CH635514A5 - Verfahren zur herstellung neuer desamino-derivate des kallikrein-trypsin-inhibitors. - Google Patents
Verfahren zur herstellung neuer desamino-derivate des kallikrein-trypsin-inhibitors. Download PDFInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung neuer Desamino-Derivate des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors (BPTI) aus Rinderorganen, welcher im folgenden BPTI genannt wird (Basic Pancreatic Trypsin Inhibitor [Kunitz]), deren Tyrosinreste 10 und/oder 21 in ortho-Stellung zur phenolischen Hydroxylgruppe gegebenenfalls Nitro-und/oder Nitrosogruppen tragen oder Desamidoderivaten des BPTI und welche neben den inhibitorischen Wirkungen des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors (BPTI) zusätzlich noch eine Elastasehemmung aufweisen und welche im Molekül 0 bis 3 Lysinreste und/oder 3 bis 6 Argininreste und/oder 2 bis 4 Tyrosinreste enthalten. Die Derivate sind ganz oder teilweise desamidiert.
Das erste erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung dieser Derivate ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Kallikrein-Trypsin-Inhibitor aus Rinderorganen (BPTI), ein Nitroderivat des BPTI oder ein Desamidoderivat des BPTI in saurer Lösung bei pH 2 bis 7 mit einer salpetrigen Säure bzw. Nitroylionen liefernden Verbindung in wässriger Lösung bei Temperaturen zwischen —20 und +30 °C umsetzt und die bei der Umsetzung in saurer Lösung erhaltenen Reaktionsprodukte fraktioniert.
Das zweite erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von neuen Desamino-Derivaten des Kallikrein-Trypsin-In-hibitors aus Rinderorganen, deren Tyrosinreste 10 und/oder 21 in ortho-Stellung zur phenolischen Hydroxylgruppe gegebenenfalls Nitrogruppen tragen oder Desamidoderivate des BPTI und welche neben den inhibitorischen Wirkungen des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors (BPTI) zusätzlich noch eine Elastasehemmung aufweisen und welche im Molekül 0 bis 3 Lysinreste und/oder 3 bis 6 Argininreste und/oder 2 bis 4 Tyrosinreste enthalten, ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Kallikrein-Trypsin-Inhibitor aus Rinderorganen (BPTI), ein Nitroderivat des BPTI oder ein Desamidoderivat des BPTI bei pH 1 bis 12 mit Diazonium-Verbindungen bei Temperaturen zwischen —20 und +30 °C umsetzt und die bei der Umsetzung in alkalischer Lösung erhaltenen Reaktionsprodukte fraktioniert.
Diese neuen, erfindungsgemäss erhaltenen Desamino-Derivate des BPTI hemmen nicht nur wie BPTI die Enzyme, Chymotrypsin, Kathepsin G, Plasmin, Trypsin und Kinino-genine (Kininogenasen), sondern zusätzlich auch Elastasen, z.B. aus Pankreas oder Granulozyten. Sie sind deshalb als Arzneimittel zur Therapie von Erkrankungen verwendbar, die ausgelöst werden entweder durch eine Überproduktion von Proteasen infolge einer erhöhten Freisetzung aus den Zymogenen bzw. einer Ausschüttung beim Zellzerfall oder aber durch einen Mangel bzw. ein Fehlen von natürlichen, körpereigenen Inhibitoren dieser Enzyme in Organen und Gewebsflüssigkeiten. Erkrankungen mit derartiger Ätiologie sind die verschiedenen Formen des Schocks und posttraumatische oder postoperative Komplikationen, Störungen der Blutgerinnung, akute und chronische Entzündungsreaktionen, insbesondere auch chronische Entzündungsreaktionen mit nekrotischen und degenerativen Bindegewebs-schädigungen, wie Pankreatitis sowie durch Immunkomplexe bedingte Vasculitiden, Glomerulonephritiden, rheumatoide Arthritis und andere Collagenosen sowie durch stoffwechselbedingte Ablagerungen verursachte Arthritiden (Gicht), aber auch degenerative Veränderungen der elastischen Elemente von Gefässwänden (Atherosklerose) oder der Lunge (Lungenemphysem). Es ist bereits bekanntgeworden, dass BPTI [H. Kraut, E.K. Frey, E. Werle, Z. Physiol. Chem. 189,97 (1930)], auch als Kunitz-Inhibitor bezeichnet [M. Kunitz, H.H. Northrop, J. Gen. Physiol. 19,991 (1936)], eine Reihe von physiologisch bedeutsamen Enzymen, wie z.B. Kininogenine (Kininogenasen), Plasmin, Chymotrypsin und Trypsin hemmt (E. Werle in W. Brendel,
G.L. Haberland: Neue Aspekte der Trasylol-Therapie 5,9, F.K. Schattauer-Verlag Stuttgart-New York 1972; H. Fritz,
H. Tschesche, L. J. Greene, E. Truscheit (Hrsg.): Proteinase Inhibitors (Bayer Symposium V), Proc. 2nd International Research Conference, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York 1974). BPTI wird als Aprotinin (generic name) zur Therapie und Prophylaxe von Schockzuständen sowie zur Prophylaxe postoperativer und posttraumatischer Komplikationen eingesetzt.
Es ist weiterhin bekannt, dass Proteine durch salpetrige Säure desaminiert werden [L.A. Cohen, Ann. Rev. Bio-chemistry 37,695 (1968]. Dabei kann zusätzlich Tyrosin durch elektrophile Substitution mit demNitrylkation in 3-Stellung nitriert bzw. mit dem Nitrosylkation nitrosiert [O. Wagner, E. Irion, A. Arens und K. Bauer, Biochem. Bio-phys. Res. Comm. 37, 383 (1969)] werden. Es ist zudem bekannt, dass man BPTI bei pH 5,0 mit salpetriger Säure des-aminieren kann [F. A. Anderer und S. Hörnle, Ann. New
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York Acad. Sci. 146,381 (1968)]. In Abhängigkeit von der Reaktionszeit verringert sich nach dieser Arbeit der Anteil des Tyrosins, und Lysin wird völlig abgebaut, während Ar-ginin nicht angegriffen wird. Weiterhin geht parallel zur Abnahme des Lysingehaltes die inhibitorische Wirkung völlig verloren. Experimentelle Einzelheiten sind in dieser Arbeit nicht beschrieben.
Das erste erfindungsgemässe Verfahren kann in Gegenwart nucleophiler Reagenzien durchgeführt werden. Man arbeitete bevorzugt unter einer Schutzgas-Atmosphäre oder unter Evakuierung und die Umsetzung kann in wässriger Lösung im Gemisch mit organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden.
Weiterhin wurde gefunden, dass die neuen Desamino-Derivate des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderor-ganen (BPTI) neben der an sich bekannten Hemmwirkung des BPTI zusätzlich noch eine Elastasehemmung aufweisen.
Überraschenderweise besitzen die erfindungsgemäss erhaltenen Desamino-Derivate des BPTI eine starke inhibitorische Wirkung und zusätzlich zu den bekannten Hemmwirkungen des BPTI auch noch eine wertvolle Elastasehemm-wirkung. Dies ist umso überraschender als nach dem Stand der Technik [F. A. Anderer und S. Hörnle, Ann. New York Acad. Sei. 146, 381 (1968)] nach einer Desaminierung mit salpetriger Säure die inhibitorische Wirkung verlorengehen sollte.
Es wurde weiterhin überraschend gefunden, dass bei der erfindungsgemässen Desaminierungsreaktion von BPTI und seinen Derivaten, auch unter den von Anderer und Hörnle [Ann. New York Acad. Sei. 146, 381 (1968)] angegebenen pH-Wert-Bedingungen, Desamino-Derivate erhalten werden, die im Gegensatz zu den von Anderer und Hörnle (s. o.) beschriebenen noch inhibitorisch aktiv sind. Alle erfindungsgemäss hergestellten Desamino-Derivate hemmen im Gegensatz zu BPTI Elastasen aus Pankreas und Granulozyten. Gegenüber anderen Proteasen wie Chymotrypsin, Pankreas-Kallikrein, Plasma-Kallikrein, Kathepsin G, Plasmin und Trypsin unterscheiden sich die Hemmspektren der einzelnen Derivate qualitativ und/oder quantitativ von dem des BPTI. Bei der Elastasehemmung handelt es sich nicht um die von Pütter und Schmidt-Kastner [Biochim. Biophys. Acta 127, 538 (1966)] beschriebene Blockierung des Substrats, die nur bei sehr hohen BPTI-Konzentrationen erfolgt, sondern um eine Hemmung des Enzyms.
Diese Elastase-Hemmwirkung ist umso überraschender, als aus dem derzeitigen Stand der Technik folgt [D.M. Blow, C.S. Wright, D. Kukla, A. Rühlmann, W. Steigemann und R. Huber, J. Mol. Biol. 69,137 (1972); R. Huber, D. Kukla, W. Steigemann, J. Deisenhofer und A. Jones in H. Fritz, H. Tschesche, L.J. Greene und E. Truscheit (Hrsg.), Proteinase Inhibitors (Bayer-Symposium V) Proc. 2nd Intern. Res. Conference, S. 484, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York 1974], dass BPTI substratartig mit seinem aktiven Zentrum (Lysin-15-Rest) in die Spezifitätstasche der hemmbaren Enzyme eingelagert wird und damit die Enzymaktivität blockiert. Selbst wenn die Seitenkette des Lysin- 15-Re-stes bei allen erfindungsgemäss herstellbaren Derivaten des-aminiert ist, ist nach dem derzeitigen Wissensstand nicht zu erwarten, dass sie in die relativ kleine Spezifitätstasche der Elastasen [D. Shotton in H. Fritz und H. Tschesche (Hrsg.), Proceedings of the International Research Conference on Proteinase Inhibitors, S. 47, Walter de Gruyter, Berlin-New York (1971)] hineinpasst.
Ausserdem erhält man bei der Umsetzung gemäss dem zweiten Verfahren bei pH 1 bis 12 überraschenderweise nicht, wie nach den Angaben der Literatur zu erwarten war [L. A. Cohen, Ann. Rev. Biochemistry 37, 695 (1968)], Azo-derivate des BPTI, sondern farblose Verbindungen mit, nach den Resultaten der Aminosäureanalyse, reduziertem Gehalt an Lysin und Arginin, nicht jedoch an Tyrosin (vgl. Tabelle 2). Dies ist umso erstaunlicher, als die im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Diazoniumverbindungen mit Acyl-Tyrosin-Derivaten unter analogen Reaktionsbedingungen zu intensiv gefärbten Azoderivaten kuppeln. So wird das Diazoniumtetrazol wegen seiner Spezifität für Histidin und Tyrosin in der Literatur [H. Horinishi, Y. Hachimori, K. Kurihara und K. Shibata, Biochim. Biophys. Acta 86, 477 (1964)] besonders für die quantitative Bestimmung dieser Reste in Proteinen empfohlen.
