:n substraattispesifisyys
Substraatti Endoproteinaasi-lys-C
_aikaansaa hajoamisen
Atsokoll +
Kaseiini +
Fibrinogeeni +
Hemoglobiini + TLME ++
Kromotsyymi PL ++ S 2251R ++
Tos-Arg-Me
Kromotsyymi TH
BAEE
Leu-pNA
Lys-pNA
ATEE
Insuliinin B-ketju + 3 76374
Lyhenteet: TLME = tosyyli-lysyyli-metyyliesteri BAEE = bentsoyyli-arbinyyli-etyyliesteri ATEE = arginyyli-tyrosyyli-etyyliesteri
Kromotsyymi PL = tosyyli-glykyyli-prolyyli-lysyyli-p-nitro- anilidi
Kromotsyymi TH = tosyyli-glykyyli-proplyyli-arginyyli-p- nitroanilidi
D
S 2251 = valyyli-leukyyli-lysyyli-p-nitroanilidi
Taulukosta 2 ilmenee keksinnön mukaisen entsyymin ja aikaisemmin lysobakteerista löydetyn proteaasin välinen ero.
i , 76374
α, - tic t <υ I
DP3 P I P 44 Φ 3 φ p
3 E C O P 3 P ,β P :3 P
p p p c >i£t ε o 44 β ι ε >1 Ο >i P Ρ >i :(0 C (0 C) 6 P >i c p c e»(0ö -η λ -η ίο >1 co •γη·η(0 <0Λί(0·Η ε ε ρ μ λ ε Ρ Ρ ο W Φ (0 π3 :iu tJ> -—' Ο Ο 3 >ι 3 β Ρ β 3 3 β β β ρ >( 0)1-1(03 Ρ 3 Ρ Ρ φ Ή Ρ 3 β 3 ρ Ρ 3 3 Ρ φ β φ Ρ Ρ Ε 3 >1 φ 44 Ρ 0)44440 3 3 3 3 3 3 44 >1 Ρ Ο 3 -Η Ρ 3 -Η (0 3 Ο) ·Η
3 ΗΛ Φ 3 C Id Μ > C C
Ρ (0 Ρ Μ ο 0) β o -rl O -rl ·Η -rl ·η
ΜΗ (0 <0 ·Η Ή ·ι~> * φ β 41 (0 01 >ι·Η C C
Η Ρ 44 >1 ο Ο :(0 ·Η ·Η ο -Ρ -Ρ ·Η ·Η :(0 m p +j μ^ερωρ^ΰ-ρ-ρ-Η-Ηε Q) 3 β ·Ρ ΌΟιΡΦ>ιΌΡΦΡ3 3 3 Ρ Οι Φ0)Ρ >1 (0 >1 0) >1 >ι Ο ·Ρ ® Ο >ι ΪΡ >ι u)l s ·(-> φ w ρ ρ ρ ρ a αρ - ρ j pip H O Ή •P (fl P 3 ε (0 Oi 3 tn 3 o 3 -P Q) rH φ
β Ρ H -P
3 0 3 O
44 Ρ Ρ β β Ρ 0) O 0) o o o
El E -ρ -Ρ I
OP I 3 3 -H
•ρ β ·Ρ ·Ρ E EC
Ρ P 44 3 Φ φ -H
44 -p 44 3 Ρ P -H
3 Ρ β 3 β β Ρ Φ Φ ·Ρ β 3 3 Φ os en ιλ ρ &η Ε-ι co ~ Ο II ·Ρ ο Ο -Η ·Η I rH η
β Ρ Ό 3 Φ Q I
cm Ρ φ φ Μ φ w
3 φ ϋ) 3 Q tnO
O O tr» —'—’ -p I O Ή 44 -P — ~ O O W O >1
44 P Q P tnQ-HQOPP
3 >1 p 3 p O 33 u Ρ ΪΡ O O P O 3 — O n 3 344 O O 03030 O QO· e 3 Φ O O O Ό O Ρ β O oo Ό β Oi EP H ΟΟβ·Ρ ΙΦ-ΡΦ O O σ' 3'^'Φ3Γ'ΌΡΟθ) S (N rH JilDHEft ,—100 " β ‘ r
0 (N en O
Ρ P CM 00 Φ · · E rH en en 3 cm m en β · i · · i 1 H’ H* H1 O · W oo oo oo u H 3 H H >i Ή
•H ·Ρ I
I I 3 3 -H
β β 3 3 3 φ φ 3 3 3 β β β β 3 •Η *Ρ -Η ·Η Ρ β Ρ 3 Ρ φ φ -Η Ρ 3 Ρ -Η Ρ Ρ φ >ι 3 >ι 3 Ο Ο Ρ >ι β >ι 3 Ρ Ρ Ο rH -H rH 3 Cl α Ρ ι φ ι φ α 3 Ρ 3 Ρ Ρ Ρ 0 Ρ Ο Ρ Ο I ΙΌ Ρ Ρ Φ Ρ Ρ Ρ β 3 Dj λ Di <! <C ω 5 76374
