JPS6322027A - セリンプロテア−ゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、その最も広い意味において、酵素阻害剤に関
する。さらに特定丁れば、本発明はセリンプロテアーゼ
に対して阻害活性を示す新規なポリペブチ−に関するも
のである。

セリンプロテア−ぜとして知られる機構分類的に蛋白分
解酵素に属する酵素は天然に広く分布していて、動物、
微生物および昆虫において同定されている。この分類へ
の帰属は、本来、その酵素機構に基づいて行われた。そ
の後、この分類に属する＃累は、配列および構造に著し
いホモロシーを有することが明らかにされた。セリンプ
ロテアーゼは、その活性部位に、アスパラギン酸、ヒス
チジンおよびセリンからなる触媒三要索を有することで
特徴づけむれている。セリンプロテアーゼは、活性部位
のセリンがジインゾロプルフルオロホスフェートによる
不可逆的かつ共通結合的に修飾できるので、容易に同定
が可能である。

セリンプロテアーゼ阻害剤は、微生物中ならびに植物、
動物、昆虫およびその他の生物の組織および体液中に見
出されている。天然に認められるセリンプロテアーゼ阻
害剤は、通常、主としてジスルフィド結合のパターンと
反応部位配列のホモロジーに基づいていくつかの群に分
類されてきたが、常にそうとは限らない。反応部位はプ
ロテアーゼと直接相互作用する一矢配列の部分と定義さ
れる。研究の結果、大部分の阻害剤は共通の機構によっ
て阻害作用を現すことが示唆されている。

すなわち、これらの阻害剤は実際には強固に結合する貧
弱な基質で、反応部位内の特定の結合の接触的な加水分
解を経験することはきわめて稀である。しかしながら、
−が中性から著しく変化すると、反応都立ペゾチドのＶ
ａ水分解を生じろ。

セリンプロテアーゼは、その正常な生理お機能のほかに
、肺気腫、各種凝血性障害および炎症過程を言むヒトの
多くの病態に関係している。セリンプロテアーゼの触媒
活性の重要性を示す一テ４としては、ヒト好中注エラス
ターゼおよびその天然の阻害剤の１種、α−１−プロテ
アーゼ阻害剤（α−Ｐ１　　）の肺気腫の病因における
役割を挙げることができる。健康人の肺では、エラスタ
ーゼとその阻害剤のレベルの間に平衡が存在する。エラ
スターゼは結合織（エラスチン）の修復および代謝回転
に寄与し、α〜１−プロゾローゼ阻害剤はエラスターゼ
の調節およびクリアランスに関与する。エラスチン、不
均一の高度に架橋され、きわめて不爵注のポリペプチド
であり、生体内のエラスチン結合繊り主成分である。こ
のエラスターゼ／α−１−プロテナーゼ阻否削平衡の崩
壊はエラスチンの分解の増大、したがってエラスチン組
織の破壊を招来する。新しいエラスチンは台底されるが
、肺の宅育時に作られるエラスチン繊維の適当な網状組
織の形成は行われない。＋−実の崩壊が長期にｖｆ暁す
ると肺の気道の不可逆的な拡張および肺の呼吸組織に幻
する損傷、丁なわち肺気腫として知られた状態を招くこ
とになる。

この平衡の崩壊は様々な経路で生じる。その−列として
は、スカンジナビアではじめて確認された家族性の肺気
腫がある。血清α−１−プロテナーゼ阻害剤の活性型の
同型接合体遺伝子欠損を有する列では、とくに喫煙のよ
うな他の危険因子に暴露された場合、肺気腫の症状を発
症しや丁いことが明らかにされている。また他の列では
、タバコの煙の凝縮物からのオキシダントがα−１−プ
ロテナーゼ阻害剤の反応部位内におけるメチオニン残基
を酸化して、そのエラスターゼ結合親和性を著しく低下
させることが示されている。さらに、喫煙者の血清では
、非喫煙者に比べて、酸化されたα−１−プロテナーゼ
阻害剤のレベルが劇的に高いとの報告がある。結局、上
述の平衡は阻害剤の不活性化によって崩壊すると結論さ
れている。

最後に、エラスターゼのレベルの上昇と同時に、機舵注
α−１−プロテナーゼ阻害剤のレベルは低下している列
を示す。空気汚染またはタバコの煙による外米注粒状物
買に対する炎症反応が肺の多形核白血球のレベルを上昇
させる例である。これらの細胞は、蛋白分解酵素たとえ
ばエラスターゼの分泌により、プロテアーゼ／デａテア
ーゼ阻害剤平衡を破壊する。これらはミエロペルオキシ
ダーゼを言むオキシダントも分泌し、これがα−１−プ
ロテナーゼ阻害剤を酸化的に不活性化するものと考えら
れる。丁なわち、制御機構の解除によりまたはエラスタ
ーゼレベルの上昇のν期にわたるＥＮ発により生じた不
均衡が、結局、病因となる望ましくない状態、結曾賊の
傷害、ひいては肺機能の低下乞招（ことになる。

α−１−７’ロテナーゼ阻讐剤（抗トリプシン、ＡＴ）
は、分子ｔｓｉ、ｏｏｏ、アミノ酸６９４個を有する一
本鎖糖蛋白質で、ジスルフィド倫はなく、３（［５のオ
リゴザラ刀ライド脚１鎖ンモつ。ヒト血清中には、１３
０１Ｎｇ／　１００ａ＋／、２３．６　μＭ存在する。

これは容易に組織空間に拡散し、襟旧ゾロテアーゼ主と
して好中注エラスターゼと１：１の複曾体を形成する。

酪累／阻杏削複会体はついで速やかに循環から除去され
、肝臓および牌滅で異化すせる。ヒ）ＡＴは、肝臓のト
リジシン不活性化能から、はじめ抗トリプシンと命名さ
れた。

天然の哺乳類セリンプロテアーゼ阻害剤またはその関連
物質を治療剤として使用するには実際上多くの問題があ
る。天然の哺乳類セリンプロテアーゼ阻害剤は比較的大
きく、大きなポリペブチｒは小さなペゾチｒに比べて製
造や患者への投与が難しいという問題がある。天然の阻
害剤は安定化するジスルフィド僑を欠き、熱に不安定で
ある。

また、オリゴサツカライド側鎖はｉｎ　ｖｉｖｏにおけ
る阻害剤の寿命に影響することが明らかにされている。

また、適当なオリゴサツカライド側鎖を有するこれらの
阻害剤の製造は、それを治療剤として使用するに際して
別の重大な難点を提供することになる。

上述のエラスターゼに関する記述で、セリンプロテアー
ゼ活性のコントロールが有用であり、望ましい楊会の１
例を挙げたが、本発明の範囲には、それに駆足されるも
のではないが、ヒトエラスターゼの１５１１害が包含さ
れる。

本発明の目的は、その最も広い態様において、新規なセ
リンプロテアーゼ阻害剤を提供することにある。

したがって本発明は、それに駆足されるものではないが
たとえば、医学、生物学、農業および微生′ｖＪ発＃を
包含する任意の適当な分野におけるセリンプロテアーゼ
の触媒活性のコントロールに適用可能であることを認識
すべきである。