Aus den Absorptionsspektren (siehe Fig. 1) ist ersichtlich, dass weder Kupplung an Tyrosinresten zu Azoderivaten noch mit der freien terminalen Aminogruppe oder mit den s-Aminogruppen der Lysinreste zu den ebenfalls farbigen Triazenen [H.G. Higgins und K.J. Harrington, Arch. Biochem. Biophys. 85,409 (1959)] erfolgte. Bei der Umsetzung des BPTI oder seiner Derivate mit den genannten Diazoniumverbindungen entstehen vorwiegend Desamino-Derivate des BPTI mit relativ wenig verminderten Lysin- und Ar-giningehàlten (vgl. Tabelle 2, Beispiele 18 und 20).
Die erfindungsgemäss erhaltenen Desamino-BPTI-Deri-vate sind in Modellen der akuten Entzündungsreaktion dem BPTI überlegen, da mit ihnen nicht nur in deutlich geringeren Dosierungen die gleiche Wirkung wie mit BPTI erreicht wird, sondern die Entzündungsreaktion auch dann signifikant gehemmt wird, wenn sie mehrere Stunden nach Setzen der Entzündungsnoxe verabreicht werden. Eine solche therapeutische Wirkung ist mit BPTI im Kaolin- und Aerosil-modell bei einmaliger Gabe nicht zu erreichen (Näheres dazu siehe im experimentellen Teil der Anmeldung).
Diese im Vergleich zu BPTI veränderte Wirkung und Wirksamkeit der erfindungsgemäss erhaltenen neuen Des-amino-BPTI-Derivate ist auf das veränderte Hemmspektrum und andere veränderte Eigenschaften, wie grössere Verweildauer und Wirkungszeit im Körper der Versuchstiere zurückzuführen. Die genannten BPTI-Derivate sind deshalb biologisch deutlich vom BPTI abzugrenzen.
Die erfindungsgemäss hergestellten Desamino-BPTI-De-rivate haben gegenüber dem BPTI überlegene biologische Eigenschaften. Von besonderem Vorteil sind ihre inhibitorischen Wirkungen auf die Elastasen aus Pankreas und Granulozyten, die neue therapeutische Einsatzmöglichkeiten eröffnen. Pankreas-Elastase spielt eine wichtige Rolle bei der Pankreatitis [M.C. Geokas, H. Rinderknecht, V. Swanson, B.P. Vitron und B. J. Haverback, Clin. Res. 16,285 (1968)]; Serum-Elastase bei der Atherosklerose [U. Butturini und M. Langen, Klin. Wochenschr. 40,472 (1962)] und Granulozy-ten-Elastase bei akuten und chronischen Entzündungen mit Bindegewebeschädigung [A. Janoff, Amer. J. Pathol. 68, 579 (1972)], bei Gefässwandschädigungen [A. Janoff und J.D. Zeligs, Science 161, 702 (1968)] sowie bei nekrotisierenden Erkrankungen und Degeneration von Lungengewebe, z.B. beim Emphysem [G.M. Turino, R.M. Senior, B.D. Garg, S. Keller, M.M. Levi und I. Mandl, Science 165, 709 (1969); H.E. Evans, M.M. Levi und I. Mandl, Amer. Rev. Respir. Dis. 101, 359 (1970) sowie A. Janoff, R.A. Sandhaus, V.D. Hospelhorn und R. Rosenberg, Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 140, 516 (1972)]. Ebenso wichtig ist die Rolle von lyo-somalen Enzymen und insbesondere der Granulozyten-Ela-stase bei immunologisch bedingten Entzündungsreaktionen [M. Koono, M. Muto und H. Hayashi, Tohoku J. Exptl. Med. 94, 231 (1968)], z.B. der rheumatoiden Arthritis [G. Weissmann und J. Spilberg, Arthritis Rheumat. 11,162 (1968)].
Die Bereitstellung der neuen erfindungsgemäss herstellbaren Desamino-Derivate des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors
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aus Rinderorganen (BPTI) stellt somit eine grosse Bereicherung der Pharmazie dar.
Die Umsetzung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderorganen (BPTI), von Nitroderivaten des BPTI oder von Desamidoderivaten des BPTI in saurer Lösung gemäss dem ersten Verfahren kann sowohl im homogenen als auch im heterogenen System erfolgen. Auch unter Bedingungen, unter denen die Konformation des Inhibitors beeinflusst wird, z.B. in Gegenwart von Dimethylsulfoxid, kann die Umsetzung durchgeführt werden. Es ist vorteilhaft, den Inhibitor in Konzentrationen von 0,1-10%, vorzugsweise 0,2-5% einzusetzen. Es sind aber auch höhere Inhibitor-Konzentrationen möglich. Zur Umsetzung kann man das Nitrosylion aus dem Donator mit organischen Säuren, vorzugsweise Essigsäure, freisetzen. Geeignet sind aber auch z.B. Ameisensäure, Zitronensäure, Trifluoressigsäure, p-To-luolsulfonsäure. Weiterhin eignen sich auch anorganische Säuren, z.B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure. Die Freisetzung des Nitrosylions kann im gepufferten oder ungepufferten Milieu erfolgen. Als Donatoren der salpetrigen Säure bzw. des Nitrosylions sind Salze der salpetrigen Säure, insbesondere die Alkalinitrite, geeignet; weiterhin gemischte Anhydride, wie Nitrosyl-chlorid oder Nitrosylschwefelsäure oder organische Derivate der salpetrigen Säure, wie z.B. die Alkylester, insbesondere Äthylnitrit, tert. Butylnitrit oder Isoamyl-nitrit. Zur Umsetzung kann man sowohl zum Gemisch aus Inhibitor und Säure bzw. saurer Lösung das das Nitrosylion liefernde Agens zufügen als auch die Säure bzw. saure Lösung zum Gemisch aus Inhibitor und dem Nitrosyl-Ionen-Donator zugeben. Es ist unter Umständen vorteilhaft, die Reaktion in Gegenwart von Zusatzstoffen, wie Guanidinhydrochlorid, Harnstoff oder anderen Säureamiden und/oder Netzmitteln durchzuführen.
Bei der Umsetzung kann neben der Desaminierung der Lysin-und Argininreste auch eine Nitrosierung der Tyrosinreste erfolgen. Schliesst man während der Umsetzung und/ oder der Aufarbeitung des Reaktionsgemisches Sauerstoff nicht aus, so erfolgt darüber hinaus noch eine Nitrierung der Tyrosinreste, deren Ausmass von den Reaktions- und Aufarbeitungsbedingungen abhängt, was durch Messung der Extinktion der Reaktionsprodukte bei 425 mm bestimmt werden kann. Nitro-Derivate des desaminierten Inhibitors werden auch erhalten, wenn man bei der Desaminierungsreak-tion von Nitro-Derivaten des BPTI [B. Meloun, I. Fric und F. Sorm, Europ. J. Biochem. 4,112 (1968)], die auch desami-diert sein können, ausgeht.
Die Nitrierung lässt sich verhindern, wenn man die Desa-minierungs-Reaktion und die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches unter Schutzgas oder unter Evakuierung durchführt. Das Schutzgas ist bei der Aufarbeitung entbehrlich, wenn man den pH-Wert des Reaktionsgemisches nach der Umsetzung auf 7,5-12, vorzugsweise auf 8,0-10,5 einstellt.
Als Zusätze zum Zurückdrängen der elektrophilen Nitrierung und/oder Nitrosierung der Tyrosinreste während der Desaminierungs-Reaktion sind Verbindungen geeignet, die - wie z.B. Phenol - stärker nucleophil sind als die phenolische Gruppe der Tyrosinreste [O. Wagner, E. Irion, A. Arens und K. Bauer, Biochem. Biophys. Res. Comm. 37, 383 (1969)].
Bei den Umsetzungen resultieren Gemische verschiedener Komponenten. Die Zusammensetzung der Gemische ist von den Reaktionsbedingungen abhängig und kann über die Konzentration der Reaktionspartner, die Acidität des Mediums, die Temperaturführung und die Reaktionsdauer sowie durch Zusätze von Denaturierungs- und Schutzstoffen gesteuert werden. Die Gemische lassen sich durch Ionenaus-tauschchromatographie auftrennen. So bilden sich beispielsweise bei der Desaminierung von BPTI mit Natriumnitrit in essigsaurer Lösung unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen nach einer Reaktionsdauer von 1 oder 24 Std. Gemische, die durch Ionenaustauschchromatographie an Sulfopropylgruppen enthaltenden Gelen aus vernetztem Dextran in mehrere Komponenten aufgetrennt werden können. Die Lysin- und Arginingehalte einzelner Komponenten sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
Tabelle 1
Lysin- und Arginingehalte von BPTI und Desamino-BPTI-Derivaten, die nach unterschiedlicher Reaktionsdauer erhalten wurden.
Substanz Reaktions- Lysinreste/Inhib. Argininreste/Inhib. dauer (Std.) (Mol/Mol) (Mol/Mol)
BPTI
4 6
(nativ)
Komponente I
0 4
Komponente II
1 5
Komponente III
12 5
Komponente IV
3 5
Komponente T
0 3
Komponente II'
0 4
Komponente III'
24 0 5
Komponente IV
1 5
Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, sind im Gegensatz zu den Angaben von Anderer und Hörnle [Ann. New York Acad. Sei. 146,381 (1968)] auch die Arginingehalte der Desaminie-rungsprodukte vermindert.
Zum zweiten beschriebenen Verfahren (Umsetzung mit Diazonium-Salzen) ist folgendes zu bemerken:
Neuartige Desaminoverbindungen des BPTI werden erfindungsgemäss auch erhalten, wenn man den Inhibitor oder seine Derivate bei pH-Werten zwischen 1 und 12, vorzugsweise bei pH 5,0-11,5 mit solchen Diazoniumverbindungen, die mit BPTI unter den üblichen Bedingungen [vgl. K.H. Schündehütte in Methoden der organischen Chemie (Houben-Weyl) Band 10,3,213, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1965, E. Müller, O. Bayer, H. Meerwein und K. Ziegler (Hrsg.)] praktisch keine Kupplungsreaktionen eingehen, umsetzt. Für die Umsetzung geeignete Diazonium-salze können durch Diazotierung von vorzugsweise hetero-cyclischen Aminen, z.B. 3-Amino-l,2,4-triazol oder 5-Ami-notetrazol erhalten werden. Die Diazoniumsalze werden gewöhnlich dabei in 1- bis 20fach molarer Menge, bezogen auf BPTI bzw. seine Derivate, eingesetzt, vorzugsweise 2 bis 10 Mole pro Mol Inhibitor. Die Umsetzungen werden bei Temperaturen von —20 bis +30 °C durchgeführt, vorzugsweise zwischen 0 und 10 °C.
