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Neue Derivate des BPTI, Verfahren zu ihrer Herstellung
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und ihre Verwendung als Arzneimittel Die vorliegende Erfindung betrifft
neue Derivate des Trypsin-Kallikrein-Inhibitors aus Rinderorganen, im folgenden
BPTI genannt (basic pancreatic trypsin inhibitor /Kunitz/), die dadurch erhalten
werden, daß man an allen Carboxylgruppen Aminoacyl- bzw. Peptidyl-Reste tragende
Derivate von BPTI mit diazotierten carbocyclischen oder heterocyclischen aromatischen
Aminen an den Tyrosinresten 10 und/oder 21 zu Azoverbindungen kuppelt.
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Die als Ausgangsderivate verwendeten BPTI-Derivate, bei denen die
Carboxylreste des nativen BPTI substituiert sind, werden erhalten durch Umsetzen
von BPTI oder BPTI-Derivaten, deren 5 primäre Aminogruppen intermediär mit unter
schonenden Bedingungen abspaltbaren Schutzgruppen, vorzugsweise dem tert. Butyloxycarbonylrest
(BOC-Rest), blockiert sind, mit den entsprechenden
Aminosäure- bzw.
Peptid-Derivaten und Carbodiimiden in Gegenwart von Kondensationsvermittlern, wie
N-Hydroxysuccinimid oder N-Hydroxybenztriazol und anschließende Abspaltung der Schutzgruppen
durch Acidolyse (Deutsche Offenlegungsschrift 2 344 886 sowie US-PS 3 953 417 und
US-PS 3 992 529).
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Außer BPTI können auch folgende Derivate des BPTI für die Herstellung
der Carboxyl-modifizierten BPTI-Derivate verwendet werden: 1. Derivate des BPTI,
die partiell oder vollständig desamidiert sind, (erhältlich z.B. durch längeres
Stehenlassen von BPTI in 2N Salzsäure) 2. Derivate des BPTI, deren Tyrosinreste
10 oder 21 in ortho-Stellung zur phenolischen Hydroxylgruppe eine Nitrogruppe tragen,
(erhältlich z.B. nach B. Meloun, I. Fric u. F. Sorm, Europ. 1. Biochemistry 4, (1968)),
oder deren Tyrosinreste 10 und/oder 21 eine Aminogruppe tragen.
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2.1. Derivate nach 2., die zusätzlich partiell oder vollständig desamidiert
sein können.
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Für die Herstellung der als Ausgangsverbindungen für die Desami.nierungs-
bzw. Kupplungsreaktionen verwendeten Carboxyl-modifizierten BPTI-Derivate können
neben dem Boc-Rest auch andere aus der Peptidchemie bekannte leicht einfiihrbare
und nach den Umsetzungen wieder abspaltbare Aminschutzgruppen verwendet werden.
Besonders geeignet sind Schiffsche
Basen, die durch Umsetzen von
BPTI mit ß-Dicarbonylverbindungen, wie z.B. Acetylaceton, Acetessigester und o-Hydroxybenzaldehyd
/E.Dane und Mitarbeiter, Angew.Chem.
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74, 874 (1962); J.C.Sheehan und V.G.Grenda, J.Amer.chem.
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Soc. 84, 2417 (1962)/ orXenzaldehyd /M.Bergmann, H.
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Eunslin und L.Zervas, Ber. dtsch. chem. Ges. 53, 1043 (1925)/ in alkalischer
wässriger Lösung vorzugsweise in Gegenwart von tert. Aminenl erhalten werden.
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Als Aminoacyl- bzw. Peptidyl-Reste liefernde Verbindungen eignen sich
insbesondere Derivate der Aminocarbonsäuren, z.B. die Ester- vorzugsweise die tert.-Butylester-,
sowie die Nitrile und Amide, die gegebenenfalls substituiert sein können, sowie
geschützte Oligopeptidderivate. Es kommen insbesondere solche Oligopeptide in Betracht,
die Asparaginsäure und/oder Glutaminsäure in Peptid- und/oder Isopeptidbindung enthalten.
Die hier genannten Aminosäurederivate können aus den optisch aktiven Aminosäuren
oder aus ihren Racematen hergestellt werden.
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Erfindungsgemäße Azoderivate von an allen Carboxylgruppen modifizierten
BPTI-Derivaten werden erhalten, wenn man Derivate des BPTI oder die aus ihnen durch
Des aminierung erhaltenen Derivate, bei denen alle Carboxylgruppen durch Aminoacyl
oder Peptidylrçste substituiert sind, sofern sie noch wenigstens einen unveränderten
Tyrosinrest in Position lo oder 21 enthalten, mit den Diazoniumserbindungen von
carbocyclischen oder heterocyclischen Aromaten, die ggf. noch weitere Substituenten
tragen, zu Azoverbindungen kuppelt.
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Die Kupplungen werden durchgeführt in wässrigen Lösungen, die ggf.
auch organische Lösungsmittel, wie beispielsweise Pyridin, Chinolin, Dimethylformamid,
Dimethylaulfoxid oder Bexamethylphosphorsäuretriamid und/oder Zusätze, wie Salze,
beispielsweise Guanidinhydrochlorid oder Lithiumchlorid und/oder Nichtelektrolyte,
wie Harnstoff enthalten können.
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Je nach der Reaktivität der Diazoniumverbindungen erfolgen die Umsetzungen
bei pH-Werten zwischen 1 und 12, vorzugsweise zwischen pH 5 und lo. Während der
Kupplungsreaktionen hält man die Temperatur der Reaktionsgemische bei -15°C bis
3o0C, vorzugsweise zwischen 80C und lose.
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Geeignete carbocyclische und heterocyolische aromatische Amine fUr
die Herstellung der Diazoniumverbindungen die für die Kupplung mit den carboxylsubstituierten
BPTI-Derivaten eingesetzt werden können, sind insbesondere Derivate des Anilins,
wie z.B. Alkyl-, Alkoxy-, Cyano-Trifluormethylaniline, die Halogenderivate sowie
heterocyolische oder aroT matische Substituenten tragende Aniline. Weiterhin seten
die Aminobenzol-carbonsäuren -sulfonsäuren,' -arsonsäuren aufgeführt. Als mehrkernige
aromatische Amine sind besonders a- und p-Naphthylamin, die ggf. substituiert sein
können, genannt. Geeignete Heteroaromaten sind beispiels weise das 3-Amino-1,2,4-triazol,
oder das 5-Aminotetrazol.
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Die Diazotierung der Amine wird nach den üblichen Verfahren /R.Putter,
in "Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie", Band lo/3, S. 1 ff, Hrag. E.MUller
unter Mitwirkung von 0, Bayer, H.Meerwein und K.Ziegler, Georg Thieme Verlag Stuttgart
1965/ durchgeführt.
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In den erfindungsgemäßen carboxylsubstituierten Azo-BPTI-
Derivaten
können die Tyrosinreste 10 und/oder 21 in orthostellung zur phenolischen Carboxylgruppe
über eine Azobrücke gebundene carbocyclische oder heterocyclische aromatische Reste
mit ggf. weiteren Substituenten tragen. Als Substituenten kommen in Frage: Alkyl
(C1-C5), Halogen, Alkoxy (C1-C5), CF3, Cyano, Sulfo, Carboxy und Arsonyl oder heterocyclische
Reste. Statt einer Azogruppe kann aber einer der beiden Tyrosinreste 10 oder 21
auch eine Nitro-oder Aminogruppe tragen.
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Die Kupplungsreaktionen mit den carboxylmodifizierten BP2I-Derivaten
fUhren erfahrungsgemäss auch zur Modifizierung einiger Aminogruppen. Die Reaktionen
an den Aminogruppen lassen sich verhindern, wenn man die Aminogruppen der BPTI-Derivate
vor der Kupplung reversibel blockiert und die Schutzgruppen nach der Kupplung wieder
abspaltet. Zum intermediären Schutz der Aminogruppen eignet sich insbesondere die
Citraconylierung mit Citraconsäureanhydrid /H.B.F.
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Dixon und R.N.Perham, Biochem.J. lo9, 312 (1968)/. Weiterhin sind
auch andere Reagentien, wie z.B. die Anhydride von Maleinsäure und 2,3-iimethylmaleinsäure
oder Tetrafluorbernsteinsäure für die vortbergehende Blockierung der Aminogruppen
von BPTI brauchbar.
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Erfahrungsgemäss können carboxylmodifizierten Azo-BPTI-Derivate auch
dadurch erhalten werden, dass man in den carboxylmodifizierten Mono- bzw. Dinitro-BPTI-Derivaten
die Nitrogruppen nach an sich bekannten Verfahren /M.Sokolovsky, J.F. Riordan und
B.L.Vallee, Biochem.Biophys.Res.Commun.
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27, 20 (1967)/ z.B. mit Natriumdithionit reduktiv in Aminogruppen
überführt
und die Aminotyrosyl-BPTI-Derivate nach dem üblichen bereits beschriebenen Verfahren
diazotiert und die Mono- bzw. Bisdiazonium-Derivate von BPTI mit ggf.
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substituierten Phenolen oder aromatischen Aminen, insbesondere tert.Aminen
oder Heteroaromaten, wie beispielsweise Imidazol oder Pyrazolonen, die ggf. substituiert
sein können, kuppelt.
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Bei der Kupplung der carboxylmodifizierten BPTI-Derivate mit den Diazoniumverbindungen
werden z.T. Gemische verschiedener Komponenten erhalten. Die Zusammensetzung dieser
Azo-BPTI-Derivat-Gemische kann durch die Umsetzungsbedingungen, insbesondere den
pH-Wert der Reaktionsgemische, das Verhältnis von BPTI-Derivat zu Diazoniumverbindung
und Zusätze zur Reaktionslösung gesteuert werden. Falls Reaktionsgemische entstehen,
können diese nach an sich bekannten Verfahren, z.B. durch Ionenaustauschchromatographie,
aufgetrennt werden. Erfindungsgemässe carboxylmodifizierte Azo-BPII-Derivate, die
noch aliphatische Aminogruppen enthalten, können nachträglich entweder guanyliert,
amidiniert, carbamoyliert oder acyliert oder alkyliert werden.
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Es ist bereits bekannt geworden, dass BPTI /H.Kraut, E.K.
