JP4701355B2 - プロトロンビン活性化タンパク質 - Google Patents

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Description

本出願は、その内容の全文が参照として本明細書に組み入れられる、2002年4月3日に提出されたオーストラリア特許仮出願第PS1483号および2003年3月7日に提出された第2003901033号の恩典を主張する。
発明の分野
本発明は、ヘビ毒プロテアーゼポリペプチドおよびこれをコードする核酸配列に関する。本発明はまた、例えば、手術時または事故に帰因する創傷および他の種類の損傷もしくは外傷を治療する場合のように、止血を促進して血液の損失を防止するために、ヘビ毒のプロテアーゼを作製および使用する方法にも関する。
発明の背景
血液凝集または血液凝固として一般的に呼ばれる止血は、過剰な血液の損失を防止する創傷または損傷に対する重要な生体反応である。哺乳類における止血を制御する生化学カスケードは、十分に理解されている。この経路における重要な段階は、トロンビンを生成するためのプロトロンビナーゼ複合体によるプロトロンビンの活性化であり、トロンビンは、次に第XIIIa因子を活性化して、これはフィブリンとクロスリンクして安定な凝血を形成する（Stubbs & Bode、1994、Curr. Opin. Struct. Biol. 4：823〜32）。
哺乳類において、プロトロンビン活性化剤複合体は、インビボにおいて典型的に、カルシウムイオンの存在下でリン脂質膜上に形成されたセリンプロテアーゼ第Xa因子および共因子である第Va因子からなる（Suttie & Jackson、1977、Physiol. Rev. 57：1）。哺乳類のプロトロンビナーゼ複合体は、共因子である第Va因子、およびセリンプロテアーゼである第Xa因子からなる。第Xa因子単独ではプロトロンビンの活性化は非常に遅いが、非酵素的共因子である第Va因子、カルシウムイオン（Ca2+）およびリン脂質を含む補助タンパク質の存在下では、プロトロンビン活性化は何倍も増強される。インビボでは、第Xa因子は、血液中の血小板のリン脂質膜のγカルボキシグルタミン酸残基に結合し、Arg274−Thr275で選択的に切断された後、プロトロンビンにおけるArg323−Ile324結合が切断されて、トロンビンを形成する。
手術時または損傷もしくは外傷後の血液の損失を制御する重要性を考慮すると、血液凝固を促進するまたは凝血の解離を抑制する（線維素溶解プラスミン/プラスミノーゲン経路によるのような；Roystonら、1990、Blood Coagul. Fibrinol. 1：53；Orchardら、1993、Br. J. Haematol. 85：596）調節因子を同定することは、非常に関心の高い領域となった。
特に、ヘビ毒は、哺乳類における手術、外傷時の血液損失の結果として、線維素溶解を防止するか、または血液凝固を促進することができる有用なタンパク質源となっている。例えば、線維素溶解の抑制剤は、オーストラリアにおける一般的なブラウンスネークであるシュードナジャ・テクスチリス（Pseudonaja textilis）（国際公開公報第99/58569号）の毒液から単離されている。ヘビ毒由来のプロトロンビン活性化因子に関しては、同様にタイパンヘビであるオクシュラヌス・スクテラツス（Oxyuranus scutellatus）の毒液から単離されたプロトロンビン活性化因子：プロトロンビン活性化酵素（Os-IIと呼ばれる）および活性化第Xa因子を開示する中国特許第1298017号を参照されたい。中国の研究グループは、出血性の創傷の場合のように止血を促進するために、Os-IIは第Xa因子を加える1時間前に加えることが最適であり、それによってプロトロンビンを活性化すると提唱している。彼らは、両者の同時の作用が、プロトロンビンを活性化して、トロンビンの産生を増加させることができると提唱した。
同様に、オーストラリアの粗面の鱗片を有するヘビであるトロピデキス・カリナツス（Tropidechis carinatus）の毒液から単離された第Xa因子様のプロトロンビン活性化剤（トロカリン）を開示するJosephら、1999、Blood 94：621も参照されたい。トロカリンは、リン脂質、第Va因子およびカルシウムイオンの存在下で、インビトロでプロトロンビンからトロンビンの形成を触媒するプロトロンビン活性化因子複合体を形成する。
現在の止血剤は、ウシまたはヒト由来の血液成分を用いて、哺乳類における手術、外傷時の出血の結果として、線維素溶解を防止するまたは血液凝固を促進する様々な因子を置換する。ウシまたはヒト由来の血液成分を用いると、おそらく患者はウイルス混入または他の有害事象に曝露される可能性がある。
発明の概要
本発明は、本明細書において血液凝固因子に非依存的である「ヘビ毒プロテアーゼまたはSVP」と呼ばれるプロトロンビン活性化ポリペプチドの発見に一部基づいている。ヘビ毒プロテアーゼは、活性化のためにカルシウム、リン脂質、および第Va因子を必要とするプロトロンビン活性化剤である第Xa因子およびトロカリンのアミノ酸配列と特定のアミノ酸配列類似性を有する。しかし、本発明のヘビ毒プロテアーゼは、完全または部分的に完全なプロトロンビン活性化剤であり、このようにヒト第Xa因子またはトロカリンの共因子必要条件を有しない。言い換えれば、それらは、カルシウム、リン脂質、および/または第Va因子のような共因子の非存在下でプロトロンビンをトロンビンにすることができる。例えば、ブラウン、沿岸性タイパンおよび内陸性タイパンの毒液からのヘビ毒プロテアーゼは、それらがカルシウム、リン脂質、および第Va因子の非存在下でプロトロンビンをトロンビンに処理することができるという点において、完全なプロトロンビン活性化剤である。これらのSVPには、図23の残基292〜305位の内部ドメインが含まれるように思われ、これによってそれらは宿主によって提供される第Va因子とは独立する。例えば、レッドベリー、タイガー、およびラフスケールスネークの毒液からのヘビ毒プロテアーゼは、それらがカルシウムおよびリン脂質の非存在下でプロトロンビンを処理できるが、第Va因子の存在を必要とするという点において、部分的に完全なプロトロンビン活性化剤である。さらに、本発明の好ましいSVPは、ヒト第X因子の不良な基質であるデスカルボキシプロトロンビンを切断することができる。
したがって、1つの局面において、本発明は、完全または部分的に完全なプロトロンビン活性化剤であって、そして例えば凝固を増加させるための試薬として有用なヘビ毒プロテアーゼポリペプチドおよびその生物活性または抗原性断片を特徴とする。もう1つの態様において、本発明は、プロトロンビン活性化活性を有するヘビ毒プロテアーゼポリペプチドを提供する。
1つの態様において、ヘビ毒プロテアーゼには、1つまたはそれ以上の軽鎖および重鎖またはその生物活性断片が含まれる。好ましい軽鎖および重鎖タンパク質は、天然に存在する種と長さが同じまたは非常に類似である（例えば、残基1または2個が異なる）。もう1つの態様において、ヘビ毒プロテアーゼには、プロペプチド、軽鎖、活性化ペプチドおよび重鎖が含まれる。処理中間体も全て、天然に存在するか否かによらず、本発明の範囲内である。このように、さらにもう1つの態様において、本発明のヘビ毒プロテアーゼポリペプチドには、軽鎖、活性化ペプチドおよび重鎖が含まれる。好ましい態様には、そこからプロペプチドドメインおよび活性化ペプチドまたは複数のペプチドが切断されている軽鎖および重鎖が含まれる。精製調製物には、切断されたプロペプチドドメインが含まれうる、または有し、切断断片は精製によって除去される。
好ましい態様において、完全または部分的に完全なプロトロンビン活性化SVPには、以下のドメインの1つまたはそれ以上および場合によっては全てが含まれる（番号は、図23のコンセンサス番号を参照されたい）：
図23の残基1〜40位に対応する第一またはポリペプチドドメイン。好ましい態様において、このドメインは、図29に示す配列5個のいずれかの対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも31、40、80、90、95もしくは98％の類似性を有しうる、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である。好ましい活性産物は、当然プロペプチドドメインを欠損すると考えられる。場合によっては、ヘビのポリペプチドドメインを、ヒト第X因子のプロペプチドドメインにさらに類似するように、またはヘビプロペプチドドメインをヒトプロペプチドドメインに置換するように、これを改変することが望ましい可能性がある。プロペプチドドメインは、レッドベリーブラックヘビにおける一アミノ酸変化V→Eを例外として6匹全てのヘビにおいて100％保存されている。対応するヒト配列と比較すると、残基40個中12個が同一であることが判明する（30％同一性）。保存された残基の大部分は疎水性である；
図23の残基40と41位のあいだの軽鎖切断部位；
図23の残基41〜85位に対応するドメイン。このドメインは、ヒト第X因子のGLA（γカルボキシグルタミン酸）ドメインと機能的に類似である可能性がある。好ましい態様において、このドメインは、図23に示す配列6個のいずれかの対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも71、75、80、85、90、95、または98％の配列類似性を有しうる、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である。いくつかの態様において、この領域におけるグルタミン酸残基11個の1つまたはそれ以上を保存することが望ましい可能性がある。これらのうち10個は、ヒト第X因子配列と、残基46/47、54、56、59/60、65/66、69、72を含むヘビ配列の6個全てのあいだで保存されている。79位も同様にヒトではγカルボキシル化されており、図23のヘビ配列では6個全てにおいて、残基76および78位で他の可能性がある部位2個が存在することに注目されたい。多くの態様において、このドメインの最初の残基は、産物の軽鎖の最初の残基である。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示するヘビ毒プロテアーゼ6個のうちの1個の対応するドメインと少なくとも85％の配列同一性を有する；
図23の残基86〜122位に対応するドメイン。このドメインは、ヒト第X因子の最初のEGFドメインと機能的に類似である可能性がある。好ましい態様において、このドメインは、図23に示す配列6個のいずれかの対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも71、75、80、90、95もしくは98％の類似性を有しうる、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である。ヘビコンセンサスとの同一性は25/37である。ドメインは、ヒト配列と70％同一性を有する。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示のヘビ毒プロテアーゼ6個中1個の対応するドメインと少なくとも70％の配列同一性を有する；
図23のヘビ配列6個のいずれかからの残基123〜165位に対応するドメイン。このドメインは、ヒト第X因子の第二のEGFドメインと機能的に類似である可能性がある。好ましい態様において、このドメインは、図23に示す配列6個のいずれかの対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも36、50、75、80、90、95もしくは98％の類似性を有しうる、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である。ヘビコンセンサスとの同一性は15/43である。ドメインは、ヒト配列と35％同一性を有する。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示のヘビ毒プロテアーゼ6個中1個の対応するドメインと少なくとも50％の配列同一性を有する；
図23のヘビ配列6個における残基166〜179位に対応するドメイン。好ましい態様において、このドメインは、図23に示す配列6個のいずれかの対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも75、80、90、95もしくは98％の類似性を有しうる、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示のヘビ毒プロテアーゼ6個中1個の対応するドメインと少なくとも70％の配列同一性を有する；
図23の残基180〜182位に対応するドメイン。好ましい態様において、このドメインは、図23に示す任意の配列6個において認められるものと同じ残基を少なくとも1、2または3個を有しうる。このドメインは好ましくは活性産物には存在しない；
図23の残基183〜209位に対応するドメイン。このドメインは、ヒト第X因子における活性化ペプチドと機能的に類似である可能性がある。好ましい態様において、このドメインは、図23に示す配列6個のいずれかの対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも17、50、75、80、90、95もしくは98％の類似性を有しうる、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である。ヘビコンセンサス配列との同一性は8/51である。ヒト配列とは16％の同一性を有する。これはプロテアーゼの軽鎖および重鎖のプロセシングの際に切断される領域であり、好ましくは活性産物には存在しない。配列は、ヒト第X因子に関してアミノ酸51個およびそれぞれのヘビに関してアミノ酸27個である。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示のヘビ毒プロテアーゼ6個中1個の対応するドメインと少なくとも50％の配列同一性を有する；
図23の残基210〜467位（ブラウン、沿岸性タイパン、内陸性タイパン、またはレッドベリーブラック配列の場合）、または456位（タイガーおよびラフスケール配列の場合）に対応する重鎖。このドメインは、ヒト第X因子の重鎖と機能的に類似である可能性がある。好ましい態様において、このドメインは、図23に示す配列6個のいずれかの対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも50、75、80、90、95もしくは98％の類似性を有しうる、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である。ヘビコンセンサス配列との同一性は135/268であり、ヒト配列と50％同一性を有する。ヒト第X因子の触媒ドメインは、必須の活性部位三連構造H236、D282、およびS379を含む。これらの残基3個は、図23におけるH251、D309およびS406としてヘビ6種全てにおいて保存されており、本発明のSVPの好ましい態様において保存されている。アミノ酸292〜305位は、第Va因子様活性に関与するように思われ、その配列または292〜305位の配列と異なる残基が1、2、3、4もしくは5個以下である配列が、完全なSVPに存在するはずである。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示のヘビ毒プロテアーゼ6個中1個の対応するドメインと少なくとも75％の配列同一性を有する。
先に言及したように、好ましい態様には、プロペプチドドメインおよび活性化または切断ドメインから切断されている完全にプロセシングされた軽鎖および重鎖の二量体分子が含まれると考えられる。好ましい態様において、軽鎖には、軽鎖の57位と62位とのあいだ、90位と101位とのあいだ、95位と110位とのあいだ、112位と121位とのあいだ、129位と140位とのあいだ、および/または151位と164位とのあいだに鎖内Cys-Cys結合が含まれ、重鎖の216位と221位とのあいだ、236位と252位とのあいだ、377位と391位とのあいだ、および/または402位と430位とのあいだに鎖内Cys-Cys結合が含まれ、そして軽鎖の172位と重鎖の329位のあいだに鎖間Cys-Cys結合が含まれる。好ましい態様において、SVPは、共因子の非存在下で不完全な活性化因子、例えばヒト第X因子またはトロカリンより有意に大きい活性を示すという点において、完全または部分的に完全なプロトロンビン活性化剤である。好ましくは、完全または部分的に完全なプロトロンビン活性化剤の活性は、不完全な活性化剤、例えばヒト第Xa因子またはトロカリン単独より少なくとも1.5、2、4、10、15、20、50または100倍（2次数）高い。この比較は、同じまたは類似の条件において、例えばCaおよびリン脂質の非存在下で測定したヘビ毒プロテアーゼと不完全な活性化剤のあいだで行われる。好ましい態様において、完全または部分的に完全な活性の割合％（すなわち、Caおよびリン脂質の存在下で同じ活性化剤について認められた活性の％と比較した、Caおよびリン脂質の非存在下での完全または部分的に完全な活性化剤の活性）は、不完全な活性化剤、例えばヒト第X因子またはトロカリンによって示される同じ％より少なくとも1.5、2、4、10、15、20、50、100、1000、または4000倍高い。好ましい完全または部分的に完全な活性化剤は、約10-10〜10-6 M、例えば10-8〜10-7 Mの濃度でクエン酸加血漿（citrated plasma）を凝固させ、凝固時間は約50〜15秒であり、Ca2+およびリン脂質非依存性を示す。したがって、プロトロンビン活性化剤は、約10-10〜10-06 Mの濃度範囲で共因子（カルシウムイオンおよび/またはリン脂質）非依存性の速度論特性を示し、この範囲は血液の損失を減少させるために適した作業範囲である。
好ましい態様において、完全または部分的に完全なプロトロンビン活性化SVPには、以下のドメインの1つまたはそれ以上および場合によっては全てが含まれる（番号付けは図22のコンセンサス番号付けを参照する）：
図22のヘビ配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の残基1〜40位に対応する第一またはプロペプチドドメイン。好ましい態様において、このドメインは、図22に示す任意の配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも31、40、80、90、95もしくは98％の配列類似性を有しうる、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である。好ましい活性産物は当然、プロペプチドドメインを欠損すると考えられる；
図22に示す任意の配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも67、90、95もしくは98％の配列類似性を有する、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である、図22のヘビ配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の残基41〜120位に対応するドメイン。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示のヘビ毒プロテアーゼ6個中1個の対応するドメインと少なくとも90％の配列同一性を有する；
図22に示す任意の配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも43、60、65、80、85、90、96もしくは98％の配列類似性を有する、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である、図22のヘビ配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の残基121〜132位に対応するドメイン。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示のヘビ毒プロテアーゼ6個中1個の対応するドメインと少なくとも60％の配列同一性を有する；
図22に示す任意の配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つと少なくとも80、85、90、96もしくは98％の配列類似性を有する、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である、図22のヘビ配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の残基133〜182位に対応するドメイン。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示のヘビ毒プロテアーゼ6個中1個の対応するドメインと少なくとも80％の配列同一性を有する；
図22に示す任意の配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも17、30、50、90、95、96もしくは98％の配列類似性を有する、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である、図22のヘビ配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の残基183〜233位に対応するドメイン。好まし活性産物は当然、活性化ドメインを欠損すると考えられる。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示のヘビ毒プロテアーゼ6個中1個の対応するドメインと少なくとも90％の配列同一性を有する；
図22に示す任意の配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）のの対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも80、85、90、96もしくは98％の配列類似性を有する、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である、図22のヘビ配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の残基234〜378位に対応するドメイン。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示のヘビ毒プロテアーゼ6個中1個の対応するドメインと少なくとも80％の配列同一性を有する；
図22に示す任意の配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）のいずれかの対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも39、30、50、80、85、90、96もしくは98％の配列類似性を有する、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である、図22のヘビ配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の残基379〜394位に対応するドメイン。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示のヘビ毒プロテアーゼ6個中1個の対応するドメインと少なくとも50％の配列同一性を有する；
図22に示す任意の配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも80、85、90、96もしくは98％の配列類似性を有する、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、5、もしくは10個以下である、図22のヘビ配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の残基395〜456位に対応するドメイン。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示のヘビ毒プロテアーゼ6個中1個の対応するドメインと少なくとも80％の配列同一性を有する；
非存在となりうる、または存在すれば、図22に示す任意の配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の対応するドメイン、特に完全なSVP、すなわちブラウン、沿岸性タイパン、もしくは内陸性タイパン配列の完全なSVPの完全なSVPの1つの対応するドメイン、または部分的に完全なSVP、すなわちレッドベリーブラック、タイガー、もしくはラフスケールの1つの対応するドメインと少なくとも90、96もしくは98％の配列類似性を有する、または異なるアミノ酸残基が1、2、3、もしくは5個以下である、図22のヘビ配列5個（または内陸性タイパンの対応する配列）の残基457〜467位に対応するドメイン。好ましい態様において、このドメインは、本明細書に開示のヘビ毒プロテアーゼ6個中1個の対応するドメインと少なくとも90％の配列同一性を有する。
先に言及したように、好ましい態様には、プロペプチドドメインおよび活性化または切断ドメインから切断されている完全にプロセシングされた軽鎖および重鎖の二量体分子が含まれると考えられる。好ましい態様において、軽鎖には、軽鎖の57位と62位とのあいだ、90位と101位とのあいだ、95位と110位とのあいだ、112位と121位とのあいだ、129位と140位とのあいだ、および/または151位と164位とのあいだに鎖内Cys-Cys結合が含まれ、重鎖の216位と221位とのあいだ、236位と252位とのあいだ、377位と391位とのあいだ、および/または402位と430位とのあいだに鎖内Cys-Cys結合が含まれ、そして軽鎖の172位と重鎖の329位のあいだに鎖間Cys-Cys結合が含まれる。好ましい態様において、二量体SVPは完全なプロトロンビン活性化因子である。言い換えれば、これは部分的に完全なプロトロンビン活性化因子である。好ましい態様において、SVPは、共因子の非存在下で不完全な活性化因子、例えばヒト第X因子またはトロカリンより有意に大きい活性を示すという点において、完全または部分的に完全なプロトロンビン活性化剤である。好ましくは、完全または部分的に完全なプロトロンビン活性化剤の活性は、不完全な活性化剤、例えばヒト第X因子またはトロカリン単独より少なくとも1.5、2、4、10、15、20、50、100、1000、または4000倍（2〜4次数）高い。この比較は、同じまたは類似の条件において、例えばCaおよびリン脂質の非存在下で測定したヘビ毒プロテアーゼと不完全な活性化剤のあいだで行われる。好ましい態様において、完全または部分的に完全な活性の割合％（すなわち、Caおよびリン脂質の存在下で同じ活性化剤について認められた活性の％と比較した、Caおよびリン脂質の非存在下での完全または部分的に完全な活性化剤の活性）は、不完全な活性化剤、例えばヒト第X因子またはトロカリンによって示される同じ％より少なくとも1.5、2、4、10、15、20、50、100、1000または4000倍高い。好ましい完全または部分的に完全な活性化剤は、約10-10〜10-6 M、例えば10-8または10-7 Mの濃度でクエン酸加血漿を凝固させ、凝固時間は約50〜15秒であり、Ca2+およびリン脂質非依存性を示している。したがって、プロトロンビン活性化剤は、約10-10〜10-06 Mの濃度範囲で共因子（カルシウムイオンおよび/またはリン脂質）非依存性の速度論特性を示し、この範囲は血液の損失を減少させるために適した作業範囲である。
本発明のSVPには、例えば図21に示すトロカインは含まれない。好ましい態様において、完全なSVPのプロセシングされた軽鎖は、少なくとも1、3、5、10、15、または20残基、トロカリンのプロセシングされた軽鎖とは異なると考えられる。好ましい態様において、完全なSVPのプロセシングされた重鎖は、少なくとも5、10、15、20、または30残基、トロカリンのプロセシングされた重鎖とは異なると考えられる（異なるとは、特に明記していない限り、挿入または欠失によって同一性が異なることを意味する）。
好ましい態様において、本発明の完全なSVPの配列は、以下の特性の1つまたはそれ以上を有し、これは残基41位でセリン以外（全て、図21のコンセンサス番号付けを参照する）、残基48位でイソロイシン以外、残基50位でプロリン以外、残基74位でアスパラギン以外、残基104位でプロリン以外、残基105位でアスパラギン以外、残基123位でリジン以外、残基127位でグルタミン以外、残基142位でアルギニン以外、残基145〜7位でセリン、グルタミン酸、トレオニン以外、残基154位でセリン以外、残基156位でアスパラギン酸以外、残基159位でバリン以外、残基167位でグルタミン酸以外、残基169位でアスパラギン酸以外、残基178位でアラニン以外であると考えられる；配列には、図21のブラウン、タイパン、レッドベリー、タイガー、ラフスケール配列の任意の配列181〜208位からの少なくとも1つの残基（または内陸性タイパンからの対応する残基）が含まれると考えられる；配列は、残基228位でイソロイシン以外、残基229位でアスパラギン以外、残基233位でグリシン以外、残基232位でグルタミン酸以外、残基245位でヒスチジン以外、残基258〜9位でセリン、バリン以外を含むと考えられる；配列は、図21のブラウン、タイパン、レッドベリー、タイガー、ラフスケール配列の任意の配列260〜270位からの少なくとも1つの残基（または内陸性タイパンからの対応する残基）が含まれると考えられる；配列は、274位でアルギニン以外、残基286位でトレオニン以外、残基292〜300位でアスパラギン-チロシン-チロシン-チロシン-バリン-ヒスチジン-グルタミン-アスパラギン以外、残基303位でアルギニン以外、残基305位でアラニン以外、残基314位でアルギニン以外、残基338位でグルタミン酸以外、残基345位でセリン以外、残基353〜360位でRIQFKQPT以外、残基367位でイソロイシン以外、残基368位でトレオニン以外、残基382位でアスパラギン酸以外、残基384位でアルギニン以外、残基387位でグルタミン以外、残基389位でアスパラギン以外、残基424位でイソロイシン以外、残基342位でアルギニン以外、残基451位でリジン以外、残基454〜455位でセリン、ロイシン以外であると考えられる；または配列には、図21のブラウン、タイパン、レッドベリー、タイガー、ラフスケール配列の任意の配列457〜467位からの少なくとも1つの残基（または内陸性タイパンからの対応する残基）が含まれると考えられる。
好ましい態様において、部分的に完全なSVPのプロセシングされた軽鎖は、トロカリンのプロセシングされた軽鎖と、残基少なくとも1、3、5、10または15個異なると考えられる。好ましい態様において、完全なSVPのプロセシングされた重鎖は、トロカリンのプロセシングされた重鎖と、残基少なくとも5、10、15、20、または30個異なると考えられる。
好ましい態様において、本発明の部分的に完全なSVPの配列には、図21のブラウン、タイパン、レッドベリー、タイガー、ラフスケール配列の任意の配列の181〜208位からの少なくとも1つの残基（または内陸性タイパンからの対応する残基）が含まれると考えられる；または図21のブラウン、タイパン、レッドベリー、タイガー、ラフスケール配列の任意の配列260〜270位からの少なくとも1つの残基（または内陸性タイパンからの対応する残基）が含まれると考えられる。
好ましい態様において、SVPは、完全なプロトロンビン活性化因子であり、これには、図24のコンセンサス配列と少なくとも87、89、もしくは90％の配列同一性を有する、または多くて16、14、もしくは13残基異なる軽鎖、または図24のコンセンサス配列と少なくとも82、85、および84％の同一性を有する、または多くて45、39、もしくは40残基異なる重鎖の1つまたは双方が含まれる。
好ましい態様において、完全なSVPには、図24に示されるブラウン、沿岸性タイパン、または内陸性タイパンSVP配列と同一である、少なくとも84、86、もしくは86％の配列同一性を有する、または61もしくは53残基以下で異なる軽鎖および重鎖の1つまたは双方が含まれる。
好ましい態様において、SVPは、部分的に完全なプロトロンビン活性化剤であり、これには、図24の配列と少なくとも84％の配列同一性を有する、または多くて61もしくは53残基異なる軽鎖および重鎖の1つまたは双方が含まれる。
好ましい態様において、部分的に完全なSVPには、図24に示されるレッドベリーブラック、タイガー、またはラフスケールSVP配列と同一である、少なくとも84、80、もしくは82％の配列同一性を有する、または61、76、68残基以下で異なる軽鎖および重鎖の1つまたは双方が含まれる。
他の態様において、本発明は、ヘビ毒プロテアーゼポリペプチド、例えば配列番号：2、5、8、11、14、もしくは17に示されるアミノ酸配列、または配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18の核酸によってコードされるアミノ酸配列；配列番号：2、5、8、11、14、もしくは17に示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列、または配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18の核酸によってコードされるアミノ酸配列；または引用したアミノ酸配列の1つと少なくとも85、90、95、98、もしくは99％の配列同一性を有する、または異なる残基が1、2、5、10、15もしくは20個以下である配列、を有するポリペプチドを提供する。
他の態様において、本発明は、ヘビ毒プロテアーゼ軽鎖ポリペプチド、例えば配列番号：2、5、8、11、14、もしくは17に示される任意のアミノ酸配列のアミノ酸残基41〜179位（番号は、図23におけるコンセンサスの番号付けを参照されたい）、または配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18の核酸によってコードされるアミノ酸配列のアミノ酸残基41〜179位を有する；配列番号：2、5、8、11、14、もしくは17に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基41〜179位と実質的に同一であるアミノ酸配列、または配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18の核酸によってコードされるアミノ酸配列のアミノ酸残基41〜179位と実質的に同一であるアミノ酸配列；または引用したアミノ酸配列の1つと少なくとも85、90、95、98、もしくは99％の配列同一性を有する、または異なる残基が1、2、5、10、15もしくは20個以下である配列、を有するポリペプチドを提供する。
他の態様において、本発明は、ヘビ毒プロテアーゼ重鎖ポリペプチド、例えば、配列番号：2、5、8、11、14、もしくは17に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基235〜少なくとも453位、または配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18の核酸によってコードされるアミノ酸配列のアミノ酸残基235〜少なくとも453位を有する；配列番号：2、5、8、11、14、もしくは17に示されるアミノ酸配列、または配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18の核酸によってコードされるアミノ酸配列のアミノ酸残基235〜少なくとも453位と実質的に同一であるアミノ酸配列；または引用したアミノ酸配列の1つと少なくとも85、90、95、98、もしくは99％配列同一性を有する、または異なる残基が1、2、5、10、15もしくは20個以下である配列、を有するポリペプチドを提供する。
関連する局面において、本発明は、本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼ核酸分子を含む核酸構築物をさらに提供する。
関連する局面において、本発明は、ヘビ毒プロテアーゼポリペプチドまたは非ヘビ毒プロテアーゼポリペプチドに機能的に結合して融合タンパク質を形成する断片を提供する。1つの態様において、ヘビ毒プロテアーゼの軽鎖の1つまたはそれ以上、活性化ポリペプチド、および重鎖毒プロテアーゼをコードする配列を、非ヘビ毒プロトロンビン活性化ポリペプチド、例えばヒト第Xa因子プロペプチドコード配列のプロペプチドをコードする配列に結合させることができる。もう1つの態様において、ヘビ毒プロテアーゼの軽鎖をコードする配列およびヘビ毒プロテアーゼの重鎖をコードする配列を、非ヘビ毒プロトロンビン活性化ポリペプチドの活性化ペプチドをコードする核酸配列、例えばヒト第Xa因子活性化ペプチドコード配列によって、互いに結合させることができる。他の態様において、SVP配列を配列、好ましくは容易に切断可能で、単離を可能にする配列に融合させることができ、例えばGST部分またはエピトープタグに融合することができる。
もう1つの局面において、本発明は、以下からなる群の任意または全てから選択されるアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質を特徴とする。
Figure 0004701355
X1、X2およびX3は如何なるアミノ酸であってもよい。
好ましくは、X1はバリンまたはイソロイシンであり、X2はアスパラギンまたはアスパラギン酸、およびX3はアルギニン、リジン、またはイソロイシンのいずれかである。
1つの態様において、単離されたタンパク質はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
Figure 0004701355
特定の態様において、本発明の該プロトロンビン活性化タンパク質は、ヘビ毒から単離される。好ましくは、本発明の該プロトロンビン活性化タンパク質は、以下からなる非制限的な群から選択されるオーストラリアのヘビの毒液から得ることができる：一般的なブラウンスネーク（Pseudonaja textilis）、タイパン（Oxyuranus scutellatus）、本土タイガー（Notechis scutatus）、ラフスケールド（Tropidechis carinatus）およびレッドベリーブラックスネーク（Pseudechis porphyriacus）を含む任意のブラウンスネーク（Pseudonaja種）。