Die Konzentrationen an BPTI bzw. Derivaten können dabei bis zu 50%, vorzugsweise 5-20%, betragen. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches liegt zwischen pH 1 und pH 12, vorzugsweise zwischen pH 5 und pH 11 und wird vorzugsweise durch Versetzen des Reaktionsgemisches mit Basen, wie z.B. Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-hydroxiden, -carbonaten, -hydrogencarbonaten, tertiären Aminen (Di-äthylamin), N-Methylmorpholin, Triäthylanolamin, eingestellt.
Nitro-Derivate des desaminierten Inhibitors werden erfindungsgemäss auch erhalten, wenn man bei der Umsetzung mit Diazoniumverbindungen von Nitro-Derivaten des BPTI [B. Meloun, I. Fric und F. §orm, Europ. J. Biochem. 4,112 (1968)], die auch desamidiert sein können, ausgeht.
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Aus den Absorptionsspektren (Fig. 1) ist ersichtlich, dass weder Kupplung an Tyrosinresten zu Azoderivaten noch mit der freien terminalen Aminogruppe oder mit den e-Amino-gruppen der Lysinreste zu den ebenfalls farbigen Triazenen [H.G. Higgins und K.J. Harrington, Arch. Biochem. Biophys. 85,409 (1959)] erfolgte. Bei der Umsetzung des BPTI oder seiner Derivate mit den im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Diazoniumverbindungen entstehen vorwiegend Desamino-Derivate des BPTI mit relativ wenig verminderten Lysin- und Arginingehalten (vgl. Tabelle 2, Beispiele 18 und 20.
In Fig. 1 sind die Spektren einiger Desaminoderivate von BPTI in 0,1m Trispuffer, pH 8,0 gegenübergestellt.
Kurve A entspricht 1,44- 10"4molarer Lösung BPTI,
Kurve B entspricht 1,20- 10"4molarer Lösung des Umsetzungsproduktes von BPTI mit diazotiertem Aminotetrazol nach Beispiel 18,
5 Kurve C entspricht 0,8 • 10~4molarer Lösung des Reaktionsprodukts von BPTI und salpetriger Säure nach Beispiel 2,
Kurve D entspricht 1,05- 10~4molarer Lösung des Umset-zungsproduktes aus BPTI und salpetriger Säure nach Beispiel 1.
Die Ordinate ist ein Mass für die Extinktion und die Abszisse zeigt die Wellenlänge in nm an.
Tabelle 2
Bei der Aminosäureanalyse von einigen Desamino-BPTI-Derivaten ermittelte Gehalte an charakteristischen Aminosäuren
Bezeichnung der Substanz Herstellung, Mol Aminosäure-Rest/Mol BPTI-Derivate1
beschrieben Glycin2 Alanin2 Tyrosin Lysin Arginin in Beispiel
BPTI3
6,09
6,00
3,80
4,08
6,01
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. A
6,18
6,66
2,11
0,27
3,51
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. B
6,08
6,35
2,83
0
4,27
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. C
1
6,19
6,80
2,61
0
3,95
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. D
6,81
5,81
2,53
0,18
4,44
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. E
6,58
6,24
3,32
0
4,40
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. F
6,31
5,92
2,98
0,25
4,50
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. A
6,32
6,08
3,51
0,30
3,61
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. B
5,98
5,61
3,764
0,26
3,84
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. C
6,01
5,62
4,554
0,21
4,81
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. D
2
6,49
5,93
3,74
0,14
4,64
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. E
6,82
5,58
4,724
1,06
4,88
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. F
6,53
5,58
3,71
0,92
3,92
Desamino-BPTI-Derivat
4
5,95
6,65
4,084
1,68
4,59
Desamino-BPTI-Derivat
5
5,68
5,95
4,364
0,51
5,69
Desamino-BPTI-Derivat
6
6,00
6,45
1,26
0,13
4,39
Desamino-BPTI-Derivat
7
5,31
5,89
2,77
3,45
4,33
Desamino-BPTI-Derivat
13
5,80
6,25
2,65
2,47
5,42
Desamino-BPTI-Derivat
14
6,17
5,87
1,28
0,53
4,71
Desamino-BPTI-Derivat
18
6,01
6,12
3,90
2,62
5,02
Desamino-BPTI-Derivat
20
5,83
6,02
4,16
2,02
5,16
1 Das Molekulargewicht der Derivate wurde zu 6511 wie für nativen BPTI angenommen.
2 Der Alanin- bzw. Glycingehalt dienen als interner Standard. Je nach den Elutionsbedingungen bei der Aminosäureanalyse werden unbe-kannte mit Ninhydrin anfärbbare Substanzen zusammen mit Glycin und/oder Alanin eluiert, die dann höhere Glycin- und/oder Alanin-Gehalte vortäuschen.
3 Zum Vergleich wurde eine Aminosäureanalyse von BPTI mit aufgenommen. Die theoretischen Werte der betreffenden Aminosäuren betragen: Gly und Ala = 6,0; Tyr = 4,0; Lys = 4,0; Arg. = 6,0.
4 Ein Desaminierungsprodukt von Lysin wird unmittelbar vor Tyrosin eluiert. Deshalb wird der Tyrosin-Peak im Chromatogramm entweder unsymmetrisch oder begleitet von einem nicht ganz aufgelösten Gipfel gefunden.
Die erfindungsgemäss erhaltenen Desaminoderivate des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderorganen (BPTI) sind neu. Sie lassen sich durch chemische, physikalisch-chemische, biochemische sowie biologische Eigenschaften charakterisieren und gegenüber bekannten Substanzen abgrenzen. Es wurden folgende Kriterien herangezogen:
1) Aminosäurezusammensetzung
Die Aminosäurezusammensetzung wurde nach S. Moore, D.H. Spackmann, W.H. Stein [Anal. Chem. 30, 1185 (1958)] bestimmt. Für einige charakteristische Desamino-
BPTI-Derivate sind in Tabelle 2 die Werte der Aminosäure-
Reste angegeben, deren Gehalt durch die erfmdungsgemässen Desaminierungs-Reaktionen verändert wird.
55 2) Elektrophoretische Eigenschaften
Polyacrylamidgelelektrophorese Die Polyacrylamidgelelektrophorese der Desamino-BPTI-Derivate wurde in 10%igem Polyacrylamidgel, das 0,8% Agarose enthielt, in der Ultraphor-Elektrophoreseap-6o paratur (LKB) bei pH 8,6 durchgeführt. Die Elektrophorese erfolgte unter Wasserkühlung und unter Konstanthaltung der Spannung auf 300 Volt. Die Laufzeit betrug im allgemeinen 2 Std. Für die Herstellung des Polyacrylamid-Agaro-se-Gels wurden in der Literatur (A. J. Crowle «Immunodiffusion», 2. Auflage, Academic Press New York-London, 1973, S. 143-147) angegebene Methoden leicht modifiziert. Die Gele wurden nach der Elektrophorese mit einer 0,1 %igen Amidoschwarz-Lösung in 7,5%iger Essigsäure an65
635514
6
gefärbt (30-60 Min.). Die Entfernung von überschüssigem, nicht Protein-gebundenem Amidoschwarz erfolgte mit 7,5%iger Essigsäure.
In Fig. 6 sind die elektrophoretischen Beweglichkeiten verschiedener BPTI-Derivate mit der von BPTI verglichen. Die Abbildung zeigt die Pherogramme folgender Derivate: I BPTI;
II-V Desamino-BPTI-Derivate nach Beispiel 1
Fraktionen A, B, E und F;
VI-IX Desamino-BPTI-Derivate nach Beispiel 2 Fraktionen A, B, D und F;
X Desamino-BPTI-Derivate nach Beispiel 4;
XI Desamino-BPTI-Derivate nach Beispiel 5;
XII Desamino-BPTI-Derivate nach Beispiel 10;
XIII Desamino-BPTI-Derivate nach Beispiel 16;
XIV Desamino-BPTI-Derivate nach Beispiel 13;
XV Desamino-BPTI-Derivate nach Beispiel 14.
3) UV-Absorptionsspektrum Zum Nachweis der nitrierten und/oder nitrosierten Tyro-sin-Reste wurde der Quotient der Extinktionen bei 280 nm und 425 nm ermittelt (Spektralphotometer von Perkin-El-mer 124; die Substanzen wurden in 0,1 m Tris-(hydroxyme-thyl)-aminomethan-HCl-Puffer, pH 8,0 gelöst).
Nach B. Meloun, I. Fric und F. Sorm [Europ. J. Biochem. 4,112 (1968)] beträgt dieser Quotient für Mononitro-BPTI ~ 2,5, für Dinitro-BPTI ~ 1,5. Höhere Werte als 3 sprechen für Gemische von BPTI-Derivaten, die nichtnitrier-te Anteile enthalten.
4) Proteasen-Inhibitionsspektrum a) Elastase-Inhibition a) Pankreas-Elastase-Inhibition Für die Hemmversuche mit den erfindungsgemäss erhaltenen Desamino-BPTI-Derivaten wurde kristallisierte Pankreas-Elastase (Schwein) der Fa. Nutritional Biochemicals Corp. verwendet. Als Substrate wurden Elastin-Kongorot [M. A. Naughton und F. Sanger, Biochem. J. 78,156 (1961)], lösliches Elastin [S. Keller und I. Mandl, Biochem. Med. 5, 342 (1971)] sowie besonders vorteilhaft Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-p-nitroanilid [J. Bieth, B. Spiess und C.G. Wermuth, Biochem. Med. 11, 350 (1974)] verwendet. Das synthetische Peptidsubstrat ermöglicht eine einfache co-lorimetrische Bestimmung der im Test eingesetzten Enzymaktivität. Der Elastase-Einsatz betrug im Elastin-Kon-gorot-Test ca. 1,1 nkat (vgl. Enzyme Nomenclature, Recom-mendations [1972] of the International Union of Pure and Applied Chemistry and the International Union of Bio-chemistry, 1973, Elsevier Amsterdam-New York, S. 26-27); mit löslichem Elastin als Substrat und ebenso mit Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-p-nitroanilid wurden ca. 0,25 nkat Elastase pro Test-Ansatz eingesetzt. Zur quantitativen Bestimmung der Elastase-Hemmungen wurden die oben angegebenen Enzym-Mengen zu der mit Inhibitorlösungen definierter Konzentration versetzten Substratlösung gegeben. Um maximale Komplexbildung sicherzustellen, wurden in einigen Fällen Enzym und Inhibitor vor der Zugabe des Substrats für 15 bis 30 Min. vorinkubiert. s Die Hydrolyse des Substrats wurde beim Elastin-Kongorot-Test durch Messung der Extinktion bei 492 nm der nach einer definierten Zeit gebildeten löslichen Spaltprodukte bestimmt. Beim Test mit löslichem Elastin wurde die Hydroly-se-Rate durch photometrische Bestimmung der nach einer io definierten Zeit in Lösung gegangenen, mit Ninhydrin farbbaren Spaltprodukte ermittelt. Bei Verwendung von Suc-cinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-p-nitroanilid als Substrat wurde die Hydrolyse durch kontinuierliche Messung der Extinktion des freigesetzten p-Nitroanilins bei 410 nm be-15 stimmt.
