JP2004529660A - Ｇｐ４１フラグメントのアセチル化 - Google Patents
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Abstract
原核宿主細胞における約１０〜５０アミノ酸長の抗膜融合性ペプチドの製造方法であって、非融合抗膜融合性ペプチドまたは融合ペプチドの封入体を形成するような条件で、ａ）前記宿主細胞中で、非融合ペプチドとして前記抗膜融合ペプチドをコードする核酸、または約４〜３０アミノ酸の更なるペプチドにＮ末端で結合させた前記抗膜融合性ペプチドからなる約１４〜７０アミノ酸長の融合ペプチドをコードする核酸を発現させる；ｂ）前記宿主細胞を回収する；ｃ）前記封入体を回収し溶解させる；ｄ）前記融合ペプチドの場合には、前記抗膜融合性ペプチドを、前記更なるペプチドから切断する；そしてｅ）前記抗膜融合性ペプチドを単離することを特徴とする。
Description
【技術分野】
【０００１】
ｇｐ４１フラグメントのアセチル化
本発明は、ウイルスと標的細胞の膜との融合を阻害するペプチドの組換え製造方法に関する。具体的には、本発明は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、麻疹ウイルス（ＭＥＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）またはヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）などのインフルエンザウイルスのペプチド性阻害剤の組換え製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスと細胞膜の融合は、ＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−ＩＩ、ＲＳＶ、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、エプスタインバーウイルスおよび肝炎ウイルスなどのエンベロープのあるウイルスが細胞に侵入するために不可欠なステップである。細胞に侵入した後、ウイルス複製のカスケードが開始され、ウイルス感染をもたらす。
【０００３】
ＨＩＶは、複雑なゲノムを有し、コーン形のカプシドコア粒子を示すレトロウイルスを含む、レンチウイルス属の一員である。レンチウイルスの他の例として、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ビスナウイルス、およびウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）などがあげられる。あらゆるレトロウイルスのように、ＨＩＶのゲノムは、ＲＮＡによってコードされており、このＲＮＡは、新しい宿主細胞に侵入すると、ウイルスの逆転写酵素（ＲＴ）によりウイルスＤＮＡに逆転写される。インフルエンザウイルスおよびその細胞侵入メカニズムは、Bullough, P. A., et al., Nature 371 (1994) 37-43; Carr, C.M., and Kim, P.S., Cell 73 (1993) 823-832; and Wilson, I.A., et al., Nature 289 (1981) 366-373.によって記載されている。
【０００４】
すべてのレンチウイルスは、宿主細胞の膜に由来する脂質二重層により包まれている。露出された表面糖タンパク質（ＳＵ、ｇｐ１２０）は、膜貫通タンパク質（ＴＭ、ｇｐ４１）との相互作用を介してウイルスに固着されている。脂質二重層は、主要組織適合抗原、アクチンおよびユビキチンを含む、宿主細胞由来のいくつかの細胞膜タンパク質をも含有する（Arthur, L.O., et al., Science 258 (1992) 1935-1938）。マトリックスタンパク質（ＭＡ、ｐ１７）約２０００コピーを含むマトリックス殻が、ウイルス膜の内部表面を裏打ちしており、カプシドタンパク質（ＣＡ、ｐ２４）約２０００コピーを含む円錐形カプシドコア粒子は、ウイルスの中央に位置する。カプシド粒子は、スプライシングされていないウイルスゲノム２コピーをカプシド形成しており、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ、ｐ７）約２０００コピーとともに、リボヌクレオタンパク質複合体として安定化されており、また、ウイルスがコードする、３種の不可欠な酵素であるプロテアーセ（ＰＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）、およびインテグラーゼ（ＩＮ）を含有する。ウイルス粒子は、アクセサリータンパク質であるＮｅｆ、ＶｉｆおよびＶｐｒをも包含している。宿主細胞で機能する、更なる３種のアクセサリータンパク質であるＲｅｖ、ＴａｔおよびＶｐｕは、包含されていないようである。
【０００５】
ＨＩＶの場合には、ウイルスの侵入は、ＨＩＶエンベロープ表面糖タンパク質と関連している（Lawless, M.K., et al., Biochemistry 35 (1996) 13697-13708; and Turner, B.G., and Summers, M. F., J. Mol. Biol. 285 (1999) 1-32）。ＨＩＶ−Ｉの場合には、この表面タンパク質が、単一の１６０ｋＤ前駆体タンパク質として合成され、それが、細胞プロテアーゼにより、２種の糖タンパク質、ｇｐ−４１およびｇｐ−１２０に切断される。ｇｐ−４１は、膜貫通タンパク質であり、ｇｐ−１２０は、三量体または多量体形態でｇｐ−４１と共有結合せずに会合している細胞外タンパク質である（Hammarskjold, M.-L., et al., Biochim. Biophys. Acta 989 (1989) 269-280）。ＣＤ４表面タンパク質がＨＩＶ−Ｉウイルスに対する細胞受容体として作用するため、ＨＩＶは、ＣＤ４＋リンパ球を標的とする。細胞へのウイルスの侵入は、細胞ＣＤ４＋受容体分子へのｇｐ１２０の結合に依存しており、ｇｐ−４１は、エンベロープ糖タンパク質複合体をウイルス膜中に固定し、膜融合を媒介する（McDougal, J.S., et al., Science 231 (1986) 382-385; and Maddon, P. J., et al., Cell 47 (1986) 333-348）。
【０００６】
ｇｐ４１は、ウイルスと細胞膜の融合を媒介する膜貫通サブユニットである。ｇｐ４１の細胞外ドメインコアは、３つのらせんヘアピンからなる６へリックスの束であり、それぞれが逆平行Ｃへリックスと対をなすＮへリックスからなる（Chan, D.C., et al., Cell 89 (1997) 263-273; Weissenhorn, W., et al., Nature 387 (1997) 426-430; Tan, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 12303-12308）。Ｎへリックスは、３つの保存された疎水性の溝を有する内部三量体コイルドコイル（coiled coil）を形成し、Ｃへリックスは、これらの溝のそれぞれに入っている。この構造は、融合活性状態のｇｐ４１のコアに対応するようである。Chan, D. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 15613-15617によれば、１型ＨＩＶｇｐ４１のコイルドコイルの顕著な空洞が、魅力的な薬物標的であるとの証拠が存在する。
【０００７】
ｇｐ−４１が膜融合を媒介するメカニズムには、コイルドコイル三量体の形成が関与しており、これが例えばインフルエンザのヘムアグルチニンについて記載されているように、休止状態から膜融合性状態への遷移を推進すると考えられている（Wilson, I. A., et al., Nature 289 (1981) 366-373; Carr, C.M., and Kim, P.S., Cell 73 (1993) 823-832; Bullough, P.A., et al., Nature 371 (1994) 37-43)。
【０００８】
ＤＰ１７８およびＣ３４などのエンベロープを有するウイルスのＣペプチド（Ｃへリックスに対応するペプチド）は、ＨＩＶ−Ｉの実験室適合株および初代分離株の両株による膜融合を強力に阻害する（Malashkevich, V. N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(1998) 9134-9139; Wild, C. T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 9770-9774）。ＣペプチドであるＤＰ１７８での第Ｉ相臨床治験は、ＤＰ１７８がin vivoで抗ウイルス活性を有し、その結果ウイルス負荷が低下することを示唆している（Kilby, J. M., et al., Nature Medicine 4 (1998) 1302-1307）。ｇｐ４１コアの構造的特徴は、これらのペプチドが、ドミナントネガティブなメカニズムを介して作用しており、そのメカニズムでは、Ｃペプチドがｇｐ４１の中心部コイルドコイルに結合して不活性化していることを示唆している（Chan, D. C., et al., Cell 93 (1998) 681-684）。
【０００９】
各コイルドコイルの界面内に、Ｎへリックスコイルドコイル中残基クラスターにより形成された深い空洞があり、それが、抗ウイルス化合物の開発において魅力的な標的であることが提唱されている。Ｃへリックスからの３残基（Ｔｒｐ−６２８、Ｔｒｐ−６３１およびＩｌｅ−６３５）がこの空洞に入り、広範囲にわたる疎水性接触をなす。突然変異体解析は、この空洞を含むＮへリックス残基（Ｌｅｕ−５６８およびＴｒｐ−５７１）のうち２つが、膜融合活性に不可欠であることを示す（Cao, J., et al., J. Virol. 67 (1993) 2747-2755）。したがって、この空洞に高い親和性をもって結合し、正常なＮとＣとのヘリックス対形成を妨げる化合物は、効果的なＨＩＶ−１阻害剤であり得る。空洞中の残基は、多様なＨＩＶ−１分離株で高度に保存されている。しかも、空洞結合領域を含有するＣペプチドは、この領域を欠くＤＰ１７８よりも、はるかに耐性ウイルスを生じにくい（Rimsky, L. T., et al., J. Viol. 72 (1998) 986-993）。これらの観察は、高度に保存されたコイルドコイル表面、特にその空洞を標的とする高親和性リガンドが、多様なＨＩＶ分離株に対して広い活性を有し、薬物を回避する突然変異体により迂回される可能性が低いことを示唆するものである。
【００１０】
エンベロープの融合タンパク質の膜融合性構造は、インフルエンザ、モロニーマウス白血病ウイルス、およびサル免疫不全ウイルス（cit. in Chan, D. C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 15613-15617）、ヒトＲＳウイルス（human respiratory syncytial virus）、エボラ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、サルパラインフルエンザから明らかにされた。それは、ウイルスの標的細胞への侵入が、ＨＩＶ−１のｇｐ４１、インフルエンザのヘムアグルチニン、エボラのＧＰ２などの似通った膜貫通糖タンパク質によって可能になる、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、レトロウイルス科などのファミリー間の密接な関係を示す（Zhao, X., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 14172-14177）。
【００１１】
最新技術では、いくつかの方法がペプチド性阻害剤（Ｃ−ペプチド）の製造について記載されている（例えば、Root, M.J., et al., Science 291 (2001) 884-888; Root et al参照；Rootらは、ＨＩＶ−１、ＨＸＢ２に由来し、６２５−６６１の残基を含有するペプチドＣ３７−Ｈ６を記載している。これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＧＲリンカーおよびヒスチジンタグを有するＮ４０セグメントとして組換え法により発現され、細菌溶解物の可溶性画分から精製される。Zhao, Xらは、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 14172-14177に、残基１５３〜２０９、Ｇに富んだリンカー、残基４７６〜５２４、第Ｘａ因子切断部位、およびヒスチジンタグをコードする組換えＲＳＶ−１（ヒトＲＳウイルス）の合成遺伝子を記載している。Chen, C.H.らは、J. Virol. 67 (1995) 3771-3777に、ＭＢＰに残基５４０〜６８６を融合させた融合タンパク質として合成させたｇｐ４１の細胞外ドメインの組換え発現を記載している。
【００１２】
例えば、非感染細胞へのレトロウイルスの伝播を阻害することを含む、上記のような膜融合に関与する事象のペプチド性阻害剤、または抗膜融合性ペプチドとも記載するものが数多く知られている。そのようなペプチドは、例えば、Lambert, D. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 2186-2191、米国特許番号第6,013,263号、6,017,536号および6,020,459号、WO00/69902、WO99/59615およびWO96/40191に記載されている。さらに、融合関連事象を阻害するペプチドは、例えば米国特許第6,093,794号、6,060,065号、6,020,459号、6,017,536号、6,013,263号、5,464,933号、5,656,480号およびWO96/19495に記載されている。
【００１３】