もう1つの局面において、本発明は、本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする単離された核酸を特徴とする。好ましい態様において、単離された核酸分子は、配列番号：2、5、8、11、14または17のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。他の態様において、本発明は、配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18に示されるヌクレオチド配列、または配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18の完全な相補体を有する単離された核酸分子を提供する。さらに他の態様において、本発明は、配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18に示されるヌクレオチド配列と実質的に同一である核酸分子（例えば、天然に存在する対立遺伝子変種）を提供する。他の態様において、本発明は、核酸が完全長のヘビ毒プロテアーゼポリペプチドまたはその活性断片をコードする、配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18のヌクレオチド配列を含む核酸分子と、本明細書に記述するストリンジェンシー条件でハイブリダイズする核酸分子を提供する。
関連する局面において、本発明はさらに、例えば、本明細書に記述するようなヘビ毒プロテアーゼまたはその一部をコードする核酸分子を含む核酸構築物を提供する。特定の態様において、本発明の核酸分子は、本来のまたは異種調節配列に機能的に結合する。他の態様において、核酸分子には、プロペプチドをコードする配列および活性化ペプチドをコードする配列の1つまたはそれ以上がヘビ毒プロテアーゼに由来しない、プロペプチドをコードする核酸、ヘビ毒プロテアーゼの軽鎖をコードする核酸配列、活性化ペプチドをコードする核酸配列、ヘビ毒プロテアーゼの重鎖をコードする核酸配列が含まれる。例えば、プロペプチドおよび活性化ペプチドをコードする配列の1つまたはそれ以上は、哺乳類のプロトロンビン活性化因子、例えばヒトプロトロンビン活性化剤、例えばヒト第Xa因子に由来しうる。同様に、本発明の核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、例えばヘビ毒プロテアーゼ核酸分子およびポリペプチドを産生するために適したベクターおよび宿主細胞も含まれる。
もう1つの関連する局面において、本発明は、ヘビ毒プロテアーゼをコードする核酸を検出または増幅するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして適した核酸断片を提供する。例えば、本発明には、完全長のヘビ毒プロテアーゼ、例えば本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼ、または本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼの任意のドメインもしくは領域を増幅するために離れて存在するプライマーが含まれる。
さらにもう1つの関連する局面において、ヘビ毒プロテアーゼコード核酸分子に対してアンチセンスである単離された核酸分子を提供する。
本発明はまた、本発明の上記の単離されたタンパク質および核酸の生物活性断片、変種、誘導体、および相同体も企図する。
もう1つの局面において、本発明は、単離されたヘビ毒プロテアーゼポリペプチド、例えば本発明に記載のヘビ毒プロテアーゼポリペプチドに結合する抗体を特徴とする。1つの態様において、抗体は、本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼポリペプチドのプロペプチドもしくはその断片、本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼポリペプチドの軽鎖もしくはその断片、本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼポリペプチドの活性化ポリペプチドもしくはその断片、またはヘビ毒プロテアーゼポリペプチドの重鎖もしくは本明細書に記述のその断片に結合することができる。もう1つの態様において、抗体は、本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼポリペプチドの軽鎖および重鎖の双方を含むヘビ毒プロテアーゼの一部に結合することができる。抗体は、例えば試料からヘビ毒プロテアーゼを単離するために用いることができる。
もう1つの局面において、本発明は、単離されたヘビ毒プロテアーゼポリペプチドまたはその生物活性断片、例えば本明細書に記述の単離されたヘビ毒プロテアーゼポリペプチドと、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む薬学的組成物を特徴とする。1つの態様において、組成物、例えば薬学的組成物は、pH約5〜9、好ましくは約6.5〜7を有する。組成物、例えば薬学的組成物には、さらに例えばポリオールのような安定化剤が含まれうる。そのような態様において、組成物、例えば薬学的組成物には、約5％、10％、20％またはそれ以上のポリオール（または複数のポリオール）が含まれうる。組成物において用いることができるポリオールの例は、グリセロールである。いくつかの態様において、組成物、例えば薬学的組成物は共因子を含まない。もう1つの態様において、組成物、例えば薬学的組成物には、1つまたはそれ以上の共因子、例えば、1つまたはそれ以上のカルシウム、リン脂質、および第Va因子が含まれうる。
もう1つの局面において、本発明は、ヘビ毒ポリペプチドの活性を調節する物質、例えば共因子のような化合物、例えば血液凝固反応および/またはプロトロンビンのトロンビンへのプロセシングを調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。1つの態様において、方法には、プロトロンビンとヘビ毒プロテアーゼ、例えば本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼとの反応混合物を提供すること、および反応混合物を1つまたはそれ以上の共因子（例えば、1つまたはそれ以上のカルシウム、リン脂質、第Va因子およびビタミン、例えばビタミンK）に接触させることが含まれうる。反応混合物にはさらに、例えばフィブリノーゲンが含まれうる。方法はさらに、物質、例えば共因子の非存在下および存在下でヘビ毒プロテアーゼのプロトロンビンプロセシングに及ぼす活性を比較することが含まれうる。もう1つの態様において、本発明には、試料（例えば、血液試料）を提供する段階、物質、例えば共因子の非存在下および存在下で試料をヘビ毒プロテアーゼに接触させる段階、およびヘビ毒プロテアーゼによる凝固に及ぼす共因子の影響を比較する段階が含まれる。さらにもう1つの態様において、方法には、血小板活性化に及ぼす物質の影響を決定するために、物質、例えば共因子の非存在下および存在下で、血小板をヘビ毒プロテアーゼに接触させる段階が含まれうる。
1つの態様において、本発明は、堅固な凝血が形成されるまでの時間を決定することによってヘビ毒ポリペプチド（プロテアーゼ）の活性を測定するために用いることができる、クエン酸加抗凝固全血またはその血漿分画による活性のレベルを測定する方法を特徴とする。測定は、手動で、または任意の自動凝固測定装置によって行うことができる。さらに、プロテアーゼの活性はまた、その基質（プロトロンビン）の特異的ドメインに類似するp-ニトロアニリド（色素産生基質）を結合させたテトラペプチドを用いて測定することができる。このアッセイ法は、基質非依存的混合物において溶液中でのp-ニトロアニリンの形成速度の単純な比色測定である。
もう1つの局面において、本発明は、例えば止血を誘導することによって、対象を治療する方法を特徴とする。方法には、本発明のヘビ毒プロテアーゼを対象に投与して、それによって例えば止血を誘導することによって対象を治療することが含まれる。
好ましい態様において、対象は対象の体の部位または体内の部位からの出血を抑制するように治療される。治療は、医学的処置、例えば手術に関連して起こりうる出血を抑制するために用いることができる。他の態様において、創傷、外傷、または他の事象が治療される。
いくつかの態様において、対象は凝血の形成能または維持能を欠損する。この欠損は、遺伝的欠損によるものとなりうる、または医学的処置の結果、例えば対象の血液凝固の形成または維持能を減少させる薬物、例えばクマジンまたはワルファリンの投与によるものとなりうる。
1つの態様において、ヘビ毒プロテアーゼは、対象以外の人によって投与されるが、他の態様において、ヘビ毒プロテアーゼは自己投与される。対象以外の人は、医療従事者となりうるが、場合によっては医療従事者でないことが考えられる。例えば、いくつかの態様において、産物は、戦場での外傷を治療するために用いられ、医療従事者以外の人によって投与されるであろう。
いくつかの態様において、ヘビ毒プロテアーゼは、それを用いる必要がある前に対象に提供される、例えば血液凝固の形成もしくは維持能に欠損を有する対象の場合、または外傷による損傷のリスクを有すると考えられる人、例えば軍人、危険な機械を用いて作業する人、または一般的に農業もしくは鉱業のような危険を伴う職業に従事している人に提供される。ヘビ毒プロテアーゼは、書面、記録されたオーディオもしくはビデオと共に、またはその使用に関する口頭での説明書と共に提供することができる。
いくつかの態様において、ヘビ毒プロテアーゼは、ユーザー（対象または対象にこれを投与する人）が一定量を投与できるような剤形で提供されると考えられる。このように、ヘビ毒プロテアーゼは、分配装置、例えば、液体、小滴、エアロゾル、乾燥粉末等を分配する装置に、好ましくは一定量で分配することができる。
もう1つの局面において、本発明は、プロトロンビンを活性化する方法を提供する。方法には、プロトロンビンを本発明のヘビ毒プロテアーゼに接触させて、それによって該プロトロンビンを活性化する段階が含まれる。プロトロンビンは、インビトロまたはインビボで活性化することができる。1つの態様において、プロトロンビンには、デスカルボキシプロトロンビンが含まれうる。
特定の態様において、薬学的組成物および止血および/またはプロトロンビン活性化を誘導する方法を用いて、創傷からの血液の損失を防止することができる。そのような1つの態様において、組成物は、組織密封剤および/またはフィブリン膠の組成物であってもよい。同様に、抗線維素溶解物質はそのような態様の一部を形成する可能性があると企図される。抗線維素溶解物質は、テクスチリニン（国際公開公報第99/58569号）、アプロチニンおよびEACAを含む非制限的な群から選択してもよく、その如何なるものも、プラスミンまたはプラスミンの活性化剤の作用の抑制によって血液凝固の溶解を防止するために加えてもよい。
もう1つの局面において、本発明は、タンパク質、核酸、もしくはライブラリ、または例えば本明細書に記述のような核酸もしくはタンパク質配列情報を得る方法を特徴とする。例えば、タンパク質、例えばSVP、例えば本明細書に記述のSVP、またはヘビタンパク質をコードする核酸、例えばSVP、例えば本明細書に記述のSVPをコードする核酸、または本明細書に記述の任意のライブラリを得る方法を特徴とする。これらは本明細書において「コレクションに基づく方法」と呼ばれる。方法には以下が含まれる：シュードナジャ・テキスチリス（Pseudonaja textilis）、シュードナジャ・ヌカリス（Pseudonaja nuchalis）、シュードナジャ・アフィニス（Pseudonaja affinis）、シュードナジャ・インフラマキュラ（Pseudonaja inframacula）、オクシュラヌス・スクテラツス（Oxyuranus scutellatus）、オクシュラヌス・ミクロレピドツス（Oxyuranus microlepidotus）、ノテキス・スクタツス（Notechis scutatus）、ノテキス・アテル・ニゲル（Notechis ater niger）、ノテキス・アテル・セルベンチイ（Notechis ater serventyi）、ホプロセファルス・ステファンシイ（Hoplocephalus stephansii）、シューデキス・ポルフィラクス（Pseudechis porphiracus）、オーストララプス・サーペルバ（Australaps surperba）、トロペデキス・カリナツス（Tropedechis carinatus）からなる非制限的な群より選択されるオーストラリアのヘビを収集する（またはそのようなヘビの組織またはヘビによって産生された組織、例えば卵、または脱皮した皮膚のような廃棄された組織を収集する）段階、およびヘビもしくはヘビの子孫からのタンパク質、核酸、またはライブラリを得る段階、またはヘビもしくはヘビの子孫からのタンパク質もしくは核酸からの配列データを得る段階。
方法は、死亡したオーストラリアのヘビを収集する、または生きたオーストラリアのヘビもしくは生きて損傷を受けたオーストラリアのヘビを捕獲する段階が含まれうる。1つの態様において、方法はさらに、ヘビからの組織を得る段階、例えばヘビから毒液試料を得る段階、および試料、例えば毒液試料からタンパク質、またはタンパク質ライブラリを得る段階が含まれる。他の態様には、ヘビの試料を得る段階、および試料、例えば毒液腺から核酸、または核酸ライブラリを得る段階が含まれる。
方法にはさらに、ヘビまたはその子孫から採取した材料から核酸またはタンパク質配列を決定する段階が含まれうる。
方法にはさらに、採取したヘビまたはその子孫からのタンパク質または核酸ライブラリを作製することが含まれうる。
方法にはさらに、例えば動物、ヒト、または植物の健康、工業的加工または診断において用いるためのポリペプチドを得ることが含まれうる。
もう1つの態様において、方法には、ヘビまたは試料を収集する段階、および方法のその後の段階を行うために、ヘビまたは試料を第二の団体、例えば第三国の団体に送付する段階が含まれる。
もう1つの局面において、本発明は、本明細書に記述の方法によって作製または産生される、例えば本明細書に記述のような、タンパク質、核酸、もしくはライブラリ、または核酸もしくはタンパク質配列情報、例えば本明細書に記述のコレクション法の1つを特徴とする。好ましい態様において、本発明はヘビタンパク質、例えばSVP、例えば本明細書に記述のSVP、またはヘビタンパク質、例えばSVP、例えば本明細書に記述のSVPをコードする核酸、または本明細書に記述の任意のライブラリ、または本明細書に記述の方法、例えば本明細書に記述のコレクション法によって作製もしくは産生される本明細書に記述の任意の核酸もしくはタンパク質の配列情報を特徴とする。
1つの局面において、本発明は、以下の配列を含む単離されたポリペプチドを特徴とする：
Figure 0004701355
式中、X1、X10、X12-13、X15-16、X19-23、X25、X27-30、X33-34、X37、X39、X42-47、X50、X53-56、X58-62、X64、X79、X81-83、X85-94、X96、X99-105、X108-109、X113-115、およびX117-119は、任意のアミノ酸残基から個々に独立して選択される；
X2、X6、X11、X14、X26、X31、X48、X57、およびX63はそれぞれ、小さいアミノ酸残基である；
X3、X4、X8、X17、X18、X35-36、X38、X51-52、X78、X80、X84、X95、X98、X106-107、X111-112、およびX116はそれぞれ、疎水性アミノ酸残基である；
X5、X7、およびX110はそれぞれ、塩基性アミノ酸残基である；
X9、X40-41、およびX49はそれぞれ、荷電アミノ酸残基である；
X24は、酸性アミノ酸残基である；
X32は、中性/極性アミノ酸残基である；
X65-67、X70-72、およびX75は、それぞれ独立して存在しないか、または任意のアミノ酸残基から選択される；
X68およびX74は、それぞれ独立して存在しないか、または酸性アミノ酸残基から選択される；
X69、X73、およびX76は、それぞれ独立して存在しないか、または疎水性アミノ酸残基から選択される；
X77は、存在しないか、または小さいアミノ酸残基である；ならびに
Zは、存在しないか、またはアミノ酸1〜20個のペプチドである。
いくつかの態様において、X1は、疎水性または酸性アミノ酸残基、例えばバリンもしくはその改変型、またはグルタミン酸もしくはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X2は、アラニンもしくはセリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X3は、チロシンもしくはフェニルアラニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X4は、フェニルアラニンもしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X5は、リジンもしくはアルギニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X6は、プロリンもしくはセリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X7は、アルギニンもしくはリジン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X8は、バリンもしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X9は、グルタミン酸もしくはリジン、またはその改変型から選択される。
いくつかの態様において、X10は、中性/極性または酸性アミノ酸残基であり、例えばX10は、アスパラギン酸もしくはアスパラギン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様においてX11は、トレオニンもしくはアラニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X12は、小さいまたは塩基性アミノ酸残基もしくはその改変型であり、例えばX12は、グリシンもしくはアルギニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X13は、疎水性もしくは小さいアミノ酸残基、またはその改変型から選択され、例えばX13は、イソロイシンもしくはトレオニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X14は、プロリンもしくはセリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X15は、小さいもしくは中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX15は、グリシンもしくはアスパラギン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X16は、塩基性もしくは中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX16は、アルギニン、ヒスチジン、もしくはリジン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X17は、バリンもしくはロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X18は、チロシン、フェニルアラニンもしくはロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X19は、塩基性もしくは中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX19は、リジンもしくはグルタミン、またはその改変型から選択される。
いくつかの態様において、X20は、疎水性または小さいアミノ酸残基であり、例えば、X20は、バリン、フェニルアラニン、もしくはアラニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X21は、酸性もしくは疎水性アミノ酸残基であり、例えば、X21は、アスパラギン酸もしくはフェニルアラニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X22は、小さいもしくは塩基性アミノ酸残基であり、例えばX22は、プロリン、アスパラギン酸、もしくはフェニルアラニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X23は、中性/極性または小さいアミノ酸残基であり、例えばX23は、アスパラギンもしくはセリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X24は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X25は、疎水性または小さいアミノ酸残基であり、例えば、X25は、イソロイシンもしくはトレオニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X26は、グリシンもしくはセリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X27は、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばX27は、ロイシンもしくはアルギニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X28は、酸性もしくは疎水性アミノ酸残基であり、例えばX28は、グルタミン酸、アスパラギン酸、もしくはバリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X29は、小さいもしくは酸性アミノ酸残基であり、例えばX29は、グリシンもしくはグルタミン酸、またはその改変型から選択される。
いくつかの態様において、X30は、中性/極性または酸性アミノ酸残基であり、例えば、X30は、アスパラギンもしくはアスパラギン酸、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X31は、トレオニンもしくはアラニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X32は、ヒスチジンもしくはグルタミン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X33は、中性/極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばX33は、アスパラギンもしくはリジン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X34は、小さいもしくは疎水性アミノ酸残基であり、例えば、X34は、トレオニンもしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X35は、ロイシンもしくはバリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X36は、バリンもしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X37は、小さいまたは疎水性アミノ酸残基であり、例えば、X37は、アラニンもしくはバリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X38は、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X39は、酸性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えば、X39は、アスパラギン酸もしくはアスパラギン、またはその改変型から選択される。
いくつかの態様において、X40は、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはリジン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X41は、リジンもしくはグルタミン酸、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X42は、荷電または小さいアミノ酸残基であり、例えばX42は、リジン、グルタミン酸、もしくはグリシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X43は、小さいまたは酸性アミノ酸残基であり、例えば、X43は、グリシン、アスパラギン酸、もしくはグルタミン酸、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X44は、小さいまたは疎水性アミノ酸残基であり、例えばX44は、アラニンもしくはバリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X45は、疎水性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX45は、チロシンもしくはヒスチジン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X46は、小さいまたは中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX46は、トレオニンもしくはアスパラギン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X47は、酸性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えば、X47は、グルタミン酸もしくはグルタミン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X48は、トレオニンもしくはセリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X49は、グルタミン酸もしくはリジン、またはその改変型から選択される。
いくつかの態様において、X50は、小さい疎水性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えば、X50は、トレオニン、メチオニン、ヒスチジン、もしくはセリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X51は、イソロイシンもしくはバリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X52は、バリンもしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X53は、酸性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX53は、アスパラギン酸もしくはアスパラギン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X54は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばX54は、アルギニンもしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X55は、小さいまたは塩基性アミノ酸残基であり、例えばX55は、アラニンもしくはリジン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X56は、酸性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX56は、グルタミン酸もしくはアスパラギン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X57は、プロリンもしくはトレオニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X58は、小さいまたは塩基性アミノ酸残基であり、例えばX58は、グリシンもしくはアルギニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X59は、小さい、塩基性、または中性/極性アミノ酸残基残基であり、例えばX59は、プロリン、アルギニン、もしくはヒスチジン、またはその改変型から選択される。
いくつかの態様において、X60は、疎水性または小さいアミノ酸残基であり、例えばX60は、バリン、イソロイシンもしくはアラニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X61は、塩基性、中性/極性または小さいアミノ酸残基であり、例えばX61は、リジン、グルタミンもしくはトレオニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X62は、小さいまたは疎水性アミノ酸残基であり、例えばX62は、プロリンもしくはロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X63は、プロリンもしくはアラニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X64は、塩基性、小さい、または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX64は、リジン、トレオニン、もしくはアスパラギン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X65は、存在する場合、塩基性の小さいまたは疎水性アミノ酸残基であり、例えば、X65は、リジン、セリン、もしくはチロシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X66は、存在する場合、小さいまたは疎水性アミノ酸残基であり、例えば、X66は、セリン、グリシンもしくはチロシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X67は、存在する場合、中性/極性または疎水性アミノ酸残基であり、例えば、X67は、グルタミンもしくはチロシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X68は、存在する場合、グルタミン酸またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X69は、存在する場合、フェニルアラニンもしくはバリン、またはその改変型から選択される。
いくつかの態様において、X70は、存在する場合、疎水性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX70は、チロシンもしくはヒスチジンまたはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X71は、存在する場合、酸性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX71は、グルタミン酸もしくはグルタミン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X72は、存在する場合、塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX72は、リジンもしくはアスパラギン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X73は存在する場合、フェニルアラニンもしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X74は、存在する場合、アスパラギン酸もしくはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X75は存在する場合、疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、例えば、X75は、ロイシンもしくはアルギニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X76は存在する場合、バリンもしくはフェニルアラニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X77は存在する場合、セリもしくはアラニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X78はイソロイシンもしくはロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X79は、中性/極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばX79は、グルタミンもしくはアルギニン、またはその改変型から選択される。
いくつかの態様において、X80は、メチオニンもしくはロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X81は、中性/極性、または塩基性アミノ酸残基であり、例えばX81は、アスパラギンもしくはリジン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様においてX82は、中性/極性、または酸性アミノ酸残基であり、例えばX82はグルタミン、もしくはグルタミン酸、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X83は、疎水性または小さいアミノ酸残基であり、例えばX83は、フェニルアラニンもしくはセリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X84は、バリンもしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X85は、小さい塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX85はグリシン、アルギニン、もしくはヒスチジン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X86は、疎水性または小さいアミノ酸残基であり、例えばイソロイシンもしくはトレオニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X87は、疎水性、塩基性、または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX87はフェニルアラニン、アルギニンもしくはグルタミン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X88は酸性の小さい、または疎水性のアミノ酸残基であり、例えばX88は、グルタミン酸、セリン、もしくはフェニルアラニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X89は、塩基性の小さいまたは疎水性アミノ酸残基であり、例えば、X89は、アルギニン、リジン、グリシン、もしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。
いくつかの態様において、X90は、小さいまたは中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX90は、グリシンもしくはグルタミン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X91は、小さい、中性/極性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばX91は、プロリン、グルタミン、もしくはチロシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X92は、中性/極性、または小さいアミノ酸残基であり、例えば、X92は、アスパラギン、グルタミン、もしくはトレオニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X93は、塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX93は、リジンもしくはアスパラギン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X94は、小さいまたは疎水性アミノ酸残基であり、例えばX94は、トレオニンもしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X95は、ロイシン、バリン、もしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X96は、塩基性または小さいアミノ酸残基であり、例えばX96は、リジンもしくはトレオニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X97は、バリンもしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X98は、ロイシンもしくはバリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X99は、中性/極性または酸性アミノ酸残基であり、例えばX99は、アスパラギン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸、またはその改変型から選択される。
いくつかの態様において、X100は、疎水性または小さいアミノ酸残基であり、例えばX100は、フェニルアラニンもしくはセリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X101は、小さいまたは塩基性のアミノ酸残基であり、例えばX101は、プロリンもしくはアルギニンまたはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X102は小さいまたは中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX102は、プロリンもしくはグルタミン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X103は、小さいまたは中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX103は、トレオニンもしくはアスパラギン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X104は、中性/極性または塩基性アミノ酸残基であり、例えばX104は、グルタミンもしくはアルギニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X105は、塩基性または小さいアミノ酸残基であり、例えばX105は、アルギニンもしくはグリシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X106は、イソロイシンもしくはバリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X107は、バリンもしくはイソロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X108は、塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX108は、アルギニン、グルタミン、もしくはリジン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X109は、塩基性または小さいアミノ酸残基であり、例えばX109は、リジンもしくはトレオニン、またはその改変型から選択される。
いくつかの態様において、X110は、アルギニンもしくはリジン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X111は、イソロイシンもしくはバリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X112は、ロイシンもしくはバリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X113は、塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX113は、リジンもしくはアスパラギン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X114は、小さいまたは疎水性アミノ酸残基でり、例えばX114は、プロリンもしくはロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X115は、塩基性または小さいアミノ酸残基であり、例えばX115は、アルギニン、リジン、もしくはアラニン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X116は、イソロイシンもしくはバリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X117は、塩基性または小さいアミノ酸残基であり、例えばX117は、アルギニンもしくはセリン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X118は中性/極性、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、例えばX118は、グルタミン、リジン、もしくはロイシン、またはその改変型から選択される。いくつかの態様において、X119は、塩基性または中性/極性アミノ酸残基であり、例えばX119は、リジンもしくはヒスチジン、またはその改変型から選択される。
いくつかの態様において、Zは、存在して、配列X118PSTESSTGRLを含み、この場合、X118は任意のアミノ酸残基である。いくつかの態様において、X118は、疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、例えばX118は、ロイシンもしくはグルタミン、またはその改変型から選択される。
いくつかの態様において、X65-77は、アミノ酸n個の配列を表し、この場合、nはアミノ酸残基0〜13個であり、例えば配列は
Figure 0004701355
から選択され、式中X119は、小さいアミノ酸残基であり、例えばX119は、セリンもしくはグリシン、またはその改変型から選択され；およびX120は、任意のアミノ酸残基であり、例えばX120は、グルタミンもしくはチロシン、またはその改変型から選択される。
本発明の他の特徴および長所は、以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかとなると考えられる。
表の簡単な説明
表1：セファクリルS-300を用いたブラウンスネーク毒プロテアーゼの精製の際の試料の特徴付け。
表2：スーパーデックス200を用いたブラウンスネーク毒プロテアーゼの精製の際の試料の特徴付け。
表3：ブラウンスネーク毒プロテアーゼ、プロトコール1の精製の際の特徴付け。
表4：ブラウンスネーク毒プロテアーゼ、プロトコール2の精製の際の特徴付け。
表5：ブラウンスネーク毒プロテアーゼ、プロトコール3の精製の際の特徴付け。
表6：ブラウンスネーク毒プロテアーゼ、プロトコール4の精製の際の特徴付け。
表7：補助成分の存在下および非存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体によるS-2222の加水分解（ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体単独、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体＋10 mM CaCl2、ならびにブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体＋10 mM CaCl2およびリン脂質）。
表8：ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体単独、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体＋10 mM CaCl2、ならびにブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体＋10 mM CaCl2およびリン脂質によるクエン酸加血漿の凝固時間。
表9：P.テクスチリス（ブラウンスネーク）に由来する単離ヘビ毒プロテアーゼを加えた、Ca2+の存在下および非存在下でのクエン酸加血漿の凝固アッセイの凝固時間。
表10：ブラウンスネーク毒プロテアーゼによるクエン酸加血漿の凝固。
表11：10 mM Ca2+の存在下、または非存在下でのP.テクスチリス（ブラウンスネーク）に由来する単離ヘビ毒プロテアーゼによるS-2222の加水分解の初回速度。
表12：40 mM CaCl2の存在下および非存在下、ならびに40 mM CaCl2単独の場合の、ブラウンスネーク毒プロテアーゼを用いたヒトクエン酸加血漿において生成された凝血のおおよその凝固時間。
表13：様々な方法によるブラウンスネーク毒プロテアーゼの分子量の決定。
表14：ブラウンスネーク毒プロテアーゼによって処置したマウス尾静脈出血モデルにおける血液損失量。
表15：ブラウンスネーク毒プロテアーゼ（試験）および生理食塩液（対照）処置マウスからの血液損失量。それぞれの個々の試験マウスに関するデータを示し、同様に血液損失量の平均値±標準偏差（SD）である。
表16：様々なオーストラリアのヘビ毒および外来のヘビ毒によるクエン酸加ヒト血漿の凝血。
発明の詳細な説明
ヘビ毒は、血小板の凝集、線維素溶解、および凝固カスケードの経路において凝固因子の抑制および/または活性化を通して、哺乳類の止血メカニズムに影響を及ぼす豊富なタンパク質および他の成分源である。オーストラリアのコブラヘビ種に独自のヘビ毒プロテアーゼは、特に注目される。通常、プロトロンビンのその活性型トロンビンへのタンパク質溶解による切断は、哺乳類の系におけるプロトロンビナーゼ複合体によって触媒される。プロトロンビナーゼにおける機能的プロテアーゼは第Xa因子である。しかし、その最適な活性のために、Xa酵素は、カルシウムイオンおよびリン脂質の存在下で共因子として第Va因子を必要とする。
本発明は、一部、オーストラリアのヘビ毒からのヘビ毒プロテアーゼの単離に基づく。オーストラリアのヘビの例には、オーストラリアの一般的なブラウンスネークであるシュードナジャ・テクスチリス、沿岸性タイパン（オクシュラヌス・スクテラツス）、内陸性タイパン（オクシュラヌス・ミクロレピドツス）、本土タイガー（ノテキス・スクタツス）、ラフスケールド（トロピデキス・カリナツス）、およびレッドベリーブラックスネーク（シューデキス・ポルフィリアクス）、ならびにコブラ属の他のヘビが含まれる。本発明のヘビ毒プロテアーゼは、インビボで第Xa因子の作用を模倣して、プロトロンビンをトロンビンに切断するが、それらは第Va因子、リン脂質およびカルシウムイオンのような共因子の非存在下でもその作用を行う。このように、本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼは、完全または部分的に完全なプロトロンビン活性化因子として作用する。本明細書において用いられる「完全なプロトロンビン活性化因子」という用語は、カルシウム、リン脂質、および第Va因子の非存在下でプロトロンビンをトロンビンに処理するヘビ毒プロテアーゼを指す。完全なプロトロンビン活性化因子として作用するヘビ毒プロテアーゼの例には、ブラウンスネークおよびタイパンスネークからのヘビ毒プロテアーゼが含まれる。本明細書において用いられる「部分的に完全なプロトロンビン活性化因子」という用語は、カルシウムおよびリン脂質の非存在下であるが第Va因子の存在を必要として、プロトロンビンをトロンビンに処理するヘビ毒プロテアーゼを指す。
1つの特定の態様において、本発明は、オーストラリアの一般的なブラウンスネークであるシュードナジャ・テクスチリス、沿岸性タイパン（オクシュラヌス・スクテラツス）または内陸性タイパン、本土タイガー（ノテキス・スクタツス）、ラフスケールド（トロピデキス・カリナツス）、およびレッドベリーブラックスネーク（シューデキス・ポルフィリアクス）の毒液から単離した単離されたヘビ毒プロテアーゼを提供する。
本発明のヘビ毒プロテアーゼは、本明細書において「ヘビ毒プロテアーゼ複合体」と呼ぶプロトロンビナーゼ複合体から単離してもよい。ヘビ毒プロテアーゼ複合体は、いくつかのタンパク質および/または共因子を含んでもよい。本発明のヘビ毒プロテアーゼには、例えば、図23に示されるタンパク質、およびそのタンパク質溶解によって消化された小断片が含まれる。図23は、ブラウンスネークのヘビ毒プロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号：2）；沿岸性タイパンスネークのヘビ毒プロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号：5）；内陸性タイパンスネークのヘビ毒プロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号：8）；レッドベリーブラックスネークのヘビ毒プロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号：11）；タイガースネークのヘビ毒プロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号：14）；およびラフスケールスネークのヘビ毒プロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号：17）を示す。
本発明のヘビ毒プロテアーゼは、互いに共通する有意な数の構造特徴を含む。本発明のタンパク質および核酸を参照する場合の「ファミリー」という用語は、共通の構造ドメインまたはモチーフを有し、本明細書に定義する十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性を有する2つまたはそれ以上のタンパク質または核酸分子を意味する。そのようなファミリーメンバーは、天然のまたは天然に存在しないメンバーであってもよく、同じまたは異なる種に由来していてもよい。ファミリーメンバーはまた、共通の機能的特徴を有しうる。
本明細書において用いられるように、「ヘビ毒プロテアーゼ活性」、「ヘビ毒プロテアーゼの生物活性」、または「ヘビ毒プロテアーゼの機能的活性」とは、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質、ポリペプチド、または核酸分子によって発揮される活性を指す。例えば、ヘビ毒プロテアーゼ活性は、以下の1つまたはそれ以上となりうる：プロトロンビンのトロンビンへの処理能（例えば、プロトロンビンのアルギニン残基274位とトレオニン残基275位のあいだ、およびプロトロンビンのアルギニン残基323位とイソロイシン残基324位のあいだでのプロトロンビンの切断能、例えばプロトロンビンのアルギニン残基274位とトレオニン残基275位のあいだ、およびプロトロンビンのアルギニン残基323位とイソロイシン残基324位のあいだでプロトロンビンを切断するが、アルギニン残基155位とセリン残基156位および/またはアルギニン残基286位とトレオニン残基287位のあいだではプロトロンビンを切断できないこと）；クエン酸処置血漿における凝血生成能；カルシウムおよびリン脂質の非存在下でのプロトロンビンの処理能および/または凝血生成能。本発明の単離されたヘビ毒プロテアーゼは、例えば表8〜12に示すようにカルシウムイオンとは全く無関係にプロトロンビナーゼ活性を有することを特徴とする。
本発明は、完全または部分的に完全なプロトロンビン活性化因子であるヘビ毒ポリペプチドおよびその生物活性断片を特徴とする。完全または部分的な活性化因子は、不完全な活性化因子、例えばヒト第X因子またはトロカリンより、共因子の非存在下でも有意に大きい活性を示す。本発明の完全または部分的に完全な活性化因子の態様は、Ca2+およびリン脂質と併用した場合に完全なプロトロンビン活性化因子の活性の約0.4％である活性レベルを有する。好ましい態様において、完全または部分的に完全なプロトロンビン活性化因子単独の活性は、不完全な活性化因子、例えばヒト第Xa因子またはトロカリン単独の場合より少なくとも1.5、2、4、10、15、20、50、100、1000、または4000倍（2〜4次数）高い。この比較は、同じまたは類似の条件で測定した、例えばCaおよびリン脂質の非存在下でヘビ毒プロテアーゼと不完全な活性化因子とのあいだで行う。好ましい態様において、完全または部分的に完全な活性化因子の活性の％（すなわち、Caおよびリン脂質の存在下における完全または部分的に完全な活性化因子について認められる活性の％としての、Caおよびリン脂質の非存在下における同じ活性化因子の活性）は、不完全な活性化因子、例えばヒト第X因子またはトロカリンによって示される同じ％より少なくとも1.5、2、4、10、15、20、50、100、1000、または4000倍高い。好ましい完全または部分的に完全な活性化因子は、約10-10〜10-06 M、例えば10-8〜10-7 Mの濃度で、約50〜15秒の凝固時間でクエン酸加血漿を凝血させ、Ca2+およびリン脂質非依存性を示すと考えられる。したがって、プロトロンビン活性化因子は、濃度範囲約10-10〜10-06 Mで共因子（カルシウムイオンおよび/またはリン脂質）非依存性の速度論特性を示し、これは血液の損失を減少させるために適した濃度範囲である。
配列番号：2、5、8、11、14および17における配列のヘビ毒プロテアーゼタンパク質、その断片、および誘導体、ならびに他の変種は、集合的に「本発明のポリペプチドまたはタンパク質」または「ヘビ毒プロテアーゼポリペプチドまたはタンパク質」と呼ぶ。そのようなポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸分子は、集合的に「本発明の核酸」または「ヘビ毒プロテアーゼをコードする核酸」と呼ぶ。ヘビ毒プロテアーゼ分子とは、ヘビ毒プロテアーゼ核酸、ポリペプチド、および抗体を指す。
本明細書において用いられるように、「核酸分子」という用語には、DNA分子（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）、RNA分子（例えば、mRNA）およびDNAまたはRNAの類似体が含まれる。DNAまたはRNA類似体は、ヌクレオチド類似体から合成することができる。核酸分子は一本鎖または二本鎖となりうるが、好ましくは二本鎖DNAである。図26は、ブラウンスネークからのヘビ毒プロテアーゼをコードする核酸配列（配列番号：1、コード領域、配列番号：3）；沿岸性タイパンスネークからのヘビ毒プロテアーゼをコードする核酸配列（配列番号：4、コード領域、配列番号：6）；内陸性タイパンスネークからのヘビ毒プロテアーゼをコードする核酸配列（配列番号：7、コード領域、配列番号：9）；レッドベリーブラックスネークからのヘビ毒プロテアーゼをコードする核酸配列（配列番号：10、コード領域、配列番号：12）；タイガースネークからのヘビ毒プロテアーゼをコードする核酸配列（配列番号：13、コード領域、配列番号：15）；およびラフスケールスネークからのヘビ毒プロテアーゼをコードする核酸配列（配列番号：16、コード領域、配列番号：18）を示す。
「単離された核酸分子」または「精製された核酸分子」という用語には、核酸の天然の起源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子が含まれる。例えば、ゲノムDNAに関して、「単離された」という用語には、ゲノムDNAが天然において会合している染色体から分離されている核酸分子が含まれる。好ましくは「単離された」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムDNAにおいて核酸に本来隣接する配列（すなわち、核酸の5'および/または3'末端に存在する配列）を含まない。例えば、様々な態様において、単離された核酸分子は、核酸分子が由来する細胞のゲノムDNAにおいて核酸分子に本来隣接する5'および/または3'ヌクレオチド配列の約5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb、または0.1 kb未満を含みうる。その上、cDNA分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技術によって産生された場合には他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まず、または化学合成された場合には化学前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
本明細書において用いられるように、「低ストリンジェンシー、中等度のストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記述する。ハイブリダイゼーション反応を行うための指針は、参照として本明細書に組み入れられる、「Current Protocols in Molecular Biology」、ジョンウィリー＆サンズ、ニューヨーク州（1989）、6.3.1〜6.3.6に見ることができる。その参考文献において水性法および非水性法が記述されているが、いずれも用いることができる。本明細書において言及される特異的ハイブリダイゼーション条件は、以下の通りである：1）6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）において約45℃の後に0.2×SSC、0.1％SDSにおいて少なくとも50℃で少なくとも2回の洗浄を行う低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（洗浄温度は低ストリンジェンシー条件の場合55℃まで増加することができる）；2）6×SSCで約45℃の後に0.2×SSC、0.1％SDSにおいて60℃で一回またはそれ以上の洗浄を行う中等度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件；3）6×SSCで、約45℃の後に0.2×SSC、0.1％SDSにおいて65℃で1回またはそれ以上の洗浄を行う高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件；および好ましくは4）0.5 Mリン酸ナトリウム、7％SDSにおいて65℃の後に、0.2×SSC、1％SDSにおいて65℃で1回またはそれ以上の洗浄を行う非常に高ストリンジェンシー条件。非常に高いストリンジェンシー条件（4）は、好ましい条件であり、特に明記していない限りこれを使用すべきである。
好ましくは、本明細書に記述のストリンジェンシー条件で、配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、または18の配列とハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。
本明細書において用いられるように、「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有するRNAまたはDNA分子を指す。例えば、天然に存在する核酸分子は天然のタンパク質をコードしうる。
本明細書において用いられるように、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを少なくとも含む核酸分子を指す。遺伝子は選択的に、さらに非コード配列、例えば調節配列およびイントロンを含みうる。
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質は、タンパク質が由来する細胞もしくは組織源からの細胞材料もしくは他の混入タンパク質を実質的に含まない、または化学合成される場合には化学前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない。「実質的に含まない」とは、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の調製物が少なくとも10％純粋であることを意味する。好ましい態様において、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の調製物は、非ヘビ毒プロテアーゼタンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも呼ぶ）、または化学前駆物質もしくは非ヘビ毒プロテアーゼ化学物質を約30％、20％、10％未満、およびより好ましくは5％（乾燥重量で）を有する。ヘビ毒プロテアーゼタンパク質またはその生物活性部分が組換えによって産生される場合、同様にこれは好ましくは培養培地を実質的に含まない、すなわち培養培地は、タンパク質調製物の容量の約20％未満、より好ましくは約10％未満、および最も好ましくは約5％未満を占める。本発明には、乾燥重量で少なくとも0.01、0.1、1.0および10 mgの単離または精製調製物が含まれる。
「非必須」アミノ酸残基は、ヘビ毒プロテアーゼ活性を消失させる、または実質的に変化させることなく、ヘビ毒プロテアーゼの野生型配列から変化しうる残基である。好ましくは、変化は、ヘビ毒プロテアーゼ活性を実質的に変化させない、例えば活性は野生型の少なくとも20％、40％、60％、70％または80％である。「必須」アミノ酸残基は、ヘビ毒プロテアーゼの野生型配列から変化する場合に、野生型活性の20％未満が存在するようにヘビ毒プロテアーゼ活性を消失させる残基である。例えば、ヘビ毒プロテアーゼにおける保存的アミノ酸残基、例えば図24に示すヘビ毒プロテアーゼは、特に変化を受けにくいと予想される。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。このように、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質における予想される非必須アミノ酸残基を、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからのもう1つのアミノ酸残基に置換する。または、もう1つの態様において、ヘビ毒プロテアーゼコード配列の全てまたは一部に沿って、飽和変異誘発のような方法によって、変異を無作為に導入することができ、得られた変異体を、ヘビ毒プロテアーゼ生物活性に関してスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、または18の変異誘発の後、コードされるタンパク質を組換えによって発現させることができ、タンパク質の活性を決定することができる。
アミノ酸残基は、一般的に以下のような主要なサブクラスに分類することができる。
酸性：残基はHイオンの喪失により、生理的pHで陰電荷を有し、残基は、生理的pHでペプチドが水性培地に存在する場合、それが含まれるペプチドの構造における表面の位置を求めるために、水溶液によって誘引される。酸性側鎖を有するアミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸が含まれる。
塩基性：残基は、生理的pHまたはその1もしくは2 pH単位（例えば、ヒスチジン）でHイオンとの会合により陽電荷を有し、残基は、生理的pHでペプチドが水性培地に存在する場合、それが含まれるペプチドの構造における表面の位置を求めるために、水溶液によって誘引される。塩基性側鎖を有するアミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる。
荷電：残基は、生理的pHで荷電しており、したがってこれには酸性または塩基性側鎖を有するアミノ酸（すなわちグルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、およびヒスチジン）が含まれる。
疎水性：残基は生理的pHで荷電しておらず、残基は、生理的pHでペプチドが水性培地に存在する場合、それが含まれるペプチドの構造における内部の位置を求めるために、水溶液によって反発される。疎水性側鎖を有するアミノ酸には、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンが含まれる。
中性/極性：残基は、生理的pHで荷電していないが、ペプチドが水性培地に存在する場合、それが含まれるペプチドの構造における内部の位置を求めるほど十分には、水溶液によって反発されない。中性/極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリン、および/またはトレオニンが含まれる。
この説明はまた、たとえ極性基を欠損していても、その側鎖が疎水性を付与するほど十分に大きくないことから特定のアミノ酸を「小さい」と特徴づける。プロリンを例外として、「小さい」アミノ酸は、少なくとも1つの極性基が側鎖に存在する場合には炭素4個またはそれ未満であり、極性基が存在しない場合には炭素3個またはそれ未満のアミノ酸である。小さい側鎖を有するアミノ酸には、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンが含まれる。遺伝子コードされる二次アミノ酸であるプロリンは、ペプチド鎖の二次構造に及ぼすその既知の作用のために特殊な例である。プロリンの構造は、その側鎖がα炭素のみならずαアミノ基の窒素にも結合するという点において、他の全ての天然に存在するアミノ酸とは異なる。しかし、いくつかのアミノ酸類似性行列（例えば、例としてDayhoffら（1978）「A model of evolutonary change in proteins. Matrices for determining distance relationships」、M.O.Dayhoff（編）、「Atlas of protein sequence and structure」、第5巻、345〜358頁、米国国立生物医学研究基金、ワシントンDC；およびGonnetら、1992、Science 256（5062）：144301445に開示されるPAM120行列およびPAM250行列）では、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンと同じグループにプロリンを含めている。したがって、本発明の目的に関して、プロリンは「小さい」アミノ酸として分類される。
極性または非極性の分類に必要な誘引または反発の程度は、任意であり、したがって、本発明によって特に企図されるアミノ酸は、どちらか一方であると分類されている。特に名前が挙げられていないほとんどのアミノ酸は、既知の挙動に基づいて分類することができる。アミノ酸残基は、さらに環状または非環状、芳香族または非芳香族、残基の側鎖置換基に関する自明の分類、および小さいまたは大きいとして細分類することができる。残基は、さらなる極性置換基が存在する場合には、カルボキシル炭素を含めて全体で炭素原子4個またはそれ未満を含む場合に小さいと見なされ、置換基が存在しない場合には3個またはそれ未満を含む場合、小さいと見なされる。当然、小さい残基は、常に非芳香族である。
天然に存在するタンパク質アミノ酸に関して、上記のスキームに従う細分類を以下の表に示す。
アミノ酸の細分類
Figure 0004701355
遺伝子コードされる二次アミノ酸であるプロリンは、ペプチド鎖の二次構造に及ぼすその既知の作用により特殊な例であり、したがってこのグループに含めない。
SVPに含まれてもよい「改変された」アミノ酸は、例えば、メチル基の付加、または他の置換基との共有結合による誘導体化、酸化還元、または他の共有結合による改変によって、遺伝子の翻訳後にプロセシングされている遺伝子コードアミノ酸である。得られた改変されたアミノ酸が入る分類は、改変型の特徴によって決定されるであろう。例えば、リジンがεアミノ基のアシル化によって改変される場合、改変型は塩基性ではなくて極性/大きいと分類されるであろう。
遺伝子コードによってコードされない特定の一般的に認められるアミノ酸には、例えばβアラニン（β-Ala）または3-アミノプロピオン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸（2,3-diaP）、4-アミノ酪酸等のような他のωアミノ酸、αアミノイソ酪酸（Aib）、サルコシン（Sar）、オルニチン（Orn）、シトルリン（Cit）、t-ブチルアラニン（t-BuA）、t-ブチルグリシン（t-BuG）、N-メチルイソロイシン（N-MeIle）、フェニルグリシン（Phg）、およびシクロヘキシルアミン（Cha）、ノルロイシン（Nle）、2-ナフチルアラニン（s-NaI）；1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸（Tic）；β-2-チエニルアラニン（Thi）、メチオニンスルホキシド（MSO）、およびホモアルギニン（Har）が含まれる。これらも同様に都合よく特定の分類に入る。
上記の定義に基づくと、Sar、β-Ala、およびAibは小さく；t-BuA、t-BuG、N-MeIle、Nle、Mvl、Cha、Phg、Nal、Thi、およびTicは疎水性であり；2,3-diaP、Orn、およびHarは塩基性；Cit、アセチルLysおよびMSOは中性/極性/大きい。様々なωアミノ酸が、大きさに従って小さい（β-Alaおよび3-アミノプロピオン酸）または大きくて疎水性（他の全て）であると分類される。遺伝子によってコードされるアミノ酸の他のアミノ酸置換も同様に本発明の範囲に含まれるSLEに含めることができ、この一般的スキームにおいてその構造に従って分類することができる。
本発明の全てのSVPにおいて、1つまたはそれ以上の結合（-CO-NH-）は選択的に、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2、-CH=CH-（シスおよびトランス）、-COCH2-、-CH(OH)CH2-および-CH2SO-のような同配体であるもう1つの結合によって置換してもよい。この置換は、当技術分野で既知の方法によって行うことができる。以下の参考文献は、これらのもう1つの結合部分を含むペプチド類似体の調製について記述している。
Figure 0004701355
本明細書において用いられるように、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の「生物活性部分」には、相互作用、例えば分子内または分子間相互作用に関与するヘビ毒プロテアーゼタンパク質の断片が含まれる。分子間相互作用は、特異的結合相互作用または酵素的相互作用となりうる（例えば、相互作用は一過性であり、共有結合は形成され、または破壊される）。分子間相互作用は、ヘビ毒プロテアーゼ分子と非ヘビ毒プロテアーゼ分子、例えばプロトロンビンのあいだ、または第一のヘビ毒プロテアーゼ分子、例えばヘビ毒プロテアーゼの軽鎖と第二のヘビ毒プロテアーゼ分子とのあいだ（例えば、二量体形成相互作用）で起こりうる。ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の生物活性部分には、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質のアミノ酸配列、例えば完全長のヘビ毒プロテアーゼタンパク質より少ないアミノ酸を含み、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の少なくとも1つの活性を示す、配列番号：2、5、8、11、14、または17に示されるアミノ酸配列と十分に相同なまたは由来するアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。典型的に、生物活性部分は、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の少なくとも1つの活性、例えばカルシウムおよび/またはリン脂質の非存在下での、例えばプロトロンビンのトロンビンへの処理能、を有するドメインまたはモチーフを含む。ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の生物活性部分は、例えば長さがアミノ酸10、25、50、100、200、またはそれ以上であるポリペプチドとなりうる。好ましくは、該断片は、本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼのプロトロンビン処理活性の1％、好ましくは10％、より好ましくは25％、およびさらにより好ましくは50％を有する「生物活性部分」である。
本発明は、本発明のヘビ毒プロテアーゼの「断片」を企図する。「断片」という用語には、その範囲にヘビ毒プロテアーゼの重鎖および軽鎖断片が含まれる。1つの態様において、断片は、下記に示されるアミノ酸配列を含むペプチドである（残基の番号は図27に示す通り）。
Figure 0004701355
Xは如何なるアミノ酸であってもよい。
上記のペプチド断片のペプチド小断片も同様に企図され、例えば配列番号：19および20に示されるペプチドはそれぞれ、配列番号：24に示されるペプチドのそれぞれの小断片である。他の断片および小断片は、当業者によって選択してもよい。さらにもう1つの態様において、「断片」は、小さいペプチドであり、例えば長さがアミノ酸少なくとも6個、好ましくは少なくとも10個、およびより好ましくは少なくとも20個である。1つより多いペプチドを含むより大きい断片も同様に企図され、標準的な組換え核酸技術の適用によって得てもよく、または通常の液相もしくは固相合成技術によって合成してもよい。または、ペプチドは、エンドLys-C、エンドArg-C、エンドGlu-C、およびブドウ球菌V8プロテアーゼのようなプロテナーゼによる本発明のポリペプチドの消化によって産生することができる。消化された断片は、例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC）技術によって精製することができる。
配列間の相同性または配列同一性（用語は本明細書において互換的に用いられる）の計算は、以下のように行う。
2つのアミノ酸配列、または2つの核酸配列の％同一性を決定するために、配列を最適な比較目的のために並列化する（例えば、最適なアラインメントとなるように第一および第二のアミノ酸または核酸配列の1つまたは双方にギャップを導入することができ、比較目的のために相同でない配列を無視することができる）。好ましい態様において、比較目的のために並列化される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、60％、およびさらにより好ましくは少なくとも70％、80％、90％、100％である。次に、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置が第二の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置で同一である（本明細書において用いられるように、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。
2つの配列間の％同一性は、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮して、配列によって占有される同一の位置の数の関数である。
配列の比較および2つの配列間の％同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。好ましい態様において、2つのアミノ酸配列の％同一性は、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）におけるGAPプログラムに組み入れられているNeedlemanおよびWunsch（（1970）、J. Mol. Biol. 48：444〜453）のアルゴリズムを用いて、Blossum 62行列またはPAM260行列のいずれかを用いて、ギャップの重み16、14、12、10、8、6、または4および長さの重み1、2、3、4、5、または6を用いて決定される。さらにもう1つの好ましい態様において、2つのヌクレオチド配列間の％同一性は、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）におけるGAPプログラムを用いて、NWSgapdna.CMP行列、ギャップの重み40、50、60、70、または80および長さの重み1、2、3、4、5、または6を用いて決定される。特に好ましいパラメータの組（および特に明記していなければ用いるべきであるパラメータ）は、Blossum 62スコア行列であり、ギャップペナルティ12、ギャップ延長ペナルティ4、およびフレームシフトギャップペナルティ5である。
2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の％同一性は、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み入れられているE. MeyersおよびW. Miller（（1989）、CABIOS 4：11〜17）のアルゴリズムを用いて、PAM120加重残基表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を用いて決定することができる。
本明細書に記述の核酸およびタンパク質配列は、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために公共のデータベースに対する検索を行うための「問い合わせ配列」として用いることができる。そのような検索は、Altschulら（1990）、J. Mol. Biol. 215：403〜10のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）を用いて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラムを用いて、本発明の核酸分子53010個に対して相同なヌクレオチド配列を得るために、スコア＝100、ワード長＝12によって行うことができる。BLASTタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子53010個と相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3を用いて行うことができる。比較目的のためにギャップを挿入したアラインメントを得るために、Altschulら（1997）、Nucleic Acids Res. 25：3389〜3402に記述されるように、ギャップドBLASTを利用することができる。BLASTおよびギャップドBLASTプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
特に好ましい本発明のヘビ毒プロテアーゼポリペプチドは、配列番号：2、5、8、11、14、または17のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列において、「実質的に同一である」という用語は、本明細書において第一と第二のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび/または共通の機能的活性を有しうるように、第二のアミノ酸配列における並列化したアミノ酸残基と（i）同一である、または（ii）その保存的置換である、アミノ酸残基の十分かつ最小数を含む第一のアミノ酸を指す。例えば、配列番号：2、5、8、11、14、または17と少なくとも約60％または65％の同一性、おそらく75％の同一性、さらにはおそらく85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は実質的に同一であると呼ばれる。
ヌクレオチド配列の場合、「実質的に同一である」とは、本明細書において、第一と第二のヌクレオチド配列が共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードする、または共通の構造ポリペプチドドメインもしくは共通の機能的ポリペプチド活性をコードするように、第二の核酸配列における並列化したヌクレオチドと同一であるヌクレオチドの十分数または最小数を含む第一の核酸配列を指す。例えば、配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、または18と少なくとも約60％または65％の同一性、おそらく75％の同一性、よりおそらく85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するヌクレオチド配列は、実質的に同一であると呼ばれる。
本明細書において用いられるように、「対象」は、ヒトおよびヒト以外の動物を指す。本発明の「ヒト以外の動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えばヒト以外の霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、齧歯類（例えばマウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシのような哺乳類、およびニワトリ、両生類、は虫類等のような非哺乳類が含まれる。好ましい態様において、対象はヒトである。もう1つの態様において、対象は実験動物または疾患モデルとして適した動物である。
本明細書において用いられるように、「細胞の精製調製物」は、インビトロ細胞調製物を指す。多細胞生物（例えば、植物および動物）からの細胞の場合、精製細胞調製物は、生物から得られた細胞のサブセットであり、無傷の生物全体ではない。単細胞微生物（例えば、培養細胞および微生物細胞）の場合、これは被験細胞の少なくとも10％およびより好ましくは50％の調製物からなる。
変種は、本発明のヘビ毒プロテアーゼタンパク質の「相同体」という用語の範囲に含まれる可能性がある。
本明細書において一般的に用いられるように、「相同体」は、場合によっては本発明の核酸またはアミノ酸配列との定義可能なヌクレオチドまたはアミノ酸配列関係を共有する。異なるヘビに由来する本発明のヘビ毒プロテアーゼタンパク質は、互いの相同体である。
シュードナジャ・テクスチリス、オクシュラヌス・スクテラツス、ノテキス・スクタツス、トロピデキス・カリナツス、およびシューデキス・ポルフィリアクス以外の生物から単離されたヘビ毒プロテアーゼタンパク質およびそのコード核酸である「オルソログ」は、相同体の範囲に含まれる。同様に、上記の種の1つからのヘビ毒プロテアーゼタンパク質は、他に言及した任意の種のオルソログである。例えば、P.テクスチリスからのヘビ毒プロテアーゼタンパク質は、O.スクテラツスからのヘビ毒プロテアーゼタンパク質のオルソログである。
本発明によって企図される他の誘導体には、側鎖の改変、非天然アミノ酸の導入、および/またはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成の際のその誘導体、ならびにクロスリンク剤および本発明のポリペプチド、断片、および変種に構造的拘束を与える他の方法を用いることが含まれるがこれらに限定されない。本発明によって企図される側鎖改変の例には、無水酢酸によるアシル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；メチルアセチミデートによるアミド化；シアネートによるアミノ基のカルバモイル化；ピロドキサル-5-ホスフェートの後にNaBH4による還元を行うリジンのピリドキシル化；アルデヒドによる反応後にNaBH4による還元を行う還元的アルキル化；および2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によるアミノ基のトリニトロベンジル化のようなアミノ基の改変が含まれる。
カルボキシル基は、O-アシルイソウレア形成によるカルボジイミド活性化の後に例として対応するアミドへのその後の誘導体化によって改変してもよい。
アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールのような試薬による複素環縮合産物の形成によって改変してもよい。
スルフヒドリル基は、システイン酸の過ギ酸酸化；4-塩化水銀フェニルスルホン酸、4-塩化水銀安息香酸を用いる水銀誘導体の形成；2-塩化水銀-4-ニトロフェノール、塩化フェニル第二水銀および他の水銀；他のチオール化合物と混合ジスルフィドの形成：マレイミド、無水マレイン酸、または他の置換マレイミドとの反応；ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；およびアルカリpHでのシアネートによるカルバモイル化のような方法によって改変してもよい。
トリプトファン残基は、例えば、2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドもしくはハロゲン化スルホニルによるインドール環のアルキル化によって、またはN-ブロモスクシニミドによる酸化によって改変してもよい。
チロシン残基は、例えばテトラニトロメタンによるニトロ化によって3-ニトロチロシン誘導体を形成することによって改変してもよい。
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ジエチルピロカーボネートによるN-カルベトキシル化またはヨード酢酸によるアルキル化によって改変してもよい。
非天然のアミノ酸を組み入れる例およびペプチド合成の際の誘導体には、4-アミノ酪酸、6-アミノヘキサン酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、t-ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、2-チエニルアラニンおよび/またはアミノ酸のD-異性体を用いることが含まれるがこれらに限定されない。
本発明の単離されたプロトロンビン活性化タンパク質（断片、変種、誘導体、および相同体を含む）は、当業者に既知の任意の適した技法によって調製してもよい。
本発明の様々な局面を、下記にさらに詳細に記述する。
単離された核酸分子
1つの局面において、本発明は、本明細書に記述されるヘビ毒プロテアーゼポリペプチド、例えば完全長のヘビ毒プロテアーゼタンパク質またはその断片、例えばヘビ毒プロテアーゼタンパク質の生物活性部分をコードする単離または精製された核酸分子を提供する。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子、ヘビ毒プロテアーゼmRNAを同定するために用いることができるハイブリダイゼーションプローブとして用いるために適した核酸断片、およびプライマー、例えば核酸分子の増幅または変異のためのPCRプライマーとして用いるために適した断片も同様に含まれる。
1つの態様において、本発明の単離された核酸分子には、配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18に示すヌクレオチド配列、またはこれらの任意のヌクレオチド配列の一部が含まれる。1つの態様において、核酸分子には、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質をコードする配列（すなわち、配列番号：3、6、9、12、15、または18にそれぞれ示される配列番号：1、4、7、10、13、または16の「コード領域」）と共に5'非翻訳配列が含まれる。または核酸分子には、配列番号：1、4、7、10、13、または16のコード領域（例えば、配列番号：3、6、9、12、15、または18）のみが含まれ、本配列に通常伴う隣接配列は含まれない。もう1つの態様において、核酸分子は、タンパク質の断片に対応する配列をコードする。例えば、核酸分子は、ヘビ毒プロテアーゼプロペプチド、軽鎖、活性化ペプチドおよび重鎖の1つまたはそれ以上をコードする。もう1つの態様において、核酸分子は、本明細書に記述のドメインまたは領域の1つまたはそれ以上をコードしうる。
もう1つの態様において、本発明の単離された核酸分子には、相補体、例えば配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18に示されるヌクレオチド配列、またはこれらの任意のヌクレオチド配列の一部、例えば本明細書に記載のドメインもしくは領域をコードする任意の部分の完全な相補体である核酸分子が含まれる。他の態様において、本発明の核酸分子は、それが配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、または18に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズ（例えば、本明細書に記述のストリンジェンシー条件で）して、それによって安定な二本鎖を形成することができるように、配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、または18に示されるヌクレオチド配列と十分に相補的である。
1つの態様において、本発明の核酸分子には、配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18に示されるヌクレオチド配列の完全な長さまたはこれらの任意のヌクレオチド配列の一部、好ましくは同じ長さの一部に対して少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上であるヌクレオチド配列が含まれる。
ヘビ毒プロテアーゼ核酸断片
本発明の核酸分子には、配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、または18の核酸配列のごく一部が含まれうる。例えば、そのような核酸分子には、プローブもしくはプライマーとして用いることができる断片、またはヘビ毒プロテアーゼタンパク質の一部をコードする断片、例えばヘビ毒プロテアーゼタンパク質の免疫原性もしくは生物活性部分、例えば本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼタンパク質の免疫原性もしくは生物活性部分をコードする断片が含まれうる。断片は、例えばプロペプチド、軽鎖、活性化ペプチド、重鎖、GLAドメイン、EGF-1ドメイン、EGF-2ドメイン、またはヘビ毒プロテアーゼの本明細書に記述の任意の他のドメインもしくは領域をコードする、配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18のヌクレオチド配列を含みうる。ヘビ毒プロテアーゼ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列によって、他のヘビ毒プロテアーゼファミリーメンバーを同定および/またはクローニングするために用いるように設計されるプローブおよびプライマー、またはその断片と共に他の種からのヘビ毒プロテアーゼ相同体もしくはその断片を作製することができる。
もう1つの態様において、核酸には、コード領域の一部または全てが含まれ、5'または3'非コード領域のいずれか（または双方）に伸長するヌクレオチド配列が含まれる。他の態様には、本明細書に記述のアミノ酸断片をコードするヌクレオチド配列が含まれる断片が含まれる。核酸断片は、本明細書に記述の特異的ドメインもしくは部位、またはその断片、特に長さがアミノ酸少なくとも50、100、150、200、250、300、350、400、450、500もしくは550個であるその断片をコードしうる。断片にはまた、上記の特異的アミノ酸またはその断片に対応する核酸配列が含まれる。核酸断片は、本発明の前に開示されている可能性があるそれらの断片を含むと解釈してはならない。
核酸断片には、本明細書に記述のドメイン、領域、または機能的部位に対応する配列が含まれうる。核酸断片にはまた、本明細書に記述の1つまたはそれ以上のドメイン、領域、または機能的部位が含まれうる。このように、例えば、ヘビ毒プロテアーゼ核酸断片には、GLAドメイン、EGFドメイン、または第Va因子様ドメインに対応する配列が含まれうる。
ヘビ毒プロテアーゼのプローブおよびプライマーを提供する。典型的に、プローブ/プライマーは単離または精製されたオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドには典型的に、本明細書に記述のストリンジェンシー条件で、配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、および/もしくは18のセンスもしくはアンチセンス配列の、または配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18の天然に存在する対立遺伝子変種もしくは変異体の少なくとも約7、12、または15、好ましくは約20または25、より好ましくは約30、35、40、45、50、55、60、65、または75連続ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域が含まれる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが約200、150、120、または100ヌクレオチド未満である。好ましい態様において、ヘビ毒プロテアーゼプローブまたはプライマーは、ヘビ毒プロテアーゼコード核酸の領域とハイブリダイズするが、ヒト第Xa因子および/またはトロカリンの領域とはハイブリダイズしない。
1つの態様において、プローブまたはプライマーは、固相支持体、例えば本明細書に記述の固相支持体に結合させる。
プライマーの1つの例としてのキットには、コード鎖にアニールするフォワードプライマーおよび非コード鎖にアニールするリバースプライマーが含まれる。フォワードプライマーは、開始コドン、例えば配列番号：2、5、8、11、14または17のアミノ酸残基1位をコードする核酸配列にアニールすることができる。リバースプライマーは、最後のコドン、例えば停止コドンの直前のコドン、例えば配列番号：2、5、8、11、14または17のアミノ酸残基581位をコードするコドンにアニールすることができる。好ましい態様において、フォワードおよびリバースプライマーのアニーリング温度の差は、5、4、3または2℃以内である。
好ましい態様において、核酸は、長さが少なくとも10、12、15、18、20ヌクレオチドで200ヌクレオチド未満である、より好ましくは100ヌクレオチド未満、または50ヌクレオチド未満であるプローブである。これは、本明細書に開示の配列と同一でなければならず、または異なるとしても1もしくは2、または5もしくは10ヌクレオチド未満であるべきである。この比較に関してアラインメントが必要である場合、配列は最大の相同性が得られるように並列化すべきである。欠失、挿入、またはミスマッチのために「ループ状となった」配列が、差異であると見なされる。
プローブまたはプライマーは、以下をコードする核酸のセンスまたはアンチセンス鎖に由来しうる：プロペプチド、軽鎖、活性化ペプチド、重鎖、またはその一部（またはそのような領域内のドメイン）。
もう1つの態様において、一組のプライマー、例えばヘビ毒プロテアーゼ配列の選択された領域、例えば本明細書に記述のドメイン、領域、部位、または他の配列を増幅するために用いることができる、PCRにおいて用いるために適したプライマーが提供される。プライマーは、長さが少なくとも5、10、または50塩基対で、100塩基対未満、または200塩基対未満なければならない。プライマーは、本明細書に開示の配列または天然に存在する変種と同一でなければならず、または1塩基異なる。例えば、以下の任意の領域の全てまたは一部を増幅するために適したプライマーが提供される：プロペプチド、軽鎖、活性化ペプチド、重鎖、またはその一部（またはそのような領域内のドメイン）。
核酸断片は、本明細書に記述のポリペプチドのエピトープを有する領域をコードしうる。
「ヘビ毒プロテアーゼポリペプチドの生物活性部分」をコードする核酸断片は、ヘビ毒プロテアーゼ生物活性（例えばヘビ毒プロテアーゼタンパク質の生物活性は本明細書に記述されている）を有するポリペプチドをコードする配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、もしくは18のヌクレオチド配列の一部を単離すること、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質のコードされた部分を発現させること（例えばインビトロで組換え発現によって）、およびヘビ毒プロテアーゼタンパク質のコードされた部分の活性を評価することによって調製することができる。ヘビ毒プロテアーゼポリペプチドの生物活性部分をコードする核酸断片は、長さが300ヌクレオチドより長いまたはそれ以上であるヌクレオチド配列を含んでもよい。
好ましい態様において、核酸には、長さが約300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400ヌクレオチドまたはそれ以上であって、本明細書に記述のストリンジェンシー条件で配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、または18の核酸分子とハイブリダイズするヌクレオチド配列が含まれる。
ヘビ毒プロテアーゼ核酸変種
本発明は、配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、または18に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子をさらに含む。そのような差は、遺伝子コードの縮重によって起こりうる（および本明細書に開示のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じヘビ毒プロテアーゼタンパク質をコードする核酸が得られる）。もう1つの態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号：2、5、8、11、14、または17に示されるアミノ酸残基少なくとも1個、しかし5、10、20、50、または100個未満異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。この比較のためにアラインメントが必要である場合、最大の相同性が得られるように配列を並列化すべきである。コードされるタンパク質は、アミノ酸5、4、3、2または1個以下で異なりうる。欠失、挿入、またはミスマッチのために「ループ状となった」配列が差異であると見なされる。
本発明の核酸は、特定の発現系にとって好ましいまたは好ましくないコドンを有するか否かに関して選択することができる。例えば、核酸は、大腸菌、酵母、ヒト、昆虫、またはCHO細胞における発現に関して配列が最適となるように、少なくとも1つのコドン、好ましくはコドンの少なくとも10％、または20％が変化している核酸となりうる。
核酸変種は、対立遺伝子変種（同じ座）、相同体（異なる座）、およびオルソログ（異なる生物）のような天然に存在しうる核酸となりうる、または天然に存在しない核酸となりうる。天然に存在しない変種は、ポリヌクレオチド、細胞、または生物に適用される技術を含む変異誘発技術によって作製することができる。変種は、ヌクレオチド置換、欠失、転位および挿入を含みうる。変種はコード領域および非コード領域のいずれかまたは双方で起こりうる。変種は、保存的および非保存的アミノ酸置換の双方を産生しうる。1つの態様において、核酸相同体は、シュードナジャ・テクスチリス、オクシュラヌス・スクテラツス、ノテキス・スクタツス、トロピデキス・カリナツス、およびシューデキス・ポルフィリアクス以外のヘビから単離されたオルソロガス核酸である。
好ましい態様において、核酸は、例えば以下のように、配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、または18の核酸と異なる：少なくとも1ヌクレオチドであるが10、20、30、または40ヌクレオチド未満；本発明の核酸における少なくとも1ヌクレオチドであるが1％、5％、10％、または20％未満。核酸は、5、4、3、2または1ヌクレオチド以下で異なりうる。この分析にとって必要である場合、核酸は最大の相同性が得られるように並列化すべきである。欠失、挿入、またはミスマッチのために「ループ状となった」配列が差異であると見なされる。
オルソログ、相同体、および対立遺伝子変種は、当技術分野で既知の方法を用いて同定することができる。これらの変種は、配列番号：2、5、8、11、14もしくは17に示すヌクレオチド配列またはこれらの配列の断片に対して、典型的に少なくとも約70〜75％、より典型的に少なくとも約80〜85％、および最も典型的に少なくとも約90〜95％、またはそれ以上同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。そのような核酸分子は、配列番号：2、5、8、11、14もしくは17に示されるヌクレオチド配列、またはその断片に対して本明細書に記述のストリンジェンシー条件でハイブリダイズすることができるとして容易に同定することができる。本発明のヘビ毒プロテアーゼcDNAのオルソログ、相同体、および対立遺伝子変種に対応する核酸分子はさらに、ヘビ毒プロテアーゼ遺伝子と同じ染色体または座にマッピングすることによって単離することができる。
好ましい変種には、ヘビ毒プロテアーゼ活性、例えばカルシウム、リン脂質、および第Va因子の1つまたはそれ以上の非存在下で凝固誘導能を有する変種が含まれる。
ヘビ毒プロテアーゼの対立遺伝子変種には、機能的および非機能的タンパク質の双方が含まれる。機能的対立遺伝子変種は、プロトロンビンの処理能を維持する集団におけるヘビ毒プロテアーゼタンパク質の天然に存在するアミノ酸配列変種である。機能的対立遺伝子変種は典型的に、配列番号：2、5、8、11、14もしくは17の1つもしくはそれ以上のアミノ酸の保存的置換、またはタンパク質の非重要領域における非必須残基の置換、欠失、もしくは挿入のみを含むと考えられる。非機能的対立遺伝子変種は、プロトロンビンの処理能を有しない集団におけるヘビ毒プロテアーゼタンパク質の天然に存在するアミノ酸配列変種である。非機能的対立遺伝子変種は典型的に、配列番号：2、5、8、11、14もしくは17のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失、挿入、もしくは未成熟切断、またはタンパク質の重要残基もしくは重要領域における置換、挿入、もしくは欠失を含むと考えられる。
その上、他のヘビ毒プロテアーゼファミリーメンバーをコードする核酸分子、そしてこのように配列番号：1、3、4、6、7、9、10、12、13、15、16、または18のヘビ毒プロテアーゼ配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内であると意図される。
本発明の単離された核酸相同体はまた、核酸配列増幅技術を用いる方法によって調製してもよい。
1つの態様において、方法には以下の段階が含まれる：
（i）宿主細胞または動物からの核酸抽出物を得る段階；
（ii）それぞれのプライマーが本発明の単離された核酸の一部に対応する、選択的に縮重している1つまたはそれ以上のプライマーを作製する段階；および
（iii）核酸増幅技術によって該核酸抽出物からの1つまたはそれ以上の増幅産物を増幅するために該プライマーを用いる段階。
該1つまたはそれ以上のプライマーは、増幅のために典型的に用いられるアニーリングおよびプライマー伸長条件で本発明の二本鎖核酸の一方または他方の鎖をアニールすることができるように設計されることが適切である。縮重プライマーの場合、プライマーと単離された核酸配列のあいだの配列の差は、相同なコード配列における縮重によるような、起こりうる配列の変化を説明するために意図的に導入される。
適した核酸増幅技術は当業者に周知であり、これには、例えば上記のAusubelらの第15章に記述されるようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびリガーゼ連鎖反応（LCR）；例えば米国特許第5,422,252号に記述されるような鎖置換増幅（SDA）；例えば国際公開公報第92/01813号および国際公開公報第97/19193号に記述されるようなローリングサークル複製（RCR）；例えばSooknananら、1994、Biotechniques 17：1077に記述されるような核酸配列に基づく増幅（NASBA）；および例えばTyagiら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：5395に記述されるようなQ-βレプリカーゼ増幅が含まれるがこれらに限定されない。
好ましい核酸配列増幅技術はPCRである。
本明細書において用いられるように、「増幅産物」は、本明細書において広く定義されるような核酸増幅技術によって作製された核酸産物を指す。
核酸相同体は、タンパク質相同体をコードしてもよい。したがって、上記の核酸相同体を単離する方法を用いてタンパク質相同体を単離してもよい。
単離されたヘビ毒プロテアーゼポリペプチド
もう1つの局面において、本発明は、抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体を作製または試験（またはより一般的にには結合）するための免疫原または抗原として用いるために単離されたヘビ毒プロテアーゼタンパク質または断片、例えば生物活性部分を特徴とする。ヘビ毒プロテアーゼタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いて細胞または組織源から単離することができる。1つの態様において、ヘビ毒プロテアーゼは、シュードナジャ・テクスチリス、オクシュラヌス・スクテラツス、ノテキス・スクタツス、トロピデキス・カリナツス、およびシューデキス・ポルフィリアクスからなる群より選択されるヘビから単離される。好ましくは、ヘビ毒プロテアーゼは、オーストラリアのヘビ、例えば本明細書に記述のオーストラリアのヘビの毒液腺から単離される。ヘビ毒プロテアーゼタンパク質またはその断片は、組換えDNA技術によって産生する、または化学的に合成することができる。
本発明のポリペプチドには、もう1つの翻訳および翻訳後事象が存在した結果として生じるポリペプチドが含まれる。ポリペプチドは、ポリペプチドを本来の細胞において発現させた場合に実質的に同じ翻訳後改変が得られる系、例えば培養細胞において、または本来の細胞において発現させた場合に、翻訳後改変の変化または脱落、例えばグリコシル化または切断が起こる系において発現させることができる。
好ましい態様において、ヘビ毒プロテアーゼポリペプチドは、以下の特徴の1つまたはそれ以上を有する：
（i）プロトロンビンの処理能を有する；
（ii）ヘビ毒プロテアーゼポリペプチド、例えば配列番号：2、5、8、11、14または17のポリペプチドの翻訳後改変、アミノ酸組成、または他の物理的特徴の如何なる関与も好ましくは無視した分子量、例えば推定分子量を有する。
（iii）ヘビ毒プロテアーゼポリペプチド、例えば配列番号：2、5、8、11、14または17のポリペプチドと少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70、80、90、または95％の全体的な配列類似性を有する；
（iv）本明細書に記述の、例えば本明細書に記述のドメインまたは領域の1つまたはそれ以上との実質的な配列同一性を有する。
好ましい態様において、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質またはその断片は、配列番号：2、5、8、11、14または17の対応する配列とは異なる。1つの態様において、これはアミノ酸残基少なくとも1つ、しかし15、10、または5個未満が異なる。もう1つの態様において、これは配列番号：2、5、8、11、14または17の対応する配列と少なくとも1つの残基、しかし残基の20％、15％、10％、または5％未満が異なる（この比較がアラインメントを必要とする場合、配列は最大の相同性が得られるように並列化すべきである。欠失、挿入、またはミスマッチにより「ループ状となった」配列が差異であると見なされる）。好ましくは差は、非必須残基または保存的置換での差または変化である。
他の態様には、アミノ酸配列における1つまたはそれ以上の変化、例えば活性にとって必須ではないアミノ酸残基における変化を含むタンパク質が含まれる。そのようなヘビ毒プロテアーゼタンパク質は、配列番号：2、5、8、11、14または17とはアミノ酸配列が異なるが、なおも生物活性を保持している。
1つの態様において、タンパク質には、配列番号：2、5、8、11、14または17と少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、またはそれ以上相同であるアミノ酸配列が含まれる。
1つの態様において、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の生物活性部分には、以下の1つまたはそれ以上が含まれる：GLAドメイン、EGF-1ドメイン、EGF-2ドメインおよび第Va因子様ドメイン。その上、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物活性部分を組換え技術によって調製することができ、天然のヘビ毒プロテアーゼタンパク質の機能的活性の1つまたはそれ以上に関して評価することができる。
好ましい態様において、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質は、配列番号：2、5、8、11、14または17に示すアミノ酸配列を有する。他の態様において、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質は、配列番号：2、5、8、11、14または17と実質的に同一であり、上記の章に詳細に記述したように、配列番号：2、5、8、11、14または17のタンパク質の機能的活性を保持している。好ましい態様において、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質は、カルシウム、リン脂質、および第Va因子の1つまたはそれ以上の非存在下でプロトロンビンの処理能を保持し、好ましくはカルシウムとリン脂質の双方の非存在下でプロトロンビンの処理能を有する。
ヘビ毒プロテアーゼキメラまたは融合タンパク質
もう1つの局面において、本発明は、ヘビ毒プロテアーゼキメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書において用いられるように、ヘビ毒プロテアーゼ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」には、非ヘビ毒プロテアーゼポリペプチドに結合したヘビ毒プロテアーゼポリペプチドが含まれる。「非ヘビ毒プロテアーゼポリペプチド」は、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質とは異なり、同じまたは異なる生物に由来するタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。融合タンパク質のヘビ毒プロテアーゼポリペプチドは、ヘビ毒プロテアーゼアミノ酸配列の全てまたは一部、例えば本明細書に記述する断片に対応しうる。好ましい態様において、ヘビ毒プロテアーゼ融合タンパク質には、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の少なくとも1つ（または2つ）の生物活性部分が含まれる。非ヘビ毒プロテアーゼポリペプチドは、ヘビ毒プロテアーゼポリペプチドのN末端またはC末端に融合させることができる。1つの態様において、「非ヘビ毒プロテアーゼポリペプチド」は、ヘビ毒プロテアーゼ以外のプロトロンビン活性化タンパク質からのプロペプチドであり、例えばこれは哺乳類の第Xa因子、例えばヒト第Xa因子からのプロペプチドである。もう1つの態様において、「非ヘビ毒プロテアーゼポリペプチド」には、ヘビ毒プロテアーゼ以外のプロトロンビン活性化タンパク質からの活性化ペプチド、例えば哺乳類の第Xa因子、例えばヒト第Xa因子からの活性化ペプチドが含まれうる。さらにもう1つの態様において、キメラまたは融合ポリペプチドには、「非ヘビ毒プロテアーゼポリペプチド」、例えば哺乳類の第Xa因子ポリペプチド、例えばヒト第Xa因子ポリペプチドからのプロペプチドおよび活性化ペプチドが含まれうる。
融合タンパク質には、リガンドに対して高い親和性を有する部分が含まれうる。例えば、融合タンパク質は、その中でヘビ毒プロテアーゼ配列をGST配列のC末端に融合させるGST-ヘビ毒プロテアーゼ融合タンパク質となりうる。そのような融合タンパク質は、組換えヘビ毒プロテアーゼの精製を促進することができる。または、融合タンパク質は、そのN末端で異種シグナル配列を含むヘビ毒プロテアーゼタンパク質となりうる。特定の宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞）において、ヘビ毒プロテアーゼの発現および/または分泌は、異種シグナル配列を用いることによって増加させることができる。
融合タンパク質には、血清タンパク質の全てまたは一部、例えばIgG定常領域またはヒト血清アルブミンが含まれうる。
本発明のヘビ毒プロテアーゼ融合タンパク質は、薬学的組成物に組み入れて、インビボで対象に投与することができる。ヘビ毒プロテアーゼ融合タンパク質を用いて、ヘビ毒プロテアーゼ基質の生物学的利用能に影響を及ぼすことができる。
その上、本発明のヘビ毒プロテアーゼ融合タンパク質は、対象において抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体を産生するため、ヘビ毒プロテアーゼリガンドを精製するため、およびスクリーニングアッセイ法においてヘビ毒プロテアーゼ基質とヘビ毒プロテアーゼとの相互作用を抑制する分子を同定するための免疫原として用いることができる。
融合部分（例えば、GSTポリペプチド）を既にコードする発現ベクターが市販されている。ヘビ毒プロテアーゼコード核酸は、融合部分がインフレームでヘビ毒プロテアーゼタンパク質に結合するように、そのような発現ベクターにクローニングすることができる。
ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の変種
もう1つの局面において、本発明はまた、例えばアゴニスト（模倣体）またはアンタゴニストとして機能するヘビ毒プロテアーゼポリペプチドの変種を特徴とする。ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の変種は、変異誘発、例えば個々の点突然変異、配列の挿入もしくは欠失、またはヘビ毒プロテアーゼタンパク質の切断によって産生することができる。ヘビ毒プロテアーゼタンパク質のアゴニストは、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の天然に存在する型と実質的に同じ生物活性またはサブセットを保持しうる。ヘビ毒プロテアーゼタンパク質のアンタゴニストは、例えば、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質のヘビ毒プロテアーゼ媒介活性を競合的に調節することによって、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の天然に存在する型の活性の1つまたはそれ以上を抑制することができる。このように、特異的生物作用は、限定された機能の変種によって処理することによって誘発することができる。
ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の変種は、変異体、例えばヘビ毒プロテアーゼタンパク質の切断変異体の組み合わせライブラリを、アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングすることによって同定することができる。
ヘビ毒プロテアーゼタンパク質コード配列の断片、例えばN末端、C末端、または内部断片のライブラリを用いて、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の変種のスクリーニングおよびその後の選択のために異型の断片集団を作製することができる。システイン残基が付加もしくは欠失している、カルシウム結合残基、例えばカルボキシグルタミン酸残基もしくはアスパラギンが付加もしくは欠失している、またはグリコシル化されている残基が付加もしくは欠失されている変種が、特に好ましい。
点突然変異または切断によって作製された組み合わせライブラリの遺伝子産物をスクリーニングする方法、および選択された特性を有する遺伝子産物に関してcDNAライブラリをスクリーニングする方法は、当技術分野で既知である。そのような方法は、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の組み合わせ変異誘発によって作製された遺伝子ライブラリを迅速にスクリーニングするために適合することができる。ライブラリにおける機能的変異体の頻度を増強する反復集合変異誘発（REM）を、ヘビ毒プロテアーゼ変種を同定するスクリーニングアッセイ法と組み合わせて用いることができる（ArkinおよびYourvan（1992）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：7811〜7815；Delgraveら（1993）、Protein Engineering 6：327〜331）。
もう1つの局面において、本発明は、ヘビ毒プロテアーゼポリペプチド、例えば非野生型活性を有するペプチド、例えば天然に存在するヘビ毒プロテアーゼポリペプチドのアンタゴニスト、アゴニスト、またはスーパーアゴニスト、例えば天然に存在するヘビ毒プロテアーゼポリペプチドを作製する方法を特徴とする。方法には、ヘビ毒プロテアーゼポリペプチドの配列を変化させること、例えば非保存領域の1つまたはそれ以上の残基、本明細書に開示のドメインもしくは残基の置換または欠失によって配列を変化させること、および変化したポリペプチドを所望の活性に関して調べることが含まれる。
もう1つの局面において、本発明は、天然に存在するヘビ毒プロテアーゼポリペプチドの生物活性を有するヘビ毒プロテアーゼポリペプチドの断片または類似体を作製する方法を特徴とする。方法には、例えばヘビ毒プロテアーゼポリペプチドの1つまたはそれ以上の残基の置換または欠失によって配列を変化させること、例えば、非保存領域の配列または本明細書に記載のドメインもしくは残基を変化させること、および変化したポリペプチドを所望の活性に関して調べることが含まれる。
抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体
もう1つの局面において、本発明は、抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体またはその断片（例えば、その抗原結合断片）を提供する。本明細書において用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子またはその免疫活性部分、すなわち抗原結合部分を指す。本明細書において用いられるように、「抗体」という用語は、少なくとも1つ、好ましくは2つの重鎖（H）可変領域（本明細書においてVHと省略する）、および少なくとも1つ、好ましくは2つの軽鎖（L）可変領域（本明細書においてVLと省略する）を含むタンパク質を指す。VHおよびVL領域は、「フレームワーク領域」（FR）と呼ばれるより保存された領域が散在する、「相補性決定領域」（「CDR」）と呼ばれる高度可変領域の領域にさらに細分することができる。フレームワーク領域およびCDRの程度は、正確に定義されている（参照として本明細書に組み入れられる、Kabat, E.A.ら（1991）、「Sequence of Proteins of Immunological Interest」、第5版、米国保健省、NIH出版、第91-3242、およびChothia, C.ら（1987）、J. Mol. Biol. 196：901〜917を参照されたい）。それぞれのVHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRで構成され、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配列する：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体にはさらに、重鎖および軽鎖定常領域が含まれ、それによって重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖をそれぞれ形成することができる。1つの態様において、抗体は、重鎖および軽鎖免疫グロブリンが例えばジスルフィド結合によって結合している、2つの重鎖免疫グロブリンおよび2つの軽鎖免疫グロブリンの四量体である。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3からなる。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は典型的に、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系路の補体第一成分（C1q）を含む、宿主組織または因子に対する抗体の結合を媒介する。
本明細書において用いられるように、「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つまたはそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認められているヒト免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α（IgA1およびIgA2）、γ（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子と共に、多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。完全長の免疫グロブリン「軽鎖」（約25 kDaまたはアミノ酸214個）は、NH2末端で可変領域遺伝子（アミノ酸約110個）、およびCOOH末端でのκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。完全長の免疫グロブリン「重鎖」（約50 kDaまたはアミノ酸446個）は、可変領域遺伝子（アミノ酸約116個）、および上記の他の定常領域遺伝子、例えばγ定常領域遺伝子（アミノ酸約330個をコードする）によってコードされる。
本明細書において用いられる抗体の「抗原結合断片」（または単純に「抗体部分」または「断片」）という用語は、抗原、例えばヘビ毒プロテアーゼポリペプチドまたはその断片に対して特異的結合能を保持する完全長の抗体の1つまたはそれ以上の断片を指す。抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体の抗原結合断片には、（i）Fab断片、VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価断片；（ii）F(ab')2断片、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって結合した2つのFab断片を含む二価断片；（iii）VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；（iv）抗体の単腕のVLおよびVHドメインからなるFv断片；（v）VHドメインからなるdAb断片（Wardら（1989）、Nature 341：544〜546）；および（vi）単離された相補性決定領域（CDR）、が含まれるがこれらに限定されない。さらに、Fv断片の2つのドメイン、すなわちVLおよびVHは、異なる遺伝子によってコードされるが、それらは組換え法を用いて合成リンカーによって結合させることができ、それによってVLおよびVH領域が対を形成して一価分子を形成する一本鎖タンパク質として作製することができる（一本鎖Fv（scFv）として知られる；例えば、Birdら、（1988）Science 242：423〜426；およびHustonら（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879〜5883を参照されたい）。そのような一本鎖抗体も同様に、抗体の「抗原結合断片」という用語に含まれる。これらの抗体断片は、当業者に既知の通常の技術を用いて得られ、断片を、無傷の抗体と同様に有用性に関してスクリーニングする。
抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体となりうる。他の態様において、抗体は、組換え的に産生、例えばファージディスプレイまたは組み合わせ法によって産生することができる。
抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体を作製するためのファージディスプレイおよび組み合わせ法は、当技術分野で既知である（例えば、その全ての内容が参照として本明細書に組み入れられる、Ladnerら、米国特許第5,223,409号；Kangら、国際公開公報第92/18619号；Dowerら、国際公開公報第91/17271号；Winterら、国際公開公報第92/20791号；Marklandら、国際公開公報第92/15679号；Breitlingら、国際公開公報第93/01288号；McCaffertyら、国際公開公報第92/01047号；Garrardら、国際公開公報第92/09690号；Ladnerら、国際公開公報第90/02809号；Fuchsら（1991）Bio/Technology 9：1370〜1372；Hayら（1992）、Hum Antibod. Hybridomas 3：81〜85；Huseら（1989）Science 246：1275〜1281；Griffthsら（1993）、EMBO J. 12：725〜734；Hawkinsら（1992）、J. Mol. Biol. 226：889〜896；Clacksonら（1991）Nature 352：624〜628；Gramら、（1992）、PNAS 89：3576〜3580；Garradら（1991）、Bio/Technology 9：1373〜1377；Hoogenboomら（1991）、Nuc. Acid Res. 19：4133〜4137；およびBarbasら（1991）、PNAS 88：7978〜7982に記述される）。
好ましい態様において、抗体は、精製ヘビ毒プロテアーゼ抗原またはその断片、例えば本明細書に記述の断片、組織、例えば、粗組織調製物、細胞全体、好ましくは生きている細胞、溶解した細胞、または細胞分画によって免疫することによって作製することができる。
完全長のヘビ毒プロテアーゼタンパク質またはヘビ毒プロテアーゼの抗原性ペプチド断片は、免疫原として、または他の免疫原、例えば細胞、膜調製物等によって作製した抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体を同定するために用いることができる。ヘビ毒プロテアーゼの抗原性ペプチドには、配列番号：2、5、8、11、14または17に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基少なくとも8個が含まれなければならず、ヘビ毒プロテアーゼのエピトープを含む。好ましくは、抗原性ペプチドには、アミノ酸残基少なくとも10個、より好ましくはアミノ酸残基少なくとも15個、さらにより好ましくはアミノ酸残基少なくとも20個、および最も好ましくはアミノ酸残基少なくとも30個が含まれる。好ましい態様において、抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体は、本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼの領域、ドメイン、または部位に結合する。これらの任意の領域または本明細書に記述の他の領域もしくはドメインに対して反応するまたは特異的な抗体を提供する。
天然のヘビ毒プロテアーゼタンパク質に限って、変性もしくはそうでなければ非変性ヘビ毒プロテアーゼタンパク質に限って結合する抗体、または双方に結合する抗体が本発明に含まれる。直線状または構造エピトープを有する抗体も本発明に含まれる。構造エピトープは時に、天然であるが変性したヘビ毒プロテアーゼタンパク質に結合する抗体を同定することによって同定することができる。
抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、軽鎖または重鎖、親水性領域と共に高い抗原性の領域に存在するヘビ毒プロテアーゼの領域である。
好ましい態様において、抗体は、1つまたはそれ以上の精製抗原、組織、例えば組織切片、細胞全体、好ましくは生きている細胞、溶解細胞、または細胞分画の1つまたはそれ以上に結合することができる。
抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体は、一本鎖抗体となりうる。一本鎖抗体（scFV）を作製してもよい（例えば、Colcher, D.ら（1999）、Ann N.Y. Acad. Sci. 880：263〜80；およびReiter, Y.（1996）、Clin. Cancer Res. 2：245〜52）。一本鎖抗体を二量体または多量体にして、同じ標的ヘビ毒プロテアーゼタンパク質の異なるエピトープに対して特異性を有する多価抗体を作製することができる。
抗体は、化合物、例えば放射活性核種または造影剤、例えば放射活性、酵素、または他の例えば造影剤、例えばNMR造影剤のような標識に結合させることができる。検出可能な放射活性放出または蛍光を生じる標識が好ましい。
抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いて、アフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈殿のような標準的な技術によってヘビ毒プロテアーゼを単離することができる。その上、抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体は、タンパク質の量および発現パターンを評価するために、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質を検出するために用いることができる（例えば細胞溶解物または細胞上清において）。抗ヘビ毒プロテアーゼ抗体は、臨床検査技術の一部として組織におけるヘビ毒プロテアーゼレベルをモニターするために診断的に用いることができる。検出は、抗体を検出可能な基質にカップリングさせる（すなわち、物理的に結合させる）ことによって促進することができる（すなわち抗体標識）。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料、生体発光材料、および放射活性材料が含まれる。適した酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる；適した補欠分子団の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれる；適した蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリスリンが含まれる；発光材料の例には、ルミノールが含まれる；生体発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびアエコリンが含まれる；ならびに適した放射活性材料の例には、125I、131I、35S、または3Hが含まれる。標識は、色原体、触媒、酵素、蛍光体、化学発光分子、ユーロピウム（Eu34）のようなランタニドイオン、放射性同位元素、および直接肉眼的標識を含む群から選択してもよい。直接肉眼的標識の場合、コロイド状の金属または非金属粒子、色素粒子、酵素または基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、またはシグナル発生物質を含む他の小胞等を利用してもよい。
標識として有用な多くの酵素が、その全てが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,366,241号、米国特許第4,843,000号、および米国特許第4,849,338号に開示されている。本発明において有用な酵素標識には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ライソザイム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等が含まれる。酵素標識は単独で用いてもよく、または溶液中で第二の酵素と併用してもよい。
組換え発現ベクター、宿主細胞および遺伝子操作細胞
もう1つの局面において、本発明には、ベクター、好ましくは本明細書に記述のポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターが含まれる。本明細書において用いられるように、「ベクター」という用語は、それが結合するもう1つの核酸を輸送することができる核酸分子を指し、これにはプラスミド、コスミド、またはウイルスベクターが含まれうる。ベクターは、自律複製することができるか、または宿主DNAに組み入れられることができる。ウイルスベクターには、例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスが含まれる。
ベクターには、宿主細胞における核酸の発現に適した型でのヘビ毒プロテアーゼ核酸が含まれうる。好ましくは、組換え発現ベクターには、発現される核酸配列に機能的に結合した1つまたはそれ以上の調節配列が含まれる。「調節配列」という用語には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）が含まれる。調節配列には、ヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列と共に、組織特異的調節および/または誘導型配列が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存しうる。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入することができ、それによって本明細書に記述の核酸によってコードされる融合タンパク質またはポリペプチドを含むタンパク質またはポリペプチド（例えば、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質、融合タンパク質等）を産生することができる
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞においてヘビ毒プロテアーゼタンパク質を発現するように設計することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、大腸菌、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞、または哺乳類細胞において発現させることができる。適した宿主細胞は、Goeddel（1990）、Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185、アカデミック出版、サンジエゴ、カリフォルニア州においてさらに考察されている。または、例えばT7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いて、組換え発現ベクターをインビトロで転写および翻訳することができる。
原核細胞におけるタンパク質の発現は、大腸菌において、融合または非融合タンパク質の発現を指示する構成的または誘導型プロモーターを含むベクターを用いて行われることが最も多い。融合ベクターは、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、その中にコードされるタンパク質に多くのアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、典型的に3つの目的を有する：1）組換えタンパク質の発現を増加させる；2）組換えタンパク質の溶解度を増加させる；および3）アフィニティ精製におけるリガンドとして作用することによって、組換えタンパク質の精製を助ける。しばしば、融合部分から組換えタンパク質を分離してその後融合タンパク質を精製できるように、融合部分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質溶解切断部位を導入する。そのような酵素、およびその同源の認識配列には、第Xa因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAをそれぞれ、標的組換えタンパク質に融合させる、pGEX（ファルマシアバイオテックインク（Pharmacia Biotech Inc.）；Smith, D.B.およびJohnson, K.S.（1988）、Gene 67：31〜40）、pMAL（ニューイングランドバイオラブス（New England Biolabs）、ビバリー、マサチューセッツ州）、ならびにpRIT5（ファルマシア（Pharmacia）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が含まれる。
大腸菌における組換えタンパク質の発現を最大限にすることは、組換えタンパク質のタンパク質溶解切断能の障害を有するタンパク質を宿主細菌において発現させることである（Gottesman, S.（1990）、Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185、アカデミック出版、サンジエゴ、カリフォルニア州、119〜128）。もう1つの戦略は、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を、それぞれのアミノ酸の個々のコドンが大腸菌において選択的に利用されるように変化させることである（Wadaら（1992）、Nucleic Acids Res. 20：2111〜2118）。本発明の核酸配列のそのような変化は、標準的なDNA合成技術を用いて行うことができる。
ヘビ毒プロテアーゼ発現ベクターは、酵母発現ベクター、昆虫細胞における発現ベクター、例えばバキュロウイルス発現ベクター、または哺乳類細胞における発現に適したベクターとなりうる。
哺乳類細胞において用いる場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節要素によって提供されうる。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40に由来する。
もう1つの態様において、プロモーターは、誘導型プロモーター、例えばステロイドホルモン、ポリペプチドホルモン（例えば、シグナル伝達経路によって）、または異種ポリペプチド（例えばテトラサイクリン誘導系、「Tet-On」および「Tet-Off」；例えば、クロンテックインク（Clontech, Inc.）、カリフォルニア州、GossenおよびBujard（1992）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：5547、ならびにPaillard（1989）Human Gene Therapy 9：983）によって調節されるプロモーターである。
もう1つの態様において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて選択的に核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的調節要素を用いて、核酸を発現させる）。適した組織特異的プロモーターの非制限的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkertら（1987）Genes Dev. 1：268〜277）、リンパ系特異的プロモーター（CalameおよびEaton（1988）Adv. Immunol. 43：235〜275）、特にT細胞受容体のプロモーター（WinotoおよびBaltimore（1989）EMBO J. 8：729〜733）、ならびに免疫グロブリン（Banerjiら（1983）、Cell 33：729〜740；QueenおよびBaltimore（1983）、Cell 33：741〜748）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ByrneおよびRuddle（1989）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：5473〜5477）、膵臓特異的プロモーター（Edlundら（1985）、Science 230：912〜916）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第4,873,316号および欧州特許出願第264,166号）が含まれる。発達によって調節されるプロモーター、例えば、マウスホックスプロモーター（KesselおよびGruss（1990）、Science 249：374〜379）およびαフェトプロテインプロモーター（CampesおよびTilghman（1989）、Genes Dev. 3：537〜546）も同様に含まれる。
いくつかの態様において、哺乳類細胞において用いられる場合、発現ベクターは、ヘビ毒プロテアーゼ軽鎖および重鎖の発現、ならびに非ヘビ毒プロテアーゼポリペプチド、例えば非ヘビ毒プロテアーゼプロトロンビン活性化タンパク質のプロペプチドドメインおよび/または活性化ペプチド、例えば哺乳類の第X因子、例えばヒト第X因子のプロペプチドおよび/または活性化ペプチドの発現を提供しうる。
本発明はさらに、発現ベクターにおいてアンチセンス方向にクローニングされた本発明のDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供する。様々な細胞タイプにおいてアンチセンスRNAの構成的、組織特異的、または細胞タイプ特異的発現を指示し、アンチセンス方向にクローニングされた核酸に機能的に結合した調節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび/またはエンハンサー）を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒ウイルスの形となりうる。
本発明のもう1つの局面は、本明細書に記述の核酸分子、例えば組換え発現ベクター内のヘビ毒プロテアーゼ核酸分子、または宿主の細胞ゲノムの特異的部位にそれを相同的に組換えさせる配列を含むヘビ毒プロテアーゼ核酸分子、を含む宿主細胞を提供する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。そのような用語は、特定の被験細胞のみならず、そのような細胞の子孫または可能性がある子孫も指す。その後の世代において突然変異または環境的影響により特定の改変が起こる可能性があることから、そのような子孫は実際には、親細胞とは同一でない可能性があるが、それでもなお本発明において用いられる用語の範囲に含まれる。
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞となりうる。例えば、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質は、細菌細胞（大腸菌のような）、昆虫細胞、酵母、または哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはCOS細胞（アフリカミドリザル腎細胞CV-1起源SV40細胞；Gluzman（1981）、Cell 23：175〜182）において発現させることができる。その他の適した宿主細胞は、当業者に既知である。
ベクターDNAは、通常の形質転換またはトランスフェクション技術によって宿主細胞に導入することができる。本明細書において用いられるように、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含む、宿主細胞に外来核酸（例えば、DNA）を導入するための当技術分野で認識された多様な技術を指すと意図される。
本発明の宿主細胞は、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質を産生（すなわち発現）するために用いることができる。したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いて、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質、例えば本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼタンパク質を産生する方法を提供する。1つの態様において、方法には、ヘビ毒プロテアーゼタンパク質が産生されるように、適した培地において本発明の宿主細胞（その中にヘビ毒プロテアーゼタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する段階が含まれる。もう1つの態様において、方法にはさらに、培地または宿主細胞からヘビ毒プロテアーゼタンパク質を単離することが含まれる。
もう1つの局面において、本発明は、ヒト細胞、例えば本発明のヘビ毒プロテアーゼポリペプチドをコードする核酸によって形質転換した造血幹細胞を特徴とする。
情報科学
ヘビ毒プロテアーゼの配列は、その使用を容易にするために多様な媒体において提供されている。タンパク質または核酸とは対照的に、記録された配列は製造物として提供することができる。そのような製造物は、それらが天然または精製型で存在することから、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列、またはそのサブセットを調べることに直接応用できない手段を用いて、例えば配列分析プログラムによってまたは直接検分によって、製造物を検査することができる形で、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列、例えばオープンリーディングフレームを提供することができる。ヌクレオチド情報には、SVPの完全長ヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列、部分的ヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列、一ヌクレオチド多形（SNP）、エピトープまたはドメイン配列等を含む多形配列が含まれるがこれらに限定されない。好ましい態様において、製造物は、機械読み取り可能な媒体、例えば磁気、光学、化学、または機械的情報保存装置である。
本明細書において用いられるように、「機械読み取り可能な媒体」とは、機械によって直接読み取って評価することができる任意の媒体、例えばデジタルコンピューター、またはアナログコンピューターを指す。コンピューターの非制限的な例には、デスクトップPC、ラップトップ、メインフレーム、サーバー（例えば、ウェブサーバー、ネットワークサーバー、またはサーバーファーム）、手動式デジタルアシスタント、ページャー、携帯電話等が含まれる。コンピューターは、独立型でもよく、またはコミュニケーションネットワーク、例えばローカルエリアネットワーク（VPNまたはイントラネットのような）、広域ネットワーク（例えば、エクストラネットまたはインターネット）、または電話ネットワーク（例えば、無線、DSL、またはISDNネットワーク）に接続してもよい。機械読み取り可能な媒体には、フロッピーディスク、ハードディスク保存媒体、および磁気テープのような磁気保存媒体；CD-ROMのような光学的保存媒体；RAM、ROM、EPROM、EEPROM、フラッシュメモリー等のような電子保存媒体；および磁気/光学保存媒体のようなこれらの分類の融合型が含まれるがこれらに限定されない。
その上に本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を記録する機械読み取り可能な媒体を作製するために、多様なデータ保存構造が当業者に利用可能である。データ保存構造の選択は、一般的に保存された情報にアクセスするために選択される手段に基づくと考えられる。さらに、多様なデータ処理プログラムおよびフォーマットを用いて、コンピューター読み取り可能な媒体上に本発明のヌクレオチド配列情報を保存することができる。配列情報は、ワードパーフェクトおよびマイクロソフトワードのような市販のソフトウェアにおいてフォーマットされるワードプロセシングテキストファイルで表すことができ、または、DB2、サイベース、オラクル等のようなデータベースアプリケーションにおいて保存されるASCIIファイルの形で表すことができる。当業者は、その上に本発明のヌクレオチド配列情報を記録するコンピューター読み取り媒体を得るために、任意の数のデータプロセッサ構造フォーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を容易に適合させることができる。
好ましい態様において、配列情報は、関連するデータベース（サイベースまたはオラクルのような）に保存される。データベースは、配列（核酸および/またはアミノ酸配列）情報を保存するための第一の表を有しうる。配列情報は、表の列の1つの領域（例えば、第一のカラム）に保存することができ、配列に関する同定子を表の列のもう1つの領域（例えば、第二のカラム）に保存することができる。データベースは、第二の表、例えば保存注釈を有しうる。第二の表は、配列同定子のための領域、記述子または注釈テキストのための領域を有しうる（例えば、記述子は配列の機能性、注釈が指す配列における最初の位置に関する領域、および注釈が指す配列における最後の位置に関する領域を指すことができる）。アミノ酸配列に対する注釈の非制限的な例には、ポリペプチドドメイン、例えば本明細書に記述のドメイン、活性部位および他の機能的アミノ酸、ならびに改変部位が含まれる。
本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列をコンピューター読み取り可能な形で提供することによって、当業者は多様な目的のために配列情報に日常的にアクセスすることができる。例えば、当業者は、標的配列または標的構造モチーフをデータ保存手段内に保存された配列情報と比較するために、本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列をコンピューター読み取り可能な形で用いることができる。特定の標的配列または標的モチーフにマッチする本発明の配列の断片または領域を同定するために検索を用いることができる。検索は、BLAST検索または他の日常的な配列比較、例えば本明細書に記述の検索となりうる。
このように、1つの局面において、本発明は、SVP配列を分析する方法、例えば構造、機能、または1つもしくはそれ以上の他の核酸もしくはアミノ酸配列との関連性を分析する方法を特徴とする。方法には、SVP核酸またはアミノ酸配列を提供する段階；SVP配列を第二の配列、例えば配列コレクション、例えば核酸またはタンパク質配列データベースからの1つまたはそれ以上、好ましくは複数の配列と比較して、それによってSVPを分析する段階が含まれる。方法は、機械、例えばコンピューターにおいて行うことができ、または当業者によって手動で行うことができる。
方法には、SVP配列と第二の配列、例えばデータベース配列との配列同一性を評価する段階が含まれうる。方法は、第二のサイト、例えばインターネット上でデータベースにアクセスすることによって行うことができる。
本明細書において用いられるように、「標的配列」は、6個もしくはそれ以上のヌクレオチドまたは2個もしくはそれ以上のアミノ酸の任意のDNAまたはアミノ酸配列となりうる。当業者は、標的配列が長ければ、標的配列がデータベースにおけるランダムな発生として現れる可能性がより低いことを容易に認識することができる。標的配列の典型的な配列の長さは、アミノ酸約10〜100個、またはヌクレオチド残基約30〜300個である。しかし、遺伝子発現およびタンパク質プロセシングに関係する配列断片のような商業的に重要な断片は、長さがより短くてもよいことは十分に認識される。
それによって当業者が分析および他の配列との比較のために、コンピューター読み取り可能な媒体において提供された配列情報にアクセスすることができるコンピューターソフトウェアは、一般公衆に利用可能である。多様な既知のアルゴリズムが公開されており、検索手段を行うための市販の多様なソフトウェアが、本発明のコンピューターに基づくシステムにおいて用いられ、用いることができる。そのようなソフトウェアの例には、MacPattern（EMBL）、BLASTN、およびBLASTX（NCBI）が含まれるがこれらに限定されない。
このように、本発明は、コンピューター読み取り可能な行列上で配列を記録することを含むSVP配列の配列のコンピューター読み取り可能な記録を作製する方法を特徴とする。好ましい態様において、記録には、以下の1つまたはそれ以上が含まれる：ORFの同定；ドメイン、領域、または部位の同定；転写開始部位の同定；転写ターミネータの同定；タンパク質またはその成熟型の完全長のアミノ酸配列；翻訳領域の5'末端。
もう1つの局面において、本発明は、配列を分析する方法を特徴とする。方法には、SVP配列または記録を機械読み取り可能な形で提供する段階；第二の配列をSVP配列と比較する段階、例えば特定のモチーフまたはドメインの有無に関してSVP配列を分析する段階；それによって配列を分析する段階が含まれる。比較には、配列が同一であるか否かに関して配列を比較する段階、または1つの配列が他の配列に含まれるか否かを決定する段階、例えば比較される配列がSVP配列に含まれるか否かを決定する段階が含まれうる。好ましい態様において、SVPまたは第二の配列を第一のコンピューター上、例えば第一の部位に保存して、第二のコンピューター上で、例えば第二の部位で比較を行い、読み取り、または記録する。例えば、SVPまたは第二の配列は、第一のコンピューターにおける公共または固有のデータベースに保存することができ、第二のコンピューター上で比較の結果を行い、読み取り、または記録することができる。好ましい態様において、記録には、以下の1つまたはそれ以上が含まれる：ORFの同定；ドメイン、領域、または部位の同定；転写開始部位の同定；転写ターミネータの同定；タンパク質またはその成熟型の完全長のアミノ酸配列；翻訳領域の5'末端。
ライブラリ
本発明には、本明細書に開示のヘビの1つ、例えばブラウン、内陸性タイパン、沿岸性タイパン、レッドベリー、タイガーまたはラフスケールスネークに由来する核酸またはタンパク質ライブラリが含まれる。核酸ライブラリは、ゲノムまたはcDNAライブラリとなりうる。cDNAライブラリは、特定の組織、例えば毒液腺組織に由来しうる。ライブラリには典型的に、少なくとも102、103、104、105個またはそれ以上の多様なメンバーが含まれると考えられる。核酸ライブラリメンバーは、ベクター、例えば発現ベクター、例えば誘導型発現ベクターに挿入することができる。
タンパク質ライブラリメンバーは、多様な方法で、例えばファージディスプレイまたは細胞ディスプレイ系において表示することができる。
アレイとその利用
もう1つの局面において、本発明は、多数のアドレスを有する基質を含むアレイを特徴とする。アレイは、核酸アレイまたはタンパク質アレイとなりうる。核酸アレイは、本明細書において言及されるヘビの1つまたはそれ以上からの核酸ライブラリを表示することができる。タンパク質アレイは、本明細書において言及したヘビの1つまたはそれ以上からのタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドライブラリのメンバーを表示することができる。タンパク質または核酸メンバーは、アレイ上の同定可能なアドレスに配置される。アレイは、アドレスの密度が1 cm2あたり少なくとも10、50、100、200、500、1,000、2,000、または10,000個またはそれ以上およびそのあいだの範囲を有しうる。好ましい態様において、複数のアドレスには、アドレス少なくとも10、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000個が含まれる。好ましい態様において、複数のアドレスには、10、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000個に等しいまたはそれ未満のアドレスが含まれる。基質は、スライドガラス、ウェーハ（例えば、シリカまたはプラスチック）、質量分析プレートのような二次元基質、またはゲルパッドのような三次元基質となりうる。複数のアドレスの他のアドレスをアレイ上に配置することができる。