Die Hemmwerte (ausgedrückt in Prozent Hemmung) . wurden ermittelt, indem man die nach Inhibitorzusatz gemessene Elastase-Restaktivität von der Aktivität der Enzymkontrolle subtrahierte. Die Hemmwerte einiger Desamino-20 BPTI-Derivate sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengestellt. Fig. 2 zeigt die Abhängigkeit der Elastasehemmung von der Menge dreier Inhibitoren. Andere erfindungsgemässe Desamino-BPTI-Derivate zeigen einen ähnlichen Hemmverlauf.
25 In Fig. 2 ist die prozentuale Hemmung von 0,25 nkat Pankreas-Elastase (Schwein) durch einige Desamino-BPTI-Derivate, bestimmt nach Bieth et al., mit 15 Minuten Vorinkubation von Inhibitor und Enzym, aufgeführt (siehe dazu auch Tabelle 3 der Anmeldung).
3o In Fig. 2 bezieht sich Kurve A auf das Desamino-BPTI-Derivat nach Beispiel 4, Kurve B bezieht sich auf das Des-amino-BPTI-Derivat nach Beispiel 3 und Kurve C auf das Desamino-BPTI-Derivat nach Beispiel 18 der vorliegenden Anmeldung.
35 Die Ordinate von Fig. 2 gibt die Hemmung in Prozent an und die Abszisse die Menge Desamino-BPTI-Derivat in jag.
ß) Granulozyten-Elastase-Inhibition
Das für die Hemmteste verwendete Isoenzymgemisch 40 wurde nach K. Ohlsson und I. Olsson [Europ. J. Biochem. 42, 519 (1974)] aus Humangranulozyten gewonnen. Als Substrat ist besonders Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-p-ni-troanilid [J. Bieth, B. Spiess und C.G. Wermuth, Biochem. Med. 11, 350 (1974)] geeignet. Die Hemmwerte einiger Des-45 amino-BPTI-Derivate sind in Tabelle 5 aufgenommen; die Abhängigkeit der Hemmung von den Inhibitorkonzentrationen ist für einige Derivate in Fig. 3 wiedergegeben.
In Fig. 3 der Anmeldung wird die prozentuale Hemmung von 0,25 nkat Granulozyten-Elastase (human) durch einige so Desamino-BPTI-Derivate, bestimmt nach Bieth et al., mit 15 Minuten Vorinkubation vom Inhibitor und Enzym angegeben. (Vergleiche dazu auch Tabelle 5 der Anmeldung.)
Die Ordinate von Fig. 3 gibt den Prozentsatz der Hemmwirkung und die Abszisse die Menge Desamino-BPTI-Deri-55 vat in (ig an.
Tabelle 3
Prozentuale Hemmung1 von 0,25 nkat Pankreas-Elastase (Schwein) durch verschiedene Desamino-BPTI-Derivate mit Suc-cinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-p-nitroanilid als Substrat, bestimmt nach J. Bieth et. al. [Biochem. Med. 11, 350 (1974)] mit 15 Min. Vorinkubation (+) und ohne Vorinkubation (—) von Enzym und Inhibitor zugesetzte Inhibitormenge
Desamino-BPTI-Derivat 50 |xg 25 }ig 12,5 ng 5 ng 2,5 ng hergestellt nach Beispiel 4- — + — + — + — +
Fraktion A 100 98 98 98 93 90 53 63 35 35
Fraktion B 100 100 76 58
Fraktion C 100 96 73 53
7
Tabelle 3 (Fortsetzung)
635 514
Desamino-BPTI-Derivat hergestellt nach Beispiel
50 Hg +
25 Hg +
—
zugesetzte Inhibitormenge
12,5 Hg 5 Hg + - +
—
2,5 Hg
+
—
2
Fraktion D
100
90
60
40
Fraktion E
100
99
69
32
Fraktion F
87
86
64
87
40
74
28
44
10
21
Fraktion A
100
92
70
55
31
Fraktion B
99
90
75
60
30
2
Fraktion C
100
98
90
40
34
Fraktion D
100
95
85
70
52
Fraktion E
100
96
90
65
30
Fraktion F
100
90
78
55
38
3
97
95
89
91
69
74
44
47 •
25
15
4
97
99
90
92
76
73
50
48
33
38
5
100
99
95
87
86
77
47
35
25
15
6
91
85
48
21
12
7
97
97
82
90
75
77
44
35
10
100
100
94
92
75
75
37
38
21
20
11
93
85
58
17
10
13
100
100
96
92
91
72
48
37
29
13
14
100
99
97
98
87
86
45
40
22
20
18
84
97
77
70
55
51
42
26
26
19
21
96
95
90
71
55
44
28
18
15
10
22
67
45
27
12
-
(AOD Test \ 1 —:—^ ; 7,— I '
A ODEnzymkontroIle /
Tabelle 4
Prozentuale Hemmung1 von 0,25 nkat Pankreas-Elastase (Schwein) durch einige Desamino-BPTI-Derivate mit löslichem Elastin als Substrat nach S. Keller und I. Mandl [Biochem. Med. 5,342 (1971)] mit 15 Min. (+) bzw. ohne Vorinkubation (—)
von Enzym und Inhibitor zugesetzte Inhibitormenge
Desamino-BPTI-Derivat hergestellt nach Beispiel
50 Hg
+
-
25 Hg +
-
12,5 Hg +
-
5 Hg
+
-
2,5 Hg +
-
3
97
94
94
88
92
84
59
45
38
20
4
95
98
94
92
86
82
52
55
46
39
5
97
94
92
51
23
6
98
92
82
38
15
7
97
98
96
97
89
90
65
50
41
28
10
97
91
82
33
18
11
98
96
88
43
20
13
97
97
92
93
89
85
59
64
36
31
14
96
100
88
98
73
84
36
43
18
23
17
87
81
81
79
75
70
64
53
28
25
21
96
86
90
84
65
83
54
59
31
25
22
68
39
28
15
-
(AOD Test \
1 I • 100
A" ODEnzymkontroIle /
b) Chymotrypsin- und Trypsin-Inhibition Die Aktivität von Chymotrypsin wurde photometrisch mit L-Tyrosinäthylester als Substrat im optischen Test nach H.U. Bergmeyer (Methoden der enzymatischen Analyse, Band 1, S. 469, 3. Auflage, Verlag Chemie, Weinheim, 1974) bestimmt. Die Bestimmung von Trypsin im pH-Stat-Verfah-ren mit Benzoyl-L-arginin-äthylester-hydrochlorid als Substrat ist in R. Ruyssen (Symposium on Pharmaceutical Enzymes and their Assay, Universitaire Pers, Ghent, Belgium
6o 1969, S. 107) angegeben. Die Chymotrypsin- und Trypsin-Inhibition wurde, wie bei R. Ruyssen (s. o. S. 117) für Trypsin mit BPTI angegeben, bestimmt. Die in Tabelle 6 für einige Desamino-BPTI-Derivate aufgeführten Hemmwerte (ausgedrückt in %) wurden auf die durch die gleiche Menge 6s BPTI bewirkte Hemmung (= 100%) bezogen. Die absoluten Hemmwerte wurden sowohl für BPTI als auch für Desami-no-BPTI-Derivate ermittelt, wie unter «Pankreas-Elastase-Inhibition» angegeben.
635 514
c) Kininogenasen-Inhibition a) Plasma-Kininogenasen-Inhibition Die Kininogenasen-Aktivitt wurde nach C. Sampaio, S.C. Wong und E. Shaw [Arch. Biochem. Biophys. 165,133 (1974 im pH-Stat-Verfahren bestimmt, jedoch wurde als Substrat anstelle von Tosyl-L-arginin-methylester-hydro-chlorid Benzoyl-L-arginin-äthylester-hydrochlorid wegen der grsseren Hydrolysegeschwindigkeit verwendet. Das Gemisch der Isoenzyme wurde nach C. Sampaio et al. [Arch. Biochem. Biophys. 165,133 (1974)] durch Affinitätschromatographie aus der Human-Plasmafraktion Cohn IV-1 iso-5 liert. Die in Tabelle 6 für einige Desamino-BPTI-Derivate aufgeführten Hemmwerte wurden, wie unter «Chymotrypsin- und Trypsin-Inhibition» angegeben, ermittelt.
Tabelle 5
Prozentuale Hemmung1 von 0,25 nkat Granulozyten-Elastase (human) durch verschiedene Desamino-BPTI-Derivate mit Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-p-nitroanalid als Substrat, bestimmt nach J. Bieth et. al. [Biochem. Med. 11,350 (1974)] mit 15 Min. Vorinkubation (+) und ohne Vorinkubation (—) von Enzym und Inhibitor zugesetzte Inhibitormenge
Desamino-BPTI-Derivat, 50 Hg 25 Hg 12,5 Hg 5 Hg hergestellt nach Beispiel + — + — + — +
Fraktion A
88
73
55
60
38
44
17
18
Fraktion B
83
49
35
20
Fraktion C
83
53
45
10
1
Fraktion D
89
62
40
21
Fraktion E
78
48
35
9
Fraktion F
55
60
39
42
28
29
6
7
Fraktion A
58
38
15
8
Fraktion B
68
43
18
4
2
Fraktion C
72
55
33
11
Fraktion D
76
55
23
6
Fraktion E
65
45
20
8
Fraktion F
60
47
22
5
3
68
71
43
50
23
26
15
10
4
72
74
43
43
27
33
18
14
5
72
75
46
45
26
26
13
11
6
56
31
18
8
10
69
66
48
45
27
32
14
14
13
83
78
55
53
35
22
20
10
14
81
74
55
44
34
31
19
15
18
63
61
45
43
28
29
17
16
21
53
29
20
9
22
60
46
24
9
/ AOD Test \
1 Berechnet nach: % Hemmung =11 I • 100
y A ODEnzymkontroIle ;/
Tabelle 6
Hemmung von Serin-Proteasen durch einige Desamino-BPTI-Derivate im Vergleich zu BPTI
Bezeichnung der Substanz
Herstellung, beschrieben in Beispielen
Chymotrypsin
Kininogenase Pankreas
Plasma
Plasmin
Trypsin
BPTI (Vergleich
100%
100%
100%
100%
100%
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. A
110
4
37
0
10
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. B
104
20
37
28
25
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. C
73
10
51
0
30
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. D
1
75
25
70
10
30
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. E
102
35
45
5
48
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. F
44
84
45
5
50
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. A
12
10
57
0
10
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. B
80
10
31
10
10
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. C
2
72
12
45
36
26
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. D
78
10
46
23
15
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. E
83
10
49
0
20
Desamino-BPTI-Derivat, Fr. F .