ウイルス融合を阻害するＨＩＶ−１ ｇｐ−４１エクトドメイン由来の線状ペプチドの例として、ＤＰ−１０７およびＤＰ−１７８があげられる。ＤＰ−１０７は、Ｎ末端融合ペプチド付近のｇｐ−４１の一部であり、へリックス状であることが明らかにされており、コイルドコイル形成に一致する様式で強くオリゴマー化している（Gallaher, W. R., et al., Aids Res. Hum. Retrovirus 5 (1989) 431-440, Weissenhorn, W., et al., Nature 387 (1997) 426-430）。ＤＰ−１７８は、ｇｐ−４１のエクトドメインのＣ末端領域に由来する（Weissenhorn, W., et al., Nature 387 (1997) 426-430）。溶液中では認識し得る構造をとらないが、このペプチドおよびその拘束アナログは、へリックス構造をとり、ｇｐ−４１のＮ末端コイルドコイル三量体の溝に結合し、ｇｐ４１が膜融合状態に変化するのを妨げる（Judice, J. K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 13426-13430）。
【００１４】
このような短鎖ペプチドは、通常、化学合成により製造される。化学合成は、例えば、Mergler, M., et al., Tetrahedron Letters 29 (1988) 4005-4008 and 4009-4012; Andersson, L., et al., Biopolymers 55 (2000) 227-250; およびby Jones, J. H., J. Pept. Sci. 6 (2000) 201-207に記載されている。他の方法が、WO 99/48513に記載されている。
【００１５】
しかし、化学的ペプチド合成には、いくつかの欠点がある。最も重要なのが、ラセミ化であり、これにより光学的な純度が不十分となる。ペプチド化学では、ラセミ化は、いくつかのキラル中心のうちの一つにおけるエピマー化をも意味する。１回のカップリング工程でたった１％のラセミ化が起こると、１００回のカップリング工程では、標的ペプチドは６１％しか得られなくなる（Jakubke, H.D., Peptide, Spektrum Akad. Verlag, Heidelberg (1996), p.198）。鎖長が増加するにつれ、不純物数が増加し、その除去がより困難で費用を要するものとなることは自明である。
【００１６】
大規模での化学的合成は、費用が高額であること、出発材料として保護されたアミノ酸誘導体が利用可能ではないことにより、制限されている。完全な反応を可能にするために、これらの出発材料を過剰に用いるべきであり、その一方で、コスト面の理由、安全性、および環境の観点からその使用を比較検討すべきである（Andersson et al., Biopolymers 55 (2000) 227-250）。
【００１７】
ペプチドは、組換えＤＮＡ技術により製造してもよい。５０アミノ酸を超える鎖長の可溶性タンパク質の組換え製造は、現在の技術水準から知られているが、５０アミノ酸未満のペプチドの製造には、いくつかの欠点がある（Doebeli, H., et al, Protein Expression and Purification 12 (1998) 404-414）。そのような短鎖または中鎖のペプチドは、通常、安定的には発現されない。それらは、内因性ペプチダーゼに攻撃されて分解される。これは、そのサイズが小さいこと、または高度に規則化された３次構造がないためかもしれない（WO00/31279）。他の著者らは、ペプチドの組換え製造には、安定な発現のために最小鎖長６０〜８０アミノ酸が必要であることを見出しており、さらに、そのようなペプチドが、封入体としてではなく、可溶性ペプチドとして製造されることは、技術常識である（例えば、van Heeke, G., et al., Methods in Molecular Biology 36 (1994)245-260, eds. B.M. Dunn and M.W. Pennington, Humana Press Inc., Totowa, N.J.);およびGoldberg et al., Maximizing Gene Expression (1986), pp.287-314, eds. Reznikoff, W., and Gold, L., Butterworks, Stoneham, MAを参照）。短いペプチドは、原核生物において発現されると、可溶性の状態のままであり、すみやかに原核生物のペプチダーゼによって分解されるため、こうしたペプチドの組換え製造は、特に成功し難い。この問題を回避するために、技術常識によれば、このようなペプチドを大きな（１５０〜２００アミノ酸超）融合タンパク質として発現させる。それにより融合テール（fusion tail）が融合タンパク質をかなり可溶性するとともに封入体の形成を回避する。または融合テールが、原核生物中での組換え発現の間に封入体を形成するタンパク質であり、したがって、そのような融合テールと所望の短いペプチドからなる融合タンパク質も、原核生物中での過剰発現の間に封入体を形成するであろう。これらの方法の大きな欠点は、融合テールの分子量が、所望のペプチドの分子量よりもかなり高いことである。したがって、所望のペプチドの収量は極めて低く、余剰の切断した融合テールを分離しなければならない。
【００１８】
Lepage, P., et al., in Analytical Biochemistry 213 (1993) 40-48は、ＨＩＶ−１Ｒｅｖペプチドの組換え製造方法を記載している。ペプチドを、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のタンパク質Ａの合成イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）結合ドメインとの融合タンパク質として発現させる。そのペプチドは、約２０アミノ酸長を有するが、ＩｇＧ結合部分は、約１７０アミノ酸長を有し、発現された融合タンパク質は、約１９０アミノ酸の全長を有する。この融合タンパク質は、発現され、培地中に可溶性形態で分泌され、親和性クロマトグラフィーにより精製される。著者らは、この方法を用いれば、培養物１リットル当たり数百ミリグラムの量で組換えタンパク質を製造することが可能かもしれないと報告している。しかし、この方法論は、シグナルペプチド配列内での選択的プロセシングならびに融合タンパク質および切断されたペプチドのいくつかの転写後修飾のために、限界がある。アミノ酸１個の平均分子量を１１０ダルトンとすると、所望のペプチドは、約２，０００〜５，０００ダルトンの分子量を有するが、Staphylococcus aureusのタンパク質ＡのＩｇＧ結合ドメインを融合テールに用いると、融合テールは、少なくとも１７０アミノ酸長を有する（約１９，０００Ｄ）。したがって、所望のペプチドは、組換え的に製造されたタンパク質の１０〜２５％に過ぎない。
【００１９】
EP0 673 948は、発現ベクターｐＳＥＭ３を用いてβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質としてのｇｐ４１ペプチドの組換え製造を記載している（Knapp, S., et al., BioTechniques 8 (1990) 280-281）。この融合タンパク質は、Ｎ末端アミノ酸３７５個をコードする、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の大部分、および付加的ポリリンカー配列の２３コドンを含む。
【００２０】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける大きな融合タンパク質を経由する小さなペプチドの組換え製造方法の更なる例は、Uhlen and Moks, "Gene Fusions For Purposes of Expression, An Itroduction" in Methods in Enzymology 185 (1990) 129-143, Academic Pressに記載されている。「封入体」経路を介する製造については、Uhlen and Moksは、ｔｒｐＥ、ｃＩＩに加え、ここでもβ−ガラクトシダーゼを含む大きな融合生成物に言及している。Ningyi, L., et al., Gaojishu Tongxun 10 (2000) 28-31は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐ２４ ｇａｇ遺伝子の組換え発現について記載している。
【００２１】
したがって、本発明の目的は、封入体ルートを経由する抗膜融合性ペプチドの高収量の組換え製造を可能にし、そのようなペプチドの大規模な工業的生産に適する方法を提供することである。
【００２２】
発明の概要
したがって、本発明は、融合ペプチドの封入体が形成される条件下で、
ａ）宿主細胞中で、約４〜３０アミノ酸長の更なるペプチドにＮ末端で結合させた約１０〜５０アミノ酸長の該抗膜融合性ペプチドからなる前記融合ペプチドをコードする核酸を発現する；
ｂ）前記宿主細胞を培養する；
ｃ）前記封入体を形成させ、回収し、可溶化する；
ｄ）前記融合タンパク質を単離する
ことを特徴とする、原核宿主細胞中で約１４〜７０アミノ酸長の融合ペプチドとして抗膜融合性ペプチドを製造する方法を提供することである。
【００２３】
好ましくは、上記抗膜融合性ペプチドが、封入体の可溶化の間または後に、上記更なるペプチドから切り離される。
【００２４】
好ましくは、抗膜融合性ペプチドが、レンチウイルス属のウイルスからのエンベロープ融合タンパク質の膜貫通サブユニットのＣへリックスのフラグメントである。
【００２５】
上記更なるペプチドは、上記宿主細胞において非融合タンパク質として組換え的に発現された場合には、非常に短いため、封入体の形態では見出されないであろう。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、更なるペプチドは、第一および／または第二部分からなり、
（ａ）前記第一部分は、１〜２０の一連のアミノ酸であり（好ましくは、融合ペプチドの等電点に影響を及ぼす親水性アミノ酸であり、および／または前記第一部分が、溶解性、クロマトグラフィー分離樹脂との相互作用の点で抗膜融合性ペプチドとは有意に異なる）、および／または切断プロテアーゼのアクセスを向上させ（Polyak, S. W., et al., Protein Eng. 10 (1997) 615-619)、
（ｂ）前記第二部分は、１〜１０アミノ酸の切断可能なペプチド性リンカー領域であり（例えば表３を参照）、膜融合性ペプチドのＮ末端および第一部分のＣ末端に隣接して位置する。
【００２７】
更なるペプチドが、第一部分または第二部分のみからなるときは、好ましくはｍＲＮＡ発現中の安定化させるため、上記部分は、少なくとも４アミノ酸（開始コドンがコードするメチオニンを含む）の長さを有する。この４アミノ酸は、好ましくは、少なくとも１個のアルギニンを含む。
【００２８】
本発明の更なる実施形態において、膜融合性ペプチドは、そのＣ末端に結合したグリシンを含有する。このグリシンは、酵素的Ｃ末端アミド化の目的に有用である。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態において、融合ペプチド中の抗膜融合性ペプチドの分子量と更なるペプチドの分子量との比は、１０：１〜１：２である。
【００３０】
本発明の更に好ましい実施形態は、本発明による融合ペプチドをコードする核酸を含む原核発現ベクター、および上記ペプチドの組換え製造のためのその使用を含む。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態は、本発明による融合ペプチドの封入体の調製物、およびその封入体の製造方法を含む。
【００３２】
本発明の更に好ましい実施形態は、本発明による融合ペプチドをコードする核酸を含む。
【００３３】
発明の詳細な説明
驚くべきことに、短鎖抗膜融合性ペプチド（好ましくは１０〜５０アミノ酸長、より好ましくは、１０〜４０アミノ酸長）を、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物中で、封入体ルート経由で、７０アミノ酸までの長さの短い融合ペプチドとしてうまく発現できることが見出された。
【００３４】
本発明によれば、更なるペプチドにＮ末端で連結された抗膜融合性ペプチドからなる融合ペプチドは、不溶性タンパク質封入体が形成される条件下、原核生物で過剰発現される。シグナル配列を含むと、ペリプラスムまたは培地へのタンパク質の可溶性分泌を可能にするが、シグナル配列を含まない発現ベクターを用いると、封入体が、細胞質内に見出される。これらの封入体を、例えば細胞溶解後の遠心などにより、他の細胞成分から分離する。封入体を、グアニジン塩酸塩、尿素、アルギニンのような物質、またはＫＯＨもしくはＮａＯＨなどの強塩基などの変性剤により可溶化する。可溶化後、そのようなタンパク質は通常、希釈または透析によって、再び折りたたまれなければならない。本発明の方法により製造された融合タンパク質は、ジスルフィド架橋のない短鎖ペプチドであり、タンパク質の復元を必要としない。可溶化後、更なるペプチドの切断が可能なように、ｐＨなどの溶液条件を単純に変え、必要ならば切断を行う。例えば、サイズ除外クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーによる、簡単な様式で、この溶液から融合ペプチドまたは抗膜融合性ペプチドを回収する。
【００３５】
本明細書で使用する「抗膜融合性」または「抗膜融合」は、例えば細胞膜、またはウイルスエンベロープまたは線毛などの２種またはそれ以上の構造物の間での融合事象のレベルを阻害するか、またはそのペプチドが存在しなければこれら構造の間で起こる膜融合レベルと相対的にこれを低下させる、ペプチドの能力を意味する。本明細書の実施例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、呼吸器シンシチカルウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）、麻疹ウイルス（ＭＥＶ）およびサル免疫不全ウイルスなどのレンチウイルスのペプチド性阻害剤である。このような抗膜融合性ペプチドは、レンチウイルス属のウイルスからのエンベロープ融合タンパク質の膜貫通サブユニットのＣへリックスに由来し、それぞれのウイルスの膜貫通サブユニットの中心のコイルドコイルに結合する。
【００３６】
特に好ましいのは、ＨＩＶ−１抗膜融合性ペプチドである。表１には、ｇｐ４１のＣペプチドに由来するＨＩＶ−１抗膜融合剤の例が記載されている。これらの抗膜融合性ペプチドおよびそのフラグメントは、本発明において特に有用である。
【００３７】
【表１】
【００３８】