Keksinnön mukaista entsyymiä saadaan sellaisten mikro-organismien viljelmäliemistä, jotka muodostavat tätä entsyymiä riittävässä määrin, erityisesti Lysobacterales-lahkosta ja näistä edullisesti Lysobacteraceae-suvusta, esimerkiksi lajista Lysobacter (myös myksobakteeriksi kutsuttu) tavanomaisella entsyymin puhdistusmenetelmällä, kuten ammoniumsulfaattifraktioinnilla, asetonifraktioinnil-la ja molekyyliseulakromatografialla vapaana useimmista epäpuhtauksista. Muiden proteaasien erottaminen onnistuu keksinnön mukaisesti käsittelemällä kantajaan kiinnitetyllä alfa2-makroglobuliini-metallikompleksilla. Tällä entsyymi-puhdistuksessa uudella menettelytavalla erotetaan vaikeasti poistettavat epäpuhtaudet, erityisesti kuitenkin mukana seuraavat proteaasit, kun taas keksinnön mukainen endoprotei-naasi-lys-C jää liuokseen ja voidaan erottaa siitä.
Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä endoprotei-naasi-lys-C ottamiseksi talteen on siten tunnusomaista, että kromatografoidaan suodatettua tai sinänsä tunnetulla menetelmällä puhdistettua sopivan bakteerikannan viljelmälientä kantajalle kiinnitetyllä alfa2-makroglobuliini-metalli-kompleksilla ja otetaan entsyymi talteen suodatteesta.
Edellä mainitussa alfa2-makroglobuliini-metallikompleksissa on metalli kaksiarvoinen sinkki, koboltti, nikkeli ja/tai kupari. Näiden kompleksien käyttöä ja niiden valmistusta on selostettu saksalaisessa patenttihakemuksessa P 30 34 043.3 lähemmin.
Kuten jo todettiin, voidaan keksinnön mukainen käsittely kantajaan kiinnitetyllä alfa2-makroglobuliini-metallikomplek-silla toteuttaa suoraan viljelyliemellä. On kuitenkin edullista ensin erottaa proteiinit muista aineista ja suorittaa esifraktionointi.
Proteiinien erottaminen viljelysuodoksesta suoritetaan edullisesti saostamalla ammoniumsulfaatilla joskin voidaan myös 6 76374 käyttää muita tavanomaisia proteiinin saostamisaineita, jotka eivät haittaa muiden siinä olevien aktiivisten proteiinien entymaattista aktiviteettia. Ammoniumsulfaattia lisättäessä lisätään sitä edullisesti väkevyyteen 2,5-3,5 M, edullisesti 3-3,2 M. Tällöin muodostuva sakka erotetaan, esimerkiksi poistetaan suodattamalla ja sisältää koko halutun aktiviteetin. Esiliuotuksen ja jäännösammoniumsulfaatin edullisen poistamisen jälkeen dialyysillä, voidaan näin saatu liuos saattaa alttiiksi joko alfa2“makrobloguliini-metallikompleksikromatografialle tai lisäesipuhdistukselle.
Mikäli vielä halutaan esipuhdistaa, suoritetaan edullisesti ammoniumsulfaattifraktionointi, jolloin ammoniumsulfaatti-pitoisuuksien 2 ja 3 M välillä saostuva fraktio sisältää halutun aktiviteetin. Tällöin lisätään edullisesti ensimmäisessä vaiheessa ammoniumsulfaattia 0,7-1,3 M, erotetaan sakka ja nostetaan ammoniumsulfaattipitoisuus arvoon 3 M, edullisesti arvoon 2,25-2,32 M, ja erotetaan saatu aktiivinen sakka tavanomaiseen tapaan ja puhdistetaan dialyysillä jäljellä olevasta ammoniumsulfaatista.