96
86
96
36
60
9 635 514
Tabelle 6 (Fortsetzung)
Bezeichnung der Substanz
Herstellung, beschrieben in Beispielen
Chymotrypsin
Kininogenase Pankreas
Plasma
Plasmin
Trypsin
Desamino-BPTI-Derivat,
3
93
38
62
93
39
Desamino-BPTI-Derivat,
4
10
54
71
86
40
Desamino-BPTI-Derivat,
6
95
50
81
86
31
Desamino-BPTI-Derivat,
10
56
5
10
86
23
Desamino-BPTI-Derivat,
11
87
18
48
86
15
Desamino-BPTI-Derivat,
13
116
31
81
86
23
Desamino-BPTI-Derivat,
14
78
108
21
86
99
Desamino-BPTI-Derivat,
18
84
152
121
95
70
Desamino-BPTI-Derivat,
21
145
57
52
86
54
Desamino-BPTI-Derivat,
22
102
80
127
86
80
ß)Pankreas-Kininogenase-Inhibition Das Testenzym wurde nach C. Kutzbach und G. Schmidt-Kastner [Z. Physiol. Chem. 353,1099 (1972)] erhalten, und die Aktivitätsbestimmungen wurden nach denselben Autoren (s. o.) durchgeführt. Die in Tabelle 6 für einige Desamino-BPTI-Derivate aufgeführten Hemmwerte wurden, wie unter «Chymotrypsin- und Trypsin-Inhibition» angegeben, ermittelt.
Für einige Desamino-BPTI-Derivate wurden die so ermittel-20 ten Hemmwerte, die mit 50 jig Derivat pro 0,3 CU Plasmin • erhalten wurden, in Tabelle 6 aufgeführt. Diese Werte wurden im Gegensatz zu denen für die anderen in Tabelle 6 wiedergegebenen Enzyme nicht auf BPTI bezogen. Bereits 0,6 (ig BPTI hemmen 0,3 CU Plasmin zu 50%.
25
d) Plasmin-Inhibition
Die enzymatische Aktivität von Plasmin wurde mit dem Substrat N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-p-ni-troanilid-hydrochlorid bestimmt. Als Enzym wurde mit Urokinase aktiviertes Plasminogen benutzt, das mittels Affinitätschromatographie [D.G. Deutsch, E.T. Mertz, J. Med. 3,224 (1972)] aus Humanplasma gewonnen wurde. (Das Substrat wird von der AB Bofors, Nobel Division, Mölndal, Schweden, unter der Bezeichnung S 2160 vertrieben.)
Die Testvorschrift wurde mit geringen Veränderungen von Svendsen und Amundsen (Abstract of a paper, read at IVth Congress of the International Society of Thrombosis and Haemostasis, Vienna, June 1973) übernommen: Man bereitet für jede Bestimmung zwei parallele Ansätze (A und B) mit je 0,3 CU [«casein units» nach J.T. Sgouris, Vox. Sang. 5, 357 (I960)] Plasmin, gelöst in 1,0 ml Puffer (0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl/0,05 m NaCl, pH 7,2). Zur Bestimmung ihrer inhibitorischen Wirkung werden BPTI und Desamino-BPTI-Derivate zu 50 ng/ml in dem genannten Puffer gelöst; 1,0 ml davon werden zu dem vorgelegten Plasmin gegeben. In die Ansätze zur Bestimmung der vollen Piasminaktivität gibt man 1,0 ml des genannten Puffers. Man inkubiert alle Ansätze 10 Min. bei 20 °C, gibt zu einem der Parallelansätze (A) 0,25 ml einer 10~3 m wässrigen Lösung von S 2160 und zu dem anderen (B) zuerst 0,25 ml Eisessig, dann 0,25 ml der Lösung des S 2160. Nach einer 30minütigen Inkubation bei 20 °C wird auch Ansatz A mit 0,25 ml Eisessig versetzt.
Das durch das Enzym freigesetzte p-Nitroanilin bestimmt man, indem man die Extinktionsdifferenz der parallelen Ansätze A und B bei 405 nm photometrisch bestimmt.
Bezeichnet man die Extinktionsdifferenz, die von Plasmin allein hervorgerufen wird, mit A E10o und die in Gegenwart von Inhibitoren gemessene Extinktionsdifferenz mit A E, so ergibt sich die Hemmung des Plasmins durch die Inhibitoren unter den angegebenen Bedingungen durch den folgenden Ausdruck:
ae100-ae A Eioo
100%
e) Kathepsin-G-Inhibition
Das Enzym wurde nach W. Schmidt und K. Havemann 30 [Z. Physiol. Chem. 355,1077 (1974)] isoliert. Die Hemmteste wurden mit Acetyl-L-tyrosin-äthylester, wie bei A. Vander-meers et al. [J. Clin. Chem. 18,1514 (1972)] beschrieben, durchgeführt.
Die neuen, erfindungsgemäss erhaltenen Desamino-Deri-35 vate des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderorganen (BPTI) können aufgrund ihrer biologischen Wirksamkeit insbesondere zur Behandlung folgender Krankheiten bzw. Krankheitserscheinungen eingesetzt werden:
1. Verschiedene Formen des Schocks, posttraumatische 40 und postoperative Komplikationen,
2. Störungen der Blutgerinnung,
3. akute und chronische Entzündungsreaktionen, insbesondere zur Therapie und Prophylaxe von Organschädigungen, wie beispielsweise Pankreatitis und strahleninduzierte
45 Enteritis, immunkomplexbedingte Entzündungsreaktionen, wie Immunvasculitis, Glomerulonephritis und Arthritiden; Kollagenosen, insbesondere rheumatoide Arthritis,
4. durch stoffwechselbedingte Ablagerungen verursachte Arthritiden (z.B. Gicht),
so 5. Degeneration der elastischen Bestandteile der Bindegewebsteile von Organen, wie bei der Atherosklerose,
6. strahleninduzierte Enteritis.
Die neuen Wirkstoffe können in bekannterWeise (analog BPTI) in die üblichen Formulierungen übergeführt wer-55 den.
Folgende Formulierungen sind dabei bevorzugt zu nennen:
1. Lösungen für parenterale Anwendung zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen Injektion, bzw. zur in-
6o traartikulären und intratumoralen Injektion.
2. Lösungen für intravenöse Dauerinfusion.
3. Lösungen zur Anwendung als Aerosole zur Inhalation.
4. Lösungen, Emulsionen, Salben, Pasten, Cremes, Lotions, Puder zur äusserlichen lokalen Anwendung.
65 5. Kombination verschiedener Hemmstoffe, deren Wirkungsspektrum sich gegenseitig ergänzt.
Die Konzentrationen der neuen Wirkstoffe in den erfin-dungsgemässen Formulierungen bewegen sich dabei in den
635 514
Grenzen 0,01 bis 100 mg/ml Lösung, vorzugsweise zwischen 0,1 bis 10 mg/ml Lösung.
Die neuen Wirkstoffe können in üblicher Weise angewendet werden, insbesondere sind folgende Anwendungsmethoden als bevorzugt zu nennen:
a) parenteral: intravenös, intramuskulär, subkutan, in-traartikulär, intratumoral b) iokal: z.B. intranasal c) oral
Als Dosierungsbereich kann für die neuen Wirkstoffe angegeben werden:
0,1-20 mg Wirkstoff/kg Körpergewicht, vorzugsweise 1 bis 10 mg Wirkstoff/kg Körpergewicht, die Dosierung ist dabei vor allem abhängig von der zu behandelnden Spezies sowie von der Applikationsart.
Die erfindungsgemäss hergestellten neuen Wirkstoffe können bei Mensch und Tier eingesetzt werden.
Versuchsanordnung zum Nachweis entzündungshemmender Wirkung bei der Ratte a) Carrageenan-induzierte Entzündungsreaktion Die Entzündungsreaktion wurde durch intraplantare Injektion von 0,1 ml einer 0,5%igen Carrageenanlösung (Car-rageenan, Marine Colloids, Inc., New York) in eine Hinterpfote von 130-160 g schweren Wistarratten induziert. Die für die Behandlung der Entzündungsreaktion verwendeten erfindungsgemässen Desamino-BPTI-Derivate sowie BPTI wurden in 0,9%iger Natriumchloridlösung in einer Konzentration von 10-20 mg/ml gelöst. Die Behandlung der Versuchstiere erfolgte durch intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane oder intravenöse Injektion von 0,5-1,0 ml Lösung von Desamino-BPTI-Derivaten und zum Vergleich BPTI entweder prophylaktisch, d.h. vor Setzen der Entzündungsnoxe, oder therapeutisch, d.h. nach Setzen der Entzündungsnoxe. Die Schwellung der entzündeten Pfote, die ein Mass für die Schwere der Entzündungsreaktion ist, wurde mit dem Antiphlogmeter nach Kemper [F. Kemper und G. Ameln, Z. ges. exp. Med. 131,407-411 (1959)] zeitlich verfolgt.
Zur Ermittlung der Dosis-Wirkungsbeziehungen wurde der 4 Stunden nach Setzen der Entzündungsnoxe gemessene Wert verwendet. Das Ergebnis des Vergleiches eines Desami-no-BPTI-Derivates nach Beispiel 3 mit BPTI ist in Tabelle 7 wiedergegeben. Es sind die Dosen in mg/kg angegeben, die eine 10%ige (ED10), 30%ige (ED30) bzw. 50%ige (ED50) Hemmung der Pfotenschwellung im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe bewirken.
b) Kaolin-induzierte Entzündungsreaktion
Die Entzündungsreaktion wurde durch intraplantare Injektion von 0,1 ml einer 10%igen Kaolinsuspension (Bolus weiss, fein gepulvert, Merck AG, Darmstadt) in eine Hinterpfote von 130-160 g schweren Wistarratten induziert. Die Prüfung der Substanzen und die Auswertung der Ergebnisse erfolgte wie unter a) angegeben.
Der Wirkungsvergleich der Desamino-BPTI-Derivate nach Beispiel 3 und 18 zeigt, dass sie dem BPTI in ihrer entzündungshemmenden Wirkung überlegen sind (Tab. 8).
