NL8103540A

NL8103540A - Bacterieel endoproteinase-lys-c en werkwijze ter verkrijging daarvan.

Info

Publication number: NL8103540A
Application number: NL8103540A
Authority: NL
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1980-09-10
Filing date: 1981-07-27
Publication date: 1982-04-01
Also published as: IT1138134B; SE8104840L; GB2083477B; JPS5928394B2; NO161684B; AT384622B; ES504834A0; FI76374C; ATA303781A; NO161684C; ES8301275A1; CH651061A5; DK369781A; NL186645C; FI812726L; DK151635C; DK151635B; SE447908B; FI76374B; GB2083477A

Description

* μ i *

Bacterieel endoproteinase-Lys-C en werkwijze ter verkrijging daarvan.

Endoproteinasen die proteïnen en peptiden op een beoogde plaats splitsen, zijn techaisch en wetenschappelijk van betekenis, onder andere voor het bepalen van de aminozuur-volgorde. Een endoproteinase dat lysine op de eindstandige 5 carboxylplaats (c) splitst, is bekend.'Dit enzym is afkomstig uit schimmels maar is moeilijk te winnen zodat het niet in voldoende mate beschikbaar is.

Gevonden i s een bacterieel enzym met dezelfde specificiteit, dat als endoproteinase-Lys-C is gekarakteriseerd 10 en zich daardoor van andere bacteriële proteasen duidelijk onderscheidt.

Het nieuwe bacteriële endoproteinase-Lys-C volgens de uitvinding wordt daardoor gekenmerkt, dat het uit een keten met een molekuulgewichfc van 35 000 - 38 000 15 dalton bestaat, een pB-optimum bij 7 »7 vertoont en wordt geremd door aprotinine maar niet wordt geremd door ctg-macro-globuline, α^-antitrypsine en ethyleendiaminetetraazijnzuur.

Iét enzym volgens de uitvinding neigt onder niet-reducerende omstandigheden tot aggregatie waarbij bij 20 voorkeur tetrameren met een molekuulgewicht van ongeveer 15 0 000 dalton en octameren met een molekuulgewicht van ongeveer 300 000 dalton, die enzymatisch aktief zijn, worden gevormd.

Het pH-optimum bij 7,7 is bepaald bij 37°C volgens de Azocoll-met bode.

25 Bij elektrofocussering splitst het enzym zich in talrijke banden op, die zich over bijna het totale pE-bereik uitstrekken. Hieruit kan worden besloten dat het om een glycoproteine gaat. Het isoelektrisch punt van het enzym is daarom niet te bepalen.

30 Iét enzym wordt niet geremd door ctg-macroglobu- line, c^-antitrypsine en ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) 8103540

t V

* - 2 - mmQ . .

tot ten hoogste 10 M. Door benzamxdme daarentegen wordt het hij 2,5 mM voor ongeveer 50 % geremd en hij hogere benzamidine-concentraties tot voor 70 %. Aprotinine remt volledig.

De substraatspecificiteit van het nieuwe enzym is in onderstaande tabel A vermeld. De specifieke aktiviteit gemeten met Tosyl-glycyl-prolyl-lysyl-p-nitroanilide bij 25°C bedraagt ongeveer 25 U/mg of ongeveer 50 Azocoll-eenheden/mg enzym bij 37°C.

In tegenstelling tot het eerder beschreven Proteinase II uit Lysobacter splitst het enzym volgens de uitvinding lysine niet op de eindstandige aminoplaatst maar op de eindstandige carboxylplaats. De hoge specificiteit blijkt ook uit het geringe aantal banden die bij gel-chromato-grafie van met het enzym verkregen fibrine-splitsingsprodukten optreden.

Tabel A

Sibstraatspecificiteit van endoproteinase Lys-C

Substraat afbraak door

endoproteinase Lys-C

Azocoll +

Caséine +

Fibrinogeen +

Hemoglobine + TLME ++

R

Chromozym PL ++ S 2251R ++

Tos-Arg-Me Chromozym TI?

