KR100614714B1 - ｇｐ41 단편의 아세틸화 - Google Patents
ｇｐ41 단편의 아세틸화 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100614714B1 KR100614714B1 KR1020037016312A KR20037016312A KR100614714B1 KR 100614714 B1 KR100614714 B1 KR 100614714B1 KR 1020037016312 A KR1020037016312 A KR 1020037016312A KR 20037016312 A KR20037016312 A KR 20037016312A KR 100614714 B1 KR100614714 B1 KR 100614714B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- peptide
- fusion
- peptides
- amino acids
- glu
- Prior art date
Links
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 title description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title description 5
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 title description 4
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 title description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 225
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 67
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 55
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 abstract description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 30
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 81
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 50
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 44
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 17
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 17
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 14
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 14
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 14
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 9
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 6
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 5
- 108010032976 Enfuvirtide Proteins 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 5
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 5
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 3-methylfuran-2,5-dione Chemical compound CC1=CC(=O)OC1=O AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 4
- XFKUFUJECJUQTQ-CIUDSAMLSA-N Gln-Gln-Glu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XFKUFUJECJUQTQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- KWBISLAEQZUYIC-UWJYBYFXSA-N His-His-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N KWBISLAEQZUYIC-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 4
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 4
- LLZLRXBTOOFODM-QSFUFRPTSA-N Ile-Asp-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N LLZLRXBTOOFODM-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 4
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 4
- QYOXSYXPHUHOJR-GUBZILKMSA-N Lys-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QYOXSYXPHUHOJR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- CNXOBMMOYZPPGS-NUTKFTJISA-N Lys-Trp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNXOBMMOYZPPGS-NUTKFTJISA-N 0.000 description 4
- DSWOTZCVCBEPOU-IUCAKERBSA-N Met-Arg-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CCCNC(N)=N DSWOTZCVCBEPOU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- GVIGVIOEYBOTCB-XIRDDKMYSA-N Ser-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 GVIGVIOEYBOTCB-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 4
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FVSOUJZKYWEFOB-KBIXCLLPSA-N Ala-Gln-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)N FVSOUJZKYWEFOB-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 3
- 101710189136 Envelope fusion protein Proteins 0.000 description 3
- MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- SWRVAQHFBRZVNX-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SWRVAQHFBRZVNX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MYGQXVYRZMKRDB-SRVKXCTJSA-N Leu-Asp-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MYGQXVYRZMKRDB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- RXWPLVRJQNWXRQ-IHRRRGAJSA-N Met-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 RXWPLVRJQNWXRQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- -1 Nef Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N Ser-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- CPYHLXSGDBDULY-IHPCNDPISA-N Asn-Trp-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O CPYHLXSGDBDULY-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 2
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- NNQHEEQNPQYPGL-FXQIFTODSA-N Gln-Ala-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O NNQHEEQNPQYPGL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- WVUZERSNWGUKJY-BPUTZDHNSA-N Gln-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N WVUZERSNWGUKJY-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- FKXCBKCOSVIGCT-AVGNSLFASA-N Gln-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FKXCBKCOSVIGCT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- LVCHEMOPBORRLB-DCAQKATOSA-N Glu-Gln-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(O)=O LVCHEMOPBORRLB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- PXXGVUVQWQGGIG-YUMQZZPRSA-N Glu-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PXXGVUVQWQGGIG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- JLCYOCDGIUZMKQ-JBACZVJFSA-N Glu-Trp-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N JLCYOCDGIUZMKQ-JBACZVJFSA-N 0.000 description 2
- RXJFSLQVMGYQEL-IHRRRGAJSA-N Glu-Tyr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 RXJFSLQVMGYQEL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- XZRZILPOZBVTDB-GJZGRUSLSA-N Gly-Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 XZRZILPOZBVTDB-GJZGRUSLSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- SYIPVNMWBZXKMU-HJPIBITLSA-N His-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N SYIPVNMWBZXKMU-HJPIBITLSA-N 0.000 description 2
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 2
- LJKDGRWXYUTRSH-YVNDNENWSA-N Ile-Gln-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N LJKDGRWXYUTRSH-YVNDNENWSA-N 0.000 description 2
- MTFVYKQRLXYAQN-LAEOZQHASA-N Ile-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O MTFVYKQRLXYAQN-LAEOZQHASA-N 0.000 description 2
- CNMOKANDJMLAIF-CIQUZCHMSA-N Ile-Thr-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNMOKANDJMLAIF-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 2
- FQZPTCNSNPWHLJ-AVGNSLFASA-N Leu-Gln-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O FQZPTCNSNPWHLJ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- NCZIQZYZPUPMKY-PPCPHDFISA-N Lys-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NCZIQZYZPUPMKY-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100068676 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) gln-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101000582398 Staphylococcus aureus Replication initiation protein Proteins 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- AVYVKJMBNLPWRX-WFBYXXMGSA-N Trp-Ala-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 AVYVKJMBNLPWRX-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 2
- VTHNLRXALGUDBS-BPUTZDHNSA-N Trp-Gln-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N VTHNLRXALGUDBS-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- PHNBFZBKLWEBJN-BPUTZDHNSA-N Trp-Glu-Gln Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N PHNBFZBKLWEBJN-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- DPMVSFFKGNKJLQ-VJBMBRPKSA-N Trp-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC3=CNC4=CC=CC=C43)C(=O)O)N DPMVSFFKGNKJLQ-VJBMBRPKSA-N 0.000 description 2
- NZFCWALTLNFHHC-JYJNAYRXSA-N Tyr-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NZFCWALTLNFHHC-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N Tyr-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 2
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000007771 core particle Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 2
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000012976 mRNA stabilization Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108010020432 prolyl-prolylisoleucine Proteins 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- SIFCHNIAAPMMKG-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) acetate Chemical compound CC(=O)ON1C(=O)CCC1=O SIFCHNIAAPMMKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDIFVHOZUBKVOS-YTAGXALCSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-1-[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-methyl Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)C1=CNC=N1 FDIFVHOZUBKVOS-YTAGXALCSA-N 0.000 description 1
- IGXNPQWXIRIGBF-KEOOTSPTSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 IGXNPQWXIRIGBF-KEOOTSPTSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- PNALXAODQKTNLV-JBDRJPRFSA-N Ala-Ile-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PNALXAODQKTNLV-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- HQJKCXHQNUCKMY-GHCJXIJMSA-N Ala-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N HQJKCXHQNUCKMY-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N Ala-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- PMQXMXAASGFUDX-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CCCCN PMQXMXAASGFUDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N Ala-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N 0.000 description 1
- ZATRYQNPUHGXCU-DTWKUNHWSA-N Arg-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O ZATRYQNPUHGXCU-DTWKUNHWSA-N 0.000 description 1
- NPAVRDPEFVKELR-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NPAVRDPEFVKELR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CMLGVVWQQHUXOZ-GHCJXIJMSA-N Asn-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CMLGVVWQQHUXOZ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- PQAIOUVVZCOLJK-FXQIFTODSA-N Asn-Gln-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PQAIOUVVZCOLJK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KUYKVGODHGHFDI-ACZMJKKPSA-N Asn-Gln-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KUYKVGODHGHFDI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- JZDZLBJVYWIIQU-AVGNSLFASA-N Asn-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JZDZLBJVYWIIQU-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- WIDVAWAQBRAKTI-YUMQZZPRSA-N Asn-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O WIDVAWAQBRAKTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NJIKKGUVGUBICV-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NJIKKGUVGUBICV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N Asp-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N Asp-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ZXRQJQCXPSMNMR-XIRDDKMYSA-N Asp-Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N ZXRQJQCXPSMNMR-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000001477 Deubiquitinating Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010093668 Deubiquitinating Enzymes Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- TWHDOEYLXXQYOZ-FXQIFTODSA-N Gln-Asn-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N TWHDOEYLXXQYOZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PNENQZWRFMUZOM-DCAQKATOSA-N Gln-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PNENQZWRFMUZOM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LURQDGKYBFWWJA-MNXVOIDGSA-N Gln-Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N LURQDGKYBFWWJA-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- ICRKQMRFXYDYMK-LAEOZQHASA-N Gln-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ICRKQMRFXYDYMK-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N Glu-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- XHUCVVHRLNPZSZ-CIUDSAMLSA-N Glu-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XHUCVVHRLNPZSZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IQACOVZVOMVILH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PJBVXVBTTFZPHJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N PJBVXVBTTFZPHJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DNPCBMNFQVTHMA-DCAQKATOSA-N Glu-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O DNPCBMNFQVTHMA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N Glu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- DAHLWSFUXOHMIA-FXQIFTODSA-N Glu-Ser-Gln Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O DAHLWSFUXOHMIA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N Gly-Arg-Phe Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Pro Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FKESCSGWBPUTPN-FOHZUACHSA-N Gly-Thr-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FKESCSGWBPUTPN-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- JBJNKUOMNZGQIM-PYJNHQTQSA-N His-Arg-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JBJNKUOMNZGQIM-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- MDBYBTWRMOAJAY-NHCYSSNCSA-N His-Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N MDBYBTWRMOAJAY-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- PZAJPILZRFPYJJ-SRVKXCTJSA-N His-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PZAJPILZRFPYJJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101000984929 Homo sapiens Butyrophilin subfamily 1 member A1 Proteins 0.000 description 1