Die Überlegenheit der Desamino-BPTI-Derivate als Arzneimittel gegenüber dem BPTI ergibt sich auch aus dem Befund, dass BPTI in der Kaolin-induzierten Entzündungsreaktion nur dann entzündungshemmende Wirkungen zeigt,
wenn es vor oder bis zu 30 Minuten nach Setzen der Entzündungsnoxe verabreicht wird, während die Desamino-BPTI-Derivate auch zu späteren Zeitpunkten nach Setzen der Entzündungsnoxe wirksam sind (Abb. 5).
c) Aerosil-induzierte Entzündungsreaktion
Die Entzündungsreaktion wurde durch intraplantare Injektion von 0,1 ml einer 2%igen Aerosilsuspension (Aerosil 200, Degussa AG, Frankfurt) in eine Hinterpfote von 130-160 g schweren Wistarratten induziert. Die für die Behandlung der Entzündungsreaktion verwendeten erfindungsgemässen Desamino-BPTI-Derivate bzw. BPTI wurden in 0,9%iger Natriumchloridlösung in einer Konzentration von 10-20 mg/ml gelöst. Die Behandlung der Versuchstiere erfolgte durch intraperitoneale, subkutane oder intravenöse Injektion von 0,5-1,0 ml Lösung von Desamino-BPTI-Derivaten und zum Vergleich BPTI 15 Stunden nach Setzen der Entzündungsnoxe. Die Schwellung der entzündeten Pfote, die ein Mass für die Schwere der Entzündungsreaktion ist, wurde mit dem Antiphlogmeter nach Kemper zeitlich verfolgt. Zur Ermittlung der Dosis-Wirkungsbeziehungen wurde der 21-Stundenwert nach Entzündungsinduktion (= 6 Stunden nach Injektion der erfindungsgemässen Desamino-BPTI-Derivate bzw. des BPTI) ermittelt. Das Ergebnis des Vergleichs der Desamino-BPTI-Derivate nach Beispiel 3 und 18 mit BPTI ist in Tabelle 9 wiedergegeben. Es sind die Dosen in mg/kg angegeben, die eine 10%ige (EDi„), 15%ige (ED15) bzw. 30%ige (ED30) Hemmung der Pfotenschwellung im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollgruppen bewirken.
Aus den Fig. 4A und 4B ist ein Vergleich der entzündungshemmenden Wirkung von BPTI (A) und des Desamino-BPTI-Derivates nach Beispiel 3 (B) in der Kaolin-induzierten Entzündimg der Rattenpfote nach intravenöser Gabe von 20 mg Inhibitor/kg Körpergewicht zu verschiedenen Zeiten vor und nach Setzen der Entzündungsnoxe zu entnehmen.
In Fig. 4A wurde BPTI 30 und 15 Minuten vor, gleichzeitig mit und 15, 30, 60,120 und 240 Minuten nach der Entzündungsinduktion gegeben. In Fig. 4B wurde 15, 60 und 120 Minuten nach Setzen der Entzündungsnoxe (Entzündungsinduktion) das Desamino-BPTI-Derivat nach Beispiel 3 verabreicht.
Die Zahlenwerte auf den drei Achsen I, II und III geben folgendes an:
I: Hemmung der Pfotenschwellung in Prozent II: Zahl der Stunden nach der Entzündungsinduktion III: Zahl der Minuten vor/bzw. nach Gabe von BPTI (Fig. 4A) bzw. Zahl der Minuten nach Gabe von Des-amino-BPTI-Derivat nach Beispiel 3 (Fig. 4B) E=Zeitpunkt der Entzündungs-Induktion
Das Ergebnis der Therapieversuche mit den Desamino-BPTI-Derivaten nach Beispiel 3 und 18 (Tab. 9) zeigt die Wirksamkeit der verwendeten Desamino-BPTI-Derivate in diesem experimentellen Modell, in dem BPTI in gleicher Dosierung die Entzündungsreaktion nicht hemmt. Damit ist die Überlegenheit der Desamino-BPTI-Derivate als Arzneimittel gegenüber dem BPTI nachgewiesen. Dieses Ergebnis steht in Einklang mit den Ergebnissen aus den Versuchen mit dem Kaolin-Modell (b), bei dem sich die therapeutische Überlegenheit durch die entzündungshemmende Wirkung zu einem späten Zeitpunkt nach Setzen der Entzündungsnoxe ebenfalls erweist.
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Tabelle 9
Hemmung der Aerosil-induzierten Entzündungsreaktion der Rattenpfote durch intravenöse Behandlung mit BPTI und den BPTI-Derivaten nach Beispielen 3 und 18.
Die Behandlung erfolgte 15 Stunden nach Setzen der Entzündungsnoxe. Aufgezeichnet sind die Mittelwerte und der 5%-Vertrauensbereich
Bezeichnung erhalten ED10 ED15 ED30
der Substanz nach mg/kg mg/kg mg/kg
Beispiel
BPTI keine Hemmung nachweisbar
Desamino- 3 2,0 4,9 61,5
BPTI-Derivat (0,1-4,6) (1-8,5) (32-500)
Desamino- 18 5,1 6,3 11,4
BPTI-Derivat (3,7-6,4) (4,8-7,6) (9,6-13,4)
Tabelle 7
Hemmung der Carrageenan-induzierten Entzündungsreaktion der Rattenpfote durch intravenöse Behandlung mit BPTI und dem Desamino-BPTI-Derivat nach Beispiel 3.
Die Behandlung erfolgte 15 Minuten nach Setzen der Entzündungsnoxe. Aufgezeichnet sind die Mittelwerte und der 5%-Vertrauensbereich (in Klammern)
Bezeichnung erhalten ED10 ED30 ED50
der Substanz nach mg/kg mg/kg mg/kg
Beispiel
BPTI 7,0 12,7 22,8
Desamino- 3 0,07 0,5 3,9
BPTI-Derivat (0,03-0,14) (0,3-0,8) (3,1-5,1)
Tabelle 8
Hemmung der Kaolin-induzierten Entzündungsreaktion der Rattenpfote durch intravenöse Behandlung mit BPTI und den Desamino-BPTI-Derivaten nach Beispiel 3 und 18.
Die Behandlung erfolgte 15 Minuten nach Setzen der Entzündungsnoxe. Aufgezeichnet sind die Mittelwerte und der 5%-Vertrauensbereich (in Klammern)
Bezeichnung erhalten EDi0 ED30 ED50
der Substanz nach mg/kg mg/kg mg/kg
Beispiel
BPTI 9,1 17,6 33,9
(5,2-12,3) (13,7-22,1) (26,7-52,1)
Desamino- 3 1,3 7,2 36,5
BPTI-Derivat (0,02-0,71) (5,9-9,1) (26,7-55,4)
Desamino- 18 0,6 2,7 11,7
BPTI-Derivat (0,12-1,4) (1,1-4,4) (8,8-15,6)
Herstellungsbeispiele Beispiel 1
500 mg BPTI (77 (iMol) wurden in 200 ml eiskalter, sauerstofffreier 0,25 m Essigsäure gelöst. Unter Durchleitung von Stickstoff und gutem Rühren tropfte man bei 0-4 °C im Verlaufe von 30 Min. 50 ml 2 m Natriumnitritlösung in die Lösung des Inhibitors und hielt das Reaktionsgemisch schliesslich 24 Std. unter Stickstoffatmosphäre bei +4°C. Dabei stieg der pH-Wert der Lösung von 3,7 auf 4,1.
Das Reaktionsgemisch wurde nun durch Ultrafiltration in einer Ultrafiltrationszelle (Amicon) mit Hilfe einer Dia-flow-UM-05-Membran eingeengt, mit Wasser verdünnt und erneut konzentriert. Dieser Vorgang wurde mehrfach wiederholt, wobei ein Teil des Reaktionsproduktes schliesslich ausfiel. Man versetzte das Retentat mit 0,1 m Ammoniumhydroxidlösung bis zur weitgehenden Lösung des Niederschlags, stellte den pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 0,1 m Essigsäure auf 6,8 und fügte so viel Wasser hinzu, dass eine 0,05 m Ammoniumacetat-Konzentration erreicht wur-55 de. Man trennte eine kleine Menge ungelöstes Material durch Zentrifugieren ab und chromatographierte die überstehende Lösung an einer mit 0,05 m Ammoniumacetat-lösung pH 6,8 äquilibrierten SP-Sephadex®C-25-Säule (2,5 x 80 cm). (Sephadex® = quervernetztes Dextran). Die Säule wurde zunächst mit 500 ml 0,05 m Ammoniumacetat-lösung pH 6,8 und anschliessend mit 500 ml 0,5 m Am-moniumacetatlösung des gleichen pH-Wertes eluiert. Das Elutionsprofil ist in Fig. 5 wiedergegeben. Die einzelnen Fraktionen A bis F (vgl. Fig. 5) wurden gefriergetrocknet und die Lyophilisate teils durch Chromatographie an Biogel P 2 mit 0,1 m Ammoniumhydroxid als Elutionsmittel, teils durch Ultrafiltrieren entsalzt. Die Ausbeuten und spektroskopischen Daten der aus den einzelnen Fraktionen erhaleo
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tenen Präparate sind in Tab. 10 zusammengestellt und die Resultate der quantitativen Aminosäureanalysen in Tab. 2 wiedergegeben. Die Angaben über die Hemmspektren können aus den Tab. 3-6 entnommen werden. In Fig. 5 ist auf der Ordinate die Extinktion in Prozent und auf der Abszisse die Bezeichnung der jeweiligen Fraktion A bis F aufgeführt. Beim Punkt W wird das Elutionsmittel gewechselt (0,5 Am-moniumacetatlösung anstelle von 0,05 m Ammoniumacetat-lösung).
Beispiel 2
500 mg BPTI wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Natriumnitrit in essigsaurer Lösung umgesetzt. Nach 24 Stunden wurde der pH-Wert durch Zugabe von konz. wäss-rigem Ammoniak auf 9,0 gestellt, die Lösung, wie in Beispiel 1 beschrieben, durch Ultrafiltration entsalzt. Höhermolekulare Anteile wurden durch Chromatographie an einer Sephadex®G-50-Säule (2,5 x 100 cm) mit 0,1 m Ammoniak-Lösung abgetrennt. Nach dem Gefriertrocknen wurde der Rückstand in 10 ml 0,1 m wässrigem Ammoniak gelöst und mit 0,1 m Essigsäure auf pH 6,8 gestellt. Die klare Lösung wurde nun, wie in Beispiel 1 angegeben, auf eine SP-Sephadex®C-25-Säule (2,5 x 70 cm) aufgetragen und zunächst mit 500 ml 0,05 m Ammoniumacetatlösung pH 6,8 eluiert, gefolgt von 500 ml 0,5 m Ammoniumacetatlösung pH 6,8 und schliesslich 200 ml 0,1 m wässrigem Ammoniak. Das Elutionsprofil ist mit dem nach Beispiel 1 erhaltenen vergleichbar. Die Ausbeuten und spektroskopischen Daten sind für die einzelnen Fraktionen in Tab. 11 wiedergegeben. Die Hemmspektren sind aus den Tabellen 3-6 ersichtlich.
Beispiel 3
2 g BPTI wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, desami-niert. Nach dem Einengen der Reaktionslösung durch Ultrafiltrieren wurde das Retentat an einer Biogel-P-2-Säule mit 0,1 m wässrigem Ammoniak als Elutionsmittel entsalzt. Der Gefriertrocknungsrückstand wurde zum Abtrennen von höhermolekularen Reaktionsprodukten (ca. 5%) mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel an Sephadex®G-50 Chromatographien. Man erhielt 1,6-1,72 g Substanz (80-85%).
