DE2007523C3

DE2007523C3 - Verfahren zur Herstellung von Präkallikreinen

Info

Publication number: DE2007523C3
Application number: DE19702007523
Authority: DE
Inventors: Franz Dr. Fiedler; Eugen Prof. Dr. Dr. Werle
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1970-02-19
Filing date: 1970-02-19
Publication date: 1978-08-03
Also published as: DE2007523A1; DE2007523B2

Description

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Die Kallikreine des Pankreas treten in ihrem Ursprungsorgan fast ausschließlich in inaktiver Form auf, die als Kallikreinogene oder besser noch als Präkallikreine bezeichnet wird. Bei der Autolyse von Pankrcashornogcnatcn oder bei der Behandlung mit Trypsin werden aus Präkallikreinen aktive Kallikreine gebildet Wegen dieser leichten Umwandelbarkeit der Präkallikreine in Kallikreine war es bisher äußerst schwierig, diese Präkallikreine zu gewinnen bzw. anzureichern.

Es wurde nun gefunden, daß man Präkallikreine aus Pankreas dadurch anreichern kann, daß man während jo

Tabelle

ihrer Anreicherung natürliche Proteaseinhibitoren zusetzt und sich im übrigen der an sich bekannten Anrejeherungsmethoden bedient

Besonders eignet sich als AusgangKprodukt für das erfindungsgemäße Verfahren Schweinepankreas, aber auch Pankreas anderer Spezies ist geeignet

Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Proteaseinhibitoren sind vor allem die bekannten Trypsin-Inhibitoren, wiez, B. derSojabohnen-Trypsin-Inhibitor und der spezifische Trypsin-Inhibitor aus Pankreas. Ferner geeignet sind Trypsin-Inhibitoren pflanzlichen Ursprungs, z. B. aus Kartoffeln, Leguminosen und Getreide.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, Präkallikreine weitgehend anzureichern und zu reinigen. Es ermöglicht es z. B., aus Schweinepankreas ein 2000mal reineres Präkallikrein zu erhalten, als im Ausgangsmaterial vorhanden war.

Die erfindungsgemäß hergestellten Prätel'jkreine sollen als Arzneimittel für die gleichen Indikationen wie die entsprechenden Kallikreine verwendet werden, z. B. als Kreislaufenzym mit vasoaktiver Wirkung. Bei der Anwendung gehen sie im Körper unter Einwirkung körpereigener Proteasen in die entsprechenden Kallikreine über und wirken daher wie diese, jedoch über einen längeren Zeitraum hinweg. Sie besitzen also gegenüber den Kallikreinen einen ausgesprochenen »long activew-Effekt

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die nachstehende Tabelle erläutert:

	Pankreasdrüsen	2,75 kg	Protein	Präkalli	Spez. Aktivität des	Ausbeute)**	7
	Überstand des Essigsäure-	5,21		krein	Präkallikrein B
	homogenates		(g)	(KE)	(KE/mg Protein)	(%)
	Ammoniumsulfatfällung	600 ml	400	250000*)	0,29	100
1.	Eluat A	1100 ml	108	120000*)	0,55	48
	Eluat B
2.	davon weiterverarbeitetes	350 ml	29	80 000*)	1,4	32
3.	Präkallikrein B		5	-	(ca. 10)	-
4.	Eluat C	250 ml		106 000
	Eluat D	22 ml	0,32	40000	125	32
	Eluat E	25 ml
5.		0,13	31000	240	25
6.		0,022	8 400	380	-
7.		0.017	9 200	540

*) Aktivitätsbestimmung am Hundeblutdruck (wegen der Störung anderer Kallikrein-Bestimmungsmethoden in Rohpräparaten), sonst am Autoanalyser.

**) Für die Berechnung der spezifischen Aktivität und der Ausbeute wurde das Vorliegen gleicher Menge von Präkallikrein A und R in den Schritten bis zur (ersten) Chromatographie an DEAE-Cellulose angenommen.

Erklärungen zur Tabelle:

Eluat A

Eluat aus sulfoäthylgruppenhaltigen quervernetzten Polydextrangel.

Eluat B

Eluat aus DEAE-Cellulose.
Eluat C

Eluat aus einen Amingruppen-haltigen Cellulosereaktionsorodukt. Dieses Cellulosenrodukt wird her-

60 gestellt durch Reaktion von Cellulose mit Epichlorhydrin und Triäthanolamin.