- 108700020121 Human Immunodeficiency Virus-1 rev Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- RGSOCXHDOPQREB-ZPFDUUQYSA-N Ile-Asp-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N RGSOCXHDOPQREB-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- PHIXPNQDGGILMP-YVNDNENWSA-N Ile-Glu-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N PHIXPNQDGGILMP-YVNDNENWSA-N 0.000 description 1
- KEKTTYCXKGBAAL-VGDYDELISA-N Ile-His-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N KEKTTYCXKGBAAL-VGDYDELISA-N 0.000 description 1
- XMYURPUVJSKTMC-KBIXCLLPSA-N Ile-Ser-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N XMYURPUVJSKTMC-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N Ile-Ser-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- QCSFMCFHVGTLFF-NHCYSSNCSA-N Leu-Asp-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QCSFMCFHVGTLFF-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- KVMULWOHPPMHHE-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O KVMULWOHPPMHHE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FMEICTQWUKNAGC-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FMEICTQWUKNAGC-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VZBIUJURDLFFOE-IHRRRGAJSA-N Leu-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O VZBIUJURDLFFOE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BTNXKBVLWJBTNR-SRVKXCTJSA-N Leu-His-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BTNXKBVLWJBTNR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HGFGEMSVBMCFKK-MNXVOIDGSA-N Leu-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HGFGEMSVBMCFKK-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- JFSGIJSCJFQGSZ-MXAVVETBSA-N Leu-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N JFSGIJSCJFQGSZ-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- KYNNSEJZFVCDIV-ZPFDUUQYSA-N Lys-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KYNNSEJZFVCDIV-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- MUXNCRWTWBMNHX-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MUXNCRWTWBMNHX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N Lys-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MGKFCQFVPKOWOL-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N MGKFCQFVPKOWOL-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CHLJXFMOQGYDNH-SZMVWBNQSA-N Met-Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 CHLJXFMOQGYDNH-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 108010030544 Peptidyl-Lys metalloendopeptidase Proteins 0.000 description 1
- LDSOBEJVGGVWGD-DLOVCJGASA-N Phe-Asp-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 LDSOBEJVGGVWGD-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- FXPZZKBHNOMLGA-HJWJTTGWSA-N Phe-Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N FXPZZKBHNOMLGA-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- DWPXHLIBFQLKLK-CYDGBPFRSA-N Pro-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 DWPXHLIBFQLKLK-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 1
- 241001428754 Rat leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- CDVFZMOFNJPUDD-ACZMJKKPSA-N Ser-Gln-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CDVFZMOFNJPUDD-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIPXCLNLUUAMJU-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUMGHWDRRFCKEP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HEUVHBXOVZONPU-BJDJZHNGSA-N Ser-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HEUVHBXOVZONPU-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N Ser-Thr-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N Thr-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BSNZTJXVDOINSR-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N Thr-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- HYLNRGXEQACDKG-NYVOZVTQSA-N Trp-Asn-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O HYLNRGXEQACDKG-NYVOZVTQSA-N 0.000 description 1
- ACGIVBXINJFALS-HKUYNNGSSA-N Trp-Phe-Gly Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N ACGIVBXINJFALS-HKUYNNGSSA-N 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- QPZMOUMNTGTEFR-ZKWXMUAHSA-N Val-Asn-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N QPZMOUMNTGTEFR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- ZMDCGGKHRKNWKD-LAEOZQHASA-N Val-Asn-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N ZMDCGGKHRKNWKD-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- KZKMBGXCNLPYKD-YEPSODPASA-N Val-Gly-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KZKMBGXCNLPYKD-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- VXDSPJJQUQDCKH-UKJIMTQDSA-N Val-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VXDSPJJQUQDCKH-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000713325 Visna/maedi virus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010091092 arginyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 108010080575 glutamyl-aspartyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-prolyl-L-arginine Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 108010076756 leucyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010083708 leucyl-aspartyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010029895 rubimetide Proteins 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 1
- 108010060175 trypsinogen activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 원핵 숙주 세포에서 약 10 내지 50개의 아미노산 길이의 항푸소젠성 펩타이드를 제조하는 방법으로서, 비융합 항푸소젠성 펩타이드 또는 이의 융합 펩타이드의 봉입체가 형성되는 조건하에서, (a) 항푸소젠성 펩타이드를 비융합 펩타이드로서 암호화하거나 약 4 내지 30개의 아미노산 길이의 추가 펩타이드에 N-말단이 연결된 상기 항푸소젠성 펩타이드로 구성된 약 14 내지 70개의 아미노산 길이의 융합 펩타이드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에서 발현시키는 단계; (b) 숙주 세포를 배양하는 단계; (c) 봉입체를 회수하고 가용화하는 단계; (d) 융합 펩타이드의 경우 추가 펩타이드로부터 항푸소젠성 펩타이드를 절단하는 단계; 및 (e) 항푸소젠성 펩타이드를 단리하는 단계를 특징으로 하는, 항푸소젠성 펩타이드의 제조 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 바이러스의 표적 세포의 막과의 융합을 억제하는 펩타이드의 재조합 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), 유인원 면역 결핍 바이러스(SIV), 홍역 바이러스(MEV), 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 같은 인플루엔자 바이러스, 또는 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPV) 같은 렌티바이러스(lentivirus)의 펩타이드 억제제의 재조합 제조 방법에 관한 것이다.
바이러스의 세포 막과의 융합은 외피보유 바이러스, 예컨대 HIV-I, HIV-II, RSV, 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 및 간염 바이러스의 세포 내로의 진입을 위한 필수 단계이다. 세포에 진입한 후, 바이러스 복제의 단계적 반응이 개시되어 바이러스 복제를 일으킨다.
HIV는 렌티바이러스 속의 일원이며, 이는 복잡한 게놈을 소유하고 원뿔 모양의 캡시드(capsid) 핵심 입자를 나타내는 레트로바이러스를 포함한다. 렌티바이러스의 다른 예로는 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 비스나(visna) 바이러스 및 말 감염성 빈혈증 바이러스(EIAV)가 포함된다. 모든 레트로바이러스와 마찬가지로, HIV의 게놈은 RNA에 의해 암호화되고, 이는 새로운 숙주 세포에 진입하여 곧 바이러스성 역전사 효소에 의해 바이러스성 DNA로 역전사된다. 인플루엔자 바이러스 및 이의 세포 진입 기전은 문헌[Bullough, P. A., et al., Nature 371 (1994) 37-43; Carr, C. M., and Kim, P. S., Cell 73 (1993) 823-832; 및 Wilson, I. A., et al., Nature 289 (1981) 366-373]에 기술되어 있다.
모든 렌티바이러스는 숙주 세포의 막으로부터 유도된 지질 이중층에 의해 피복된다. 노출된 표면 당단백질(SU, gp120)은 막통과 단백질(TM, gp41)과의 상호작용을 통해 바이러스에 부착된다. 또한, 지질 이중층은 숙주 세포로부터 유도된, 주요 조직적합성 항원, 액틴 및 유비퀴틴(ubiquitin)을 비롯한 몇몇 세포 막 단백질을 함유한다(문헌[Arthur, L. O., et al., Science 258 (1992) 1935-1938] 참조). 기질(matrix) 단백질(MP, p17)의 약 2000 복제본(copy)을 포함하는 매트릭스 쉘(shell)은 바이러스 막의 내부 표면에 줄지어 있고, 캡시드 단백질(CP, p24)의 약 2000 복제본을 포함하는 원뿔 캡시드 핵심 입자는 바이러스의 중심에 위치한다. 캡시드 입자는 스플라이싱되지 않은 바이러스 게놈의 2개 복제본을 싸고, 이것은 뉴클레오캡시드 단백질(NC, p7)의 약 2000 복제본과의 리보핵산단백질 복합체로서 안정화되고, 또한 3가지의 필수적인 바이러스 암호화 효소, 즉 단백질 분해 효소(PR), 역전사효소(RT) 및 인터그라제(integrase: IN)를 함유한다. 또한, 바이러스 입자는 보조 단백질, Nef, Vif 및 Vpr을 함께 포장한다. 숙주 세포에서 작용하는 3가지 추가의 보조 단백질인 Rev, Tat 및 Vpu는 함께 포장되지 않는 것으로 보인다.
HIV의 경우, 바이러스 진입은 HIV 외피 표면 당단백질과 관련되어 있다(문헌[Lawless, M. K., et al., Biochemistry 35 (1996) 13697-13708; 및 Turner, B. G., and Summers, M. F., J. Mol. Biol. 285 (1999) 1-32] 참조). HIV-1의 경우, 이 표면 단백질은 단일의 160kD 전구체 단백질로서 합성되고, 이는 세포 단백질 분해 효소에 의해 2개의 당단백질 gp41 및 gp120으로 절단된다. gp41은 막통과 단백질이고, gp120은 세포외 단백질로서 삼합체 또는 다합체 형태로 gp41과 비공유적으로 연결되어 있다(문헌[Hammarskjold, M. -L., et al., Biochim. Biophys. Acta 989 (1989) 269-280] 참조). CD4 표면 단백질이 HIV-1 바이러스에 대한 세포 수용기로서 행동하기 때문에 HIV는 CD4+ 림프구를 표적으로 한다. 세포 내로의 바이러스의 진입은 세포 CD4+ 수용기 분자에 대한 gp120 결합에 의존하고, 한편 gp41은 외피 당단백 복합체를 바이러스 막에 고정시키고 막 융합을 매개한다(문헌[McDougal, J. S., et al., Science 231 (1986) 382-385; 및 Maddon, P. J., et al., Cell 47 (1986) 333-348] 참조).
gp41은 바이러스 막과 세포 막의 융합을 매개하는 막통과 아단위(subunit)이다. gp41 엑토도메인(ectodomain) 핵심은, 각각 역방향평행(antiparallel) C 나선과 쌍을 이룬 N 나선으로 구성된 3개의 나선형 헤어핀(hairpin)으로 구성된 6개의 나선의 묶음(bundle)이다(문헌[Chan, D. C., et al., Cell 89 (1997) 263-273; Weissenhorn, W., et al., Nature 387 (1997) 426-430; 및 Tan, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 12303-12308] 참조). N 나선은 3개의 보존된 소수성 홈(groove)을 갖는 내부의 삼합체의 꼬인(coiled) 코일을 형성하고, 이들 각각의 홈 내로 C 나선이 포장된다. 이러한 구조는 아마 gp41의 융합-활성 상태의 핵심에 상응한다. 문헌[Chan, D. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 15613-15617]에 따르면 HIV 유형 I gp41의 꼬인 코일의 현저한 공동(cavity)이 유력한 약물 표적이라는 증거가 있다.
gp41이 막 융합을 매개하는 기전은 꼬인 코일 삼합체의 형성을 포함하는 것으로 추정되며, 이는 예컨대 인플루엔자 적혈구 응집소(hemagglutinin)에 대하여 기술된 바와 같이 휴지 상태로부터 푸소젠(fusogen: 융합유도원) 상태로의 전이를 구동시키는 것으로 여겨진다(문헌[Wilson, I. A., et al., Nature 289 (1981) 366-373; Carr, C. M., and Kim, P. S., Cell 73 (1993) 823-832; 및 Bullough, P. A., et al., Nature 371 (1994) 37-43] 참조).
외피보유 바이러스의 C 펩타이드(C 나선에 상응하는 펩타이드), 예컨대 DP178 및 C34는 HIV-1의 실험용으로 변형된 균주 및 1차 단리물 둘 모두에 의한 막 융합을 둘 다 강력하게 억제한다(문헌[Malashkevich, V. N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 9134-9139; 및 Wild, C. T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 9770-9774] 참조). C 펩타이드 DP178을 이용한 임상 I상 시험 결과는 이것이 생체내 항바이러스 활성을 가지므로 바이러스성 부하(load)를 감소시키는 결과를 가져올 것임을 시사하고 있다(문헌[Kilby, J. M., et al., Nature Medicine 4 (1998) 1302-1307] 참조). gp41 핵심의 구조적 특징은 C 펩타이드가 gp41의 중심 꼬인 코일에 결합하여 이의 불활성화를 일으키는 지배적-부정적(dominant-negative) 기전을 통해 이 펩타이드가 작용함을 시사하고 있다(문헌[Chan, D. C., et al., Cell 93 (1998) 681-684] 참조).