Mikäli näin saatua liuosta ei saateta altiiksi alfa2-makro-globuliini-metallikompleksikäsittelylle, voidaan siihen vielä liittää asetonifraktiointi ja molekyyliseulakromatografia. Asetonifraktiointitapauksessa saostetaan lisäämällä 0,3-1,5 tilavuutta, edullisesti 0,5-1,2 tilavuutta asetonia, erotetaan sakka ja lisätään vielä 1,2 tilavuutta asetonia, erotetaan sakka ja liuotetaan se puskuriin pH 7,5-9. Puskuri-pitoisuus on edullisesti 0,01-0,05 M. Jäännösasetonin poistamiseksi suoritetun dialyysin ja saadun liuoksen mahdollisen haihduttamisen jälkeen voidaan kromatografoida molekyyli-seulalla, esimerkiksi verkkoutetulla dekstraanilla, kuten Sephadex-G-100:11a, jolloin haluttu aktiviteetti eluoidaan ensin kolonnista, kun taas tunnettu AL-1 proteinaasi I eluoidaan vasta lopussa. Eluaatti kromatografoidaan, mahdollisesti väkevöittämisen jälkeen, kantajalle kiinnitetyllä alfa2-makroglobuliini-metallikompleksilla, jolloin etsitty 7 76374 endoproteinaasi-lys-C menee läpi. Eluointi tapahtuu edullisesti pH-alueella 7,0-8,5 puskuriväkevyydessä 0,03-0,08 M. Tavanomaiset tällä alueella toimivat puskuriaineet ovat sopivia, edullisia ovat tris-puskuri, hepes-puskuri ja fosfaatti-puskuri. Hyviä tuloksia saadaan pH-arvossa 6,5-9 ja puskuripitoisuudessa 0,01-0,1. Eluaatti sisältää puhdasta endoproteinaasi-lys-C:tä ja puskuria ja voidaan suoraan lyofilisoida.
Keksinnön mukainen uusi entsyymi on erityisen käyttökelpoinen proteiinin ja peptidien sekvenssimäärityksessä. Johtuen hyvin spesifisestä hajotusaktiviteetista voidaan sitä myös käyttää terapeuttisesti, esimerkiksi hyytymishäiriöissä tai muissa sairauksissa, joissa pyritään proteiiniketjujen pilkkoutumiseen.
Alla olevissa esimerkeissä havainnollistetaan keksinnön mukaisen entsyymin talteenottoa ja sen määritystä.
Esimerkki 1
Endoproteinaasi-lys-C:n talteenotto Lysobacter enzymogenes enzymogenes-kannasta DSM 1895 (ATCC 27796)_ Lähtömateriaali: 206 litraa lysobakteeri-vi1jelmäsuodosta 206 litraa lysobakteeri-viljelmäsuodosta saostettiin hitaasti 3-3,2 M ammoniumsulfaattia. Vähäinen höytälemäinen sakka poistettiin suodattamalla. Suodattimena oleva sakka liuotettiin pienellä määrällä tislattua vettä ja saostettiin 0,9 M (1,3-3 M) kiinteää ammoniumsulfaattia ja sentrifugoi-tiin. Jäännös saostettiin vielä 2,25-2,32 M ammoniumsulfaa-tista ja sakka suodatettiin tai sentrifugoitiin, liuotettiin se noin 400 ml:aan tislattua vettä ja dialysoitiin virtavalla vesijohtovedellä.
Dialysaattiin lisättiin 0,5-1,2 tilavuutta -20°C:sta kylmää asetonia ja poistettiin sentrifugoimalla. Jäännökseen (kirkas) lisättiin vielä 1,2 tilavuutta (lähtötilavuudesta β 76374 laskettuna) asetonia, sentrifugoitiin sakka pois ja liuotettiin se niin väkevänä kuin mahdollista 0,025 M:llä tris, pH 9 ja dialysoitiin 10 litralla samaa puskuria.
Dialysaatti otettiin Sephadex-G-100-kolonnille, jolla oli seuraavat mitat: 0 5 cm, pituus 150 cm, kolonnitilavuus noin 2,9 litraa.
Kolonni tasapainotettiin 0,025 Millä tris, pH 9,0 ja pestiin Saimalla puskurilla panostamisen jälkeen.
Aluksi eluoitiin lysobakteeri-proteaasia.
Eluaatti saostettiin kiinteällä 3,2 M ammoniumsulfaatilla ja sentrifugoitiin. Väkevänä saatu sakka dialysoitiin 0,05 Millä tris, pH 8,0.