本発明のこれらのまた他の目的および利点は、以下の記
述およびその代表的な列より、本発明の技術分野におけ
る熟練者には明白であろう。

発明の説明 本発明は、標的セリンプロテアーゼに幻して阻害活性を
示す曾成ボリペゾチド、およびその製造方法を提供する
。襟的セリンゾロテアーゼは、基質ペプチドの切断都立
のアミン末端方向に隣接するアミノ酸残基に対して強い
選択性を示すものである。このようなセリンプロテアー
ゼの例としては、エラスターゼおよびカテプシンＧがあ
る。さらに詳しくは、本発明は久式 Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｏｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘ　　−工（１６）
−Ｌ１３ｕ−Ｍｅｔ−Ｌ７１ｉ１−Ｃ！７Ｓ−Ｌ７Ｅｌ
−Ｌ７１１！−Ａ８ｐ−８ｆ１１ｒ−Ａ８ｐ−０７８−
Ｌ［３ｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−０７８−Ｖａｌ−０３１”
１Ｉｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｌｓ−Ｇｌｙ−Ｔ７ｒ−Ｏ
ｙａ−Ｇｌｙ（式中Ｘは標的セリンプロテアーゼＩＣ対
する阻害活性を付与するために適応されるアミノ酸を表
りで示されろアミノ酸配列およびその相同性変異配列を
有する合成セリンプロテアーゼ阻害剤を提供する。「＠
−成」の語は、ポリペゾチＶが天然に生じる化会物では
ないことを意味する。

本発明の阻害剤は、それを全く実用的にするある種の性
質を有する。これらのペプチドの短い配列（アミノ酸残
基２９〜６２個）はその製造、とくに化学合成法による
製造を容易にする。残基総数に対して多数の半シスチン
が存在することは、ジスルフィド結合の形成による高度
の架橋を示している。手シスチンの特定のどれとどれが
対を作るのかは現時点では不明であるが、本発明のポリ
ペプチド阻害剤は以下に述べるような生物学的活性型に
容易に折り畳まれ、−投にポリペプチドや蛋白質に安定
性が付与されろ形態をとるものど考えられる。

以下の記述および特許請求の範囲に示されたポリペプチ
ド構造は丁べて、Ｎ末端におけるアミン基が左側、Ｃ末
端のカルボキシル基が右側に（ろ慣用の形式によるもの
である。とくに記載のない限り、すべてのアミノ酸はＬ
−アミノ酸である。

蛋白質中に見出され、また本発明のポリペプチド阻害剤
を構成する天然アミノ酸の命名法は次のとおりである：
アラニン（ＡＪ、ａ　：　Ａ　）　、アスパラギン（Ａ
２Ｂ：　Ｎ　）　、アスパライン酸（Ａ８Ｐ　：　Ｄ　
）、アルギニノ（Ａｒｇ　：　Ｒ）　、システィンもし
くは半シスチン（Ｏｙｓ　：　Ｃ）　、グルタミン酸（
ＧＪｕ　：　Ｅ）、グルタミニ’　（ＧＬｎ：　Ｑ　）
　、グリシン（Ｇｌｙ　：　Ｇ　）、ヒスチジン（Ｈ２
Ｓ：Ｈ）、インロイシン（工Ｊ、８；工〕、ロイシン（
Ｌｅｕ：　Ｌ　）　％　リジン（Ｌｙｓ　：　Ｋ　）　
、メチオニン（Ｍｅｔ　：　Ｍ　）　、フェニルアラ＝
　７　（Ｐｈｅ　：Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ：Ｐ）、セ
リｙ　（Ｓｅｒ　：　Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）
、トリブトファン（Ｔｒｐ：Ｗ　）　、チロシン（Ｔ７
ｒ　；　Ｙ　）　、バリ：／　（ｖａＬＳｖ）化学、生
物学、医学および技術的な用語、句、記号および命名法
はすべて生命科学の分野において使用されているものと
共通で、これらの語、句−記号および命名法は教科書お
よび科学文献原振の両者で共通に使用されてきたもので
ある。定義については、相当する主題に関する教科書ま
たは生化学命名法に関する工σｐＡｃ−工σＢ委員会の
勧告、’　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａＩＮｏｍｅｎｃｌａｔ
ｕｒｅ　ａｎｄ　ＲｅｌａｔｅｄＤｏｃｕｍｅｎｔｓ　
’　　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　５ｏｃｉｅｔｙ、
　　Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ３　２　　、　　Ｃ！ｏｍｍｅｒｃ
ｅ　　Ｗａｙ、　　０ｏｌｃｈｅｓｔｅｒ、　　Ｆｔａ
ｓｅｘ　　ＣＯ２８ＨＰ　Ｅｎｇｌａｎｄ　）を参照サ
レタイ。

本発明のポリペプチド阻害剤の列を第１表に掲げる。第
１表では、反応部位ヘプチド結合に対する残基の相対位
置を示すのに５ｃｈｅｃｔａｒとＢｅｒｇｅｒの表記法
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ１０ｐｈｙｓ、　Ｒｆ３Ｂ、　
ｃｏｍｍｕｎ、。

２７　：１５７．１９６７）を便用する。この表記法に
よれば、Ｐｌ、Ｐ２．Ｐ３・・・は反応部位結合からア
ミノ床端の方間に１残基ずつ進んでい（−連の残基を指
子。Ｐ　ｉ’、　Ｐ　２’、　Ｐ　３’・・・・につい
てもカルボキシ末端の方向に１残基ずつ進むほかは同じ
である。

本発明の阻害剤は、第２表に示すカポチャからのトリプ
シン阻害剤ファミリーと関係がある。このカポチャから
のトリプシン阻害剤ファミリーは、最近、ウリ科植物の
種子中に発見された阻害剤群である（　ｗｔｅｃｚｏｒ
ｅｋほか：　Ｂｉｏｃｈｓｍ、　Ｂ１０ｐｈｙｓ。

Ｒ１３８，ｃｏｍｍｕｎ、、　１２６　：　６４６〜６
５２　、１９８５）。

現在のところ、アミノ酸配列の決定によって７種の新し
い阻害剤が明らかにされ、そのうち６種についてはウシ
トリジシンとの金倉常数が測定されている（第２表）。

アミンおよびカルボキシ末端の延長により、カポチャか
らの天然のトリプシン阻害剤は、分子量のもつと大きい
前駆体の蛋白分解によって産生されることが明らかにさ
れている。この現象は植物起源の他のセリンプロテアー
ゼについても認められていた。これは、多くの蛋白質お
よびポリペプチドがその前駆体型においてその生物学的
活性型に畳まれや丁く、ついで小さなペプチドまたは蛋
白質に処理されることから重要である（　５ｔｅｉｎｅ
ｒはカニ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｉ、　Ｓｃ
ｉ、σＥＩＡ、　６０　：６２２〜６２９．．１９６８
）。すなわち、本発見以前には、本発明のプロテアープ
阻害剤がその成熟型から合成されるかどうかは不明であ
り、したがって、その生物学的活性を推測することはで
きなかった。

カポチャからのトリジシン阻誉剤ファミリーとの類似性
により、反応部位はＰ５からＰ５′まで（両端を宮む）
の残基からなるものと同定できる。

この帰属は正確ではないかもしれないが、正確な図解は
本発明の目的には重要ではない。むしろ、指定の反応部
位内の残基が、これらのポリペブチｒの阻害活性の親和
性および選択性の決定にある役割を果たすことが必要で
ある。これは、阻害剤の活性部位残基と、標的セリンプ
ロテアーゼの活性部位残基との間の詳細な分子相互作用
によって生じるものと考えられる。