각각의 꼬인 코일 계면 내에 N 나선 꼬인 코일의 잔기의 집합에 의해 형성된 깊은 공동이 있고, 이는 항바이러스 화합물의 개발을 위한 유력한 표적으로서 제시되었다. C 나선으로부터의 3개의 잔기(Trp-628, Trp-631 및 Ile-635)가 이들 공동으로 삽입되고 광범위한 소수성 접촉(contact)을 만든다. 돌연 변이 분석에서는 이 공동을 포함하는 2개의 N 나선 잔기(Leu-568 및 Trp-571)가 막 융합 활성에 결정적인 것으로 나타난다(문헌[Cao, J., et al., J. Virol. 67 (1993) 2747-2755] 참조). 따라서, 이 공동에 높은 친화도로 결합하여 정상의 N 및 C 나선 결합(pairing)을 방지하는 화합물은 효과적인 HIV-1 억제제일 수 있다. 공동 내의 잔기는 다양한 HIV-1 단리물중에 고도로 보존된다. 더욱이, 공동-결합 구역(region)을 함유하는 C 펩타이드는 이 영역이 결핍된 DP178보다 저항성 바이러스의 진화에 대하여 감수성이 훨씬 더 적다(문헌[Rimsky, L. T., et al., J. Virol. 72 (1998) 986-993] 참조). 이러한 관찰은 고도로 보존된 꼬인 코일 표면, 특히 이의 공동을 표적으로 하는 높은 친화도 리간드는 다양한 HIV 단리물에 대하여 넓은 활성을 갖고 약물-이탈(escape) 돌연변이체에 의해 우회되기 어려울 것임을 시사한다.
외피 융합 단백질의 푸소젠 구조는 인플루엔자, 몰로니(Moloney) 쥐 백혈병 바이러스 및 유인원 면역결핍 바이러스(문헌[Chan, D. C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 15613-15617]에서 인용됨), 인간 호흡기 합포체 바이러스, 에볼라, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 및 유인원 파라인플루엔자에서 나타난다. 이는 오르토믹소비리대(orthomyxoviridae), 파리믹소비리대(paramyxoviridae), 레트로비리대(retroviridae) 및 기타 유사한 필로비리대(filoviridae) 과 사이의 밀접한 관계를 나타내며, 이들에서 표적 세포로의 바이러스 진입은 HIV-1의 gp41, 인플루엔자의 적혈구 응집소, 에볼라의 GP2 등 같은 유사 막통과 당단백에 의해 가능하게 된다(문헌[Zhao, X., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 14172-14177] 참조).
종래의 기술로서 펩타이드성 억제제(C 펩타이드)의 제조 방법이 기술되어 있다(문헌[Root, M. J., et al., Science 291 (2001) 884-888] 참조). 루트(Root) 등은 HIV-1, HXB2로부터 유래되고 잔기 625 내지 661을 함유하는 펩타이드 C37-H6을 기술하고 있다. 이는 대장균(E. coli)에서 발현되고 세균성 용해질(lysate)의 가용성 분획으로부터 정제된 GGR-연결자 및 히스티딘 표지(tag)를 갖는 N40-절편으로서 재조합적으로 표현되었다. 자오(Zhao, X) 등은 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 14172-14177]에서 잔기 153 내지 209, G-풍부 연결자, 잔기 476 내지 524, 인자 Xa 절단 부위 및 his-표지를 암호화하는 합성 유전자 recRSV-1(인간 호흡기 합포체 바이러스)를 기술하고 있다. 첸(Chen, C. H.) 등은 문헌[J. Virol. 67 (1995) 3771-3777]에서 MBP에 융합된, 잔기 540 내지 686로서의 합성된 gp41의 세포외 영역의 융합 단백질의 재조합적 발현을 기술하고 있다.
예컨대, 감염되지 않은 세포로의 레트로바이러스 전달을 억제함을 포함하는, 항푸소젠성(antifusogenic) 펩타이드로도 알려진 이러한 막 융합-관련 사건의 다수의 펩타이드성 억제제가 공지되어 있다. 이러한 펩타이드는 예컨대 문헌[Lambert, D. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 2186-2191], 미국 특허 제 6,013,263 호, 제 6,017,536 호 및 제 6,020,459 호, 및 국제 출원 공개 제 WO 00/69902 호, 제 WO 99/59615 호 및 제 WO 96/40191 호에 기술되어 있다. 융합 관련 사건의 추가 펩타이드가 예컨대 미국 특허 제 6,093,794 호, 제 6,060,065 호, 제 6,020,459 호, 제 6,017,536 호, 제 6,013,263 호, 제 5,464,933 호, 제 5,656,480 호 및 국제 출원 공개 제 WO 96/19495 호에 기술되어 있다.
바이러스 융합을 억제하는 HIV-1 gp41 엑토도메인으로부터 유래된 선형 펩타이드의 예로는 DP-107 및 DP-178이 있다. DP-107은 N-말단 융합 펩타이드 부근의 gp41의 부분이고 나선형으로 보이고, 이는 꼬인 코일 형성과 일치하는 방식으로 강력하게 올리고머화된다(문헌[Gallaher, W. R., et al., Aids Res. Hum. Retrovirus 5 (1989) 431-440; 및 Weissenhorn, W., et al., Nature 387 (1997) 426-430] 참조). DP-178은 gp41 엑토도메인의 C-말단 구역으로부터 유래된다(문헌[Weissenhorn, W., et al., Nature 387 (1997) 426-430] 참조). 용액중에서 식별할 수 있는 구조를 갖지 않지만, 이 펩타이드 및 이로부터의 구속된 유사체는 나선형 구조를 취하고, gp41의 N-말단 꼬인 코일 삼합체의 홈에 결합함으로써 gp41의 푸소젠 상태로의 변형을 방지한다(문헌[Judice, J. K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 13426-13430] 참조).
보통, 이러한 단쇄 펩타이드는 화학적 합성에 의해 제조된다. 화학적 합성 방법이 예컨대 문헌[Mergler, M., et al., Tetrahedron Letters 29 (1988) 4005-4008 and 4009-4012; Andersson, L., et al., Biopolymers 55 (2000) 227-250; 및 Jones, J. H., J. Pept. Sci. 6 (2000) 201-207]에 기술되어 있다. 또 다른 방법이 국제 출원 공개 제 WO 99/48513 호에 기술되어 있다.
그러나, 화학적 펩타이드 합성법은 몇몇 단점을 갖고 있다. 가장 중요한 것은 라세미화인데, 이는 광학적 순도를 불충분하게 만든다. 펩타이드 화학에서, 라세미화는 또한 몇몇 키랄 중심중의 하나에서 에피머화를 의미한다. 단일 커플링 단계에서 단지 1%의 라세미화만이 일어나더라도, 100개의 커플링 단계를 거치면 표적 펩타이드의 단지 61%만이 수득된다(문헌[Jakubke, H. D., Peptide, Spektrum Akad. Verlag, Heidelberg (1996), p. 198] 참조). 쇄 길이의 성장과 함께 불순분의 수가 증가하고 이의 제거가 더더욱 어렵고 비용이 많이 들게 됨은 자명하다.
대규모의 화학적 합성은 고비용과 출발 물질로서 보호된 아미노산 유도체의 이용성 부족으로 제한받는다. 한편, 이들 출발 물질은 완전한 반응을 가능하게 하기 위하여 과량으로 사용되어야 하고, 다른 한편 이들 사용은 비용 사정, 안전성 및 환경 측면에 균형을 맞춰야 한다(문헌[Andersson et al., Biopolymers 55 (2000) 227-250] 참조).
또한, 펩타이드는 재조합 DNA 기술로 제조될 수 있다. 50개 초과의 아미노산 쇄 길이의 가용성 단백질의 재조합 제조는 현재 기술적 수준에서 공지되어 있고, 50개 미만의 아미노산의 펩타이드의 제조는 몇 가지 단점을 갖고 있다[Doebeli, H., et al, Protein Expression and Purification 12 (1998) 404-414] 참조). 보통, 이러한 단쇄 또는 중쇄 펩타이드는 안정적으로 발현되지 않는다. 이들은 고유의 펩티다제에 의해 공격을 받아 분해된다. 이는 이들의 작은 크기때문이거나 고도로 정렬된 3차 구조가 없기 때문일 수 있다(국제 출원 공개 제 WO 00/31279 호 참조). 다른 연구자들은 펩타이드의 재조합 제조는 안정한 발현을 위해 60 내지 80개의 아미노산의 최소 쇄 길이가 필요하다는 것을 밝혔고, 이러한 펩타이드는 봉입체(inclusion body)가 아니라 가용성 펩타이드로서 제조된다는 것이 더 통상적인 지식이다(문헌[van Heeke, G., et al., Methods in Molecular Biology 36 (1994) 245-260, eds. B. M. Dunn and M. W. Pennington, Humana Press Inc., Totowa, N.J.); 및 Goldberg et al., Maximizing Gene Expression (1986), pp. 287-314, eds. Reznikoff, W., and Gold, L., Butterworks, Stoneham, MA] 참조). 짧은 펩타이드의 재조합 제조는, 이러한 펩타이드가 원핵 생물에서 발현되는 경우, 이들이 가용성으로 존재하여 원핵성 펩티다제에 의해 즉시 분해될 수 있기 때문에 특히 성공적이지 못하다. 이 문제를 피하기 위하여, 통상의 지식에 따라 이러한 펩타이드는 큰(150 내지 200개 초과의 아미노산) 융합 단백질로서 발현되고, 이에 따라 융합 꼬리(tail)는 융합 단백질을 완전히 가용성으로 만들어 봉입체의 형성을 피하거나, 또는 융합 꼬리는 원핵 생물에서 재조합 발현중 봉입체를 형성하는 단백질로서 이러한 융합 꼬리 및 목적한 짧은 펩타이드로 구성된 융합 단백질은 또한 원핵 생물에서 과발현중 봉입체를 형성할 것이다. 이러한 방법의 중대한 단점은 융합 꼬리의 분자량이 목적한 펩타이드의 분자량보다 상당히 크다는 점이다. 따라서, 목적한 펩타이드의 수율이 매우 낮고, 과량의 절단된 융합 꼬리를 분리해내야 한다.
레파지(Lepage, P.) 등의 문헌[Analytical Biochemistry 213 (1993) 40-48]에는 HIV-1Rev 펩타이드의 제조를 위한 재조합 방법이 기술되어 있다. 이 펩타이드는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A의 합성 면역글루불린 유형 G(IgG) 결합 도메인과의 융합 단백질로서 발현된다. 이 펩타이드는 약 20개의 아미노산 길이를 갖는 반면, IgG-결합 부분은 약 170개의 아미노산 길이를 가지므로, 발현된 융합 단백질이 약 190개의 아미노산의 전체 길이를 갖는다. 이 융합 단백질은 배지에서 가용성 형태로 발현되고 분비되어 친화도 크로마토그래피로 정제된다. 이 저자는 이 방법으로 배양액 1ℓ당 수백 mg의 양으로 재조합 단백질을 제조할 수 있다고 보고하였다. 그러나, 이 방법론은 신호 펩타이드 서열 내에서의 또 다른 공정 및 융합된 단백질과 절단 펩타이드의 여러 번역후 변형으로 인하여 제한된다. 아미노산의 평균 분자량을 110달톤으로 가정할 때, 목적한 펩타이드는 약 2,000 내지 5,000달톤의 분자량을 갖는 반면, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A의 IgG 결합 도메인이 융합 꼬리로 사용되는 경우, 이 융합 꼬리는 적어도 170개의 아미노산(약 19,000달톤)의 길이를 갖는다. 그러므로, 재조합적으로 제조된 단백질의 10 내지 25%만이 목적한 펩타이드이다.