BASE

Leu-pNA

Lys-pNA

ATEE

B-keten van insuline + 8103540 - 3 -

Afkortingen TIME * To syl-lysyl-methyle st er BAEE = Benzoyl-arginyl-ethylester ATEE = Arginyl-tyrosyl-ethylester

R

5 Chromozym PL = Tosyl-glycyl-prolyl-lysyl-p-nitro-anilid

Chromozym th® = Tosyl-glycyl-prolyl-arginyl-p-nitroanilide R

S 2251 = Valyl-leucyl-lysyl-p-nitroanilide

In onderstaande tabel B zijn de verschillen tussen het enzym volgens de uitvinding en bekende proteasen uit 10 Lysobacter aangegeven.

8103540 « 5- - k -

(UI

4) ,0 4) iH O P I fi .

B 4) ft o sa) 2 P fi O B H >Ö fi .μ ·Η p ,Ο 4) β ·Η PO'S Mas a) ra

4) fi s <u Is--' β S

*h <d ·η h ej P β 4) r* “ _ β β 4) 4) U 4) S fi

Β · B 4) Ρ ·Η H OJ

> ,Ο > «0 β 4) P _ r> • S N Η ·Η β βΛ βΗβ Ο :4) ra Β fi 4) · 4) 4) 4) β·ΗΟ >2 P ft.H ft HOT) ·Η P ft . ft •h p <dSso)ö ö2 4) 0"0*(oB+3® <1)0 as L t! )i Ö S Op Pi h •rt M4>S>8.H4)B«sO om 0 ηρηρο^λ Pt1 u F3,N£?Nüfta),a ω •3 SS JS5 £Έ* § |

<u p .H p ·Η :<U *0 <ü · ·Η P

o· dg <j S ·Η K P Ή BB

Μ O B O B P J3 «W S O

<U · <l) ra l 2

B O B

O P p

ft Pi P

O O O o

IK ft H 'O 'Ö PP

® β 4) 43 ra o SS

4) d β 4) B rW X β pq.M.2 ·η Ë β O P ·Η B o P t -H A -2 S?

H 4) 4) 4) β 4) fi SS

4) PB M N ft O O® 8 L _·

* .S H O

| *· -p 4) O

Η·"' B ft O O

4) 4) ft JS _ J, rf | (&·Η β O O W JA K,

H* w +> 4) M Q Q CO P

au Bftes o m O'-' § Ja β o o op.Hgo · B o w o o o o QftO'öo-ocO'SftC) K.H+sO o °HQ4)p>oop'eofton

p4 f—) «rl 4j tO 4) I 4) ÉG 4) I

04)B O ON ON ft -3· — C— VO p β ¢/5 tó S bO Ό CM »-CO — O —' β CM ON °

§ r- CM CO I

1 r- i On On I

β CM I σ\ ON I

i ·ι * · ! O J- I -fi- -fi ! GS . j · »1 <n m co 4) o n ^ «

B 4) ö P

fi CO H W !>

•ri tó W

4) <D 4) 4) +) +s CO (0 0) 0 O Β B (0

P P β fi B

ft ft ·Η ·Η fi VI 4) 4) ·Ρ J-J .fi ft ft 4) V O o O ft

ra co P O

•Η *rl ft ft P

•PP ft S h 7 7 £ Η Η I I 'g 1 I ift t™l rfi

Ö «1 < < W

8103540 - 5 -

Het enzym volgens de uitvinding kan uit de cultuurvloeistof van microorganismen die bet enzym in voldoende mate vormen, in het bijzonder microorganismen behorende tot de orde der Lysobacterale s en daarvan bij voorkeur tot de 5 familie der Lysobacteraceae, bijvoorbeeld het genus Lysobacter (ook Myxobacter genoemd) volgens gebruikelijke enzymzuiverings-methoden, zoals ammoniumsulfaatfraktionering, acetonfraktionering en molekulairzeefchromatografie worden gewonnen en van de meeste verontreinigingen bevrijd. Andere proteasen worden volgens 10 de uitvinding afgescheiden door behandelen met ag-macroglobuline-metaalcomplex op een drager. Door deze, voor het zuiveren van enzymen nieuwe behandeling, worden moeilijk te verwijderen verontreinigingen, maar vooral de aanwezige proteasen, afgescheiden, terwijl het endoproteinase Lys-C volgens de uitvinding 15 in de oplossing achterblijft en daaruit kan worden geïsoleerd.