第２ 力ざチャ種子からの 反応部位　　　　　Ｉ ＲＶＯＰＲＩＬＭＫＯＫＫＤ８ＤＯ １１！１ＺＲＶＯＰＲ工　ＬＭＫＯＫＫＤ８ＤＯＲＶＯ
ＰＲＩＬＭＫＯＫＫＤ８ＤＱ ＲＶＯＰＩＣＩＬＭＩＣＯＫＫＤＢＤＯＨ１ｌ：ｌＲＶ
ＯＰＫＩＬＭＫＯＩｃＫＤ８Ｄ。

ＭＶＱＰＫＸＬＭＫＯＫＨＤ８ＤＯ ＭＭＯＰＲＩＬＭＫＯＫＨＤ８ＤＯ カポチャからの阻害剤ファミリーのアミノ酸配列、Ｋａ
　：　トリプシンとの会合平衡定数（Ｗｉｅｃｚｏｒｅ
ｋほか：Ｂｅｓ、　　ａｏｍｍｕｎ、、　　１２６　：
　６４６−６５２．１９８５　）ＮＲ＝報告なし ｌ）ホモクジ−の比較のためにギャップを挿入トリプシ
ン阻害剤 骨　　　　格　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
　　　　ｘＡ、Ｍ−”Ｌ　Ａ　　Ｉｌｔ　　ＯＶ　　Ｏ
Ｌ　　Ｂ　Ｈ−ＩＧ　　Ｙ　　ＯＣｋ　　　６．８Ｘ１
０１１Ｌ　Ａ　ＩＩ！　ＯＶ　ＯＬ　Ｋ　Ｈ−Ｇ　Ｙ　
ＯＧ　　　５．９ＸＩＱ”Ｌ　Ａ　Ｅ　ＯＶ　ＯＬ　Ｋ
　Ｈ−Ｇ　Ｙ　ＯＧ　　　３．２Ｘ１０１１Ｌ　Ａ　Ｋ
　ＯＩ　ＯＬ　ＩＣＨ−Ｇ　Ｙ　ＯＣｋ　　　８．５Ｘ
１０１１Ｌ　Ａ　Ｉｎ　ＯＩ　ＯＴ、＋　Ｋ　Ｈ−Ｇ　
Ｙ　ＯＧ　　　１．３Ｘ１０”Ｌ　ＩＪ　Ｄ　ＯＶ　Ｏ
Ｌ　Ｋ　Ｄ　ｘ　　ａ　Ｙ　ｃ　Ｇ　　　９．５Ｘ１０
１１ＬＰＧＯＶＯＬｍＨ工　ＩＹＯＧＮＲ Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ１０ｐｈ７Ｂ。

ポリペゾチド阻害剤は、Ｐ１位置に適当なアミノ酸残基
な挿入することにより、標的セリンプロテアーゼに対す
る阻害活性を生じさせることができる。たとえば、エラ
スターゼ阻害剤を調製するのに適当なＰ１アミノ酸には
、これらに限定されるものではないが、インロイシン、
ロイシン、ノルロイシン（Ｈｌｅ　）、バリン、ノルバ
リン（Ｎｖａ）、メチオニン、フェニルアラニンおよび
アラニンが包含されろ。

基質および阻害剤のＰ１位置におけるアミノ酸の種類に
対する標的セリンゾロテアーゼの選択性を文献データの
解析または実験により決定すれば、その標的プロテアー
ゼに対する阻害剤の調製に際してのＰｌの置換の選択に
ついての指示が得られる。標的セリンゾロテアーゼのＰ
１位置における各種アミノ酸に対する相対的な選択性は
、以下の方法にエリ容易に求めることができる。

弐Ｘ−Ｙ−ａａ−Ｚ　Ｃ式中、ＸおよびＹは各誘導体で
それぞれ同じアミノ酸であり、　ａａはＰＩＵ置のアミ
ノ酸で、変化させる）で示される一群の小ペプチｒ誘導
体を製造する。２は＃累によって切断される発色性の脱
離基である。通常、ポリペブチＶのアミノ末端は末端効
果を防止するために保護する。ついで、一連の各化合物
について、標準方法を用い、ミカエル−メントン、運動
パラメーターを求める。酵素のＰ１基質に幻する選択的
結合性が問題である。酵素に対する基質結合の平衡が生
成物の脱離（回転）より速やかな条件では、−の逆数、
丁なわちミカエリス定数が、基質−酵素の会合常数を示
す。すなわち、一連のＰ１アミノ酸のみが異なるペプチ
Ｖ誘導体罠ついて、′／−値を調べれば、特定の酵素に
対するＰ１アミノ酸基質の結合選択性を求めることがで
きる。第１図にはヒト白血球エラスターゼのＰ１基質選
択注について公民された？−夕を例示した（　Ｈａ　ｒ
ｐｅ　ｒほか：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉａｔｒｙ、　２３　
：　２９９５〜３００２＋１９８４）。この研究では、
式 ％式％） ペプチドチオベンジルエステル基質が用いられた。

第１図を調べると、直鎖および分岐鎖脂肪族測鎖に対す
る強い選択性が明らかである。この条件では、芳香性の
基ならびに硫黄および酸素含有側鎖は弱い結合剤である
。この方法は、２が発色性離脱基ではなくクロロアルキ
ルのような活性化基である不町逆注阻害剤も１更用でき
る。

もちろん、本発明の技術分野の熟練者には明らかである
ように、Ｐ１以外の基も酵素と阻害剤の間の結合相互作
用に影響する。丁なわち、反応部位の幾何的配置に対す
る幾何的要求に合致するようにＰｌが選択されても、他
の反応部位残基が特定の標的セリンプロテアーゼに灯し
て重大な役割を有する場合には、それだけでは十分では
ない。

阻害活性に必要な適当な三次構造の折り畳みを達成しそ
れを維持するためには、活性部位外の配列も重要である
。半シスチン残基の適当な配置が保存されている必要が
ある。池の多（の相同性蛋白質ファミリーの場合のよう
に、ジスルフィド結合が同様に保持されていることが、
活性な三次元構造の維持に重要な役割を果た丁ものと考
えられる。このような領域を、分子の骨組みまたは骨格
と呼ぶことができる。

これまで明らかにされたセリンプロテアーゼ阻害剤の原
子構造は、その反応部位の領域において著しい類似性を
示している。同様に、セリンゾロテアーゼのＸ線結晶構
造も、活性部位に広範な構造類似性を示すことが明らか
にされた。本発明のプロテアーゼ阻害剤の反応部位内の
残基が、阻害活性を示すために要求されるある種の幾何
的配置に合致することは当然に期待されろ。したがって
、反応部位におけろ配列変化は、必要な反応部位の幾何
的配置にコンホーメーションが合致するものでなければ
ならない。この要求を満たさない１ｉ＠を行えば、阻害
活性は失われる。

また、三次元構造の折り畳みの達成および安定性を妨害
しない！！換のみが許されることも当然である。他の天
然（蛋白質中に天然にあるもＱ〕およびないものを甘め
て）または合成アミノ酸でこれらのポリペプチドを置換
する場合、その側鎖はペプチドの構造および機能な維持
するのに必要な慨能的同等注をもつことが要求される。

たとえば、塩基性アミノ酸であるオルニチンは、Ｌ７８
１　ＡｒｇまたはＨ１８を１１喚できる可能性がある。

β−２−チェニルアラニンはフェニルアラニンａ　似（
１）　合成アミノ酸である。もちろん、生物学的活性が
悪影響を受けないならば、アミノ酸の適当な立体異性体
で置換することができる。同様にある種の欠失も、これ
らのポリペゾチＶのサイズが小さいことによる不適切と
いう問題が生じなければ可能である。ジスルフィド結合
を付ＤＯしたり、または塩橋もしくは水素結合の給体／
受体対を与えることができる基を付加することにより、
折り畳みをさらに安定化することもできる。新しいジス
ルフィド僑、＠橋、水素納会Ｎ　５たはその他の適当な
組合せを付加するために既存の僑結合を除去してもよい
。

本技術分野の熟練者には明らかなように、本発明りペプ
チド阻害剤は化学的に修飾することができる。たとえば
、アミノ床端および／またはりジン残基をアシル化する
ことができる。また、カルボキシル基をエステル化また
はアミド化してもよい。アミノまたはカルボキシ末端を
、別個にまたは同時に延長することも可能である。この
ような延長部は、他の阻害剤分子または特定の組織を標
的とする分子認識セグメントのような他の望ましい性質
を含有するものであってもよい。分子認識セグメントの
例としては、受容体に対するリガンｒとして動くポリペ
ゾチげホルモンを挙げることができる。他の列には抗体
がある。

本発明の目的においては、２個のポリペプチド配列がア
ミノ酸の同−注および／−！たは類似性の点で少なくと
も７５％の相似性を示す場合には、２種のペプチド配列
はたがいに相同性の変化を有するとみな丁。この比較に
は、これまで知られているいくつかのアルゴリズムのひ
とつを便用することかできる。適当なアルゴリズムの例
としては、Ｌｉｐｍａｎ　＆　Ｐｅａｒｓｏｎ　（５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　２２７　：　１４３５〜１４４１．１９
８５）のものを挙げることができる。このアルゴリズム
は、コンピュータープログラムＦＡＳＴＰの形で利用で
きる（　Ｗ、　Ｒ，Ｐｅａｒｓｏｎ。

Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆ　　１３１ｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、　　　σｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ　　ｏｆＶｉｒ
ｇｉｎｉａ、ＣｈａｒｌＯｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ、
　　２２９　０８　）。

本技術分野の熟練者には明らかなように、蛋白質やポリ
ペプチドに、アミノ酸の置換、欠失および挿入を行って
も、構造および機能に不部会な影響を与えないことは多
い。実際、第１表に掲げたポリペプチドは少な（とも７
５％の配列向−注を示している。たとえば、ポリペプチ
ド２〜７ならびに４６および４４はポリペプチド１の相
同性変異体とみろことができ、ポリペプチド９〜１４は
ポリペプチド８の相同性変異体、ポリペブチｒ１６〜２
１はポリペブチｐ１５の相同性変異体、ポリペプチド２
３〜２８はポリペプチド２２の相同性変異体、ポリペブ
チ）Ｆ３０〜３５はポリペプチド２９の相同性変異体、
ポリペプチド３７〜４２はポリペプチド６６の相同性変
異体、ポリペプチド５２〜５７はポリペプチド５１の相
同ａＫ異体とみな丁ことができる。

さらに、本技術分野の熟練者には明らかなように、相同
性は構造および機能についてのひとつの指摘に丁ぎない
。換言子れば、相同性が７５僑以上の挿入、欠失および
置換のすべての組合せが生物学的に活性なポリペプチド
を導くわけではない。

たとえば、半シスチンの位置は、プロテアーゼ阻害剤で
は通常高度に保存されていて、位置のわずかな遷移が認
められるに丁ぎない。したがって、上述の相同性の条件
は、そのペプチドがその阻害活性を実質的に維持してい
るという条件を満たすものでなければならない。

第２表のポリペブチＶは全く相同性である。すべだがＰ
２にプロリン残基な有する。鎖反転を生じるプロリンの
よく知られた性質は、その厳密な保存を説明であろう。

プロリンがＰ２に必要であるが、他の残基も比較的高い
頻度で鎖反転を生じる。とくに、アスパラギン酸、アス
パラギンおよびセリンの前のグリシンである。小さなペ
プチＶ基質について公表されている結果から、アラニン
およびロイシンもＰ２位置で機能することが示されてい
る。Ｐ３の半シスチンは厳密に保存されている。Ｐ３の
半シスチンは適当なジスルフィド結合、全体的コンホー
メーションの維持に必要と思われる。カポチャからの阻
害剤ファミリーでは、Ｐ４位置は非極性残基バリンおよ
びメチオニンで占められている。Ｐ４は他の極性および
非極性置換が可能である。置換が必要な全体的折り畳み
および反応部位の幾何的配置の達成を妨害しない限りは
、置換基の効果は標的セリンゾロテアーゼに依存してい
る。Ｐ５位置はカポチャからの阻害剤ファミリーの場合
、アルギニンまたはメチオニンのいずれかによって占め
られている。Ｐ４ｍ置の場合と同じ見解が適用される。

カポチャからの阻害剤ファミリー中の公知化合物では、
Ｐ１′からＰ５′までのパターン、丁なわち３個の連続
した非極性残基、ついで荷電残基、ついで半シスチンは
厳密に保存されている。Ｐ１′からｐ　５１位置におけ
る配列の変動は、置換および標的セリンプロテア−ぜに
依存して、多かれ少なかれペプチドの親和性および選択
性に影響することが期待される。たとえば、陽性（リジ
ン）および陰性（グルタミン［）のいずれに荷電してい
る残基がＰ４′にあっても、平衡会合定数にはほとんど
変化はない。一方、Ｐ５′はすべてのポリペプチドにお
いてｐ　５／であり、適当なジスルフィド結合のための
要求と考えられる。

カポチャからの阻害剤ファミリーにおいては、配列の骨
格領域内にはほとんど変化がない。しかし置換があるこ
とに留意丁べきである。これは、この配列部分を、置換
の頻度が低く保存性を与える骨格と帰属したこと罠よ（
一致するものである。

これらのトリジシン阻害剤の配列は高度に保存されてい
る。これらの阻害度の相同性とトリプシンに対する結会
足数がほぼ等しいことは、本発明のポリペプチド阻害剤
に関して上述した相同性の条件を直接支持するものであ
る。

本発明のポリペブチｒは、治療剤として、発酵液中のセ
リンゾロテアーゼ活性の調節に、また有害生物の制御等
、各種の態様において有用である。

本発明のポリペブチＶは、望ましくないプロテアーゼ活
性を伴う病態の治療に、また適切に適応されればその予
防に有用である。ヒトおよび動物用医薬の両者に使用で
きる。本発明のボリペプチドは遊離のポリペブチ−とし
て、または医薬的に許容される塩として投与できる。医
薬的に許容される塩の語は、そのポリペブチげの治療活
性（たとえば有効性、毒性等）に有意な悪影響を与えな
いポリペプチドの酸性８ロ塩または金属複合体を意味す
る。本発明のポリペプチドは多くの場会、ポリペプチド
および／またはその医薬的に許容される塩と医薬的に許
容される担体からなる医薬組成物として投与される。医
薬的に許容される担体の語は、ポリペプチドの治療活性
に有意な悪影響を与えない固体または液体担体を意味す
る。本発明のポリペプチドを含有する医薬組成物はヒト
に、静脈内、皮下、筋肉内、経鼻腔的また経口的にも投
与することができる。必要な用量は、治療丁べき特定の
状態、投与方法およびポリペプチドの体内からのクリア
ランス速度によって変動する。多くの場会、ｏ、ｏ　ｏ
　ｉ〜６０■／ｋ１９の用量が有効である。０．１〜１
０■／に９の用を範囲が好ましい。

本発明のポリペプチドは、発酵液中のプロアーゼ活性レ
ベルの制御にも有用である。すなわち、一般的に用いら
れる微生物の発酵によって産生された蛋白質の分解を防
止するのに適している。これは、外来性のポリペプチド
を添ｖＯするか、またはこれらのポリペブチｒをコーｒ
する遺伝子を保護すべき蛋白質の遺伝子とともにコクロ
ーニングし発現させることによって行われる。

本発明のポリペブチＶは、家庭および農業有害生物の制
御に、その消化機ホ目を終結させることによって便用で
きる。ポリペブチ−は本発明における適当な効果を適用
部位で発揮できろように処方されろ。本発明のポリペブ
チ「は他の有害生物制御剤とともに便用することもでき
ろ。

本発明のポリペブチげは適当な方法で製造することがで
きる。たとえば組換えＤＮＡ技術ならびに広（用いられ
て０るＭｅｒｒｉｆｓｌｄ　（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ
。

８０Ｃ−、８５：　２１４９　、１９６３　：’５ｏｘ
１ａＰｈａｓｅ　　Ｐｅｐｔｉｄｅ　　５ｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ’　　、　　　Ｂｔｅｗａｒｔ　　ａｎｄｙｏｕｎ
ｇ、第２版、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ
、、　ＲＯｃｋ−ｆｏｒｄ　工Ｌ　）の固相ペプチド合
成法を含めた化学的合成によって製造できる。本発明の
ポリペブチげはシスティンを含有するので、標準フッ化
水素切断反応に際しては、ペゾチー樹脂１！！あたりア
二ンール１−およびメルカプトピリジン１５０■を添７
１０すべきである。切断されたペプチドは約１５囁酢酸
から凍結乾燥する。

ついで粗ペプチドを以下の方法で酸化して折り畳む。酸
化緩衝液［１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび還元型（Ｑ、５〜１
．３　ｍＭ　）および酸化型（５〜１０ｍＭ）グルタチ
オンのそれぞれ１：１０のモル比の湿分″４ｉＪを含有
するＯ−Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈこ２．　ｐＨ８，７５］
を粗ペゾチげに卯え、ペプチド濃度を４■／−とする。

８．６００　Ｘ　、！ｊで１０分間遠心分離して不溶＊
ｆ沈殿させる。上置液乞傾瀉し、酸化折り畳み反応乞室
温で２〜８時間進行させる。反応湿分物は精製工程まで
４　”Ｃに保存する。

酸化された粗ペゾチドについて、たとえば以下に記載の
方法を用い、１徨もしくは２種以上のセリングロテアー
ゼに対する阻害活性を一１１定することができろ。酸化
緩衝液のみχ用いてコントロール実験を実施する。酸化
相ペプチドは、アセトニトリル２０〜４０％の勾配から
なる水／アセトニトリル混合溶媒（両溶媒とも０．１％
のトリフルオロ酢酸を富有）を用い、流速２ゴ／分で０
１８シリカｒル力ラム上、逆相ＨＰＬＯによって分析す
る。

カラムの溶出液の２２６　ｎｍの吸収を調べる。酸化相
ペプチド２００〜３００μＪを注入し、適当な阻害活性
定量法を用いて活性成分を同定すればピークを収集する
ことができる。精製比、浴出時間、したがってカラムか
らペプチドが溶出するときの勾配混合物のアセトニトリ
ル言置がこの方法でわかる。活性成分の溶出時間は以下
の′ｎ製（下記診照）でクロマト分画された分画につい
て分析スケールのＨＰＬＣ定歓法を用いる際に必要であ
る。

アセトニトリル言置は酸化相ペプチドの精製を行う鴨廿
の条件の概略（浴媒組成）を確立するのに有用である。

本発明の酸化相ポリペプチドは以下の方法によって精製
することができる。酸化相ペプチドを０．４５μｍフィ
ルターでｇ過し、認められることがある白濁浮遊物を除
去する。濾液を０１８シリカｒル（１０μＭ）充填４０
　Ｘ　３５０　ＲｘＭｉｃｈｅｌ−Ｍｉｌ、ｅ　ｒガラ
スカラム上に６−７分の流速により送る。カラムは予め
、アセトニトリルとガラス蒸留゛水（いずれも０．１　
ｖ／ｖ％のトリフルオロ酢酸ヲ含む）を混合して得られ
、最終アセトニトリル濃度５％の溶媒で平衡化しておく
。カラムを５％アセトニトリルで３０〜６０分間洗浄し
、結合しない吻質を溶出する。流速は、この場合および
以後の操作を通じてろ４７分とする。勾配は５チアセト
ニトリルから最終組成物まで３０分で流す。ついでカラ
ムを最終組成物により、活性成分がカラムから放出され
るまで一定に溶出させる。カラム溶出液について２２６
　ｎｍの吸収を調べ、分画なフラクションコレクターを
便って集める。谷分画について、適当な定を法（下記参
照）を用いて阻害活性を測定する。活性分画については
、上逆の分析スケール逆相１（ＰＬＯを用いて純度を調
べる。

この情報を用いて分画？合すると、ＨＰＬＯで９５ｓＢ
上の均−注な示すポリペプチドが得られる。

合した分画な凍結乾燥する。か（して、ポリペブチｒが
トリフルオロ酢酸の塩として得られる。

精製を試みるに際しては、適当な最終組成物は、分析ス
ケールの逆相ＨＰ　ＬＯから溶出したペプチドがアセト
ニトリル９１０％未満の組成物である。

初期の溶出プロフィルを調べたのち数パーセントのアセ
トニトリルにわずかな改変を行うことで改良できる。

本発明のポリペプチドの阻害活性は、ｉｎ慰ｔｒ。

足を法を用いて容易に測定できる。この種の比色定を法
では、ペプチド阻害剤の存在または非存在下に、適当な
ｐ−ニトロアニリド基質に対するセリンゾロテアーゼ活
性を測定する。ペゾチドｐ−二トロアニリド基質の酵素
触媒加水分解により４０５〜４１０　ｎｍの範囲の吸収
の増大を生じる。

吸収の増加率が酵素活性の指標となり、この比の過当な
コントロールに対する低下を阻害の確認に便用する。実
施列に使用した特定の足を法の一投操作および詳細は、
実施列の後の注として記載する。ポリペプチドを、ｉｎ
　Ｖｉ’７０条件に相当する機能的に方向づけした定蓋
法で試験することもできる。エラスターゼに対するこの
ような阻害定量法も注に示した。

り１１〜１５ 第１表に例示したポリペブチＶを固相合成法で製造し、
酸化（折り畳み）粗ペプチドとして定量したポリペプチ
ド２９，３６．４３．４７．４８および５０以外は前述
の方法で精製した。

第２表の第１列に示した天然のトリジシン阻害剤の配列
を有するペプチｒを、本例では比較対照として用いた。

以下に掲げるポリペブチＶは、トリプシン、エラスター
ゼ、カテゾシンＧおよびキモトリプシンに対する活性を
以下の注に示した定を法を用いてｆ４１１定した。結果
を第６表に示す。