유럽 특허 제 EP 0 673 948 호에는 발현 벡터 pSEM3(문헌[Knapp, S., et al., BioTechniques 8 (1990) 280-281] 참조)을 이용하여 β-갈락토시다제와의 융합 단백질로서 gp41 펩타이드를 재조합적으로 제조하는 방법이 기술되어 있다. 이 융합 단백질은 N-말단 375개의 아미노산을 암호화하는 β-갈락토시다제 유전자의 큰 부분 및 추가의 23개 코돈의 다중연결자 서열을 함유한다.
대장균(E. coli)에서 큰 융합 단백질을 통해 작은 펩타이드를 재조합 제조하는 추가의 예 및 방법이 문헌[Uhlen and Moks, "Gene Fusions For Purposes of Expression, An Introduction" in Methods in Enzymology 185 (1990) 129-143, Academic Press]에 기술되어 있다. "봉입체" 방식을 통한 제조와 관련하여, 울렌(Uhlen)과 목스(Moks)는 trpE, cII 및, 또한 β-갈락토시다제 같은 융합 부분을 포함하는 큰 융합 생성물을 언급하고 있다. 문헌[Ningyi, L., et al., Gaojishu Tongxun 10 (2000) 28-31]에서는 대장균(E. coli)에서 p24 gag 유전자의 재조합 발현을 기술하고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 봉입체 경로를 통하여 항푸소젠성 펩타이드를 고수율로 재조합적으로 제조할 수 있게 하고 이러한 펩타이드의 대규모 산업적 생산에 적합한 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
따라서, 본 발명은 항푸소젠성 펩타이드를 원핵 숙주 세포에서 약 약 14 내지 70개 아미노산 길이의 융합 펩타이드로서 제조하는 방법으로서, 상기 융합 펩타이드의 봉입체가 형성되는 조건하에서,
(a) 약 4 내지 30개의 아미노산 길이의 추가 펩타이드에 N-말단이 연결된 약 10 내지 50개의 아미노산 길이의 항푸소젠성 펩타이드로 구성된 융합 펩타이드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에서 발현시키는 단계;
(b) 숙주 세포를 배양하는 단계;
(c) 형성된 봉입체를 회수하고 가용화하는 단계; 및
(d) 융합 펩타이드를 단리하는 단계
를 특징으로 하는, 항푸소젠성 펩타이드의 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는, 항푸소젠성 펩타이드는 봉입체의 가용화중 또는 가용화후 추가 펩타이드로부터 절단된다. 바람직하게는, 항푸소젠성 펩타이드는 렌티바이러스 속 바이러스의 외피 융합 단백질의 막통과 서브유니트의 C 나선의 단편이다.
상기 추가 펩타이드는, 비융합 펩타이드로서 상기 숙주 세포에서 재조합적으로 발현되는 경우, 매우 짧기 때문에 봉입체의 형태로서 발견되지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 추가 펩타이드는 제 1 부분 및/또는 제 2 부분으로 구성되며, 이때
(a) 제 1 부분은 융합 펩타이드의 등전점(isoelectric point)에 영향을 미치는 1 내지 20개의 아미노산, 바람직하게는 친수성 아미노산의 연장부이고/이거나 제 1 부분은 용해도 및 크로마토그래피 분리 수지와의 상호작용에 있어서 항푸소젠성 펩타이드와는 상당히 다르고/다르거나 절단 단백질 분해 효소의 접근을 향상시키고(문헌[Polyak, S. W., et al., Protein Eng. 10 (1997) 615-619] 참조),
(b) 제 2 부분은 1 내지 10개의 아미노산(예컨대, 하기 표 3 참조)의 절단될 수 있는 펩타이드성 연결자 구역이고 푸소젠성 펩타이드의 N-말단 및 제 1 부분의 C-말단에 인접하여 위치한다.
추가 펩타이드가 제 1 부분 또는 제 2 부분만으로 구성되는 경우, 이 부분은 바람직하게는 mRNA 발현중 안정화를 위하여 적어도 4개의 아미노산(출발 코돈 부호화 메티오닌 포함) 길이를 갖는다. 바람직하게는, 이 4개의 아미노산은 적어도 하나의 아르기닌을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 항푸소젠성 펩타이드는 이의 C-말단에 부착된 글라이신을 함유한다. 이 글라이신은 효소적 C-말단 아미드화에 유용하다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 융합 펩타이드에서 항푸소젠성 펩타이드의 분자량과 추가 펩타이드의 분자량의 비율은 10:1 내지 1:2이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시태양은 본 발명에 따른 융합 펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는 원핵성 발현 벡터 및 상기 펩타이드의 재조합적 제조를 위한 이의 사용을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시태양은 본 발명에 따른 융합 펩타이드의 봉입체의 제조물 및 이러한 봉입체의 제조 방법을 포함한다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시태양은 본 발명에 따른 융합 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다.
도 1은 Xa-T 1357을 암호화하는 발현 벡터를 나타낸다.
본 발명자들은 봉입체 경로를 통하여 대장균(E. coli) 같은 원핵 생물에서 단쇄의 항푸소젠성 펩타이드(바람직하게는, 10 내지 50개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 10 내지 40개의 아미노산 길이)가 70개의 아미노산 길이 이하의 짧은 융합 펩타이드로서 성공적으로 발현될 수 있다는 놀라운 사실을 발견하였다.
본 발명에 따라, 추가 펩타이드에 N-말단이 연결된 항푸소젠성 펩타이드로 구성된 융합 펩타이드가, 불용성 단백질 봉입체가 형성되는 조건하에서 원핵 생물에서 과발현된다. 봉입체는, 원형질막 주위공간(periplasm) 또는 매질 내로 가용성 단백질의 분비를 가능케 하는 신호 서열을 함유하지 않는 발현 벡터가 사용되는 경우 세포질에서 발견된다. 이 봉입체는 예컨대 세포 용해후 원심분리에 의해 다른 세포 성분으로부터 분리된다. 이 봉입체는 구아니딘 염산염, 우레아와 같은 변성제, 아르기닌 같은 물질, 또는 KOH 또는 NaOH 같은 강염기에 의해 가용화된다. 가용화후, 보통 이러한 단백질은 희석 또는 투석에 의해 되접힌다. 본 발명의 방법에 따라 제조되는 융합 펩타이드는 디설파이드 다리를 갖지 않는 단쇄 펩타이드이므로 재생(renaturation)이 필요하지 않다. 가용화후, pH 등 같은 용액 조건은 추가 펩타이드가 절단될 수 있도록 하는 방식으로 간단히 조정되고, 필요시 절단을 수행한다. 이어서, 융합 펩타이드 또는 항푸소젠성 펩타이드를 간단한 방식으로, 예컨대 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피에 의해 용액으로부터 회수할 수 있다.
본원에 사용된 "항푸소젠성" 및 "항-막 융합"은, 펩타이드의 부재시에 구조간에 일어나는 막 융합의 수준에 비해, 2종 이상의 구조, 예컨대 세포 막 또는 바이러스 외피 또는 모(pili) 사이의 융합 사건의 수준을 억제 또는 감소시키는 펩타이드의 능력을 가리킨다. 이의 예로는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPV), 홍역 바이러스(MEV) 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV) 같은 렌티바이러스의 펩타이드 억제제가 있다. 이러한 항푸소젠성 펩타이드는 렌티바이러스 속의 바이러스의 외피 융합 단백질의 막통과 서브유니트의 C 나선으로부터 유래하고 각각의 바이러스의 막통과 아단위의 중심 꼬인 코일에 결합한다.
HIV-1 항푸소젠성 펩타이드가 특히 바람직하다. 하기 표 1은 gp41의 C-펩타이드로부터 유래된 HIV-1 항푸소젠성 펩타이드의 예를 나타낸다. 이들 항푸소젠성 펩타이드 및 이의 단편은 본 발명에 특히 유용하다.
본 발명에 따른 추가 펩타이드는 봉입체의 형성을 향상시키기 위함이 아니고 항푸소젠성 펩타이드의 N-말단에 첨가되는 펩타이드이다. 이의 목적은, 예컨대 발현 mRNA 안정화 및 정제(예: His-표지; 문헌[Zhang, J.-H., et al., Nanjing Daxue Xuebao, Ziran Kexue 36(4) (2000) 515-517] 참조)를 개선시키거나 아세틸화 또는 PEG화 같은 후속의 N-말단 변형을 가능케 하기 위함이다.
본 발명에 따른 추가 펩타이드는 적어도 4개의 아미노산(메티오닌 및 절단, mRNA 안정화 및/또는 발현 목적을 위한 3개의 추가의 아미노산) 내지 약 30개의 아미노산, 바람직하게는 약 20개의 아미노산(핵산 코돈 수준에 관하여)으로 구성된 짧은 펩타이드성 연장부(stretch)이다. 추가 펩타이드가, 면역글로불린, 스트렙타비딘 또는 조직형 플라스미노겐 활성화제 같은 큰 단백질이 봉입체로서 제조되는 조건하에서 원핵 생물에서 재조합 발현중 세포질에서 가용성 형태로 형성되는 펩타이드인 한, 이 추가 펩타이드의 길이는 본 발명에 결정적이지 않다. 그러나, 이 추가 펩타이드는 항푸소젠성 펩타이드의 수율을 향상시키기 위하여 매우 짧은 것이 바람직하다(동일한 양의 융합 펩타이드가 제조되었다고 가정할 때 추가 펩타이드 대 항푸소젠성 펩타이드의 길이의 비율이 3:1인 경우 회수되는 항푸소젠성 펩타이드의 양은 이 비율이 1:1인 경우에 비하여, 약 50% 더 적다). 추가 펩타이드의 길이는, 허용되는 수율의 항푸소젠성 펩타이드를 얻기 위하여, 융합 펩타이드의 총 길이가 약 70개의 아미노산, 바람직하게는 약 50개의 아미노산, 가장 바람직하게는 약 40개의 아미노산을 넘지 않도록 선택된다. 따라서, 추가 펩타이드가 적절한 절단 부위, 융합 펩타이드의 발현 및 용해도를 향상시키고 봉입체의 가용화 과정을 촉진하거나 절단 단백질 분해 효소의 접근(입체 장애의 기피)을 향상시키기 위한 일부의 아미노산 및/또는 정제 수단을 위한 His-표지(문헌[Hengen, P., Trends Biochem. Sci. 20 (1995) 285-286] 참조) 및 출발 코돈에 필수적이고 이에 의해 암호화되는 메티오닌 같은 일부 아미노산만으로 구성되는 것이 특히 바람직하다.