Eluat D

Eluat aus einem quervernetzten Polydextrangel mit einem Quell vermögen von 12-15 ml/g Trockengewicht und einem Fraktionierbereich für Proteine von 3000 bis 70000Dalton.

Eluat E

Eluat aus Carboxymethylgruppen-haltiger Cellulose. Alle Ooerationen wurden bei 0 bis 5°C und in An-

Wesenheit von Sojabohnen-Trypsin-lnhibitor durchgeführt

1. 2,75 kg Schweinepankreas wurden mit 7,5 Liter 0,1 N-Essigsäure unter Zusatz von 1,1 g Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor homogenisiert und zentrifugiert.

2. Der klare Überstand wurde mit V_)o Volumen

1 M-Natriumphosphatlösung versetzt und bei pH 7,0 mit 176g/Liter Ammoniumsulfat gefällt und zentrifugiert Dem Überstand wurden weitere 235 g/Liter Ammoniumsulfat zugesetzt und der Niederschlag nach Zusatz von 0,6 g Sojabohnen-Trypsin-lnhibitor dialysiert

3. Die dialysierte Lösung wurde mit V₂₀ Volumen

2 M-Ammoniumacetat versetzt und bei pH 5,4 mit 0,1 M-Ammoniumacetat an einer Säule, bestehend aus Sulfoäthylgruppen-haltigen quervernetzten Polydextrangel chromatographiert, wobei die Auffanggefäße Sojabohnen-Trypsin-lnhibitor enthielten.

4. Die präkallikrenüaltigen Fraktionen von Schritt 3 wurden bei pH 6,7 an einer DEAE-Ceüulosesäule mit einem Vrnmoniumacetat-PufTergradienten (von 0,1 M ansteigender Konzentration) chromatographiei t Dabei wurden zunächst Präkallikrein B und dann Präkallikrein A eluiert und in Gefäßen, die Sojabohnen-Trypsin -Inhibitor enthielten, aufgefangen.

Die vereinigten präkallikrein-B-haltigen Fraktio- jo nen wurden nach Zusatz von weiteren 16 mg Sojabohnen-Trypsin-lnhibitor dialysiert.
Die dialysierte PrSkallikrein-B-Lösung wurde mit V₂₀ Volumen 1 M-Natriumphosphatlösung versetzt auf pH 7,\) gebracht und auf eine Amino- j5 gruppen-haltige Säule aufgetragen, welche aus einem durch Umsetzung von Cellulose mit Epichlorhydrin und Triethanolamin hergestellten Reaktionsprodukt besteht Die Elution erfolgte mit 0,05 M-Natriumphosphat und einem Natriumchlorid-Gradienten, Die in Anwesenheit vorf Sojabohnen Trypsin-Inhibttor aufgefangenen Präkallikrein-B-haltigen Fraktionen wurden dialysiert und lyophilisiert

5. Der trockene Rückstand wurde mit 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,0 aufgenommen und einer Gerfiltration an einer Säule, bestehend aus quervernetztem Polydextrangel mit einem Quellvermögen von 12-15 ml/g Trockengewicht und einem Fraktionierbereich für Proteine von 3000 bis 70 000 Dalton unterworfen.

6. Die vereinigten präkallikreinhaltigen Fraktionen wurden in Gegenwart von Sojabohnen-Trypsinlnhibitor an CM-Cellulose mit 0,05 M-Natriumphosphat pH 7 als Elutionsmittel chromatographiert Die präkallikreinhaltigen Fraktionen wurden vereinigt dialysiert und lyophilisiert

Das Molekulargewicht des so gewonnenen Präkallikreins B weicht nur geringfügig von dem des Kallikreins ab (bestimmt durch Gelfiltration an einer Säule bestehend aus quervernetztem Polydextrangel mit einem Quervermögen von 12-15 ml/g Trockengewicht und einem Frakiionierbereich für Proteine von 3000 bis 70 000 Dalton). Der isoelektrische Punkt liegt bei 4,55 (bestimmt durch Elektrofokussierung in einem Ampholine-pH-Gradienten). Die Aktivierung des Präkallikreins B mit Trypsin zum biologisch wirksamen Kallikrein erfolgt sehr rasch (1 Minute).

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Präkallikreinen aus Pankreas, dadurch gekennzeichnet, daß man die Anreicherung in Gegenwart von natürlichen Proteaseinhibitoren durchführt und im übrigen an sich bekannte Methoden der Präkallikrein-Anreicherung verwendet

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial Schweinepankreas verwendet

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Protease-Inhibitor Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor verwendet

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