第６表−阻害活性 対照　　→　　　　−−− １−十十−− ８−←　　　　−− ４３−十十　　　　　　　　−＋ ４４−＋＋−− １５＋十　　　　　　→　　　　　　　十十十十２２　
　　　　＋十　　　　　　十十　　　　　　　　十　　
　　　　　十十２９　　　　　＋十　　　　　　　→　
　　　　　　　十　　　　　　　十十３６　　　　　　
＋　　　　　　　十十　　　　　　　　十　　　　　　
　十十５１　　　　　　−　　　　　　　十十−−４５
−士士　　　　　　　　−− ４６−十十　　　　　　　　−− ４’　７−十十−− ４８−十　　　　　　　　　−− ４９−十　　　　　　　　　−− 十＋　５０％を越える阻害 ＋　　１０　％　〜　５０　％　の阻讐−１０％未満の
阻害 ペプチド阻害剤は、阻害剤／プロテアーゼ比約１０７１
〜５０／１で測定した。このモル比で５０％を越える阻
害を示すペプチドは、阻害剤／プロテアーゼ比：Ｌ　Ｏ
Ｏ／１では完全な阻害を示すと考えてよい。

それよい低い効力の阻害剤は、もつと高い阻害剤／プロ
テアーゼ比で実質的に阻害を示すものである。好ましい
エラスターゼ阻害剤には、ペプチド１．８および５１が
包含されろ。ペプチド８は、エラスターゼ阻害剤として
とくに好ましい。第２図を参照すれば明らかなように、
ペプチド８はヒトエラスターゼをほぼ化学量論的に阻害
する。

第１図からは、エラスターゼがインロイシン（工１θ）
およびバリン（Ｖａｆ　）　Ｋ強い選択性を示すことが
明らかである。定量データからはＰＩＲ置のＡｒｇを工
Ｌｅ　ｆたはＶ’ａＪ、でｌｉｔ換すると強力なエラス
ターゼ阻害剤が得られろことを示している。

ペプチド４６〜４８の活性はＰ１位置から離れた位置で
の保存的置換では生物学的活性が保持されることを示し
ている。

ポリペプチド１５はＰ１立がフェニルアラニンで置換さ
れるように合成した。キモトリプシンおよびカテプシン
ＧがＰ１位置のフェニルアラニンに選択性を示すことは
知られている。キモトリプシンお裏δカテプシンＧの阻
害が認められた。ポリペプチド１５はヒトエラスターゼ
およびトリプシンも阻害した。ペプチド１５と類似して
、ペプチド２２はＰ１ｉ置に嵩の大きい非極性アミノ酸
（Ｍθｔ）を有するが、これもヒト力テプシンＧ１キモ
トリプシン、ヒトエラスターゼおよびトリプシンを阻害
した。天然のα−１−プロテナーゼ阻害剤もＰ１位置に
メチオニンを有するが、これもこれらの酵素を同様に丁
べて阻害する。

ペプチド４５．４６．４７．４８，２９．３６および４
９の活性はｐ１ｉ置に疎水性測鎖をもつペプチドが、ヒ
トエラスターゼの阻害活性を維持することを示している
。Ｐ　１’のインロイシンをアラニンに置換することが
できるが、効力にある程度の差を生じる。ペプチド４９
および５０がわずかな活性しか示さない事実はＰ３Ｍ置
のシスティン残基が重要で、はとんど置換できないこと
な示している。Ｐ２ｆｌ置のプロリンをヒドロキシゾロ
リン（Ｈ７１）　）およびグリシンで置換できることか
ら、鎖反転コンホーメーションを受は継ぐことができる
アミノ酸）ｉＰ２ｉ置のプロリンを置換できることがわ
かる。Ｐ１測鎖を欠くペプチド５１がヒトエラスターゼ
阻害剤である事実は、単に側鎖が阻害に必要ではないこ
とを示唆する。ペプチド５１はエラスターゼ阻害剤とし
てはペプチｒ１または８より効果が劣る。したがって、
Ｐ１１ＩＩ１１鎖は、反応部位の残部によって付与され
る阻害を増強（ペプチド８）または減弱（ペプチド５１
）させることがわかる。

例１６〜１７ 本発明の阻害剤の有用性を明らかにするために、天然の
有効な基質を用いる機能的バイオアツセーをペプチド８
について実施した。ペプチド８は、さらに多形核白血球
（ＰＭＮ　）を蛋白分解活性源として用いる試験によっ
ても調べた。

第３図には、基質として１２５エフイブロネクチンを用
い、酵素濃度４　ｍＭ　Ｃ−！たはＰＭＮ窮導ヒトエラ
スターゼ活性と同等ｔ（ＨＬＫ当量〕において得られた
阻害データを例示する。データの各点は、阻害剤なしで
の対照と比べて数回（ｎ＝６〜９）測定した値の平均で
ある。

ペプチド８は精製ヒトエラスターゼ（ＨＥ）およびＰＭ
Ｅ誘導ＨＥ活性に対してほぼ同じ阻害鐵を示した。α−
１−プロテナーゼ阻害剤は精製ＨＥＩＣ対してはペデチ
ｖ８よりもはるかに効果が高かった。しかしながら、刺
激ＰＥＮを用いた場合には、α−１−プロテナーゼ阻害
剤の効果はペプチド８と同程度にまで低下した。

ペデチｖ８によるエラスチン分解の阻害を、３Ｈ−エラ
スチンおよびｎＩ製ＨＥ’４用いて試験した。結果は、
−第４図に示すとおりで、第６図の場合と同様、ペゾチ
）−′８がこれらの２種の結合織基質に等しく有効であ
ることを示している。

注） の−　−プロトコール １）使い捨てポリスチレンキューベット（光路長１α）
に酵素浴液１００μｍをピペットで取る。

２）（１９００−Ｘ）１（ｘ次工ｓ　テｎｏ　、ｔ　ラ
れる試験溶液の容量：　１ＬＡ）の緩衝液をキュベツト
に卯える。

３）　　Ｘμノの試験液をキュベツトに加える。Ｘは対
照の場合００μｍから、最大的５００ＩＬＬまでである
。浴液な１〜５分、室温でインキュベートする。

４）キュベツトに基質溶液１００μＬを加える。

キュベツトをパラフィンフィルムで覆い、５〜１５秒間
くり返し倒立させて内容物を湿分する。

５）約５分後の吸収の変化を、定を伝に応じて４０５ま
たは４１０　ｎｍで、適当な記録デバイスを付した比色
計によって記録する。

６）試験溶液を包まない対照に対する初期の吸収変化比
の低下ＩＣより阻害を求める。％阻害率は式 （式中ΔＡ／分は初期の吸収変化比） で計算される。

７）さらに正確な定量には、キュベツトホルダーと試薬
溶液の温度調節を行う。

８）試験溶液は上述のように調製した粗酸化ペプチｖ１
　クロマトグラフィによる分離分画または精製ポリペプ
チドであってよい。

トリプシンの定量 Ａ）緩衝液−２００ｍＭトリエタノールアミン、２Ｑ　
ｍＭ　０ａＣＪ２からなるトリエタノールアミン緩衝液
、ｐＨ７，８ Ｂ〕　基質溶液−Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンｐ−
ニトロアニリド５０■を水５０−に洛解する。５〜１０
分間超音波処理して、固体を完全に溶解させる。