추가 펩타이드는, 대장균(E. coli) 같은 원핵 생물에서 단독으로 과발현되고 신호 서열이 없는 경우, 봉입체로서 형성되지 않고 세포질에 가용화되어 남거나, 세포질에서 급속하게 분해되는 단쇄 펩타이드이다. 이러한 단백질은 고정된 변성 3차 구조를 형성하지 않고, 따라서 이는 거의 가용성이지 않은 고정된 3차 구조를 형성할 수 없으므로, 가용성인 상태로 남아, 발현되는 경우 대장균(E. coli) 단백질 분해 효소에 의해 분해될 것이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 추가 펩타이드는 푸소젠성 펩타이드와 추가 펩타이드 사이의 절단 부위에 절단제가 접근하는 것을 입체적으로 방해할 수 있는 고정된 3차 입체구조를 형성하지 않는 아미노산으로 구성된다. 이러한 이유로, 바람직하게는 추가 펩타이드에는 시스테인 잔기가 없다. 시스테인은 고도로 반응성이고 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 설프하이드릴 또는 티올 기를 함유한다. 시스테인의 존재는 추가의 펩타이드에 고정된 2차 또는 3차 입체구조가 없어야 바람직하다는 측면에서 역작용을 할 수 있으며, 따라서 이의 사용을 피한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, N-말단에 부착되는 추가 펩타이드 연장부는 효소적 또는 화학적 수단에 의해 용이하게 절단될 수 있는 C-말단 서열을 함유한다.
본 발명에 따른 추가 펩타이드는 또한 바람직하게는 발현, 가용화, 정제 및 펩타이드 변성중 항푸소젠성 펩타이드의 N-말단의 보호를 위해 융합 펩타이드에 사용된다. 이러한 융합 펩타이드는 N-말단 변성된 항푸소젠성 펩타이드의 제조 방법에 특히 가치가 있다. 이러한 방법은 융합 펩타이드로서 재조합 폴리펩타이드를 형성시킴을 포함하고, 이 융합 부분이 N-말단을 보호한다. 이어서, 재조합 융합 펩타이드를 3개 이하의 화학적 보호제와 반응시켜 반응성 측쇄 기를 선택적으로 보호하고, 이에 따라 측쇄 기가 변성되는 것을 방지할 수 있다. 이어서, 펩타이드와 융합 부분 사이에서 적어도 하나의 절단 시약으로 융합 펩타이드를 절단하여 보호되지 않은 말단 아미노산 반응성 기를 형성시킨다. 보호되지 않은 말단 아미노산 반응성 기는 N-말단 아세틸화를 위한 아세트산 무수물 또는 아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르 같은 적어도 하나의 화학적 변성제로 변성된다. 이어서, 측쇄를 탈보호하여 N-말단 변성된 펩타이드를 형성한다. 이러한 방법은, 예컨대 국제 출원 공개 제 WO 94/01451 호, 미국 특허 제 5,635,371 호 및 제 5,656,456 호에 기술되어 있다.
바람직하게는, 추가 펩타이드 부분은 융합 펩타이드의 정제를 촉진하는 구조를 갖는다. 바람직하게는, 추가 펩타이드는 이러한 목적으로 "친화도 표지(affinity tag)", 예컨대 폴리히스티딘(약 6 His 잔기) 등을 함유한다(문헌[Pandjaitan, B., et al., Gene 237 (1999) 333-342] 참조).
용이하게 발현되고 절단후 단편을 용이하게 분리할 수 있도록 항푸소젠성 펩타이드의 등전점(IP)과 다른 등전점을 갖는 방식으로 추가 펩타이드를 선택하는 것이 바람직하다. 하기 표 2는 다양한 융합 펩타이드의 IP 및 비융합 푸소젠성 펩타이드 T680 및 T1357(국제 출원 공개 제 WO 96/40191 호 및 제 WO 99/59615 호에 따른 명명)의 IP를 보여준다. 바람직하게는, 융합 펩타이드와 융합 펩타이드의 항푸소젠성 부분의 IP는 약 1 pH 단위, 바람직하게는 약 1 내지 2 pH 단위만큼 다르다. 바람직하게는, 이러한 IP 이동은 추가 펩타이드에 함유된 염기성 아미노산 및/또는 히스티딘에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시태양에서, 항푸소젠성 펩타이드는 C-말단에 글라이신을 함유한다. 이 글라이신은 후속의 효소적 C-말단 아미드화에 유용하다(문헌[Bradbury, A. F., and Smyth, D. G., Trends Biochem. Sci. 16 (1991) 112-115] 참조).
본 발명에 따른 특히 바람직한 융합 펩타이드로는 하기의 것들이 포함된다(표준 1문자 부호로 나타낸 아미노산):
MRGS-HHHHHH-AIDV-IEGR-T1357-G(서열 번호: 2)
MRGS-HHHHHH-AIDV-IEGR-RSV118-G(서열 번호: 11)
MRGS-HHHHHH-AIDV-IEGR-MV257-G(서열 번호: 12)
M-HHHHHH-AIDV-IEGR-T680-G(서열 번호: 13) 및
M-HHHHHH-IEGR-T1357-G(서열 번호: 14)
폴리 His-표지(His 6)를 갖지 않는 상기 융합 펩타이드, 또는 서열 번호: 2, 11 또는 12의 최초 4개 아미노산을 추가 펩타이드로 갖는 융합 펩타이드도 바람직하다.
상기 서열에서, 기울은 문자 부분은 펩타이드 명칭이고, 그러므로 이들 부분에 포함된 문자는 아미노산에 대한 1문자 부호를 구성하지 않는다.
봉입체 경로를 통하여 원핵 생물에서 재조합 단백질 제조법을 기술하고 있는 많은 수의 공개문헌이 있다. 그러한 문헌의 예로는 문헌[Misawa, S., et al., Biopolymers 51 (1999) 297-307; Lilie, H., Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1998) 497-501; 및 Hockney, R. C., Trends Biotechnol. 12 (1994) 456-463]이 있다.
본 발명에 따른 융합 펩타이드는 원핵 생물에서 과발현된다. 신호 펩타이드를 갖지 않는 과발현은 봉입체의 형성을 일으킨다. 출발 코돈에 의해 부호화되고 앞의 예에서 언급된 메티오닌은 추가의 공정중 절단될 수 있다. 원핵 생물에서 단백질의 과발현을 위한 일반적 방법은 당해 기술분야에 오랫동안 널리 알려져 있다. 이 기술분야의 문헌의 예로는 문헌[Skelly, J. V., et al., Methods Mol. Biol. 56 (1996) 23-53; 및 Das, A., Methods Enzymol. 182 (1990) 93-112]이 있다.
원핵 생물에서의 과발현은 tac 또는 lac 촉진자 같은 촉진자를 갖는 최적화된 발현 카세트를 이용한 발현을 의미한다(유럽 특허 제 EP-B 0 067 540 호). 보통, 이는 화학 유도성 촉진자 또는 온도의 이동을 통해 유도될 수 있는 촉진자를 함유하는 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 대장균(E. coli)에 유용한 촉진자중 하나는 온도-감수성 λPL 촉진자(유럽 특허 제 EP-B 0 041 767 호 참조)이다. 추가의 효율적인 촉진자는 tac 촉진자(미국 특허 제 4,551,433 호 참조)이다. 대장균(E. coli) 같은 원핵 생물을 위한 이러한 강한 조절 신호는 보통 박테리아-공격(chanllenging) 박테리오파지로로부터 기원한다(문헌[Lanzer, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 8973-8977; 및 Knaus, R., and Bujard, H., EMBO Journal 7 (1988) 2919-2923]; λT7 촉진자에 대한 경우는 문헌[Studier, F. W., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 60-89)]; 및 T5 촉진자의 경우는 유럽 특허 제 EP 0 186 069 호 참조).
이러한 과생산 원핵 세포 발현 체계를 이용함으로써, 본 발명에 따른 융합 펩타이드가 총 발현된 세포의 단백질의 적어도 10%, 전형적으로는 30 내지 40%, 경우에 따라서는 50%만큼 높게 제조될 수 있다.
본원에 사용되는 "봉입체(IB)"는 원핵 생물에서 암호화 핵산의 과발현후 재조합적으로 제조된 폴리펩타이드의 불용성 형태를 가리킨다. 이 현상은 당해 기술분야의 기술적 수준에서 널리 알려져 있으며, 예컨대 문헌[Misawa S., and Kumagai, I., Biopolymers 51 (1999) 297-307; Guise, A. D., et al., Mol. Biotechnol. 6 (1996) 53-64; 및 Hockney et al., Trends Biotechnol. 12 (1994) 456-463]에서 검토되고 있다.
바람직하게는, 봉입체의 가용화는 우레아, 구아니딘 염산염, 또는 KOH 또는 NaOH 같은 알칼리성 용액 같은 변성제를 첨가함으로써 수행된다(문헌[Guise, A. D., et al., Mol. Biotechnol. 6 (1996) 53-64; Fischer, B., et al., Arzneimittelforschung 42 (1992) 1512-1515] 참조).
본 발명에 따른 융합 펩타이드는 특이적 절단 단백질 분해 효소(제한 단백질 분해 효소)를 이용하여 가용화후 효소적으로 절단될 수 있다. 단백질 분해 효소는 제조되는 항푸소젠성 펩타이드의 아미노산 서열을 고려하여 선택된다. 가능하다면, 제한 단백질 분해 효소의 인식/절단 서열이 항푸소젠성 펩타이드에서 나타나지 않고, 바람직하게는 또한 추가 펩타이드에서 나타나지 않음에 주의하여야 하는 바, 즉 이는 절단 영역(연결자 구역)에서 단 한 번만 발생하여야 한다. 적합한 특이적 절단 엔도프로티나제(endoproteinase)로는, 예컨대 Xa 인자, 트롬빈, 섭틸리신, BTN 변이체/유비퀴틴 단백질 분해 효소 펩티다제, 레닌, 콜라게나제, 트립신, 키모트립신, 엔도프로티나제 Lys-C, 칼리크레인(문헌[Carter, P.: In: Ladisch, M. R.; Willson, R. C.; Painton, C. C.; Builder, S. E., eds., Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes; 및 ACS Symposium Series No. 427, American Chemical Society, pp. 181-193 (1990)] 참조), TEV 단백질 분해 효소(문헌[Parks, T. D., et al., Anal. Biochem. 216 (1994) 413-417] 참조), IgA 단백질 분해 효소(문헌[Pohlner, J., et al., Nature 325 (1987) 458-462] 참조), Kex2p 단백질 분해 효소(유럽 특허 공개 제 EP-A 0 467 839 호 참조) 또는 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) V8 단백질 분해 효소가 있다.
시스테인의 부재 외에, 바람직하게는 추가 펩타이드의 서열은 예정된 절단 환경에서 효율적인 절단을 촉진하는 기타의 설계 전략을 이용할 수 있다. 특히 예정된 절단제가 엔도펩티다제인 경우, 추가 펩타이드가 수성 환경에서 가용성인 것이 바람직하다. 따라서, 바람직하게는 용해도를 촉진하기 위하여 하전된 측쇄 기 및 친수성 성질을 갖는 아미노산 또는 절단 단백질 분해 효소의 접근을 촉진하는 다른 임의의 아미노산이 추가 펩타이드 내에 포함되는 것이 바람직하다. 이러한 아미노산으로는, 예컨대 Glu 및 Asp(음이온성), Arg 및 Lys, 및 Ser 및 Thr(중성, 친수성)이 있다. 아르기닌이 사용되는 경우, 아르기닌은 트립신 절단 부위를 구성함을 유의하여야 한다. 따라서, 추가 펩타이드가 아르기닌을 함유하는 이러한 경우, 절단 단백질 분해 효소로서 트립신은 피해야 한다. 또한, 라이신의 사용도 제한을 받는다. 펩타이드가 N-말단이 변성되어야 하는 경우(상기 참조), 라이신 기를 보호할 필요가 있을 수 있다. 따라서, 이러한 경우, 추가 펩타이드에서 라이신을 피하는 것이 바람직하다.