Beispiel 4
500 mg BPTI wurden in 200 ml 0,25 m Essigsäure, die zugleich 8 m an Harnstoff war, mit Natriumnitrit, wie in Beispiel 2 beschrieben, umgesetzt. Nach 20 Std. Reaktionsdauer wurde das Reaktionsgemisch durch Ultrafiltrieren auf 30 ml eingeengt und das Retentat zum Abtrennen des Harnstoffs an einer Sephadex®G-10-Säule (2,5 x 150 cm) mit 0,1 m wässrigem Ammoniak als Elutionsmittel gelfiltriert. Die unmittelbar nach dem Ausschlussvolumen eluierte Fraktion wurde lyophilisiert und anschliessend an Sephadex®G-50 mit 0,2 m Essigsäure als Elutionsmittel chromatographiert.
Nach dem Gefriertrocknen wurden aus der ersten Fraktion 40 mg (8%) höhermolekulare Anteile und aus der zweiten Fraktion 392 mg (79%) einer farblosen Substanz erhalten.
Tabelle 10
Fraktionierung des nach Beispiel 1 dargestellten Desamino-
BPTI-Gemisches an SP-Sephadex® C-25 (vgl. Abb. 6)
Fraktions-Nr. Bezeichnung Menge (mg) E 280 nm
425 nm
21-30 Ä 224 5~53
31-40 B 73 8,57
41-52 C 37 6,15
53-63 D 87 4,61
75-105 E 67 16,60
106-140 F . 12 13,25
Tabelle 11
Fraktionierimg des nach Beispiel 2 dargestellten Desamino-BPTI-Gemisches an SP-Sephadex® C-25
Fraktions-Nr. Bezeichnung Menge (mg) E 280 nm
425
19-27 A 7 9,0
28-42 B 22 13,3
43-48 C 177 17,4
49-51 D 44 21,2
52-59 E 9 15,5
113-127 F 185 22,1
Beispiel 5
500 mg BPTI wurden in einem Gemisch von 195 ml Wasser und 5,7 g Trifluoressigsäure in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise mit Natriumnitrit umgesetzt. Nach dem Zutropfen der Nitritlösung war der pH-Wert von 1,65 auf 3,43 angestiegen. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Std. bei +4 °C gerührt und der pH-Wert vor dem Einengen mit konz. Ammoniaklösung auf 8,8 gestellt. Die eingeengte Lösung wurde über Sephadex®G-10 entsalzt. Anschliessend wurden höhermolekulare Anteile durch Chromatographie an Sephadex®G-50 abgetrennt. Durch Lyophilisieren der Hauptfraktion wurden 360 mg (72%) Rückstand erhalten. '
Beispiel 6
500 mg BPTI wurden analog der Beschreibung von Beispiel 4 in 200 ml 0,25 m Essigsäure, die zugleich 3 m an Gua-nidin-hydrochlorid war, umgesetzt. Dabei stieg der pH-Wert der Lösung von 2,86 über 3,86 auf 3,96 an. Nach dem üblichen Aufarbeiten erhielt man 320 mg Lyophilisat (64%).
Beispiel 7
200 mg BPTI (30,8 jiMol) wurden, wie in Beispiel 2 angegeben, in 90 ml 0,25 m Essigsäure gelöst und unter Rühren und Überleiten von Stickstoff bei 4 °C mit 4,7 ml Isoamylni-trit (40 mMol) tropfenweise versetzt. Nach 20 Std. erfolgte die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Die Ausbeute an Lyophilisat betrug 168 mg (84%).
Beispiel 8
200 mg BPTI (30,8 jxMol) wurden analog zu der in Beispiel 2 wiedergegebenen Vorschrift in 90 ml 0,5 m Natrium-acetatpuffer, pH 5,5 gelöst. In N2-Atmosphäre unter gutem Rühren trug man bei +4 °C 5,1 g Nitrosylschwefelsäure (40 mMol) in Abständen von 10 Min. in insgesamt 4 Anteilen ein. Man rührte weitere 5 Std. bei +4°C und stellte durch Zugabe von konz. Ammoniumhydroxidlösung den pH-Wert des Reaktionsgemisches (1,25) auf 9,8. Die Aufarbeitung erfolgte wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Die Ausbeute an Lyophilisat betrug 158 mg (79%).
Beispiel 9
200 mg BPTI (30,8 1.1M0I) wurden in einem Gemisch von 72 ml absol. Dimethylsulfoxid, 8 ml Wasser und 1,35 ml Eisessig gelöst. Man kühlte die Lösung auf +4 °C und fügte im Verlaufe von 30 Min. unter gutem magnetischem Rühren und Einleiten von Stickstoff eine Lösung von 2,75 g Natriumnitrit (40 fiMol) in 16 ml Dimethylsulfoxid und 4 ml Wasser zu. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Std. bei +4 °C gerührt. Man trennte das Dimethylsulfoxid und die Salze durch Gelfiltration des Reaktionsgemisches über s
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Sephadex®G-10 (Säule 5 x 100 cm) mit 0,1 m Ammonium-hydroxid-Lösung als Elutionsmittel ab. Die Protein enthaltende Fraktion wurde gefriergetrocknet. An Sephadex®G-50 mit 0,1 m wässrigem Ammoniak als Elutionsmittel erhielt man aus der Hauptfraktion 108 mg Rückstand (54%). Der Quotient der UV-Extinktionen bei 285 nm und 425 nm betrug für dieses Präparat 1,72. Daraus folgt, dass 2 Tyrosinreste im Molekül des Derivates nitriert sind.
Beispiel 10
500 mg BPTI (77 fiMol) wurden in 200 ml einer 0,5 m Natriumnitritlösung gelöst. Bei +4 °C wurde unter Durchleiten von Stickstoff und gutem magnetischem Rühren mit 2 n Salzsäure der pH-Wert der Lösung auf 3,5 eingestellt und über 24 Std. konstant gehalten. Danach wurde der pH-Wert durch Zugabe von konzentrierter Ammoniumhy-droxidlösung auf 8,8 gestellt und das Volumen der Reaktionslösung durch Ultrafiltration über ein UM-2-Filter auf ca. 20 ml eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde durch Gelfiltration über Sephadex®G-10 entsalzt. Nach dem Gefriertrocknen der Protein enthaltenden Eluate wurde der Rückstand mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel an Se-phadex G-50 chromatographiert. Aus der Hauptfraktion wurden durch Gefriertrocknen 390 mg (78%) Substanz isoliert. Weiterhin wurden 48 mg (ca. 10%) höhermolekulare Anteile erhalten.
Beispiel 11
500 mg BPTI (77 (iMol) wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, in 200 ml 0,25 m Essigsäure gelöst. Nach Zusatz von 282 mg Phenol (3 m Mol) zu der Lösung wurden bei 4 °C unter Rühren und Durchleiten von Stickstoff 50 ml einer 2 m Natriumnitritlösung im Verlaufe von 2 Std. zugetropft. Dabei färbte sich die Reaktionslösung gelb. Man hielt das Gemisch 17 Std. bei +4 °C und stellte den pH-Wert der Lösung dann mit konz. Ammoniumhydroxidlösung auf 8,5. Dabei färbte sich die intensiv gelbe Lösung rotbraun. Das Reaktionsgemisch wurde durch Ultrafiltration in der üblichen Weise auf ein Volumen von ca. 50 ml eingeengt und das Retentat auf eine Sephadex®-G-10-Säule (5 x 100 cm) aufgetragen. Man eluierte zum Abtrennen der Salze und der vom Phenol abgeleiteten Nebenprodukte mit 0,1 m Ammoniumhydroxidlösung. Das beim Gefriertrocknen der unmittelbar nach dem Ausschlussvolumen eluierten proteinhal-tigen Fraktionen erhaltene Lyophilisat wurde nun in 0,1 m Essigsäure gelöst und zum Abtrennen der höhermolekularen Anteile an Sephadex®G-50 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel rechromatographiert. Aus der Hauptfraktion wurden 335 mg (67%) Lyophilisat erhalten.
Beispiel 12
200 mg BPTI wurden, wie in Beispiel 8 beschrieben, in 100 ml Im Natriumacetatpuffer, pH 5,3, mit 5,1 g Nitrosyl-schwefelsäure (40 mMol) in 4 Anteilen versetzt. Dabei fiel der pH-Wert über 4,0,2,9 schliesslich auf 1,7. Nach 10 Minuten stellte man den pH-Wert der Lösung auf 3,25 und rührte 20 Std. bei +4 °C. Dann versetzte man das Reaktionsgemisch mit Ammoniak bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 8,5 und entsalzte die Lösung über Sephadex® G-10 mit 0,1 m Ammoniumhydroxidlösung als Laufmittel. Die nach dem Gefriertrocknen erhaltene Substanz wurde zum Abtrennen der polymeren Anteile an Sephadex®G-50 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel chromatographiert. Die Hauptfraktion lieferte beim Gefriertrocknen 166 mg (83%) Substanz.
Beispiel 13
200 mg Mononitro-BPTI [erhalten nach B. Meloun, I. Fric und F. Sorm, Europ. J. Biochemistry 4, 112 (1968)] wurden in 80 ml 0,25 m Essigsäure gelöst und bei +4 °C unter Stickstoff mit 20 ml einer 2 m wässrigen Lösung von Natriumnitrit, wie in Beispiel 2 beschrieben, umgesetzt und nach 20stündigem Rühren bei +4 °C, wie ebenfalls in Beispiel 2 beschrieben, aufgearbeitet. Nach dem Gefriertrocknen des entsalzten und an Sephadex®G-50 chromatographisch gereinigten Reaktionsproduktes wurden 150 mg eines gelblichen Lyophilisats erhalten (75%).
Beispiel 14
500 mg Dinitro-BPTI (erhalten nach den in Beispiel 12 angegebenen Autoren) wurden in 200 ml 0,25 m Essigsäure gelöst und bei +4 °C im Stickstoffstrom mit 50 ml 2 m Natriumnitritlösung im Verlaufe einer Stunde versetzt. Die Reaktionslösung wurde 24 Std. bei +4°C gerührt. Dabei fielen feste Anteile aus, die durch Einstellen des pH-Wertes auf 9,2 mit Ammoniumhydroxidlösung vollständig gelöst wurden. Nach dem Einengen der Lösung durch Ultrafiltration wurde das Retentat durch Gelfiltration über Biogel P-2 entsalzt. Höhermolekulare Anteile wurden durch Chromatographie an Sephadex®G-50 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel abgetrennt. Nach dem Lyophilisieren wurden 470 mg einer gelben Substanz (94%) erhalten.
Beispiel 15
430 mg nach Beispiel 14 erhaltenes Desamino-dinitro-BPTI-Derivat wurden in 8 ml 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochloridpuffer, pH 7,5 gelöst. Zu dieser Lösung fügte man unter gutem Rühren bei +4 °C in 2 Anteilen im Abstand von 10 Minuten 300 mg Natriumdithionit. Nach weiteren 10 Min. wurde das Reaktionsgemisch durch Gelfiltration über Sephadex®G-10 entsalzt und die Proteinfraktion durch Gefriertrocknen isoliert. Man löste die Substanz in 10 ml 0,1 m Essigsäure und chromatographierte die Lösung an Sephadex®G-50. Aus der Hauptfraktion wurden durch Lyophilisation 320 mg (75%) farblose Substanz erhalten. Weitere 50 mg höhermolekulare Anteile fielen aus einer Protein enthaltenden Vorfraktion an (12%).