＊Ｎ末端アセチル化および／またはＣ末端アミド化ペプチド；Ｔ−２０（ＤＰ１７８と同義）およびＴ−１２４９は、１型ヒト免疫不全ウイルスから、Ｔ−１１８は、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）から、Ｔ−２５７は、麻疹ウイルス（ＭＶ）からのものである。
【００３９】
１）WO 99/59615
２）Rimsky, L. T., et al., J. Virol. 72 (1998) 986-993
３）Lambert, D. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 2186-2191
【００４０】
本発明の更なるペプチドは、封入体の形成の改善を目的とせずに、Ｎ末端で抗膜融合性ペプチドに添加されたペプチドである。その目的は、例えば、発現ｍＲＮＡ安定化、精製（例えば、Ｈｉｓタグ；例えば、Zhang, J.-H., et al., Nanjing Daxue Xuebao, Ziran Kexue 36(4) (2000) 515-517を参照）を改善すること、またはアセチル化またはＰＥＧ修飾のようなその後のＮ末端の修飾を可能にすることである。
【００４１】
本発明の更なるペプチドは、少なくとも４アミノ酸（切断、ｍＲＮＡ安定化および／または発現目的で、メチオニンおよび更に３アミノ酸）〜約３０アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸（核酸のコドンレベルについて）からなる短い一連のペプチドである。更なるペプチドの長さは、このペプチドが、イムノグロブリン、ストレプトアビジンまたは組織型プラスミノーゲン活性化因子などの大きなタンパク質が封入体として産生される条件下、原核生物内での組換え発現中に細胞質中に可溶性形態で形成されるペプチドである限り、本発明では重要ではない。しかし、更なるペプチドは、抗膜融合性ペプチドの収量を改善するために、非常に短いことが好ましい。（更なるペプチドの抗膜融合性ペプチドに対する長さの比が３：１であるときは、同量の融合ペプチドが産生されるとすれば、回収された融合ペプチドの量との関係において、抗膜融合性ペプチドの量は、その比が１：１であるときより約５０％低い。融合ペプチドの許容し得る収量を得るために、更なるペプチドの長さは、融合ペプチドの全長が、７０アミノ酸、好ましくは５０アミノ酸、もっとも好ましくは４０アミノ酸を超えないように選択する。したがって、更なるペプチドが、適当な切断部位、融合タンパク質の発現および溶解性を改善しその封入体の溶解化プロセスを促進するかまたは切断プロテアーゼのアクセスを向上させる（立体障害の回避）ためのいくつかのアミノ酸、および／または精製手段のためのＨｉｓタグ（Hengen, P., Trends Biochem. Sci. 20(1995) 285-286）などのいくつかのアミノ酸、および開始コドンに必要でありそれによってコードされているメチオニンのみからなるのが特に好ましい。
【００４２】
更なるペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物中で、単独で、シグナル配列なしに過剰発現されると、封入体として形成されずに、細胞質内に可溶性状態のままとどまるか、または細胞質内で急速に分解される短鎖ペプチドである。そのようなタンパク質は、固定化した変性三次構造をとらず、したがって、そのようなタンパク質は、溶解性に乏しい固定化三次構造を形成することができず、発現された場合には、可溶性状態のままであり、Ｅ．ｃｏｌｉプロテアーゼによって分解される。
【００４３】
本発明の更なるペプチドは、好ましくは、融合ペプチドと更なるペプチドとの間の切断部位への切断剤のアクセスを立体的に妨害する、固定化三次構造を形成しないアミノ酸からなる。このため、更なるペプチドは、システイン残基を好ましくは含まない。システインは、高度に反応性で、ジスルフィド結合を形成し得る、スルフヒドリル基またはチオール基を含有する。システインが存在すると、更なるペプチドが固定化二次または三次構造をとらないことを所望するのに相反して作用し得るので、その使用を避ける。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様において、Ｎ末端に結合した一連の更なるペプチドは、そのＣ末端に、酵素的または化学的手段により容易に切断可能な配列を含有する。
【００４５】
本発明の更なるペプチドを、発現、可溶化、精製およびペプチド修飾の間、抗膜融合性ペプチドのＮ末端を保護するために、融合ペプチド中に使用することも好ましい。そのような融合ペプチドは、Ｎ末端修飾抗膜融合性ペプチドの製造方法において特に価値がある。そのような方法は、融合ペプチドとして組換えポリペプチドの形成を含んでおり、そのような融合部分は、Ｎ末端を保護する。組換え融合ペプチドは、３種類までの化学保護剤と反応させて、反応性側鎖基を選択的に保護し、側鎖基が修飾されるのを防ぐことができる。その後、融合ペプチドを、少なくとも１種の切断試薬を用いて、ペプチドと融合部分との間で切断し、非保護末端アミノ酸反応性基を形成する。非保護末端アミノ酸反応性基を、Ｎ−末端アセチル化のために、無水酢酸またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド酢酸エステルなどの、少なくとも１種類の化学修飾剤で修飾する。その後、側鎖を脱保護し、Ｎ末端修飾ペプチドを形成する。そのような方法は、例えばWO94/01451; 米国特許第5,635,371号および米国特許第5,656,456号に記載されている。
【００４６】
更なるペプチド部分は、好ましくは、融合ペプチドの精製を促進するような構造を有する。更なるペプチドは、好ましくは、この目的のために、ポリヒスチジン（約６個のヒスチジン残基）などの「親和性タグ」（Pandjaitan, B., et al., Gene 237 (1999) 333-342と比較）を含有する。
【００４７】
容易な発現および切断後のフラグメントの分離のために、更なるペプチドの等電点（ＩＰ）が、抗膜融合性ペプチドのＩＰと異なるように更なるペプチドを選択することが好ましい。表２に、様々な融合ペプチドのＩＰ、ならびに融合体ではない膜融合性ペプチドＴ６８０およびＴ１３５７（WO96/40191およびWO99/59615による命名）のＩＰとを示す。好ましくは、融合ペプチドと融合ペプチドの抗膜融合性部分のＩＰが、約１ｐＨ単位、好ましくは約１〜２ｐＨ単位異なる。そのようなＩＰの変化は、更なるペプチド中に含有される好ましくは塩基性アミノ酸および／またはヒスチジンにより行うことができる。
【００４８】
【表２】
【００４９】
１）実験的に決定
２）１文字コードによるアミノ酸；そうでないところはペプチド名。
【００５０】
本発明のさらに好ましい実施態様において、抗膜融合性ペプチドは、Ｃ末端にグリシンを含有する。このグリシンは、その後の酵素的Ｃ末端アミド化の目的のために有用である（Bradbury, A.F., and Smyth, D.G., Trends Biochem. Sci.16 (1991) 112-115）。
【００５１】
本発明による特に好ましい融合ペプチドは以下のとおりである（標準的１文字コードでのアミノ酸）。
【００５２】
【表３】
【００５３】
上記融合ペプチドは、ポリＨｉｓタグ（Ｈｉｓ６）を含まない、または配列番号２、１１または１２の最初の４アミノ酸を融合ペプチド中の更なるペプチドとして含む。
【００５４】
注：逆部分は、ペプチドの名称であり、したがって、この部分に含まれる文字は、アミノ酸の１文字コードを構成しない。
【００５５】
原核生物中で封入体経由でタンパク質の組換え産生を記載した刊行物が数多く存在する。そうした刊行物のそれぞれは、Misawa, S., et al., Biopolymers 51 (1999) 297-307; Lilie, H., Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1998) 497-501; Hockney, R.C., Trends Biotechnol. 12 (1994) 456-463である。
【００５６】
本発明の融合ペプチドは、原核生物内で過剰発現される。シグナルペプチドなしでの過剰発現は、封入体を形成させることとなった。開始コドンによりコードされ、上記例で言及したメチオニンは、その後のプロセシングの間に切断され得る。原核生物におけるタンパク質の過剰発現の一般的方法は、当技術分野では長く広く知られていた。当業界での刊行物の例に、Skelly, J. V., et al., Methods. Mol. Biol. 56 (1996) 23-53 およびDas, A., Methods Enzymol. 182 (1990) 93-112がある。
【００５７】
原核生物での過剰発現は、ｔａｃまたはｌａｃプロモーターなどのプロモーターを伴う最適化発現カセットを用いる発現を意味する（EP-B0 067 540）。通常、化学的に誘導し得るプロモーターまたは温度変化を介して誘導し得るプロモーターを含有するベクターの使用により行うことができる。Ｅ．ｃｏｌｉに有用なプロモーターの１つが、温度感受性λＰＬプロモーターである（EP-B 0 041 767と比較）。さらに効率的なプロモーターは、ｔａｃプロモーターである（米国特許第4,551,433号を参照）である。Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物用の強い制御シグナルは、通常、細菌に対するバクテリオファージに由来する（Lanzer, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 8973-8977; Knaus, R., and Bujard, H., EMBO Journal 7 (1988) 2919-2923; λＴ７プロモーターについては、Studier, F. W., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 60-89);Ｔ５プロモーターについては、EP 0 186 069を参照）。
【００５８】
そのような過剰産生する原核細胞発現系の使用により、少なくとも細胞により発現された総タンパク質量の少なくとも１０％、典型的には３０〜４０％、そしてときには５０％にも上るレベルで、本発明の融合ペプチドが産生される。
【００５９】
本明細書で使用する「封入体」（ＩＢ）は、原核生物においてコードする核酸の過剰発現後に組替えて基に産生されたポリペプチドの不溶性形態を意味する。この現象は、当分野において広く知られており、例えば、Misawa S., and Kumagai, I., Biopolymers 51 (1999) 297-307); Guise, A.D., et al., Mol. Biotechnol. 6 (1996) 53-64; およびHockney et al., Trends Biotechnol. 12 (1994) 456-463により概説されている。
【００６０】
封入体の可溶化は、好ましくは、尿素、グアニジン塩酸塩またはＫＯＨもしくはＮａＯＨのアルカリ性溶液などの変性剤を加えることにより行われる（Guise, A.D., et al., Mol. Biotechnol. 6 (1996) 53-64; Fischer, B., et al., Arzneimittelforschung 42 (1992) 1512-1515）。
【００６１】
本発明の融合ペプチドは、特異的な切断プロテアーゼにより可溶化した後、酵素的に切断することができる（制限プロテアーゼ）。産生する抗膜融合性ペプチドのアミノ酸配列を考慮して、プロテイナーゼを選択する。可能ならば、制限プロテイナーゼの認識／切断配列が、抗膜融合性ペプチド中には存在しないように、そして好ましくは更なるペプチドにも存在しないように注意する。すなわち、認識／切断配列が、切断領域（リンカー領域）内に１つ存在するようにする。特異的に切断する適切なエンドプロテイナーゼは、例えば、第Ｘａ因子、トロンビン、サブチリシン、ＢＴＮ変異体／ユビキチンプロテアーゼペプチダーゼ、レニン、コラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、カリクレイン（Carter, P.: In: Ladisch, M.R,; Willson, R.C.; Painton, C.C.; Builder, S.E., eds., Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes; ACS Symposium Series No. 427, American Chemical Society, pp. 181-193 (1990))、ＴＥＶプロテイナーゼ（Parks, T.D., et al., Anal. Biochem. 216 (1994) 413-417）、ＩｇＡプロテアーゼ（Pohlner, J., et al., Nature 325 (1987) 458-462）、Ｋｅｘ２ｐプロテイナーゼ（EP-A 0 467 839）またはＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プロテイナーゼである。
【００６２】
システインを含まないことに加えて、更なるペプチドの配列を、予め選択された切断環境中で効率的切断を促進する別の設計計画を好ましくは利用してもよい。特に、予め選択された切断剤がエンドペプチダーゼであるならば、更なるペプチドが、水性環境で可溶性であることが好ましい。したがって、溶解性を高め、切断プロテアーゼのアクセスを促進するために、更なるペプチドが、電荷を帯びた側鎖基を有し、親水性を有するアミノ酸を含むことが好ましく、切断プロテアーゼのアクセスを促進する他のあらゆるアミノ酸を含むことが好ましい。そのようなアミノ酸は、例えば、ＧｌｕおよびＡｓｐ（アニオン性）、ＡｒｇおよびＬｙｓ、ならびにＳｅｒおよびＴｈｒ（中性、親水性）である。アルギニンを使用するときは、アルギニンがトリプシンの切断部位を構成することを考慮に入れなければならない。したがって、更なるペプチドがアルギニンを含有する場合には、切断プロテアーゼとしてトリプシンを回避すべきである。リシンの使用も、制限の対象となる。ペプチドがＮ末端修飾されていなければならないならば（上記参照）、リシン基を保護する必要があるかもしれない。したがって、そのような場合には、更なるペプチド中のリシンを回避することが好ましい。
【００６３】
切断部位は、典型的には、抗膜融合性ペプチド中に含まれておらず、好ましくは更なるペプチド中に含まれているように、選択される。化学的および酵素的切断部位およびそうした部位の１つに近いペプチド結合の切断を行うのに使用される相当する作用剤は、例えばWO92/01707およびWO95/03405に記載されている。
【００６４】
切断酵素および切断配列の例を以下の表３に示す。
【００６５】
【表４】
【００６６】
１）１文字コードでのアミノ酸
【００６７】
好ましくは、トリプシンが使用されるが、これは、アルギニンのＣ末端側末端でタンパク質およびペプチドを特異的に切断する。そのような酵素は、例えば、ブタもしくはウシのすい臓から、または組換え酵母から公知である。リシン残基が保護され、酵素により攻撃を受けるときには、トリプシンが、所望のポリペプチドを産生するのに特に適している。
【００６８】
エンドプロテイナーゼにより切断することができるペプチド配列は、本発明の範囲内では、１〜２０アミノ酸、好ましくは１〜１０アミノ酸で好ましくは構成されており、所望のエンドプロテイナーゼに向けたＣ末端切断部位を含有する短鎖ペプチド配列として、理解される。この更なるペプチドは、好ましくは、追加的にＮ末端側末端と所望のエンドプロテイナーゼ認識配列部位との間に、好ましくはＧｌｙ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇおよびＬｙｓから選択される、いくつかのアミノ酸の組合わせ（第１部分）を含有する。その中のこれらの追加アミノ酸の２〜８個が、陰性電荷を帯びているアミノ酸であるＡｓｐおよび／またはＧｌｕであるアミノ酸の一連を、好ましくは、第１部分として使用する。
【００６９】
抗膜融合性ペプチドがメチオニンを含まない限り、ＢｒＣＮ（化学的切断）を用いる切断も可能である。
【００７０】
融合ペプチドは、原核生物中で、そのペプチドをコードするＤＮＡ（核酸配列）の発現によって産生される。発現ベクターは、融合ペプチドを培地またはペリプラスム中への分泌を媒介する、いかなるエレメント（例えばシグナルペプチド）も含有しない。したがって、ペプチドは、不溶性の屈折体（ＩＰ）として形成される。
【００７１】
融合ペプチドをコードするＤＮＡは、当分野に公知の方法に従って生成することができる。宿主細胞中で発現を最適化するために、その核酸配列を、更なる制御および転写エレメントで伸長することが更に好ましい。発現に適するＤＮＡは、好ましくは、合成によって生成することができる。そのようなプロセスは、当業者には慣用であり、例えば、Beattie, K. L., and Fowler, R. F., Nature 352 (1991) 548-549; EP-B 0 424 990; Itakura, K., et al., Science 198 (1977) 1056-1063などに記載されている。本発明のペプチドの核酸配列を修飾することも、適切であり得る。
【００７２】
そのような修飾には、例えば以下のようなものがある：
−ライゲーション、クローニングおよび突然変異生成のステップを容易にするために様々な制限酵素認識配列を導入するために、核酸配列を修飾すること；
−宿主細胞に好ましいコドンを取り込むために核酸配列を修飾すること；
−宿主細胞中での発現を最適化するために、更なる制御および転写エレメントで核酸配列を伸長させること。
【００７３】
適当な発現ベクターの生成および発現のプロセスにおけるすべての更なるステップは、技術常識であり、当業者には慣用である。そのような方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USAに記載されている。
【００７４】
融合ペプチドは分泌されないので、細胞内、好ましくは細胞質内で凝集する。ここで、そのペプチドは、圧縮された不溶性形態（封入体）で貯蔵される。これにより、タンパク質分解性分解のような細胞機能の介入が最小限にまで低下する。
【００７５】
エシェリシア・コリ（Escherichia coli）、ストレプトマイセス属またはバシラス属は、例えば原核宿主生物として適している。本発明の融合ペプチドの生成のために、原核生物を、そのペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターで通常の方法で形質転換し、その後通常の方法で発光させる。細胞溶解後、不溶性不活性ペプチド（ＩＢ）を、例えば遠心などの通常の方法で単離する（ペレット画分）。所望の不溶性ペプチド凝集物は、必要ならば、例えば、界面活性剤を含有する緩衝液で洗浄することによりさらに、濃縮することができる。
【００７６】
不溶性融合ペプチドは、好ましくはアルカリ性溶液（例えば、ＫＯＨ、ｐＨ１０）で可溶化し、例えば、第Ｘａ因子ｐＨ８．０などの適当な手段で切断する。
【００７７】
驚いたことに、本発明のプロセスにより生成される融合ペプチドは、封入体として形成されており、宿主細胞中で分解されず、その後、融合ペプチド成分自体を著しく切断することなく、酵素的に完全に切断することができることが明らかにされている。
【００７８】
以下の実施例、参考文献、図１および配列表は、本発明、すなわち添付の特許請求の範囲に記載された真の範囲の理解を助けるために記載される。本発明の精神を逸脱することなく、記載された手順を変えることができることは理解される。
【００７９】
図１は、Ｘａ−Ｔ１３５７をコードする発現ベクターを示す。
【００８０】
【表５】
【００８１】
実施例１
発現ベクターの構築
合成遺伝子Ｘａ−Ｔ１３５７は、以下の構造を有する（Ｎ末端からＣ末端）：
−ＥｃｏＲＩ切断部位
−Ｔ５ファージのリボゾーム結合部位
−アミノ酸Ｍ、Ｒ、Ｇ、Ｓ
−アミノ酸６×Ｈ（Ｈｉｓタグ）
−アミノ酸Ａ、Ｉ、Ｄ、Ｖ
−第Ｘａ因子リンカーＩ、Ｅ、Ｇ、Ｒ
−Ｔ１３５７配列（３９アミノ酸）
−アミノ酸Ｇ
−停止コドン ２つ
−ＢａｍＨＩ切断部位
これはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で記載されている。
【００８２】
合成遺伝子は、２０、２１および２０塩基対の３つの重複領域を有する、遺伝子の配列からなる４つのオリゴヌクレオチドを使用して、遺伝子合成により構築される。合成は、２段階ＰＣＲ反応の手段で行った。第一ステップでは、オリゴ１および２ならびにオリゴ３および４のそれぞれを、テンペレートとして遺伝子のＮ末端部分および遺伝子のＣ末端部分をそれぞれ完全に合成した。その生成物を第二ステップのテンペレートとして用い、したがって、これらの生成物の等量を適用した。プライマー１および４をこのステップの合成プライマーとして用いた。
【００８３】
得られた合成遺伝子をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ベクターｐＱＥ−３０（Qiagen、独）も同様に消化した。両制限消化物を、ゲル抽出手段（Qiagen）で精製し、その後、発現ベクターの生成のためのライゲーションに用いた。挿入物のベクターに対する比は、３：１である。ベクターを図１に示す。
【００８４】
構築物の配列および正しい方向は、制限制御および配列決定（SequiServe、独）の手段により決定した。
【００８５】
実施例２
醗酵、ＩＢ単離および可溶化
醗酵およびＩＢ単離：
実施例１の発現ベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、アンピシリンおよびカナマイシンを用いて選択しながら、複合培地で醗酵させた。前培養にはＬＢ培地を用いた。本培養には、ＣおよびＮ源として唯一の複合成分として酵母抽出物を使用し、グリセリンを更なるＣ源として使用した。両成分は、流加培養期間中に濃縮形態で添加した。ＩＰＴＧによる発現を、適当な増殖期に誘導した。ｐＨ値は、リン酸／苛性ソーダを用いて７±０．２に調整した。醗酵を、０．５ｂａｒまでの過剰圧力で行った。酸素分圧を、撹拌機の回転スピード、通気および／または添加速度を介して調節した。増殖停止後かつ相当する発現期の後、菌体を、即座にまたは冷却後、遠心により回収し、凍結状態で保存した。
【００８６】
発現させるべき外来タンパク質は、封入体（ＩＢ）の形態で細胞内で得て、精製前にＩＢを調製した。この目的のために、菌体をホモジナイザーを使用して破壊し、ＩＢを数回の洗浄および遠心ステップにおいて精製した。
【００８７】
可溶化
ＩＢ５．２１ｇ（破壊緩衝液（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ,ｐＨ７．０）１００ml中で、高圧破壊により細胞２０ｇから調製）を、撹拌しながら、室温で３０mM ＫＯＨ、ｐＨ１２ ２０６mlに溶解した。
【００８８】
可溶化体のタンパク含量：ｃ＝３．２mg/mL（Bradfordタンパク質アッセイ、Bradford M. M., Analytical Biochemistry 72 (1976) 248-254）⇒ ６５９．２mg総タンパク質
融合ペプチドの分子量：MW＝７１６１．９６（モノアイソトピック質量７１５６．０５）
【００８９】
【表６】
【００９０】
のペプチドは、同様の方法で生成され、したがって、配列ＲＳＶ１１８およびＭＶ２５７を、配列「Ｔ１３５７」の代わりに使用した。
【００９１】
実施例３
シトラコニル化および切断
ａ）シトラコニル化
シトラコニル化のために、融合ペプチドに、無水シトラコン酸（ＭＷ：１１２．０９、ｐ＝１．２４５g/ml）およびジオキサンの１：１の比の混合物を適用し、したがって、無水シトラコン酸は、アミノ基１モルあたり１２倍過剰で使用した。シトラコニル化のために、融合ペプチド０．６６ｇ（ＭＷ：７１６２、Ｃ＝実施例２ｂの破壊緩衝液中３.２mg/ml）、５アミノ基／分子および無水シトラコン酸５７０μLが必要であった。溶解化物を濃ＨＣｌを用いてｐＨ１１に調整した。引き続き、無水シトラコン酸５７０μLおよびジオキサン５７０μLの混合物を、滴下して加え、溶液を２Ｍ ＫＯＨで緩衝化させて、ｐＨ値が８．５以下に降下しないようにする。ｐＨ値をｐＨ１０に調整した後、調製物を一晩室温で、撹拌しながらインキュベートした。反応をエタノールアミン（Ｈ２Ｏ中１ＭエタノールアミンｐＨ８．０、２１ml）で停止させ（溶液中のエタノールアミンの採集濃度：１００mM）、ｐＨ値を２Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ８．５に調整した。その後、シトラコニル化された物質を、−２０℃で保存した。
【００９２】
反応バッチの総容量：２３７ml
【００９３】
ｂ）トリプシンによる切断
反応バッチを、１Ｍ ＮａＣｌ １１．８５ml（最終濃度５０mM）および１Ｍ ＣａＣｌ２ １．２５ml（最終濃度２mM）と混合し、それぞれ１０mlのそのバッチを１．３Ｕ/mLのトリプシンで、室温で８０分間、撹拌しながらインキュベートした。１．３Ｕ/mLのトリプシンレベルで、融合タンパク質が完全に切断された。切断は、１６％−トリシン−ＳＤＳゲルおよびＨＰＬＣ分析の手段で測定した。適用したトリプシンは、Roche Diagnostics GmbH（純度ＩＩ、０．００９１％キモトリプシン活性、活性２０６Ｕ/mL）。
【００９４】
ｃ）ＨＰＬＣ分析による切断の測定
ペプチドの比を、合成Ａｃ−Ｔ１３５７−Ｇ−ＯＨで作成した直線較正曲線を用いてＨＰＬＣにより決定した。以下のＨＰＬＣ系を使用した。
カラム： ファルマシア １５ＲＰＣＳＴ４．６／１００
溶出液： 緩衝液Ａ：２０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；緩衝液Ｂ：７０％アセトニトリル＋３０％緩衝液Ａ
勾配： ２８分間で０％Ｂ〜１００％Ｂ
流速： １mL／分
検出：ＵＶ２２６nm
【００９５】
実施例４
精製
ａ）硫酸アンモニウム沈殿
実施例３ｂの反応混合物に、固体硫酸アンモニウム（ＡＳ）（最終濃度２Ｍ）を加え、ＡＳが溶解したのち、室温で撹拌した。沈殿したペプチドを、４℃で５分間遠心（１０，０００rpm）することにより除外し、得られたペレット（ペプチドおよびトリプシンを含有する）をＴｒｉｓ緩衝液（５０mM、ｐＨ８．５）５mL中に溶解した。
【００９６】
ｂ）ベンズアミジンセファロース６Ｂクロマトグラフィー
上記溶液からのトリプシンの除去は、ベンズアミジンカラムの手段により成し遂げられた。
適用：タンパク質５mg
カラム：ＨＲ１６（ファルマシア、ｈ＝３．３cm、ｄ＝１．６cm、Ｖ＝１０ml）
材料：ベンズアミジンセファロース６Ｂ（ファルマシアＮｏ．１７−０５６８−０１）、製造業者の指示書に従って再生し、５０mM Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．５で平衡化させたもの。
流速：１mL/分
カラムの洗浄：５０ｍM Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．５
【００９７】
ペプチドの４０〜８０％がカラムを通過し、残余がカラム物質に結合した。エタノールの６０％で行ったその後の溶出中には、エタノール含量が２０％以上のとき、トリプシンはもはや検出不可能であったため、存在の可能性が考えられたトリプシンの共溶出は測定することはできなかった。フロースルー中および溶出中の両方で、ペプチドはＨＰＬＣ分析において単一ピークとして出現し、さらにそのペプチドは、ＳＤＳゲルにおいて均一であった。
【００９８】
ｃ） フェニルセファロースＦＦによる精製
フェニルセファロースファーストフロー（ファルマシア）：ＡＳによるペレット状沈殿物５mg（タンパク質含量約５mg/mL）をＴｒｉｓ緩衝液１mL（５０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５）に溶解させ、カラムにかけた。ペプチドは、完全にカラム材料に結合し、５０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．５中の２０〜６０％エタノール勾配で溶出することができた。長時間の保持時間にわたって溶出された。ペプチド画分は、均一であった。
【００９９】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】Ｘａ−Ｔ１３５７をコードする発現ベクターを示す図である。
【０００１】
ｇｐ４１フラグメントのアセチル化