전형적으로, 절단 부위는 항푸소젠성 펩타이드 내에 함유되지 않고, 바람직하게는 추가 펩타이드에 함유되도록 선택된다. 화학적 및 효소적 절단 부위 및 이 부위의 하나에 가까운 펩타이드 결합의 절단에 사용되는 상응하는 작용제는, 예컨대 국제 출원 공개 제 WO 92/01707 호 및 제 WO 95/03405 호에 기술되어 있다.
절단 효소 및 절단 서열의 예를 하기 표 3에 나타낸다:
바람직하게는, 트립신이 사용되고, 이는 아르기닌의 C-말단 종점에서 단백질 및 펩타이드를 특이적으로 절단한다. 이러한 효소는 공지되어 있으며, 예컨대 돼지 또는 소의 췌장으로부터 또는 재조합 효모로부터 얻는다. 트립신은 라이신 잔기가 보호되고 효소에 의해 공격받는 경우, 목적하는 폴리펩타이드를 제조하는 데 특히 적합하다.
엔도프로티나제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열은 본 발명의 의미 내에서 바람직하게는 1 내지 20개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산으로 구성되고, 목적하는 엔도프로티나제에 대한 C-말단 절단 부위를 함유하는 단쇄 펩타이드 서열로서 이해된다. 바람직하게는, 이러한 추가 펩타이드는 N-말단 종점과 목적하는 엔도프로티나제 인식 서열의 사이에 몇 개의 아미노산(제 1 부분), 바람직하게는 아미노산 Gly, Thr, Ser, Ala, Pro, Asp, Glu, Arg 및 Lys로부터 선택된 몇 개의 아미노산의 조합을 추가적으로 함유한다. 바람직하게는, 2 내지 8개의 이들 추가의 아미노산이 음으로 하전된 아미노산 Asp 및/또는 Glu인 아미노산 연장부가 제 1 부분으로서 사용된다.
또한, 항푸소젠성 펩타이드가 메티오닌을 함유하지 않는 한, BrCN을 이용한 절단 또한 가능하다(화학적 절단).
융합 펩타이드는 원핵 생물에서 펩타이드를 부호화하는 DNA(핵산 서열)의 발현에 의해 제조된다. 발현 벡터는 융합 펩타이드의 배지 또는 원형질막 주위공간 내로의 분비를 매개하는 임의의 요소(예: 신호 펩타이드)를 포함하지 않는다. 따라서, 이 펩타이드는 불용성 굴절체(refractile body)(IP)로서 형성된다.
융합 단백질을 암호화하는 DNA는 당해 기술분야의 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 숙주 세포에서 발현을 최적화하기 위하여 추가의 조절 및 전사 요소를 갖도록 핵산 서열을 연장하는 것이 더 바람직하다. 바람직하게는, 발현에 적합한 DNA는 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 당해 기술분야의 숙련자에게 친숙하며, 예컨대 문헌[Beattie, K. L., and Fowler, R. F., Nature 352 (1991) 548-549]; 유럽 특허 제 EP-B 0 424 990 호; 및 문헌[Itakura, K., et al., Science 198 (1977) 1056-1063]에 기술되어 있다. 또한 본 발명에 따라 펩타이드의 핵산 서열을 변성시키는 것이 편리할 수 있다.
이러한 변성으로는, 예컨대 결찰(ligation), 클로닝 및 돌연변이 유발 단계를 용이하게 하는 제한 효소의 다양한 인식 서열을 도입하기 위한 핵산 서열의 변성; 숙주 세포에 바람직한 코돈을 도입하기 위한 핵산 서열의 변성; 및 숙주 세포에서 발현을 최적화하기 위한 추가의 조절 및 전사 요소를 갖도록 하는 핵산 서열의 연장이 있다.
적합한 발현 벡터의 제조 방법 및 발현 방법에서 모든 추가의 단계는 당해 기술분야에 공지된 기술로서 당해 기술분야의 숙련자에게 친숙하다. 이러한 방법은, 예컨대 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA]에 기술되어 있다.
융합 펩타이드는 분비되지 않으므로 세포, 바람직하게는 세포질에 응집된다. 여기서 펩타이드가 압축되고 불용성 형태(봉입체)로서 저장된다. 이는 단백질 가수분해 같은 세포 작용을 최소로 감소시킨다.
예컨대, 대장균(Escherichia coli), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 또는 바실루스(Bacillus)가 원핵 숙주 생물로서 적합하다. 본 발명에 따른 융합 펩타이드의 제조의 경우, 이 펩타이드를 부호화하는 DNA를 함유하는 벡터로 통상의 방식으로 형질전환되고, 이어서 통상의 방식으로 발효된다. 세포의 용해후, 불용성 불활성 펩타이드(IB)를 통상의 방식으로, 예컨대 원심분리로 단리한다(펠렛 분획). 필요시 펠렛을, 예컨대 계면활성제를 함유하는 완충액으로 세척함으로써 목적하는 불용성 펩타이드 응집괴를 더욱 풍부하게 만들 수 있다.
바람직하게는, 불용성 융합 펩타이드는 알칼리성 용액(예: KOH, pH 10)으로 가용화시키고 적절한 수단으로, 예컨대 pH 8에서 인자 Xa로 절단될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명에 따라 제조된 융합 펩타이드가 숙주 세포에서 분해되지 않고 봉합체로서 형성되고, 그 결과로서 항푸소젠성 펩타이드 성분 자체 내에서의 유의성있는 절단이 없이 효소적으로 완전히 절단될 수 있는 것으로 나타났다.
도 1을 참조하는 하기 실시예 및 서열 목록은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구의 범위에 기재된다. 본 발명의 기술 사상으로부터 벗어남이 없이 개진된 과정에 변형을 가할 수 있음은 물론이다.
서열 목록
서열 번호:1 합성 유전자 Xa-T 1357.
서열 번호:2 펩타이드 Xa-T1357.
서열 번호:3 프라이머 1.
서열 번호:4 프라이머 2.
서열 번호:5 프라이머 3.
서열 번호:6 프라이머 4.
서열 번호:7 펩타이드 T1357.
서열 번호:8 펩타이드 T680.
서열 번호:9 펩타이드 RSV118.
서열 번호:10 펩타이드 MV257.
서열 번호:11 펩타이드 Xa-RSV118.
서열 번호:12 펩타이드 Xa-MV257.
서열 번호:13 펩타이드 M-HHHHHH-AIDV-IEGR-T1357-G.
서열 번호:14 펩타이드 M-HHHHHH-IEGR-T1357-G.
서열 번호:15 펩타이드 M-HHHHHH-IEGR-T680-G.
서열 번호:16 절단 서열.
서열 번호:17 절단 서열.
서열 번호:18 절단 서열.
서열 번호:19 절단 서열.
실시예 1
발현 벡터 구성
합성 유전자 Xa-T1357은 N-말단에서 C-말단으로 하기 구조를 가지며, 서열 번호: 1로 기술된다:
EcoRI 절단 부위,
파지 T5의 리보솜 결합 부위,
아미노산 M, R, G, S,
아미노산 6xH(His-표지),
아미노산 A, I, D, V,
인자 Xa 연결자 I, E, G, R,
T1357 서열(39개의 아미노산),
아미노산 G,
2개의 정지 코돈, 및
BamHI 절단 부위.
20, 21 및 20 염기쌍의 3개의 중첩 구역을 갖는 유전자 서열로 구성된 4개의 올리고뉴클레오타이드를 이용한 유전자 합성을 통하여 상기 합성 유전자를 구성하였다. 2단계 PCR 반응에 의해 합성을 수행하였다. 제 1 단계에서, 올리고 1 및 2, 및 올리고 3 및 4를 각각 유전자의 N-말단 부분 및 유전자의 C-말단 부분의 완전한 합성을 위한 주형(template)으로서 적용하였다. 생성물을 제 2 단계를 위한 주형으로서 사용하였고, 이들 생성물의 동일한 부분이 적용되었다. 이 단계의 합성 프라이머로서 프라이머 1 및 4를 사용하였다.
생성된 합성 유전자를 EcoRI 및 BamHI로 분해(digest)하여 벡터 pQE-30(독일 소재의 키아겐(Qiagen))을 얻었다. 두 제한 절단 분해물을 겔 추출(키아겐)로 정제한 후, 발현 벡터의 제조를 위한 결찰에 사용하였다. 삽입물 대 벡터의 비율은 3:1이었다. 이 벡터를 도 1에 나타낸다.
구성물의 서열 및 정확한 배향을 제한 조절 및 서열 결정법(독일 소재의 세퀴서브(SequiServe))으로 결정하였다.
실시예 2
발효, IB 단리 및 가용화
발효 및 IB 단리
실시예 1의 발현 벡터를 함유하는 대장균(E. coli)을 암피실린 및 카나마이신 선택성을 갖는 복합 배지에서 발효시켰다. 예비배양에 LB 배지를 사용하였다. 주 배양의 경우, 효모 추출물을 C- 및 N-공급원으로서 유일한 복합 성분으로서 사용하고, 글리세린을 추가의 C-공급원으로서 사용하였다. 공급-배치상(fed-batch phase)중 농축 형태로 두 성분을 첨가하였다. 적합한 성장 상에서 IPTG를 이용한 발현을 유도하였다. 인산/가성 소다를 이용하여 pH 값을 7±0.2로 조정하였다. 0.5바 이하의 과압으로 발효를 수행하였다. 교반기의 회전 속도, 통기 및/또는 투여 속도를 통해 산소 분압을 조절하였다. 성장 중지후 및 상응하는 발현 시간후, 생물덩이(biomass)를 즉시 또는 냉각후 원심분리법으로 수확하고 냉동 상태로 저장하였다.
발현된 외부 단백질을 봉입체(IB) 형태로 세포내에서 수득하고, IB 제조물을
처리하고 정제를 수행하였다. 이를 위하여, 균질화기를 이용하여 생물덩이를 분쇄하고, IB를 수회 세척하고 원심분리하여 정제하였다.
가용화
분쇄 완충액(100mM Tris-HCl, 10mM EDTA, pH 7.0) 100ml중의 고압 분쇄된 세포 20g으로 제조된 IB 5.21g을 pH 12의 30mM KOH 206ml에 교반하면서 실온에서 용해시켰다.
단백질 내용물 용해물: c=3.2mg/ml(브래드포드(Bradford) 단백질 분석법, 문헌[Bradford M. M., Analytical Biochemistry 72 (1976) 248-254] 참조) -> 총 단백질 659.2mg.
융합 펩타이드의 분자량: MW=7161.96(7156.05 단일동위원소)
동일한 방식으로 펩타이드,
MRGS-HHHHHH-AIDV-IEGR-RSV118-G(서열 번호:11) 및
MRGS-HHHHHH-AIDV-IEGR-MV257-G(서열 번호:12)를 제조하였고, 서열 "T 1357" 대신에 서열 RSV 118 및 MV 257(상기 표 1 참조)을 사용하였다.
실시예 3
시트라콘화(Citraconylation) 및 절단
(a) 시트라콘화
시트라콘화를 위하여, 융합 펩타이드에 시트라콘산 무수물((MW: 112.09, p=1.245g/ml) 및 디옥산의 1:1 비율의 혼합물을 적용하였고, 이때 시트라콘산 무수물은 아미노 기 1몰당 12배 과량으로 사용되었다. 시트라콘화를 위하여, 융합 펩타이드(MW: 7162, 실시예 2b의 분쇄 완충액중 C=3.2mg/ml) 0.66g, 5개의 아미노 기/분자 및 시트라콘산 무수물 570㎕가 필요하였다. 진한 염산을 사용하여 용해물의 pH를 11로 조정하였다. 이어서, 시트라콘산 무수물 570㎕ 및 디옥산 570㎕의 혼합물을 적가하고 용액을 2M KOH로 완충시켜 pH 값이 8.5 미만으로 떨어지지 않도록 하였다. pH 값을 10으로 조정한 후, 제조물을 교반하면서 실온에서 하룻밤 배양하였다. 에탄올 아민(H2O중 1M 에탄올 아민 21ml, pH 8.0)(용액중 에탄올 아민의 최종 농도: 100mM)으로 반응을 중지시키고, 2M HCl을 사용하여 pH 값을 8.5로 조정하였다. 이어서 시트라콘화된 물질을 -20℃에서 저장하였다.
반응 배치의 총 부피: 237ml.
(b) 트립신을 이용한 절단
반응 배치를 1M NaCl 11.85ml(최종 농도 50mM) 및 1M CaCl2 1.25ml(최종 농도 2mM)과 혼합하고, 각각 10ml의 이 배치를 교반하면서 실온에서 80분동안 트립신 1.3U/ml와 배양하였다. 트립신 1.3U/ml의 수준에서 융합 단백질의 완전한 절단이 이루어졌다. 16%-트리신-SDS 겔 및 HPLC 분석으로 절단을 측정하였다. 적용된 트립신은 로슈 디아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH)의 트립신(순도 등급: II, 키모트립신 활성: 0.0091%, 활성: 206U/ml)이었다.
(c) HPLC 분석에 의한 절단 측정
합성 Ac-T1357-G-OH로 구한 선형 보정 곡선을 이용하여 HPLC로 펩타이드의 부분을 결정하였다. 하기 HPLC 시스템을 사용하였다:
컬럼: 파마시아 소오스(Pharmacia Source) 15RPC ST 4.6/100
용출액: 완충액 A: 20mM Tris, pH 7.5; 완충액 B: 70% 아세토니트릴+30% 완충액 A
농도구배: 28분동안 0% B에서 100% B
유속: 1ml/분
검출: UV 226nm
실시예 4
정제
(a) 황산 암모늄 침전
실시예 3b의 반응 혼합물에 고체 황산 암모늄(AS)(최종 농도 2M)을 첨가하고, AS를 용해시킨 후, 실온에서 교반하였다. 침전된 펩타이드를 4℃에서 5분동안 원심분리(10,000rpm)하여 제거하고 수득된 펠렛(펩타이드와 트립신 함유)을 트리스 완충액(50mM, pH 8.5) 5ml에 용해시켰다.
(b) 벤즈아미딘 세파로스 6B 크로마토그래피
벤즈아미딘 컬럼을 이용하여 전술한 용액으로부터 트립신을 제거하였다.
적용: 단백질 5mg
컬럼: HR 16(파마시아, h=3.3cm, d=1.6cm, V=10ml)
물질: 벤즈아미딘 세파로스 6B(파마시아 제 17-0568-01 호), 제조자의 지시에 따라 재생되고 pH 8.5의 50mM 트리스 완충액으로 평형을 맞춤.
유속: 1ml/분
컬럼 세척: 50mM 트리스 완충액, pH. 8.5
40 내지 80%의 펩타이드가 컬럼을 통해 흐르고, 나머지는 컬럼 물질에 결합하였다. 60% 에탄올을 이용한 후속의 용출에서, 에탄올 함량이 20% 이상인 경우 트립신을 더 이상 검출할 수 없으므로 존재할 수도 있는 트립신의 공용출(co-elution)을 측정할 수 없었다. 유동(flow-through) 및 용출 둘 다에서 펩타이드는 HPLC 분석에서 단일 피이크로서 나타났고, 또한 펩타이드는 SDS 겔에서 균질하였다.
(c) 페닐 세파로스 FF를 통한 정제
페닐 세파로스 패스트플로우(FastFlow)(파마시아): AS를 이용한 펠렛 침전물(단백질 함량: c=5mg/ml) 5mg을 트리스 완충액(50mM 트리스, pH 8.5) 1ml에 용해시키고 컬럼에 적용하였다. 펩타이드는 컬럼 물질에 완전히 결합하였고, pH 8.5의 50mM 트리스 HCl중에서 20 내지 60%의 에탄올 농도구배를 이용하여 용출될 수 있었다. 긴 지연 시간에 걸쳐 용출이 일어났다. 펩타이드 분획은 균질하였다.
참고 문헌 목록
<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
<120> Acetylation of gp41 fragments
<130> Case 20904
<160> 20
<170> KopatentIn Ver. 1.71
<210> 1
<211> 221
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: synthetic gene Xa-T 1357
<220>
<221> CDS
<222> (32)..(205)
<400> 1
cgaggaattc attaaagagg agaaattaac t atg aga gga tcg cat 46
Met Arg Gly Ser His
1 5
cat cat cat cat cat gct atc gat gtt att gaa ggc cgt tgg cag gaa 94
His His His His His Ala Ile Asp Val Ile Glu Gly Arg Trp Gln Glu
10 15 20
tgg gaa cag aaa att acc gcc ctg ctg gaa cag gcg caa att cag caa 142
Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln
25 30 35
gag aaa aac gaa tat gag ctg cag aaa ctg gat aag tgg gcg agc ctg 190
Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
40 45 50
tgg gaa tgg ttc ggc taatg aggatccagc t 221
Trp Glu Trp Phe Gly
55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Arg Gly Ser His His His His His His Ala Ile Asp Val Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln
20 25 30
Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp
35 40 45
Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe Gly
50 55
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer 1
<400> 3
cgaggaattc attaaagagg agaaattaac tatgagagga tcgcatcatc atcatcatca 60
tgctatcgat 70
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer 2
<400> 4
agcagggcgg taattttctg ttcccattcc tgccaacggc cttcaataac atcgatagca 60
tgatgatgat 70
<210> 5
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer 3
<400> 5
acagaaaatt accgccctgc tggaacaggc gcaaattcag caagagaaaa acgaatatga 60
gctgcagaaa c 71
<210> 6
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer 4
<400> 6
agctggatcc tcattagccg aaccattccc acaggctcgc ccacttatcc agtttctgca 60
gctcatattc g 71
<210> 7
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptid T1357
<400> 7
Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln
1 5 10 15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp
20 25 30
Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe
35
<210> 8
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide T680
<400> 8
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1 5 10 15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
20 25 30
Trp Asn Trp Phe
35
<210> 9
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide RSV118
<400> 9
Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu
1 5 10 15
Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly
20 25 30
Lys Ser Thr
35
<210> 10
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide MV257
<400> 10
Leu His Arg Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp
1 5 10 15
Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Asp Ala Lys
20 25 30
Glu Leu Leu
35
<210> 11
<211> 54
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide Xa-RSV118
<400> 11
Met Arg Gly Ser His His His His His His Ala Ile Asp Val Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln
20 25 30
Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn
35 40 45
Ala Gly Lys Ser Thr Gly
50
<210> 12
<211> 54
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide Xa-MV257
<400> 12
Met Arg Gly Ser His His His His His His Ala Ile Asp Val Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Leu His Arg Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg
20 25 30
Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Asp
35 40 45
Ala Lys Glu Leu Leu Gly
50
<210> 13
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide
M-HHHHHH-AIDV-IEGR-T1357-G
<400> 13
Met His His His His His His Ala Ile Asp Val Ile Glu Gly Arg Tyr
1 5 10 15
Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu
20 25 30
Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp
35 40 45
Asn Trp Phe Gly
50
<210> 14
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide M-HHHHHH-IEGR-T1357-G
<400> 14
Met His His His His His His Ile Glu Gly Arg Trp Gln Glu Trp Glu
1 5 10 15
Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys
20 25 30
Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu
35 40 45
Trp Phe Gly
50
<210> 15
<211> 48
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide M-HHHHHH-IEGR-T680-G
<400> 15
Met His His His His His His Ile Glu Gly Arg Tyr Thr Ser Leu Ile
1 5 10 15
His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln
20 25 30
Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Gly
35 40 45
<210> 16
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide MR-T1357-G
<400> 16
Met Arg Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln
1 5 10 15
Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp
20 25 30
Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe Gly
35 40
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:cleavage sequence
<400> 17
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:cleavage sequence
<400> 18
Ile Glu Gly Arg
1
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:cleavage sequence
<400> 19
Arg Gly Pro Arg
1
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:cleavage sequence
<400> 20
His Pro Phe His Leu Leu Val Tyr
1 5
Claims (7)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- MRGS-HHHHHH-AIDV, M-HHHHHH-AIDV, M-HHHHHH, MRGS-AIDV, M-AIDV 및 M에서 선택되는 제 1 부분 및 서열 번호 16 내지 19의 아미노산 서열을 갖고 푸소젠성 펩타이드의 N-말단 및 제 1 부분의 C-말단에 인접하게 위치하는 제 2 부분으로 구성된 추가 펩타이드 또는 MRGS인 추가 펩타이드에 N-말단이 연결된, 서열 번호 7 내지 10의 아미노산 서열을 갖는 항푸소젠성 펩타이드로 구성된 약 14 내지 70개의 아미노산 길이의 융합 펩타이드를 암호화하는 핵산.
- 서열 번호 7 내지 10의 아미노산 서열을 갖는 항푸소젠성 펩타이드, 또는 MRGS-HHHHHH-AIDV, M-HHHHHH-AIDV, M-HHHHHH, MRGS-AIDV, M-AIDV 및 M에서 선택되는 제 1 부분 및 서열 번호 16 내지 19의 아미노산 서열을 갖고 푸소젠성 펩타이드의 N-말단 및 제 1 부분의 C-말단에 인접하게 위치하는 제 2 부분으로 구성된 추가 펩타이드 또는 MRGS인 추가 펩타이드에 N-말단이 연결된 상기 항푸소젠성 펩타이드로 구성된 약 14 내지 70개의 아미노산 길이의 융합 펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는 원핵 발현 벡터.