Ｃ）＃素爵液−ウシトリプシンをｏ、ｏ　ｏ　Ｉ　ＮＨ
Ｃｊ　１０−に洛解し、定量時、氷上に保存する。

Ｄ）　試験溶液−−投プロトコール８）参照操作二上記
溶液を用い、上述の一般プロトコールに従う。

Ａ）　緩衝浴液、Ｑ、５　Ｍ　Ｎａ（Ｊおよび０．０３
　％ナトリウムアジド含有０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｊ　、　ｐＨ３，Ｑ　カらなるＴｒｉ、ａ−ＮａＣｊ緩
衝液 Ｂ）　　基’Ｊｔ溶液−Ｎ−スクシニル−Ｌ　−７５ニ
ル−Ｌ−７ラニルーＬ−ゾロリルーＬ−フェニルアラニ
ンｐ−ニトロアニリド５０′ｑを１−メチル−２−ぎロ
リゾノン１−に溶解し、Ｔｒｉｓ−ＮａＣｊ緩衝液で５
０−に希釈する。

Ｃ）＃累溶液−ヒト唾液カテゾシンＧ（製品Ａ８Ｇ　−
４５、ＥＰＯ，工ｎｃ、、　ｐａｃｔｆｉｃ、　ＭＯ）
。１８．白質１■をＴｒｉ８−１（ａ　（Ｊ緩衝液１−
に溶解する。氷上または４℃に保存する。

Ｄ）　試験溶液−一般プロトコール８）参照操作二上記
溶液を用い、上述の一般ゾロトコールに従う。

１）この定量はキモ）　ＩＪゾシン定歓の酵素溶液を使
用して、キモトリプシンの定量に使用できる。

キモトリプシンの定量 Ａ）　緩衝浴液−トリエタノールアミン緩衝液。

トリプシンの定を参照 Ｂ）　基質浴液−３−カルボメトキシゾロぎオニル−Ｌ
−フルギニルーＬ−プロリルーＬ−チロシンｐ−ニトロ
アニリド（製品Ａｓ−２５８６゜ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ
　ＡＢ、　８ｔｏｃｋｈｏ１ｍ、　Ｓｗｅｄｅｎ　）　
２５　ｗｑを水２３６６−九浴解する Ｏ）　酵素浴液−ウシキモトリプシン１１１１ヲ０．０
０１　Ｎ　ｕｃｚ４−に溶解する。最終希釈液は保存キ
モトリプシン溶液０゜１−と０．００１　Ｎ　Ｈ（Ｊｌ
ｏ−を合する。氷上または４°Ｃに保存する。

操作二上紀溶液を用い、一般プロトコールに従う。

２）カテゾシンＧの定量の１）参照 ３）トリエタノールアミン後ｓ液の代わりに２　　Ｑ　
　　ｍＭ　　（！ａｃｆ２　　　、　　　０−０　　５
　　％　　ト　　リ　　ト　　ｙｘ−１００含有０．１
ＭＴｒより−ＨＣ！、ｐＨ７，８を便用できる。

エラスターゼの定量 方法１： Ａ）緩＠溶液−Ｑ、５　Ｍ　ＮａＣＪおよび０．０１％
’　”／Ｖ、）　Ｎ　ａＮ　３　含有Ｑ、Ｉ　Ｍ　Ｔｒ
ｌｓ−ＨＣｊ　（２５℃の阻７．５）からなるＴｒｉｓ
−ＮａＣＪ！緩衝液Ｂ）　　基５を溶液−Ｎ−スクシニ
ル−Ｌ−７：ｌｙニル−Ｌ−７５二ｋ　−Ｌ−７ラニン
ｐ−ニトコアニリド４５．５■を１−メチル−２−ビａ
リジノン１−に溶解する。Ｔｒｉｓ−Ｎａｃｉ緩衝液３
２−を７１１］えろ。

Ｃ）＃累浴液−ヒト唾液エラスターゼ製品ム５Ｋ−５６
３ＥＰｃ、工ｎｃ、　、　Ｐａｃｉｆｉｃ、　ＭＯ，σ
８Ａ。

ロット番号８５７０１　）。その１ｍｇをＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＪ！緩衝液１　ｒｎｌｌｃ爵解する。氷上または４°
Ｃに保存する。

Ｄ）試験溶液−一般プロトコール８）参照操作：上記浴
液を用い、上述の一投グロトコールに従う。

方法２； Ａ）緩衝溶液一方法１のＴ　ｒｉ　ｅ　−ＮａＣＬ緩衝
液緩衝液質溶液−６−カルボメトキシゾロピオニル−Ｌ
−アラニル−Ｌ−７ラニルーＬ−プロピル−Ｌ−バリン
ｐ−ニトロアニリド５０ｔＩｇを１−メチル−２−ぎロ
リシノン１−に溶解する。

’ｒｒ　１ｓ−Ｎａ　ＣＪ−緩衝液６２１１１７！を８
口える。

Ｃ）酵素溶液−ヒト唾液エラスターゼ製品点ＥＩＥ−５
６３，ＫＰＣ，工ｎｃ、、　　Ｐａｃｉｆｉｃ、ＭＯ，
σＳＡ。

ロット番号８５０７１゜サンプルはＴｒｉｓ−ＮａＣｊ
緩衝液１−あたり０．０１■の濃度に調製する。氷上に
保存する。

Ｄ）試験溶液−一投プロトコール８）参照操作二上記溶
液を用い、上述の一役デロトコールに従う。

１）ブタ膵臓エラスターゼの阻害剤を所望の場会は、ヒ
トエラスターゼの代わりに使用できる。

２）エラスターゼプレバレージョンの活性は次式で計算
できる。

３）　　Ｔｒｉｇ−Ｎａ（Ｊ緩衝液は０．０３％ナトリ
ウムアジドを旨み、ｐｉ（８，０でもよい。結果は単一
の−で比較する。

エラスターゼ分解活性は、鋳造アガールの薄いフィルム
中に懸濁したフルオレスカミン浸漬エラスチン粒子の可
溶化半径によって測定する。消失領域の面積は、アガー
ルのウェルカットに添加したエラスターゼの量に比例す
る。ペプチドの消失領域阻害能な試験する。

材料および試薬： １）　　ＡＩｐｈａｓｉｎエラスターゼ拡散プレート、
製品扁Ａ−６２２，Ｅｐａ、　工ｎｃ、、　Ｐａｃｉｆ
ｉｃ、　ＭＯ，。

ット番号８６１２８ ２〉　ヒト唾液エラスターゼ、　ＢＰＣ！、工ｎＣ１゜
ｐａｃｉｆｉｃ、　ＭＯ，Ｍ品Ａ　ｓＥ−５６３、約３
００単位／−の濃度（エラスターゼの比色定置法、方法
１で定ｔ）にＴｒｉｓ−Ｎａ（Ｊ緩衝液（方法１）中に
調製３）試験溶液−ペプチド、濃度約１μｇ／μヱ操作
： １）　　エラスターゼ溶液１０μヱを１．５−のＥｐｐ
ｅｎｄｏｒｆ管に７１０える（対照用に１個と各試験浴
液に１個ずつ〕。