好ましい態様において、複数の少なくとも1つのアドレスには、核酸ライブラリのメンバー、例えばセンスまたはアンチセンス鎖と特異的にハイブリダイズする核酸捕獲プローブが含まれる。1つの好ましい態様において、複数のアドレスのアドレスのサブセットは、核酸ライブラリメンバーに関する核酸捕獲プローブを有する。サブセットのそれぞれのアドレスには、ライブラリメンバーの異なる領域にハイブリダイズする捕獲プローブが含まれうる。
アレイは、様々な方法によって、例えば写真平板法（例えば、米国特許第5,143,854号；第5,510,270号；および第5,527,681号を参照されたい）、機械的法（例えば、米国特許第5,384,261号に記載される定方向流法）、ピンに基づく方法（例えば米国特許第5,288,514号に記述されるように）、およびビーズに基づく方法（例えば、PCT出願第US/93/04145号に記述されるように）によって作成することができる。
もう1つの好ましい態様において、複数の少なくとも1つのアドレスには、SVPポリペプチドまたはその断片と特異的に結合するポリペプチド捕獲プローブが含まれる。ポリペプチドは、SVPポリペプチドの天然に存在する相互作用パートナーとなりうる。好ましくは、ポリペプチドは抗体、例えばモノクローナル抗体または一本鎖抗体のような本明細書に記載の抗体（上記の「Anti-SVP Antibodies」を参照されたい）となりうる。
薬学的組成物
本発明はまた、本発明のヘビ毒プロテアーゼポリペプチドと薬学的に許容される担体とが含まれる薬学的組成物を提供する。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」という用語には、薬学的投与と適合する、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤等が含まれる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、ポリエチレングリコールおよびその異なる分子量、等張生理食塩液ならびに塩酸塩、臭化物および硫酸塩を含む鉱酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、およびマロン酸塩のような有機酸の塩、ならびに発熱物質不含水を含む非制限的な群から選択してもよい。
薬学的に許容される担体、希釈剤、および賦形剤を説明する有用な参考文献は、参照として本明細書に組み入れられる、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（マック出版社、ニュージャージー州、アメリカ、1991）である。補助的な活性化合物も同様に組成物に組み入れることができる。
本発明の薬学的組成物は、血液凝固を促進またはそうでなければ容易にするために用いることができる。使用例には、手術時または損傷もしくは外傷後のような、出血している損傷への投与が含まれる。1つの局面において、ヘビ毒プロテアーゼポリペプチドは、薬学的組成物に存在する唯一の血液凝固成分である。本発明の薬学的組成物の1つの長所は、血液凝固が、共因子のような複数の成分の連続的または複合作用を必要とすることなく、迅速に起こる点である。例えば、カルシウムイオン、第Va因子、およびリン脂質のようなさらなる成分を必要としない。このように、いくつかの態様において、薬学的組成物には、如何なる共因子も、例えばカルシウム、リン脂質、第Va因子またはビタミンKの如何なるものも含まれない。他の態様において、薬学的組成物には、1つまたはそれ以上の、しかし全てではないカルシウム、リン脂質、および第Va因子が含まれうる。
いくつかの態様において、薬学的組成物には、さらなる成分またはアジュバントが含まれうる。例えば、組成物には、以下の1つまたはそれ以上が含まれうる：抗菌剤、例えば抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、抗線維素溶解剤、および増殖因子。抗生物質の例には、テトラサイクリン、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、シクロスポリン、セフォタキシム等が含まれる。抗ウイルス剤の例には、ガンシクロビル、ジドブジン、アマンチジン、ビラダビン、リバラビン、トリフルリジン、アシクロビル、ジデオキシウリジン等が含まれる。抗真菌剤には、ジフルカン、ケタコニゾール、ナイスタチン等が含まれるがこれらに限定されない。ペンタミジンのような抗寄生虫剤を含めることができる。組成物はさらに、I-1-アンチトリプシン、I-1-アンチキモトリプシン等のような抗炎症剤を含んでもよい。組成物に含めることができる増殖因子の例は、アンジオゲニン、エンドセリン、肝細胞増殖因子およびケラチノサイト増殖因子；線維芽細胞増殖因子-1（FGF-1）、線維芽細胞増殖因子-2（FGF-2）、および線維芽細胞増殖因子-4（FGF-4）を含む線維芽細胞増殖因子；血小板由来増殖因子（PDGF）；インスリン結合増殖因子-1およびインスリン結合増殖因子-2を含むインスリン結合増殖因子（IGF）、上皮細胞増殖因子（EGF）、トランスフォーミング増殖因子-Iおよびトランスフォーミング増殖因子-9を含むトランスフォーミング増殖因子（TGF）；CIP-AおよびCIP-Bを含む軟骨誘導因子（CIF）；類骨誘導因子（OIF）；オステオゲニンおよび他の骨増殖因子；BMP-1およびBMP-2を含む骨形態形成増殖因子（BMP）；ヘパリン結合増殖因子-1およびヘパリン結合増殖因子-2を含むヘパリン結合増殖因子；サイトカイン；インターフェロン；ホルモンを含むがこれらに限定されない創傷の治癒を促進する増殖因子である。組成物に含めることができる他の化合物には、アドレナリンのような血管収縮剤、または麻酔薬、例えば局所麻酔薬が含まれる。
薬学的組成物は、ヘビ毒プロテアーゼの安定性を促進するように、例えばヘビ毒プロテアーゼの消化、例えば自己消化を減少させるように調製することができる。ヘビ毒プロテアーゼの安定性は、例えばpH約5〜9、好ましくは約6.5〜7の薬学的組成物においてヘビ毒プロテアーゼを提供することによって促進することができる。ヘビ毒プロテアーゼの安定性はまた、さらにポリオールのような安定化剤を含む薬学的組成物においてヘビ毒プロテアーゼを提供することによっても得ることができる。そのような態様において、薬学的組成物には、約5％、10％、20％またはそれ以上のポリオール（または複数のポリオール）が含まれうる。薬学的組成物において用いることができるポリオールの例はグリセロールである。他の局面において、ヘビ毒プロテアーゼの安定性は、ヘビ毒プロテアーゼを結晶化した凍結乾燥、または凍結乾燥型で提供することによって増加させることができる。組成物を凍結する場合、組成物は、使用時間の前に融解すべきである。もう1つの態様において、本発明は、ヘビ毒プロテアーゼ、例えば本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼを含み、pHが約5〜9、好ましくは約6.5〜7の組成物を特徴とする。本発明はまた、ヘビ毒プロテアーゼ、例えば本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼと、安定化剤、例えばポリオール、例えばグリセロールとを含む組成物も特徴とする。グリセロールは、約5％、10％、または20％で存在しうる。
ヘビ毒プロテアーゼを含む組成物の用量は、ヘビ毒プロテアーゼの特定の用途に依存するが、用量は、その意図する用途を行うために組成物の有効量でなければならない。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて用いるための用量範囲を設定するために用いることができる。一般的に、水溶液であるヘビ毒プロテアーゼを含む組成物に関して、フィブリン凝固形成を増加させるために、そのような組成物の約1 ml〜約50 mlが十分であると考えられる。しかし、組成物の用途に応じて、用量は、約1 ml〜約200 mlの範囲となりうる。
いくつかの態様において、本発明の薬学的組成物は、血液の損失を防止すべき創傷、手術の切開部、または他の部位に局所投与される。この目的のために、絆創膏、小片、ガーゼ、外科用テープ、綿球、または他の吸収材料または支持マトリクスを、局所投与のために本発明のヘビ毒プロテアーゼを含む組成物によってコーティング、含浸、または化学結合させてもよい。フィブリン膠または外科用密封剤の形の薬学的組成物も同様に企図される。本発明の組成物は、腹腔鏡、または開いた外科もしくは外傷創傷を閉鎖するために、クリーム、ローション、ゲル、スプレー、またはエアロゾルの形となりうる。これらの適用では局所投与が望ましい。さらに、ヘビ毒プロテアーゼを含む組成物によってコーティングまたは化学結合させた縫合糸およびステープルを用いることができる。
薬学的組成物は、投与の説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
組織プラスミノーゲン活性化剤の作用による凝血の溶解を防止するために、国際公開公報第99/58569号に記載されるテクスチリニン、アプロチニン、およびEACAのような抗線維素溶解剤を加えてもよいと同様に企図される。
本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼまたはその一部を含むキットもまた、本発明の範囲に含まれる。キットには、以下を含む1つまたはそれ以上の他の要素が含まれうる：使用説明書；他の試薬、例えば1つまたはそれ以上の共因子（例えば、1つまたはそれ以上のカルシウム、リン脂質、および第Va因子）、および/または他の治療物質（例えば、1つまたはそれ以上の、抗菌剤、例えば抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、抗線維素溶解剤、鎮痛剤、および増殖因子）；希釈剤；装置、例えば容器、例えば滅菌容器、または投与のためにヘビ毒プロテアーゼを調製するための他の材料；薬学的に許容される担体（例えば、安定化剤）；および対象に投与するための装置または他の材料（例えば、シリンジ、アプリケータ、絆創膏、スプレー、またはエアロゾル装置）。説明書には、例えば外部出血および/または内部出血を有する患者において、提案される用量および/または投与様式を含む治療応用のための説明書が含まれうる。いくつかの態様において、ヘビ毒プロテアーゼは、投与前に他の成分、例えば1つまたはそれ以上の共因子と反応すると考えられる。他の応用において、ヘビ毒プロテアーゼは、他の成分、例えば1つまたはそれ以上の共因子と共に投与することができ、キットには、ヘビ毒プロテアーゼおよび他の成分の投与の量、用量、および時期に関する説明書が含まれうる。
いくつかの態様において、ヘビ毒プロテアーゼは、凍結乾燥またはフリーズドライ型で供給してもよい。そのような態様において、キットには、融解および/または加水分解するための説明書、および薬学的に許容される担体または希釈剤の1つまたはそれ以上が含まれうる。いくつかの態様において、キットには、希釈剤、または予め測定した量の希釈剤の説明書が含まれうる。
用途
本発明のヘビ毒プロテアーゼは、プロトロンビンをトロンビンに処理することによってプロトロンビンを有効に活性化することが判明した。トロンビンは、フィブリノーゲンを切断してフィブリンを生成するセリンプロテアーゼであり、第V因子、第VIII因子、および第XIII因子を含むいくつかの凝固因子に作用して、フィブリン単量体間の相互作用を安定化させ、それによって凝血の形成を増強する。したがって、本発明は、本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼを投与することによって、プロトロンビンを活性化して、止血を増加させる方法を特徴とする。方法には、フィブリンの凝血形成を促進または増加するために有効な量でヘビ毒プロテアーゼを対象における所望の部位に投与して、それによって凝血形成を増加させおよび/または血液または体液の損失を減少させる段階が含まれうる。「所望の部位」という用語は、フィブリン凝血の形成が望ましい位置を指す。組成物は、創傷、他の組織、または他の所望の部位に直接適用することができる。典型的に、外部創傷の場合、これは創傷への噴霧を含む任意の手段によって直接適用することができる。これはまた、外科的技法の際のように体内に適用することができる。
好ましい態様において、対象は哺乳類、例えばヒトである。本明細書に記述のヘビ毒プロテアーゼは、血液由来ではないため、血液成分から得られた密封剤、絆創膏および止血鉗子において認められうる血液媒介病原体または他の感染物質のリスクに関する懸念は緩和される。
ヘビ毒プロテアーゼおよび本明細書に記載のヘビ毒プロテアーゼを含む組成物は、外科用密封剤、接着剤（例えば、局所または外科用接着剤）、または止血鉗子としての応用を含む様々な応用において用いることができる。
本発明の方法、キット、または薬学的組成物は、例えば、組織または臓器を結合させるため、出血を止めるまたは減少させるために、出血を予防または抑制するため、創傷を治癒するため、および/または創傷を密封するために用いることができる。本発明の方法、キット、および薬学的組成物は、以下を含む様々な外科的状況において用いることができる；鼻、口、または咽頭の手術；呼吸器系の手術；心血管系の手術；血液またはリンパ系の手術、消化器系の手術；泌尿器系の手術；生殖系の手術；骨格筋系の手術；外皮系の手術；形成外科；整形外科；および移植手術。例えば、ヘビ毒プロテアーゼは、血管の手術において用いることができ、これには、遠位冠動脈吻合の縫合穴の出血；左心室縫合線；大動脈切開およびカニューレ挿入部位；再手術において認められる散在性の心筋外膜出血；および例えば心房、大静脈、または右心室レベルでの静脈出血部位からの浸出、の止血を提供することが含まれる。本発明はまた、移植前のダクロン動脈移植片の密封、体外の組織の密封、損傷した脾臓、肝臓および他の実質臓器からの出血の停止（それによって臓器を救う）；気管および気管支吻合の密封、および肺の空気漏出または裂傷の密封、気管支断端、気管支そう、および食道そうの密封；ならびに縫合なしの縫い目のない治癒（「ジッパー」技術）にとっても有用である。本発明はさらに、角膜移植、鼻血、扁桃摘除後、抜歯、および他の適用において止血を提供するために有用である。G.F. GestringおよびR. Lermer、Vascular Surgery、294〜304、9月/10月、1983を参照されたい。同様に、本発明の薬学的組成物は、血友病（例えば、血友病Aおよび血友病B）のような凝固欠損を有する人にとって特に適している。
同様に、第Xa因子およびトロカリンとは異なり、本発明のヘビ毒プロテアーゼは、デスカルボキシプロトロンビンを活性化することができることも判明している。デスカルボキシプロトロンビンは、例えば、クマジンのような抗凝固剤によって治療した対象において認められる。このように、本発明の方法、キット、および薬学的組成物は、クマジンのような抗凝固剤によって治療される対象においてプロトロンビンを活性化するため、および止血を増加するために用いることができる。本明細書に記述の方法および組成物は、クマジン治療を抑制または減少する必要なく、手術または外傷時にこれらの対象について用いることができる。
上記のように、ヘビ毒プロテアーゼは、創傷包帯、絆創膏、小片、ガーゼ、外科用テープ、綿球、または他の吸収材料もしくは支持マトリクスの一部として調製してもよい。包帯および絆創膏は、使用が容易で、操作するために高等な技術に関する知識または熟練を必要としない。それらは緊急時の救急処置手段として自己投与さえ可能である。そのような創傷包帯および絆創膏は、兵士、レスキュー隊員、救急車/パラメディカルチーム、消防士用の外傷湿布のような様々な領域の適応において、ならびに病院および診療所、特に災害の状況において、救急室の人員による初期外傷および救急処置において用いることができる。そのような包帯はまた、一般公衆または医療従事者が用いるための救急キットにおいても有用性を有する可能性がある。ヘビ毒プロテアーゼを含む創傷包帯または絆創膏には、さらにカルシウム、リン脂質、安定化剤、または本明細書に記述のような他の化合物もしくは物質の1つまたはそれ以上が含まれうる。例えば、創傷包帯または絆創膏にはさらに：鎮痛剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、抗線維素溶解剤、および増殖因子が含まれうる。
ヘビ毒プロテアーゼ以外の1つより多い化合物を組成物に加えて、同時に放出させる、またはそれぞれを既定の時間に放出させるように放出させることができる。組成物に加えられるさらなる化合物（または複数の化合物）は、それが意図する目的にとって有効となるような、例えば、抗生物質は微生物の増殖を抑制し、鎮痛薬は疼痛を軽減するために有効となるような濃度で加えることができる。いくつかの態様において、包帯または絆創膏には、接着層および/または裏打ち層が含まれてもよい。包帯または絆創膏の裏打ち層は、通常の非吸収性の材料であってもよく、例えばシリコン小片またはプラスチック材料であってもよい；またはこれは生体適合性の吸収性の材料、例えばキチンまたはその誘導体であってもよい。
外科的密封剤または外科的接着剤として用いるためのような他の応用に関して、薬学的組成物は、フィブリン膠の形、またはクリーム、ローション、ゲル、スプレー、フォーム、もしくはエアロゾルの形であってもよい外科的密封剤の形となりうる。フォーム、スプレー、およびエアロゾルの場合、組成物は、成分が膨張可能なフォームまたはスプレーとして創傷部位に輸送されるように、加圧された噴射剤を有するキャニスターまたはタンクに保存することができる。好ましい態様において、スプレー、フォーム、またはエアロゾルは、一定用量で提供される。そのような態様において、方法には、対象に、一定用量のスプレー、エアロゾル、またはフォームを提供すること、およびスプレー、エアロゾル、またはフォームを例えば創傷に投与するための説明書を対象に提供することが含まれうる。説明書は、自己投与のため、または他人に投与するためとなりうる。
それによって組成物が凝血を形成する速度は、適応によってある程度左右される可能性があり、例えば動脈損傷および出血性の組織損傷の場合には迅速であり、そして骨の多い組織に対する損傷の治療の場合にはよりゆっくりである。好ましくは、凝血形成は、適用後10分以内に明白である。最も好ましくは、凝血形成は、適用後2〜8分以内に明らかとなると考えられる。
本発明は、制限的に解釈されてはならない以下の実施例によってさらに説明する。本出願を通して引用された全ての参考文献、特許および公表された特許出願の内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
実施例
材料および方法
材料
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体は、参照として本明細書に組み入れられる、Masciら、1988、Biochem. Int. 17：825に記述される方法によって調製した。4 mg/mlプロトロンビン活性化因子を50％グリセロールにおいて-20℃で保存した。セファクリルS-300は、アマシャムファルマシアバイオテック（Amersham Pharmacia Biotech）、ウプサラ、スウェーデン）から得て、合成色素産生基質S-2222を、クロモゲネクス（Chromogenex）、ストックホルム、スウェーデンから得た。期限切れのクエン酸加血漿は、アレクサンドラ王女病院血液バンクが利用できる健常なウイルススクリーニングを行ったボランティアから得た。ハンプトン1および2スクリーニングキットは、米国のハンプトン研究所（Hampton Research）から得た。ウィザード（Wizard）1および2スクリーニングキットは、イギリスのエメラルドバイオストラクチャーズ（Emerald Biostructures）から得た。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼの精製
ConA-セファロース4B
P.テクスチリスヘビ毒プロテアーゼの精製における第一段階は、上記のMasciら、1988に記述されるように、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体を粗毒液から単離することであった。Con-Aセファロース4Bを2.5×16 cmカラムに充填して、製造元の推奨されるとおりに洗浄して、開始緩衝液（0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4）によって平衡にした。P.テクスチリス毒液（乾燥重量233 mg）を開始緩衝液10 mlに溶解して、溶解するまで37℃の水浴に入れた。試料をカラムにローディングして、初期値がゼロに戻るまでカラム緩衝液によって洗浄した。溶出緩衝液（0.02 Mメチルα-D-マンノピラノシドの0.05 Mトリス塩酸溶液）を、カラムに適用して、結合したタンパク質（ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体）をCon-Aセファロース4Bから溶出した。カラムの流速は、52 ml/時間であった。UV二波長検出器を280 nmに設定して、吸光度測定レンジ（absorbance units full scale、AUFS）の減衰を0.32および0.64とした。S-2222加水分解活性を有する分画をプールして、YM3メンブレンを備えたアミコン濃縮器モデル405において流速48 ml/時間で濃縮した。精製ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体は、50％グリセロールにおいて-20℃で保存した。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体からのブラウンスネーク毒プロテアーゼの精製
セファクリルS-300クロマトグラフィー
セファクリルS-300クロマトグラフィーゲルを、製造元の推奨通りに洗浄した。セファクリルS-300を6℃で87 cm×2.5 cmカラムに充填して、開始緩衝液（0.05 Mトリス塩酸緩衝液、pH 7.4）によって平衡にした後、0.8 M NaSCNを加えた同じ緩衝液のカラム容積の2倍量によって平衡にしてから、試料を適用した。4 mg/mlプロトロンビン活性化剤10 mlおよび1.6 M NaSCN 10 mlを10分間インキュベートして、カラムにローディングした。ギルソン蠕動ポンプを、流速40 ml/時間が得られるように、紫/黒チャンバーに設定した。コールパルマー2ペンチャートレコーダーを備え、減衰0.32 AUFSでA280に設定したアルテックスUV二波長検出器を、1 cm/時間に設定して用いた。当初、10分/チューブの間隔で分画を回収した後、12分/チューブに変更してそれぞれ、LKB 7000分画コレクターを用いて6.5および8 mlの分画を得た。上記のように、色素産生アッセイを行って加水分解活性を有する分画を評価して、YM3メンブレンを備えたアミコン濃縮器、モデル42において濃縮した。この技法を、3回繰り返した。
スーパーデックス200ゲルクロマトグラフィー
スーパーデックス200高解像度ゲルクロマトグラフィーも同様に用いてブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体からプロテアーゼを精製した。スーパーデックス200を、製造元の推奨通りに洗浄して、2.5×90 cmカラムに充填してカラム緩衝液（0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4、0.8 M NaSCN）によって脱平衡した。5.6 mg/mlブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体9 mlを含む溶液を1.6 M NaSCN 9 mlと共に30分間インキュベートした後、カラムにローディングした。流速は48 ml/時間であった。波長検出器の280 nmでの減衰は0.32または0.64 AUFSであった。S-2222活性を有する分画をプールして、YM3メンブレンを備えたアミコン濃縮器、モデル52において濃縮した。プールして濃縮した試料（5 ml）を、同じカラムにおいて再度クロマトグラフィーを行った。最終的なプロテアーゼ調製物を0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4において一晩透析して、溶液からNaSCNを除去した。この調製物（10 ％グリセロール/トリス緩衝液において-20℃で保存）を、全ての機能的および構造的特徴研究に用いた。
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
逆相HPLCを、6000A二ピストンポンプおよびM45Aポンプ、A280 nmに設定した490波長検出器、Wisp試料注入器、およびPhemonenex Jupiter C18-カラム（KHO-4154）（1.4 mm×250 mm）からなるWaters（商標）システムを用いて25℃で行った。クロマトグラフィーは、開始溶液（A）0.1％TFAの蒸留水溶液によって60分の直線勾配モードを用いて行い、（B）80％アセトニトリルの（A）溶液によって溶出した。Waters Milleniumバージョン1.01ソフトウェアを用いてシステムを管理して、データを統合した。
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）
SDS PAGEは、本質的にLaemlli、1970、Nature 227：680に記述されたとおりに実施した。SDS-PAGE試料を、βメルカプトエタノール（β-Me）の存在下または非存在下でSDS試料緩衝液において10分間沸騰させた。ゲルをクーマシーブルーによって染色して、メタノール、酢酸、および水（45：10：45）によって脱色した。
N末端アミノ酸シークエンシング
シークエンシングは、エドマン分解法を用いて行った。アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）Procine 492cLcタンパク質シークエンシングシステムを用いて、ブラウンスネーク毒プロテアーゼをシークエンシングした。装置の詳細に関しては、アプライドバイオシステムズのマニュアル第904 244号、改訂版Dを参照されたい。ExPAsy/NCBI blastを用いて検索を行って、は虫類のセリンプロテアーゼと第Xa因子、およびT.カリヌツス第Xa因子様セリンプロテアーゼとの配列相同性を同定した。
第一鎖cDNA合成とcDNA末端の増幅
ヘビ毒液腺から単離した総RNA 1μgを、cDNA合成のために用いた。5' RACE-Ready cDNAを合成する場合には、本発明者らは、SMART RACE cDNA増幅キットからの5'-CDS[5'-(T)25N-1N-3'；N＝A、C、GまたはT；N-1＝A、G、またはC][配列番号：32]およびSMART II Aオリゴ
Figure 0004701355
プライマーを用いて、3' RACE ready cDNAを調製する場合には、3'-CDSプライマーA
Figure 0004701355
および同じキットからのPowerScript逆転写酵素を用いた。水100 μlを加えて双方のcDNAを希釈し、これを、ユーザーマニュアル（SMART RACE cDNA増幅キット、クロンテック）に記述のプロトコールに従って、cDNA末端の迅速な増幅（RACE）のために用いた。
3' RACE PCRに関して、3' RACE cDNA、UPM[万能プライマーミクスA
Figure 0004701355
ならびにN末端アミノ酸配列IVNGMDに基づく縮重GSP-2（フォワード）プライマー
Figure 0004701355
を用いた。Advantage 2ポリメラーゼミクス（クロンテック）を用いて反応をプライミングした。サーマルサイクラー：1サイクル：95℃1分；25サイクル：95℃30秒、65℃1分、68℃3分；1サイクル：68℃3分。主なPCR産物（1.5 kbp）を、QIAquickゲル抽出キット（キアゲン（Qiagen））を用いてゲルから単離して、pGEM-T Easyベクターにクローニングした。コロニーをスクリーニングした後、QIAprepスピンミニプレップキット（キアゲン）を用いてコロニー35個から微小沈殿物を単離した。
DNAシークエンシング
DNAシークエンシングは、BigDyeターミネータおよびpGEM-T Easyベクターに対するフォワードプライマー
Figure 0004701355
を用いて行った。約500 bp内に停止コドンを含まないクローン2個のみを発見した。これらのクローンをFor2プライマー
Figure 0004701355
によってシークエンシングした。停止コドンを発見した。これらの2つのクローンの完全長の配列は類似であり、最初の停止コドンまでのGSP-2からの3'-DNAの長さは776 bpであった。
3' cDNA配列を用いて、リバースプライマーGSP-1を設計した。
Figure 0004701355
5' RACE PCR 5' cDNAに関して、UPM（上記を参照されたい）、GSP-1およびAdvantage 2ポリメラーゼミクス（クロンテック）を用いた。PCR条件は、3' RACE PCRと同じであった。主なPCR産物（1 kbp）を単離して、pGEM-T Easyベクターにクローニングした。シークエンシングのために選択されたクローン15個中6個が同じであり、停止コドンを含まなかった。シークエンシングプライマー2個を用いた：pGEM-T Easyベクターに対して進行方向（上記を参照されたい）のプライマーとリバースプライマーGSP-1。クローンは6個全てがATGを含み、開始からGSP-2プライマー配列に対応する位置まで628 bpであった。3'および5' cDNA配列を用いて、完全長のcDNAに関するフォワードおよびリバースプライマーを設計した。
Figure 0004701355
PCR産物（1.407 bp）をシークエンシングのためにpGEM-T Easyベクターにクローニングした。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体の色素産生プロトロンビン活性化アッセイ
一連のアッセイを行って、S-2222加水分解速度対ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体またはブラウンスネーク毒プロテアーゼの量に関する標準曲線を得た。ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体（4 mg/ml）およびプロテアーゼ（1 mg/ml）の10倍〜10,000倍までのそれぞれの希釈液を0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4において調製して、氷中で保存した。
P.テクスチリスセリンプロテアーゼまたはブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体のS-2222に及ぼす加水分解活性は、ヒタチ557分光光度計の1 mlセルにおいて、25℃で10 mM CaCl2の存在下または非存在下で、0.05 Mトリス塩酸緩衝液（pH 7.4）0.93 mlおよび3.0 mM S-2222 50 μlの平衡によって決定した。反応は、様々な濃度のプロテアーゼ（0.4 mg/ml）20 μlを加えることによって開始した。405 nmでのp-ニトロアニリンの放出をモニターした。0.8 M NaSCN、S-2222 50 μl、および0.4 mg/mlブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体40 μlを含むpH 7.4の0.05 Mトリス塩酸緩衝液0.91 mlによるアッセイを、0、1、2、5および10分の間隔で行った。活性1単位は、基質1μmol/分の加水分解に相当する。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼのプロトロンビン活性化アッセイ
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ（5 μg）を0.25 mg/mlプロトロンビン（0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4溶液）2 mlに加えた。この溶液の少量（20 μl）を様々な時間間隔で採取して、トロンビン選択的な基質S-2238による色素産生アッセイを行った。これらのアッセイは、0.05 Mトリス塩酸（pH 7.4）930 μl、S-2238 50 μl、および試料20 μlからなった。基質の加水分解速度を405 nmで測定した。SDS-PAGE分析±βメルカプトエタノールの場合も同様に、20 μlの少量2個ずつをそれぞれの時間間隔で採取した。
凝血アッセイ
クエン酸加血漿凝血アッセイは、Austen＆Rhymes、「A Laboratory manual of blood coagulation」、ブラックウェル科学出版社、オックスフォード、イギリス、1975に記述のHyland-Clotek装置を用いて行った。アッセイは、0.05 Mトリス塩酸（）pH 7.4）100 μl、クエン酸加ヒト血漿100 μlおよび様々な濃度のプロテアーゼ20 μlからなった。同様に、0.04 M CaCl2の存在下または非存在下で、0.8 M NaSCNを含む同一のアッセイを一定間隔で少量を採取して行った。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼによるクエン酸加血漿におけるフィブリン形成
ヒトクエン酸加血漿（970 μl）を、以下と混合した：
（1）1.16 mg/mlプロテアーゼ20 μl；
（2）最終的なCa2+濃度が40 mM（遊離のCa2+濃度〜10 mM）となるように1.16 mg/mlプロテアーゼ20 μlおよび4 M CaCl2 10 μl；
（3）4 M CaCl2 10 μl。
0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4を加えて各溶液を1 mlとした。3つの溶液を4時間放置して、得られた凝血を圧縮して、dH2Oによって数回洗浄し、フィブリン凝血から他の血漿タンパク質を除去した。次に、凝血をβメルカプトエタノールおよび4 M尿素を含む4×SDS試料緩衝液500 μlを含むエッペンドルフチューブに加えた。βメルカプトエタノールをそれぞれのエッペンドルフチューブにさらに滴下して、一晩放置した。試料を5分間沸騰させて、各10 μlを本明細書に記述のように、SDS-PAGEアクリルアミドゲル上で泳動させた。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体およびブラウンスネーク毒プロテアーゼの活性部位標識
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体（4 mg/ml）およびブラウンスネーク毒プロテアーゼ（2 mg/ml）溶液の試料（120 μl）を40 mM DNS-GGACK（0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4において最終濃度4 mM）15 μlと1時間反応させた。次に、0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4において磁気攪拌装置によって試料を4℃で一晩透析して、過剰量の抑制剤を除去した。次に、標識および非標識ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体およびプロテアーゼの双方に関して、βメルカプトエタノールの存在下および非存在下でSDS PAGEを行った。活性部位標識タンパク質を有するゲルを紫外光下で可視化したが、他のゲルはクーマシー・ブルー染色を行った。
フィブリン膠の研究
期限切れのクエン酸加血漿（3.5 ml）を37℃の水浴中で20 mlコニカルプラスチックバイアルに分配した。2 mg/mlブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼ20 μlを双方のバイアルに加えた。0.025 M CaCl2を一方のバイアルに加えて、もう一方のバイアルに生理食塩液を加えた。凝固時間を肉眼によってモニターして、堅固な凝血が形成されれば、それらを54番の濾紙に載せて、圧迫した。得られた圧迫した凝血を蒸留水で十分に洗浄して、4℃で一晩保存した。凝血の写真を撮影して組織を調べた。
結果
本明細書において示されるように、そしてP.テクスチリスによって例示されるように、ヘビ毒プロテアーゼ複合体は、第Xa因子様セリンプロテアーゼの特徴的なプロテアーゼと、機能が不明の他の多数のタンパク質とを含む。P.テクスチリス、O.スクテラツス、N.スクタツス、T.カリナツス、およびP.ポルフィリアクスから単離されたヘビ毒プロテアーゼは、局所フィブリン「膠」または「密封剤」の形で薬学的組成物を調製するために有用となる可能性がある。
本明細書に記述の実験のいくつかは、P.テクスチリス由来の試料およびタンパク質を用いて行われた。しかし、これらの実験は、本発明の他のヘビ毒プロテアーゼに応用可能となる可能性があるヘビ毒プロテアーゼ複合体およびヘビ毒プロテアーゼの特徴を示す例であることは当業者には明らかであると考えられる。
ヘビ毒プロテアーゼの精製
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体の精製（Con-Aセファロース4B）
P.テクスチリスヘビ毒プロテアーゼの精製における第一段階は、粗毒液からブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体を単離することであった。Masciら、1988、上記に記載される方法に基づく方法を用いた。Con-Aセファロース4B上でのP.テクスチリスの天然の毒液の乾燥重量233 mgのクロマトグラフィーによって得られた280 nmでの溶出プロフィールを図1に示す（当初のクロマトグラムの軌跡）。
毒液は2つの主なタンパク質ピークに分解され、1つは、Con-Aセファロース4Bに結合して、第Xa因子基質S-2222に対する活性を有した（図1におけるAの線で示す）。A280測定に基づいて、活性のピークは、総毒液タンパク質の約30％を占めた。
Con-Aセファロース4Bクロマトグラフィーからのプールしたブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体濃縮物のSDS PAGEの結果を図2に示す；レーン1：分子量マーカー（大きさをkDaで示す）、レーン2：βメルカプトエタノールの非存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体、レーン3：βメルカプトエタノールの存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体。
矢印Aは、レーン2における天然のブラウンスネーク毒プロテアーゼのバンドを示すが、矢印BおよびCは、レーン3におけるブラウンスネーク毒プロテアーゼのそれぞれ、重鎖および軽鎖を示す（下記を参照されたい）。