- 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 융합 펩타이드의 봉입체 제조물.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01114497.9 | 2001-06-15 | ||
| EP01114497 | 2001-06-15 | ||
| PCT/EP2002/005782 WO2002103026A2 (en) | 2001-06-15 | 2002-05-27 | Method for the recombinant production of peptidic antiviral fusion inhibitors, and acetylation of gb41 fragments |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2006-7006344A Division KR100694919B1 (ko) | 2001-06-15 | 2006-03-31 | ｇｐ41 단편의 아세틸화 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20040010705A KR20040010705A (ko) | 2004-01-31 |
| KR100614714B1 true KR100614714B1 (ko) | 2006-08-21 |
Family
ID=8177732
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020037016312A KR100614714B1 (ko) | 2001-06-15 | 2002-05-27 | ｇｐ41 단편의 아세틸화 |
| KR10-2006-7006344A KR100694919B1 (ko) | 2001-06-15 | 2006-03-31 | ｇｐ41 단편의 아세틸화 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2006-7006344A KR100694919B1 (ko) | 2001-06-15 | 2006-03-31 | ｇｐ41 단편의 아세틸화 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6858410B2 (ko) |
| EP (1) | EP1402050B1 (ko) |
| JP (1) | JP4267444B2 (ko) |
| KR (2) | KR100614714B1 (ko) |
| CN (1) | CN1255548C (ko) |
| AU (1) | AU2002314111A1 (ko) |
| CA (1) | CA2450548C (ko) |
| ES (1) | ES2525317T3 (ko) |
| MX (1) | MXPA03011453A (ko) |
| WO (1) | WO2002103026A2 (ko) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002103026A2 (en) | 2001-06-15 | 2002-12-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the recombinant production of peptidic antiviral fusion inhibitors, and acetylation of gb41 fragments |
| CA2443365C (en) * | 2002-11-19 | 2010-01-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods for the recombinant production of antifusogenic peptides |
| JP2007515965A (ja) * | 2003-12-23 | 2007-06-21 | セントカー・インコーポレーテツド | 抗レトロウイルス性の剤、組成物、方法および用途 |
| US20090088365A1 (en) * | 2005-11-02 | 2009-04-02 | Roberto Mariani | Biosynthetic Polypeptide Fusion Inhibitors |
| GB0608368D0 (en) * | 2006-04-28 | 2006-06-07 | Isis Innovation | Process for making Oligopeptides |
| TW200817438A (en) * | 2006-08-17 | 2008-04-16 | Hoffmann La Roche | A conjugate of an antibody against CCR5 and an antifusogenic peptide |
| TW200902544A (en) | 2007-03-13 | 2009-01-16 | Hoffmann La Roche | Peptide-complement conjugates |
| US10077290B2 (en) * | 2011-12-29 | 2018-09-18 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Stabilized antiviral fusion helices |
| WO2014012090A1 (en) * | 2012-07-13 | 2014-01-16 | The Broad Institute, Inc. | Molecular sleds comprising a positively-charged amino acid sequence and a molecular cargo and uses thereof |
| JP7105696B2 (ja) | 2016-02-29 | 2022-07-25 | デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド | 感染症を治療するステープル化細胞内ターゲティング抗微生物ペプチド |
| AU2018304230A1 (en) | 2017-07-19 | 2020-02-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Stabilized anti-microbial peptides for the treatment of antibiotic-resistant bacterial infections |
Family Cites Families (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US123039A (en) * | 1872-01-23 | Improvement in canal-boats | ||
| US9667A (en) * | 1853-04-12 | Washiug-machine | ||
| DE3034045A1 (de) | 1980-09-10 | 1982-04-22 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Endoproteinase-lys-c aus bakterien, verfahren zu ihrer gewinnung und verwendung |
| US6936694B1 (en) | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US5453363A (en) | 1985-10-23 | 1995-09-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the activation of t-PA or Ing after genetic expression in prokaryotes |
| CU22222A1 (es) * | 1989-08-03 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la expresion de proteinas heterologicas producidas de forma fusionada en escherichia coli, su uso, vectores de expresion y cepas recombinantes |
| US5595887A (en) | 1990-07-16 | 1997-01-21 | Bionebraska, Inc. | Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment |
| US5656456A (en) | 1992-07-13 | 1997-08-12 | Bionebraska, Inc. | Chemical method for selective modification of the N- and/or C-terminal amino acid α-carbon reactive group of a recombinant polypeptide or a portion thereof |
| JPH07509128A (ja) | 1992-07-13 | 1995-10-12 | バイオネブラスカ・インコーポレーテッド | 組換型ポリペプチドの修飾方法 |
| WO1994002505A1 (en) | 1992-07-20 | 1994-02-03 | Duke University | Compounds which inhibit hiv replication |
| JPH08501213A (ja) * | 1992-08-21 | 1996-02-13 | ザ ユニバーシティー オブ ブリティッシュ コロンビア | カチオン性ペプチド及びその製造方法 |
| US6479055B1 (en) | 1993-06-07 | 2002-11-12 | Trimeris, Inc. | Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission |
| US6017536A (en) | 1993-06-07 | 2000-01-25 | Trimeris, Inc. | Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities |
| US5464933A (en) | 1993-06-07 | 1995-11-07 | Duke University | Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission |
| US5512459A (en) | 1993-07-20 | 1996-04-30 | Bionebraska, Inc. | Enzymatic method for modification or recombinant polypeptides |
| US5648244A (en) * | 1993-09-27 | 1997-07-15 | President And Fellows Of Harvard College | Production, purification, cleavage and use of fusion peptides |
| DE4405810A1 (de) * | 1994-02-23 | 1995-08-24 | Behringwerke Ag | Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung |
| KR100571215B1 (ko) * | 1995-06-07 | 2006-10-24 | 트라이머리스 인코퍼레이티드 | 복합적인치료요법을이용한hiv와다른바이러스감염의치료 |
| US6846905B2 (en) * | 1997-08-15 | 2005-01-25 | Abbott Laboratories | Antigen constructs useful in the detection and differentiation of antibodies to HIV |
| CA2324348C (en) | 1998-03-23 | 2006-03-14 | Trimeris, Inc. | Methods and compositions for peptide synthesis |
| US6258782B1 (en) | 1998-05-20 | 2001-07-10 | Trimeris, Inc. | Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties |
| US6656906B1 (en) | 1998-05-20 | 2003-12-02 | Trimeris, Inc. | Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties |
| EP2305815B1 (en) * | 1998-07-10 | 2014-11-05 | Scios, Inc. | Method for producing a natriuretic peptide with a pI above 8 or below 5 |
| CA2351737A1 (en) | 1998-11-20 | 2000-06-02 | Micrologix Biotech Inc. | Efficient methods for producing antimicrobial cationic peptides in host cells |
| EP1149115A4 (en) * | 1999-01-08 | 2005-11-02 | Panacos Pharmaceuticals Inc | TECHNIQUES FOR ELICITATION OF NEUTRALIZING ANTIBODIES TARGETING HIV-1 gp41 |
| JP4216480B2 (ja) | 1999-05-17 | 2009-01-28 | コンジュケム バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド | ウイルス感染の長期持続性融合ペプチドインヒビター |
| US7053179B2 (en) * | 1999-12-16 | 2006-05-30 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Five-Helix protein |
| WO2002103026A2 (en) | 2001-06-15 | 2002-12-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the recombinant production of peptidic antiviral fusion inhibitors, and acetylation of gb41 fragments |
-
2002
- 2002-05-27 WO PCT/EP2002/005782 patent/WO2002103026A2/en active Application Filing
- 2002-05-27 CA CA2450548A patent/CA2450548C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-27 MX MXPA03011453A patent/MXPA03011453A/es active IP Right Grant
- 2002-05-27 CN CNB028119533A patent/CN1255548C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-27 JP JP2003505348A patent/JP4267444B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-27 AU AU2002314111A patent/AU2002314111A1/en not_active Abandoned
- 2002-05-27 ES ES02740652.9T patent/ES2525317T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-27 EP EP02740652.9A patent/EP1402050B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-27 KR KR1020037016312A patent/KR100614714B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-05-30 US US10/158,742 patent/US6858410B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-10-20 US US10/969,624 patent/US7348423B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-03-31 KR KR10-2006-7006344A patent/KR100694919B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100694919B1 (ko) | 2007-03-14 |
| EP1402050B1 (en) | 2014-10-29 |
| WO2002103026A2 (en) | 2002-12-27 |
| KR20060035814A (ko) | 2006-04-26 |
| JP4267444B2 (ja) | 2009-05-27 |
| CN1255548C (zh) | 2006-05-10 |
| MXPA03011453A (es) | 2004-04-05 |
| WO2002103026A3 (en) | 2003-11-20 |
| US20050058659A1 (en) | 2005-03-17 |
| AU2002314111A1 (en) | 2003-01-02 |
| US20030104581A1 (en) | 2003-06-05 |
| EP1402050A2 (en) | 2004-03-31 |
| KR20040010705A (ko) | 2004-01-31 |
| JP2004529660A (ja) | 2004-09-30 |
| CA2450548C (en) | 2012-05-01 |
| ES2525317T3 (es) | 2014-12-22 |
| US7348423B2 (en) | 2008-03-25 |
| CA2450548A1 (en) | 2002-12-27 |
| US6858410B2 (en) | 2005-02-22 |
| CN1516738A (zh) | 2004-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1422237B1 (en) | Methods for the recombinant production of antifusogenic peptides | |
| CA2395291C (en) | Five-helix protein | |
| US7811578B2 (en) | Soluble chimeric peptide inhibitors of HIV entry comprising an IZ trimeric coiled-coil peptide and HIV gp41 N-helix coiled-coil peptide | |
| KR100614714B1 (ko) | ｇｐ41 단편의 아세틸화 | |
| WO2009099777A2 (en) | Chimeric hiv fusion proteins as vaccines | |
| EP1720899A2 (en) | Multimerised hiv fusion inhibitors | |
| JPH10502337A (ja) | Ｈｉｖの細胞侵入を阻害するための、 ｄｐｐｉｖの基質であるペプチド類縁体、特にｋｐｒ型の該類縁体の複合提示 | |
| AU2005225063A1 (en) | Peptide inhibitors of HIV entry | |
| US20100048879A1 (en) | Multimerised hiv fusion inhibitors | |
| US20030082525A1 (en) | Five-Helix protein | |
| AU2001292944A1 (en) | Peptide inhibitors of HIV entry | |
| EP2616487B1 (en) | Serpin-finger fusion polypeptide | |
| Quintana et al. | Antibody response in rabbits against two HIV-1 multi-epitope polypeptides bearing different copies of V3 epitopes fused to the N terminal fragment of N. meningitidis P64K protein | |
| JP2011177135A (ja) | 酵母によるｎ３６結合ペプチドの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| A107 | Divisional application of patent | ||
| AMND | Amendment | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| B701 | Decision to grant | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20120727 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130729 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140730 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150630 Year of fee payment: 10 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |