DE3034045A1 - Endoproteinase-lys-c aus bakterien, verfahren zu ihrer gewinnung und verwendung - Google Patents

Endoproteinase-lys-c aus bakterien, verfahren zu ihrer gewinnung und verwendung

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DE3034045A1 DE19803034045 DE3034045A DE3034045A1 DE 3034045 A1 DE3034045 A1 DE 3034045A1 DE 19803034045 DE19803034045 DE 19803034045 DE 3034045 A DE3034045 A DE 3034045A DE 3034045 A1 DE3034045 A1 DE 3034045A1
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Description

G'3
. H.
Patentanwälte Dipl.-Ing. H. weickmann, Dipl.-I'hys. Dr. K. Finckl
Dipl,-Ing. F. Λ.Weickmann, Dipl-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. Liska
HRA 800° MÜNCHEN 86, DEN f Qp $βρ, 1980
POSTFACH 860 820
int. Nr. 2399 möhlstrasse 22, rufnummer 983921/22
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH Sandhofer Straße 112 - 132, 6800 Mannheim-Waldhof
Endoproteinase-Lys-C aus Bakterien, Verfahren zu
ihrer Gewinnung und Verwendung.
Für verschiedene Zwecke, insbesondere für die gezielte Spaltung von Proteinen und Peptiden, beispielsweise im Rahmen der Sequenzbestimmung, sind Endoproteinasen, die- an einer bestimmten Stelle spalten, von technischem und wissenschaftlichem Interesse. So ist bereits eine am C-terminalen Ende von Lysin die Peptidbindung spaltende Endoproteinase aus Pilzen bekannt. Dieses Enzym ist jedoch schwierig zugänglich und steht daher nicht im gewünschten Ausmaß zur Verfügung. Nunmehr wurde ein Enzym der gleichen Spezifität in Bakterien gefunden, welches als Endoproteinase-Lys-C charakterisiert wird und sich von anderen bakteriellen Proteasen durch die Eigenschaften deutlich unterscheidet.
Die erfindungsgemäße neue Endoproteinase-Lys-C aus Bakterien ist dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Kette von Molekulargewicht 35 000 - 38 000 Dalton besteht, ein pH-Optimum bei pH7,7 aufweist und durch Aprotinin gehemmt, durch alpha,,-Makroglobulin, OtfAntitrypsin und Äthylendiamintetraessigsäure nicht gehemmt wird.
Das erfindungsgemäße Enzym neigt unter nicht reduzierenden Bedingungen zur Aggregation, wobei bevorzugt Tetramere mit einem Molekulargewicht von etwa 150 000 D und Oktamere mit einem Molekulargewicht von etwa 300 000 D gebildet werden, die enzymatisch aktiv sind.
Das pH-Optimum des neuen Enzyms liegt, wie bereits erwähnt, bei pH 7,7, bestimmt bei 37° C nach der Azocoll-Methode.
In der Elektrofokussierung spaltet sich das Enzym in zahlreiche Banden auf, die sich über fast den gesamten pH-Bereich erstrecken. Dieses Verhalten läßt darauf schließen, daß es sich um ein Glycoprotein handelt; der isoelektrische Punkt des Enzyms ist daher nicht bestimmbar.
Wie bereits erwähnt, heiranen alpha2-Makroglobulin,^5C1 -Antitrypsin und Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) bis höchstens 1O~ M nicht. Benzamidin hemmt dagegen bei 2,5 mM etwa 50 %; durch Erhöhung der Benzamidinkonzentration lassen sich 70 % Hemmung erzielen. Eine vollständige Hemmung ergibt Aprotinin.
Die Substratspezifität des neuen Enzyms zeigt Tabelle 1. Seine spezifische Aktivität , gemessen mit Tosyl-glycyl-prolyl-lysylp-nitroanilid bei 25° C beträgt ca. 25 ü/mg oder ca. 50 Azocoll-Einheiten/mg Enzym bei 37° C.
Im Gegensatz zu der aus Lysobacter beschriebenen Proteinase II spaltet das erfindungsgemäße Enzym nicht aminoständig, sondern carboxyständig am Lysin. Die hohe Spezifität zeigt auch die geringe Zahl von Banden, die bei Gel-Ghromatographie von mit diesem Enzym erhaltenen Fibrin-Spaltprodukten auftreten.
Tabelle 1
Substratspezifität von Endoproteinase Lys-C
Substrat Abbau durch Endoproteinase Lys-C
Azocoll R
Casein
Fibrinogen
Hämoglobin R
TLME
Chromozym PL
S 2251R
Tos-Arg-Me
Chroraozym TH Insulin
BAEE
Leu-pNA
Lys-pNA
ATEE
B-Kette von R
Abkürzungen R
TLME
BAEE
ATEE
Chromozym PL
Chromozym TH
S 2251R
Tosy1-1ysy1-methyIester Benzoyl-arginyl-äthylester Arginyl-tyrosyl-äthylester Tosyl-glycyl-prolyl-lysyl-p-nitroanilid
Tosyl-glycyl-prolyl-arginyl-p-nitroanilid
Valyl-leucyl-lysyl-p-nitroanilid
ORIGINAL INSPECTED
Tabelle 2
cX. -lytic-proteinase
κ -lytic-protease
AL-1 Proteinase I
AL-1 Proteinase II
Endoproteinase
Lys-C
EC-Nummer
3.4.21.12
3.4.99.29
3.4.99.30
Molekulargewicht
20 000 D
19 000 D
9 000 D (Gelfiltration) , 14 000 D (Sedimentationsäquili- brum)
17 000 D
Reaktionsmechanismus
Serin-Protease
Zn-Metalloproteinase
unbekannt
unbekannt
36-38 000 D Serin-Protease
(red. SDS-GeI),
ca. 35 000 D
(Sephacryl
S-300)
Spezifität
Carboxylgruppe neutraler Aminosäuren, bes. Alanin
Carboxylgruppe hydrophober Aminosäuren, lysiert bakterielle Zellwände
hydrophobe Aminosäuren, lysiert bakterielle Zellwände (besonders grampositive)
Aminogruppe von Lysin
Carboxylgruppe von Lysin
W σ
3 H-
N (D
κ:
3 hf)
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(D
(D
IQ H
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Co
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3
σ co
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Das erfindungsgemäße Enzym läßt sich aus den Kulturbrühen von Mikroorganismen, die dieses Enzym in ausreichender Menge bilden, insbesondere aus solchen der Ordnung Lysobacterales und hierunter vorzugsweise solchen der Familie Lysobacteraceae, z.B. der Gattung Lysobacter (auch Myxobacter genannt) nach üblichen Enzymreinigung smethoden, wie Ammonsulfatfraktionierung, Acetonfraktionierung und Molekular Siebchromatographie von den meisten Verunreinigungen befreien. Die Abtrennung anderer Proteasen gelingt erfindungsgemäß durch Behandlung mit trägerfixiertem alpha^Makroglobulin-Metallkomplex. Bei diesem, für Enzymreinigungen neuen Verfahrensschritt werden schwer zu entfernende Verunreinigungen, insbesondere aber die begleitenden Proteasen, abgetrennt, während die erfindungsgemäße Endoproteinase Lys-C in Lösung bleibt und aus dieser isoliert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Endoproteinase Lys-C ist daher dadurch gekennzeichnet, daß man eine filtrierte, oder nach an sich bekannten Methoden gereinigte Kulturbrühe eines geeigneten Bakterienstammes, über trägerfixiertem alpha^-Makroglobulin-Metall-Komplex chromatographiert, und das Enzym aus dem Filtrat gewinnt.
In dem oben erwähnten alpha^-Makroglobulin-Metall-Komplex besteht das Metall aus einem zweiwertigen Metall der Gruppe Zn, Co, Ni oder/und Cu. Die Verwendung dieses Komplexes und seine Herstellung ist in der gleichzeitig eingereichten deutschen Patentanmeldung P (int. Nr. 2380) näher beschrieben.
Wie bereits erwähnt, kann direkt von der Kulturbrühe ausgehend die erfindungsgemäße Behandlung mit trägerfixiertem alpha„-Makroglobulin-Metall-Komplex vorgenommen werden. Zweckmäßiger ist es jedoch, die Proteine vorher von anderen Substanzen abzutrennen und eine Vorfraktionierung durchzuführen.
Die Abtrennung der Proteine aus dem Kulturfiltrat erfolgt zweckmäßigerweise durch Fällung mit Ammonsulfat, obwohl auch
andere übliche Proteinfällungsmittel, welche die enzymatische Aktivität der darin enthaltenen, aktiven Proteine nicht beeinträchtigt, verwendet werden können. Bei Zusatz von Ammonsulfat gibt man dieses zweckmäßig bis zu einer Konzentration von 2,5 - 3,5 M, vorzugsweise 3 - 3,2 M zu. Der dabei gebildete Niederschlag wird abgetrennt, beispielsweise abfiltriert, und enthält die gesamte gesuchte Aktivität. Nach Auflösen mit Wasser und vorzugsweise Entfernung von restlichem Ammonsulfat durch Dialyse kann man die so erhaltene Lösung entweder der alpha^-Makroglobulin-Metall-Komplex-Chromatographie unterwerfen, oder einer weiteren Vorreinigung unterziehen.
Wird eine weitere Vorreinigung gewünscht, so führt man zweckmäßig eine Ammonsulfatfraktionierung durch, wobei die zwischen
2 und 3M Ammonsulfatkonzentration ausfallende Fraktion die gewünschte Aktivität enthält. Dabei wird zweckmäßig in einer ersten Stufe Ammonsulfat auf 0,7 - 1,3 M zugegeben, der Niederschlag abgetrennt und dann die Ammonsulfatkonzentration, auf
3 M, vorzugsweise auf 2,25 - 2,32 M, erhöht, und der dabei erhaltene aktive Niederschlag in üblicher Weise abgetrennt und durch Dialyse von verbliebenem Ammonsulfat gereinigt.
Falls die so erhaltene Lösung nicht der alpha„-Makroglobulin-Metall-Komplex-Behandlung unterworfen wird, kann auch noch eine Acetonfraktionierung und eine Molekularsiebchromatographie vorgeschaltet werden. Im Falle einer Acetonfraktionierung fällt man durch Zusatz von 0,3 - 1,5 Vol., vorzugsweise 0,5 - 1,2 Vol. Aceton, trennt den Niederschlag ab und gibt weitere 1,2 Vol. Aceton zu, trennt den Niederschlag ab und löst ihn in Puffer pH 7,5 - 9 auf. Die Pufferkonzentration liegt zweckmäßig zwischen 0,01 und 0,05 M. Nach Dialyse zur Entfernung von restlichem Aceton und ggf. Einengung der erhaltenen Lösung kann über ein Molekularsieb, beispielsweise vernetztes Dextran, wie Sephadex-G-100 chromatographiert werden, wobei die gewünschte Aktivität zu Beginn aus der Säure eluiert wird, während die
bekannte AL-1 Proteinase I erst gegen Ende eluiert wird. Das Eluat wird, ggf. nach Konzentrierung, über trägerfixiertem alpha^-Makroglobulin-Metall-Komplex chromatographiert, wobei die gesuchte Endoproteinase-Lys-C durchläuft. Die Elution erfolgt vorzugsweise im pH-Bereich 7,0 - 8,5 bei einer Pufferkonzentration von 0,03 - 0,08 M. Die üblichen in diesem Bereich wirksamen Puffersubstanzen sind geeignet, bevorzugt werden Tris-Puffer, Hepes-Puffer und Phosphat-Puffer. Gute Ergebnisse werden bei pH 6,5 - 9 und 0,01 - 0,1 Puffergehalt erreicht. Das Eluat enthält reine Endoproteinase~Lys-C und Puffer und kann direkt lyophilisiert werden.
Das erfindungsgemäße neue Enzym ist insbesondere zur Sequenzbestimmung von'Proteinen und Peptiden anwendbar. Auf Grund seiner sehr spezifischen Spaltungsaktivität läßt es sich auch therapeutisch einsetzen, beispielsweise bei Gerinnungsstörungen, beziehungsweise anderen Erkranknungen, bei denen die Spaltung von Proteinketten angestrebt wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die Gewinnung des erfindungsgemäßen Enzyms und seine Bestimmung.
Beispiel 1
Gewinnung von Endoproteinase-Lys-C aus Lysobacter enzymogenes- ssp. enzymogenes DSM 1895 (ATCC 27796)
Ausgangsmaterial: 206 Ltr. Lysobacter-Kulturfiltrat
206 Ltr. Lysobacter-Kulturfiltrat werden langsam mit festem Ammonsulfat auf 3 - 3,2 M ausgefällt. Der geringe flockige Niederschlag wird abfiltriert. Der Niederschlag auf den Filtern wird mit wonig dost. Wasser gelöst und mit festem Ammonsulfat auf 0,9 M (1,3-3 M) ausgefällt und zentrifugiert. Den Überstand fällt man nun weiter auf 2,25 - 2,32 M Ammonsulfat aus, und filtriert oder zentrifugiert den Niederschlag, löst ihn mit
ca. 400 ml dest. Wasser und dialysiert gegen fließendes Leitungswasser.
Das Dialysat wird mit 0,5 - 1,2 Vol. -20° C kaltem Aceton versetzt und abzentrifugiert. Den überstand (klar) versetzt man nun mit weiteren 1,2 Vol. ( berechnet aus Anfangsvol.) Aceton, zentrifugiert den Niederschlag ab und löst ihn so konzentriert wie möglich mit 0,025 M Tris, pH 9 auf und dialysiert gegen 10 Ltr. desselben Puffers. -.
Das Dialysat'wird auf eine Sephadex-G-100-Säule aufgetragen mit
folgenden Abmessungen:
0 5 cm, Länge 150 cm, Säulenvol. ca. 2,9 Ltr.
Die Säule wird mit 0,025 M Tris, pH 9,0 äquilibriert und nach dem Aufziehen mit demselben Puffer nachgewaschen.
Lysobacter-Protease wird zu Beginn eluiert.
Die Eluate werden mit festem Ammonsulfat auf 3,2 M ausgefällt und zentrifugiert. Der konzentriert aufgenommene Niederschlag wird gegen 0,05 M Tris pH 8,0 dialysiert.
Alpha^-Makroglobulin-Zn-Komplcx, kovalent an Agarose gebunden, wird zur Weiterreinigung verwendet. 110 ml dieses Trägermaterials werden in 3 cm 0 Säule, Länge 17,5 cm, eingefüllt und mit 0,05 M Tris, pH 8,0 gewaschen, bis sich kein Protein im Durchlauf befindet.
Nun wird das Dialysat aufgezogen und mit 0,05 M Tris, pH 8,0 nachgewaschen. Proteinase-Lys-C läuft durch·.
Der Durchlauf wird gegen 0,05 M Glycin, pH 8,0 dialysiert und auf 0,4 mg/ml mit demselben Puffer verdünnt und lyophilisiert.
ORIGINAL INSPECTED
' Al-
Gesamt-Ausbeute: ca. 50 - 140 mg Protein
6 - 23 ü/mg Proteinase LyS-C Chromozym TH Aktivität < 0,2 %
Beispiel 2 Bestimmung der Endoproteinase Lys-C
Herstellung der Lösungen:
1 . 0,025 M Tris, 0,001 M EDTA, pH 7,7
0,303 g Tris, 37,2 mg EDTA werden in ca. 80 ml bidest. Wasser gelöst und pH mit 2 N HCl auf 7,7 eingestellt und auf 100 ml aufgefüllt.
2. Chromozym-PL ( 14|iM/ml )
9 mg Chromozym-PL in 1 ml bidest. H2O auflösen.
3. Endoproteinase-Lys-C-Lösung
10 mg Lyophilisat in 1 ml bidest. H-O lösen. Vor Gebrauch 1:100 mit Lösung 1 verdünnen.
Ausführung: 4 05 nm 1 cm Halbmikroküvette
25° C Testvolumen 1,07 ml
- --ΓΤΓ-
In Küvette pipettieren: 1
0		 ml
05 ml		 5 min. r02 ml
Lösung 1
Lösung 2		 C temperieren.
mischen, ca. 2 min. bei 25° 0
Probelösung 3
mischen,
aus linearer Phase nach ca.
ΔΕ/min berrechnen.
Berechnung;
ΔE/min χ 1,07 10,4 χ 0,02
100 = U/ml Endoproteinase—Lys-C

Claims (7)

Patentansprüche
1. Endoproteinase-Lys-C aus Bakterien, dadurch g ekennz eichnet, daß sie aus einer Kette vom Molekulargewicht 35 000 - 38 000 Dalton besteht, ein pH-Optimum bei pH 7,7 aufweist und durch Aprotinin gehemmt, durch alpha«- Makroglobulin, OC1-Antitrypsin und Äthylendiamintetraessigsaure nicht gehemmt wird.
2. Verfahren zur Gewinnung der Endoproteinase-Lys-C von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man filtrierte oder nach üblichen Methoden vorgereinigte Kulturbrühe eines geeigneten Bakterienstammes über trägerfixierten alpha2-Makroglobulin-Metall-Komplex chromatographiert und das Enzym aus dem FiItrat gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in 0,01 - 0,1 M Puffer pH 6,5 - 9 chromatographiert.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch g.ekennzeichnet, daß man Kulturbrühe aus Lysobacterales-Züchtung verwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der filtrierten Kulturbrühe das Protein durch Ammonsulfat fällt, den Niederschlag nach erneutem Auflösen zwischen 1,3 und 3 M Ammonsulfat fraktioniert und die in diesem Bereich unlösliche Fraktion in Wasser auflöst und nach Dialyse mit Aceton zwischen 1,2 und 2,4 Vol. Aceton fraktioniert.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Niederschlag der Aceton-Fraktionierung nach Auflösung über einem Molekularsieb chromatographiert und die zu Beginn der Chromatographie eluierte Proteinfraktion der alphap-Makroglobulin-Metall-Komplex-Chromatographie unterwirft.
7. Verwendung der Endoproteinase-Lys-C von Anspruch 1 zur Sequenzbestimmung von Proteinen und Peptiden.
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