本発明は、ウイルスと標的細胞の膜との融合を阻害するペプチドの組換え製造方法に関する。具体的には、本発明は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、麻疹ウイルス（ＭＥＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）またはヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）などのインフルエンザウイルスのペプチド性阻害剤の組換え製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスと細胞膜の融合は、ＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−ＩＩ、ＲＳＶ、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、エプスタインバーウイルスおよび肝炎ウイルスなどのエンベロープのあるウイルスが細胞に侵入するために不可欠なステップである。細胞に侵入した後、ウイルス複製のカスケードが開始され、ウイルス感染をもたらす。
【０００３】
ＨＩＶは、複雑なゲノムを有し、コーン形のカプシドコア粒子を示すレトロウイルスを含む、レンチウイルス属の一員である。レンチウイルスの他の例として、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ビスナウイルス、およびウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）などがあげられる。あらゆるレトロウイルスのように、ＨＩＶのゲノムは、ＲＮＡによってコードされており、このＲＮＡは、新しい宿主細胞に侵入すると、ウイルスの逆転写酵素（ＲＴ）によりウイルスＤＮＡに逆転写される。インフルエンザウイルスおよびその細胞侵入メカニズムは、Bullough, P. A., et al., Nature 371 (1994) 37-43; Carr, C.M., and Kim, P.S., Cell 73 (1993) 823-832; and Wilson, I.A., et al., Nature 289 (1981) 366-373.によって記載されている。
【０００４】
すべてのレンチウイルスは、宿主細胞の膜に由来する脂質二重層により包まれている。露出された表面糖タンパク質（ＳＵ、ｇｐ１２０）は、膜貫通タンパク質（ＴＭ、ｇｐ４１）との相互作用を介してウイルスに固着されている。脂質二重層は、主要組織適合抗原、アクチンおよびユビキチンを含む、宿主細胞由来のいくつかの細胞膜タンパク質をも含有する（Arthur, L.O., et al., Science 258 (1992) 1935-1938）。マトリックスタンパク質（ＭＡ、ｐ１７）約２０００コピーを含むマトリックス殻が、ウイルス膜の内部表面を裏打ちしており、カプシドタンパク質（ＣＡ、ｐ２４）約２０００コピーを含む円錐形カプシドコア粒子は、ウイルスの中央に位置する。カプシド粒子は、スプライシングされていないウイルスゲノム２コピーをカプシド形成しており、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ、ｐ７）約２０００コピーとともに、リボヌクレオタンパク質複合体として安定化されており、また、ウイルスがコードする、３種の不可欠な酵素であるプロテアーセ（ＰＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）、およびインテグラーゼ（ＩＮ）を含有する。ウイルス粒子は、アクセサリータンパク質であるＮｅｆ、ＶｉｆおよびＶｐｒをも包含している。宿主細胞で機能する、更なる３種のアクセサリータンパク質であるＲｅｖ、ＴａｔおよびＶｐｕは、包含されていないようである。
【０００５】
ＨＩＶの場合には、ウイルスの侵入は、ＨＩＶエンベロープ表面糖タンパク質と関連している（Lawless, M.K., et al., Biochemistry 35 (1996) 13697-13708; and Turner, B.G., and Summers, M. F., J. Mol. Biol. 285 (1999) 1-32）。ＨＩＶ−Ｉの場合には、この表面タンパク質が、単一の１６０ｋＤ前駆体タンパク質として合成され、それが、細胞プロテアーゼにより、２種の糖タンパク質、ｇｐ−４１およびｇｐ−１２０に切断される。ｇｐ−４１は、膜貫通タンパク質であり、ｇｐ−１２０は、三量体または多量体形態でｇｐ−４１と共有結合せずに会合している細胞外タンパク質である（Hammarskjold, M.-L., et al., Biochim. Biophys. Acta 989 (1989) 269-280）。ＣＤ４表面タンパク質がＨＩＶ−Ｉウイルスに対する細胞受容体として作用するため、ＨＩＶは、ＣＤ４＋リンパ球を標的とする。細胞へのウイルスの侵入は、細胞ＣＤ４＋受容体分子へのｇｐ１２０の結合に依存しており、ｇｐ−４１は、エンベロープ糖タンパク質複合体をウイルス膜中に固定し、膜融合を媒介する（McDougal, J.S., et al., Science 231 (1986) 382-385; and Maddon, P. J., et al., Cell 47 (1986) 333-348）。
【０００６】
ｇｐ４１は、ウイルスと細胞膜の融合を媒介する膜貫通サブユニットである。ｇｐ４１の細胞外ドメインコアは、３つのらせんヘアピンからなる６へリックスの束であり、それぞれが逆平行Ｃへリックスと対をなすＮへリックスからなる（Chan, D.C., et al., Cell 89 (1997) 263-273; Weissenhorn, W., et al., Nature 387 (1997) 426-430; Tan, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 12303-12308）。Ｎへリックスは、３つの保存された疎水性の溝を有する内部三量体コイルドコイル（coiled coil）を形成し、Ｃへリックスは、これらの溝のそれぞれに入っている。この構造は、融合活性状態のｇｐ４１のコアに対応するようである。Chan, D. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 15613-15617によれば、１型ＨＩＶｇｐ４１のコイルドコイルの顕著な空洞が、魅力的な薬物標的であるとの証拠が存在する。
【０００７】
ｇｐ−４１が膜融合を媒介するメカニズムには、コイルドコイル三量体の形成が関与しており、これが例えばインフルエンザのヘムアグルチニンについて記載されているように、休止状態から膜融合性状態への遷移を推進すると考えられている（Wilson, I. A., et al., Nature 289 (1981) 366-373; Carr, C.M., and Kim, P.S., Cell 73 (1993) 823-832; Bullough, P.A., et al., Nature 371 (1994) 37-43)。
【０００８】
ＤＰ１７８およびＣ３４などのエンベロープを有するウイルスのＣペプチド（Ｃへリックスに対応するペプチド）は、ＨＩＶ−Ｉの実験室適合株および初代分離株の両株による膜融合を強力に阻害する（Malashkevich, V. N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(1998) 9134-9139; Wild, C. T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 9770-9774）。ＣペプチドであるＤＰ１７８での第Ｉ相臨床治験は、ＤＰ１７８がin vivoで抗ウイルス活性を有し、その結果ウイルス負荷が低下することを示唆している（Kilby, J. M., et al., Nature Medicine 4 (1998) 1302-1307）。ｇｐ４１コアの構造的特徴は、これらのペプチドが、ドミナントネガティブなメカニズムを介して作用しており、そのメカニズムでは、Ｃペプチドがｇｐ４１の中心部コイルドコイルに結合して不活性化していることを示唆している（Chan, D. C., et al., Cell 93 (1998) 681-684）。
【０００９】
各コイルドコイルの界面内に、Ｎへリックスコイルドコイル中残基クラスターにより形成された深い空洞があり、それが、抗ウイルス化合物の開発において魅力的な標的であることが提唱されている。Ｃへリックスからの３残基（Ｔｒｐ−６２８、Ｔｒｐ−６３１およびＩｌｅ−６３５）がこの空洞に入り、広範囲にわたる疎水性接触をなす。突然変異体解析は、この空洞を含むＮへリックス残基（Ｌｅｕ−５６８およびＴｒｐ−５７１）のうち２つが、膜融合活性に不可欠であることを示す（Cao, J., et al., J. Virol. 67 (1993) 2747-2755）。したがって、この空洞に高い親和性をもって結合し、正常なＮとＣとのヘリックス対形成を妨げる化合物は、効果的なＨＩＶ−１阻害剤であり得る。空洞中の残基は、多様なＨＩＶ−１分離株で高度に保存されている。しかも、空洞結合領域を含有するＣペプチドは、この領域を欠くＤＰ１７８よりも、はるかに耐性ウイルスを生じにくい（Rimsky, L. T., et al., J. Viol. 72 (1998) 986-993）。これらの観察は、高度に保存されたコイルドコイル表面、特にその空洞を標的とする高親和性リガンドが、多様なＨＩＶ分離株に対して広い活性を有し、薬物を回避する突然変異体により迂回される可能性が低いことを示唆するものである。
【００１０】
エンベロープの融合タンパク質の膜融合性構造は、インフルエンザ、モロニーマウス白血病ウイルス、およびサル免疫不全ウイルス（cit. in Chan, D. C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 15613-15617）、ヒトＲＳウイルス（human respiratory syncytial virus）、エボラ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、サルパラインフルエンザから明らかにされた。それは、ウイルスの標的細胞への侵入が、ＨＩＶ−１のｇｐ４１、インフルエンザのヘムアグルチニン、エボラのＧＰ２などの似通った膜貫通糖タンパク質によって可能になる、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、レトロウイルス科などのファミリー間の密接な関係を示す（Zhao, X., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 14172-14177）。
【００１１】
最新技術では、いくつかの方法がペプチド性阻害剤（Ｃ−ペプチド）の製造について記載されている（例えば、Root, M.J., et al., Science 291 (2001) 884-888; Root et al参照；Rootらは、ＨＩＶ−１、ＨＸＢ２に由来し、６２５−６６１の残基を含有するペプチドＣ３７−Ｈ６を記載している。これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＧＲリンカーおよびヒスチジンタグを有するＮ４０セグメントとして組換え法により発現され、細菌溶解物の可溶性画分から精製される。Zhao, Xらは、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 14172-14177に、残基１５３〜２０９、Ｇに富んだリンカー、残基４７６〜５２４、第Ｘａ因子切断部位、およびヒスチジンタグをコードする組換えＲＳＶ−１（ヒトＲＳウイルス）の合成遺伝子を記載している。Chen, C.H.らは、J. Virol. 67 (1995) 3771-3777に、ＭＢＰに残基５４０〜６８６を融合させた融合タンパク質として合成させたｇｐ４１の細胞外ドメインの組換え発現を記載している。
【００１２】
例えば、非感染細胞へのレトロウイルスの伝播を阻害することを含む、上記のような膜融合に関与する事象のペプチド性阻害剤、または抗膜融合性ペプチドとも記載するものが数多く知られている。そのようなペプチドは、例えば、Lambert, D. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 2186-2191、米国特許番号第6,013,263号、6,017,536号および6,020,459号、WO00/69902、WO99/59615およびWO96/40191に記載されている。さらに、融合関連事象を阻害するペプチドは、例えば米国特許第6,093,794号、6,060,065号、6,020,459号、6,017,536号、6,013,263号、5,464,933号、5,656,480号およびWO96/19495に記載されている。
【００１３】
ウイルス融合を阻害するＨＩＶ−１ ｇｐ−４１エクトドメイン由来の線状ペプチドの例として、ＤＰ−１０７およびＤＰ−１７８があげられる。ＤＰ−１０７は、Ｎ末端融合ペプチド付近のｇｐ−４１の一部であり、へリックス状であることが明らかにされており、コイルドコイル形成に一致する様式で強くオリゴマー化している（Gallaher, W. R., et al., Aids Res. Hum. Retrovirus 5 (1989) 431-440, Weissenhorn, W., et al., Nature 387 (1997) 426-430）。ＤＰ−１７８は、ｇｐ−４１のエクトドメインのＣ末端領域に由来する（Weissenhorn, W., et al., Nature 387 (1997) 426-430）。溶液中では認識し得る構造をとらないが、このペプチドおよびその拘束アナログは、へリックス構造をとり、ｇｐ−４１のＮ末端コイルドコイル三量体の溝に結合し、ｇｐ４１が膜融合状態に変化するのを妨げる（Judice, J. K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 13426-13430）。
【００１４】
このような短鎖ペプチドは、通常、化学合成により製造される。化学合成は、例えば、Mergler, M., et al., Tetrahedron Letters 29 (1988) 4005-4008 and 4009-4012; Andersson, L., et al., Biopolymers 55 (2000) 227-250; およびby Jones, J. H., J. Pept. Sci. 6 (2000) 201-207に記載されている。他の方法が、WO 99/48513に記載されている。
【００１５】