Beispiel 16
500 mg BPTI wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, in 200 ml 0,25 m Essigsäure gelöst. Man fügte 2,95 g Acetamid (50 mMol) zu der Lösung und tropfte bei +4 °C 50 ml einer 2 m Natriumnitritlösung zu. Nach 20stündigem Rühren bei +4 °C wurde der pH-Wert der Reaktionslösung mit wässrigem Ammoniak auf 9,0 gestellt und das Volumen durch Ultrafiltration auf 50 ml vermindert. Man entsalzte das Retentat durch Gelfiltration an Sephadex®G-10 mit 0,1 m wässrigem Ammoniak als Elutionsmittel. Das aus der Protein enthaltenden Fraktion gewonnene Lyophilisat wurde in 0,1 m Essigsäure gelöst und an Sephadex®G-50 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel chromatographiert. Durch Lyophilisieren wurde neben 35 mg (7%) höhermolekularen Anteilen eine Hauptfraktion von 418 mg (84%) erhalten.
Beispiel 17
200 mg BPTI wurden in 100 ml 0,25 m Essigsäure gelöst und nach Zugabe von 1,51 g Dimethylanilin (12,5 mMol) zu der Lösung, wie in Beispiel 11 beschrieben, mit Natriumnitritlösung umgesetzt. Nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 8,5 mit konz. wässrigem Ammoniak wurde das Reaktionsgemisch durch Filtration über Sephadex®G-10 entsalzt. Die nach Gefriertrocknung der Protein enthaltenden Fraktion isolierte Substanz wurde in 0,1 m Essigsäure gelöst und die Lösung an Sephadex®G-50 mit 0,1 m Essigsäure als Elu-
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Beispiel 18
27 mg (0,31 mMol) 5-Aminotetrazol-(l,H) [J. Thiele, I-iebigs Ann. Chem. 270,1 (1892)] wurden in 5 ml 1 m Salzsäure gelöst. Diese Lösung wurde bei +4 °C unter magnetischem Rühren mit 25 mg (0,35 mMol) festem Natriumnitrit versetzt. Nach lOminütigem Rühren wurde eine geringe Menge Harnstoff zugefügt. Nach weiteren 10 Min. setzte man 4 ml eiskalte Natronlauge (I m) zu. Die so erhaltene Lösung wurde unter gutem Rühren zu einer Lösung von 1 g BPTI (0,154 mMol) in 10 ml 1 m Kaliumhydrogenkarbonat-Natriumkarbonat-Puffer, pH 9,4, gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Min. bei +4 °C gerührt, mit einer geringen Menge Phenol versetzt und schliesslich mit Eisessig auf einen pH-Wert von 5,5 gebracht. Die leicht gefärbte Lösung wurde durch Gelfiltration über eine Sephadex®G-10-Säule (2,2 x 90 cm) mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel entsalzt. Nach dem Lyophilisieren der Protein enthaltenden Fraktionen wurden 110 mg höhermolekulare Beimengungen durch Chromatographie an Sephadex®G-50 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel abgetrennt (11%). Beim Gefriertrocknen der Hauptfraktion wurden 660 mg Rückstand (~ 66%) erhalten. Das Absorptionsspektrum (von 250-600 nm) ist in Abb. 1 wiedergegeben; die Hemmwerte sind den Tabellen 3 bis 6 zu entnehmen.
Beispiel 19
Aus 27 mg Aminotetrazol wurde, wie in Beispiel 18 beschrieben, in 5 ml 1 m Salzsäure mit einer Lösung von 25 mg Natriumnitrit in 0,3 ml Wasser das Diazoniumsalz dargestellt und überschüssiges Nitrit durch Umsetzung mit 15 mg Harnstoff zerstört. Die Lösung des Diazoniumsalzes wurde mit einer Lösung von 1 g BPTI in 10 ml Wasser vereinigt. Man versetzte unter gutem Kühlen mit 4n Natronlauge bis zum Erreichen von pH-Wert 4,5 und rührte das Gemisch 45 Min. unter Kühlung. Dann wurde mit Essigsäure versetzt und nach Beispiel 18 die Lösung an Sephadex®G 10 entsalzt und chromatographiert. Man erhielt schliesslich 856 mg Substanz (86%).
Beispiel 20
Analog zu Beispiel 16 wurden 143 mg (1,7 mMol) 2-Ami-no-l,3,4-triazol in 15 ml 1 m HCl mit einer Lösung von 127 mg Natriumnitrit (1,85 mMol) in 2 ml Wasser diazotiert. Die so erhaltene Lösung wurde, wie in Beispiel 18 angegeben, mit Harnstoff und Natronlauge versetzt und anschliessend mit der Lösung von 1 g (0,154 mMol) BPTI in 10 ml 1 m Natriumkarbonat-Kaliumhydrogenkarbonat-Puffer pH 9,5 vereinigt. Nach Zusatz einer geringen Menge Phenol wurde die Reaktionslösung durch Gelfiltration über Sephadex®G-10 entsalzt und das Eluat nach dem Lyophilisieren mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel an Sephadex®G-50 chromatographiert, wie bereits in Beispiel 18 beschrieben. Es wurden 60 mg (6%) höhermolekulare Anteile und aus der Hauptfraktion 810 mg (81%) Substanz erhalten.
Beispiel 21
5,4 mg (64 |xMól) 5-Aminotetrazol-(l,H) wurden in 1 ml 1 m Salzsäure bei +4 °C mit 5 mg Natriumnitrit (70 fiMol) diazotiert. Das gebildete Diazoniumsalz wurde nach dem Umsetzen des überschüssigen Nitrits mit einer geringen Menge Amidosulfonsäure mit 100 mg (15,4 jiMol) Mononi-tro-BPTI (vgl. Beispiel 13) in 10 ml 1 m Natriumkarbonatlösung bei pH 10,0 15 Min. gerührt. Schliesslich wurde eine geringe Menge Phenol zugegeben. Nach Entsalzen der Lösung durch Gelfiltration an Sephadex®G-10 mit 0,1 m Ammoniumhydroxidlösung als Elutionsmittel wurde das lyophilisierte Eluat an Sephadex®G-50 chromatographiert. Es wurden 10 mg (10%) höhermolekulare Anteile und aus der Hauptfraktion 68 mg (68%) gelbe Substanz erhalten.
Beispiel 22
27 mg (0,31 mMol) 5-Aminotetrazol-(l,H) wurden, wie in Beispiel 18 angegeben, diazotiert. Die Diazoniumsalz-lösung wurde mit einer geringen Menge Amidosulfonsäure versetzt und mit konz. Natronlauge auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt. Die so erhaltene Lösung wurde bei +4 °C mit einer Lösung von 500 mg Dinitro-BPTI (vgl. Beispiel 14) in 15 ml 1 m Natriumkarbonatpuffer pH 9,0 vereinigt. Nach 15 Min. Rühren bei +4 °C wurde die Reaktionslösung durch Gelfiltration an Sephadex®G-10 (2,9 x 100 cm Säule) entsalzt, nachdem zuvor eine geringe Menge Phenol zum Umsetzen des überschüssigen Diazoniumsalzes zugesetzt worden war. Das gefriergetrocknete Eluat wurde an Sephadex®G-50 mit 0,1 m Essigsäure als Elutionsmittel chromatographiert. Es wurden 25 mg (5%) höhermolekulare Anteile und aus der Hauptfraktion 396 mg (79%) Substanz erhalten.
Beispiel 23
500 mg partiell desamidiertes BPTI, erhalten durch 20tägiges Stehenlassen von BPTI in 2n Salzsäure (2 g/ 100 ml) bei 20 °C und unter Stickstoff wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, in essigsaurer Lösung mit Natriumnitritlösung versetzt und 24 Std. bei +4 °C umgesetzt. Dann wurde das Reaktionsgemisch, wie in Beispiel 2 angegeben, auf ein Volumen von ca. 100 ml eingeengt und durch Filtration über Sephadex®G-10 entsalzt mit 0,1 m wässrigem Ammoniak als Elutionsmittel. Die durch Gefriertrocknen der Protein enthaltenden Fraktionen gewonnene Substanz wurde in 0,1 m Essigsäure zum Abtrennen höhermolekularer Anteile (ca. 36 mg=ca. 7%) an Sephadex®G-50 chromatographiert. Beim Lyophilisieren der Hauptfraktion erhielt man 372 mg Substanz (74%).
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S
3 Blatt Zeichnungen
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung von neuen Desamino-Deri-vaten des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors (BPTI) aus Rinderorganen, deren Tyrosinreste 10 und/oder 21 in ortho-Stellung zur phenolischen Hydroxylgruppe gegebenenfalls Nitro- und/oder Nitrosogruppen tragen oder Desamidoderi-vaten des BPTI und welche neben den inhibitorischen Wirkungen des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors (BPTI) zusätzlich noch eine Elastasehemmung aufweisen und welche im Molekül 0 bis 3 Lysinreste und/oder 3 bis 6 Argininreste und/oder 2 bis 4 Tyrosinreste enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass man den Kallikrein-Trypsin-Inhibitor aus Rinderorganen (BPTI), ein Nitroderivat des BPTI oder ein Desamidoderivat des BPTI in saurer Lösung bei pH 2 bis 7 mit einer salpetrigen Säure bzw. Nitrosylionen liefernden Verbindung in wässriger Lösung bei Temperaturen zwischen —20 und +30 °C umsetzt und die bei der Umsetzung in saurer Lösung erhaltenen Reaktionsprodukte fraktioniert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in Gegenwart nucleophiler Reagenzien umsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung unter Schutzgas-Atmosphäre durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung unter Evakuierung durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung in wässriger Lösung im Gemisch mit organischen Lösungsmitteln durchführt.
6. Verfahren zur Herstellung von neuen Desamino-Deri-vaten des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderorganen, deren Tyrosinreste 10 und/oder 21 in ortho-Stellung zur phenolischen Hydroylgruppe gegebenenfalls Nitrogruppen tragen oder Desamidoderivate des BPTI und welche neben den inhibitorischen Wirkungen des Kallikrein-Trypsin-Inhibi-tors (BPTI) zusätzlich noch eine Elastasehemmung aufweisen und welche im Molekül 0 bis 3 Lysinreste und/oder 3 bis 6 Argininreste und/oder 2 bis 4 Tyrosinreste enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass man den Kallikrein-Trypsin-Inhibitor aus Rinderorganen (BPTI), ein Nitroderivat des BPTI oder ein Desamidoderivat des BPTI bei pH 1 bis 12 mit Diazonium-Verbindungen bei Temperaturen zwischen —20 und +30 °C umsetzt und die bei der Umsetzung in alkalischer Lösung erhaltenen Reaktionsprodukte fraktioniert.
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