βメルカプトエタノールの非存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体（レーン2）は、〜150から200 kDaで1本の主要な広いタンパク質のバンド、および分子量が〜60、50、および45 kDaの他の3本の主なバンドを含む。レーン2における3本の主要なバンドのおおよその質量を合計すると、無傷の複合体に関して300から350 kDaの予想計算分子量が得られる。
βメルカプトエタノールの存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体（レーン3）は、それぞれの見かけの分子量が110、93、80、55、46、40であるいくつかのタンパク質のバンドと、〜32から34 kDaの広いバンド（おそらくダブレット）に分離される。レーン2と3の違いは、ジスルフィド結合が複合体におけるポリペプチドのいくつかを互いに連結しているように思われることを示している。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体のプロテアーゼ成分は、矢印Aによって示されるように、〜50から60 kDaでレーン2において目に見える二重項として存在する。プロテアーゼの重鎖（矢印Bによって示す）は約40 kDaでのバンドとして存在し、およびプロテアーゼの軽鎖は分子量約32 kDaを有する（矢印Cによって示す）。SDS PAGEのバンドA、B、およびCのこのような命名は、本明細書に記述の単離および特徴付け実験によって確認された。図2におけるバンドのいくつかは、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体における毒液の不純物を表す可能性がある。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体からのプロテアーゼ成分の精製
セファクリルS-300クロマトグラフィー
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体からブラウンスネーク毒第Xa因子様セリンプロテアーゼ成分を単離するために、複合体を解離する必要がある。Speijerら（1986）は、0.8 M NaSCNがO.スクテラツス-プロトロンビン活性化剤を有効に解離することを示したが、クロマトグラフィー技法において0.8 M NaSCNによってこれを精製する試みを行わなかった。0.8 M NaSCNによるブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体の解離能を説明するために、以下の実験を行って、結果を図3に示す。0.8 M NaSCNをブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体に加えると、クエン酸加血漿凝固活性の10秒未満から60秒を超える時間までの急激な減少を引き起こしたが、ほとんどのS-2222活性は本質的に保持された。
0.8 M NaSCNによって処置したブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体は、0.8 M NaSCN含有緩衝液によって平衡にしたセファクリルS-300カラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーによって個々の成分に分離した。
分画30〜43は、S-2222加水分解活性を示した。分画の容量は、残りのクロマトグラフィー段階に関して、分画数を減少させるために、6.5 ml/チューブから8 ml/チューブまで増加させた。第二のセファクリルS-300クロマトグラフィーは、プールして濃縮した分画30〜43について行った。S-2222加水分解活性は、分画25〜29において認めた。プールして濃縮した分画25〜29に関する第三のセファクリルS-300クロマトグラフィー。本質的に、これは分画25〜29におけるS-2222加水分解活性を有する単一のタンパク質ピークを生じた。HPLCによって高い程度の相同性を確認した（図4）。HPLCに基づき、ブラウンスネーク毒プロテアーゼは95％を超えて純粋である。
表1〜6は、実験の組からの試料の精製結果および特徴付けを要約する。
セファクリルS-300ゲル濾過産物のSDS PAGE±β-Me
SDS PAGEは、図5に示すように全てのクロマトグラフィー段階からのプールした分画について実施した。レーン4（セファクリルS-300、クロマトグラフィー段階1、プールした分画30〜43）は、分子量約107 kDaに混入物が存在したことから、プールしたブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼの均一な調製物が得られなかったことを示している。レーン5（セファクリルS-300を含む、クロマトグラフィー段階2、プールした分画25〜29）は、より大きい百分率の55〜56 kDa成分を示すが、なおも第三のクロマトグラフィーを必要とする混入物を含む。第三のクロマトグラフィー段階からのセファクリルS-300プール分画25〜29の異なる量を有するレーン6〜8は、均一な調製物であることを示す。無傷のブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼの分子量は、レーン5〜8において55〜56 kDaのあいだであるように思われる。
ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼを、β-Meの存在下（レーン10）および非存在下（レーン3）で、P.テクスチリス毒液全体（レーン2）と無傷のブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体の双方と比較した。これは、複合体内および全毒液におけるブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼの位置を示した。
図5のレーン9は、β-Meの存在下でのクロマトグラフィー段階3からのセファクリルS-300プール分画25〜29の減少を示す。分子量約31 kDaの単一のバンドを認めることができる。ブラウンスネーク毒プロテアーゼの減少に起因するはずである予測される2つのバンドを同定するために、第二のゲル分離を行った。このゲルを図6に示す。
β-Meの存在下または非存在下でのセファクリルS-300のプールして濃縮した分画25〜29のSDS PAGEを、図6に示す。レーン3（セファクリルS-300、クロマトグラフィー段階3、プールした分画25〜29を含む）、4および6（クロマトグラフィー3からのセファクリルS-300のプールして濃縮した分画25〜29を含む）は、ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼの均一な調製物が得られたことを示している。しかし、レーン3および6のバンドはいずれも非常にかすかであった。ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼの分子量は、55〜56 kDaであるように思われ、これは図5における結果と一致する。
レーン5（β-Meの存在下でのクロマトグラフィー3からのセファクリルS-300のプールして濃縮した分画25〜29）は、ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼが3つのサブユニットを含むが、最後のバンドは、Laemlli法についてしばしば認められる色素の最前部である可能性があるか、または自己消化産物の可能性がある。レーン7（β-Meの存在下でセファクリルS-300、クロマトグラフィー段階3のプールして濃縮した分画25〜29を含む）は、バンドを示さず、レーン8（β-Meの存在下でのクロマトグラフィー3からのセファクリルS-300のプールして濃縮した分画25〜29を含む）は、ブラウンスネークセリン毒プロテアーゼが重鎖および軽鎖を含むことを示している。ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼは、対応する第Xa因子およびO.スクテラツスセリンプロテアーゼ構造に基づいて重鎖および軽鎖を含むと推定される。ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼ重鎖の分子量は約31 kDaであるように思われ、図5の結果に対応するが、軽鎖は約18 kDaである。ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼを表すバンドについて比較を行うことができるように、β-Meの存在下でのP.テクスチリス毒液全体（レーン2）および無傷のブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体（レーン9）をゲルに含めた。
スーパーデックス200ゲル濾過
ブラウンスネーク毒プロテアーゼの精製を改善する試みで、高い分解能のゲル濾過媒体（スーパーデックス200）を、セファクリルS-300の代わりに用いた。NaSCNの存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体のスーパーデックス200でのクロマトグラフィー後および再クロマトグラフィー後の280 nmでの溶出プロフィールを、図7Aおよび7Bに示す。図7Aおよび7Bは、0.8 M NaSCNを含む0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4におけるスーパーデックス200のカラム（2.5×90 cm）上でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体（18 ml；50.4 mg）のクロマトグラフィー後の溶出プロフィールを示す。図7Aは、クロマトグラフィー段階1を示し、図7Bは、クロマトグラフィー段階2を示す。それぞれの段階において、S-2222活性を有する分画をプールして濃縮し、Aの線で示した。
スーパーデックス200によるブラウンスネーク毒プロテアーゼの精製からの試料を、図7Cに示すそれぞれの精製段階後にSDS PAGEによって分離した。レーン1および2：βメルカプトエタノールの存在下（レーン2）および非存在下（レーン1）でのクロマトグラフィー段階1からのプールした濃縮物；レーン3および4：βメルカプトエタノールの存在下（レーン5）および非存在下（レーン4）でのクロマトグラフィー段階2からのプールした濃縮物；レーン5：分子量マーカー（大きさをkDaで示す）；矢印A、BおよびCは、レーン4における不純物を示す。
スーパーデックス200精製において用いた開始材料の特異的活性は、セファクリルS-300クロマトグラフィーにおいて用いた開始材料より実質的に低かった（表2）。これは、異なる毒液試料の異なる活性を反映する可能性がある。スーパーデックス200の精製からの最終産物は、特異的活性1.1 U/ml/A280を有し、セファクリルS-300産物の2.4 U/ml/A280の半分より低かった。
イオン交換クロマトグラフィー、もう1つの解離物質としての尿素、一段階ConA-セファロース4B精製技法を用いた粗P.テクスチリス毒液からのブラウンスネーク毒プロテアーゼの精製、プロテアーゼの基質特異性に基づく親和性、および当技術分野で既知の他の方法を含む、他の単離法が企図される。以下は、ブラウンスネーク毒プロテアーゼの単離によって示される、本発明のプロトロンビン活性化タンパク質を単離するための適した方法の例である。表3〜6は、異なる段階での精製の際の試料の特性を示す。
プロトコール1
ConA-セファロース（07-01-03）
・開始緩衝液、0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4
・溶出緩衝液、0.05 Mトリス塩酸、0.02 Mメチル-α-D-マンノピラノシド
・ローディング試料：毒液製品からの乾燥毒液（重量：541 mg）を、開始緩衝液10 mlに溶解した
* 1 ml溶液のA280：13.5
* ローディングした総A280単位：135
* 試料の活性：38 U/ml
* ローディングした総活性単位：377
・プールしたS-2222活性を有する分画
* 濃縮したプールのA280は6.8であり、10 mlからなった。
* プールした総A280単位：68
* プールの活性：2.6 U/ml
* プールした総活性単位：26.0
スーパーデックス200（13-01-03）
・開始緩衝液、0.05Mトリス塩酸、pH 7.4、0.8 M NaSCN
・ローディング試料：0.8 M NaSCNを加えた上記のConA-セファロースクロマトグラフィー（A280 8.9、10 ml、3.25 U/ml）からのプールして濃縮したピークの一部
* ローディングした総A280単位：89
* ローディングした総活性単位：32.5
・プールしたS-2222活性を有する分画
* 濃縮したプールのA280は、0.350であり、20 mlからなった
* プールした総A280単位：7
* 濃縮したプールの活性：0.46 U/ml
* プールした総活性単位：9.2
スーパーデックス200（14-01-03）
・開始緩衝液、0.05Mトリス塩酸、pH 7.4、0.8 M NaSCN
・ローディング試料：先のスーパーデックス200クロマトグラフィー（A280 0.350、20 ml、0.46 U/ml）からのプールして濃縮した分画
* ローディングした総A280単位：7
* ローディングした総活性単位：9.2
・プールしたS-2222活性を有する分画
* 濃縮したプールのA280は、0.076であり、40 mlからなった
* プールした総A280単位：3.0
* 濃縮したプールの活性：0.11 U/ml
* プールした総活性単位：4.4
プロトコール2
ConA-セファロース（21-01-03）
・開始緩衝液、0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4
・溶出緩衝液、0.05 Mトリス塩酸、0.02 Mメチル-α-D-マンノピラノシドの後に、0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4、0.8 M NaSCN
・ローディング試料：John Weigelからの乾燥毒液（重量：432 mg）を、開始緩衝液10 mlに溶解した
* 1 ml溶液のA280：25.6
* ローディングした総A280単位：256
* 試料の活性：102.9 U/ml
* ローディングした総活性単位：1028
・プールしたS-2222活性を有する分画
* プール2個を作製した
1．メチル-α-D-マンノピラノシドによって溶出した濃縮分画（フェニル-セファロースカラムに適用）
* 濃縮したプールのA280は0.95であり、22 mlからなった。
* プールした総A280単位：20.9
* プールの活性：5.0 U/ml
* プールした総活性単位：110
2．NaSCNによって溶出した濃縮分画（この半分のみを、下記の2つの同一のスーパーデックス200クロマトグラフィー段階に適用した）
下記の200カラム
* 濃縮したプールのA280は1.85であり、27 mlからなった。
* プールした総A280単位：68
* プールの活性：2.6 U/ml
* プールした総活性単位：26.0
スーパーデックス200（29-01-03および30-01-03）
・開始緩衝液、0.05Mトリス塩酸、pH 7.4、0.8 M NaSCN
・ローディング試料：上記のConA-セファロースクロマトグラフィーからプールして濃縮したピークの一部。2つの同一のクロマトグラフィー段階を行った。ローディング試料は、0.8 M NaSCNを加えた上記のConA-セファロースクロマトグラフィーからのプールして濃縮したピーク16 mlからなった
* 1 ml溶液のA280：1.2
* ローディングした総A280単位：19.2
* 試料の活性：15.7 U/ml
* ローディングした総活性単位：250.6
・それぞれのクロマトグラフィー段階からの高い同一の特異的活性を有する分画をプールして濃縮した（他の分画も同様にS-2222活性を有したが、特異的活性は低く、これらは個別にプールした）
* 濃縮したプールのA280は1.9であり、9 mlからなった
* プールした総A280単位：17.1
* 濃縮したプールの活性：25.7 U/ml
* プールした総活性単位：231.3
スーパーデックス200（04-02-03）
・開始緩衝液、0.05Mトリス塩酸、pH 7.4（0.8 M NaSCNを含まない）
・ローディング試料：これまでのスーパーデックス200クロマトグラフィー（A280 1.9、9 ml、25.7 U/ml）からのプールして濃縮した分画
* ローディングした総A280単位：17.1
* ローディングした総活性単位：231.3
・プールしたS-2222活性を有する分画（下記の結果には、最高のS-2222活性を有する分画が含まれ、他の分画も同様にS-2222活性を有し、これらは個別にプールした）
* 濃縮したプールのA280は、1.7であり、9.5 mlからなった
* プールした総A280単位：16.2
* 濃縮したプールの活性：17.7 U/ml
* プールした総活性単位：168.2
プロトコール3
ConA-セファロース（10-02-03）
・開始緩衝液、0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4
・溶出緩衝液、0.025 Mトリス酢酸、pH 6.5、4 M尿素
・ローディング試料：乾燥毒液（重量：557 mg）を、開始緩衝液25 mlに溶解した
* 1 ml溶液のA280：28
* ローディングした総A280単位：700
* 試料の活性：83.4 U/ml
* ローディングした総活性単位：2087
・プールしたS-2222活性を有する分画
* プールのA280は0.592であり、640 mlからなった。
* プールした総A280単位：379
* プールの活性：0.152 U/ml
* プールした総活性単位：97.3
CMセファロース（12-02-03）
・開始緩衝液、0.025Mトリス酢酸、pH 6.5、4 M尿素
・ローディング試料：ConA-セファロースクロマトグラフィー（A280 0.592、640 ml、0.152 U/ml）からのプールした分画
* ローディングした総A280単位：379
* ローディングした総活性単位：97
・試料全体をカラムにローディングした後、0〜0.5 M NaCl勾配を適用した
・S-2222活性を有する分画をプールした
* 濃縮したプールのA280は、4.5であり、17.5 mlからなった
* プールした総A280単位：79
* 濃縮したプールの活性：1.44 U/ml
* プールした総活性単位：25
スーパーデックス200（13-02-03）
・開始緩衝液、0.05Mトリス酢酸、pH 6.5
・ローディング試料：CM-セファロースクロマトグラフィー（A280 4.5、17.5 ml、1.44 U/ml）からのプールして濃縮した分画
* ローディングした総A280単位：79
* ローディングした総活性単位：25
・プールしたS-2222活性を有する分画（下記の結果は、プールした対称なピークを指し、他の分画も同様にS-2222活性を有した）
* 濃縮したプールのA280は、0.330であり、7.5 mlからなった
* プールした総A280単位：2.5
* 濃縮したプールの活性：0.146 U/ml
* プールした総活性単位：1
プロトコール4
フェニル-セファロース（15-02-03）
・開始緩衝液、0.8 M NaSCN-リン酸、pH 6.5
・ローディング試料：ConA-セファロースクロマトグラフィー（A280 0.95、22 ml、5.03 U/ml）からのプールして濃縮した分画
* ローディングした総A280単位：20.9
* ローディングした総活性単位：110
・試料全体をカラムにローディングした後、0.8〜0 M NaSCN勾配を適用した
・プールしたS-2222活性を有する分画
* 濃縮したプールのA280は、0.485であり、9.5 mlからなった
* プールした総A280単位：4.6
* 濃縮したプールの活性：1.4 U/ml
* プールした総活性単位：13
スーパーデックス200（18-02-03）
・開始緩衝液、0.05Mトリス酢酸、pH 6.5
・ローディング試料：フェニル-セファロースクロマトグラフィー（A280 0.485、10 ml、1.4 U/ml）からのプールして濃縮した分画
* ローディングした総A280単位：4.85
* ローディングした総活性単位：14
・プールしたS-2222活性を有する分画（2つのプールを作製し、下記の1つは最大の活性を有する分画を含む）
* 濃縮したプールのA280は、0.327であり、3.5 mlからなった
* プールした総A280単位：1.14
* 濃縮したプールの活性：1.83 U/ml
* プールした総活性単位：6.4
P.テクスチリスヘビ毒プロテアーゼ複合体の特徴付け
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体によるS-2222色素産生基質の加水分解に及ぼすCa2+の影響
ヘビ毒プロテアーゼ複合体第Xa因子様切断の特異性を決定するために、第Xa因子色素産生基質S-2222を用いる色素産生アッセイを行った。ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体はCa2+を加えても加えなくてもS-2222を加水分解する。Ca2+の非存在下での加水分解の初速度はCa2+の存在下の初速度と類似であるが、これは2 μg/mlより高い濃度のブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体に限られる（データは示していない）。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体によるS-2222加水分解速度は、アッセイにおけるブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体の量とほぼ比例する（表7におけるR2値によって示されるように；グラフは示していない）。
Ca2+またはCa2+と共にPLを添加しても、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体によるS-2222の加水分解に実質的に影響を及ぼさず、これは単離されたブラウンスネーク毒プロテアーゼに関して類似である。ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体によるS-2222加水分解をブラウンスネーク毒プロテアーゼと比較すると、単位μg-1で表す速度が類似であることを示している。ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体の約10〜15％のみがプロテアーゼであることから（質量に基づいて）、モルに関してのブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体中のプロテアーゼによるS-2222加水分解速度は、単離されたプロテアーゼの場合よりも約10倍大きい。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体によるクエン酸加血漿の凝血
凝血特性を単離されたブラウンスネーク毒プロテアーゼと比較するために、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体によるクエン酸加血漿凝血アッセイを行った。これらの実験結果を表8に示す。表8に示す値は、補助成分の存在下および非存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体によるクエン酸加血漿の凝血に関連したデータに由来する（すなわち、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体単独、40 mM CaCl2の存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体、ならびに40 mM CaCl2およびリン脂質の存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ）。
結果は、Ca2+およびPLがブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体の凝血効率に影響を及ぼさないことを示している。
ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼのクエン酸加血漿凝血時間に及ぼすCa2+の影響
ブラウンスネーク毒プロテアーゼの凝血特性を調べるために、Ca2+の非存在下でのクエン酸加血漿凝血時間を、Ca2+が存在する場合と比較した。表9および10の結果は、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体が、血液を凝固させるためにCa2+を必要としないことを示している。例えば、39 μg/mlの単離されたブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼは、Ca2+の非存在下で30秒未満でクエン酸加血漿を凝血させるであろう。Ca2+の添加によって、凝血時間70秒を生じるために必要なブラウンスネーク毒プロテアーゼの量は200倍減少した（表10）。このことは、ブラウンスネーク毒プロテアーゼがCa2+の非存在下でプロトロンビンをトロンビンに変換できること、そしてCa2+がプロトロンビン切断を促進する可能性があることを示している。
図8A〜8Cは、補助成分の存在下および非存在下でブラウンスネーク毒プロテアーゼによるクエン酸加血漿の凝血を示す（データ点は、1試料あたり2回測定の平均値である）。図8A：ブラウンスネーク毒プロテアーゼの単独、図8B：10 mM CaCl2の存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ；および図8C：10 mM CaCl2およびリン脂質（プレートリン）の存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ。
Ca2+はまた、ブラウンスネーク毒プロテアーゼによって産生されたトロンビンによるフィブリノーゲンの活性化を増強して（MankadおよびCodispoti、2001、Am J. Surg. 182：21S）、したがって凝血形成に影響を及ぼすCa2+の添加は、プロトロンビン活性化に対して二次的となる可能性がある。PLはまた、ブラウンスネーク毒プロテアーゼによるプロトロンビン切断を促進するように機能して、それによって表14に示されるように凝血形成に必要なブラウンスネーク毒プロテアーゼの量はさらに10倍減少するであろう。
プロトロンビン活性化タンパク質によるS-2222色素産生基質の切断に及ぼすCa2+の影響
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体の第Va因子様切断特異性を決定するために、第Xa因子特異的色素産生基質S-2222を用いる色素産生アッセイを行った。S-2222は、第Xa因子のために開発された合成色素産生基質である（Aurellら、1977、Thronbin Res. 11：595）。S-2222の加水分解は、吸光度405 nmでの増加によって検出可能であるp-ニトロアニリンを放出する。ブラウンスネーク毒プロテアーゼの量に対する酵素活性のプロットは、図9A〜9Dに示されるように、本質的に直線的であった。結果は、S-2222加水分解速度が、Ca2+またはCa2+およびPLの存在によって影響を受けず、したがって、触媒位置はCa2+およびPLによって影響を受けないことを示している。0.002 U/μgプロテアーゼの勾配から、精製調製物の特異的活性が2 U/mgであった。
図9A〜9Dは、付属成分の存在下および非存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼによるS-2222の加水分解を示す（データ点は、1試料あたり2回の測定の平均値である）。図9A：ブラウンスネーク毒プロテアーゼ単独、図9B：10 mM CaCl2の存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ；図9C：10 mM CaCl2およびPLの存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ；ならびに図9D：それぞれの図9A〜9Cに示されるそれぞれのプロットの勾配とR2値。R2値は、直線に関する相関係数である。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼは、表11に示すように、Ca2+を添加してもしなくてもS-2222を加水分解するが、Ca2+の存在下と比較するとCa2+の非存在下での加水分解の初速度はわずかに低い。
対照的に、テクスタリンによる合成第Xa因子基質の加水分解は、ラフスケールヘビ毒からの第Xa因子様セリンプロテアーゼであるトロカリンによる場合と同様に、Ca2+およびPL（Stockerら、1994、Toxicon 32：1227）の存在によって増強された（Josephら、1999、Blood 94：621）。
プロトロンビンの単離ブラウンスネーク毒プロテアーゼの活性化
理論に拘束されることなく、凝血は2段階反応によって起こると考えられている：（1）ブラウンスネーク毒プロテアーゼによるプロトロンビンのトロンビンへの変換の後に（2）フィブリノーゲンのフィブリンへの切断と、トロンビンによる第XIII因子の活性化。
プロトロンビンのブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼ活性化を示す図10を参照すると、反応10分以内にブラウンスネーク毒プロテアーゼは、クエン酸加血漿の凝固時間を65秒から基準値の12秒に減少させるために十分にプロトロンビンをトロンビンに変換するように作用する。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼによるプロトロンビンの活性化
下記の実験の結果は、ブラウンスネーク毒プロテアーゼがCa2+、PLまたは第Va因子のような補助タンパク質の非存在下でプロトロンビンをトロンビンに変換することができることを示している。
S-2222アッセイの結果は、ブラウンスネーク毒プロテアーゼが、プロトロンビンにおける第Xa因子と同じ結合を加水分解する可能性があることを示している。ブラウンスネーク毒プロテアーゼのプロトロンビンに及ぼす影響は、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ5 μgに反応させたヒトプロトロンビン（0.05 Mトリス塩酸緩衝液2 ml中に0.5 mg）を用いて決定した（酵素：基質、1：100）。反応産物を、図11Aに示すように非還元SDS PAGEによって分析した。さらに、図11Bに示すように、トロンビン形成速度をS-2238加水分解によってモニターした。S-2238は、トロンビンの酵素活性を決定するために一般的に用いられている（参照として本明細書に組み入れられる、KornalikおよびBlomback、1975、Nature 227：680）。
図11Aは、ブラウンスネーク毒プロテアーゼによるプロトロンビン切断の時間経過のSDS PAGEを示す。〜40 kDa（レーン5）のタンパク質のバンドは、トロンビン（分子量36.7 kDa）が主要な最終産物であることを示している。このタンパク質のバンドは、時間と共にその強度が増加し、プロトロンビン（PT）がブラウンスネーク毒プロテアーゼによってトロンビン（T）に変換されていることを示している。プロトロンビン（T）は、48時間の時点までに実質的に消失する（レーン5）。図11Bは、S-2238に対する最初の反応は非常に低いが、約20倍増加することを示している。SDS PAGEゲルから、S-2238活性は48時間までに最大に達するであろうと予想された。
これらの実験において用いたヒトプロトロンビンは、図11Aのレーン2に示されるバンドによって示されるように、完全に純粋ではなかった。72 kDaでのプロトロンビン（PT）のバンドのみを認めることができた（Mann、1976、Methods Enzymol. 1976、132）。〜55 kDaでのよりかすかなタンパク質のバンドは、図12に示すように、おそらくプロトロンビンのトロンビンによる切断に起因するいくつかのプレトロンビン1（PT1）の存在を示す。プレトロンビン1は、t＝0でのプロトロンビン溶液に関するS-2238アッセイによって確認すると、活性な酵素ではない。
プレトロンビン1のバンドは、時間と共に増加した後減少するように思われる。おそらくトロンビンは、プロトロンビン溶液に存在したが、S-2238アッセイによって検出できなかった。より可能性が高いのは、インキュベーションの際に生成されたトロンビンは、プレトロンビン1の形成に関与している可能性がある。
結果の解釈を補助するために、ブラウンスネーク毒プロテアーゼによるプロトロンビン活性化のメカニズムを提唱し、略図を図12に示す。本発明は、この図に拘束されない。
単離されたブラウンスネーク毒Aプロテアーゼのプロトロンビン活性化とクロスリンクしたフィブリンの形成
上記の結果から、ブラウンスネーク毒プロテアーゼは、プロトロンビンをトロンビンに活性化する。活性化されたトロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに連続的に変換するはずである。これを調べるために、クエン酸加血漿をCa2+の存在下または非存在下でブラウンスネーク毒プロテアーゼと共にインキュベートした。これによって、凝血が形成され、これを洗浄した後、Ca2+を単独でクエン酸加血漿に加えることによって形成された洗浄したフィブリン凝血（Ca2+は単独で凝固カスケードを活性化することから、通常のインビボ凝血の形成を表す）と共に、SDS PAGEによって分離した。図13に示すこの実験の結果は、ブラウンスネーク毒プロテアーゼの作用によって生じたフィブリンが正常なフィブリンと類似の構造を有し、クロスリンクしたフィブリンの形成は、トロンビンのブラウンスネーク毒プロテアーゼによる活性化および得られた第XIII因子活性化に反応して起こることを示している。それぞれの実験のおおよその凝固時間も同様に記録した（表12）。
図13の分子量標準物質（レーン1）、フィブリノーゲン（レーン5）およびCa2+産生フィブリン凝血（レーン4）の双方の鎖の構造を用いて、バンドを同定することができる。レーン2および3における約100 kDaのバンド（それぞれ、Ca2+の非存在下および存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ）は、γ二量体（γ-γ）を示している。γ二量体は、分子量105 kDaを有し、第XIIIa因子によって形成された2つのγ単量体のあいだの共有結合クロスリンクを示す（McKeeら、1970、Proc. Natl. Acad. Sci. 66：738）。
約70および60 kDaのバンドも同様に、これらのレーンにおいて認められ、それぞれ、フィブリンのαモノマー（α）およびβモノマー（β）鎖を示している。αモノマーは、分子量73 kDaであり、βモノマーは、分子量60 kDaである（McKeeら、1970、上記）。分子量が400 kDaより大きいバンド（ゲルの上部）はαポリマー（αp）を示し、これは第XIIIa因子によるαモノマーのリジン-グルタミン酸共有結合クロスリンクに起因する（GaffneyおよびBrasher、1974、Nature 251：53）。α鎖分解産物（α1）も同様にレーン2〜4において〜38 kDaに認めることができる。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼの作用に起因するトロンビンは、通常のαトロンビンと同様にフィブリノーゲンをフィブリンに変換するように思われる。これは、通常のように（クエン酸加血漿にCa2+を添加することによって）産生された凝血のバンド形成パターンを、Ca2+の存在下および非存在下（それぞれ、レーン3および2）でブラウンスネーク毒プロテアーゼによって産生された凝血と比較することによって示される。ブラウンスネーク毒プロテアーゼ単独によって産生された凝血（レーン2）には、Ca2+の存在下（レーン3）と比較すると、より大量の非クロスリンクαモノマーが存在する。このことは、第XIIIa因子が前者の凝血の形成において後者ほど活性ではないことを示唆している。このことは、Ca2+の存在下で活性化された第XIIIa因子がCa2+の非存在下で活性化された同じ酵素より活性が高いという文献と一致する（TurnerおよびMaurer、2002、Biochemistry 41：7947）。第XIIIa因子によるαモノマーのクロスリンクは、γ鎖のクロスリンクより遅いプロセスであり、3つ全ての凝血においてγ鎖が完全にクロスリンクしているように思われる理由を説明する。凝血を4時間より長いあいだ放置すると、αモノマーが完全にクロスリンクされる可能性がある。
Ca2+と共にブラウンスネーク毒プロテアーゼを用いて産生された凝血および通常のインビボ形成（Ca2+単独）を表す凝血において、非常に類似のバンド形成パターンを認めた。しかし、これらの2つの凝血の凝固時間には差を認めた（表12）。ブラウンスネーク毒プロテアーゼとCa2+とによる凝血は、Ca2+単独による凝血より〜30倍速かった。このことは、凝血が、Ca2+の作用よりむしろクエン酸加血漿に及ぼすブラウンスネーク毒プロテアーゼの作用によることを示している。カルシウムを添加すると、ブラウンスネーク毒プロテアーゼによるクエン酸加血漿の凝固時間はわずかに減少した（120秒から60秒）。これは、ブラウンスネーク毒プロテアーゼとCa2+の添加によるクエン酸加血漿の凝血形成アッセイの結果と一致する。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼのP.テクスチリスヘビ毒プロテアーゼ活性部位標識の構造特徴付け
ダンシル-L-グルタミル-グリシル-L-アルギニルクロロメチルケトン（DNS-GGACK）は、第Xa因子を含むセリンプロテアーゼの活性部位ヒスチジンを特異的にアルキル化して、それによってそれらを不活化する抑制剤である（KettnerおよびShaw、1981、Methods Enzymol. 80：826）。SDS PAGEバンドまたは複数のバンドが触媒部位を含むか否かを決定するために、ブラウンスネーク毒プロテアーゼおよび無傷のブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体をそれぞれ、DNS-GGACKと共にインキュベートして、SDS PAGEによって分離した。DNS-GGACKの蛍光特性によって、紫外光を用いて、共有結合した抑制剤を組み入れたブラウンスネーク毒プロテアーゼのバンドを可視化することができる。この実験の結果を図14に示す。