しかし、化学的ペプチド合成には、いくつかの欠点がある。最も重要なのが、ラセミ化であり、これにより光学的な純度が不十分となる。ペプチド化学では、ラセミ化は、いくつかのキラル中心のうちの一つにおけるエピマー化をも意味する。１回のカップリング工程でたった１％のラセミ化が起こると、１００回のカップリング工程では、標的ペプチドは６１％しか得られなくなる（Jakubke, H.D., Peptide, Spektrum Akad. Verlag, Heidelberg (1996), p.198）。鎖長が増加するにつれ、不純物数が増加し、その除去がより困難で費用を要するものとなることは自明である。
【００１６】
大規模での化学的合成は、費用が高額であること、出発材料として保護されたアミノ酸誘導体が利用可能ではないことにより、制限されている。完全な反応を可能にするために、これらの出発材料を過剰に用いるべきであり、その一方で、コスト面の理由、安全性、および環境の観点からその使用を比較検討すべきである（Andersson et al., Biopolymers 55 (2000) 227-250）。
【００１７】
ペプチドは、組換えＤＮＡ技術により製造してもよい。５０アミノ酸を超える鎖長の可溶性タンパク質の組換え製造は、現在の技術水準から知られているが、５０アミノ酸未満のペプチドの製造には、いくつかの欠点がある（Doebeli, H., et al, Protein Expression and Purification 12 (1998) 404-414）。そのような短鎖または中鎖のペプチドは、通常、安定的には発現されない。それらは、内因性ペプチダーゼに攻撃されて分解される。これは、そのサイズが小さいこと、または高度に規則化された３次構造がないためかもしれない（WO00/31279）。他の著者らは、ペプチドの組換え製造には、安定な発現のために最小鎖長６０〜８０アミノ酸が必要であることを見出しており、さらに、そのようなペプチドが、封入体としてではなく、可溶性ペプチドとして製造されることは、技術常識である（例えば、van Heeke, G., et al., Methods in Molecular Biology 36 (1994)245-260, eds. B.M. Dunn and M.W. Pennington, Humana Press Inc., Totowa, N.J.);およびGoldberg et al., Maximizing Gene Expression (1986), pp.287-314, eds. Reznikoff, W., and Gold, L., Butterworks, Stoneham, MAを参照）。短いペプチドは、原核生物において発現されると、可溶性の状態のままであり、すみやかに原核生物のペプチダーゼによって分解されるため、こうしたペプチドの組換え製造は、特に成功し難い。この問題を回避するために、技術常識によれば、このようなペプチドを大きな（１５０〜２００アミノ酸超）融合タンパク質として発現させる。それにより融合テール（fusion tail）が融合タンパク質をかなり可溶性するとともに封入体の形成を回避する。または融合テールが、原核生物中での組換え発現の間に封入体を形成するタンパク質であり、したがって、そのような融合テールと所望の短いペプチドからなる融合タンパク質も、原核生物中での過剰発現の間に封入体を形成するであろう。これらの方法の大きな欠点は、融合テールの分子量が、所望のペプチドの分子量よりもかなり高いことである。したがって、所望のペプチドの収量は極めて低く、余剰の切断した融合テールを分離しなければならない。
【００１８】
Lepage, P., et al., in Analytical Biochemistry 213 (1993) 40-48は、ＨＩＶ−１Ｒｅｖペプチドの組換え製造方法を記載している。ペプチドを、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のタンパク質Ａの合成イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）結合ドメインとの融合タンパク質として発現させる。そのペプチドは、約２０アミノ酸長を有するが、ＩｇＧ結合部分は、約１７０アミノ酸長を有し、発現された融合タンパク質は、約１９０アミノ酸の全長を有する。この融合タンパク質は、発現され、培地中に可溶性形態で分泌され、親和性クロマトグラフィーにより精製される。著者らは、この方法を用いれば、培養物１リットル当たり数百ミリグラムの量で組換えタンパク質を製造することが可能かもしれないと報告している。しかし、この方法論は、シグナルペプチド配列内での選択的プロセシングならびに融合タンパク質および切断されたペプチドのいくつかの転写後修飾のために、限界がある。アミノ酸１個の平均分子量を１１０ダルトンとすると、所望のペプチドは、約２，０００〜５，０００ダルトンの分子量を有するが、Staphylococcus aureusのタンパク質ＡのＩｇＧ結合ドメインを融合テールに用いると、融合テールは、少なくとも１７０アミノ酸長を有する（約１９，０００Ｄ）。したがって、所望のペプチドは、組換え的に製造されたタンパク質の１０〜２５％に過ぎない。
【００１９】
EP0 673 948は、発現ベクターｐＳＥＭ３を用いてβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質としてのｇｐ４１ペプチドの組換え製造を記載している（Knapp, S., et al., BioTechniques 8 (1990) 280-281）。この融合タンパク質は、Ｎ末端アミノ酸３７５個をコードする、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の大部分、および付加的ポリリンカー配列の２３コドンを含む。
【００２０】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける大きな融合タンパク質を経由する小さなペプチドの組換え製造方法の更なる例は、Uhlen and Moks, "Gene Fusions For Purposes of Expression, An Itroduction" in Methods in Enzymology 185 (1990) 129-143, Academic Pressに記載されている。「封入体」経路を介する製造については、Uhlen and Moksは、ｔｒｐＥ、ｃＩＩに加え、ここでもβ−ガラクトシダーゼを含む大きな融合生成物に言及している。Ningyi, L., et al., Gaojishu Tongxun 10 (2000) 28-31は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐ２４ ｇａｇ遺伝子の組換え発現について記載している。
【００２１】
したがって、本発明の目的は、封入体ルートを経由する抗膜融合性ペプチドの高収量の組換え製造を可能にし、そのようなペプチドの大規模な工業的生産に適する方法を提供することである。
【００２２】
発明の概要
したがって、本発明は、融合ペプチドの封入体が形成される条件下で、
ａ）宿主細胞中で、約４〜３０アミノ酸長の更なるペプチドにＮ末端で結合させた約１０〜５０アミノ酸長の該抗膜融合性ペプチドからなる前記融合ペプチドをコードする核酸を発現する；
ｂ）前記宿主細胞を培養する；
ｃ）前記封入体を形成させ、回収し、可溶化する；
ｄ）前記融合タンパク質を単離する
ことを特徴とする、原核宿主細胞中で約１４〜７０アミノ酸長の融合ペプチドとして抗膜融合性ペプチドを製造する方法を提供することである。
【００２３】
好ましくは、上記抗膜融合性ペプチドが、封入体の可溶化の間または後に、上記更なるペプチドから切り離される。
【００２４】
好ましくは、抗膜融合性ペプチドが、レンチウイルス属のウイルスからのエンベロープ融合タンパク質の膜貫通サブユニットのＣへリックスのフラグメントである。
【００２５】
上記更なるペプチドは、上記宿主細胞において非融合タンパク質として組換え的に発現された場合には、非常に短いため、封入体の形態では見出されないであろう。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、更なるペプチドは、第一および／または第二部分からなり、
（ａ）前記第一部分は、１〜２０の一連のアミノ酸であり（好ましくは、融合ペプチドの等電点に影響を及ぼす親水性アミノ酸であり、および／または前記第一部分が、溶解性、クロマトグラフィー分離樹脂との相互作用の点で抗膜融合性ペプチドとは有意に異なる）、および／または切断プロテアーゼのアクセスを向上させ（Polyak, S. W., et al., Protein Eng. 10 (1997) 615-619)、
（ｂ）前記第二部分は、１〜１０アミノ酸の切断可能なペプチド性リンカー領域であり（例えば表３を参照）、膜融合性ペプチドのＮ末端および第一部分のＣ末端に隣接して位置する。
【００２７】
更なるペプチドが、第一部分または第二部分のみからなるときは、好ましくはｍＲＮＡ発現中の安定化させるため、上記部分は、少なくとも４アミノ酸（開始コドンがコードするメチオニンを含む）の長さを有する。この４アミノ酸は、好ましくは、少なくとも１個のアルギニンを含む。
【００２８】
本発明の更なる実施形態において、膜融合性ペプチドは、そのＣ末端に結合したグリシンを含有する。このグリシンは、酵素的Ｃ末端アミド化の目的に有用である。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態において、融合ペプチド中の抗膜融合性ペプチドの分子量と更なるペプチドの分子量との比は、１０：１〜１：２である。
【００３０】
本発明の更に好ましい実施形態は、本発明による融合ペプチドをコードする核酸を含む原核発現ベクター、および上記ペプチドの組換え製造のためのその使用を含む。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態は、本発明による融合ペプチドの封入体の調製物、およびその封入体の製造方法を含む。
【００３２】
本発明の更に好ましい実施形態は、本発明による融合ペプチドをコードする核酸を含む。
【００３３】
発明の詳細な説明
驚くべきことに、短鎖抗膜融合性ペプチド（好ましくは１０〜５０アミノ酸長、より好ましくは、１０〜４０アミノ酸長）を、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物中で、封入体ルート経由で、７０アミノ酸までの長さの短い融合ペプチドとしてうまく発現できることが見出された。
【００３４】
本発明によれば、更なるペプチドにＮ末端で連結された抗膜融合性ペプチドからなる融合ペプチドは、不溶性タンパク質封入体が形成される条件下、原核生物で過剰発現される。シグナル配列を含むと、ペリプラスムまたは培地へのタンパク質の可溶性分泌を可能にするが、シグナル配列を含まない発現ベクターを用いると、封入体が、細胞質内に見出される。これらの封入体を、例えば細胞溶解後の遠心などにより、他の細胞成分から分離する。封入体を、グアニジン塩酸塩、尿素、アルギニンのような物質、またはＫＯＨもしくはＮａＯＨなどの強塩基などの変性剤により可溶化する。可溶化後、そのようなタンパク質は通常、希釈または透析によって、再び折りたたまれなければならない。本発明の方法により製造された融合タンパク質は、ジスルフィド架橋のない短鎖ペプチドであり、タンパク質の復元を必要としない。可溶化後、更なるペプチドの切断が可能なように、ｐＨなどの溶液条件を単純に変え、必要ならば切断を行う。例えば、サイズ除外クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーによる、簡単な様式で、この溶液から融合ペプチドまたは抗膜融合性ペプチドを回収する。
【００３５】
本明細書で使用する「抗膜融合性」または「抗膜融合」は、例えば細胞膜、またはウイルスエンベロープまたは線毛などの２種またはそれ以上の構造物の間での融合事象のレベルを阻害するか、またはそのペプチドが存在しなければこれら構造の間で起こる膜融合レベルと相対的にこれを低下させる、ペプチドの能力を意味する。本明細書の実施例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、呼吸器シンシチカルウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）、麻疹ウイルス（ＭＥＶ）およびサル免疫不全ウイルスなどのレンチウイルスのペプチド性阻害剤である。このような抗膜融合性ペプチドは、レンチウイルス属のウイルスからのエンベロープ融合タンパク質の膜貫通サブユニットのＣへリックスに由来し、それぞれのウイルスの膜貫通サブユニットの中心のコイルドコイルに結合する。
【００３６】
特に好ましいのは、ＨＩＶ−１抗膜融合性ペプチドである。表１には、ｇｐ４１のＣペプチドに由来するＨＩＶ−１抗膜融合剤の例が記載されている。これらの抗膜融合性ペプチドおよびそのフラグメントは、本発明において特に有用である。
【００３７】
【表１】
＊Ｎ末端アセチル化および／またはＣ末端アミド化ペプチド；Ｔ−２０（ＤＰ１７８と同義）およびＴ−１２４９は、１型ヒト免疫不全ウイルスから、Ｔ−１１８は、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）から、Ｔ−２５７は、麻疹ウイルス（ＭＶ）からのものである。
【００３９】
１）WO 99/59615
２）Rimsky, L. T., et al., J. Virol. 72 (1998) 986-993
３）Lambert, D. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 2186-2191
【００４０】
本発明の更なるペプチドは、封入体の形成の改善を目的とせずに、Ｎ末端で抗膜融合性ペプチドに添加されたペプチドである。その目的は、例えば、発現ｍＲＮＡ安定化、精製（例えば、Ｈｉｓタグ；例えば、Zhang, J.-H., et al., Nanjing Daxue Xuebao, Ziran Kexue 36(4) (2000) 515-517を参照）を改善すること、またはアセチル化またはＰＥＧ修飾のようなその後のＮ末端の修飾を可能にすることである。
【００４１】