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Frey, E.Werle, Z.Physiol.Chem. 189, 97 (1930)/, auch als Kunitz-Inhibitor
bezeichnet /M.Kunitz, R.H.Northrop, J.Gen.
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Physiol. 19, 991 (1936)/, eine Reihe von physiologisch bedeutsamen
Enzymen, wie z.B. Kininogenine (Kininogenasen), Plasmin, Chymotrypsin und Trypsin
hemmt (E.Werle in W.Brendel, G.L.Haberland: Neue Aspekte der Trasylol-Therapie 5,
9, F.K.Schattauer-Verlag Stuttgart-New York 1972; H.Fritz, H.Tschesche, L.J.Greene,
E.Truscheit (Hrsg.): Proteinase Inhibitors (Bayer Symposium V), Proc.2nd International
Research
Conference, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York
1974). BPTI wird als Aprotinin (generic name) zur Therapie und Prophylaxe von Schockzuständen
sowie zur Prophylaxe postoperativer und posttraumatischer Komplikationen eingesetzt.
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Die erfindungsgemässen BPTI-Derivate sind Proteaseninhibitoren; sie
hemmen nicht nur wie BPTI Chymotrypsin, Plasmin, Trypsin, Kathepsin G, das chymotrypsinartige
Enzym aus Granulozyten und Kininogenine (Kininogenasen), sondern z.T. zusätzlich
auch Elastasen, z.B. aus Pankreas oder Granulozyten. Weiterhin wirken sie in tierexperimentellen
Modellen entzündungshemmend. Sie sind erfindungsgemäss verwendbar als Arzneimittel
zur Therapie von Erkrankungen, die ausgeldst werden entweder durch eine Uberproduktion
von Proteasen infolge einer erhöhten Freisetzung aus den Zymogenen bzw. einer Ausechtittung
beim Zellzerfall oder aber durch einen Mangel bzw. ein Fehlen von natürlichen körpereigenen
Inhibitoren dieser Enzyme in Organen und Gewebeflassigke ten. Erkrankungen mit derartiger
Ätiologie sind die verschiedenen Formen des Schocks und posttraumatische oder postoperative
Komplikationen, Störungen der Blutgerinnung, akute und chronische Entzündungsreaktionen,
insbesondere auch chronische Entztindungsreaktionen mit nekrotischen und degenerativen
Bindegewebsschädieungen, wie Pankreatitis sowie durch Immunkomplexe bedingte Vasculitiden,
Glomerulonephritiden, rheumatoide Arthritis und andere Collagenosen sowie durch
stoffwechselbedingte Ablagerungen verursachte
Arthritiden (Gicht),
aber auch degenerative Veränderungen der elastischen Elemente von Gefässwänden (Atherosklerose)
oder der Lunge (Lungenemphysem).
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Zum Teil hemmen die erfindungsgemssen BPTI-Derivate im Gegensatz zu
BPII alastasen aus Pankreas und Granulozyten. Gegenüber anderen Proteasen, wie Chymotrypsin,
Pankreas-Kallikrein, Plasma-Kallikrein, Plasmin, Kathepsin G und Trypsin unterscheiden
sich die Hemmspektren einzelner Derivate oualitativ und/oder quantitativ von dem
des BPTI. Bei der Elastasehemmung handelt es sich nicht um die von J.PU.tter und
G.Schmidt-Kastner, Biochem.Biophys.Acta 127, 538 (1966) beschriebene Blockierung
des Substrats, die nur bei sehr hohen HPTI-Eonzentrationen erfolgt, sondern um eine
Hemmung des Enzyms. Diese Elastase-Hemmwirkung ist umso Uberraschender, als aus
dem derzeitigen Stand der Technik folgt /D.05.
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Blow, C.S.Wright, D.Kukla, A.Rtihlmann, W.Steigemann, J.Deisenhofer
und A.Jones in H.Fritz, H.Tschesche, L.J.Greene, S.ruscheit (Hrsg.), Proteinase
Inhibitors (Bayer Symposium V), Proc.2nd International Research Conference, S. 484,
Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York 1974/, dass BPTI substratartig mit seinem
aktiven Zentrum (Iysin-15-Rest) in die Spezifitätstasche der hemmbaren Enzyme eingelagert
wird und damit die Enzymaktivität blockiert. Selbst wenn die Seitenkette des Lysin-15-Restes
bei einigen erfindungsgemässen Derivaten desaminiert ist, ist nach dem derzeitigen
Wissensstand nicht zu erwarten, dass sie in die relativ kleine Spezifitätstasche
der Elastasen (D.Shotton in H.Fritz und H.
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Tschesche (Hrsg.), Proceedings of the International Research Conference
on Proteinase Inhibitors, S. 47, Walter de Gruyter Berlin-New York 1971) hineinpasst.
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Die erfindungsgemässen BPTI-Derivate sind neu. Sie lassen sich durch
chemische, physikalisch-chemische, biochemische sowie biologische Eigenschaften
charakterisieren und gegenüber bekannten Substanzen abgrenzen. Es wurden folgende
Kriterien herangezogen:
1. Aminosäure zu sammensetzung Die Aminosäurezusammensetzung
wurde nach S.Moore, D.H.
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Spackman , W.H.Stein, Anal.Chem. Do, 1185 (1958) bestimmt.
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Die Gehalte charakteristischer Aminosäuren sind für die einzelnen
Carboxyl-modifizierten BPTI-Derivate in den betreffenden Beispielen angegeben. Aus
den Werten ist ersichtlich, wie sich der Gehalt dieser Aminosäuren nach einer Kupplungs-
oder Desaminierungsreaktion verändert hat.
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2. Elektrophoretische Eigenschaften Cellogelektrophoresen Für die
Cellogelektrophoresen wurden 2,5 cm breite Celluloseacetatstreifen der Fa. Serva
unter den üblichen Bedingungen /J.Kohn, Cellulose Acetate Electrophoresis and Immuno-Diffusion
Techniques in I.Smith, Chromatographic and Electrophoretic Techniques, Vol. II,
W.Heinemann, Ltd., London and Interscience Publishers 56-9o (1960); Gelman Procedures,
Techniques, and Apparatus for Electrophoresis, Gelman Instrument Company (1968)/
verwendet. Als Puffersystem wurde eine ol m 5,5-Diäthylbarbitur säurelösung pH 8,6
verwendet. Die Trennungen wurden bei 150 V mit einer Stromstärke von 0,8 mA/cm Streifenbreite
durchgeftihrt, wobei man stets zum Vergleich BPTI als Standard mitlaufen liess.
Zum Anfärben der Streifen wurde eine Lösung von 5 g Amidoschwarz in einer Mischung
von 9oo ml Methanol und loo ml Eisessig verwendet.
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Disc-Elektrophoresen: Die Disc-Elektrophoresen wurden in einem 15
%igen Trenngel mit 0,03 m Imidazol-Puffer pH 7,1 als Anodenpuffer und o,o3 m E-Aminocapronsäure,
o,ol m Imidazol-Puffer vom gleichen pH-Wert als gathodenpuffer durchgeführt. Die
Stromstärke betrug 2,5 mA pro Röhrchen; die Trennung wurde beendet, sobald der Markerfarbstoff
(Methylgrün) vollständig durch das Gel hindurchgewandert war. Nach
der
Trennung wurden die Gele in einer o,l %igen Lösung von Amidoschwarz in 7 zeiger
Essigsäure 30 Min. lang gefärbt.
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Überschüssiger Farbstoff wurde anschliessend mit 7 zeiger Essigsäure
wieder entfernt.
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In den Beispielen ist als relative elektrophoretische Beweglichkeit
jeweils der Quotient aus der Wanderungsstrecke des betreffenden BPTI-Derivates und
der Wanderungsstrecke des BPTI angegeben. Das Vorzeichen gibt die Wanderungsrichtung
an. Negatives Vorzeichen bedeutet also kathodische Beweglichkeit.
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3. Absorptionsspektren Zur weiteren Charakterisierung der erfindungsgemässen
BPTI-Derivate eignen sich besonders bei den Azo- und/oder Nitrogruppen enthaltenden
Verbindungen die Absorptionsspektren.
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Charakteristische Daten sind für einige Derivate in den betreffenden
Beispielen angegeben.
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4. Proteasen-Inhibitionsspektren a) Elastase-Inhibition a) Pankreas-Elastase-Inhibition
Für die Hemmversuche mit den erfindungsgemässen BPTI-Derivaten wurde kristallisierte
Pankreas-Elastase (Schwein) der Fa. Nutritional Biochemicals Corp. verwendet. Als
Substrat wurde Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-p-nitroanilid /J.Bieth, B.Spiess
und C.G.
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Wermuth, Biochem.Med. 11, 350 (1974)/ verwendet. Das synthetische
Peptidsubstrat ermöglicht eine einfache colorimetrische Bestimmung der im Test eingesetzten
Enzymaktivität. Der Elastase-Einsatz betrug ca. 0,5 nkat (vgl. Enzyme Nomenclature,
Recommendations /1972/ of the International Union of Pure and Applied Chemistry
and the International Union of Biochemieltry A973/
Elsevier Amsterdam-New
Kork, S. 26-27) pro Test. Die Hydrolyse wurde durch kontinuierliche Messung der
Extinktion des freigesetzten p-Nitroanilins bei 41c flin bestimmt. Die Hemmwerte
(ausgedrückt in % Hemmung) wurden ermittelt, indem man die nach Inhibitorzusatz
gemessene Elastase-Restaktivität von der Aktivität der Enzymkontrolle substrahierte.
Die Hemmwerte einiger erfindunggemässer BPTI-Derivate sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
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ß) Granulozyten-Elastase-Inhibition Das für die Hemmteste verwendete
Isoenzymgemisch wurde nach t.Ohlsson und I.Olsson /Europ.J.Biochem. 42, 519 (1974)/
aus Humangranulozyten gewonnen. Als Substrat ist besonders Succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-p-nitroanilid
/J.Bieth, B.Spiess und C.G.Wermuth, Biochem.Ned. 11, 350 (1974)/ geeignet. Die Hemmwerte
einiger BPXI-Derivate sind in Tsbelle 1 aufgenommen; der Enzym-Einsatz betrug o,25
nkat pro Test. Die Hemmwerte sind Absolutwerte und nicht auf BPTI bezogen.
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Sie wurden ermittelt, wie für Pankreas-Elastase angegeben.
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b) Chymotrynsin-Inhibition Bei der Bestimmung der Aktivität von Chymotrypsin
diente Succinyl-L-phenylalanin-ß-naphthylester in einem 0,25 m Trispuffer pH 7,2,
der 5 mM an Calciumchlorid war, als Substrat. Das bei der Spaltung gebildete ß-Naphthol
wurde photometrisch bei 329 nm bestimmt.
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2 mg kristallisiertes a-Chymotrypsin wurden in 6 ml o,ool Salzsäure,
die 5 mM an Calciumchlorid war, gelöst und o,5 ml dieser Lösung mit o,25 m Trispuffer
pH 7,2 (s.o.)
auf lo ml aufgefüllt. 50 µl der so erhaltenen Enzymlösung
fügte man zu 2,35 ml des o,25 m Trispuffers und versetzte diese Lösung für die Enzymkontrolle
mit loo pl Wasser, für den Inhibitionstest Jedoch mit loo pl einer BPTI-Derivatlösung
mit bekanntem Gehalt. Nach gutem Durchmischen und einer Äquilibrierphase von 15
Min.
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oder ggf. auch ohne Vorinkubation setzte man 25 µl der Substratlösung
zu. Die Substratlösung wurde hergestellt durch Lösen von 39,1 mg Succinyl-L-phenylalanin-ßnaphthylester
in 1 ml Dimethylsulfoxid. Die durch den Inhibitor bewirkte prozentuale Hemmung errechnet
sich nach der folgenden Gleichung: ################ # 100 = % Hemmung wobei die
optische Dichte um den durch Spontanhydrolyse des Naphthylesters bedingten ß-Naphthol-Anteil
korrigiert wurde.
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Die in der Tabelle 1 für einige BPTI-Derivate angegebenen Hemmwerte
sind auf die durch die gleiche Menge BPTI bewirkte Hemmung (= loo ) bezogen.
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c) Kathepsin G-Inhibition Das Enzym wurde nach einem kombinierten
Verfahren nach J.R.Baugh und J.Travis /Biochemistry 15, 836 (1976)/ und nach W.Schmidt
und K.Havemann /Z.Physiol.Chem. 355, 1077 (1974)/ isoliert. Die Bestimmung der Aktivität
erfolgte, wie für Chymotrypsin beschrieben, mit Succinyl-1-phenylalanin-ß-naphthylester
als Substrat in einem o,25 m Trispuffer pH 7,2, der o,ol % BriilR und o,oo5 Mol/l
Magneetumchlorid
enthielt. Der Enzym-Einsatz betrug o,25 nkat
pro Test. Die Berechnung aer prozentualen Hemmung wurde, wie unter a) beschrieben,
durchgeführt.
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d) Kininogenasen-Inhibition a) Plasma-EininoSenasen-Inhibition Die
Kininogenasen-Aktivität wurde nach der Deutschen Offenlegungsschrift 25 27 932 vom
22.1.76, Erfinder L.G.Svendsen, Pentapharm AG, Basel, mit Benzoyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-arginin-p-nitroanilid
als Substrat bestimmt mit einem Einsatz von o,l nkat Enzym Je Test. Das Gemisch
der Isoenzyme wurde nach C.Sampsio et al. /Arch.Biochem.Biophys. 165, 133 (1974)/
durch Affinitätschromatographie aus der Ruman-Plasmafraktion Cohn IV-1 isoliert.
Die in Tabelle 1 für einige BPTI-Derivate aufgeführten Hemmwerte wurden, wie unter
Chymotrypsin-Inhibition angegeben, ermittelt.
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ß) Pankreas-Kininogenase-Inhibition Das Testenzym wurde nach C.Kutzbach
und G.Schmidt-Kastner /Z.Physiol.Chem. 353, 1o99 (1972)/ erhalten, und die Aktivitätsbestimmungen
wurden nach denselben Autoren (s.o.) durchgeführt. Der Enzym-Einsatz betrug lo nkat
pro Test. Die in Tabelle 1 für einige BPTI-Derivate aufgeführten Hemmwerte wurden,
wie unter Chymotrypsin-Inhibition angegeben, ermittelt.
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e) Plasmin-Inhibition Die enzymatische Aktivität von Plasmin wurde
mit Azokasein bestimmt. Als Enzym wurde mit Urokinase aktiviertes Plasminogen benutzt,
das mittels Affinitätschromatographie /D.G.Deutsch, B.T.Merz, J.Med. 3, 224 (1972)/
aus Humanplasma gewonnen wurde.
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Die Herstellung des Substrates und das Prinzip des Testes sind in
der Arbeit von P.M. Starkey, A.J.Barrett, Biochem.
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J. 155, 255 (1976) beschrieben. Man bereitet für Jede Bestimmung zwei
Ansätze A und B mit Je o,6 CU Plasmin, gelöst in l,o ml Puffer (o,l m Xris-(hydroxymethyl)-aminomethan,
o,o5 M NaCl, eingestellt auf pH 7,2 mit HCl). Beide Ansätze erhalten Je 1,25 µg)
BPTI bzw. BPTI-Derivat, gelöst in 1,25 ml Puffer (s.o.); zum Vergleich dient Je
ein Ansatz A und B mit 1,25 ml Puffer anstelle des Inhibitors. Man inkubiert alle
Ansätze lo Min. bei 37°C und gibt darauf Je o,45 ml einer 2 zeigen Azokaseinlösung
(in Puffer, s.o.) zu. Serie A versetzt man direkt danach mit o,3 ml 30 %iger Trichloressigsäurelösun4
(TCA); Serie B wird 60 Min. bei 370C inkubiert und darauf mit o,3 ml TOA versetzt.
Die Ansätze werden nach ca. 20 Min. zentrifugiert; die Extinktionen der Überstände
werden photometrisch bei 340 nm in einer 1 cm-Ktivette bestimmt. Als Mass der enzymatischen
Aktivität gilt die Extinktionsdifferenz der parallelen Ansätze A und B (#E).
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Bezeichnet man die Extinktionsdifferenz, die von Plasmin allein hervorgerufen
wird, mit # #E100 und die in Gegenwart von Inhibitoren gemessene Extinktionsdifferenz
mit OE, 80 ergibt sich die Hemmung des Plamins durch die Inhibitoren unter den angegebenen
Bedingungen durch den folgenden Ausdruck
Die in Tabelle 1 für einige BPTI-Derivate aufgeführten Hemmwerte (auagedrUckt in
%) werden auf die durch die gleiche Menge BPTI bewirkte Hemmung (# loo %) bezogen.
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f) Trypsin-Inhibition Die Bestimmung von trypsin wurde mit Benzoyl-L-argininäthylester-hydrochlorid
als Substrat im pH-Stat-Verfahren nach R.Ruyssen (Symposium on Pharmaceutical Enzymes
and their Assay, Universitaire Pers, Ghent, Belgium 1969, S. llo) durchgefUhrt.
Die in Tabelle 1 für einige BPTI-Derivate aufgeführten Hemmwerte wurden, wie unter
Chymotrypsin-Inhlbition angegeben, ermittelt.
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Tabelle 1: Hemmung einiger Serinproteasen durch BPTI-Derivate BPTI-Derivat
Enzym erhalten nach Chymo- Kathep- Elastase Elastase Kalli- Kalli- Plasmin Trypsin
trypsin sin G (Pankr.) (Gran.) krein krein (Pankr.) (Plasm.) BPTI 100 20 0 0 100
100 100 100 C.2. 83 0 0 14 66 61 97 100 C.3. 22 30 18 23 43 40 79 98 C.4. 136 16
25 8 0 97 93 98 C.5. 104 40 0 29 95 94 100 100 C.6. 207 14 11 16 35 52 29 56 C.7.
65 33 0 27 15 17 100 100 C.8. 130 1 4 29 69 38 74 96 C.9. 73 45 0 13 31 0 23 72
C.10. 35 37 0 52 23 16 74 96 C.11. 49 22 3 41 68 52 98 100 Beispiel 2 133 12 34
63 51 106 94 98 5 55 24 0 75 83 43 96 98 6 48 29 21 35 33 63 94 100 8 65 26 4 47
20 114 89 99 9 86 11 4 29 58 83 93 96
Tabelle 1: Fortsetzung BPTI-Derivat
erhalten nach Chymo- Kathep- Elastase Elastase Kalli- Kalli- Plasmin Trypsin trypsin
sin G (Pankr.) (Gran.) krein krein (Pankr.) (Plasm.) Beispiel 10 66 9 17 18 80 22
89 4 11 24 19 21 14 0 12 56 42 12 43 0 0 27 19 74 93 96 13 6 24 12 25 38 30 56 66
14 2 0 37 37 26 8 24 14 15 0 0 0 27 0 42 13 38 16 98 0 67 48 5 10 87 98 17 80 29
69 43 11 9 0 4 18 31 0 0 18 8 32 10 82 19 31 21 0 36 5 13 19 22 20 10 20 35 32 33
22 17 38 Für Chymotrypsin, die Kallikreine, Plasmin und Trypsin sind die angegebenen
Hemmwerte bezogen auf die durch die gleiche Menge BPTI bewirkte Hemmung (100 #).
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Die BPTI-Menge in Hemmtest wurde so gewählt, dass der Absolutwert
der Hemmung 50 # 10 % betrug. Bei den Elastasen enthält die Tabelle Absolutwerte:
für Kathepsin G wurden mit BPTI 20 % Hemmung gefunden. Der Einsatz je Test betrug
26 µg BPTI bzw. BPTI-Derivat.
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Versuchsanordnung zum Nachweis entzündungshemmender Wirkung bei der
Ratte a) Kaolin-induzierte Entzündungsreaktion Die Entzündungsreaktion wird durch
intraplantare Injektion von o,l ml einer lo zeigen Kaolinsuspension (Bolus weiss,
fein gepulvert, Merck AG, Darmstadt) in eine Hinterpfote von 130-160 g schweren
Wistarratten induziert.
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Die für die Behandlung der Entzündungsreaktion verwendeten erfindungsgemässen
BPTI-Derivate sowie BPTI werden in o,9 zeiger Natriumchloridlösung in einer Konzentration
von 10-20 mg/ml gelöst. Die Behandlung der Versuchstiere erfolgt durch intraperitoneale,
intramuskuläre, subkutane oder intravenöse Injektion von o,5-l,o ml Lösung von BPTI-Derivaten
und zum Vergleich BPTI entweder prophylaktisch, d.h. vor Setzen der Enzündungsoxe,
oder therapeutisch, d.h. nach Setzen der Enzündungsnoxe. Die Schwellung der entzündeten
Pfote, die ein Mass für die Schwere der Entzündungsreaktion ist, wird mit dem Antiphlogmeter
nach Kemper /F.Kemper und G.Ameln, Z.ges.exp.Med.
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131, 4c7-411 (1959)/ zeitlich verfolgt. Zur Ermittlung der Dosis-Wirkungsbeziehungen
wird der 4 Std. nach Setzen der Entzündungsnoxe gemessene Wert verwendet. Das Ergebnis
des Vergleichs verschiedener BPTI-Derivate mit BPTI zeigt, dass sie dem BPTI in
ihrer entzündungshemmenden Wirkung überlegen sind.
-
b) Aerosil-induzierte Entzündungsreaktion Die Entzündungsreaktion
wird durch intraplantare Injektion von o,l ml einer 2 %igen Aerosilsuspension (Aerosil
200, Degussa AG, Frankfurt) in eine Hinterpfote von 130-16c g schweren Wistarratten
induziert. Die für die Behandlung der Entzündungsreaktion verwendeten erfindungsgemässen
BPTI-Derivate bzw. BPTI werden in o,9 %iger Natriumchloridlösung
in
einer Konzentration von 10-20 mg/ml gelöst. Die Behandlung der Versuchstiere erfolgt
durch intraperitoneale, subkutane oder intravenöse Injektion von o,5-l,o ml Lösung
von BPTI-Derivaten und zum Vergleich BPTI 15 Std. nach Setzen der Entzündungsnoxe
Die Schwellung der entzilndeten Pfote, die ein Masts für die Schwere der Entzündungsreaktion
ist, wird mit dem Antiphlogmeter nach Kemper zeitlich verfolgt. Zur Ermittlung der
Dosis-Wirkungsbeziehungen wird der 21-Stundenwert nach Entzündungsinduktion (= 6
Std. nach Injektion der erfindungsgemässen BPTI-Derivate bzw. des BPTI) ermittelt.
-
Das Ergebnis der Therapieversuche mit den erfindungsgemäßen BPTI-Derivaten
zeigt die Wirksamkeit der verwendeten BPTI-Derivate in diesem experimentellen Modell,
in dem BPTI in gleicher Dosierung die hntsUndungsreaktion nicht hemmt. Damit ist
die Überlegenheit der BEDI-Derivate als Arzneimittel gegenüber dem BPTI nachgewiesen.
-
Die erfindungsgemässen BPTI-Derivate sind dem BPTI als Arzneimittel
überlegen. Von besonderem Vorteil sind ihre inhibitorischen Wirkungen auf die Elastasen
aus Pankreas und Granulozyten, die neue therapeutische Einsatzmöglichkeiten eröffnen.
Pankreas-Elastase spielt eine wichtige Rolle bei der Pankreatitis /M.C.Geokas, H.Rinderknecht,
V.Swanson, B.P.Vitron und B.J. Haverback, Clin.Res. 16, 285 (1968)1; Serum-Elastase
bei der Atherosklerose /U.Butturini und N.
-
Langen, Klin.Wochenschr. 40, 472 (1962)/ und Granulozyten-Elastase
bei akuten und chronischen Entzündungen mit Bindegewebsschädigung /A.janoff, Amer.J.Pathol.
68, 579 (1972)/ bei Gefässwandschädigungen /A.Janoff und J.D.Zeligs, Science 161ç
7s2 (1968)/, bei nekrotisierenden Erkrankungen und
Degeneration
von Lungengewebe, z.B. beim Emphysem /G.M.Turino, R.M.Senior, B.D.Garg, S.Keller,
M.M.Levi und I.Mandl, Science 165, 709 (1969); H.E.Evans, M.M.Levi und I.Mandl,
Amer.Rev.Respir.Dis. lol, 359 (1970)'sowie A.Janoff, R.A.
-
Sandhaus, V.D.Hospelhorn und R.Rosenberg, Proc.Soc.Exptl.
-
Biol.Med. 140, 516 (1972)/. Ebenso wichtig ist die Rolle von lysosomalen
Enzymen und insbesondere der Granulozyten-Elastase bei immunologisch bedingten Entztindungsreaktionen
/M.Koono, M.Muto und H.Hayashi, Tohoku J.Exptl.Med. 94, 231 (1968)/, z.B. der rheumatoiden
Arthritis /G.Weissmann und J.Spilberg, Arthritis Rheumat. 11, 162 (1968).
-
Es wurde gefunden, dass die erfindungsgemässen BPTI-Derivate in Modellen
der akuten Entzündungsreaktion dem BPTI überlegen sind, da mit ihnen nicht nur in
deutlich geringeren Dosierungen die gleiche Wirkung wie mit BPTI erreicht wird,
sondern die Entzttndungsreaktion auch dann signifikant gehemmt wird, wenn sie mehrere
Stunden nach Setzen der Entzündungsnoxe verabreicht werden. Eine solche therapeutische
Wirkung ist mit BPTI im Baolin- und Aerosilmodell bei einmaliger Gabe nicht zu erreichen.
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Diese im Vergleich zu BPTI veränderte Wirkung und Wirksamkeit der
erfindungsgemässen BPTI-Derivate sind auf das veränderte Hemmspektrum und andere
veränderte Eigenschaften, wie grössere Verweildauer und Wirkungszeit im Körper der
Versuchstiere, zurückzuführen. Die erfindungsgemässen BPTI-Derivate sind deshalb
biologisch deutlich vom BPTI abzugrenzen.
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Die neuen erfindungsgemässen BPTI-Derivate des BPTI können aufgrund
ihrer biologischen Wirksamkeit insbesondere zur.
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Behandlung folgender Krankheiten bzw. Krankheitserscheinungen eingesetzt
werden:
1. Verschiedene Formen des Schocks, posttraumatischer und
postoperativer Komplikationen 2. Störungen der Blutgerinnun$ 3. Akute und chronische
Entzündungsreaktionen, insbesondere zur Therapie und Prophylaxe von Organschädigungen,
wie beispielsweise Pankreatitis und Strahlen-induzierte Enteritis 4. Imrnunkomplex-bedingte
Entzündungareaktionen, wie Immun-Vasculitis, Glomerulonephritis und Arthritiden
5. Kollagenosen, insbesondere rheumatoide Arthritis 6. durch Stoffwechsel-bedingte
Ablagerungen verursachte Arthritiden (z.B. Gicht) 7. Degeneration der elastischen
Bestandteile der Bindegewebsbestandteile von Organen wie bei der Atherosklerose
und Bungenemphysem.
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Die neuen Wirkstoffe können in bekannter Weise (analog BPRI) in die
üblichen Formulierungen überführt werden.
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Folgende Formulierungen sind dabei bevorzugt zu nennen: 1. Lösungen
für parenterale Anwendung zur i.v.-, i.m.-, s.c.-Injektion, zur intraartikulären
und intratumoralen InJektion 2. Lösungen für intravenöse Dauerinfusion 3. Lösungen
zur Anwendung als Aerosole zur Inhalation 4. Lösungen, Emulsionen, Salben, Pasten,
Cremes, Lotions, Puder zur äusserlichen lokalen Anwendung 5. Kombination verschiedener
Hemmstoffe, deren Wirkungsspektrum sich gegenseitig ergänzt.
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Die Konzentrationen der neuen Wirkstoffe in den erfindungsgemEssen
Formulierungen bewegen sich in den Grenzen o,ol bis loo mg/ml Lösung, vorzugsweise
zwischen o,l und lo mg/ml Lösung.
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Die neuen Wirkstoffe können in üblicher Weise angewendet werden, insbesondere
sind folgende Anwendungsmethoden als bevorzugt zu nennen: 1. parenteral, intravenös,
intramuskulär, subkutan, intraartikulär, intratumoral 2. lokal; als Aerosol 3. oral,
evtl. in magensaftresistenten Anwendungsformen und/oder dünndarmlslich Als Dosierungsbereich
kann für die neuen erfindungsgemässen Verbindungen angegeben werden: 0,1-40 mg Wirkstoff/kg
Körpergewicht, vorzugsweise 1-25 mg Wlrkstoff/kg Körpergewicht, die Dosierung ist
dabei vor allem abhängig von der zu behandelnden Spezies eowie von der Applikationsart.
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Die erfindungsgemässen neuen Wirkstoffe können bei Mensch und Tier
eingesetzt werden.
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I. Synthese der als Ausgangsmaterialien verwendeten Substanzen A.
Nucleonhile Aminoverbindungen 1) #-tert.Butyloxycarbonyl-L-lysinamid a) α-Carboxybenzoxy-#-tert.butyloxycarbonyl-L-ly
sinamid Zu einer Lösung von 17 g (30 mMol) a-Carbobenzoxy-#-tert.butyloxycarbonyl-L-lysin-dicyclohexyl
ammoniumsalz /E.Schnabel, Liebigs Ann.Chem. 674, 218 (1964)/ in 130 ml absol. Dimethylformamid
tropfte man bei -50C unter gutem Rühren 2,85 ml Chlorameisensäureäthylester (30
mMol). 15 Min.
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nachdem das Eintropfen beendet war, versetzte man das Reaktionsgemisch
mit 20 ml einer lo n methanolischen Ammoniaklösung und rührt die
Reaktionslösung
30 Min. bei OOC und weitere 2 Std. bei 22°C. Dann wurde das ausgefallene Dicyclohexylammoniumchlorid
durch Abfiltrieren abgetrennt und das Filtrat i.Vak. eingeengt.
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Die Lösung des Rückstandes in 250 ml Essigester extrahierte man mit
Je 50 ml 2 n Schwefelsäure, 5 proz. wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und
Wasser und destillierte den Essigester i.Vak.
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ab. Durch Umkristallisieren aus Acetonitril erhielt man 9,4 g (82
%) farblose Substanz. Schmp.
-
142-143°C [α]57820 = +3,60 (c = 1, in Dimethylformamid) Ber.f.
C19H29N3O5 (379,4) C 60, 1 H 7,7 N 11,1 Gef. 60,3 7,6 11,3 b) #-tert.Butyloxycarbonyl-L-lysinamid
9 g (24 mMol) der unter A.l.a. beschriebenen Carbobenzopy-Verbindung wurden in loo
ml Äthanol gelöst. Zu der Lösung fügte man aus o,5 g Palladiumchlorid frisch bereiteten
Palladiummohr und liess unter guten Durchmischen einen langsamen Wasserstoffstrom
durch die Suspension perlen. Nach 5 Std. wurde der Katalysator durch Abfiltrieren
abgetrennt. Nach dem Abdestillieren des Alkohols i.Vak. blieben farblose Kristalle
zurück Sie schmolzen nach dem Umkristallisieren aus Acetonitril und aus Äthylacetat-Petroläther
bei 99-100°C; Rp SBA+ o,42; Ausbeute 5 g (86 %) [α]57820 s +15,40 (c 3 1,
in Eisessig) Ber.f. C11H25N3O3 (245,3) C 53,8 H 9,5 N 17,1 Gef. 53,4 9,5 17,2 +
SBA: sek.Butanol:Ameisensäure:Wasser = 75:10:15 (Vol)
2) L-Aspargyl-α,ß-di-(L-glutaminsäure-di-tert.butylester
a) Carbobenzoxy-L-asparagyl-α-ß-di-(L-glutaminsäure-di-tert.butylester) 7
g Carbobenzoxy-asparaginsäure (26 mMol) /M.
-
Bergmann und L.Zervas, Ber.dt.chem.Ges. 65, 1192 (1932)l und 13,6
g L-Glutaminsäure-di-tert.butylester (55 mMol) /G.W.Anderson und F.M.Callahan, J.Amer.Chem.Soc.
82, 3359 (1960)/ wurden unter Zusatz von 7,5 g N-Hydroxybenztriazol in 150 ml absol.Dimethylformamid
gelöst und die Lösung nach dem Abkühlen auf -5°C mit 11,3 g Dicyclohexylcarbodiimid
(55 mMol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde nach 2-tätigem Stehen bei +4°C aufgearbeitet,
wie bei A.l.a. beschrieben. Beim Versetzen der ätherischen Lösung des öligen Eindampfrückstandes
mit Petroläther wurden 12,3 g (63 %) einer farblosen amorphen Substanz erhalten.
Schmp.
-
90°C; BF CMA+ 0,88 [α]57622 = -14,9° (c = 1, in Dimethylformamid)
Ber.f. C25H59N2O12 (749,9) C 60,9 H 7,9 N 5,6 Gef. 60,7 7,8 5,6 b) katalytische
Hydrierung Aus 8,5 g der unter A.2.a. beschriebenen Carbobenzoxyverbindung wurden
analog zu A.l.b. durch katalytische Hydrierung in 250 ml absol.Äther 6,5 g farblose
sirupartige Substanz erhalten (93 %) RF SBA o,75; R SBN++ o,92 LaQ = -23,5 (c =
1, in Dimethylformamid) Ber.f. C20H52N3O1 (615,8) C 58,5 H 8,7 N 6,8 Gef. 59,3 8,3
7,6 + CMA: Chloroform:Methanol:Essigsäure = 190:10:6 (Vol) ++SEN: sek.Butanol:lo
sig.Ammoniak = 85:15 (Vol)
3) L-Asparagyl-α,ß-di-(L-serin-tert.butyläther-tert.
-
butylester a) Carbobenzoxy-L-asparagyl-α,ß-di-(L-serin-tert.
-
butyläther-tert.butylester) 7 g Carbobenzoxyasparaginsäure und 12
g 1-Serintert.butyläther-tert.butylester (55 mMol) wurden analog zu A.2.a. mit Hilfe
von Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxybenztriazol kondensiert.
-
Das Peptidderivat fiel nach dem Aufarbeiten gemäss A.2.a. sirupös
und chromatographisch uneinheitlich an. Man löste den Sirup in ca. 50 ml absol.Äther
und trug die Lösung auf eine Säule mit Kieselgel 60 (2p5 x 12 cm) auf und eluierte
diese nacheinander mit Petroläther, Petroläther-Äther (1:1) und Äther. Nach dem
Abdestillieren des Petroläthers aus dem Petroläther-Eluat wurden 13,5 g farbloses
hochviskoses Öl mit RF SBA 0,92 chromatographisch rein erhalten (89 %) Ca3§88 =
+9,60 (c = 1, in Dimethylformamid) Ber.f. C54H57N5P10 (665,8) C 61,3 H 8,3 N 6,3
Gef. 61,6 8,2 6,4 b) katalytische Hydrierung Aus 10,5 g der unter A.3.a. beschriebenen
Carbobenzoxyverbindung wurden durch katalytische Hydrierung analog zu A.l.b. eine
zunächst sirupöse, chromatographisch nicht einheitliche Substanz erhalten. Durch
Chromatographie an Kieselgel 60 wurden analog zu A.3.a. mit Petroläther 5,7 g (68
%) Substanz isoliert, die unter Äther-Petroläther kristallisierte. Schmp. 70°C RF
SBA o,65; RF SBN 0,92; RF CMA o,12 m + 3,9° (c = 1, in Dimethylformamid) Ber.f.
C26H49N5O5 (531,7) C 58,7 H 9,3 N 7,9 Gef. 58,2 9,3 7,8
B. Aminoqeschützte
BPTI-Derivate 1) Penta-Boc-BPTI a) Mit Boc-Fluorid: Eine Lösung von 3,9 g BPTI (600
µMol) in 20 ml 1 m Natriumhydrogencarbonatlösung wurde bei 4°C mit 1,2 ml Boc-Fluorid
(lo mMol) /E.Schnabel, H.Herzog, P.Hoffmann, E.
-
Klauke und I.Ugi, Liebigs Ann.Chem. 716, 175 (1968)/ versetzt. Man
hielt die Mischung unter Rühren 1 Std. bei 40C und über Nacht bei 220C.
-
Dann wurde die ausgefallene Substanz durch Abzentrifugieren isoliert.
Nach dem Waschen des Sediments mit Je lo ml Wasser, o,l m Essigsäure und nochmals
Wasser wurde der Rückstand mit 20 ml einer 1 m Triäthylammoniumchloridlösung angeteigt,
abgesaugt und nach zweimaligem Waschen mit Je 20 ml Wasser gefriergetrocknet. Das
Lyophilisat wurde mehrmals mit je lo ml Wasser gewaschen. Nach erneutem Anteigen
mit Wasser wurden beim Gefriertrocknen 4,1 g farblose Substanz (97 %) erhalten.
-
b) Mit Boc-Azid: Eine Lösung von 3,25 g (500 pMol) BPTI in 25 ml
Wasser wurde mit einer Lösung von 3,5 g Boc-Azid (25 mMol) in 50 ml Dimethylformamid
/L.A.Carpino, J.Amer.Chem.Soc. 79, 4427 (1957)/ vereinigt. Man fügte 4 n Natronlauge
zu der Mischung bis zum Erreichen von pH 10,5 und hielt unter Rühren durch weitere
Zugabe von 4 n Natronlauge mit Hilfe eines Autotitrators bei diesem pH. Nach 24
Std. wurden die Lösungsmittel i.Vak. abdestilliert. Den Rückstand verrieb man mit
o,l m Essigsäure, saugte ab und wusch, wie unter B.l.a. beschrieben. Durch Gefriertrocknen
wurden 3,1 g (88 %) farblose ninhydrinnegative Substanz erhalten.
-
c) Mit 2-Boc-Oximino-2-phenylacetonitril: Zu einer Lösung von 3,9
g BPTI (600 pMol) in einem Gemisch von 3o ml Dimethylformamid und 1,25 ml Triäthylamin
(9 mMol) fügte man unter Rühren eine Lösung von 1,5 g 2-Boc-Oximino-2-phenylacetonitril
(6 mMol) in 30 ml Dimethylformamid.
-
Nach 4 Std. wurden weitere 50 ml Dimethylformamid zum Reaktionsgemisch
gegeben. Nach 24 Std.
-
wurden die Lösungsmittel i.V. abdestilliert und der Rückstand mehrmals
unter Digerieren mit Jeweils 50 ml Essigester gewaschen. Das nach dem Anteigen mit
Wasser erhaltene Lyophilisat wurde analog zu B.l.a. gewaschen und der Rückstand
erneut gefriergetrocknet. Man erhielt 3,5 g (83 ) farblose ninhydrinnegative Substanz.
-
2) Penta-Boc-di-nitro-BPTI 650 mg (loo pMol) Di-nitro-BPTI /B.Meloun,
I.Fric F.Sorm, Europ.J.Biochem. 4, 112 (1968)/ wurden, wie für Penta-Boc-BPTI unter
B.l.c. beschrieben, mit 500 mg 2-Boc-Oximino-2-phenylacetonitril in einem Lösungsmittelgemisch
aus lo ml Wasser und lo ml Dimethylformamid unter allmählicher Zugabe von weiteren
20 ml Dimethylformamid umgesetzt und aufgearbeitet. Nach dem Waschen wurden durch
Gefriertrocknung 635 mg (91 ) gelbe Substanz isoliert.
-
3) Pent-Boc-diamino tyrosyl 10,21-BPTI 6oo mg (92uM01) durch Dithionitreduktion
analog M.Sokolovsky, J.F.Riordan und B.L.Vallee /Biochem.
-
Biophys.Res.Comm. 27, 20 (1967)/ aus Di-nitro-BPTI /B.Meloun, I.Fri!
und F.Sorm, Europ.J.Biochem. X,
112 (1968)/ dargestelltes o-Diaminotyrosyl
10'21 BPTI wurden, wie für Penta-Boc-BPTI beschrieben, in einem Gemisch aus lo ml
Wasser und 15 ml Dimethylformamid mit 1 g 2-Boc-Oximino-2-phenylaceto nitril (4
mMol) acyliert und das Boc-Derivat isoliert, wie dort beschrieben. Man erhielt 350
mg (53 %) farbloses Lyophilisat.
-
4) Penta-Boc-desamido-BP?I 1,3 g (200 µMol), durch 3-wdchiges Stehenlassen
in 2 n Salzsäure desamidiertes BPTI, wurden, wie für Penta-Boc-BPTI unter B.l.c.
beschrieben, in einer Mischung von lo ml Wasser und 30 ml Dimethylformamid sowie
28o ul Triäthylamin mit 1 g 2-Boo-Oximino-2-phenylacetonitril (4 mMol) umgesetzt
und analog aufgearbeitet. Man erhielt 950 mg farblose Substanz (73 %).
-
5) Penta-Boc-mononitro-desamido-BPTI Eine Lösung von 1,3 g (200 µMol)
Mononitro-BPTI /3.Meloun, I.Pric und F.Sorm, Europ.J.Biochem. 4, 112 (1968)/ in
loo ml 2 n Salzsäure wurde 3 Wochen bei Raumtemperatur gehalten. Dann wurde die
Lösung i.Vak. auf 20 ml eingeengt und durch Filtration über Sephadex G lo mit o,l
m Essigsäure als Elutionsmittel entsalzt. Durch Gefriertrocknen der Protein enthaltenden
Eluate wurden 1050 mg (81 %) gelbe Substanz erhalten.
-
650 mg (loo ZMol) dieser Substanz wurden, wie für B.l.c. beschrieben,
mit 500 mg 2-Boc-Oximino-2-phenylacetonitril umgesetzt und die Reaktionslösung analog
aufgearbeitet. Man erhielt nach dem Gefriertrocknen 480 mg (74 %) gelbe Substanz.
-
6) Schiff-Base aus BPTI und Acetessigsäuremethylester Zu einer Lösung
von 1,3 g BPTI (200 µMol) in einem Gemisch aus 8 ml Wasser und 700 1 Triäthylamin
(5 mMol) fügte man unter Rühren 150 µl Aceteasigsäuremethylester (1,2 mMol). Der
alsbald gebildete Niederschlag wurde nach 3-stUndiger Reaktion bei 250 und weiteren
2 Std. bei 40C abgeschleudert und das Sediment nach zweimaligem Waschen mit je 5
ml Wasser gefriergetrocknet. Man erhielt 935 mg farblose Substanz (72 %).
-
C. Carboxylmodifizierte BPTI-Derivate 1) BPTI-Penta-L-lysinamid Zu
einer Suspension von 1,4 g nach B.l.a. erhaltenem Penta-Boc-BPTI (200 ?Mol) in lo
ml absol. Dimethylformamid fügte man bei OOC 49o mg -tert.Butyloxycarbonyl-L-lysinamid
(2 mMol) und 410 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Man führte die Reaktionsmischung
5 Std. bei OOC und weitere 20 Std.
-
bei Raumtemperatur. Dann wurde das Ungelöste durch Abfiltrieren abgetrennt,
das Filtrat i.Vak. eingeengt und der Rückstand mit Äther gewaschen. Man löste die
farblose Substanz in lo ml lrifluoressigsäure und hielt die Lösung 1 Std. bei Raumtemperatur
unter einer Stickstoffatmosphäre. Die Lösung wurde in 50 ml absol. Äther eingerührt
und die aus gefallene Substanz durch Abzentrifugieren isoliert. Das Sediment löste
man in lo ml o,l m Essigsäure und filtrierte die Lösung über Sephadex G lo (150
s 2,5 cm Säule) mit o,l m Essigsäure als Elutionsmittel. Man erhielt durch Gefriertrocknen
der Protein enthaltenden Eluate 1020 mg farblose Substanz (78 ).
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: -1,72 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
8,8 Lys/Mol (BPTI: 4)
2) BPTI-Penta-L-serin a) Über Boc-BPTI Analog
zu C.l.wurden aus 2,8 g (400 Mol) nach B.l.c. erhaltenem Penta-Boc-BPTI und 870
mg (5 mMol) L-Serin-tert.butyläther-tert.butylester /H.C.Beyerman und J.S.Bontekoe,
Proc.
-
chem.Soc. 85, 201 (1963)/ in Gegenwart von 540 mg N-Hydroxybenztriazol
(4 mMol) 1853 mg farblose Substanz (70 %) erhalten. Relative elektrophoretische
Beweglichkeit: -o,98 (Cellogel) bzw.
-
-o,92 (Diskelektrophorese); Aminosäureanalyse: 5,5 Ser/Mol (BPTI:
1).
-
b) Über Schiff-Base (B.6.) von BPTI 1,4 g (200 pMol) nach 3.6. dargestelltes
BPTI-Derivat und 435 mg E-Serin-tert.butyläther-tert.
-
butylester (2 mMol) wurden in 15 ml absol. Dimethylformamid mit 412
mg DOC unter Zugabe von 270 mg N-Hydroxybenztriazol 1 Std. bei 0°C und weitere 20
Std. bei 220C umgesetzt. Dann wurde das Dimethylformamid i.Vak. abdestilliert. Den
Rückstand löste man in lo ml wasserfreier Trifluoressigsäure. Nach l-stUndigem Stehen
der Lösung unter Na-Atmosphäre bei 22°C wurde die Trifluoressigsäure i.Vak. abdestilliert
und der Eindampfrückstand mit lo ml 2 m Natriumacetatlösung versetzt. Nach Zugabe
von 700 mg Hydroxylaminhydrochlorid wurde das Gemisch 15 Std. bei 22°C geruhrt.
Dann wurden die ungelösten Anteile abzentrifugiert und das Sediment mit o,l m Essigsäure
als Elutionsmittel über Sephadex G lo filtriert. Durch Gefriertrocknung der Protein
enthaltenden Eluate wurden 1,o2 g farblose Substanz erhalten (77 ). Relative elektrophoretische
Beweglichkeit: -l,o (Cellogel) bzw. -0,98 (Diskelektrophorese); Aminosäureanalyse:
5,85 Ser/Mol (BPTI: 1).
-
3) BPTI-Penta-L-glutaminsäure Analog zu US-PS 3.953.417 wurden aus
1,4 g (200 ZMol) nach B.l.c. erhaltenem Penta-Boc-BPTI und 520 mg (2 mMol) L-Glutaminsäure-di-tert.butylester
/G.W.Anderson und F.M.Callahan, J.Amer.Chem.Soc.
-
82, 3359 (1966)/ in Gegenwart von 270 mg N-Hydroxybenztriazol (2
mMol) mit Hilfe von 412 mg (2 mMol) DCC 880 mg farblose Substanz erhalten (68 ).
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: -o,12 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
7,9 Glu/Mol (BPTI: 3) 4) BPTI-Penta-(L-leucyl-L-methioninamid) Wie unter C.2. beschrieben,
wurden 1,4 g Penta-Boc-BPTI und 860 mg (3 mMol) Leucyl-L-methioninamidhydrochlorid
/L.Bernardi, G.Bosisio, R.de Castiglione, O.Goffredo und F.Chillemi, Gazz.chim.
94, 853 (1964)/ nach Zugabe von 420 pl Triäthylamin (3 mMol) und 337 mg N-Hydroxybenztriazol
mit 515 mg DCC (2,5 mMol) umgesetzt und die Reaktionsmischung analog zu C.2. aufgearbeitet.
Man erhielt 980 mg (75 %) farblose Substanz. Relative elektrophoretische Beweglichkeit:
0 (Cellogel); Aminosäureanalyse: 5,2 Met und 7,74 Leu pro Mol (BPTI: 1 Met und 2
Leu) 5) BPTI-Penta-(L-asparagyl-di-L-glutaminsäure) a) Über Boc-BPTI Aus 1050 mg
Penta-Boc-BPTI (150 µMol) und 920 mg I-Asparagyl-a,$-di-glutaminsäure-di-tert.butylester
(1,5 mMol) wurden mit Hilfe von 310 mg DCC (1,5 mMol) und 202 mg N-Hydroxybenztriazol
(1,5 mMol) analog zu C.2. nach dem Abspalten der Schutzgruppen und dem Entsalzen
der Reaktionslösung durch Filtration
über Sephadex G lo mit 50
proz. Essigsäure 1014 mg (97 ) farblose Substanz erhalten.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: o,63 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
9,4 Asp und 12,4 Glu pro Mol (BPTI: 5 Asp bzw. 3 Glu) b) Über Schiff-Base (B.6.)
von BPTI Aus 1,4 g(?oo Mol) nach B.6. dargestelltem BPTI-Derivat wurden analog zu
4.a. mit 1 g L-Asparagyldi-(l-glutaminsäure-di-tert.butylester) (1,6 mMol) nach
der Filtration über Sephadex G lo mit 50 proz.
-
Essigsäure 1058 mg (81 %) farblose Substanz erhalten.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: +o,7o (Cellogel); Aminosäureanalyse:
9,7 Asp und 13,3 Glu pro Mol (BPTI: 5 Asp bzw. 3 Glu) 6) BPTI-Penta-(L-asparagyl-di-L-serin)
Aus 910 mg Penta-Boc-BPTI (130 µMol) und 690 mg L-Asparagyl-«,ß-di-(I-serin-tert.butyläther-tert.butylester)
(1,3 mMol) wurden analog zu C.5. mit Hilfe von 270 mg DCC und 175 mg N-Hydroxybenztriazol
(1,3 mMol) nach dem Abspalten der Schutzgruppen und Entsalzung der Reaktionslösung
durch Filtrieren über Sephadex G lo mit 50 proz. Essigsäure 725 mg farblose Substanz
erhalten. Relative elektrophoretische Beweglichkeit: -o,l (Cellogel); Aminosäureanalyse:
10,5 Asp und 10,7 Ser pro Mol (BPTI: 5 Asp bzw. 1 Ser).
-
7) Dinitro-BPTI-penta-(tri-L-glutaminsäure) Analog zu C.5. wurden
aus 300 mg (90 µMol) gemäss B.2.
-
hergestelltem Boc-Dinitro-BPTI-Derivat und 9oo mg (1,4 mMol) Tri-glutaminsäure-tetra-tert.butylester
(DOS
2344886) mit Hilfe von 280 mg DicyclohexylcarWodiimid und 190 mg N-Hydroxyvbenztriazol
215 mg (72 %) gelbes Kondensationsprodukt dargestellt.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: +1,66 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
18,9 Glu/Mol (BPTI: 3).