顕著な蛍光バンドをレーン3において認め、これは無傷のブラウンスネーク毒プロテアーゼに対応する（レーン7）。βメルカプトエタノールの存在下では（レーン4）、蛍光抑制剤は、毒液プロテアーゼの重鎖に専ら組み入れられた（レーン8における約37 kDaのバンド）。このことは、ブラウンスネーク毒プロテアーゼの活性部位が軽鎖よりむしろ重鎖に存在することを示している。これらの結果、およびブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体内のブラウンスネーク毒プロテアーゼの位置は、レーン1および2、ならびに7および8において確認される。
哺乳類の第Xa因子の重鎖は、酵素活性部位を含む（Bockら、1989、Arch. Biochem Biophys. 273：375）。DNS-GGACKによって不活化された第Xa因子のペプチド消化物の分析は、重鎖のヒスチジン42位が活性部位の一部を形成することを示した。配列アラインメントにより、トロカリンおよびブラウンスネーク毒プロテアーゼの双方の活性部位ヒスチジン残基は、図15に示すように、第Xa因子の活性部位ヒスチジンと同一の位置であると提唱される。提唱される活性部位のヒスチジンを太字で示す。
ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼのN末端アミノ酸シークエンシングと、第Xa因子およびT.カリナツス第Xa因子様セリンプロテアーゼとの配列相同性
ブラウンスネーク毒プロテアーゼの推定の軽鎖および重鎖のN末端アミノ酸シークエンシングを行った。P.テクスチリス毒液腺cDNAライブラリからのブラウンスネーク毒プロテアーゼのcDNAのクローニングを容易にするために、短い配列も同様に必要であった。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体およびブラウンスネーク毒プロテアーゼは、βメルカプトエタノールの存在下でSDS PAGEによって分離して、PVDFメンブレンに転写した。このメンブレンから、タンパク質のバンドのシークエンシングを行った。
最初に、ブラウンスネーク毒プロテアーゼの重鎖から部分的アミノ酸配列を得た。
Figure 0004701355
（C）は、このサイクルがブランクであり、システインが存在するが確かではないことを意味する。このシステイン残基が存在することは、その後、対応するcDNAのシークエンシング後に確認した。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼの重鎖は、PVDFメンブレンに転写された最初のタンパク質バンドであり、これをシークエンシングした。重鎖断片のN末端は、アミノ酸配列
Figure 0004701355
を含む。相同性検索から、この配列がトロカリンの重鎖のN末端配列と100％同一であることが示された（図16を参照されたい）。この配列を用いて、ブラウンスネーク毒プロテアーゼcDNAを増幅するために連続的に用いられる核酸プライマーを設計した。類似性はまた、図17に示すように、ブラウンスネーク毒プロテアーゼとヒト第Xa因子重鎖のN末端配列のあいだでも認めた。
ブラウンスネーク毒プロテアーゼの軽鎖も同様にアミノ酸シークエンシングした。軽鎖に対応するバンドのN末端配列は、
Figure 0004701355
であった。「X」は、6回目および7回目のシークエンシングサイクルにブランクが存在したことを示している。これは、アミノ酸がシークエンシングの際に分解するシステインであるか、または残基が翻訳後改変を含むことを示した。対応するcDNAのヌクレオチド配列から推定したブラウンスネーク毒プロテアーゼのアミノ酸配列から、「X」アミノ酸残基がいずれもグルタミン酸であることが判明した。アミノ酸配列における「X」は、これらの残基の代わりに用いられた。本発明の軽鎖のシークエンシングしたN末端の相同性を、図18に示されるようにトロカリンと共に並列化した。図19に示すように、部分的ブラウンスネーク毒プロテアーゼの軽鎖配列をマウス第Xa因子軽鎖のN末端配列と並列化することによっても類似性を認めた。図15〜19に示すアラインメントは、ブラウンスネーク毒プロテアーゼが、トロカリンおよび第Xa因子と相同性を共有することを示している。
配列相同性はまた、ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼおよび第Xa因子に関するもう1つの第二の配列についても認めた。相同性は55％より大きい。
トロカリンのアミノ酸配列とブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼから得たN末端配列との比較。
ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼの完全長のcDNAおよびコードされるタンパク質配列を、上記のように得て、双方の配列を図20〜26に示す。
ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼおよびトロカリンの完全なアミノ酸配列の比較を図21に示す。配列同一性の全体的なレベルは81％であったが、N末端プロペプチド配列で始まるブラウンスネーク毒プロテアーゼには多数の独自の特徴が存在し、これはトロカリンには存在しない。プロペプチド切断部位は、図23に示すように、プロペプチドの末端のRとAのあいだであると予測された。これは、第X因子、第IX因子、第VII因子およびその他を含む一連の止血因子ならびにブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼに関連しているその前駆体を示すBLAST検索によって支持される。プロペプチドKRANS------EE-----ERECの末端でのこの配列と、Ca2+の結合における機能にとって重要であるさらなるグルタミン酸残基も、十分に保存されている。実際に、アミノ酸残基200位のまさに遠位の重鎖および軽鎖RIVNGMD[配列番号：45]のあいだの切断部位またはその一部を含むいくつかのブロックの配列が保存されている。
アラインメントにおいて明白なトロカリンとのもう1つの差は、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ（残基182〜209個）にアミノ酸28個が存在することであり、これはトロカリンには存在しない。この配列は、図23に示すように、軽鎖と重鎖のあいだの予想切断部位ということになる。トロカリンの軽鎖は141残基からなり、アミノ酸配列KARNK[配列番号：46]で終わる（Josephら、1999、Blood 94：621）。ブラウンスネーク毒プロテアーゼ軽鎖の予想されるアミノ酸配列は、図23のアミノ酸177位で始まる類似の配列（KTRNK）[配列番号：47]を含む。ブラウンスネーク毒プロテアーゼの軽鎖は、この点で切断されて、それによって重鎖の開始前の最後のアミノ酸28個を除去する可能性がある。ブラウンスネーク毒プロテアーゼの分子量は、上記の点での切断を仮定して43,587 Daであると計算され、それぞれの重鎖および軽鎖は、分子量27,952および15,652 Daを有すると予想される（表13を参照されたい）。
SDS PAGEによって分離されたタンパク質の移動距離も同様に用いて、ブラウンスネーク毒プロテアーゼおよびその成分の鎖の分子量を推定した（データは示していない）。無傷のブラウンスネーク毒プロテアーゼならびにその重鎖および軽鎖のおおよその分子量は、SDS PAGEデータに基づいてそれぞれ、53 kDa、35 kDa、および29 kDaであると決定された（表13を参照されたい）。
cDNAヌクレオチド配列は、タンパク質が切断されたか否か、または翻訳後改変を有するか否かを示さない。この理由から、天然のトロカリンのアミノ酸配列（タンパク質のシークエンシングによって決定）およびブラウンスネーク毒プロテアーゼの翻訳されたcDNAヌクレオチド配列が非常に類似であることから、トロカリンをモデルとして用いた。天然のトロカリンの分子量は46,515 Daであると推定された（Josephら、1999、上記）。トロカリンアミノ酸配列から計算された翻訳後改変のない分子量は、約42,455 Daである。したがって、Glu残基、N-グリコシル化、およびO-グリコシル化を含む翻訳後改変約4,060 Daが存在する。トロカリンとブラウンスネーク毒プロテアーゼは非常に類似であり、したがって、ブラウンスネーク毒プロテアーゼはトロカリンと類似の翻訳後改変を有すると予測される可能性がある。この仮定に基づいて、翻訳後改変および切断された軽鎖を有するブラウンスネーク毒プロテアーゼの分子量は、47,647 Daであり、これは、実験によって決定された53および48 kDaという値と一致する。第Xa因子は分子量46 kDaを有する（Di Scipioら、1977、Biochemistry 67：99）。この計算された質量47,647 Daを、溶液中でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ濃度を決定するために用いた。
ヘビ由来毒液プロテアーゼタンパク質の比較
沿岸性タイパン、内陸性タイパン、ブラウン、タイガー、レッドベリーブラックおよびラフスケールスネークからの毒液腺を生きている損傷した標本から採取して、総RNAをTRI Reagent（著作権）RNA抽出法によって抽出した（シグマ（Sigma）、キャッスルヒル、オーストラリア）。次に、第一鎖cDNAをRNAから合成した。次に、cDNAを、ブラウンスネーク毒プロテアーゼから推定した予備的アミノ酸配列から設計した縮重プライマーを用いて、PCRによって第Xa因子様ヘビ毒プロテアーゼ遺伝子に関してスクリーニングした。第Xa因子様成分の重鎖に着目すると、異なるプライマーの組を用いて、プロテアーゼの異なる領域が増幅されることに注目されたい。PCR産物は全て、1.5％TAEアガロースゲル上で泳動してQIAEX IIゲル抽出キット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いて抽出し、pGEM-Tベクターシステム（プロメガ、アナンデール、オーストラリア）にクローニングして、その後ABIプリズムビッグダイターミネーターサイクルシークエンスレディー反応キット（ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit）（パーキン-エルマー、ボストン、アメリカ）を用いてシークエンシングした。次に、配列アラインメントを5つ全ての種から単離したプロテアーゼのあいだで行った。図21は、本発明のブラウン、沿岸性タイパン、内陸性タイパン、レッドベリーブラックおよびラフスケールスネークのプロテアーゼとトロカリンとのアミノ酸アラインメントを示す。図22は、本発明のこれらのプロテアーゼとヒト第Xa因子とのアミノ酸アラインメントを示す。図23は、本発明のブラウン、沿岸性タイパン、内陸性タイパン、レッドベリーブラックおよびラフスケールスネークの全てのプロテアーゼと表記のプロペプチド、軽鎖および重鎖ドメインとのアラインメントを示す。
ブラウン、沿岸性タイパン、内陸性タイパン、レッドベリーブラックおよびラフスケールスネークのプロテアーゼタンパク質をコードする核酸のクローニングおよびシークエンシング
ヘビ毒プロテアーゼタンパク質をコードする代表的な完全長の核酸を、タイパン、タイガー、ラフスケール、およびレッドベリーブラックスネークからクローニングしてシークエンシングした。上記のヘビ由来核酸と一般的なブラウンスネークからのヘビ毒プロテアーゼのヌクレオチド配列のアラインメントにより、興味深い多くの点が判明した。これには、レッドベリーブラックスネークではアミノ酸1個の変化があったとはいえ、アミノ酸40個のプロペプチドアミノ酸配列（図23に示される残基1〜40個）におけるほぼ100％の相同性が含まれる。この高い程度の保存はまた、プロペプチドと軽鎖、および軽鎖と重鎖のあいだの切断部位領域においても認められる（図23を参照されたい）。全体として、ヘビ5種類のあいだに72％の相同性を認める。タイパンからのプロテアーゼは、双方がC群のプロトロンビン活性化剤であると予測されるように、一般的なブラウンスネークからのプロテアーゼと最も近縁で、92％相同である。同様に、D群プロトロンビン活性化剤のあいだにも高い程度の相同性を認め、本土タイガーとラフスケールスネークでは95％相同性を示し、レッドベリーブラックスネークプロテアーゼは、5つの中で最も遠縁であった。興味深い最終的な1つのポイントは、重鎖における低い相同性の領域であり、ここではタイガー、レッドベリーブラックおよびラフスケールスネークでは欠失が認められ、タイガーおよびラフスケールスネークでは末端からアミノ酸11個でプロテアーゼが未熟に終了している。
トロカリンおよびヒト第Xa因子の双方と他の全ての既知のタンパク質とは異なるヘビ毒プロテアーゼの保存された新規領域が存在する。これらの領域には、以下が含まれ、これも同様にコンセンサス配列として図21〜23に示される。
Figure 0004701355
X1、X2およびX3は、如何なるアミノ酸であってもよいが、好ましくはX1はVまたはI、X2はDまたはN、およびX3はRまたはIのいずれかである。
Figure 0004701355
および
Figure 0004701355
Xは如何なるアミノ酸であってもよい；
Figure 0004701355
Xは如何なるアミノ酸であってもよい。
配列番号：23、24、および25は、図23に示されるアミノ酸1〜40位を含む予想プロペプチドに対応し、したがって1つの態様において、タンパク質分解によって消化された成熟タンパク質の一部を形成しない可能性があると認識されるであろう。
当業者は、図21〜23に提供したアラインメントデータに基づいて、本発明のプロトロンビン活性化タンパク質の他の新規保存領域を同定することができるであろう。
同様に、本発明のプロトロンビン活性化タンパク質をコードする新規保存核酸は、図25、および26に提供されるアラインメントデータから決定してもよい。そのような新規核酸は、例えば、本発明の核酸を増幅、シークエンシング、および/または同定するための特異的核酸プライマーおよび/またはプローブを設計するために有用となる可能性がある。
フィブリン膠
ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼを添加したクエン酸加血漿は、10 mM Ca2+の存在下および非存在下の双方において非常に迅速に凝血を形成した。2つの凝血の肉眼的構造は、2つの調製物に関して異なるように思われる。
マウス尾静脈出血モデル
精製ブラウンスネーク毒プロテアーゼが抗出血剤として機能する有効性を、マウスにおいて尾静脈出血モデルを用いて試験した。これらの実験の結果を表14および15ならびに図27、および28に示す。
マウス尾静脈出血研究は、本質的に、Masciら（2000）によって記述されたものに軽微な改変を加えて行った。結果を図27および28、ならびに表14および15に示す。P.テクスチリスプロテアーゼ（250 μl；0.02 Mトリス塩酸、pH 7.4、10 mM CaCl2中の65 μg/ml P.テクスチリスプロテアーゼ）を、切断された尾の開いた損傷部に3分間局所適用した。予め重量を測定したエッペンドルフチューブを用いて血液の損失量を測定した。正確性を得るために、血液の損失量を容積よりむしろ重量によって測定した。プロテアーゼによって局所処置したマウスは全て、図27に示すように損傷部位で大きい凝血を示したことに注目されたい。マウスは、頚部断頭によって安楽死させた。
表15および図28のデータは、切断されたマウス尾の開いた損傷部を、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ65 μgの存在下または非存在下で0.9％塩化ナトリウム（生理食塩液対照）250 μlに3分間浸した。血液の損失量は重量によって測定した。表15および図28に示すように、共因子は血液を凝固させるために必要ではない。
表14および15ならびに図28に示すように、ブラウンスネーク毒プロテアーゼは、技術的誤差に関して補正すると、対照動物（0.542±0.160）と比較してマウスにおける血液の損失量を有意に減少した（0.169 g±0.086）（マンホイトニーU検定、p＝0.021）。
実施例
種間比較のためのマイクロアレイチップを確立するため、および新薬発見のために用いるためのP.テクスチリスの毒液腺からのcDNAライブラリの作製
標的ヘビの毒液腺から抽出したメッセンジャーRNAは、cDNAとして増幅され、大きさが600 bpより大きい断片を、SMART cDNAライブラリ合成キット（クロンテック、パロアルト、アメリカ）を用いてλTriplEx2ベクターにクローニングした。そのようなcDNAライブラリを、タイパンおよびブラウンスネークの双方から作製して、それぞれのライブラリからの転写物約30個について予備的な配列分析を行った。このプロセスは、インサートの存在および大きさを検出するためにPCR増幅の後にλTriplEx2のpTripEx2プラスミドへの変換を行い、その後シークエンシングすることを含んだ。
その増加したインサートの大きさの平均値および変動により、マイクロアレイチップの確立のためにタイパンcDNAライブラリを選択することを決定した。その後、cDNAクローン4800個を、大規模PCR増幅および精製のために無作為に単離した後、これをクイーンズランド医学研究所において利用できるGMS 417アレイスポッターを用いて、コーティングしたスライドガラス上に1試料あたり2個ずつスポットした。上記のヘビの毒液腺からのRNAを、チップとのハイブリダイゼーションを待っている改変EberwineアンチセンスRNA増幅プロトコール（RNA濃度の70倍増加までを生じる）を用いて直線的に増幅した。
考察
本発明のヘビ毒プロテアーゼは、独自の構造および機能的特性を有する。それらはまた、第Xa因子およびO.スクテラツス-プロトロンビン活性化剤と何らかの類似性を有する。本発明のヘビ毒プロテアーゼは、Ca2+の非存在下でもクエン酸加血漿を凝固させた。インビボでは、第Xa因子も同様に、通常の凝血のためにCa2+の存在を必要とする。したがって、本発明のヘビ毒プロテアーゼが、リン脂質、第Va因子またはCa2+のような要因の非存在下で血液を凝固させることができることは新しい意外な知見である。
第Xa因子特異的色素産生基質であるS-2222は、本発明のヘビ毒プロテアーゼによって切断される。このことは、ヘビ毒プロテアーゼが第Xa因子に対して非常に類似の切断特異性を有することを示している。さらに、Ca2+のみが2 μg/mlより低い濃度のブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体のS-2222加水分解速度を増強することは興味深い。同様に、NaSCNをブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体に加えても、必ずしも全てのS-2222活性が維持されるわけではない。これらの知見は、O.スクテラツス-プロトロンビン活性化剤に関連したSpeijerら（1986）による研究とは異なる。
セファクリルS-300を用いる単純なゲル濾過法は、精製のために必要なクロマトグラフィーの数から明らかなように、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体からセリンプロテアーゼ成分を単離するには比較的不良であることが判明した。十分な精製にもかかわらず、β-Meの非存在下でHPLCおよびSDS PAGEによって決定すると、均一な調製物が最終的に得られた。
SDS PAGEの結果は、ブラウンスネーク毒プロテアーゼが55〜56 kDaのあいだの未変性分子量を有することを示唆している。ブラウンスネーク毒プロテアーゼは、60 kDaのO.スクテラツス第Xa因子様プロテアーゼより54 kDaの哺乳類第Xa因子に対してより大きい大きさの類似性を有する（Speijerら、1987、J. Biol. Chem. 261：13258）。さらに、ブラウンスネーク毒プロテアーゼの鎖の構造は、O.スクテラツス第Xa因子様プロテアーゼより第Xa因子に大きい類似性を示す。
SDS PAGE（＋β-Me）により、ブラウンスネーク毒プロテアーゼが、おそらくジスルフィド架橋によって互いに結合した2つのペプチド鎖を含むことが示された。このことは、ブラウンスネーク毒プロテアーゼのシークエンシングから2つのN末端アミノ酸が発見されたことによってさらに支持される。結果から、重鎖および軽鎖の大きさはそれぞれ、約31および18 kDaであるが、これは全プロテアーゼの分子量55〜56 kDaに対応しない。本発明のブラウンスネーク毒プロテアーゼとは対照的に、O.スクテラツス第Xa因子様セリンプロテアーゼは、それぞれ30 kDaからなる2つの鎖からなることが判明した（Speijerら、1986、上記）。
T.カリナツス第Xa因子様セリンプロテアーゼと本発明のブラウンスネーク毒プロテアーゼの最初のアミノ酸11個に100％の配列相同性が存在することは興味深い知見であった。このことは、アミノ酸配列の保存の程度（ブラウンスネーク毒プロテアーゼの完全なアミノ酸配列について判明）が、これらの2つのオーストラリアのヘビ毒プロトロンビン活性化剤の進化を通して発生したことを示している。配列相同性は第Xa因子とブラウンスネーク毒プロテアーゼとのあいだにも存在し、ヘビと哺乳類の進化において何らかのアミノ酸が保存されたことを示している。しかし、図21および22に示すように、本発明のヘビ毒プロテアーゼは、第Xa因子およびトロカリン、ならびに出願人が承知している他の全てのタンパク質とは異なる新規保存領域を有する。
第Xa因子は全て、セリンプロテアーゼの典型的な特徴を有し、2つの類似の構造のドメイン、ドメイン間ジスルフィド結合、およびその他（Stubbs＆Bode、1994、上記）を有する。しかし、セリンプロテアーゼの差は、その特異的機能を付与する。例えば第Xa因子活性部位の溝は、トロンビンの溝よりかなりより大きく開口しており（Stubbs＆Bode、1994、上記）、これはArg274-Thr275およびArg323-Ile324に関する第Xa因子切断特異性に関与する可能性がある。
本発明のヘビ毒プロテアーゼの新規治療的用途は、局所フィブリン膠を作製するための試薬としてである。本発明のヘビ毒プロテアーゼは、現行の方法よりフィブリン膠を調製するためのより有効な治療法を提供する可能性がある。本発明のヘビ毒プロテアーゼによって調製した局所フィブリン膠は、外傷時の出血を大きく減少させる可能性があり、したがって多くのヒトおよびヒト以外の動物の生命を救う可能性がある。例えば、救急救命室は、事故での出血を防止するために、本発明のヘビ毒プロテアーゼを含むフィブリン膠を含浸した絆創膏等を備えてもよい。
略語
A405 − 405 nmでの吸光度
Arg − アルギニン
AUFS − 280 nmでの吸光度測定レンジ
C − システイン
Ca2+ − カルシウムイオン
CaCl2 − 塩化カルシウム
cm − センチメートル
D − アスパラギン酸
E − グルタミン酸
F − フェニルアラニン
G − グリシン
HPLC − 高速液体クロマトグラフィー
hr − 時間
I − イソロイシン
Ile − イソロイシン
K − リジン
kDa − キロダルトン
L − ロイシン
M − メチオニン
M − モル濃度
mg − ミリグラム
min − 分
ml − ミリリットル
mM − ミリモル濃度
N − アスパラギン
NaSCN − チオシアネートナトリウム
nm − ナノメートル
O.scullatus − オクシュラヌス・スクテラツス
P.textilis − シュードナジャ・テクスチリス
PAGE − ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PEG − ポリエチレングリコール
Q − グルタミン
S − セリン
SDS − ドデシル硫酸ナトリウム
sec − 秒
T − トレオニン
T.carinatus − トロピデキス・カリナツス
TFA − トリフルオロ酢酸
Thr − トレオニン
TOF − 時間飛行型
V − バリン
Y − チロシン
β-Me − βメルカプトエタノール
μl − マイクロリットル
μmol − マイクロモル
Figure 0004701355
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本明細書を通して、目的は本発明の好ましい態様を記述してきたが、本発明は如何なる1つの態様または特定の特徴のコレクションにも限定されない。したがって、本開示に照らして、例示される特定の態様に様々な改変および変更を行うことができ、それらも本発明の範囲に含まれることは当業者によって認識されると思われる。
0.05 Mトリス-塩酸、pH 7.4におけるConA-セファロース4Bカラム（2.5×16 cm）でのP.テクスチリスヘビ毒（10 ml；233 mg）のクロマトグラフィー後の溶出プロフィール。A．クロマトグラフィーパターンの軌跡。溶出緩衝液（0.02 Mメチルα-Dマンノピラノシドの0.05 Mトリス塩酸溶液）を矢印Bの時点でカラムに適用した。S-2222加水分解活性を有する分画を、プールして濃縮した（Aのラインで示す）。 ConA-セファロース4Bクロマトグラフィーからプールして濃縮したピークのSDS PAGE。レーン1、分子量マーカー（大きさをkDaで示す）。レーン2、βメルカプトエタノールの非存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体。レーン3、βメルカプトエタノールの存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体。 0.8 M NaSCNによって処置したP.テクスチリスに由来するヘビ毒プロテアーゼ複合体によるクエン酸加血漿凝固時間およびS-2222の加水分解に及ぼす影響。 ブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼのHPLCデータ。 SDS-PAGE±β-Me。レーン1−BIO-RADマーカー10 μl。レーン2−P.テクスチリス毒液20 μl、レーン3−天然のPt-PA 20 μl、レーン4−セファクリルS-300（1）プール分画30〜43 20 μl、レーン5−セファクリルS-300（2）プール分画25〜29 20 μl、レーン6、7および8−セファクリルS-300（3）プール分画25〜29 10 μl、レーン9−セファクリルS-300（3）プール分画25〜29＋β-Me 20 μl、ならびにレーン10−天然の血清ヘビ毒プロテアーゼ複合体＋β-Me 20 μl。 β-Meの存在下または非存在下でのブラウンスネーク毒セリンプロテアーゼのSDS-PAGE。レーン1−BIO-RADマーカー。レーン2−全P.テクスチリス毒液、レーン3−セファクリルS-300（3）プール分画30〜43、レーン4−セファクリルS-300（#3）、レーン5−S-300（#3）＋β-Me、レーン6−S300（#3）、レーン7−セファクリルS-300（#3）＋β-Me、レーン8−セファクリルS-300（3）プール分画30〜43＋β-Me、レーン9−天然のブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体＋β-Me、およびレーン10−BIO-RADマーカー。#は、上記のブラウンスネーク毒液プロテアーゼ複合体のセファクリルS-300クロマトグラフィーからのプールして濃縮した活性なピークを表す。試料は全て10 μlの少量からなった。 0.8 M NaSCNを含む0.05 Mトリス塩酸、pH 7.4におけるブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体（18 ml、50.4 mg）の、スーパーデックス200カラム（2.5×90 cm）上でのクロマトグラフィー段階1後の溶出プロフィール。S-2222活性を有する分画をプールして濃縮し、これをAの線で示す。 図7Aの条件によるクロマトグラフィー段階2。 スーパーデックス200によるブラウンスネーク毒プロテアーゼの精製後の試料のSDS-PAGE。レーン1＆2、βメルカプトエタノールの存在下（2）および非存在下（1）でのクロマトグラフィー段階1からのプールした濃縮液。レーン3＆4、βメルカプトエタノールの存在下（5）および非存在下（4）でのクロマトグラフィー段階2からのプールした濃縮液。レーン5、分子量マーカー（大きさをkDaで示す）。レーン4における矢印A、BおよびCは、不純物を示す。 補助成分の非存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ（Pt-PAプロテアーゼと呼ぶ）によるクエン酸加血漿の凝固（データ点は、1試料あたり2回ずつの測定の平均値である）。 10 mM CaCl2の存在下でのブラウンスネーク毒（「Pt-PA」）プロテアーゼによるクエン酸加血漿の凝固。 10 mM CaCl2およびリン脂質の存在下でのブラウンスネーク毒（「Pt-PA」）プロテアーゼによるクエン酸加血漿の凝固。 補助成分の非存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼ（Pt-PAプロテアーゼと呼ぶ）によるS-2222の加水分解（データ点は、1試料あたり2回ずつの測定の平均値である）。 10 mM CaCl2の存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼによるS-2222の加水分解（データ点は、1試料あたり2回ずつの測定の平均値である）。 10 mM CaCl2の存在下でのブラウンスネーク毒プロテアーゼによるS-2222の加水分解（データ点は、1試料あたり2回ずつの測定の平均値である）。 図9A、9B、および9Cにおける各プロットの勾配およびR2値。R2値は、直線の相関係数である。 ブラウンスネーク毒プロテアーゼのプロトロンビン活性化。プロトロンビン（1.3 mg/ml調製物100 μl）を、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ（1.3 mg/ml調製物20 μl）によって全量500 μlにおいてX軸に示す時間、トロンビンに変換した。次に、各反応物の少量をクエン酸加血漿凝固アッセイに加えて、凝固時間を測定した（Y軸）。 ブラウンスネーク毒プロテアーゼと共にインキュベーション後のプロトロンビンの減少を伴わないSDS-PAGE。ブラウンスネーク毒プロテアーゼを0分にプロトロンビンに加えた（時間、t＝0）；レーン1、分子量マーカー（大きさをkDaで示す）；レーン2、t＝0；レーン3、t＝6分；レーン4、t＝24時間；レーン5、t＝48時間。PT、プロトロンビン；PT1、プレトロンビン1；T、トロンビン；F1,2、断片1,2；PT2、プレトロンビン2；F1、断片1。 ブラウンスネーク毒プロテアーゼ生成トロンビンによるS-2238の加水分解。 ブラウンスネーク毒プロテアーゼによるプロトロンビン活性化に関する提案するモデル。矢印は、トロンビンとブラウンスネーク毒プロテアーゼによって切断される結合を示す。 βメルカプトエタノールの存在下でのフィブリン凝血のSDS-PAGE。レーン1、分子量マーカー（大きさをkDaで示す）。レーン2、クエン酸加血漿に及ぼすブラウンスネーク毒プロテアーゼ22 μg単独の作用によって得られたフィブリンの凝血。レーン3、クエン酸加血漿に及ぼす、40 mM CaCl2の存在下でブラウンスネーク毒プロテアーゼ22 μgの作用によって得られたフィブリンの凝血。レーン4、40 mM CaCl2によって生成されたフィブリンの凝血。レーン5、ヒトフィブリノーゲン。ゲルの右側のギリシャ文字は、Aα（αモノマーおよびフィブリノペプチドA）、Bβ（βモノマーとフィブリノペプチドB）、ならびにγ鎖を含むヒトフィブリノーゲンの鎖を示す。 プロテアーゼ活性部位のマッピング。DNS-GGACK処置を行ったおよび行わない精製ブラウンスネーク毒プロテアーゼのSDS-PAGE。レーン1および2、ブラウンスネーク毒プロテアーゼ複合体は、βメルカプトエタノールの存在下（2）および非存在下（1）でDNS-GGACKを抑制した。レーン3および4、ブラウンスネーク毒プロテアーゼは、βメルカプトエタノールの存在下（4）および非存在下（3）でDNS-GGACKを抑制した。レーン5〜8は、DNS-GGACKの非存在下でクーマシーブルーで染色したレーン1〜4の同等物である。レーン9、分子量マーカー（大きさをkDaで示す）。 太字で示す提案される相互作用ヒスチジンを有する推定活性部位を含むブラウンスネーク毒プロテアーゼ、トロカリンおよびヒト第Xa因子のタンパク質断片のアミノ酸配列アラインメント。 予想されるブラウンスネーク毒プロテアーゼ重鎖とトロカリンとの一部のアミノ酸配列アラインメント。予測値（E）は、NCBIデータベースにおいて検索を行った場合に偶然予測されるヒット数を示すパラメータである。E値がゼロに近づくと、配列のマッチはより有意となる。E値は、2つの配列間のマッチに与えられるスコアと共に指数的に減少して、比較される配列の長さにも依存する。期待値1は、データベースにおいて1つのマッチが類似のスコアに偶然予測されることを意味する。スコア＝39.7、期待値＝0.004；同一性＝11/11（100％）、陽性＝11/11（100％）。 予測されるブラウンスネーク毒プロテアーゼ重鎖とヒト第Xa因子との一部のアミノ酸配列アラインメント。 予測されるブラウンスネーク毒プロテアーゼ軽鎖とトロカリンの一部のアミノ酸配列アラインメント。 予測されるブラウンスネーク毒プロテアーゼ軽鎖とマウス第X因子の一部の配列アラインメント。スコア＝24.8、期待値＝116；同一性＝9/12（75％）、陽性＝9/12（76％）。 P.テクスチリス（一般的なブラウンスネーク）のヘビ毒プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列[配列番号：1]。 P.テクスチリス（一般的なブラウンスネーク）のヘビ毒プロテアーゼのアミノ酸配列[配列番号：2]。 以下のオーストラリアのヘビの毒液腺から単離したヘビ毒プロテアーゼ間のアミノ酸アラインメント：P.テクスチリス（ブラウン）[配列番号：2]、O.スクテラツス（沿岸性タイパン）[配列番号：5]、P.ポルフィリアクス（レッドベリーブラック）[配列番号：11]、N.スクタツス（本土タイガー）[配列番号：14]、T.カリナツス（ラフスケール）[配列番号：17]、およびトロカリン[配列番号：31]。 単離したヘビ毒プロテアーゼとヒト第Xa因子[配列番号：27]とのアミノ酸配列アラインメント。以下のヘビに由来するヘビ毒プロテアーゼのアミノ酸配列を示す：ブラウン[配列番号：2]、沿岸性タイパン[配列番号：5]、レッドベリー[配列番号：11]、ラフスケール「ラフィー」[配列番号：14]および本土タイガー[配列番号：17]。 オーストラリアのヘビ、P.テクスチリス（ブラウン）[配列番号：2]、O.スクテラツス（沿岸性タイパン）[配列番号：5]、O.ミクロエピドツス（内陸性タイパン）[配列番号：8]、P.ポルフィリアクス（レッドベリーブラック）[配列番号：11]、N.スクタツス（本土タイガー）[配列番号：14]、およびT.カリナツス（ラフスケール）[配列番号：17]の毒液腺から単離したヘビ毒プロテアーゼ間のアミノ酸配列アラインメント。 オーストラリアのヘビ、P.テクスチリス（ブラウン）[配列番号：2]、O.スクテラツス（沿岸性タイパン）[配列番号：5]、O.ミクロエピドツス（内陸性タイパン）[配列番号：8]、P.ポルフィリアクス（レッドベリーブラック）[配列番号：11]、N.スクタツス（本土タイガー）[配列番号：14]、T.カリナツス（ラフスケール）[配列番号：17]の毒液腺から単離したヘビ毒プロテアーゼ、およびコンセンサス配列[配列番号：]間のアミノ酸配列アラインメント。 以下のオーストラリアのヘビ、P.テクスチリス（ブラウン）[配列番号：1]、O.スクテラツス（沿岸性タイパン）[配列番号：4]、P.ポルフィリアクス（レッドベリーブラック）[配列番号：10]、N.スクタツス（本土タイガー）[配列番号：13]、T.カリナツス（ラフスケール）[配列番号：16]に由来するヘビ毒プロテアーゼ、およびヒト第Xa因子[配列番号：26]をコードする核酸のヌクレオチド配列アラインメント。 以下のオーストラリアのヘビ、P.テクスチリス（ブラウン）[配列番号：1]、O.スクテラツス（沿岸性タイパン）[配列番号：4]、O.ミクロレピドツス（内陸性タイパン）[配列番号：7]、P.ポルフィリアクス（レッドベリーブラック）[配列番号：10]、N.スクタツス（本土タイガー）[配列番号：13]、およびT.カリナツス（ラフスケール）[配列番号：16]に由来するヘビ毒プロテアーゼをコードする核酸のヌクレオチド配列アラインメント。 ブラウンスネーク毒プロテアーゼによる処置を行ったおよび行わないマウス尾を示す（プロテアーゼ処置によって形成された大きい凝血に注意されたい）。 マウス出血結果のボックスプロット。各ボックスは、値の50％を含む範囲を表す。上下のバーは、ボックスから最高値と最低値まで伸長した線である。ボックスを横切る線は中央値を示す。

Claims (14)

  1. 対象における凝血形成を増加させるための、および／または血液もしくは体液の損失を減少させるための薬剤の製造における、配列番号：2の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ活性にカルシウム、リン脂質、または第Va因子を必要としない、単離されたヘビ毒プロテアーゼ（SVP）の使用。
  2. 単離されたSVPが、配列番号：１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１記載の使用。
  3. SVPが、請求項１に規定されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を用いて組換えによって産生されたものであって、該核酸分子がベクター核酸配列をさらに含む、請求項１または２記載の使用。
  4. 核酸分子が、異種ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項３記載の使用。
  5. 核酸分子がベクターの形をとる、請求項３または４記載の使用。
  6. 核酸分子が宿主細胞に含まれる、請求項３〜５のいずれか一項記載の使用。
  7. SVPが、核酸分子が発現される条件で請求項６に規定される宿主細胞を培養する段階を含む方法によって産生される、請求項１〜６のいずれか一項記載の使用。
  8. 薬剤がポリオールを含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用。
  9. 薬剤が、さらに薬学的に許容される担体を含む、請求項１〜８のいずれか一項記載の使用。
  10. 薬剤が対象の体表または体内の部位からの出血を抑制する、請求項１〜９のいずれか一項記載の使用。
  11. 部位が内科的もしくは外科的介入部位、または望まれない外傷部位である、請求項１０記載の使用。
  12. 薬剤が対象以外のヒトによる投与のためのものである、請求項１〜１１のいずれか一項記載の使用。
  13. 出血を抑制するために十分な量の薬剤が分配できるように形成された装置において、装置を対象に接触させた場合に薬剤が提供される、請求項１〜１２のいずれか一項記載の使用。
  14. 装置が任意の絆創膏、湿布、創傷包帯、縫合糸、または縫合材料である、請求項１３記載の使用。
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