本発明の更なるペプチドは、少なくとも４アミノ酸（切断、ｍＲＮＡ安定化および／または発現目的で、メチオニンおよび更に３アミノ酸）〜約３０アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸（核酸のコドンレベルについて）からなる短い一連のペプチドである。更なるペプチドの長さは、このペプチドが、イムノグロブリン、ストレプトアビジンまたは組織型プラスミノーゲン活性化因子などの大きなタンパク質が封入体として産生される条件下、原核生物内での組換え発現中に細胞質中に可溶性形態で形成されるペプチドである限り、本発明では重要ではない。しかし、更なるペプチドは、抗膜融合性ペプチドの収量を改善するために、非常に短いことが好ましい。（更なるペプチドの抗膜融合性ペプチドに対する長さの比が３：１であるときは、同量の融合ペプチドが産生されるとすれば、回収された融合ペプチドの量との関係において、抗膜融合性ペプチドの量は、その比が１：１であるときより約５０％低い。融合ペプチドの許容し得る収量を得るために、更なるペプチドの長さは、融合ペプチドの全長が、７０アミノ酸、好ましくは５０アミノ酸、もっとも好ましくは４０アミノ酸を超えないように選択する。したがって、更なるペプチドが、適当な切断部位、融合タンパク質の発現および溶解性を改善しその封入体の溶解化プロセスを促進するかまたは切断プロテアーゼのアクセスを向上させる（立体障害の回避）ためのいくつかのアミノ酸、および／または精製手段のためのＨｉｓタグ（Hengen, P., Trends Biochem. Sci. 20(1995) 285-286）などのいくつかのアミノ酸、および開始コドンに必要でありそれによってコードされているメチオニンのみからなるのが特に好ましい。
【００４２】
更なるペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物中で、単独で、シグナル配列なしに過剰発現されると、封入体として形成されずに、細胞質内に可溶性状態のままとどまるか、または細胞質内で急速に分解される短鎖ペプチドである。そのようなタンパク質は、固定化した変性三次構造をとらず、したがって、そのようなタンパク質は、溶解性に乏しい固定化三次構造を形成することができず、発現された場合には、可溶性状態のままであり、Ｅ．ｃｏｌｉプロテアーゼによって分解される。
【００４３】
本発明の更なるペプチドは、好ましくは、融合ペプチドと更なるペプチドとの間の切断部位への切断剤のアクセスを立体的に妨害する、固定化三次構造を形成しないアミノ酸からなる。このため、更なるペプチドは、システイン残基を好ましくは含まない。システインは、高度に反応性で、ジスルフィド結合を形成し得る、スルフヒドリル基またはチオール基を含有する。システインが存在すると、更なるペプチドが固定化二次または三次構造をとらないことを所望するのに相反して作用し得るので、その使用を避ける。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様において、Ｎ末端に結合した一連の更なるペプチドは、そのＣ末端に、酵素的または化学的手段により容易に切断可能な配列を含有する。
【００４５】
本発明の更なるペプチドを、発現、可溶化、精製およびペプチド修飾の間、抗膜融合性ペプチドのＮ末端を保護するために、融合ペプチド中に使用することも好ましい。そのような融合ペプチドは、Ｎ末端修飾抗膜融合性ペプチドの製造方法において特に価値がある。そのような方法は、融合ペプチドとして組換えポリペプチドの形成を含んでおり、そのような融合部分は、Ｎ末端を保護する。組換え融合ペプチドは、３種類までの化学保護剤と反応させて、反応性側鎖基を選択的に保護し、側鎖基が修飾されるのを防ぐことができる。その後、融合ペプチドを、少なくとも１種の切断試薬を用いて、ペプチドと融合部分との間で切断し、非保護末端アミノ酸反応性基を形成する。非保護末端アミノ酸反応性基を、Ｎ−末端アセチル化のために、無水酢酸またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド酢酸エステルなどの、少なくとも１種類の化学修飾剤で修飾する。その後、側鎖を脱保護し、Ｎ末端修飾ペプチドを形成する。そのような方法は、例えばWO94/01451; 米国特許第5,635,371号および米国特許第5,656,456号に記載されている。
【００４６】
更なるペプチド部分は、好ましくは、融合ペプチドの精製を促進するような構造を有する。更なるペプチドは、好ましくは、この目的のために、ポリヒスチジン（約６個のヒスチジン残基）などの「親和性タグ」（Pandjaitan, B., et al., Gene 237 (1999) 333-342と比較）を含有する。
【００４７】
容易な発現および切断後のフラグメントの分離のために、更なるペプチドの等電点（ＩＰ）が、抗膜融合性ペプチドのＩＰと異なるように更なるペプチドを選択することが好ましい。表２に、様々な融合ペプチドのＩＰ、ならびに融合体ではない膜融合性ペプチドＴ６８０およびＴ１３５７（WO96/40191およびWO99/59615による命名）のＩＰとを示す。好ましくは、融合ペプチドと融合ペプチドの抗膜融合性部分のＩＰが、約１ｐＨ単位、好ましくは約１〜２ｐＨ単位異なる。そのようなＩＰの変化は、更なるペプチド中に含有される好ましくは塩基性アミノ酸および／またはヒスチジンにより行うことができる。
【００４８】
【表２】
１）実験的に決定
２）１文字コードによるアミノ酸；そうでないところはペプチド名。
【００５０】
本発明のさらに好ましい実施態様において、抗膜融合性ペプチドは、Ｃ末端にグリシンを含有する。このグリシンは、その後の酵素的Ｃ末端アミド化の目的のために有用である（Bradbury, A.F., and Smyth, D.G., Trends Biochem. Sci.16 (1991) 112-115）。
【００５１】
本発明による特に好ましい融合ペプチドは以下のとおりである（標準的１文字コードでのアミノ酸）。
【００５２】
【表３】
上記融合ペプチドは、ポリＨｉｓタグ（Ｈｉｓ６）を含まない、または配列番号２、１１または１２の最初の４アミノ酸を融合ペプチド中の更なるペプチドとして含む。
【００５４】
注：逆部分は、ペプチドの名称であり、したがって、この部分に含まれる文字は、アミノ酸の１文字コードを構成しない。
【００５５】
原核生物中で封入体経由でタンパク質の組換え産生を記載した刊行物が数多く存在する。そうした刊行物のそれぞれは、Misawa, S., et al., Biopolymers 51 (1999) 297-307; Lilie, H., Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1998) 497-501; Hockney, R.C., Trends Biotechnol. 12 (1994) 456-463である。
【００５６】
本発明の融合ペプチドは、原核生物内で過剰発現される。シグナルペプチドなしでの過剰発現は、封入体を形成させることとなった。開始コドンによりコードされ、上記例で言及したメチオニンは、その後のプロセシングの間に切断され得る。原核生物におけるタンパク質の過剰発現の一般的方法は、当技術分野では長く広く知られていた。当業界での刊行物の例に、Skelly, J. V., et al., Methods. Mol. Biol. 56 (1996) 23-53 およびDas, A., Methods Enzymol. 182 (1990) 93-112がある。
【００５７】
原核生物での過剰発現は、ｔａｃまたはｌａｃプロモーターなどのプロモーターを伴う最適化発現カセットを用いる発現を意味する（EP-B0 067 540）。通常、化学的に誘導し得るプロモーターまたは温度変化を介して誘導し得るプロモーターを含有するベクターの使用により行うことができる。Ｅ．ｃｏｌｉに有用なプロモーターの１つが、温度感受性λＰＬプロモーターである（EP-B 0 041 767と比較）。さらに効率的なプロモーターは、ｔａｃプロモーターである（米国特許第4,551,433号を参照）である。Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物用の強い制御シグナルは、通常、細菌に対するバクテリオファージに由来する（Lanzer, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 8973-8977; Knaus, R., and Bujard, H., EMBO Journal 7 (1988) 2919-2923; λＴ７プロモーターについては、Studier, F. W., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 60-89);Ｔ５プロモーターについては、EP 0 186 069を参照）。
【００５８】
そのような過剰産生する原核細胞発現系の使用により、少なくとも細胞により発現された総タンパク質量の少なくとも１０％、典型的には３０〜４０％、そしてときには５０％にも上るレベルで、本発明の融合ペプチドが産生される。
【００５９】
本明細書で使用する「封入体」（ＩＢ）は、原核生物においてコードする核酸の過剰発現後に組替えて基に産生されたポリペプチドの不溶性形態を意味する。この現象は、当分野において広く知られており、例えば、Misawa S., and Kumagai, I., Biopolymers 51 (1999) 297-307); Guise, A.D., et al., Mol. Biotechnol. 6 (1996) 53-64; およびHockney et al., Trends Biotechnol. 12 (1994) 456-463により概説されている。
【００６０】
封入体の可溶化は、好ましくは、尿素、グアニジン塩酸塩またはＫＯＨもしくはＮａＯＨのアルカリ性溶液などの変性剤を加えることにより行われる（Guise, A.D., et al., Mol. Biotechnol. 6 (1996) 53-64; Fischer, B., et al., Arzneimittelforschung 42 (1992) 1512-1515）。
【００６１】
本発明の融合ペプチドは、特異的な切断プロテアーゼにより可溶化した後、酵素的に切断することができる（制限プロテアーゼ）。産生する抗膜融合性ペプチドのアミノ酸配列を考慮して、プロテイナーゼを選択する。可能ならば、制限プロテイナーゼの認識／切断配列が、抗膜融合性ペプチド中には存在しないように、そして好ましくは更なるペプチドにも存在しないように注意する。すなわち、認識／切断配列が、切断領域（リンカー領域）内に１つ存在するようにする。特異的に切断する適切なエンドプロテイナーゼは、例えば、第Ｘａ因子、トロンビン、サブチリシン、ＢＴＮ変異体／ユビキチンプロテアーゼペプチダーゼ、レニン、コラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、カリクレイン（Carter, P.: In: Ladisch, M.R,; Willson, R.C.; Painton, C.C.; Builder, S.E., eds., Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes; ACS Symposium Series No. 427, American Chemical Society, pp. 181-193 (1990))、ＴＥＶプロテイナーゼ（Parks, T.D., et al., Anal. Biochem. 216 (1994) 413-417）、ＩｇＡプロテアーゼ（Pohlner, J., et al., Nature 325 (1987) 458-462）、Ｋｅｘ２ｐプロテイナーゼ（EP-A 0 467 839）またはＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プロテイナーゼである。
【００６２】
システインを含まないことに加えて、更なるペプチドの配列を、予め選択された切断環境中で効率的切断を促進する別の設計計画を好ましくは利用してもよい。特に、予め選択された切断剤がエンドペプチダーゼであるならば、更なるペプチドが、水性環境で可溶性であることが好ましい。したがって、溶解性を高め、切断プロテアーゼのアクセスを促進するために、更なるペプチドが、電荷を帯びた側鎖基を有し、親水性を有するアミノ酸を含むことが好ましく、切断プロテアーゼのアクセスを促進する他のあらゆるアミノ酸を含むことが好ましい。そのようなアミノ酸は、例えば、ＧｌｕおよびＡｓｐ（アニオン性）、ＡｒｇおよびＬｙｓ、ならびにＳｅｒおよびＴｈｒ（中性、親水性）である。アルギニンを使用するときは、アルギニンがトリプシンの切断部位を構成することを考慮に入れなければならない。したがって、更なるペプチドがアルギニンを含有する場合には、切断プロテアーゼとしてトリプシンを回避すべきである。リシンの使用も、制限の対象となる。ペプチドがＮ末端修飾されていなければならないならば（上記参照）、リシン基を保護する必要があるかもしれない。したがって、そのような場合には、更なるペプチド中のリシンを回避することが好ましい。
【００６３】
切断部位は、典型的には、抗膜融合性ペプチド中に含まれておらず、好ましくは更なるペプチド中に含まれているように、選択される。化学的および酵素的切断部位およびそうした部位の１つに近いペプチド結合の切断を行うのに使用される相当する作用剤は、例えばWO92/01707およびWO95/03405に記載されている。
【００６４】
切断酵素および切断配列の例を以下の表３に示す。
【００６５】
【表４】
１）１文字コードでのアミノ酸
【００６７】
好ましくは、トリプシンが使用されるが、これは、アルギニンのＣ末端側末端でタンパク質およびペプチドを特異的に切断する。そのような酵素は、例えば、ブタもしくはウシのすい臓から、または組換え酵母から公知である。リシン残基が保護され、酵素により攻撃を受けるときには、トリプシンが、所望のポリペプチドを産生するのに特に適している。
【００６８】
エンドプロテイナーゼにより切断することができるペプチド配列は、本発明の範囲内では、１〜２０アミノ酸、好ましくは１〜１０アミノ酸で好ましくは構成されており、所望のエンドプロテイナーゼに向けたＣ末端切断部位を含有する短鎖ペプチド配列として、理解される。この更なるペプチドは、好ましくは、追加的にＮ末端側末端と所望のエンドプロテイナーゼ認識配列部位との間に、好ましくはＧｌｙ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇおよびＬｙｓから選択される、いくつかのアミノ酸の組合わせ（第１部分）を含有する。その中のこれらの追加アミノ酸の２〜８個が、陰性電荷を帯びているアミノ酸であるＡｓｐおよび／またはＧｌｕであるアミノ酸の一連を、好ましくは、第１部分として使用する。