De uitvinding heeft derhalve verder betrekking op een werkwijze voor het winnen van endoproteinase Lys-C, met het kenmerk dat, een gefiltreerde of op op-zich bekende wijze gezuiverde cultuurvloeistof van een geschikte bacterie-20 stam over een drager-gebonden ag-macroglobuline-metaalcomplex wordt gechromatografeerd waarna uit het filtraat het enzym wordt gewonnen.

Bet metaal in het α,,-macroglobuline-metaalcomplex bestaat uit zink (II), kobalt (II), nikkel (II) en/of koper (II). 25 De bereiding en toepassing van dit complex is beschreven in de Duitse octrooiaanvrage P 30 3^ Λ3.3 (int. Hr. 2380).

fbewel de cultuurvloeistof dus rechtstreeks met drager-gebonden a^-macroglobuline-metaalcomplex kan worden behandeld, is het doelmatiger om het proteïne eerst van andere 30 stoffen te bevrijden en een voorfraktionering uit te voeren.

Iét proteine kan doelmatig uit het cultuurfiltraat worden afgescheiden door precipitatie met ammoniumsulfaat, hoewel ook andere gebruikelijke proteineprecipitatiemiddelen die de enzymatische aktiviteit van het proteine niet aantasten, 35 gebruikt kunnen worden. Bet ammoniumsulfaat wordt doelmatig 8103540 - 6 - .¾ tot een concentratie van 2,5-3,5 M en bij voorkeur 3 - 3,2 M toegevoegd, fet gevormde neerslag wordt afgescheiden, bijvoorbeeld door filtreren, en bevat de totale aktiviteit. Na oplossen in water en bij voorkeur na verwijderen van achtergebleven 5 ammoniumsulfaat door dialyse kan de verkregen oplossing over het ctg-macroglobuline-metaalcomplex worden gechromatografeerd, of aan nog een voor zuivering worden onderworpen.

Wanneer nog een voorzuivering gewenst is,wordt doelmatig een ammoniumsulfaatfraktionering uitgevoerd,waarbij 10 de fraktie die bij een concentratie ammoniumsulfaat tussen 2 en 3 M precipiteert,de gewenste aktiviteit bevat. Daarbij wordt doelmatig eerst ammoniumsulfaat in een concentratie van 0,7-1,3 M toegevoegd,gevolgd door afscheiden van het neerslag, waarna de ammoniumsulfaatconcentratie wordt verhoogd tot 3 M 15 en bij voorkeur op 2,25 - 2,32 M wordt ingesteld,gevolgd door afscheiden van het aktieve neerslag op gebruikelijke wijze en verwijderen van achtergebleven ammoniumsulfaat door dialyse.

Wordt de verkregen oplossing niet(meteen) met het a^-macroglobuline-metaalcoraplex behandeld, dan kunnen ook 20 eerst nog een acetonfraktionering en molekulairzeefcIromatografie worden uitgevoerd. Bij de acetonfraktionering wordt precipitatie bewerkstelligd door toevoegen van 0,3 - 1,5 en bij voorkeur 0,5 - 1,2 volumedelen aceton, wordt het neerslag afgescheiden en wordt nog 1,2 volumedelen aceton toegevoegd, waarna hst 25 neerslag wordt afgescheiden en opgelost in een buffer met een pa 7,5-9. De bufferconcentratie bedraagt doelmatig 0,01 - 0,05 M.

Na verwijderen van achtergebleven aceton door dialyse en eventueel concentreren van de verkregen oplossing, kan over een molekulair zeef, bijvoorbeeld vernet dextran zoals Sepbadex 30 G-100 worden gechromatografeerd, waarbij de gewenste aktiviteit aan het begin uit de kolom wordt geelueerd en het bekende AL-1 Proteinase I pas aan het eind. Het eluaat wordt, eventueel na concentreren, over drager-gebonden ctg-macroglobuline-metaal-eomplex gechromatografeerd waarbij het gewenste endoproteinase-35 Lys-C elueert. Bet elueren wordt bij voorkeur uitgevoerd bij 81 03 5 40 - 7 - een pFvan 7,0 - 8,5 en een bufferconcentratie van 0,03 - 0,08 M. Gebruikelijke buffers met deze p H kunnen worden gebruikt maar de voorkeur gaat uit naar Tris-buffer, Hepes-buffer en fosfaat-buffer. Buffers met een pH 6,5-9 en een concentratie van 0,01-5 0,1 M geven goede resultaten. Bst eluaat bevat zuiver endo- proteinase-Lys-C en buffer en kan rechtstreeks worden gelyofili-seerd.

Het nieuwe enzym volgens de uitvinding leent zich in het bijzonder voor het bepalen van de aminozuurvolgorde in 10 proteïnen en peptiden. Maar vanwege de zeer specifieke splitsings-aktiviteit komt het ook in aanmerking voor therapeutische toepassingen, bijvoorbeeld stoornissen in de bloedstoiling, en andere aandoeningen waarbij de splitsing van proteineketens wordt beoogd.

15 Voorbeeld I

Winnen van endoproteinase-Lys-C uit Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes DSM 1895 (ATCC 27796)

Aan 206 1 Iysobacter-cultuurvloeistof wordt 20 langzaam vast ammoniumsulfaat toegevoegd tot een concentratie van 3 - 3,2 M. Het geringe vlokkige neerslag wordt afgefiltreerd en op het filter met een weinig gedestilleerd water opgelost.

Aan de oplo ssing wordt vast ammoniumsulfaat tot een concentratie van 0,9 M (1,3 - 3 M) toegevoegd onder precipiteren/waarna wordt 25 gecentrifugeerd. Aan de bovenstaande vloeistof wordt weer ammoniumsulfaat toegevoegd tot een concentratie van 2,25 - 2,32 M, waarna het neerslag door filtreren of centrifugeren wordt verzameld. Het neerslag wordt dan in ongeveer UC0 ml gedestilleerd water opgelost en de oplossing wordt gedialyseerd tegen stromend 30 leidingwater. Aan het dialysaat worden 0,5-1,2 volumedelen koude aceton (-20°C) toegevoegd waarna wordt gecentrifugeerd.

Aan de heldere bovenstaande vloeistof worden 1,2 volumedelen aceton (berekend op het beginvolume) toegevoegd waarna het neerslag door centrifugeren wordt afgescheiden. Het neerslag wordt in 35 zo weinig mogelijk 0,025 M Tris*buffer met een pH 9 opgelost 8103540

J

- a - en de oplossing wordt tegen 10 1 van dezelfde buffer gedialyseerd. Vervolgens wordt het dialysaat op een Sephadex-G-100 kolom (lengte: 150 cm, diameter: 5 cm; volume: ongeveer 2,9 l)) gebracht. De kolom wordt geequilibreerd met 0,025 M Trisbuffer 5 met een pH 9,0 en na optrekken met dezelfde buffer nagewassen.

Lysobacter-protease wordt aan het begin geelueerd.

Aan de eluaten wordt vast ammoniumsulfaat tot een concentratie van 3,2 M toegevoegd waarbij precipitatie optreedt, waarna wordt gecentrifugeerd. Het neerslag bevattende 10 concentraat wordt tegen 0,05 M Tris-buffer met een pH 8,0 gedialyseerd.

Voor verdere zuivering wordt covalent aan agarose gebonden a^-macroglobuline-zinkcomplex gebruikt. Hiermee (110 ml) wordt een kolom met een lengte van 17,5 cm en een diameter van 15 3 cm gevuld. De kolom wordt met 0,05 M Tris-buffer met een pH

8,0 gewassen totdat in het eluaat geen proteïne meer aanwezig is. Vervolgens wordt het dialysaat opgebracht waarna met 0,05 M Trisbuffer van pH 8,0 wordt nagewassen. Daarbij elueert proteinase-Lys-C. Het eluaat wordt tegen 0,05 M glycine met een pH 8,0 2/0 gedialyseerd en na verdunnen met dezelfde buffer tot een concen tratie van 0,1* mg/ml gelyofiliseerd.

Totaalopbrengst: ongeveer 50 - 1U0 mg proteine en 6 - 23 U/mg proteinase Lys- C. Chromozym TH aktiviteit 25 kleiner dan 0,2 %,

Voorbeeld II

Bepaling van endoproteinase Lys-C Bereiding van de oplossingen 1. 0,025 M Trisbuffer, 0,001 M EDTA, pH 7.7 30 - 0,303 g Trisbuffer en 37,2 mg EDTA worden in ongeveer 80 ml 2x gedestilleerd water opgelost. De oplossing wordt met 2 N zoutzuur op een pH 7,7 ingesteld en tot 100 ml aangevuld.

2. Chromozym-PL (uM/ml) 35 9 mg Chromozym-PL wordt in 1 ml 2x gedestilleerd 8103540 - 9 - water opgelost.

3. Endonroteinase-Lys-C-oplossing 10 mg lyofilisaat wordt in 1 ml 2x gedestilleerd water opgelost. De oplossing wordt voor gebruik 1:100 verdund met de oplossing 1.

uitvoering: U05 nm 1 cm semimicrocuvetten 25°C testvolume 1,07 ml

In cuvetten pipetteren: oplossing 1 1 ml oplossing 2 0,05 ml mengen, in ongev. 2 min. op 25°C laten komen.

Testoplossing 3 0,02 ml mengen, uit lineaire fase na ongev. 5 min.

ΔΕ/min. berekenen

Berekening:

ΔΕ/min x 1,0T ^ 100 = U/ml endoproteinase-Lys-C

10,k x 0,02 8103540

Claims

1. Endoproteinase-Lys-C, met het kenmerk dat, het enzym bacterieel is en uit een keten met een molekuulgewic hb van 35 000 - 38 000 dalton bestaat, een pH-optimum bij 7,7 5 vertoont en door aprotinine wel wordt geremd maar niet door Qg-macroglobuline, c^-antitrypsine en ethyleendiaminetetraazijn-zuur.

2. Werkwijze voor het winnen van endoproteinase-Lys-C volgens conclusie 1, met het kenmerk dat, een gefiltreerde 10 of op gebruikelijke wijze voorgezuiverde cultuurvloeistof van een geschikte bacteriestam wordt gechromatografeerd over een drager-gebonden a^-macroglobuline-metaalcomplex waarna uit het filtraat het enzym wordt gewonnen,

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, 15 dat in een buffer met een pH 6,5 - 9 en met een concentratie van 0,01 - 0,1 M wordt gechromatografeerd. 1*. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, met het kenmerk, dat een Lysobacterales-cultuurvloeistof wordt gechromatografeerd.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 2-1*, met het kenmerk, dat uit de gefiltreerde cultuurvloei stof het proteine wordt geprecipiteerd met behulp van ammonium sulfaat, .......................... het neerslag na opnieuw oplossen wordt gefraktioneerd met ammoniumsulfaat binnen een concentratie van 1,3 en 3 M, de 25 binnen deze concentratie onoplosbare fraktie in water wordt opgelost en na dialyse wordt gefraktioneerd met 1,2 - 2,1* volume-delen aceton.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk dat, het bij de fraktionering met aceton gevormde neerslag wordt 30 opgelost en over een molekulair zeef wordt gechromatografeerd waarna de aan het begin geelueerde proteinefraktie wordt gechromatografeerd over het ctg-macroglobuline-metaalcomplex.

7. Werkwijze voor het bepalen van de aminozuur-volgorde in proteïnen en peptiden met behilp van endoproteinase-

35 Lys-C, met het kenmerk dat, de bepaling wordt uitgevoerd met 8103540 - 11 - behulp van bacterieel endoproteinase-Lys-C volgens conclusie 1 subsidiair verkregen met de werkwijze volgens een der conclusies 2-6.

8. Enzymmateriaal en werkwijzen voor het verkrijgen 5 en toenassen daarvan zoals beschreven in de beschrijving en voor beelden. 8103540