-
8) Diaminotyrosyl10,21-BPTI-penta-L-glutaminsäure 325 mg nach B.3.
erhaltenes Boc-BPTI-Derivat (50 µMol) und 130 mg L-Glutaminsäure-di-tert.butylester
(500 µMol) /G.W.Anderson und F.M.Callahan, J.Amer.Chem.Soc. 82, 3359 (1966)/ wurden
analog zu C.2. mit 1o3 mg DCC in Gegenwart von 7o mg N-Hydroxybenztriazol umgesetzt.
Nach Aufarbeitung der Reaktionslösung, wie bei C.5. angegebec, wurden 252 mg farblose
Substanz (78 ) erhalten.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: +o,18 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
9,11 Glu und o,95 Tyr pro Mol (BPTI: 3 Glu bzw. 4 Tyr).
-
9) Desamido-BPTI-hePta-L-Rlutaminsäure Aus 350 mg (50 µMol) nach B.4.
dargestelltem Penta-Boc-desamido-BPTI wurden analog zu C.2. durch Umsetzen mit 390
mg (1,5 mMol) L-Glutaminsäure-di-tert.
-
butylester in Gegenwart von 290 mg DCC (1,4 mMol) und 2o2 mg N-Hyxdroxybenztriazol
(1,5 mMol) nach dem Abspalten der Schutzgruppen und Entsalzung an Sephadex G lo
mit 50 proz. Essigsäure 232 mg (66 ) farbloses Kondensationsprodukt erhalten.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: +o,45 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
9,8 Glu/Mol (BPTI: 3).
-
10) Desamino-BPTI-hepta-(di-L.-glutaminsäure) Aus 400 mg (57 µMol)
nach B.4. erhaltenem Penta-Bocdesamido-BPTI wurden analog zu C.9. mit 535 mg (1,2
mMol) Di-L-glutaminsäure-tri-tert.butylester (DOS 2344886) 306 mg (76 ) farblose
Substanz gewonnen.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: +o,86 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
17,5 Glu/Mol (3PTI: 3).
-
11) Desamino-mononitro-BPTI-hepta-L-serin Aus 300 mg Nach B.5. hergestelltem
BPTI-Derivat und 375 mg Di-tert.butyl-Eserin (1,7 mMol) erhielt man, wie bei C.2.
beschrieben, mit Hilfe von N-Hydroxy benztriazol/Dicyclohe~pylcarbodiimid ein Kondensationsprodukt,
das mit 5 ml wasserfreier Trifluoressigsäure analog zu C.1. behandelt wurde. Anschliessend
wurde die Reaktiorslösung über.Sephadex G lo mit 50 proz.
-
Essigsäure als Elutionsmittel filtriert. Man erhielt 181 mg (66 ^,)
gelbe Substanz.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: O (Cellogel); Aminosäureanalyse:
8,4 Ser bzw. 2,6 Tyr pro Mol (BPTI: 1 Ser und 4 Tyr).
-
II. Herstellung von Desamino-BPTI-Ausgangsprodukten Beispiel A 325
mg nach C.3. gewonnenes BPTI-Derivat wurden mit 10 ml 2 m Natiumnitritlösung in
75 ml Sauerstoff-freier 0,5 m Essigsäure bei 4° unter Sickstoff gerührt. Man versetzte
die Reaktionslösung nach 24 Stunden mit 2,9 g Aminosulfonsäure und filtrierte sie
nach dem Einengen auf 20 ml und nach Zugabe von 20 ml Eisessig über Sephadex G 10
(3,5 x 100 cm Säule) mit 50 Proz. Essigsäure als Elutionsmittel. Nach dem Lyophilisieren
der Protein enthaltenden Eluate verblieben 210 mg gelbliche Substanz (65 %). Relative
elektrophoretische Beweglichkeit: O (Cellogel); Aminosäureanalyse: 0.5 Lys, 4.7
Arg und 7,6 Glu pro Mol (BPTI: 4 Lys, 6 Arg und 3 Glu).
-
Beispiel B 325 mg nach C.6. gewonnenes BPTI-Derivat wurden analog
Beispiel A, jedoch ohne Schutzgas während der Zugabe der Amidosulfonsäure, umgesetzt.
Man isolierte nach entsprechendem Aufarbeiten 208 mg (64 %) orangefarbene Substanz.
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: + 0,79 und + 1,21 (Doppelbande; Cellogel);
III. Synthese der erfindungsgemäßen BPTI-Derivate Beispiel 1 a) Citraconylierung:
Zu einer Lösung von 325 mg nach C.l. gewonnenem BPTI-Derivat (50 µMol) in 5 ml 0,1
m Boratpuffer fügte man bei 4 C unter Aufrechterhalten von pH 8,5 (durch Zugabe
von 4 n Natronlauge) 190 um Citraconsäureanhydrid (2mMol) und rührt das Reaktionsgemisch
1 Std. unter Eiskühlung.
-
b) Diazotierung des Amins: Man versetzte die eisgekühlte Lösung von
81 mg 3,5-Dichloranilin (500 µMol) in einer Mischung von 250 um Essigsäure und 250/ul
80 proz. Phosphorsäure unter Rühren mit einer Lösung von 40 mg Natriumnitrit (575
µMol) in 100/ul Wasser.
-
Nach 10 Min. fügte man 30 mg Harnstoff zu der Mischung und rührte
die Lösung weitere 10 Min. bei 40C.
-
c) Kupplung: Man vereinigte die Lösung des nach a) erhaltenen citraconylierten
BPTI-Derivates mit der nach b) dargestellten Diazoniumsalzlösung und stellte den
pH-Wert
der Mischung mit 4 n Natronlauge auf 8,5.
-
Man rührte die Lösung 1,5 Std. bei 4°C und nach Zugabe von 50 mg
Phenol weitere 20 Min. unter Kühlung.
-
d) Abspaltung der Citraconylgruppen: Die Kupplungsmischung wurde bis
zur völligen Lösung mit Essigsäure versetzt und konz. Salzsäure bis pH 3,5 zu der
Lösung zugegeben. Man rührte die Reaktionsmischung 16 Std. bei Zimmertemperatur
und filtrierte sie anschließend über Sephadex G 10 mit 50 proz.
-
Essigsäure als Elutionsmittel. Durch Gefriertrocknen der Protein
enthaltenen Eluate erhielt man 220 mg orangerote Substanz (68 %).
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: -0,85 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
2,25 Tyr bzw.
-
8,5 Lys pro Mol (BPTI: je 4 Tyr und Lys).
-
Elcm = 24,8 (bei 6,5 g/l 50 proz. Essigsäure) 328 Beispiel 2 490
mg (75 µMol) nach C.2.a. erhaltenes BPTIDerivat wurden analog Beispiel 1a citraconyliert.
Man vereinigte die Lösung der Citraconylverbindung mit einer Lösung der nach Beispiel
ib aus 97 mg 3,5-Dichloranilin (600 /uMol) dargestellten Diazoniumverbindung. Die
Kupplung wurde, wie bei Beispiel 1c beschrieben, durchgeführt und das Reaktionsgemisch
analog Id aufgearbeitet. Man erhielt 474 mg orangefarbene Substanz (95 %).
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: -0,85 bzw.
-
0,55 (Doppelbande, Cellogel); Aminosäureanalyse: 3,04 Tyr bzw. 5,7
Ser pro Mol (BPTI: 4 Tyr bzw. 1 Ser).
-
E3181cm = 11,7 (bei 6,5 g/1 50 proz. Essigsäure).
-
Beispiel 3 Aus 200 mg nach C.7. dargestelltem BPTI-Derivat wurden
durch Cltraconylierung und Kupplung analog Beispiel 1 nach entsprechender Aufarbeitung
102 mg (51 %) orangefarbene Substanz erhalten.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: -1,7 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
1,87 Tyr bzw. 17,8 Glu pro Mol (BPTI: 4 Tyr bzw.'3 Glu).
-
Elcm = 325 - 23,4 (bei 6,5 gIl So proz. Essigsäure) Beispiel 4 490
mg (75 Mol) nach Beispiel 3 des US-Patentes 3992529 erhaltenes BPTI-Derivat wurden
entsprechend Beispiel 1a durch Umsetzen mit 300 1 Citraoonsäureanhydrid (3,25 mMol)
citraconyliert. Man versetzte die Lösung des Citraconyl-BPTI-Derivates mit der Lösung
der aus 69 mg 3-Amino-1,2,4-triazol (830 pMol) mit 69 mg Natriumnitrit in 1 ml 2
n Salzsäure bei 4 C dargestellten Diazoniumverbindung. Die Aufarbeitung der Kupplungslösung
wurde analog Beispiel 1 durchgeführt. Man erhielt 464 mg (94 %) orangerote Substanz.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: -0,72 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
17,5 Glu sowie 3,1 Tyr pro Mol (BPTI: 3 Glu bzw. 4 Tyr).
-
Elcm cm = 18,2 (bei 6,5 g/l 50 proz. Essigsäure) 328 nm Beispiel 5
Aus 300 mg nach C.5. gewonnenem BPTI-Derivat wurden, wie in Beispiel 4, über die
Citraconylverbindung durch Kuppeln mit aus 42 mg 3-Amino-1,2,4-triazol dargestellter
Diazoniumverbindung nach entsprechender Aufarbeitung 220 mg gelborange Substanz
(73 %) erhalten.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: +o,57 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
9,5 Asp, 12,4 Glu und 3,5 Tyr pro Mol (BPTI: 5 Asp, 3 Glu und 4 Tyr) E32mo = 4,8
(bei 6,5 g/l o,l m Trispuffer pH 7,5) 32o = 4,8 (bei 6,5 gIl 0,1 m Trispuffer pH
7,5) Beispiel 6 Aus 250 mg nach C.5. dargestelltem BPTI-Derivat wurden analog Beispiel
4. nach Citraconylierung und Kuppeln mit aus 34 mg 3-Amino-1,2,4-triazol dargestellter
Diazoniumverbindung nach entsprechender Aufarbeitung 191 mg (76 ) orangerote Substanz
isoliert.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: -o,49 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
9,5 Asp, 10,4 Ser und 1.8 Tyr pro Mol (BPTI: 5 Asp, 1 Ser und 4 Tyr) E3301cm 33o
= 2o,3 (bei 6,5 gIl So proz.Essigsäure) BeisPiel 7 Durch Kuppeln von 150 mg nach
C.ll. erhaltenem BPTI-Derivat nach vorhergehender Citraconylierung wurden analog
zu Beispiel 4 85 mg orangerote Substanz (57 ) erhalten.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: +1,54 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
1,85 Tyr und 8 Ser pro Mol (BPTI: 4 Tyr bzw. 1 Ser) E3251cm = 18,1 (bei 6,5 g/l
50 proz. Esaigsäure Beispiel 8 220 mg (34 µMol) nach C.2.b. erhaltenes BPTI-Derivat
wurden wie in Beispiel 1 mit 200 µl Citraconsäureanhydrid bei pH 8,5 citraconyliert.
Zu der Lösung dieses Derivates fügte man die Lösung der aus 69 mg (300 Mol) l-(p-Aminophenyl)-3,5-dichlor-1,2,4-triazol
in einer Mischung von o,5 ml 80 proz. Phosphorsäure und 2 ml Wasser analog Beispiel
1 mit einer Lösung von 23 mg Matriumnitrit bei 4 0C hergestellten Diazoniumverbindung.
Die
Kupplung und die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches wurden
analog Beispiel 1 durchgeführt. Man erhielt 212 mg orangegelbe Substanz (97 ).
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: O (Cellogel); Aminosäureanalyse:
5,7 Ser bzw. 2,13 Tyr pro Mol (BPTI: 1 Ser bzw. 4 Tyr).
-
E3301cm nm = 42,0 (bei 6,5 g/l 5ß0 proz. Essigsäure) Beispiel 9 Analog
zu Beispiel 8 wurden aus 25o mg nach C.3. hergestelltem BPTI-Derivat durch Kuppeln
mit aus 69 mg 1-(p-Aminophenyl)-3,5-dichlor-1,2,4-triazol dargestellter Diazoniumverbindung
nach entsprechender Aufarbeitung 225 mg (9o O'o) orangefarbene Substanz erhalten.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: O (Cellogel); Aminosäureanalyse:
8,30 Glu und 1,61 Tyr pro Mol (BPTI: 3 Glu und 4 Tyr).
-
E330 1cm nm = 36,4 (bei 6,5 g/l 0,1 m Acetatpuffer pH 6) Beispiel
10 Analog zu Beispiel 8 wurden aus 215 mg ( 33,uMol) nach C.4. erhaltenem BPTI-Derivat
durch Kuppeln mit aus 30 mg 1-(p-Aminophenyl)-3,5-dichlor-1,2,4-triazol (120 µMol)
dargestellter Diazoniumverbindung und entsprechende Aufarbeitung der Reaktionslösung
152 mg (70 ) gelborange Substanz erhalten.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: O (Cellogel); Aminosäureanalyse:
5.1 Met, 6.89 Leu, 1.94 Tyr pro Mol (BPTI: 1 Met, 2 Leu und 4 Tyr).
-
E330 1cm nm = 36,0 (bei 6,5 g/l 50 üproz. Essigsäure)
Beispiel
11 Analog zu Beispiel 8 wurden aus 150 mg nach C.5.b. erhaltenem BPTI-Derivat und
diazotiertem l-(p-Aminophenyl)-3,5-dichlor-1,2,4-triazol 96 mg orangegelbe Substanz
(64 %) isoliert.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: O (Cellogel); Aminosäureanalyse:
3.48 Lys., 4,74 Arg, 9,6 Asp, 14,6 Glu pro Mol (BPTI: 4 Lys, 6 Arg, 5 Asp, 3 Glu).
-
E315 1cm nm = 12,2 (bei 6,5 g/l 50 proz. Essigsäure) Beispiel 12
Aus 130 mg nach C.6. erhaltenem BPTI-Derivat wurden analog zu Beispiel 8 nach entsprechendem
Aufarbeiten 123 mg orangefarbene Substanz (95 %) erhalten.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: O (Cellogel); Aminosäureanalyse:
4,83 Arg, 9,5 Asp, 10,5 Ser, 2,3 Tyr pro Mol (BPTI: 6 Arg, 5 Asp, 1 Ser, 4 Tyr).
-
Elcm = 11,6 (bei 6,5 g/l 0,1 m Trispuffer pH 7,8) 33o Beispiel 13
Aus 200 mg nach C.8. dargestelltem BPTI-Derivat wurden analog zu Beispiel 8 nach
analoger Aufarbeitung 128 mg (64 ) orangebraune Substanz erhalten.
-
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: +o,16 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
9.37 Glu, 0,5 Tyr proMol (BPTI: 3 Glu und 4 Tyr).
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E340 1cm nm = 18,5 (bei 6,5 g/l 50 proz. Essigsäure) Beispiel 14 Zu
einer Lösung von 300 mg Desamino-BPTI-Derivat gemäss Beispiel IIA fügte man eine
nach Beispiel 8 aus 45 mg 1-(p-Aminophenyl)-3,5-dichlor-1,2,4-triazol hergestell
te Lösung der Diazoniumverbindung und führte die Kupplung
wie
dort durch. Die Reaktionsmischung wurde nach dem Versetzen mit dem gleichen Volumen
Essigsäure an Sephadex G lo entsalzt mit 50 proz. Essigsäure als Elutionsmittel.
Man erhielt schliesslich nach dem Gefriertrocknen der Protein enthaltenden Eluate
215 mg (71 %) orangerote Substanz.
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Relative elektrophoretische Beweglichkeit: -0,95 (Cellogel); Aminosäureanalyse:0
Lys, 9,8 Asp, 10,4 Ser, 1,67 Tyr pro Mol (BPTI: 4 Lys, 5 Asp, 1 Ser, 4 Tyr) Elcm
= 7,2 (bei 6,5 g/l 50 proz. Essigsäure) 33o Beispiel 15 Eine Lösung von 11 mg 5-Aminotetrazol
in 2 ml n Salzsäure wurde bei 4 0C unter Rühren mit einer Lösung von lo mg Natriumnitrit
in 50 1 Wasser versetzt. Nach lo Min.
-
fügte man 25 mg Harnstoff zu der gut gerührten Reaktionslösung. Nach
weiteren lo Min. vereinigte man die Lösung der so erhaltenen Diazoniumverbindung
mit einer vorgekühlsten Lösung von loo mg nach C.2. dargestelltem BPTI-Derivat in
5 ml o,l m Boratpuffer. Dann stellte man den pH-Wert der Reaktionsmischung mit 8
n Natronlauge auf 8,5 und hielt den Ansatz 1 Std. unter Rühren bei 40C.
-
Nach Zugabe von lo mg Phenol versetzte man die Lösung mit dem gleichen
Volumen Eisessig und filtrierte sie zum Entsalzen über Sephadex G lo mit 50 proz.
Essigsäure als Elutionsmittel. Beim Lyophilisieren der Protein enthaltenden Fraktionen
wurden 72 mg blassgelbe Substanz erhalten (72 %).
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Relative elektrophoretische Beweglichkeit: +1,o (Cellogel); Aminosäureanalyse:
l,o Lys, 5,2 Arg, 5,4 Ser sowie 2,8 Tyr pro Mol (BPTI: je 4 Lys uns Tyr, 1 Ser sowie
6 Arg).
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E318 1cm = 7,8 (Schulter; bei 6,5 g/l 50 proz. Essigsäure)
Beispiel
16 Analog zu Beispiel 15 wurden 325 mg nach C.3. gewonnenes BPTI-Derivat (50 µMol)
mit aus 17 mg (200 µMol) 5-Aminotetrazol erhaltener Diazoniumverbindung umgesetzt.
Nach entsprechender Aufarbeitung erhielt man 245 mg (75 %) graubraune Substanz.
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Relative elektrophoretische Beweglichkeit: O (Cellogel); Aminosäureanalyse:
2,0 Lys, 4.45 Arg, 10.03 Asp, 10,93 Ser, 3.58 Tyr pro Mol (BPTI: 4 Lys, 6 Arg, 5
Asp, 1 Ser, 4 Tyr).
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E1cm = 7,3 (bei 6,5 g/l o,l m Trispuffer pH 798) Beispiel 17 loo mg
nach C.4. erhaltenes BPTI Derivat wurden analog Beispiel 15 umgesetzt und das Reaktionsgemisch
entsprechend aufgearbeitet. Man isolierte 68 mg (68 ) graue Substanz.
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Relative elektrophoretische Beweglichkeit: O (Cellogel); Aminosäureanalyse:
5.48 Met,6,65 Leu, 3,02 Tyr pro Mol (BPTI: 1 Met, 2 Leu, 4 Tyr) E312 1cm = 4,8 (Schulter;
bei 695 gIl 50 proz.Essigsäure) Beispiel 18 Analog zu Beispiel 15 wurden aus 200
mg nach C.5. erhaltenem BPTI-Derivat 132 mg (66 %) rosafarbene Substanz gewonnen0
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: #0,42 (cellogel); Aminosäureanalyse:
2,94 Lys, 11,73 Asp, 12,85 Glu und 3,96 Tyr pro Mol (BPTI: 4 Lys, 5 Asp, 3 Glu und
4 Tyr).
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E320 1cm = 7,3 (bei 6,5 g/l 50 proz. Essigsäure) Beispiel 19 Aus
105 mg BPTI-Derivat gemäss C.7. wurden analog zu Beispiel 22 75 mg(71 %) grauviolette
Substanz erhalten0
Relative elektrophoretische Beweglichkeit: +1,29
(Cellogel); Aminosäureanalyse: 1,o4 Lys, 9,37 Glu und 0,94 Tyr pro Mol (BPTI: je
4 Lys und Tyr, 3 Glu) E309 1cm = 17,4 (bei 6,5 g/l 50 proz. Essigsäure) Beispiel
20 Aus loo mg gemäss C.lo. erhaltenem BPTI-Derivat wurden analog zu Beispiel 15
65 mg (65 %) celbe Substanz erhalten.
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Relative elektrophoretische Beweglichkeit: +1,04 (Cellogel); Aminosäureanalyse:
2,74 L:rs. 5.11 Arg. 17,5 Glu und 2,16 pro Mol (BPTI: je 4 Lys und Tyr, 6 Arg sowie
3 Glu).
-
E320 1cm = 17,o (bei 6,5 g/l 50 proz. Essigsäure)