【００６９】
抗膜融合性ペプチドがメチオニンを含まない限り、ＢｒＣＮ（化学的切断）を用いる切断も可能である。
【００７０】
融合ペプチドは、原核生物中で、そのペプチドをコードするＤＮＡ（核酸配列）の発現によって産生される。発現ベクターは、融合ペプチドを培地またはペリプラスム中への分泌を媒介する、いかなるエレメント（例えばシグナルペプチド）も含有しない。したがって、ペプチドは、不溶性の屈折体（ＩＰ）として形成される。
【００７１】
融合ペプチドをコードするＤＮＡは、当分野に公知の方法に従って生成することができる。宿主細胞中で発現を最適化するために、その核酸配列を、更なる制御および転写エレメントで伸長することが更に好ましい。発現に適するＤＮＡは、好ましくは、合成によって生成することができる。そのようなプロセスは、当業者には慣用であり、例えば、Beattie, K. L., and Fowler, R. F., Nature 352 (1991) 548-549; EP-B 0 424 990; Itakura, K., et al., Science 198 (1977) 1056-1063などに記載されている。本発明のペプチドの核酸配列を修飾することも、適切であり得る。
【００７２】
そのような修飾には、例えば以下のようなものがある：
−ライゲーション、クローニングおよび突然変異生成のステップを容易にするために様々な制限酵素認識配列を導入するために、核酸配列を修飾すること；
−宿主細胞に好ましいコドンを取り込むために核酸配列を修飾すること；
−宿主細胞中での発現を最適化するために、更なる制御および転写エレメントで核酸配列を伸長させること。
【００７３】
適当な発現ベクターの生成および発現のプロセスにおけるすべての更なるステップは、技術常識であり、当業者には慣用である。そのような方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USAに記載されている。
【００７４】
融合ペプチドは分泌されないので、細胞内、好ましくは細胞質内で凝集する。ここで、そのペプチドは、圧縮された不溶性形態（封入体）で貯蔵される。これにより、タンパク質分解性分解のような細胞機能の介入が最小限にまで低下する。
【００７５】
エシェリシア・コリ（Escherichia coli）、ストレプトマイセス属またはバシラス属は、例えば原核宿主生物として適している。本発明の融合ペプチドの生成のために、原核生物を、そのペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターで通常の方法で形質転換し、その後通常の方法で発光させる。細胞溶解後、不溶性不活性ペプチド（ＩＢ）を、例えば遠心などの通常の方法で単離する（ペレット画分）。所望の不溶性ペプチド凝集物は、必要ならば、例えば、界面活性剤を含有する緩衝液で洗浄することによりさらに、濃縮することができる。
【００７６】
不溶性融合ペプチドは、好ましくはアルカリ性溶液（例えば、ＫＯＨ、ｐＨ１０）で可溶化し、例えば、第Ｘａ因子ｐＨ８．０などの適当な手段で切断する。
【００７７】
驚いたことに、本発明のプロセスにより生成される融合ペプチドは、封入体として形成されており、宿主細胞中で分解されず、その後、融合ペプチド成分自体を著しく切断することなく、酵素的に完全に切断することができることが明らかにされている。
【００７８】
以下の実施例、参考文献、図１および配列表は、本発明、すなわち添付の特許請求の範囲に記載された真の範囲の理解を助けるために記載される。本発明の精神を逸脱することなく、記載された手順を変えることができることは理解される。
【００７９】
図１は、Ｘａ−Ｔ１３５７をコードする発現ベクターを示す。
【００８０】
【表５】
実施例１
発現ベクターの構築
合成遺伝子Ｘａ−Ｔ１３５７は、以下の構造を有する（Ｎ末端からＣ末端）：
−ＥｃｏＲＩ切断部位
−Ｔ５ファージのリボゾーム結合部位
−アミノ酸Ｍ、Ｒ、Ｇ、Ｓ
−アミノ酸６×Ｈ（Ｈｉｓタグ）
−アミノ酸Ａ、Ｉ、Ｄ、Ｖ
−第Ｘａ因子リンカーＩ、Ｅ、Ｇ、Ｒ
−Ｔ１３５７配列（３９アミノ酸）
−アミノ酸Ｇ
−停止コドン ２つ
−ＢａｍＨＩ切断部位
これはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で記載されている。
【００８２】
合成遺伝子は、２０、２１および２０塩基対の３つの重複領域を有する、遺伝子の配列からなる４つのオリゴヌクレオチドを使用して、遺伝子合成により構築される。合成は、２段階ＰＣＲ反応の手段で行った。第一ステップでは、オリゴ１および２ならびにオリゴ３および４のそれぞれを、テンペレートとして遺伝子のＮ末端部分および遺伝子のＣ末端部分をそれぞれ完全に合成した。その生成物を第二ステップのテンペレートとして用い、したがって、これらの生成物の等量を適用した。プライマー１および４をこのステップの合成プライマーとして用いた。
【００８３】
得られた合成遺伝子をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ベクターｐＱＥ−３０（Qiagen、独）も同様に消化した。両制限消化物を、ゲル抽出手段（Qiagen）で精製し、その後、発現ベクターの生成のためのライゲーションに用いた。挿入物のベクターに対する比は、３：１である。ベクターを図１に示す。
【００８４】
構築物の配列および正しい方向は、制限制御および配列決定（SequiServe、独）の手段により決定した。
【００８５】
実施例２
醗酵、ＩＢ単離および可溶化
醗酵およびＩＢ単離：
実施例１の発現ベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、アンピシリンおよびカナマイシンを用いて選択しながら、複合培地で醗酵させた。前培養にはＬＢ培地を用いた。本培養には、ＣおよびＮ源として唯一の複合成分として酵母抽出物を使用し、グリセリンを更なるＣ源として使用した。両成分は、流加培養期間中に濃縮形態で添加した。ＩＰＴＧによる発現を、適当な増殖期に誘導した。ｐＨ値は、リン酸／苛性ソーダを用いて７±０．２に調整した。醗酵を、０．５ｂａｒまでの過剰圧力で行った。酸素分圧を、撹拌機の回転スピード、通気および／または添加速度を介して調節した。増殖停止後かつ相当する発現期の後、菌体を、即座にまたは冷却後、遠心により回収し、凍結状態で保存した。
【００８６】
発現させるべき外来タンパク質は、封入体（ＩＢ）の形態で細胞内で得て、精製前にＩＢを調製した。この目的のために、菌体をホモジナイザーを使用して破壊し、ＩＢを数回の洗浄および遠心ステップにおいて精製した。
【００８７】
可溶化
ＩＢ５．２１ｇ（破壊緩衝液（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ,ｐＨ７．０）１００ml中で、高圧破壊により細胞２０ｇから調製）を、撹拌しながら、室温で３０mM ＫＯＨ、ｐＨ１２ ２０６mlに溶解した。
【００８８】
可溶化体のタンパク含量：ｃ＝３．２mg/mL（Bradfordタンパク質アッセイ、Bradford M. M., Analytical Biochemistry 72 (1976) 248-254）⇒ ６５９．２mg総タンパク質
融合ペプチドの分子量：MW＝７１６１．９６（モノアイソトピック質量７１５６．０５）
【００８９】
【表６】
のペプチドは、同様の方法で生成され、したがって、配列ＲＳＶ１１８およびＭＶ２５７を、配列「Ｔ１３５７」の代わりに使用した。
【００９１】
実施例３
シトラコニル化および切断
ａ）シトラコニル化
シトラコニル化のために、融合ペプチドに、無水シトラコン酸（ＭＷ：１１２．０９、ｐ＝１．２４５g/ml）およびジオキサンの１：１の比の混合物を適用し、したがって、無水シトラコン酸は、アミノ基１モルあたり１２倍過剰で使用した。シトラコニル化のために、融合ペプチド０．６６ｇ（ＭＷ：７１６２、Ｃ＝実施例２ｂの破壊緩衝液中３.２mg/ml）、５アミノ基／分子および無水シトラコン酸５７０μLが必要であった。溶解化物を濃ＨＣｌを用いてｐＨ１１に調整した。引き続き、無水シトラコン酸５７０μLおよびジオキサン５７０μLの混合物を、滴下して加え、溶液を２Ｍ ＫＯＨで緩衝化させて、ｐＨ値が８．５以下に降下しないようにする。ｐＨ値をｐＨ１０に調整した後、調製物を一晩室温で、撹拌しながらインキュベートした。反応をエタノールアミン（Ｈ２Ｏ中１ＭエタノールアミンｐＨ８．０、２１ml）で停止させ（溶液中のエタノールアミンの採集濃度：１００mM）、ｐＨ値を２Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ８．５に調整した。その後、シトラコニル化された物質を、−２０℃で保存した。
【００９２】
反応バッチの総容量：２３７ml
【００９３】
ｂ）トリプシンによる切断
反応バッチを、１Ｍ ＮａＣｌ １１．８５ml（最終濃度５０mM）および１Ｍ ＣａＣｌ２ １．２５ml（最終濃度２mM）と混合し、それぞれ１０mlのそのバッチを１．３Ｕ/mLのトリプシンで、室温で８０分間、撹拌しながらインキュベートした。１．３Ｕ/mLのトリプシンレベルで、融合タンパク質が完全に切断された。切断は、１６％−トリシン−ＳＤＳゲルおよびＨＰＬＣ分析の手段で測定した。適用したトリプシンは、Roche Diagnostics GmbH（純度ＩＩ、０．００９１％キモトリプシン活性、活性２０６Ｕ/mL）。
【００９４】
ｃ）ＨＰＬＣ分析による切断の測定
ペプチドの比を、合成Ａｃ−Ｔ１３５７−Ｇ−ＯＨで作成した直線較正曲線を用いてＨＰＬＣにより決定した。以下のＨＰＬＣ系を使用した。
カラム： ファルマシア １５ＲＰＣＳＴ４．６／１００
溶出液： 緩衝液Ａ：２０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；緩衝液Ｂ：７０％アセトニトリル＋３０％緩衝液Ａ
勾配： ２８分間で０％Ｂ〜１００％Ｂ
流速： １mL／分
検出：ＵＶ２２６nm
【００９５】
実施例４
精製
ａ）硫酸アンモニウム沈殿
実施例３ｂの反応混合物に、固体硫酸アンモニウム（ＡＳ）（最終濃度２Ｍ）を加え、ＡＳが溶解したのち、室温で撹拌した。沈殿したペプチドを、４℃で５分間遠心（１０，０００rpm）することにより除外し、得られたペレット（ペプチドおよびトリプシンを含有する）をＴｒｉｓ緩衝液（５０mM、ｐＨ８．５）５mL中に溶解した。
【００９６】
ｂ）ベンズアミジンセファロース６Ｂクロマトグラフィー
上記溶液からのトリプシンの除去は、ベンズアミジンカラムの手段により成し遂げられた。
適用：タンパク質５mg
カラム：ＨＲ１６（ファルマシア、ｈ＝３．３cm、ｄ＝１．６cm、Ｖ＝１０ml）
材料：ベンズアミジンセファロース６Ｂ（ファルマシアＮｏ．１７−０５６８−０１）、製造業者の指示書に従って再生し、５０mM Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．５で平衡化させたもの。
流速：１mL/分
カラムの洗浄：５０ｍM Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．５
【００９７】
ペプチドの４０〜８０％がカラムを通過し、残余がカラム物質に結合した。エタノールの６０％で行ったその後の溶出中には、エタノール含量が２０％以上のとき、トリプシンはもはや検出不可能であったため、存在の可能性が考えられたトリプシンの共溶出は測定することはできなかった。フロースルー中および溶出中の両方で、ペプチドはＨＰＬＣ分析において単一ピークとして出現し、さらにそのペプチドは、ＳＤＳゲルにおいて均一であった。
【００９８】
ｃ） フェニルセファロースＦＦによる精製
フェニルセファロースファーストフロー（ファルマシア）：ＡＳによるペレット状沈殿物５mg（タンパク質含量約５mg/mL）をＴｒｉｓ緩衝液１mL（５０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５）に溶解させ、カラムにかけた。ペプチドは、完全にカラム材料に結合し、５０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．５中の２０〜６０％エタノール勾配で溶出することができた。長時間の保持時間にわたって溶出された。ペプチド画分は、均一であった。
【００９９】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】Ｘａ−Ｔ１３５７をコードする発現ベクターを示す図である。
Claims (7)
- 原核宿主細胞で約１４〜７０アミノ酸長の融合ペプチドとしての抗膜融合性ペプチドの製造方法であり、前記融合ペプチドの封入体が形成される条件下、
ａ） 前記宿主細胞中で、約４〜３０アミノ酸長の更なるペプチドにＮ末端で結合させた約１０〜５０アミノ酸長の該抗膜融合性ペプチドからなる融合ペプチドをコードする核酸を発現させること、
ｂ） 前記宿主細胞を培養すること；
ｃ） 前記封入体を形成させ、回収し、可溶化すること；
ｃ） 前記融合ペプチドを単離すること
を特徴とする、製造方法。 - 更なるペプチドが、第一および／または第二部分からなることを特徴とし、
ａ）前記第一部分が、２０以下の一連のアミノ酸であること、そして
ｂ）前記第二部分が、１０アミノ酸以下の切断可能なペプチド性リンカー領域であり、膜融合性ペプチドのＮ末端および第一部分のＣ末端に隣接して位置することを特徴とする、請求項１記載の方法。 - 前記抗膜融合性ペプチドの分子量と第二ペプチドの分子量との比が、１０：１〜１：２であることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
- 抗膜融合性ペプチドを、前記封入体の可溶化中または可溶化後に上記更なるペプチドから切断することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
- ４〜３０アミノ酸長の更なるベプチドにＮ末端で結合させた約１０〜５０アミノ酸長の抗膜融合性ペプチドからなる約１４〜７０アミノ酸長の融合ペプチドをコードする核酸。
- 約１０〜５０アミノ酸長の抗膜融合性ペプチド、または４〜３０アミノ酸長の更なるペプチドにＮ末端で結合させた前記抗膜融合ペプチドからなる約１４〜７０アミノ酸長の融合ペプチドをコードする核酸を含む原核発現ベクター。
- 約１０〜５０アミノ酸長の抗膜融合性ペプチド、または４〜３０アミノ酸長の更なるペプチドにＮ末端で結合させた約１４〜７０アミノ酸長の融合ペプチドの封入体の調製物。
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