２）　　Ｔｒｉｓ−Ｎａ（Ｊ緩衝液（２０−Ｘ）μｊ（
Ｘは加える試験サンプルの浴液、μｍＬ）を添ｖＯする
。

３）試験溶液Ｘμｍを７１１１える。又はＤ〜２０であ
る。室温で１〜５分間インキュベートする。

４）得られた溶液１０μについて、酵素溶液を第一工程
で１０μＪしか使用しないほかは方法１と同様に定置を
行う。

５）各サンプル１０ＩＬＬをウェルにピペットで取る。

６）３７°Ｃで１２時間インキュベートする。

７）消失領域を抗生物質の阻止円測定装置を用い、常法
により測定する。容置からウェルの面積（対照）を差し
引く。

（注意事項） １）インキュベーション中のアが−ルの脱水を避けるた
めの注意が必要である。プレートを数−の水とともにプ
ラスチックの袋に入れ、袋をシールする。

２）方法１の注意１参照 ３ン　阻害率は次式で求める ユ２５工−フイブσネクチンの定ｔ この定ｉ′法は結合繊の崩壊モデルとして設計されてい
る。定量は、はぼ、ａａｍｐｂａｌｌほか（Ｊ。

０１１ｎ、工ｎｖｅｓｔ、、　７０　：　８４５〜８５
２．１９８２）の記載に従って実施する。要約すれば、
精製ヒト血漿フィブロネクチン（ｆｎ）をＩＣｎｚｙｍ
ｏｔ）ｅａｄｓ　第１び慣用操作を用いて１２５Ｉで標
識する。脱塩した１２５ニーｆｎを約１５，０００　ｃ
ｐｍ／μｇになるように希釈する。この物質をｐＨ９，
６のバルピタール緩衝液でさらに希釈し、その２００μ
Ｌ（３０μｇ　ｆｎ。

５０．０００　ｃｐｍ）をぎペットで取り、９６個の底
の平らなウェルのある微量滴定板にウェルに加える。プ
レートを３７℃で約２４時間乾燥し、リン酸緩衝食塩浴
液（ＰＢ８　）で２回洗浄した非結合ｆｎを除去する。

プレートは４℃に保存すれば少なくとも２週間は安定で
ある。

各被覆ウェルの定置には総容量２００μｍを充填する。

、すべての測定は至適のよおよび緩衝剤条件で実施する
。阻害剤の存在または非存在下に蛋白分解活性を添加し
たのち、プレートを３７゛Ｃで３時間インキュベートす
る。ウェルの内容物を遠心分離し、その１００μＪをと
って１２ｉ５工のｒ照射をカウントする。一部の定量に
は新たに調製した好中球から誘導したエラスターゼ活性
を用いた（ＰＭＮ）。この場合は、ＰＭＮを刺激する活
性化剤をウェル中に添加し、最後Ｋ　ＰＭＮを加える。

精製ヒトエラスターゼ（ＨＥ）の添加量に対応して直線
性を示す標準曲線が各定量について得られる。

３Ｈ−エラスチン定量法 感度は低いが別の定量では、結合繊の分解を模倣するた
めに放射標識エラスチンを固体基質として使用する。

ウシ頚部靭帯エラスチンの放射標識は、トリチウム化水
素化ホウ素ナトリウムを用い、５ｔｏｎｅらの方ｆｆ１
（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　８ｏ　：　５７２
〜５７７１１９７７）に従って実質する。エラスチン被
覆機１に滴定板はフィブロネクチンの場合に上述したと
ほぼ同様にして調製した。定置は、上澄液をカウント測
定のためシンチレーションカクテルに卯えるほかは同様
に実施する。′１′！！製ＨＥに対する反応の直線性も
同様に試験する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、分裂部位に対してすぐアミン末端側の位置に
おけるアミノ酸に対するヒト白血球エラスターゼの嗜好
性を示すグラフである。この位置はＰ１立置と呼ばれ、
明細書に詳細に述べられている。 第２図は、阻害剤ペプチド８によるエラスターゼ阻害の
滴定曲線である。 第６図は、阻害剤ペゾチｖ８の１２５エフイプロネクチ
ン定量で得られたデータの一例である。 第４図は、阻害剤ペプチド８の３Ｈ−エラスチン定量で
得られたデータの一例である。

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式 【アミノ酸配列があります】 （式中Ｘは標的セリンプロテアーゼに対する阻害活性を
   付与するために適応されるアミノ酸を表す）で示される
   アミノ酸配列およびその相同性変異配列を有する合成プ
   ロテアーゼ阻害剤。
2. （２）Ｘがアルギニンまたはリジン以外のアミノ酸であ
   る）特許請求の範囲第１項のセリンプロテアーゼ阻害剤
   。
3. （３）Ｘがイソロイシン、ノルバリン、バリン、ノルロ
   イシン、メチオニン、ロイシン、アラニン、グリシンお
   よびフエニルアラニンよりなる群から選ばれ、エラスタ
   ーゼに対する阻害活性を示す特許請求の範囲第１項のセ
   リンプロテアーゼ阻害剤。
4. （４）Ｘがバリンである特許請求の範囲第３項のセリン
   プロテアーゼ阻害剤。
5. （５）Ｘがイソロイシンである特許請求の範囲第３項の
   セリンプロテアーゼ阻害剤。
6. （６）Ｘがフェニルアラニンであり、エラスターゼおよ
   びカテプシンＧに対する阻害活性を示す特許請求の範囲
   第１項のセリンプロテアーゼ阻害剤。
7. （７）Ｘがメチオニンであり、エラスターゼおよびカテ
   プシンＧに対する阻害活性を示す特許請求の範囲第１項
   のセリンプロテアーゼ阻害剤。
8. （８）第１表のポリペプチド１〜４８および５１〜５７
   よりなる群から選ばれるセリンプロテアーゼ阻害剤。
9. （９）特許請求の範囲第１項の阻害剤またはその医薬的
   に許容される塩の有効量およびその医薬的に許容する担
   体を含有する標的セリンプロテアーゼを阻害する医薬組
   成物。
10. （１０）特許請求の範囲第３項の阻害剤の有効量を含有
    する特許請求の範囲第９項の組成物。
11. （１１）特許請求の範囲第８項の阻害剤の有効量を含有
    する特許請求の範囲第９項の組成物。
12. （１２）特許請求の範囲第４項の阻害剤の有効量を含有
    する特許請求の範囲第９項の組成物。
13. （１３）特許請求の範囲第５項の阻害剤の有効量を含有
    する特許請求の範囲第９項の組成物。
14. （１４）特許請求の範囲第６項の阻害剤の有効量を含有
    する特許請求の範囲第９項の組成物。
15. （１５）特許請求の範囲第７項の阻害剤の有効量を含有
    する特許請求の範囲第９項の組成物。
16. （１６）特許請求の範囲第１項の阻害剤の有効量を投与
    することを特徴とする望ましくないセリンプロテアーゼ
    活性によつて生じた生理状態を有する患者を治療する方
    法。
17. （１７）特許請求の範囲第３項の阻害剤を投与する特許
    請求の範囲第１６項の方法。
18. （１８）特許請求の範囲第８項の阻害剤を投与する特許
    請求の範囲第１６項の方法。
19. （１９）特許請求の範囲第４項の阻害剤を投与する特許
    請求の範囲第１６項の方法。
20. （２０）特許請求の範囲第５項の阻害剤を投与する特許
    請求の範囲第１６項の方法。
21. （２１）特許請求の範囲第６項の阻害剤を投与する特許
    請求の範囲第１６項の方法。
22. （２２）特許請求の範囲第７項の阻害剤を投与する特許
    請求の範囲第１６項の方法。