Agaroosiin kovalenttisesti sitoutunutta alfa2-makroglobulii-ni-sinkkikompleksia käytettiin jatkopuhdistukseen. 110 ml tätä kantaja-ainetta pantiin halkaisijaltaan 3 cm:n suuruiseen kolonniin, jonka pituus oli 17,5 cm ja pestiin 0,05 Millä tris, pH 8,0, kunnes mitään proteiinia ei tullut ulos.
Sen jälkeen käsiteltiin dialysaattia ja pestiin jälkeen päin 0. 05 Millä tris, pH 8,0. Proteinaasi-lys-C virtasi läpi.
Läpivirtaus dialysoitiin 0,05 Millä glysiiniä, pH 8,0 ja laimennettiin 0,4 mg/ml samalla puskurilla ja lyofilisoitiin. Kokonaissaanto: noin 50-140 mg proteiinia 6-23 yksikköä/mg proteinaasi-lys-C kromozym TH aktiviteettia alle 0,2%.
Esimerkki 2
Endoproteinaasi-lys-C;n määritys Liuoksen valmistus: 1. 0,025 M tris, 0,001 M EDTA, pH 7,7 0,303 g tris, 37,2 mg EDTA liuotettiin noin 80 ml:aan kaksi kertaa tislattua vettä ja pH sovitettiin arvoon 7,7 2 N HCl 9 76374 ja täytettiin 100 ml:aan.
2. Chromozym-PL (14 yUM/ml) 9 mg Chromozym-PL liuotettiin 1 ml:aan kaksi kertaa tislattua vettä.
3. Endoproteinaasi-lys-C-liuos 10 mg lyofilisaattia liuotettiin yhteen ml:aan kaksi kertaa tislattua vettä. Ennen käyttöä laimennettiin liuoksella 1 1:100.
Toteutus: 405 nm 1 cm puolimikrokyvetti 25°C testitilavuus 1,07 ml
Ryvettiin pipetoitiin:
Liuosta 1 1 ml
Liuosta 2 0,05 ml sekoitus, noin 2 minuuttia lämpötilan säätö 25°C.
Liuos 3 0,02 ml sekoitus, lineaarisesta faasista laskettiin noin 5 minuutin jälkeen Δ E/min.
Laskenta: AE/min x 1,07 . ioo = yksikköä/ml endoproteinaasi-lys-C.
10,4 x 0,02
Claims (6)
1. Bakteereista saatava endoproteinaasi-lys-C, tunnettu siitä, että se muodostuu ketjusta, jonka molekyylipaino on 35 000 - 38 000 Daltonia, sillä on pH-optimiarvo 7,7 ja että aprotiniini ehkäisee, mutta alfa -makroglobuliini, alfa - 2 1 antitrypsiini ja etyleenidiamiinitetraetikkahappo eivät ehkäise sen vaikutusta ja että se pilkkoo lysiinin C-päätteisessä päässä sekä että se on saatavissa bakteerikannasta Lysobacter enzymogenes ATCC 27796.
2. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen endoproteinaasi-lys-C :n ottamiseksi talteen, tunnettu siitä, että suodatettua tai tavanomaisilla menetelmillä esipuhdistettua sopivan bakteerikannan viljelmälientä kromatografoidaan kantajaan kiinnitetyllä alfa^-makroglobuliini-metallikompleksilla ja että entsyymi otetaan talteen suodatteesta.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatografoidaan 0,01-0,1 M puskurissa, jonka pH on 6,5-9.
4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään Lysobacterales-viljelystä saatua viljelmälientä.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 2-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini saostetaan vi1jelmäliemestä ammoniumsulfaatilla, sakka fraktioidaan uudelleenliuotuksen jälkeen 1,3 ja 3 M ammoniumsulfaatin välillä ja että tällä välillä liukenematon fraktio liuotetaan veteen ja asetonilla suoritetun dialyysin jälkeen fraktioidaan 1,2 ja 2,4 tilavuuden asetonia välillä.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asetoni-fraktioinnin sakka liuotuksen jälkeen kromatografoidaan molekyyliseulalla ja kromatografoinnin alussa eluoitu proteiinifraktio saatetaan alttiiksi alfa -makro-globuliini-metallikompleksikromatografialie. n 76374
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19803034045 DE3034045A1 (de) | 1980-09-10 | 1980-09-10 | Endoproteinase-lys-c aus bakterien, verfahren zu ihrer gewinnung und verwendung |
| DE3034045 | 1980-09-10 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI812726L FI812726L (fi) | 1982-03-11 |
| FI76374B FI76374B (fi) | 1988-06-30 |
| FI76374C true FI76374C (fi) | 1988-10-10 |
Family
ID=6111580
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI812726A FI76374C (fi) | 1980-09-10 | 1981-09-03 | Endoproteinas-lys-c som erhaolles ur bakterier och foerfarande foer tillvaratagning av denna. |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4414332A (fi) |
| JP (1) | JPS5928394B2 (fi) |
| AT (1) | AT384622B (fi) |
| BE (1) | BE890259A (fi) |
| CA (1) | CA1172979A (fi) |
| CH (1) | CH651061A5 (fi) |
| DE (1) | DE3034045A1 (fi) |
| DK (1) | DK151635C (fi) |
| ES (1) | ES8301275A1 (fi) |
| FI (1) | FI76374C (fi) |
| FR (1) | FR2489838A1 (fi) |
| GB (1) | GB2083477B (fi) |
| HU (1) | HU185454B (fi) |
| IT (1) | IT1138134B (fi) |
| LU (1) | LU83627A1 (fi) |
| NL (1) | NL186645C (fi) |
| NO (1) | NO161684C (fi) |
| SE (1) | SE447908B (fi) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3034043A1 (de) * | 1980-09-10 | 1982-04-22 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur selektiven abtrennung von endoproteasen |
| US4749511A (en) * | 1986-07-31 | 1988-06-07 | Genencor, Inc. | Contact lens cleaning solutions containing endoproteinase lys-C |
| JPH0669399B2 (ja) * | 1988-03-15 | 1994-09-07 | 三菱化成株式会社 | カルボキシル末端ペプチドの分取方法 |
| AU9341398A (en) * | 1997-08-22 | 1999-03-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Protease precursors that can be autocatalytically activated and their use |
| EP1402050B1 (en) | 2001-06-15 | 2014-10-29 | F. Hoffmann-La Roche AG | Recombinant production of peptidic antiviral fusion inhibitors |
| US7785825B2 (en) | 2004-01-12 | 2010-08-31 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Compositions and methods for dehydration and cyclization of peptides, synthetic compounds, and lantibiotics |
| CN103865836B (zh) * | 2013-12-19 | 2015-03-11 | 中国人民解放军总医院 | 一种产酶溶杆菌突变菌株及其制备方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3515641A (en) * | 1966-12-05 | 1970-06-02 | Canadian Patents Dev | Proteolytic enzymes |
| JPS5244061Y2 (fi) * | 1974-02-25 | 1977-10-06 | ||
| JPS5243784A (en) * | 1975-10-02 | 1977-04-06 | Ebara Infilco Co Ltd | Water-making unit |
| JPS5731928Y2 (fi) * | 1978-04-29 | 1982-07-14 |
-
1980
- 1980-09-10 DE DE19803034045 patent/DE3034045A1/de active Granted
-
1981
- 1981-07-09 AT AT0303781A patent/AT384622B/de not_active IP Right Cessation
- 1981-07-27 NL NLAANVRAGE8103540,A patent/NL186645C/xx not_active IP Right Cessation
- 1981-08-03 IT IT23351/81A patent/IT1138134B/it active
- 1981-08-06 CA CA000383349A patent/CA1172979A/en not_active Expired
- 1981-08-14 SE SE8104840A patent/SE447908B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-08-19 ES ES504834A patent/ES8301275A1/es not_active Expired
- 1981-08-20 DK DK369781A patent/DK151635C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-08-28 US US06/297,480 patent/US4414332A/en not_active Expired - Lifetime
- 1981-09-01 GB GB8126512A patent/GB2083477B/en not_active Expired
- 1981-09-03 FI FI812726A patent/FI76374C/fi not_active IP Right Cessation
- 1981-09-03 CH CH5692/81A patent/CH651061A5/de not_active IP Right Cessation
- 1981-09-07 FR FR8116944A patent/FR2489838A1/fr active Granted
- 1981-09-08 BE BE0/205892A patent/BE890259A/fr not_active IP Right Cessation
- 1981-09-09 LU LU83627A patent/LU83627A1/de unknown
- 1981-09-09 HU HU812609A patent/HU185454B/hu unknown
- 1981-09-09 NO NO813068A patent/NO161684C/no unknown
- 1981-09-10 JP JP56141791A patent/JPS5928394B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES504834A0 (es) | 1982-12-16 |
| DE3034045A1 (de) | 1982-04-22 |
| HU185454B (en) | 1985-02-28 |
| FI76374B (fi) | 1988-06-30 |
| ES8301275A1 (es) | 1982-12-16 |
| BE890259A (fr) | 1982-03-08 |
| DK151635B (da) | 1987-12-21 |
| LU83627A1 (de) | 1982-01-21 |
| ATA303781A (de) | 1987-05-15 |
| NL8103540A (nl) | 1982-04-01 |
| NO161684C (no) | 1989-09-13 |
| IT1138134B (it) | 1986-09-17 |
| SE8104840L (sv) | 1982-03-11 |
| NO161684B (no) | 1989-06-05 |
| NL186645C (nl) | 1991-01-16 |
| SE447908B (sv) | 1986-12-22 |
| AT384622B (de) | 1987-12-10 |
| CA1172979A (en) | 1984-08-21 |
| NO813068L (no) | 1982-03-11 |
| DK369781A (da) | 1982-03-11 |
| CH651061A5 (de) | 1985-08-30 |
| DE3034045C2 (fi) | 1988-10-27 |
| GB2083477A (en) | 1982-03-24 |
| FR2489838A1 (fr) | 1982-03-12 |
| JPS5779884A (en) | 1982-05-19 |
| US4414332A (en) | 1983-11-08 |
| FI812726L (fi) | 1982-03-11 |
| JPS5928394B2 (ja) | 1984-07-12 |
| GB2083477B (en) | 1983-09-01 |
| DK151635C (da) | 1988-06-20 |
| FR2489838B1 (fi) | 1983-11-18 |
| IT8123351A0 (it) | 1981-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nordfang et al. | The C-terminus of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) is essential to its anticoagulant activity | |
| Payne et al. | Isolation of complementary DNA clones encoding pathogenesis-related proteins P and Q, two acidic chitinases from tobacco. | |
| US4629567A (en) | Alpha-1-antiprotease purification | |
| US5258497A (en) | Process for purifying annexines | |
| US4937324A (en) | Chromatographic purification of human proteins having anticoagulant and anti-inflammatory activity | |
| FI76374C (fi) | Endoproteinas-lys-c som erhaolles ur bakterier och foerfarande foer tillvaratagning av denna. | |
| Hnilica | Studies on nuclea proteins I. Observations on the tissue and species specificity of the moderately lysine-rich histone fraction 2b | |
| KR20030057545A (ko) | 잠복형 안티트롬빈 ｉｉｉ의 제조방법 | |
| EP0740702A1 (en) | Novel human amyloid protein precursor homologue and kunitz-type inhibitors | |
| Laraba-Djebari et al. | A fibrinogen-clotting serine proteinase from Cerastes cerastes (horned viper) venom with arginine-esterase and amidase activities. Purification, characterization and kinetic parameter determination | |
| Wearne | Factor Xa cleavage of fusion proteins: elimination of non-specific cleavage by reversible acylation | |
| Tsubata et al. | Limited proteolysis of bovine myelin basic protein by calcium-dependent proteinase from bovine spinal cord | |
| EP0300030A1 (en) | Human proteins having anticoagulant and anti-inflammatory activity | |
| Beckmann et al. | Semisynthesis of Arg15, Glu15, Met15, and Nle15-aprotinin involving enzymatic peptide bond resynthesis | |
| Fritz et al. | Trypsin-plasmin inhibitors from leeches isolation, amino acid composition, inhibitory characteristics | |
| 吉中禮二 et al. | Studies on collagenase in fish. III. Purification and properties of a collagenase from the pyloric caeca of yellow-tail. | |
| Koide et al. | [7a] Bovine factor XI (plasma thromboplastin antecedent) | |
| Tanabe et al. | Isolation and characterization of Streptoverticillium anticoagulant (SAC), a novel protein inhibitor of blood coagulation produced by Streptoverticillium cinnamoneum subsp. cinnamoneum | |
| Dewald et al. | Human complement component C8: molecular basis of the β-chain polymorphism | |
| WO1999060126A2 (en) | Protein z-dependent protease inhibitor | |
| IE65590B1 (en) | A process for the purification of plasminogen activator inhibitor 2 (PAI) 2 | |
| Maynard | Identification of a new molecular form of human α-lactalbumin | |
| Kurata et al. | Purification, characterization, and relation to bikunin of rat urinary trypsin inhibitors | |
| Chuchana et al. | Purification of active human α1-antitrypsin from genetically engineered micro-organisms | |
| KR20020081601A (ko) | Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ 억제 단백질 및 그의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |
Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH |