ES2276396T3 - Proteinas anticoagulantes e inhibidores de la serina proteasa extraidos de nematodos. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN PROTEINAS CON ACTIVIDAD COMO ANTICOAGULANTES Y/O INHIBIDORES DE SERIN PROTEASA, Y QUE TIENEN AL MENOS UN DOMINIO NAP. ALGUNAS DE DICHAS PROTEINAS, TIENEN ACTIVIDAD INHIBIDORA DEL FACTOR X{SUB,A}, Y OTROS INHIBEN EL FACTOR VIIA/TF. DICHAS PROTEINAS, SE PUEDEN AISLAR A PARTIR DE FUENTES NATURALES, COMO NEMATODOS, SINTETIZARSE QUIMICAMENTE, O FABRICARSE MEDIANTE METODOS RECOMBINANTES, UTILIZANDO VARIOS SISTEMAS DE EXPRESION DEL ADN.

Description

Proteínas anticoagulantes e inhibidores de la serina proteasa extraídos de nemátodos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas específicas así como a versiones recombinantes de estas proteínas que son inhibidores de serina proteasa, que comprenden potentes anticoagulantes en el plasma humano. Estas proteínas comprenden determinadas proteínas extraídas de los nemátodos. En otro aspecto, la presente invención se refiere a las composiciones que comprenden estas proteínas, que son útiles como inhibidores potentes y específicos de enzimas de la coagulación sanguínea in vivo e in vitro, y a los métodos para su utilización como agentes de diagnóstico in vitro, o como agentes terapéuticos in vivo, para prevenir la coagulación de la sangre. En un aspecto adicional, la invención se refiere a secuencias de ácido nucleico, que comprenden ARNm y ADN que codifican las proteínas y a su utilización en vectores para transferir o transformar células hospedadoras y como sondas para aislar determinados genes relacionados en otras especies y organismos.

Antecedentes e introducción a la invención

La hemostasis normal es el resultado de un delicado equilibrio entre los procesos de formación del coágulo (coagulación sanguínea) y de disolución del coágulo (fibrinólisis). Las interacciones complejas entre las células sanguíneas, las proteínas específicas del plasma y la superficie vascular, mantienen la fluidez de la sangre a menos que se produzcan lesiones. El daño a la barrera endotelial que recubre la pared vascular expone el tejido subyacente a estos componentes de la sangre. Éste a su vez desencadena una serie de reacciones bioquímicas que alteran el equilibrio hemostático a favor de la coagulación sanguínea que puede producir la formación deseada de un trombo hemostático que detiene la pérdida de sangre o la formación indeseable de un trombo intravascular oclusivo que produce la pérdida reducida o completa de la circulación sanguínea en el órgano afectado.

La respuesta de la coagulación sanguínea es la culminación de una serie de reacciones ampliadas en las que varios zimógenos específicos de serina proteasas en el plasma son activados por la proteólisis limitada. Esta serie de reacciones produce la formación de una matriz insoluble compuesta de fibrina y componentes celulares que se requieren para la estabilización del coágulo o trombo hemostático primario. La iniciación y propagación de las reacciones de activación proteolíticas se produce mediante una serie de reacciones ampliadas que están localizadas en las superficies membranosas en la zona de la lesión vascular (Mann, K. G., Nesheim, M. E., Church, W. R., Haley, P. y Krishnaswamy, S. (1990) Blood 76: 1-16 y Lawson, J. H., Kalafatis, M., Stram, S., y Mann, K. G. (1994) J. Biol. Chem. 269: 23357-23366).

La iniciación de la respuesta de la coagulación sanguínea a la lesión vascular sigue la formación de un complejo catalítico compuesto del factor VIIa de la serina proteasa y del cofactor no enzimático, factor tisular (TF) (Rappaport, S. I. y Rao, L. V. M. (1992) Arteriosclerosis and Trombosis 12: 1112-1121). Esta respuesta parece estar regulada exclusivamente por la exposición de TF subendotelial a vestigios de concentraciones circulantes del factor VIIa y a su factor VII zimógeno, seguido de una destrucción focal en la integridad vascular. La autoactivación produce un aumento en el número de complejos factor VIIa/TF que son responsables de la formación del factor Xa de la serina proteasa. Se cree que además del complejo factor VIIa/TF, la pequeña cantidad del factor Xa que se forma favorece la respuesta a la coagulación mediante la modificación proteolítica del factor IX al factor IX_{alfa} que a su vez es convertido en el factor IXa_{beta} activo de la serina proteasa por el complejo factor VIIa/TF (Mann, K. G., Krishnaswamy, S. y Lawson, J. H. (1992) Sem. Hematology 29: 213-226). Es el factor IXa_{beta} en el complejo con factor VIIIa activado, el que parece ser responsable de la producción de cantidades significativas de factor Xa que cataliza posteriormente la penúltima etapa en la cascada de la coagulación sanguínea; la formación de la serina proteasa trombina.

El factor Xa cataliza la formación de trombina después del montaje del complejo de protrombinasa que está compuesto por el factor Xa, el cofactor Va no enzimático y el sustrato protrombina (factor II) montado en la mayoría de los casos, sobre la superficie de plaquetas activadas que están adheridas en la zona de la adhesión (Fuster, V., Badimon, L., Badimon, J. J. y Chesebro, J. H. (1992) New Engl. J. Med. 326: 310-318). En el sistema vascular arterial, la "irrupción" ampliada resultante de la generación de trombina catalizada por la protrombinasa produce una concentración elevada de esta proteasa localmente que es responsable de la formación de fibrina y la recuperación ulterior de plaquetas adicionales así como la estabilización covalente del coágulo mediante la activación del factor XIII del zimógeno de transglutaminasa. Además, la respuesta a la coagulación se continúa propagando mediante la activación con retroalimentación proteolítica mediada por trombina de los cofactores V y VIII no enzimáticos que producen más formación de
protrombinasa y la generación de trombina posterior (Hemker, H. C. y Kessels, H. (1991) Haeomostasis 21: 189-196).

Se ha demostrado que las sustancias que interfieren en el proceso de la coagulación sanguínea (anticoagulantes) son importantes agentes terapéuticos en el tratamiento y prevención de los trastornos trombóticos (Kessler, C. M. (1991) Chest. 99: 97S-112S y Cairns, J. A., Hirsh, J., Lewis, H. D., Resnekov, L., y Theroux, P. (1992) Chest. 102: 456S-481S). Los anticoagulantes clínicos aprobados actualmente han estado relacionados con numerosos efectos desfavorables debido a la naturaleza relativamente no específica de sus efectos sobre la cascada de la coagulación sanguínea (Levine, M. N., Hirsh, J., Landefeld, S., y Raskob, G. (1992) Chest. 102: 352S-363S). Esto ha estimulado la búsqueda de agentes anticoagulantes más eficaces que puedan controlar de manera más eficaz la actividad de la cascada de coagulación interfiriendo selectivamente con las reacciones específicas en este proceso que puede tener un efecto positivo en la reducción de las complicaciones de la terapia anticoagulante (Weitz, J., y Hirsh, J. (1993) J. Lab. Clin. Med. 122: 364-373). En otro aspecto, esta búsqueda se ha centrado en las proteínas normales humanas que sirven como anticoagulantes endógenos para controlar la actividad de la cascada de la coagulación sanguínea. Además, se han investigado varios organismos hematófagos debido a su capacidad para anticoagular con eficacia el alimento sanguíneo durante y después de la alimentación o sus anfitriones lo que sugiere que han desarrollado estrategias anticoagulantes eficaces que pueden ser útiles como agentes terapéuticos.

Una proteína del plasma, el inhibidor de la serie de reacciones del factor tisular (TFPI), contiene tres dominios de Kunitz consecutivos y se ha descrito que inhibe la actividad enzimática del factor Xa directamente y, en función del factor Xa, inhibe la actividad enzimática del complejo factor VIIa-factor tisular. Salvensen, G., y Pizzo, S. V., "Proteinase Inhibitors: \alpha-Macroglobulins, Serpins, y Kunis", Hemostasis and Trombosis, tercera edición, págs. 251-253, J. B. Lippincott Company (Edit. R. W. Colman et al. 1994). Se ha descrito una secuencia de ADNc que codifica TFPI, y la proteína clonada se describió que tiene un peso molecular de 31.950 daltons y que contiene 276 aminoácidos. Broze, G. J. y Girard, T. J., patente US nº 5.106.833, col. 1, (1992). Se han descrito varias proteínas recombinantes derivadas de TFPI. Girad, T. J. y Broze, G. J., patente EP 439.442 (1991); Rasmussen, J. S. y Nordfand, O. J., documento WO 91/02753 (1991); y Broze, G. J. y Girad, T. J., patente US nº 5.106.833, col. 1, (1992).

Se ha publicado que la antiestasina, una proteína que comprende 119 aminoácidos y que se encuentra en la glándula salival de la sanguijuela mejicana Haementeria officinalis, inhibe la actividad enzimática del factor Xa. Tuszynski et al., J. Biol. Chem., 262:9718 (1987); Nutt, et al., J. Biol. Chem., 263:10162 (1988). Se ha publicado que una proteína recombinante de 6.000 daltons que contiene 58 aminoácidos con un grado de homología elevado con los aminoácidos 1 a 58 del terminal amino de la antiestasina inhibe la actividad enzimática del factor Xa. Tung, J. et al., patente EP 454.372 (30 de octubre de 1991); Tung, J. et al., patente U. S. nº 5.189.019 (23 de febrero de 1993).

Se ha publicado que el péptido anticoagulante de la garrapata (TAP), una proteína que comprende 60 aminoácidos y aislada de la garrapata blanda Ornithodoros moubata, inhibe la actividad enzimática del factor Xa pero no la del factor VIIa. Waxman, L. et al., Science, 248:593 (1990). Se ha descrito el TAP preparado por métodos recombinantes. Vlausk, G. P. et al., patente EP 419.099 (1991) y Vlausk, G. P. et al., patente US nº 5.239.058 (1993).

El anquilostoma del perro, Ancylostoma caninum, que puede infectar también al hombre, se ha descrito que contiene una sustancia anticoagulante potente que inhibe la coagulación de la sangre in vitro. Loeb, L. y Smith, A. J., Proc. Pathol. Soc. Philadelphia, 7:173-187 (1904). Se publicó que los extractos de A. caninum prolongan el tiempo de la protrombina y el tiempo parcial de la tromboplastina en el plasma humano siendo el efecto anticoagulante descrito atribuible a la inhibición del factor Xa pero no a la trombina. Spellman, Jr., J. J. y Nossel, H. L., Am. J. Physiol., 220:922-927 (1971). Más recientemente, se describió que los extractos solubles de la proteína de A. caninum prolongan el tiempo de la protrombina y el tiempo parcial de la tromboplastina en el plasma humano in vitro. Se describió que el efecto anticoagulante era atribuible a la inhibición del factor Xa humano pero no a la trombina, Cappelo, M. et al., J. Infect. Diseases, 167:1474-1477 (1993) y a la inhibición del factor Xa y del factor VIIa (documento WO 94/25.000; patente US nº 5.427.937).

Se ha publicado que el anquilostoma humano, Ancylostoma ceylanicum, contiene un anticoagulante. Se ha publicado que los extractos de A. ceylanicum prolongan el tiempo de la protrombina y el tiempo parcial de la tromboplastina en el plasma del perro y del hombre in vitro. Carroll, S. M., et al., Thromb. Haemostas. (Stuttgart), 51:222-227 (1984).

Se ha publicado que los extractos solubles del parásito no hematófago, Ascaris suum, contienen un anticoagulante. Se publicó que estos extractos prolongan la coagulación de la sangre completa, así como el tiempo de coagulación en la prueba de tiempo parcial de la tromboplastina activada por el caolín pero no en la prueba de tiempo de protrombina. Crawford, G. P. M. et al., J. Parasitol, 68:1044-1047 (1982).

Se describió que el inhibidor-1 de quimiotripsina/elastasa y sus isoformas principales, inhibidor-1 de tripsina e inhibidor-4 de quimiotripsina/elastasa aislados de Ascaris suum, eran inhibidores de serina proteasa y que comparten un modelo común de puentes con cinco disulfuros. Bernard, V. D. y Peanasky, R. J., Arch. Biochem. Biophys., 303:367-376 (1993); Huang, K. et al., Structure, 2:679-689 (1994); y Grasberger, B. L. et al., Structure, 2:669-678 (1994). No hubo ninguna indicación de que los inhibidores de serina proteasa descritos presentaran actividad anticoagulante.

Se publica que las secreciones del anquilostoma Necator americanus prolongan el tiempo de coagulación del plasma humano, inhiben la actividad amidolítica de FXa humana utilizando un sustrato fluorógeno, inhiben la liberación de gránulos densos de plaquetas producidos por agonistas múltiples y degradan el fibrinógeno. Pritchard, D. I. y B. Furmidge, Thromb. Haemost. 73: 546 (1995) (documento WO 95/12615).

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a proteínas aisladas que presentan actividad inhibidora de serina proteasa y/o actividad anticoagulante que incluyen por lo menos un dominio de NAP. Los inventores se refieren a estas proteínas como Proteínas Anticoagulantes extraídas de Nemátodos o "NAP". "Dominio de NAP" se refiere a una secuencia de la proteína aislada, o NAP, que se cree que presenta actividad inhibidora, tal como se define con mayor detalle en la presente memoria a continuación. La actividad anticoagulante de estas proteínas puede ser evaluada por sus actividades en el aumento del tiempo de coagulación del plasma humano en los ensayos de tiempo de la protrombina (PT) y de tiempo parcial de la tromboplastina activada (aPTT), así como por su capacidad para inhibir el factor Xa de las enzimas de coagulación de la sangre o el factor VIIa/TF. Se cree que el dominio de NAP es responsable de la actividad anticoagulante observada por estas proteínas. Determinadas de estas proteínas presentan por lo menos un dominio de NAP que es una secuencia de aminoácidos que contiene menos de aproximadamente 120 restos de aminoácido, e incluye 10 restos del aminoácido cisteína.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de preparación y aislamiento de una molécula de ADNc que codifica una proteína que presenta actividad anticoagulante y que presenta un dominio de NAP, y a una molécula de ADNc recombinante preparada por este método. Este método comprende las etapas de: (a) construcción de un banco de ADNc a partir de una especie de nemátodo; (b) ligadura de dicho banco de ADNc en un vector de clonación apropiado; (c) introducción de dicho vector de clonación que contiene dicho banco de ADNc en una célula hospedadora apropiada; (d) puesta en contacto de las moléculas de ADNc de dicha célula hospedadora con una solución que contiene una sonda de hibridación que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG, [SEC. ID. nº 94] en la que R es A o G, Y es T o C, e i es inosina; (e) detección de una molécula de ADNc recombinante que se hibrida con dicha sonda; y (f) aislamiento de dicha molécula de ADNc recombinante.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de preparación de una proteína recombinante codificada por dicho ADNc que tiene actividad anticoagulante y que incluye un dominio de NAP y a proteínas recombinantes preparadas por este método. Este método comprende las etapas de: (a) construcción de un banco de ADNc a partir de una especie de nemátodo; (b) ligadura de dicho banco de ADNc en un vector de clonación apropiado; (c) introducción de dicho vector de clonación que contiene dicho banco de ADNc en una célula hospedadora apropiada; (d) puesta en contacto de las moléculas de ADNc de dicha célula hospedadora con una solución que contiene una sonda de hibridación que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG, en la que R es A o G, Y es T o C, e i es inopina [SEC. ID. nº 94]; (e) detección de una molécula de ADNc recombinante que se hibrida con dicha sonda; y (f) aislamiento de dicha molécula de ADNc recombinante; (g) ligadura de la secuencia de ácido nucleico a dicha molécula de ADNc que codifica dicha proteína recombinante en un vector de clonación con expresión apropiada; (h) transformación de una segunda célula hospedadora con dicho vector de clonación de expresión que contiene dicha secuencia de ácido nucleico de dicha molécula de ADNc que codifica dicha proteína recombinante; (i) cultivo de la segunda célula hospedadora transformada; y (j) aislamiento de dicha proteína recombinante expresada por dicha segunda célula hospedadora. Obsérvese que al describir la producción de proteínas recombinantes en determinados sistemas de expresión tal como las células COS, el término "transfección" se utiliza convencionalmente en lugar de (y a veces de manera intercambiable con) "transformación".

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de preparación de un ADNc recombinante que codifica una proteína recombinante que tiene actividad anticoagulante y que tiene un dominio de NAP, que comprende las etapas de: (a) aislamiento de un banco de ADNc de un nemátodo; (b) ligadura de dicho banco de ADNc en un vector de clonación; (c) introducción de dicho vector de clonación que contiene dicho banco de ADNc en una célula hospedadora; (d) puesta en contacto de las moléculas de ADNc de dichas células hospedadoras con una solución que comprende la primera y segunda sondas de hibridación, en la que dicha primera sonda de hibridación tiene la secuencia de ácido nucleico que comprende AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GAC TGT GGA ACT CAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AAT GAG GAA CCC CCT GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGC TCA CGT GGT TGT TTA TTA CCT CCT GCT TGC GTA TGC AAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AGG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA [SEC. ID. nº 1] y dicha segunda sonda de hibridación tiene la secuencia de ácido nucleico que comprende AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GTC TGT GGA ACT AAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AGT GAG GAA GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGA TCA TTT TCT TGT CCG GGT CCC GCT GCT TGC GTA TGC GAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AAG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA [SEC. ID. nº 2];

(e) detección de una molécula de ADNc recombinante que se hibrida con dicha mezcla de dichas sondas; y (f) aislamiento de dicha molécula de ADNc recombinante.

En otro aspecto todavía, la presente invención se refiere a un método de preparación de un ADNc recombinante que codifica una proteína que tiene actividad anticoagulante y que incluye un dominio de NAP, que comprende las etapas de: (a) aislamiento de un banco de ADNc de un nemátodo; (b) ligadura de dicho banco de ADNc en un vector de clonación con expresión de fagómido apropiado; (c) transformación de las células hospedadoras con dicho vector que contiene dicho banco de ADNc; (d) cultivo de dichas células hospedadoras; (e) infección de dichas células hospedadoras con un fago auxiliar; (f) separación del fago que contiene dicho banco de ADNc de dichas células hospedadoras; (g) combinación de una solución de dicho fago que contiene dicho banco de ADNc con una solución de factor Xa humano biotinilado; (h) puesta en contacto de una fase sólida recubierta con estreptavidina con dicha solución que contiene dichos fagos que contienen dicho banco de ADNc, y dicho factor Xa humano biotinilado; (i) aislamiento de fagos que se unen a dicha fase sólida recubierta con estreptavidina; y (j) aislamiento de la molécula de ADNc recombinante de los fagos que se unen a dicha fase sólida recubierta con estreptavidina.

En un aspecto preferido, la presente invención se refiere a un ADNc recombinante que presenta una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre las secuencias de ácido nucleico descritas en la Figura 1, Figura 3, Figuras 7A a 7F, Figura 9, Figuras 13A a 13H y Figura 14.

La presente invención se refiere asimismo a las NAP que inhiben la actividad catalítica de FXa, a las NAP que inhiben la actividad catalítica del complejo FVIIa/TF, y a las NAP que inhiben la actividad catalítica de una serina proteasa, así como a los ácidos nucleicos que codifican dichas NAP y a sus métodos de utilización.

Definiciones

El término "aminoácido" se refiere a los L-aminoácidos naturales; los D-aminoácidos están incluidos en la medida en que la proteína que incluye dichos D-aminoácidos conserva actividad biológica. Los L-aminoácidos naturales incluyen alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteína (Cys), glutamina (Gln), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptófano (Trp), tirosina (Tyr) y valina (Val).

La expresión "restos de aminoácido" se refiere a los radicales que presentan la estructura: (1) -NH-CH(R)C(=O)-, en la que R es el grupo de la cadena lateral del carbono alfa de un L-aminoácido, excepto para la L-prolina; o (2) 1000 para la L-prolina.

El término "péptido" se refiere a una secuencia de aminoácidos unidos por sus grupos alfa-amino y carboxilato por enlaces peptídicos. Dichas secuencias como se muestra en la presente memoria se presentan en la dirección amino a carboxi, de izquierda a derecha.

El término "proteína" se refiere a una molécula compuesta de uno o más péptidos.

El término "ADNc" se refiere al ADN complementario.

La expresión "ácido nucleico" se refiere a los polímeros en los que las bases (p. ej. purinas o pirimidinas) están unidas a un eje central de azúcar fosfato. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN.

La expresión "secuencia de ácido nucleico" se refiere a la secuencia de nucleósidos que comprenden un ácido nucleico. Dichas secuencias mostradas en la presente memoria se presentan en la dirección 5’ a 3’, de izquierda a derecha.

La expresión "molécula de ADN recombinante" se refiere a una molécula de ADN creada ligando piezas de ADN que normalmente no están contiguas.

El término "ARNm" se refiere al ácido ribonucleico mensajero.

El término "homología" se refiere al grado de similitud del ADN o de las secuencias peptídicas.

Las expresiones "factor Xa" o "fXa" o "FXa" son sinónimas y se conoce normalmente que significan una proteína serasa dentro de la cascada de coagulación sanguínea de las enzimas que funciona como parte del complejo de protrombinasa para formar la enzima trombina.

La frase "actividad inhibidora del factor Xa" significa una actividad que inhibe la actividad catalítica del fXa para con su sustrato.

La frase "actividad inhibidora selectiva del factor Xa" significa la actividad inhibidora que es selectiva hacia el factor Xa en comparación con otras enzimas relacionadas, tales como otras serina proteasas.

La frase "inhibidor del factor Xa" es un compuesto que presenta actividad inhibidora del factor Xa.

Las expresiones "factor VIIa/factor tisular" o "fVIIa/TF" o "FVIIa/TF" son sinónimas y se conoce normalmente que significan un complejo catalíticamente activo del factor VIIa (fVIIa) de coagulación de la serina proteasa y el factor tisular de la proteína no enzimática (TF), en el que el complejo está montado sobre la superficie de una membrana de fosfolípido de composición definida.

La frase "actividad inhibidora de fVIIa/TF" significa una actividad que inhibe la actividad catalítica del complejo fVIIa/TF en presencia de fXa o de un derivado de fXa catalíticamente inactivo.

La frase "actividad inhibidora selectiva de fVIIa/TF" significa la actividad inhibidora de fVIIa/TF que es selectiva hacia fVIIa/TF en comparación con otras enzimas relacionadas, tales como otras serina proteasas, incluyendo FVIIa y fXa.

La frase un "inhibidor de fVIIa/TF" es un compuesto con actividad inhibidora de fVIIa/TF en presencia de fXa o de derivados de fXa catalíticamente inactivos.

La frase "serina proteasa" se conoce comúnmente que significa una enzima, que comprende una triada de los aminoácidos histidina, ácido aspártico y serina, que escinde catalíticamente un enlace amida, en el que el resto serina en la triada está implicado en un modo covalente en la escisión catalítica. Las serina proteasas se vuelven catalíticamente inactivas por modificación covalente del resto de serina en la triada catalítica por el fluorofosfato de diisopropilo (DFP).

La frase "actividad inhibidora de la serina proteasa" significa una actividad que inhibe la actividad catalítica de una serina proteasa.

La frase "actividad inhibidora selectiva de serina proteasa" significa la actividad inhibidora que es selectiva para una serina proteasa en comparación con otras serina proteasas.

La frase "inhibidor de serina proteasa" es un compuesto con actividad inhibidora de serina proteasa.

El término "protrombinasa" es sabido normalmente que significa un complejo catalíticamente activo del Factor Xa (fXa) de coagulación de la serina proteasa y del factor Va (fVa) de la proteína no enzimática, en el que el complejo está ensamblado sobre la superficie de una membrana fosfolipídica de composición definida.

La frase "actividad anticoagulante" significa una actividad que inhibe la coagulación de la sangre, que incluye la coagulación del plasma.

El término "selectivo", "selectividad" y permutaciones de los mismos, cuando se refiere a la actividad de NAP para una determinada enzima, significa que la NAP inhibe la enzima especificada con por lo menos una potencia 10 veces mayor que inhibe otras enzimas relacionadas. Por lo tanto, la actividad de NAP es selectiva para esta enzima especificada.

La expresión "sustancialmente la misma" cuando se utiliza para referirse a proteínas, secuencias de aminoácidos, ADNc, secuencias de nucleótidos y similares se refiere a proteínas, ADNc o secuencias con por lo menos aproximadamente el 90% de homología con la otra proteína, ADNc o secuencia.

El término "NAP" o "proteína NAP" significa una proteína aislada que incluye por lo menos un dominio de NAP y con actividad inhibidora de serina proteasa y/o actividad anticoagulante.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 describe la secuencia nucleotídica del ADNc de AcaNAP5 [SEC. ID. nº 3]. La numeración empieza en el primer nucleótido del ADNc. La traducción empieza en el primer codón ATG (posición 14); un segundo ATG del marco está presente en la posición 20.

La Figura 2 describe la secuencia de aminoácidos de AcaNAP5 maduro [SEC. ID. nº 4].

La Figura 3 describe la secuencia nucleotídica del ADNc de AcaNAP6 [SEC. ID. nº 5]. La numeración empieza en el primer nucleótido del ADNc. La traducción empieza en el primer codón ATG (posición 14); un segundo ATG del marco está presente en la posición 20.

La Figura 4 describe la secuencia de aminoácidos de AcaNAP6 maduro [SEC. ID. nº 6]. Los aminoácidos que se diferencian de AcaNAP5 están subrayados. Además de estas sustituciones de aminoácidos, AcaNAP6 contiene una deleción de dos aminoácidos (Pro-Pro) en comparación con AcaNAP5.

La Figura 5 describe la secuencia de aminoácidos de Pro-AcaNAP5 [SEC. ID. nº 7].

La Figura 6 describe la secuencia de aminoácidos de Pro-AcaNAP6 [SEC. ID. nº 8]. Los aminoácidos que se diferencian de Pro-AcaNAP5 están subrayados. Además de estas sustituciones de aminoácidos, Pro-AcaNAP6 contiene una deleción de dos aminoácidos (Pro-Pro) en comparación con Pro-AcaNAP5.

Las Figuras 7A a 7F describen las secuencias nucleotídicas de los ADNc y las secuencias de aminoácidos deducidas de determinadas proteínas NAP aisladas de Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale y Heligmosomoides polygyrus. La Figura 7A describe las secuencias para la molécula de ADNc recombinante, AceNAP4, aislada de Ancylostoma ceylanicum [SEC. ID. nº 9]. La Figura 7B describe las secuencias para la molécula de ADNc recombinante, AceNAP5, aislada de Ancylostoma ceylanicum [SEC. ID. nº 10]. La Figura 7C describe las secuencias para la molécula de ADNc recombinante, AceNAP7, aislada de Ancylostoma ceylanicum [SEC. ID. nº 11]. La Figura 7D describe las secuencias para la molécula de ADNc recombinante, AceNAP4, aislada de Ancylostoma duodenale [SEC. ID. nº 12]. La Figura 7E describe las secuencias para la molécula de ADNc recombinante, AceNAP7, aislada de Ancylostoma duodenale [SEC. ID. nº 13]. La Figura 7F describe las secuencias para la molécula de ADNc recombinante, HpoNAP5, aislada de Heligmosomoides polygyrus [SEC. ID. nº 14]. La secuencia EcoRI, correspondiente al extremo 5’ de la molécula ADNc recombinante, se indica en todos los casos (subrayada). La numeración de cada secuencia comienza en esta secuencia EcoRI. AceNAP4 y AduNAP7, cada una codifica una proteína que presenta dos dominios de NAP; todos los demás clones en esta Figura codifican una proteína con un único dominio de NAP. El clon AduNAP4 de ADNc no es completo, es decir, la molécula ADNc recombinante carece de la parte 5’-terminal de la zona de codificación basada en la comparación con otras isoformas.

Las Figuras 8A a 8C describen la secuencia nucleotídica de los vectores, pDONG61 (Figura 8A) [SEC. ID. nº 15], pDONG62 (Figura 8B) [SEC. ID. nº 16] y pDONG63 (Figura 8C) [SEC. ID. nº 17]. El fragmento HindIII-BamHI que se muestra está localizado entre las secuencias HindIII y BamHI de pUC119. Los vectores permiten la clonación de los ADNc, como fragmentos de SfiI-NotI, en los tres marcos de lectura diferentes corriente abajo del gen 6 del fago filamentoso. Todas las secuencias de restricción aplicables están indicadas. El triplete AAA que codifica a Lys en la posición 373 a 375 es el último codón del gen 6. La proteína codificada por el gen 6 va seguida por una secuencia enlazadora Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly [SEC. ID. nº 18].

La Figura 9 describe la secuencia de nucleótidos de la molécula de ADNc recombinante, ADNc de AcaNAPc2 [SEC. ID. nº 19]. La secuencia EcoRI, correspondiente al extremo 5’ del ADNc, está indicada (subrayada). La numeración comienza en esta secuencia EcoRI. La secuencia de aminoácidos deducida también se presenta; el marco de lectura de la traducción fue determinado mediante el socio de fusión del gen 6. El ADNc de AcaNAPc2 carece de un fragmento de la parte 5’-terminal de la zona de codificación; la homología con AcaNAP5 y AcaNAP6 predice que los primeros siete restos de aminoácidos pertenecen a la señal de secreción.

Las Figuras 10A y 10B describen los efectos comparativos de determinadas proteínas NAP sobre la medición del tiempo de la protrombina (PT) (Figura 10A) y del tiempo de la tromboplastina parcial activada (aPTT) (Figura 10B) del plasma humano citrado normal. Los círculos negros, (\bullet) representan Pro-AcaNAP5; los triángulos blancos, (\Delta), representan AcaNAP5 (AcaNAP5^{a} en la Tabla 2); y los círculos blancos (O), representan AcaNAP5 natural.

La Figura 11 describe la alineación de las secuencias de aminoácidos codificada por determinados ADNc de NAP aislados de varios nemátodos. AcaNAP5 [SEC. ID. nº 20], AcaNAP6 [SEC. ID. nº 21] y AcaNAPc2 [SEC. ID. nº 128] se aislaron de Ancylostoma caninum. AceNAP5 [SEC. ID. nº 23] y AceNAP4d2 [SEC. ID. nº 25] se aislaron de Ancylostoma caninum. AduNAP4 [SEC. ID. nº 26] y AduNAP7 (AduNAP7d1 [SEC. ID. nº 27] y AduNAP7d2 [SEC. ID. nº 28] se aislaron de Ancylostoma duodenale. HpoNAP5 [SEC. ID. nº 29] se aisló de Heligmosomoides polygyrus. Las secuencias de aminoácidos mostradas en esta figura son las proporcionadas en las Figuras 1, 3, 7A a 7F y 9. Las secuencias de AcaNAP5 madura [SEC. ID. nº 4] y de AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6] (véase las Figuras 2 y 4) están caracterizadas, en parte, por 10 restos de cisteína (numerados del 1 al 10 y mostrados en negrita). Todas las secuencias de aminoácidos en esta Figura contienen por lo menos un dominio de NAP. El ADNc de AceNAP4 consta de dos zonas adyacentes, denominadas AceNAP4d1 [SEC. ID. nº 24] y AceNAP4d2 [SEC. ID. nº 25], que codifican un primer (d1) y segundo (d2) dominio de NAP; asimismo, el ADN de AduNAP7 contiene dos zonas adyacentes, AduNAP7d1 [SEC. ID. nº 27] y AduNAPd2 [SEC. ID. nº 28], que codifica un primer (d1) y segundo (d2) dominio de NAP. La alineación de las secuencias de aminoácidos de todos los dominios de NAP está guiada por las cisteínas; se introdujeron guiones (- - -) en determinadas posiciones para mantener la alineación de la cisteína e indican la ausencia de un aminoácido
en esta posición. El resto carboxi-terminal de la proteína codificada por el ADNc está seguido de la palabra "fin".

Las Figuras 12A y 12B describen una cartografía del vector de expresión/secreción de pYAM7SP8 de P. pastoris (Figura 12A) y las secuencias incluidas en el vector (Figura 12B) [SEC. ID. nº 30]. Tal como se describe en la Figura 12A, este plásmido contiene los elementos siguientes insertados entre el activador AOX1 producido por metanol (flecha oscura en la zona 5’AOX no traducida) y la señal de terminación de la transcripción AOX1 (3’T): un fragmento de ADN sintético que codifica la señal de secreción de la fosfatasa ácida (S), una secuencia pro (P) de 19 aminoácidos sintéticos que finaliza con una secuencia de tratamiento Lys-Arg para la proteasa KEX2 y una secuencia de multiclonación. El gen HIS4 que sirve como marcador de selección en la transformación GS115 fue modificado por mutagénesis dirigida al sitio para eliminar la secuencia de reconocimiento Stu1 (HIS4*). Las secuencias de pBR322, incluyendo el gen Bla y el origen (ori) para la propagación en E. coli están representadas por una sola línea. La Figura 12B describe las secuencias de ADN contiguas siguientes que están incorporadas en pYAM7SP8: la secuencia señal de secreción de la fosfatasa ácida (PH01), la secuencia pro y la secuencia del punto de multiclonación (MCS). El codón de iniciación ATG de la señal de secreción PH01 está subrayado.

Las Figuras 13A a 13H describen las secuencias nucleotídicas de los ADNc y las secuencias de aminoácidos deducidas de determinadas proteínas NAP aisladas de Ancylostoma caninum. La Figura 13A describe las secuencias de la molécula AcaNAP23 de ADNc recombinante [SEC. ID. nº 31]. La Figura 13B describe las secuencias de la molécula AcaNAP24 de ADNc recombinante [SEC. ID. nº 32]. La Figura 13C describe las secuencias de la molécula AcaNAP25 de ADNc recombinante [SEC. ID. nº 33]. La Figura 13D describe las secuencias de las moléculas AcaNAP31, AcaNAP42 y AcaNAP46 del ADNc recombinante, todas las cuales son idénticas [SEC. ID. nº 34]. La Figura 13E describe las secuencias de la molécula AcaNAP44 de ADNc recombinante [SEC. ID. nº 35]. La Figura 13F describe las secuencias de la molécula AcaNAP45 de ADNc recombinante [SEC. ID. nº 36]. La Figura 13G describe las secuencias de la molécula AcaNAP47 de ADNc recombinante [SEC. ID. nº 37]. La Figura 13H describe las secuencias de la molécula AcaNAP48 de ADNc recombinante [SEC. ID. nº 38]. La secuencia EcoRI, correspondiente al extremo 5’ de la molécula de ADNc recombinante, se indica en todos los casos (subrayada). La numeración de cada secuencia comienza en esta secuencia EcoRI. AcaNAP45 y AcaNAP47, codifican cada una una proteína que presenta dos dominios de NAP; todos los demás clones en esta figura codifican una proteína con un solo dominio de NAP.

La Figura 14 describe el nucleótido y la secuencia de aminoácidos deducida de la molécula NamNAP del ADNc recombinante [SEC. ID. nº 39].

La Figura 15 representa la actividad antitrombocítica de AcaNAP5 y la Heparina de Bajo Peso Molecular (LMWH; Enoxaparin^{TM}) evaluada en el modelo de FeCl_{3} de la trombosis arterial. Los datos de actividad están representados como porcentaje de frecuencia de la formación del trombo oclusivo en la arteria carótida (círculos). La formación del trombo comenzó 150 minutos después de la administración subcutánea (s.c.) del agente de ensayo. Se cuantificó la hemorragia grave en un grupo independiente de animales que fueron tratados de manera idéntica pero sin adición de FeCl_{3} (cuadrados). La pérdida de sangre en una herida quirúrgica profunda en el cuello fue cuantificada durante un total de 210 minutos después de la administración subcutánea del compuesto.

La Figura 16 presenta la alineación de las secuencias de aminoácidos correspondientes a las NAP maduras aisladas según los procedimientos dados a conocer en la presente memoria: a saber AcaNAP5 [SEC. ID. nº: 40], AcaNAP6 [SEC. ID. nº: 41], AcaNAP48 [SEC. ID. nº: 42], AcaNAP23 [SEC. ID. nº: 43], AcaNAP24 [SEC. ID. nº: 44], AcaNAP25 [SEC. ID. nº: 45], AcaNAP44 [SEC. ID. nº: 46], AcaNAP31, 42, 46 [SEC. ID. nº: 47], AceNAP4d1 [SEC. ID. nº: 48], AceNAP4d2 [SEC. ID. nº: 49], AcaNAP45d1 [SEC. ID. nº: 50], AcaNAP47d1 [SEC. ID. nº: 51], AduNAP7d1 [SEC. ID. nº: 52], AcaNAP45d2 [SEC. ID. nº: 53], AcaNAP47d2 [SEC. ID. nº: 54], AduNAP4 [SEC. ID. nº: 55], AduNAP7d2 [SEC. ID. nº: 56], AceNAP5 [SEC. ID. nº: 57], AceNAP7 [SEC. ID. nº: 58], AcaNAPc2 [SEC. ID. nº: 59], HpoNAP5 [SEC. ID. nº: 60], y NamNAP [SEC. ID. nº: 61]. Cada dominio de NAP comprende diez restos de cisteína, que se utilizan para alinear las secuencias, y las secuencias de aminoácidos entre las cisteínas. A1 a A10 representan las secuencias de aminoácidos entre los restos de cisteínas.

La Figura 17 describe la secuencia de aminoácidos de AceNAP4 madura [SEC. ID. nº 62] con dos dominios de NAP.

La Figura 18 describe la secuencia de aminoácidos de AcaNAP45 madura [SEC. ID. nº 63] con dos dominios de NAP.

La Figura 19 describe la secuencia de aminoácidos de AcaNAP47 madura [SEC. ID. nº 64] con dos dominios de NAP.

La Figura 20 describe la secuencia de aminoácidos de AceNAP7 madura [SEC. ID. nº 65] con dos dominios de NAP.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una familia de proteínas, denominadas en conjunto Proteínas Anticoagulantes extraídas de Nemátodos (NAP). Estas proteínas se denominan así porque el primer miembro aislado originalmente fue extraído de un nemátodo, el anquilostoma canino, Ancyclostoma caninum. Sin embargo, la denominación NAP o dominio de NAP no debería considerarse que limita las proteínas de la presente invención por esta u otra fuente natural.

Las proteínas NAP aisladas se caracterizan por tener por lo menos un dominio de NAP y por tener actividad inhibidora y/o anticoagulante de serina proteasa. Dicha actividad anticoagulante puede ser evaluada por los incrementos en el tiempo de coagulación tanto en el análisis PT como en aPTT descritos en la presente memoria, mediante la inhibición de la actividad del factor Xa o del factor VIIa/TF o mediante la demostración de la actividad in vivo. Preferentemente, la sangre o el plasma utilizados en dichos análisis proceden de especies que se sabe que están infectadas por nemátodos, tales como cerdos, seres humanos, primates y similares. El dominio de NAP es una secuencia de aminoácidos. Se cree que el dominio de NAP es responsable de la actividad inhibidora y/o anticoagulante observada. Determinados dominios de NAP representativos incluyen las secuencias de aminoácidos descritas en las Figuras 11 y 16, especialmente las secuencias entre las cisteínas denominadas Cisteína 1 y Cisteína 10 en las Figuras y la secuencia siguiente a la Cisteína 10. Se proporcionan las características que definen ampliamente esta familia de proteínas, así como las moléculas de ácido nucleico, incluyendo las secuencias de ARNm y las secuencias de ADN que codifican dichas proteínas. Se proporcionan asimismo los métodos de preparación de estas proteínas, así como los métodos de preparación de las moléculas de ácido nucleico que codifican dichas proteínas. Los ejemplos específicos proporcionados son únicamente a título de ejemplo y otros miembros de la familia NAP de proteínas, así como las secuencias de ácido nucleico que les codifican, pueden obtenerse siguiendo los procedimientos esbozados en estos ejemplos y descritos en la presente memoria.

Las proteínas de la presente invención incluyen las NAP aisladas que comprenden proteínas con actividad anticoagulante y que incluyen por lo menos un dominio de NAP. Con respecto a la "actividad anticoagulante", las proteínas purificadas de la presente invención son activas como anticoagulantes, y como tales se caracterizan por inhibir la coagulación de la sangre que incluye la coagulación del plasma. En un aspecto, las proteínas aisladas de la presente invención incluyen las que aumentan el tiempo de coagulación del plasma humano medido en los ensayos tanto del tiempo de la protrombina (PT) como del tiempo de la tromboplastina parcial activada (aPTT).

En este ensayo PT, la coagulación se inicia mediante la adición de una cantidad fija de complejo factor tisular-micela de fosfolípido (tromboplastina) al plasma humano. Los anticoagulantes interfieren con determinadas interacciones sobre la superficie de este complejo y aumentan el tiempo requerido para conseguir la coagulación en comparación con la coagulación observada en ausencia de anticoagulante. La medición de PT es particularmente aplicable a la evaluación de la actividad anticoagulante de NAP porque la serie de fenómenos bioquímicos específicos requeridos para producir la coagulación en este ensayo son similares a los que deben ser superados por el anquilostoma en la naturaleza para facilitar la alimentación. Por lo tanto, la capacidad de NAP para actuar como inhibidor en este análisis puede ser paralela a su actividad en la naturaleza, y es pronóstico de actividad anticoagulante in vivo. Tanto en el análisis como en la naturaleza, la respuesta a la coagulación se inicia mediante la formación de un complejo binario del factor VIIa (fVIIa) de la serina proteasa y el factor tisular de la proteína (TF) (fVIIa/TF), resultante en la generación de fXa. El montaje posterior de fXa en el complejo de protrombinasa es el episodio clave responsable de la formación de trombina y de la formación eventual del coágulo.

En el ensayo aPTT, la coagulación se inicia mediante la adición de una determinada cantidad fija de micelas de fosfolípido (activador) cargadas negativamente al plasma humano. Las sustancias que actúan como anticoagulantes interferirán con determinadas interacciones sobre la superficie del complejo y otra vez aumentarán el tiempo para conseguir una determinada cantidad de coagulación en comparación con la observada en ausencia de anticoagulante. El Ejemplo B describe dichos análisis PT y aPTT. Estos análisis pueden utilizarse para evaluar la actividad anticoagulante de las NAP aisladas de la presente invención.

Las NAP aisladas preferidas de la presente invención incluyen las que duplican el tiempo de coagulación del plasma humano en el ensayo PT cuando están presentes en una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 nanomolar y que duplican asimismo el tiempo de coagulación del plasma humano en el ensayo aPTT cuando están presentes a una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 nanomolar. Se prefieren especialmente las proteínas que duplican el tiempo de coagulación del plasma humano en el ensayo PT cuando están presentes en una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nanomolar y que duplican asimismo el tiempo de coagulación del plasma humano en el ensayo aPTT cuando están presentes a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 nanomolar. Se prefieren más especialmente las proteínas que duplican el tiempo de coagulación del plasma humano en el ensayo PT cuando están presentes en una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nanomolar y que duplican asimismo el tiempo de coagulación del plasma humano en el ensayo aPTT cuando están presentes a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nanomolar.

La actividad anticoagulante o antitrombocítica de las NAP de la presente invención puede también evaluarse utilizando los modelos in vivo presentados en el Ejemplo F. El modelo FeCl_{3} de rata descrito en la parte A de este Ejemplo es un modelo de trombosis arterial, dependiente de plaquetas que se utiliza normalmente para evaluar compuestos antitrombocíticos. El modelo evalúa la capacidad de un compuesto de ensayo para impedir la formación de un trombo oclusivo producido por FeCl_{3} en un segmento de la arteria carótida de la rata. Las NAP de la presente invención son anticoagulantes eficaces en este modelo cuando se administran por vía intravenosa o subcutánea. El ensayo de hemorragia profunda descrito en la parte B del Ejemplo F permite la medición de la pérdida de sangre tras la administración de un compuesto anticoagulante. Un efecto deseado de un anticoagulante es que inhiba la coagulación de la sangre o la formación del trombo, pero no tanto que impida la coagulación completamente y potencie por esta razón la hemorragia. De este modo, el ensayo de hemorragia profunda mide la cantidad de pérdida de sangre durante el periodo de 3,5 horas después de la administración de anticoagulante. Los datos presentados en la Figura 15 demuestran que la NAP de la presente invención es un compuesto antitrombocítico eficaz a una dosis que no produce excesiva hemorragia. En cambio, la dosis de heparina de bajo peso molecular (LMWH) que se correlaciona con 0% de oclusión produjo aproximadamente tres veces más hemorragia que la dosis eficaz de NAP.

Dominio de NAP general [Fórmula I]

Con respecto al "dominio de NAP", las proteínas aisladas (o NAP) de la presente invención incluyen por lo menos un dominio de NAP en su secuencia de aminoácidos. Determinados dominios de NAP presentan una secuencia de aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 5,0 a 10,0 kilodaltons, preferentemente de aproximadamente 7,0 a 10,0 kilodaltons y que contienen 10 restos del aminoácido cisteína.

Determinadas NAP de la presente invención demuestran especificidad para inhibir un componente específico en la cascada de coagulación, tal como fXa o el complejo fVIIa/TF. La especificidad de una actividad inhibidora de NAP hacia un componente en la cascada de coagulación puede evaluarse utilizando el protocolo del Ejemplo D. Se mide y se compara la capacidad de una NAP para inhibir la actividad de una variedad de serina proteasas implicada en la coagulación. La capacidad de una NAP para inhibir el complejo fVIIa/TF puede evaluarse también utilizando los protocolos en el Ejemplo E, que miden la capacidad de una NAP para fijarse a fXa de manera inhibidora o no inhibidora y para inhibir a fVIIa cuando se acompleja con TF. AcaNAP5 y AcaNAP6 son ejemplos de proteínas con dominios de NAP que inhiben de manera específica a fXa. AcaNAPc2 es una proteína con un dominio de NAP que demuestra inhibición selectiva del complejo fVIIa/TF cuando está presente fXa, o un derivado catalíticamente activo o inactivo de la misma.

NAP con actividad anticoagulante, incluyendo las NAP con actividad inhibidora del factor Xa (Fórmula II)

De este modo, en un aspecto las NAP de la presente invención incluyen también una proteína aislada con actividad anticoagulante, incluyendo una proteína aislada con actividad inhibidora del factor Xa, y con uno o más dominios de NAP, en el que cada dominio de NAP incluye la secuencia:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 \hskip0,4cm ("Fórmula II"),

en la que

(a)

A1 es una secuencia de aminoácidos de 7 a 8 restos de aminoácidos;

(b)

A2 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 5 restos de aminoácidos;

(c)

A3 es una secuencia de aminoácidos de 3 restos de aminoácidos;

(d)

A4 es una secuencia de aminoácidos de 6 a 19 restos de aminoácidos;

(e)

A5 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 4 restos de aminoácidos;

(f)

A6 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 5 restos de aminoácidos;

(g)

A7 es un aminoácido;

(h)

A8 es una secuencia de aminoácidos de 11 a 12 restos de aminoácidos;

(i)

A9 es una secuencia de aminoácidos de 5 a 7 restos de aminoácidos;

(j)

A10 es una secuencia de aminoácidos de 5 a 25 restos de aminoácidos.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas NAP según este aspecto, y los métodos de inhibición de la coagulación sanguínea que comprenden la administración de proteínas NAP según este aspecto se contemplan también en esta invención.

Las proteínas NAP en este aspecto de la invención presentan por lo menos un dominio de NAP. Se prefieren las NAP con uno o dos dominios de NAP. Las proteínas AcaNAP5 de NAP [SEC. ID. nº 4 y nº: 40] y AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6 y nº: 41] presentan un dominio de NAP y son las NAP preferidas según este aspecto de la invención.

Por lo tanto, según un aspecto preferido, se proporcionan proteínas aisladas con actividad anticoagulante, incluyendo las proteínas aisladas con actividad como inhibidores del Factor Xa, con por lo menos un dominio de NAP de fórmula II que incluye la secuencia siguiente:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 en la que (a) Cys-1 se selecciona de entre la SEC. ID. nº 67 y nº: 156; (b) Cys-A2-Cys se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 157 a la nº: 159; (c) A3-Cys-A4 se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 160 a la nº: 173; (d) Cys-A5 se selecciona de entre la SEC. ID. nº 174 y la nº: 175; (e) Cys-A6 se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 176 a la nº: 178; (f) Cys-A7-Cys-A8 se selecciona de entre la SEC. ID. nº 179 y la nº: 180; (g) Cys-A9 se selecciona de entre la SEC. ID. nº 181 a la nº: 183; y (h) Cys-A10 se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 184 a la nº: 204.

En otra forma de realización preferida de este aspecto de la invención, A3 presenta la secuencia Glu-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} y A3_{b} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados. Más preferentemente, A3_{a} se selecciona de entre el grupo constituido por Ala, Arg, Pro, Lys, Ile, His, Leu y Thr, y A3_{b} se selecciona de entre el grupo constituido por Lys, Thr y Arg. Las secuencias de A3 especialmente preferidas se seleccionan de entre el grupo constituido por Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys y Glu-Thr-Lys.

En una forma de realización preferida adicional de este aspecto de la invención, A4 es una secuencia de aminoácidos con una carga aniónica neta.

Según este aspecto de la invención, un resto de aminoácidos A7 preferido es Val o Ile.

Otra forma de realización preferida de este aspecto de la invención es en la que A8 incluye la secuencia de aminoácidos A8_{a}-A8_{b}-A8_{c}-A8_{d}-A8_{e}-A8_{f}-A8_{g} [SEC. ID. nº 68], en la que

(a) A8_{a} es el primer resto de aminoácido en A8,

(b) por lo menos uno de entre A8_{a} y A8_{b} se selecciona de entre el grupo constituido por Glu o Asp, y

(c) A8_{c} a A8_{g} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados.

Preferentemente, A8_{c} es Gly, A8_{d} se selecciona de entre el grupo constituido por Phe, Tyr y Leu, A8_{e} es Tyr, A8_{f} es Arg y A8_{g} se selecciona de entre Asp y Asn. Una secuencia A8_{c}-A8_{d}-A8_{e}-A8_{f}-A8_{g} preferida se selecciona de entre el grupo constituido por Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 72] y Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 73].

\newpage

Una forma de realización preferida adicional es en la que A10 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados de entre el grupo constituido por Glu-Ile-Ile-His-Val [SEC. ID. nº 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEC. ID. nº 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEC. ID. nº 76] y Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEC. ID. nº 77].

Las proteínas NAP, AcaNAP5 y AcaNAP6, comprenden la secuencia de aminoácidos Glu-Ile-Ile-His-Val [SEC. ID. nº 74] en A10, y son las NAP preferidas según la forma de realización de la invención.

En una forma de realización de este aspecto de la invención, una molécula de NAP preferida es en la que

(a) A3 presenta la secuencia Glu-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} y A3_{b} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados;

(b) A4 es una secuencia de aminoácidos que tiene una carga aniónica neta;

(c) A7 se selecciona de entre el grupo constituido por Val e Ile;

(d) A8 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 72] y Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 73]; y

(e) A10 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por Glu-Ile-Ile-His-Val [SEC. ID. nº 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEC. ID. nº 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEC. ID. nº 76] y Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEC. ID. nº 77].

Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas NAP según esta forma de realización, y los métodos de inhibición de la coagulación sanguínea que comprenden la administración de proteínas NAP según esta forma de realización se contemplan también en la presente invención. Las proteínas NAP en esta forma de realización de la invención presentan por lo menos un dominio de NAP. Se prefieren las NAP con uno o dos dominios de NAP. Las proteínas AcaNAP5 y AcaNAP6 de NAP presentan un dominio de NAP y se prefieren las NAP según esta forma de realización de la invención.

En otra forma de realización preferida, una molécula de NAP es en la que

(a) A3 se selecciona de entre el grupo constituido por Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys y Glu-Thr-Lys;

(b) A4 es una secuencia de aminoácidos con una carga aniónica neta;

(c) A7 es Val o Ile;

(d) A8 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por A8_{a}-A8_{b}-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 79], A8_{a}-A8_{b}-Gly- Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 80], A8_{a}-A8_{b}-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 81] y Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 82], en la que por lo menos uno de A8_{a} y A8_{b} es Glu o Asp;

(e) A9 es una secuencia de aminoácidos de cinco restos de aminoácidos; y

(f) A10 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por Glu-Ile-Ile-His-Val [SEC. ID. nº 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEC. ID. nº 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEC. ID. nº 76] y Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEC. ID. nº 77]. Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas NAP según esta forma de realización, y los métodos de inhibición de la coagulación sanguínea que comprenden la administración de proteínas NAP según esta forma de realización son contempladas asimismo por la presente invención. Las proteínas NAP en esta forma de realización de la invención tienen por lo menos un dominio de NAP. Se prefieren las NAP con uno o dos dominios de NAP. Se prefieren las proteínas que presentan por lo menos un dominio de NAP que es sustancialmente el mismo que el de AcaNAP5 [SEC. ID. nº 40] o AcaNAP6 [SEC. ID. nº 41]. Las proteínas NAP AcaNAP5 [SEC. ID. nº 4 y nº: 40] y AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6 y nº: 41] presentan un dominio de NAP y son especialmente preferidas las NAP según esta forma de realización de la invención.

Las proteínas NAP preferidas con actividad anticoagulante, incluyendo las que presentan actividad inhibidora del factor Xa, según todas las formas de realización mencionadas anteriormente para este aspecto de la invención, pueden proceder de una especie de nemátodo. Se selecciona una especie preferida de nemátodo de entre el grupo constituido por Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus y Heligomosomoides polygyrus. Son particularmente preferidas las proteínas NAP AcaNAP5 y AcaNAP6 procedentes de Ancylostoma caninum.

Este aspecto de la invención contempla también moléculas de ADNc recombinantes aisladas que codifican una proteína con actividad anticoagulante y/o inhibidora del factor Xa, en la que la proteína se define según cada una de las formas de realización mencionadas anteriormente para la proteína NAP aislada con actividad anticoagulante y/o inhibidora del factor Xa. Los ADNc preferidos según este aspecto de la invención codifican AcaNAP5 y AcaNAP6.

La actividad inhibidora del factor Xa de las NAP dentro de este aspecto de la invención puede determinarse utilizando los protocolos descritos en la presente memoria. El Ejemplo A describe uno de dichos métodos. En resumen, se incuba una NAP con el factor Xa durante un periodo de tiempo, después del cual se añade un sustrato del factor Xa. Se mide la velocidad de hidrólisis del sustrato, con una velocidad más lenta en comparación con la velocidad en ausencia de NAP indicadora de la inhibición de NAP del factor Xa. El Ejemplo C proporciona otro método de detección de una actividad inhibidora de NAP hacia el factor Xa cuando se monta en el complejo de protrombinasa, que refleja con más precisión la función fisiológica normal de fXa in vivo. Como se describe en la presente memoria, el factor Xa montado en el complejo de protrombinasa se incuba con NAP, seguido de adición del sustrato. La generación de protrombina mediada por el factor Xa por el complejo de protrombinasa se mide por la velocidad de generación de trombina procedente de esta mezcla.

NAP con actividad anticoagulante, incluyendo las NAP con actividad inhibidora del factor VIIa/TF (Fórmula III)

En otro aspecto las NAP de la presente invención incluyen también una proteína aislada con actividad anticoagulante, incluyendo una proteína aislada con actividad inhibidora del factor VIIa/TF, y con uno o más dominios de NAP, en el que cada dominio de NAP incluye la secuencia:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 \hskip0,4cm ("Fórmula III"),

en la que

(a)

A1 es una secuencia de aminoácidos de 7 a 8 restos de aminoácidos;

(b)

A2 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 5 restos de aminoácidos;

(c)

A3 es una secuencia de aminoácidos de 3 restos de aminoácidos;

(d)

A4 es una secuencia de aminoácidos de 6 a 19 restos de aminoácidos;

(e)

A5 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 4 restos de aminoácidos;

(f)

A6 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 5 restos de aminoácidos;

(g)

A7 es un aminoácido;

(h)

A8 es una secuencia de aminoácidos de 11 a 12 restos de aminoácidos;

(i)

A9 es una secuencia de aminoácidos de 5 a 7 restos de aminoácidos;

(j)

A10 es una secuencia de aminoácidos de 5 a 25 restos de aminoácidos.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas NAP según este aspecto, y los métodos de inhibición de la coagulación sanguínea que comprenden la administración de proteínas NAP según este aspecto se contemplan también en esta invención.

Las proteínas NAP en este aspecto de la invención presentan por lo menos un dominio de NAP. Se prefieren las NAP con uno o dos dominios de NAP. Se prefieren las proteínas con por lo menos un dominio de NAP, sustancialmente el mismo que el de AcaNAPc2 [SEC. ID. nº 59]. La proteína NAP AcaNAPc2 [SEC. ID. nº 59] presenta un dominio de NAP y es una NAP especialmente preferida según este aspecto de la invención.

Por consiguiente, en un aspecto preferido, se proporcionan las NAP con actividad anticoagulante, incluyendo la actividad inhibidora del Factor VIIa/TF, y con por lo menos un dominio de NAP de fórmula III, en el que el dominio de NAP incluye la secuencia de aminoácidos:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 en la que (a) Cys-A1 se selecciona de entre las SEC. ID. nº 83 y nº: 205; (b) Cys-A2-Cys se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 206 a la nº: 208; (c) A3-Cys-A4 se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 209 a la nº: 222; (d) Cys-A5 se selecciona de entre la SEC. ID. nº 223 y la nº: 224; (e) Cys-A6 se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 225 a la nº: 227; (f) Cys-A7-Cys-A8 se selecciona de entre la SEC. ID. nº 228 y la nº: 229; (g) Cys-A9 se selecciona de entre la SEC. ID. nº 230 a la nº: 232; y (h) Cys-A10 se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 233 a la nº: 253.

En otra forma de realización preferida de este aspecto de la invención, A3 presenta la secuencia Asp-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} y A3_{b} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados. Más preferentemente, A3 es Asp-Lys-Lys.

En una forma de realización preferida, A4 es una secuencia de aminoácidos con una carga aniónica neta.

\newpage

En otra forma de realización preferida de este aspecto de la invención, A5 presenta la secuencia A5_{a}-A5_{b}-A5_{c}-A5_{d} [SEC. ID. nº 84], en la que A5_{a} a A5_{d} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados. Preferentemente, A5_{a} es Leu y A5_{c} es Arg.

Según este aspecto de la invención, un resto de aminoácidos A7 preferido es Val o Ile, más preferentemente Val.

Una forma de realización preferida adicional de este aspecto de la invención es en la que A8 incluye la secuencia de aminoácidos A8_{a}-A8_{b}-A8_{c}-A8_{d}-A8_{e}-A8_{f}-A8_{g} [SEC. ID. nº 68], en la que

(a) A8_{a} es el primer resto de aminoácido en A8,

(b) por lo menos uno de entre A8_{a} y A8_{b} se selecciona de entre el grupo constituido por Glu o Asp, y

(c) A8_{c} a A8_{g} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados.

Preferentemente, A8_{c} es Gly, A8_{d} se selecciona de entre el grupo constituido por Phe, Tyr y Leu, A8_{e} es Tyr, A8_{f} es Arg y A8_{g} se selecciona de entre Asp y Asn. Una secuencia A8_{c}-A8_{d}-A8_{e}-A8_{f}-A8_{g} preferida es Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 70].

En una forma de realización, una molécula de NAP preferida es en la que:

(a) A3 presenta la secuencia Asp-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} y A3_{b} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados;

(b) A4 es una secuencia de aminoácidos que tiene una carga aniónica neta;

(c) A5 presenta la secuencia A5_{a}-A5_{b}-A5_{c}-A5_{d}, en la que A5_{a} a A5_{d} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados;

(d) A7 se selecciona de entre el grupo constituido por Val e Ile. Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas NAP según esta forma de realización, y los métodos de inhibición de la coagulación sanguínea que comprenden la administración de proteínas NAP según esta forma de realización se contemplan también en la presente invención. Las proteínas NAP en esta forma de realización de la invención presentan por lo menos un dominio de NAP. Se prefieren las NAP con uno o dos dominios de NAP. La proteína NAP AcaNAPc2 presenta un dominio de NAP y es una NAP preferida según esta forma de realización de la invención.

En otra forma de realización preferida, una molécula de NAP es en la que

(a) A3 es Asp-Lys-Lys;

(b) A4 es una secuencia de aminoácidos con una carga aniónica neta;

(c) A5 presenta la secuencia A5_{a}-A5_{b}-A5_{c}-A5_{d} [SEC. ID. nº 85], en la que A5_{a} a A5_{d} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados;

(d) A7 es Val; y

(e) A8 incluye una secuencia de aminoácidos A8_{a}-A8_{b}-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 79], en la que por lo menos uno de entre A8_{a} y A8_{b} es Glu o Asp. Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas NAP según esta forma de realización, y los métodos de inhibición de la coagulación sanguínea que comprenden la administración de proteínas NAP según esta forma de realización se contemplan también en la presente invención. Las proteínas NAP en esta forma de realización de la invención presentan por lo menos un dominio de NAP. Se prefieren las NAP con uno o dos dominios de NAP. La proteína NAP AcaNAPc2 [SEC. ID. nº 59] presenta un dominio de NAP y es una NAP preferida según esta forma de realización de la invención.

Las proteínas NAP preferidas con actividad anticoagulante, incluyendo las que presentan actividad inhibidora del factor VIIa/TF, según todas las formas de realización citadas anteriormente para este aspecto de la invención, pueden proceder de una especie de nemátodo. Se selecciona una especie preferida de nemátodo de entre el grupo constituido por Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus y Heligomosomoides polygyrus. Es particularmente preferida la proteína NAP AcaNAPc2 procedente de Ancylostoma cani- num.

Este aspecto de la invención contempla también moléculas de ADNc recombinantes aisladas que codifican una proteína con actividad anticoagulante y/o inhibidora del factor VIIa/TF, en la que la proteína se define según cada una de las formas de realización mencionadas anteriormente para la proteína NAP aislada con actividad anticoagulante y/o actividad inhibidora del factor VIIa/TF. Un ADNc preferido según este aspecto de la invención presenta una secuencia nucleotídica [SEC. ID. nº 19] y codifica AcaNAPc2 [SEC. ID. nº 59].

La actividad inhibidora del fVIIa/TF de las NAP dentro de este aspecto de la invención puede determinarse utilizando los protocolos descritos en la presente memoria. El Ejemplo E describe los ensayos con fVIIA/TF. Se miden la escisión mediada por fVIIa/TF y la liberación del péptido de activación tritiado del factor IX humano (^{3}H-FIX) radiomarcado o la hidrólisis amidolítica de un sustrato de peptidilo cromógeno. Cabe destacar que los inhibidores del fVIIa/TF del NAP de la presente invención requieren la presencia de fXa para ser inhibidores activos de fVIIa/TF. Sin embargo, los inhibidores de fVIIa/TF de NAP fueron igualmente eficaces en presencia de fXa en el que la secuencia activa había sido ocupada de forma irreversible por la peptidilclorometilcetona H-Glu-Gly-Arg-CMK (EGR) y por lo tanto se volvieron catalíticamente inactivos (EGR-fXa). Si bien no se desea estar ligado por ninguna explicación, parece que una NAP con actividad de inhibición de fVIIa/TF forma un complejo binario con fXa uniéndose a una secuencia de reconocimiento específica en la enzima que es distinta de las secuencias de reconocimiento primario P_{4}-P_{1}, dentro del centro catalítico de la enzima. Esto es seguido de la formación de un complejo inhibidor cuaternario con el complejo fVIIa/TF. De acuerdo con esta hipótesis EGR-fXa puede soportar totalmente la inhibición de fVIIa/TF mediante las NAP inhibidoras para fVIIa/TF a pesar de la ocupación covalente de las secuencias de reconocimiento primario (P_{4}-P_{1}) dentro de la secuencia catalítica de fXa por la tripeptidilclorometilcetona (EGR-CMK).

La actividad inhibidora de fVIIa/TF de las NAP puede determinarse también utilizando los protocolos del Ejemplo D, así como los ensayos de fXa descritos en los Ejemplos A y C. La capacidad de una NAP para inhibir la actividad catalítica de una variedad de enzimas se mide y se compara con su actividad inhibidora hacia el complejo fVIIa/TF. Una inhibición específica de fVIIa/TF por una NAP es una característica deseada para determinadas aplicaciones.

Un aspecto adicional de la invención incluye una proteína aislada con actividad anticoagulante, y los ADNc que codifican la proteína, en el que dicha proteína inhibe específicamente la actividad catalítica del complejo fVIIa/TF en presencia de fXa o del derivado de fXa catalíticamente inactivo, pero no inhibe específicamente la actividad de fVIIa en ausencia de TF y no inhibe específicamente la protrombinasa. Las proteínas preferidas según este aspecto de la invención presentan las características descritas anteriormente para una proteína aislada con actividad inhibidora del factor VIIa/TF y con uno o más dominios de NAP. Una proteína preferida según este aspecto de la invención es la AcaNAPc2.

Las NAP en este aspecto de la invención están identificadas por su actividad inhibidora del fVIIA/TF en presencia de fXa o de un derivado de fXa, ya sea el derivado catalíticamente activo o no. Los protocolos descritos en los Ejemplos B, C y F son útiles en la determinación de la actividad anticoagulante de dichas NAP. El protocolo en el Ejemplo A puede detectar una inactividad de NAP hacia el fXa libre o la protrombinasa. Los datos generados utilizando los protocolos del Ejemplo E identificarán las NAP que requieran fXa catalíticamente activo o inactivo para inhibir el complejo fVIIa/TF.

NAP con actividad inhibidora de factor serina proteasa (Fórmula IV)

En un aspecto adicional, las NAP de la presente invención incluyen también una proteína aislada con actividad anticoagulante, incluyendo una proteína aislada con actividad inhibidora de serina proteasa y con uno o más dominios de NAP, en el que cada dominio de NAP incluye la secuencia:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 \hskip0,4cm ("Fórmula IV"),

en la que

(a)

A1 es una secuencia de aminoácidos de 7 a 8 restos de aminoácidos;

(b)

A2 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 5 restos de aminoácidos;

(c)

A3 es una secuencia de aminoácidos de 3 restos de aminoácidos;

(d)

A4 es una secuencia de aminoácidos de 6 a 19 restos de aminoácidos;

(e)

A5 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 4 restos de aminoácidos;

(f)

A6 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 5 restos de aminoácidos;

(g)

A7 es un aminoácido;

(h)

A8 es una secuencia de aminoácidos de 10 a 12 restos de aminoácidos;

(i)

A9 es una secuencia de aminoácidos de 5 a 7 restos de aminoácidos

(j)

A10 es una secuencia de aminoácidos de 1 a 25 restos de aminoácidos.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas NAP según este aspecto, y los métodos de inhibición de la coagulación sanguínea que comprenden la administración de proteínas NAP según este aspecto se contemplan también en la presente invención. Las proteínas NAP en este aspecto de la invención presentan por lo menos un dominio de NAP. Se prefieren las NAP con uno o dos dominios de NAP. Se prefieren los dominios de NAP que presentan secuencias de aminoácidos que son sustancialmente iguales que los dominios de NAP de HpoNAP5 [SEC. ID. nº 60] o NamNAP [SEC. ID. nº 61]. Las proteínas NAP HpoNAP5 [SEC. ID. nº 60] y NamNAP [SEC. ID. nº 61] presentan un dominio de NAP y se prefieren las NAP según este aspecto de la invención.

Por lo tanto, en un aspecto preferido, las NAP que presentan actividad de serina proteasa tienen por lo menos un dominio de NAP de fórmula IV que incluye la secuencia de aminoácidos:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 en la que (a) Cys-A1 se selecciona de entre las SEC. ID. nº 86 y nº: 254; (b) Cys-A2-Cys se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 255 a la nº: 257; (c) A3-Cys-A4 se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 258 a la nº: 271; (d) Cys-A5 se selecciona de entre la SEC. ID. nº 272 y la nº: 273; (e) Cys-A6 se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 274 a la nº: 276; (f) Cys-A7-Cys-A8 se selecciona de entre la SEC. ID. nº 277 a la nº: 279; (g) Cys-A9 se selecciona de entre la SEC. ID. nº 280 a la nº: 282; y (h) Cys-A10 se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 283 a la nº: 307.

En otra forma de realización preferida de este aspecto de la invención, A3 presenta la secuencia Glu-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} y A3_{b} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados. Más preferentemente, A3 es Glu-Pro-Lys.

En una forma de realización preferida, A4 es una secuencia de aminoácidos con una carga aniónica neta.

En otra forma de realización preferida de este aspecto de la invención, A5 presenta la secuencia A5_{a}-A5_{b}-A5_{c}-A5_{d}, en la que A5_{a} a A5_{d} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados. Preferentemente, A5_{a} es Thr y A5_{c} es Asn.

Según este aspecto de la invención, un resto de aminoácido A7 preferido es Gln.

En una forma de realización de este aspecto de la invención, una molécula de NAP preferida es en la que:

(a) A3 presenta la secuencia Glu-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} y A3_{b} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados;

(b) A4 es una secuencia de aminoácidos que tiene una carga aniónica neta;

(c) A5 presenta la secuencia A5_{a}-A5_{b}-A5_{c}, en la que A5_{a} a A5_{c} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados, y

(d) A7 es Gln. Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas NAP según esta forma de realización, y los métodos de inhibición de la coagulación sanguínea que comprenden la administración de proteínas NAP según esta forma de realización se contemplan también en la presente invención. Las proteínas NAP en esta forma de realización de la invención presentan por lo menos un dominio de NAP. Se prefieren las NAP con uno o dos dominios de NAP. Las proteínas NAP HpoNAP5 [SEC. ID. nº 60] y NamNAP [SEC. ID. nº 61] presentan un dominio de NAP y son las NAP preferidas según esta forma de realización de la invención.

En otra forma de realización preferida, una molécula de NAP es en la que:

(a) A3 es Glu-Pro-Lys;

(b) A4 es una secuencia de aminoácidos que tiene una carga aniónica neta;

(c) A5 se selecciona de entre Thr-Leu-Asn y Thr-Met-Asn; y

(d) A7 es Gln. Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas NAP según esta forma de realización, y los métodos de inhibición de la coagulación sanguínea que comprenden la administración de proteínas NAP según esta forma de realización se contemplan también en la presente invención. Las proteínas NAP en esta forma de realización de la invención presentan por lo menos un dominio de NAP. Se prefieren las NAP con uno o dos dominios de NAP. Las proteínas NAP HpoNAP5 [SEC. ID. nº 60] y NamNAP [SEC. ID. nº 61] presentan un dominio de NAP y son las NAP preferidas según esta forma de realización de la invención.

Las proteínas NAP preferidas con actividad inhibidora de serina proteasa, según todas las formas de realización citadas anteriormente para este aspecto de la invención, pueden proceder de una especie de nemátodo. Se selecciona una especie preferida de nemátodo de entre el grupo constituido por Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus y Heligomosomoides polygyrus. Son particularmente preferidas las proteínas NAP HpoNAP5 y NamNAP procedentes de Heligomosomoides polygyrus y Necator americanus, respectivamente.

Este aspecto de la invención contempla también moléculas de ADNc recombinantes aisladas que codifican una proteína con actividad inhibidora de serina proteasa, en la que la proteína se define según cada una de las formas de realización mencionadas anteriormente para la proteína NAP aislada con actividad inhibidora de serina proteasa. Los ADNc preferidos según este aspecto de la invención presentan las secuencias nucleotídicas [SEC. ID. nº 14] (HpoNAP5) y [SEC. ID. nº 39] (NamNAP) y codifican a HpoNAP5 [SEC. ID. nº 60] y NamNAP [SEC. ID. nº 61].

La actividad inhibidora de serina proteasa puede determinarse utilizando cualquiera de los análisis descritos en los Ejemplos A a F, o cualquiera de los análisis enzimáticos utilizados normalmente para medir la inhibición de la actividad de la serina proteasa. Los procedimientos para numerosos análisis enzimáticos pueden encontrarse en los volúmenes de Methods of Enzymology o materiales de referencia similares. Las NAP preferidas presentan actividad inhibidora de serina proteasa dirigida hacia las enzimas en la cascada de la coagulación de la sangre o hacia tripsina/
elastasa.

NAP con actividad anticoagulante (Fórmula V)

En un aspecto adicional, las NAP de la presente invención incluyen también una proteína aislada con actividad anticoagulante, con actividad anticoagulante y con uno o más dominios de NAP, en el que cada dominio de NAP incluye la secuencia:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 \hskip0,4cm ("Fórmula V"),

en la que

(a)

A1 es una secuencia de aminoácidos de 7 a 8 restos de aminoácidos;

(b)

A2 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 5 restos de aminoácidos;

(c)

A3 es una secuencia de aminoácidos de 3 restos de aminoácidos;

(d)

A4 es una secuencia de aminoácidos de 6 a 19 restos de aminoácidos;

(e)

A5 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 4 restos de aminoácidos;

(f)

A6 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 5 restos de aminoácidos;

(g)

A7 es un aminoácido;

(h)

A8 es una secuencia de aminoácidos de 11 a 12 restos de aminoácidos;

(i)

A9 es una secuencia de aminoácidos de 5 a 7 restos de aminoácidos;

(j)

A10 es una secuencia de aminoácidos de 5 a 25 restos de aminoácidos.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas NAP según este aspecto, y los métodos de inhibición de la coagulación sanguínea que comprenden la administración de proteínas NAP según este aspecto se contemplan también en la presente invención. Las proteínas NAP en este aspecto de la invención presentan por lo menos un dominio de NAP. Se prefieren las NAP con uno o dos dominios de NAP. Las NAP preferidas incluyen las que presentan por lo menos un dominio de NAP con una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual que cualquiera de [SEC. ID. nº 40 a nº: 58]. Las proteínas NAP AcaNAP5 [SEC. ID. nº 40], AcaNAP6 [SEC. ID. nº 41], AcaNAP48 [SEC. ID. nº 42], AcaNAP23 [SEC. ID. nº 43], AcaNAP24 [SEC. ID. nº 44], AcaNAP25 [SEC. ID. nº 45], AcaNAP44 [SEC. ID. nº 46], AcaNAP31 [SEC. ID. nº 47], AduNAP6 [SEC. ID. nº 55], AceNAP5 [SEC. ID. nº 57] y AceNAP7 [SEC. ID. nº 58] presentan un dominio de NAP y se prefieren las NAP según este aspecto de la invención. Las proteínas NAP AceNAP4 [SEC. ID. nº 62], AcaNAP45 [SEC. ID. nº 63], AcaNAP47 [SEC. ID. nº 64] y AduNAP7 [SEC. ID. nº 65] presentan dos dominios de NAP y son las NAP preferidas según este aspecto de la invención.

Las NAP preferidas de la presente invención según este aspecto incluyen las proteínas aisladas que presentan actividad anticoagulante y que tienen por lo menos un dominio de NAP de fórmula V que incluye la secuencia siguiente:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 en la que (a) Cys-A1 se selecciona de entre las SEC. ID. nº 87 y nº: 308; (b) Cys-A2-Cys se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 309 a la nº: 311; (c) A3-Cys-A4 se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 312 a la nº: 325; (d) Cys-A5 se selecciona de entre la SEC. ID. nº 326 y la nº: 327; (e) Cys-A6 se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 328 a la nº: 330; (f) Cys-A7-Cys-A8 se selecciona de entre la SEC. ID. nº 331 a la nº: 332; (g) Cys-A9 se selecciona de entre la SEC. ID. nº 333 a la nº: 335; y (h) Cys-A10 se selecciona de entre una de la SEC. ID. nº 236 a la nº: 356.

En otra forma de realización preferida, A3 presenta la secuencia Glu-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} y A3_{b} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados. Más preferentemente, A3_{a} y A3_{b} se selecciona de entre el grupo constituido por Ala, Arg, Pro, Lys, Ile, His, Leu y Thr, y A3_{b} se selecciona de entre el grupo constituido por Lys, Thr y Arg. Las secuencias de A3 especialmente preferidas se seleccionan de entre el grupo constituido por Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys y Glu-Thr-Lys.

En una forma de realización preferida, A4 es una secuencia de aminoácidos con una carga aniónica neta.

Según este aspecto de la invención, un resto de aminoácido A7 preferido es Val o Ile.

Otra forma de realización preferida de la invención es en la que A8 incluye la secuencia de aminoácidos A8_{a}-A8_{b}-A8_{c}-A8_{d}-A8_{e}-A8_{f}-A8_{g} [SEC. ID. nº 68], en la que

(a) A8_{a} es el primer resto de aminoácido en A8,

(b) por lo menos uno de entre A8_{a} y A8_{b} se selecciona de entre el grupo constituido por Glu o Asp, y

(c) A8_{c} a A8_{g} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados.

Preferentemente, A8_{c} es Gly, A8_{d} se selecciona de entre el grupo constituido por Phe, Tyr y Leu, A8_{e} es Tyr, A8_{f} es Arg, y A8_{g} se selecciona de entre Asp y Asn. Una secuencia A8_{c}-A8_{d}-A8_{e}-A8_{f}-A8_{g} preferida se selecciona de entre el grupo constituido por Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [s-I 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 72] y Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 73].

Otra forma de realización preferida es en la que A10 comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por Glu-Ile-Ile-His-Val [SEC. ID. nº 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEC. ID. nº 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEC. ID. nº 76] y Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEC. ID. nº 77]. Las proteínas de NAP AcaNAP5 [SEC. ID. nº 4 y nº: 40] y AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6 y nº: 41] comprenden la secuencia de aminoácidos Glu-Ile-Ile-His-Val [SEC. ID. nº 74] en A10 y son las NAP preferidas según esta forma de realización de la invención. La proteína NAP AcaNAP48 [SEC. ID. nº 42] incluye la secuencia de aminoácidos Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEC. ID. nº 75] en A10 y es la NAP preferida según esta forma de realización de la invención. Las proteínas NAP AcaNAP23 [SEC. ID. nº 43], AcaNAP24 [SEC. ID. nº 44], AcaNAP25 [SEC. ID. nº 45], AcaNAP44 [SEC. ID. nº 46], AcaNAP31 [SEC. ID. nº 47] y AceNAP4 [SEC. ID. nº 48, nº: 49 y nº: 62] incluyen la secuencia de aminoácidos Phe-Ala-Thr-Phe-Ala-Pro [SEC. ID. nº 76] y son las NAP preferidas según este aspecto de la invención. Las proteínas NAP AcaNAP45 [SEC. ID. nº 50, nº: 53 y nº: 63], AcaNAP47 [SEC. ID. nº 51, nº: 54 y nº: 64], AduNAP7 [SEC. ID. nº 52, nº: 56 y nº: 65] y AduNAP4 [SEC. ID. nº 55], AceNAP5 [SEC. ID. nº 57] y AceNAP7 [SEC. ID. nº 58] incluyen la secuencia de aminoácidos Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEC. ID. nº 77] y son las NAP preferidas según este aspecto de la
invención.

En una forma de realización, una molécula de NAP preferida es en la que

(a) A3 presenta la secuencia Glu-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} y A3_{b} se seleccionan independientemente de entre restos de aminoácido;

(b) A4 es una secuencia de aminoácido con una carga aniónica neta;

(c) A7 se selecciona de entre el grupo constituido por Val e Ile;

(d) A8 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 72] y Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 73]; y

(e) A10 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por Glu-Ile-Ile-His-Val [SEC. ID. nº 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEC. ID. nº 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEC. ID. nº 76] y Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEC. ID. nº 77]. Las composiciones farmacéuticas que contienen proteínas NAP según esta forma de realización, y los métodos para inhibir la coagulación sanguínea que comprenden la administración de proteínas NAP según esta forma de realización también se contemplan en esta invención. Las proteínas NAP dentro de este aspecto de la invención tienen por lo menos un dominio de NAP. Las NAP preferidas son las que tienen uno o dos dominios de NAP. Las proteínas NAP AcaNAP5 [SEC. ID. nº 4 y nº: 40], AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6 y nº: 41], AcaNAP48 [SEC. ID. nº 42], AcaNAP23 [SEC. ID. nº 43], AcaNAP24 [SEC. ID. nº 44], AcaNAP25 [SEC. ID. nº 45], AcaNAP44 [SEC. ID. nº 46], AcaNAP31 [SEC. ID. nº 47], AduNAP4 [SEC. ID. nº 55], AceNAP5 [SEC. ID. nº 57] y AceNAP7 [SEC. ID. nº 58] tienen un dominio de NAP y son NAP preferidas según esta forma de realización. Las proteínas NAP AcaNAP4 [SEC. ID. nº 62], AcaNAP45 [SEC. ID. nº 63], AcaNAP47 [SEC. ID. nº 64] y AduNAP7 [SEC. ID. nº 65] tienen dos dominios de NAP y son las NAP preferidas según esta forma de realización.

En otra forma de realización preferida, una molécula NAP es aquella en la que

(a) A3 se selecciona de entre el grupo constituido por Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys y Glu-Thr-Lys;

(b) A4 es una secuencia de aminoácido con una carga aniónica neta;

(c) A7 es Val o Ile;

(d) A8 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por A8_{a}-A8_{b}-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 78], A8_{a}-A8_{b}-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 79], A8_{a}-A8_{b}-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 80], A8_{a}-A8_{b}-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 81] y A8_{a}-A8_{b}-Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 82], en la que por lo menos uno de entre A8_{a} y A8_{b} es Glu o Asp.

(e) A9 es una secuencia de aminoácidos de cinco restos de aminoácido; y

(f) A10 incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por Glu-Ile-Ile-His-Val [SEC. ID. nº 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEC. ID. nº 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEC. ID. nº 76] y Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEC. ID. nº 77]. Las composiciones farmacéuticas que contienen proteínas NAP según esta forma de realización, y los métodos de inhibición de la coagulación sanguínea que comprenden la administración de proteínas NAP según esta forma de realización también se contemplan en esta invención. Las proteínas NAP en esta forma de realización de la invención tienen por lo menos un dominio de NAP. Las NAP preferidas son las que tienen uno o dos dominios de NAP. Las proteínas NAP AcaNAP5 [SEC. ID. nº 4 y nº: 40], AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6 y nº: 41], AcaNAP48 [SEC. ID. nº 42], AcaNAP23 [SEC. ID. nº 43], AcaNAP24 [SEC. ID. nº 44], AcaNAP25 [SEC. ID. nº 45], AcaNAP44 [SEC. ID. nº 46], AcaNAP31 [SEC. ID. nº 47], AduNAP4 [SEC. ID. nº 55], AceNAP5 [SEC. ID. nº 57] y AceNAP7 [SEC. ID. nº 58] tienen un dominio de NAP y son NAP preferidas según esta forma de realización. Las proteínas NAP AceNAP4 [SEC. ID. nº 62], AcaNAP45 [SEC. ID. nº 63], AcaNAP47 [SEC. ID. nº 64] y AduNAP7 [SEC. ID. nº 65] tienen dos dominios de NAP y son las NAP preferidas según esta forma de realización.

Las proteínas NAP preferidas con actividad anticoagulante, según todas las formas de realización citadas anteriormente para este aspecto de la invención, pueden proceder de una especie de nemátodo. Se selecciona una especie preferida de nemátodo de entre el grupo constituido por Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus y Heligomosomoides polygyrus. Se prefieren especialmente las proteínas NAP AcaNAP5 [SEC. ID. nº 4 y nº: 40], AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6 y nº: 41], AcaNAP48 [SEC. ID. nº 42], AcaNAP23 [SEC. ID. nº 43], AcaNAP24 [SEC. ID. nº 44], AcaNAP25 [SEC. ID. nº 45], AcaNAP44 [SEC. ID. nº 46], AcaNAP45 [SEC. ID. nº 63], AcaNAP47 [SEC. ID. nº 64] y AcaNAP31 [SEC. ID. nº 47] procedentes de Ancylostoma caninum; AceNAP4 [SEC. ID. nº 62], AceNAP5 [SEC. ID. nº 57] y AceNAP7 [SEC. ID. nº 58] procedentes de Ancylostoma ceylanicum; y AduNAP7 [SEC. ID. nº 65] AduNAP4 [SEC. ID. nº 55] procedentes de Ancylostoma duodenale.

Este aspecto de la invención contempla asimismo moléculas de ADNc recombinante aislado que codifican una proteína con actividad anticoagulante, en las que la proteína se define según cada una de las formas de realización mencionadas anteriormente para la proteína NAP aislada con actividad anticoagulante. Las ADNc preferidas según este aspecto incluyen AcaNAP5 [SEC. ID. nº 3], AcaNAP6 [SEC. ID. nº 5], AcaNAP48 [SEC. ID. nº 38], AcaNAP23 [SEC. ID. nº 31], AcaNAP24 [SEC. ID. nº 32], AcaNAP25 [SEC. ID. nº 33], AcaNAP44 [SEC. ID. nº 35], AcaNAP31 [SEC. ID. nº 34], AduNAP4 [SEC. ID. nº 12], AceNAP5 [SEC. ID. nº 10], AceNAP7 [SEC. ID. nº 11], AceNAP4 [SEC. ID. nº 9], AcaNAP45 [SEC. ID. nº 36], AcaNAP47 [SEC. ID. nº 37] y AduNAP7 [SEC. ID. nº 13].

La actividad de anticoagulación de las NAP dentro de este aspecto de la invención puede determinarse utilizando los protocolos descritos en la presente memoria. Los ejemplos B y F presentan métodos particularmente útiles para evaluar una actividad de anticoagulación de NAP. Los procedimientos descritos para detectar las NAP con actividad inhibidora de fXa (Ejemplos A y C) y actividad inhibidora de fVIIa/TF (Ejemplo E) son también útiles en la evaluación de una actividad de anticoagulación de NAP.

Oligonucleótidos

Otro aspecto de la presente invención es un oligonucleótido que comprende una secuencia seleccionada de entre

YG109:

TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [SEC. ID. nº 88],

YG103:

AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [SEC. ID. nº 89],

NAP-1:

AAR-CCN-TGY-GAR-MGG-AAR-TGY [SEC. ID. nº 90] y

NAP-4.RC:

TW-RWA-NCC-NTC-YTT-RCA-NAC-RCA [SEC. ID. nº 91].

Estas secuencias oligonucleotídicas se hibridan a las secuencias de ácido nucleico que codifica la proteína NAP.

Las NAP aisladas de la presente invención incluyen las que tienen variaciones en la secuencia o secuencias descritas de aminoácidos, incluyendo los fragmentos, las mutaciones naturales, las variantes alélicas, los mutantes artificiales generados al azar y las variaciones deliberadas de la secuencia, todas las cuales conservan actividad anticoagulante. El término "fragmentos" se refiere a cualquier parte de la secuencia que contiene menos aminoácidos que la proteína completa, como por ejemplo, secuencias parciales excluyendo las partes en el terminal amino, terminal carboxi o entre el terminal amino y el terminal carboxi de la proteína completa.

Las NAP aisladas de la presente invención incluyen asimismo proteínas con una secuencia o secuencias de aminoácido recombinante que conservan actividad anticoagulante de la secuencia o secuencias de aminoácidos del dominio de NAP. Por lo tanto, tal como se utiliza en la presente memoria, la frase "proteína NAP" o el término "proteína" cuando se refiere a una proteína que comprende un dominio de NAP, significa, sin discriminación, la proteína NAP natural y la proteína NAP construida por medios recombinantes. Estas proteínas recombinantes incluyen las proteínas híbridas, tales como las proteínas de fusión, las proteínas resultantes de la expresión de múltiples genes dentro del vector de expresión, las proteínas resultantes de la expresión de múltiples genes dentro del cromosoma de la célula hospedadora, y pueden incluir un polipéptido con actividad anticoagulante de una proteína descrita unida por enlaces peptídicos a un segundo polipéptido. Las proteínas recombinantes también incluyen variantes de la secuencia o secuencias de aminoácidos del dominio de NAP de la presente invención que se diferencian solamente por la sustitución conservadora de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se definen como "conjuntos" en la Tabla 1 de Taylor, W. R., J. Mol. Biol., 188:233 (1986). Las proteínas recombinantes también incluyen variantes de la secuencia o secuencias de aminoácidos aisladas del dominio de NAP descritas de la presente invención en las que se hacen las sustituciones o deleciones de aminoácidos que conservan actividad anticoagulante de la secuencia o secuencias de dominio de NAP aislado.

Una forma de realización preferida de la presente invención es una proteína aislada por métodos bioquímicos procedente del nemátodo, Ancylostoma caninum, tal como se describe en el Ejemplo 1. Esta proteína aumenta el tiempo de coagulación del plasma humano en los ensayos PT y aPTT, contiene un dominio de NAP y se caracteriza por un terminal N que presenta la secuencia de aminoácidos, Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Gly-Asn-Glu-Trp-Leu-Asp [SEC. ID. nº 92], y un peso molecular de aproximadamente 8,7 kilodaltons hasta aproximadamente 8,8 kilodaltons determinados por espectrometría de masas.

Las formas de realización más preferidas de la presente invención incluyen las proteínas con actividad anticoagulante preparadas por métodos recombinantes a partir del banco de ADNc aisladas del nemátodo, Ancylostoma caninum, por ejemplo, AcaNAP5 [SEC. ID. nº 4 o nº: 40], AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6 o nº: 41], Pro-AcaNAP5 [SEC. ID. nº 7], Pro-AcaNAP6 [SEC. ID. nº 8], AcaNAP48 [SEC. ID. nº 42], AcaNAP23 [SEC. ID. nº 43], AcaNAP24 [SEC. ID. nº 44], AcaNAP25 [SEC. ID. nº 45], AcaNAP44 [SEC. ID. nº 46], AcaNAP31 [SEC. ID. nº 47], AcaNAP45 [SEC. ID. nº 63], AcaNAP47 [SEC. ID. nº 64] y AcaNAPc2 [SEC. ID. nº 59]; aisladas del nemátodo, Ancyclostoma ceylanium, por ejemplo, AceNAP4 [SEC. ID. nº 62], AceNAP5 [SEC. ID. nº 57] y AceNAP7 [SEC. ID. nº 58]; aisladas del nemátodo, Ancyclostoma duodenale, por ejemplo, AduNAP4 [SEC. ID. nº 55] y AduNAP7 [SEC. ID. nº 65]; aisladas del nemátodo Heligmosmoides polygyrus, por ejemplo, HpoNAP5 [SEC. ID. nº 60]; y del nemátodo Necator americanus, por ejemplo, NamNAP [SEC. ID. nº 61]. Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas se presentan en las Figuras 11 y 16 y en alguna otra parte. Cada una de dichas formas de realización preferidas aumenta el tiempo de coagulación del plasma humano en los ensayos PT y APTT y contiene por lo menos un dominio de NAP.

Con respecto a las "proteínas aisladas", las proteínas de la presente invención se aíslan por métodos de purificación de proteínas bien conocidos en la materia, o como se describe a continuación. Pueden aislarse de una fuente natural, a partir de una mezcla química tras la síntesis química en fase sólida o en solución tal como la síntesis de péptidos automática en fase sólida o a partir del cultivo celular después de la producción por métodos recombinantes.

Como se describe con mayor detalle a continuación en la presente memoria, la presente invención contempla también composiciones farmacéuticas que comprenden la NAP y métodos de utilización de la NAP para inhibir el proceso de coagulación de la sangre y la trombosis asociada. Las sondas de oligonucleótido útiles para la identificación de ácido nucleico con NAP en una muestra están comprendidas asimismo en el alcance de la presente invención, tal como se describe con mayor detalle a continuación.

1. NAP aislada de fuentes naturales

Las proteínas (NAP) aisladas preferidas de la presente invención pueden aislarse y purificarse a partir de fuentes naturales. Se prefieren como fuentes naturales los nemátodos; los nemátodos adecuados incluyen los nemátodos intestinales tales como Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus y Heligmosomoides polygyrus. Se prefieren especialmente como fuente natural el nemátodo hematófago, anquilostoma, Ancylostoma caninum.

Las proteínas preferidas de la presente invención se aíslan y purifican a partir de sus fuentes naturales por métodos conocidos en las técnicas bioquímicas. Estos métodos incluyen la preparación de un extracto soluble y el enriquecimiento del extracto utilizando métodos cromatográficos en diferentes matrices con soporte sólido. Los métodos preferidos de purificación incluirían la preparación de un extracto soluble de un nemátodo en Tris-HCl 0,02 M, tampón de pH 7,4 que contiene varios inhibidores de proteasa, seguida de la cromatografía secuencial del extracto a través de columnas que contienen la matriz de Sepharose Concanavalina-A, la matriz de intercambio catión-ion Poros20 HQ, la matriz de filtración en gel Superdex30 y una matriz en fase inversa C18. Las fracciones recogidas de dichas columnas cromatográficas pueden seleccionarse por su capacidad para aumentar el tiempo de coagulación del plasma humano, medido por los ensayos PT y aPTT, o su capacidad para inhibir la actividad amidolítica del factor Xa medida en un ensayo amidolítico colorimétrico que utiliza enzima purificada, o por otros métodos descritos en los Ejemplos A a F en la presente memoria. Un ejemplo de un método preferido de purificación de una proteína aislada de la presente invención incluiría la que se describe en el Ejemplo 1.

Las proteínas preferidas de la presente invención, cuando se purifican a partir de una fuente natural, tal como Ancylostoma caninum, descrita, incluyen las que contienen la secuencia de aminoácidos: Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Gly-Asn-Gly-Trp-Leu-Asp [SEC. ID. nº 92]. Se prefieren especialmente las proteínas purificadas con esta secuencia de aminoácidos en su terminal amino, tal como las presentadas en la Figura 2 (AcaNAP5 [SEC. ID. nº 4]) o en la Figura 4 (AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6]). Se demostró que una proteína preferida de la presente invención presenta la secuencia de aminoácidos, Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp-Leu-Asp [SEC. ID. nº 92] en su terminal amino y un peso molecular de 8,7 a 8,8 kilodaltons, determinado por espectrometría de masas.

2. NAP preparada por síntesis química

Las NAP aisladas preferidas de la presente invención pueden sintetizarse por métodos normalizados conocidos en las técnicas químicas. Las proteínas aisladas de la presente invención pueden prepararse utilizando síntesis en fase sólida, tal como la descrita por Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85:2149 (1964) u otros métodos equivalentes conocidos en las técnicas químicas, tales como el método descrito por Houghten en Proc. Natl. Acad. Sci., 82:5132 (1985).

La síntesis en fase sólida comienza en el terminal C del péptido acoplando un aminoácido o péptido protegido a una resina insoluble adecuada. Las resinas adecuadas incluyen las que contienen los grupos clorometilo, bromometilo, hidroxilmetilo, aminometilo, benchidrilo y t-alquiloxicarbonilhidrazida a los que puede acoplarse directamente el aminoácido.

En esta síntesis en fase sólida, el aminoácido carboxi terminal, que tiene su grupo alfa amino y, si es necesario, su grupo de la cadena lateral reactiva adecuadamente protegido, se acopla en primer lugar a la resina insoluble. Tras la eliminación del grupo protector alfa amino, tal como por tratamiento con ácido trifluoroacético en un disolvente adecuado, el aminoácido o péptido siguiente, que tiene también su grupo alfa amino y, si es necesario, cualquier grupo o grupos de la cadena lateral reactivos adecuadamente protegidos, se acopla al grupo alfa amino libre del aminoácido acoplado a la resina. Los aminoácidos o péptidos adicionales adecuadamente protegidos se acoplan de la misma manera a la cadena peptídica en crecimiento hasta que se consigue la secuencia de aminoácidos deseada. La síntesis puede realizarse manualmente, utilizando sintetizadores de péptidos automáticos o mediante una combinación de éstos.

El acoplamiento del aminoácido o péptido adecuadamente protegido al grupo alfa amino libre del aminoácido unido a la resina puede realizarse según métodos de acoplamiento convencionales, tales como el método de la azida, método del anhídrido mixto, método de la DCC (diciclohexilcarbodiimida), método del éster activado (éster de p-nitrofenilo o éster de N-hidroxisuccinimida), método del BOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris (diamino) fosfonio) o método del reactivo K de Woodward.

Es habitual en la síntesis de péptidos que los grupos protectores del grupo alfa amino de los aminoácidos o péptidos acoplados a la cadena peptídica en crecimiento unidos a la resina insoluble se separen en condiciones que no se separan los grupos protectores de la cadena lateral. Al terminar la síntesis, es frecuente también que el péptido se separe de la cadena insoluble y, durante o después de dicha separación, los grupos protectores se separan de la cadena lateral.

Los grupos protectores adecuados del grupo alfa amino de todos los aminoácidos y del grupo omega amino de la lisina incluyen benciloxicarbonilo, isonicotiniloxicarbonilo, o-clorobenciloxicarbonilo, p-nitrofeniloxicarbonilo, p-metoxifeniloxicarbonilo, t-butoxicarbonilo, t-amiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, 2-(4-bifenil)-2-propiloxicarbonilo, 9-fluorenilmetoxi-carbonilo, metilsulfoniletoxicarbonilo, trifluoroacetilo, ptalilo, formilo, 2-nitrofenilsulfenilo, difenilfosfinotioilo, dimetilfosfinotioilo y similares.

Los grupos protectores adecuados del grupo carboxi del ácido aspártico y del ácido glutámico incluyen el éster bencílico, el éster ciclohexílico, el éster 4-nitrobencílico, el éster t-butílico, el éster 4-piridilmetílico y similares.

Los grupos protectores adecuados del grupo guanidino de la arginina incluyen nitro, p-toluensulfonilo, benciloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, p-metoxibencenosulfonilo, 4-metoxi-2,6-dimetilbencenosulfonilo, 1,3,5-trimetilfenilsulfonilo y similares.

Los grupos protectores adecuados del grupo tiol de la cisteína incluyen p-metoxibencilo, trifenilmetilo, acetilaminometilo, etilcarbamoilo, 4-metilbencilo, 2,4,6-trimetilbencilo y similares.

Los grupos protectores adecuados del grupo hidroxi de la serina incluyen bencilo, t-butilo, acetilo, tetrahidropiranilo y similares.

El péptido terminado puede escindirse de la resina mediante tratamiento con ácido fluorhídrico líquido que contiene uno o más antioxidantes que contienen tio a temperaturas reducidas. La escisión de péptido de la resina mediante dicho tratamiento separará también todos los grupos protectores de la cadena lateral del péptido.

El péptido escindido se disuelve en ácido acético diluido seguido de filtración, a continuación se deja replegar y se crea la formación del enlace disulfuro apropiada mediante dilución a una concentración de péptido de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2 mM en una solución de ácido acético 0,1 M. El pH de esta solución se ajusta a aproximadamente 8,0 utilizando hidróxido de amonio y la solución se agita al aire libre durante aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas. El péptido replegado se purifica por cromatografía, preferentemente por cromatografía líquida a alta presión en una columna de fase inversa, eluyendo con un gradiente de acetonitrilo en agua (que contiene también ácido trifluoroacético al 0,1%), poniendo en funcionamiento el gradiente preferido desde 0 a aproximadamente 80% de acetonitrilo en agua. Durante la recogida de las fracciones que contienen el péptido puro, se agrupan las fracciones y se liofilizan hasta el péptido sólido.

3. NAP preparada por métodos recombinantes

Alternativamente, las NAP aisladas preferidas de la presente invención pueden prepararse por métodos de ADN recombinantes dados a conocer en la presente memoria y bien conocidos en las técnicas biológicas. Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, volúmenes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Los métodos del ADN recombinante permiten que los segmentos de información genética, ADN, de diferentes organismos, se unan fuera de los organismos de los que se extrae el ADN y permitan que este ADN híbrido se incorpore en el interior de una célula que permita la producción de la proteína que codifica el ADN original.

La información genética que codifica una proteína de la presente invención puede obtenerse a partir del ADN o ARNm genómico de un organismo por métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos preferidos de obtención de esta información genética incluyen aislar el ARNm de un organismo, convertirlo en su ADN complementario (ADNc), incorporar el ADNc en un vector de clonación apropiado e identificar el clon que contiene el ADN recombinante que codifica la proteína deseada mediante hibridación con sondas oligonucleotídicas apropiadas construidas a partir de las secuencias de la proteína conocidas.

La información genética en el ADNc recombinante que codifica una proteína de la presente invención puede estar ligada en un vector de expresión, el vector introducirse en células hospedadoras y la información genética expresarse como la proteína que codifica.

(A) Preparación del banco de ADNc

Las fuentes naturales preferidas de ARNm a partir de las cuales se construye un banco de ADNc son los nemátodos que incluyen los nemátodos intestinales tales como Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus y Heligmosomoides polygyrus. Se prefieren especialmente como fuente natural de ARNm es el nemátodo anquilostoma, Ancylostoma caninum.

Los métodos preferidos de aislamiento del ARNm que codifica una proteína de la presente invención, junto con otro ARNm, procedente de un organismo incluyen la cromatografía en geles de afinidad para poli U o poli T. Los métodos especialmente preferidos de aislamiento de ARNm procedente de nemátodos incluyen el procedimiento y los materiales proporcionados en el kit de purificación de ARNm QuickPrep (Pharmacia).

Los métodos de obtención preferidos del ADNc de doble cadena a partir de ARNm aislado incluyen la síntesis de un ADNc monocatenario en la plantilla del ARNm utilizando una transcriptasa inversa, degradando el ARN hibridado a la cadena de ADNc utilizando una ribonucleasa (RNasa) y sintetizando una cadena de ADN complementario que utiliza una ADN polimerasa para dar un ADNc de doble cadena. Los métodos especialmente preferidos incluyen aquellos en los que aproximadamente 3 microgramos de ARNm aislado de un nemátodo se convierten en ADNc de doble cadena haciendo uso de la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar, RNasa H y ADN polimerasa I de E. coli y ADN polimerasa de T4.

El ADNc que codifica una proteína de la presente invención, junto con otro ADNc en el banco construido como anteriormente, se ligan a continuación en vectores de clonación. Los vectores de clonación incluyen una secuencia de ADN que se adapta al ADNc procedente del banco de ADNc. Los vectores que contienen el banco de ADNc se introducen en las células hospedadoras que pueden existir de manera estable y proporcionan un medio en el que se replica el vector de clonación. Los vectores de clonación adecuados incluyen plásmidos, bacteriófagos, virus y cósmidos. Los vectores de clonación preferidos incluyen los bacteriófagos. Los vectores de clonación que son especialmente preferidos incluyen el bacteriófago, vector lambda gt11 Sfi-Not.

La construcción de los vectores de clonación adecuados que contienen el banco de ADNc y las secuencias de referencia emplean ligadura y técnicas de restricción habituales que son bien conocidas en la técnica. Los plásmidos aislados, las secuencias de ADN o los oligonucleótidos sintetizados se escinden, se adaptan y se vuelven a ligar en la forma deseada.

Con respecto a las técnicas de restricción, la escisión específica para el sitio de ADNc se realiza tratando con la enzima de restricción adecuada en condiciones que son generalmente comprendidas en la materia, y las particulares de las especificadas por el fabricante de estas enzimas de restricción disponibles en el mercado. Por ejemplo, véase los catálogos de productos de New England Biolabs, Promega y Stratagene Cloning Systems.

Generalmente, se escinde aproximadamente 1 microgramo del ADNc mediante tratamiento en aproximadamente una unidad de una enzima de restricción en aproximadamente 20 microlitros de solución de tampón. Típicamente, se utiliza un exceso de enzima de restricción para asegurar la escisión completa del ADNc. Se utilizan normalmente periodos de incubación de aproximadamente 1 a 2 horas a aproximadamente 37ºC, aunque se conocen excepciones. Después de cada reacción de escisión, la proteína puede eliminarse por extracción con fenol/cloroformo, seguida opcionalmente de cromatografía sobre una columna de filtración en gel, tal como Sephadex® G50. Alternativamente, los fragmentos de ADNc escindidos pueden separarse por sus tamaños por electroforesis en geles de poliacrilamida o de agarosa y aislarse utilizando técnicas normalizadas. Una descripción general de las separaciones por tamaño se encuentra en Methods of Enzymology, 65:499-560 (1980).

Los fragmentos de enzima de restricción-ADNc escindido se ligan a continuación en un vector de clonación.

Con respecto a las técnicas de ligadura, las ligaduras con extremo truncado se realizan normalmente en aproximadamente 15 a aproximadamente 30 microlitros de un tampón de pH 7,5 que comprende ATP aproximadamente 1 mM y aproximadamente 0,3 a 0,6 unidades (Weiss) de T4 ADN ligasa a aproximadamente 14ºC. Las ligaduras intermoleculares con "extremo adhesivo" se realiza normalmente entre aproximadamente 5 y 100 concentraciones nanomolares de ADN total-extremo. Las ligaduras intermoleculares del extremo truncado (que emplean normalmente aproximadamente 10 a 30 veces de exceso molar de enlazadores) se realizan a concentraciones de ADN total-extremo de aproximadamente 1 micromolar.

(B) Preparación del ADNc que codifica NAP

Los vectores de clonación que contienen el banco de ADNc preparado como se expuso anteriormente se introducen en las células hospedadoras, se cultivan las células hospedadoras, se colocan en placas y a continuación se sondan con una sonda de hibridación para identificar los clones que contienen el ADNc recombinante que codifica una proteína de la presente invención. Las células hospedadoras preferidas incluyen bacterias cuando se utilizan los vectores de clonación del fago. Las células hospedadoras especialmente preferidas incluyen cepas de E. coli tales como la cepa Y1090.

Alternativamente, el ADNc recombinante que codifica una proteína de la presente invención puede obtenerse por expresión de dicha proteína sobre la superficie externa de un fago filamentoso y a continuación aislando dicho fago uniéndole a una proteína diana implicada en la coagulación sanguínea.

Una característica importante bien conocida del código genético es su redundancia, más de una secuencia de nucleótidos del triplete codifica un aminoácido. De este modo, numerosas secuencias nucleotídicas diferentes son posibles para las moléculas de ADNc recombinante que codifican una determinada secuencia de aminoácidos para una NAP de la presente invención. Dichas secuencias nucleotídicas se consideran funcionalmente equivalentes dado que pueden dar como resultado la producción de la misma secuencia de aminoácidos en todos los organismos. Ocasionalmente, una variante metilada de una purina o pirimidina puede incorporarse en una secuencia nucleotídica dada. Sin embargo, dichas metilaciones no afectan la relación de codificación en modo alguno.

(1) Utilización de sondas de oligonucleótido

Las sondas y cebadores de hibridación son secuencias oligonucleotídicas que son complementarias con toda o parte de la molécula de ADNc recombinante que se desea. Pueden prepararse utilizando cualquier método adecuado, por ejemplo, los métodos de fosfotriéster y fosfodiéster, descritos respectivamente en Narang, S. A. et al., Methods in Enzymology, 68:90 (1979) y Brown, E. L. et al., Methods in Enzymology, 68:109 (1979), o las formas de realización automáticas de los mismos. En dicha forma de realización, se utilizan como materiales de partida las dietilfosforamiditas y pueden sintetizarse como se describe en Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22:1859-1862 (1981). Un método para sintetizar oligonucleótidos sobre un soporte sólido modificado se describe en la patente US nº 4.458.066. Las sondas se diferencian de los cebadores en que están marcadas con una enzima, tal como la peroxidasa del rábano picante o un átomo radioactivo, tal como ^{32}P, para facilitar su detección. Una sonda sintetizada está radiomarcada por la traducción de la señal utilizando ADN polimerasa I de E. coli o mediante el marcado del extremo utilizando fosfatasa alcalina y la polinucleótido cinasa del bacteriófago T4.

Las sondas de hibridación preferidas comprenden las secuencias oligonucleotídicas que son complementarias con un alargamiento del ADNc monocatenario que codifica una parte de la secuencia de aminoácidos de una NAP purificada procedente de un nemátodo, tal como el anquilostoma, Ancylostoma caninum. Por ejemplo, puede utilizarse una parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (AcaNAP5) [SEC. ID. nº 4] o en la Figura 4 (AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6]). Las sondas de hibridación especialmente preferidas incluyen aquellas en las que su secuencia oligonucleotídica es complementaria con el alargamiento del ADN monocatenario que codifica la secuencia de aminoácidos: Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp [SEC. ID. nº 93]. Dichas sondas de hibridación incluyen la sonda degenerada que presenta la secuencia de oligonucleótidos AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [SEC. ID. nº 94], en la que R es A o G, Y es T o C e i es inosina. Una molécula de ADNc recombinante preferida
que codifica una proteína de la presente invención está identificada por su capacidad para hibridarse con esta sonda.

Las sondas de hibridación preferidas incluyen también el par NAP-1 [SEC. ID. nº 90] y NAP-4.RC [SEC. ID. nº 91] y el par YG109 [SEC. ID. nº 88] e YG103 [SEC. ID. nº 89], describiéndose ambos en los Ejemplos 13 y 12, respectivamente.

En la identificación del clon que contiene el ADNc deseado, se utiliza la ampliación para producir grandes cantidades de un gen que codifica una proteína de la presente invención en forma de molécula de ADNc recombinante.

Los métodos preferidos de ampliación incluyen la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase, p. ej., PCR Technology, W. H. Freeman y Company, Nueva York (edit. Erlich, H. A. 1992). La PCR es un método de ampliación in vitro para la síntesis de secuencias de ADN específicas. En la PCR, se utilizan dos cebadores de oligonucleótido que se hibridan con cadenas opuestas y flanquean la zona de interés en el ADNc del clon. Una serie repetitiva de ciclos que implican la desnaturalización del ADNc en cadenas individuales, la hibridación del cebador con el ADNc monocatenario y la prolongación de los cebadores hibridados mediante ADN polimerasa produce un número de copias de ADNc, cuyos terminales están definidos por los extremos 5’ de los cebadores, duplicándose aproximadamente en cada ciclo. Ibid., pág. 1. Mediante la ampliación por PCR, se obtiene el dominio de codificación y cualquier información codificada del cebador adicional tal como las secuencias de restricción o las señales de traducción (secuencias
señal, codones de iniciación y/o codones de terminación) de la molécula de ADNc recombinante que deben aislarse.

Las condiciones preferidas para la ampliación del ADNc incluyen las que utilizan Taq polimerasa y que implican 30 ciclos de temperatura de 1 minuto a 95ºC; 1 minuto a 50ºC; 1,5 minutos a 72ºC. Los cebadores preferidos incluyen el cebador oligo(dT)-NotI, AATTCGCGGC CGC(T)_{15} [SEC. ID. nº 95], adquirido en Promega Corp. en combinación con (i) el cebador degenerado que presenta la secuencia de oligonucleótidos: AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [SEC. ID. nº 94], en la que R es A o G, Y es T o C e i es inosina, o (ii) el cebador nº 1218 lambda gt11, GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [SEC. ID. nº 96], adquirida en New England Biolabs.

La secuencia de ácido nucleico de una molécula de ADNc recombinante preparada como se da a conocer se determina por métodos basados en el método del dideoxi de Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463 (1977) como se describe con mayor detalle por Messing, et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981).

Las moléculas de ADNc recombinante preferidas preparadas como se describe incluyen las que presentan las secuencias de ácido nucleico de las Figuras 1, 3, 7, 9, 13 y 14.

(2) Utilización de los ADNc de NAP como sondas

Asimismo se prefieren especialmente como sondas de hibridación las secuencias de oligonucleótidos que codifican sustancialmente toda la secuencia de aminoácidos de una NAP purificada del anquilostoma de nemátodo, Ancylostoma caninum. Se prefieren especialmente las sondas que incluyen las procedentes de los genes AcaNAP5 y AcaNAP6 y que presentan las secuencias de ácido nucleico siguientes (gen AcaNAP5): AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GAC TGT GGA ACT CAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AAT GAG GAA CCC CCT GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGC TCA CGT GGT TGT TTA TTA CCT CCT GCT TGC GTA TGC AAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AGG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA [SEC. ID. nº 1], o Figura 3 (gen AcaNAP6): AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GTC TGT GGA ACT AAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AGT GAG GAA GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGA TCA TTT TCT TGT CCG GGT CCC GCT GCT TGC GTA TGC GAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AAG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA [SEC. ID. nº 2].

Las sondas de hibridación preferidas también incluyen las secuencias que codifican una parte sustancial de la secuencia de aminoácidos de una NAP, tal como el fragmento de PCR generado con la pareja de cebador NAP-1 [SEC. ID. nº 90] y NAP-4.RC [SEC. ID. nº 91] como se describe en el Ejemplo 13.

(3) Utilización de la presentación del fago

Se describe en la presente memoria un método para seleccionar los ADNc que codifican las proteínas de la presente invención a partir de bancos de ADNc completos haciendo uso de la tecnología de presentación del fago filamentoso. La tecnología de presentación actual con fago filamentoso se basa en la inserción en el marco de zonas de codificación de interés en el gen 3 o el gen 8 que codifican la proteína de acoplamiento y la proteína de la capa principal del fago, respectivamente. Los expertos en la materia apreciarán que varias dificultades son inherentes en la realización de esto con una amplia mezcla de ADNc de secuencia desconocida y que la forma más práctica de obtener la presentación funcional de los productos de ADNc consistiría en la fusión de los ADNc por su extremo 5’. De hecho, los bancos de ADNc de tamaño suficiente pueden contener varios ADNc que proceden del mismo ARNm pero que están truncados en el terminal 5’ en varias posiciones de manera que algunos de ellos pueden expresarse como productos de fusión. Una estrategia a lo largo de esta línea, que se basa en la capacidad de las cremalleras Jun y Fos de leucina para formar heterodímeros se describió recientemente. Véase, Crameri, R. y Suter, M., Gene, 137:69-75 (1993).

Los inventores han descubierto una nueva alternativa y una forma directa de enlazar por enlace covalente los productos génicos del ADNc a la superficie del fago; el descubrimiento se basa en la observación de que las proteínas fusionadas al terminal C de la proteína 6 de recubrimiento del fago pueden presentarse de forma funcional. Esta observación ha llevado al desarrollo de un sistema de fagómido como se describe en la presente memoria que permite la expresión de productos de ADNc presentados de forma funcional, lo que a su vez permite la selección por afinidad de las partículas del fago que contienen el ADNc requerido para la producción del producto de ADNc presentado. Este sistema proporciona la base para el aislamiento de los ADNc que codifican una proteína de la presente invención. Una vez aisladas, las moléculas de ADNc recombinante que contienen dicho ADNc pueden utilizarse para la expresión de las proteínas de la presente invención en otros sistemas de expresión. Las moléculas de ADNc recombinante preparadas de esta manera se considera que están dentro del alcance de la presente invención.

Las moléculas de ADNc recombinantes de la presente invención se aíslan preparando un banco de ADNc procedente de una fuente natural (como por ejemplo, un nemátodo tal como un anquilostoma), ligando este banco de ADNc a vectores de fagómido apropiados, transformando las células hospedadoras con estos vectores que contienen los ADNc, cultivando las células hospedadoras, infectando las células transformadas con un fago auxiliar apropiado, separando el fago del cultivo de células hospedadoras, separando el fago que expresa una proteína de la presente invención en su superficie, aislando estos fagos y aislando una molécula de ADNc recombinante de dicho fago.

Los vectores de fagómido se construyen utilizando el vector de expresión pUC119 descrito por Vieira, J. y Messing, J., Methods in Enzymology, 153:3-11 (1987). El gen 6 del fago filamentoso que codifica una proteína de la superficie del fago se modifica en sus extremos 5’ y 3’ mediante la adición de las secuencias de restricción HindIII y SfiI, respectivamente, mediante la utilización de tres cebadores transcritos y un cebador complementario utilizando PCR. Esto da como resultado tres fragmentos de ADN que se continúan modificando mediante la adición de sus extremos 3’ de las secuencias de restricción NotI y BamHI por PCR. Después de la digestión por separado de los tres fragmentos de ADN con HindIII y BamHI, los tres fragmentos de ADN se ligan en el pUC119 para dar los vectores de expresión pDONG61, pDONG62 y pDONG63. Estos vectores permiten la inserción de ADNc como fragmentos SfiI-NotI en ellos.

Se preparan bancos de ADNc procedentes de fuentes naturales, tales como nemátodos, tal como se describe en los Ejemplos 2, 9 y 13. Los nemátodos preferidos a partir de los que se preparan dichos bancos incluyen los nemátodos intestinales tales como Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus y Heligmosomoides polygyrus.

Un banco de ADNc tal como los fragmentos SfiI-NotI puede ligarse desde el punto de vista direccional directamente en los vectores de fagómido pDONG61, pDONG62 y pDONG63. Alternativamente, un banco de ADNc que se ha ligado en el vector del fago lamba gt11 como se describe en el Ejemplo 2 puede recuperase por PCR, seguido de aislamiento con electroforesis y a continuación ligadura direccional en estos vectores. En el método último las condiciones preferidas para la PCR utilizan la Taq polimerasa; los cebadores, cebador nº 1218 lambda gt11 que presenta la secuencia GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) [SEC. ID. nº 96] y el cebador oligo(dT)-NotI que presenta la secuencia, AATTCGCGGC CGC(T)_{15}, (Promega Corp.) [SEC. ID. nº 95]; y 20 ciclos de temperatura de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC y 3 minutos a 72ºC, seguidos de 10 minutos a 65ºC.

Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión pDONG que contienen un banco de ADNc. Las células hospedadoras preferidas incluyen cepas de E. coli, siendo especialmente preferida la cepa TG1. Los métodos preferidos para la transformación de células hospedadoras de E. coli incluyen la electroporación.

Las células transformadas se cultivan a 37ºC en medio LB enriquecido con glucosa al 1% y 100 microgramos/ml de carbenicilina hasta que la absorbancia óptica a 600 nm alcanza el valor de 0,5 y a continuación se infectan con el fago auxiliar VCSM13 (Stratagene) a una multiplicidad de infección (moi) de 20.

Los fagos se separan del cultivo por centrifugación, a continuación se purifican por precipitaciones con polietilenglicol/cloruro sódico.

Los fagos que expresan una NAP de la presente invención en su superficie se aíslan aprovechándose de la capacidad de la NAP para unirse a una proteína diana implicada en la coagulación de la sangre, por ejemplo, el Factor Xa.

Los métodos de aislamiento preferidos de dicho fago incluyen un método que comprende las etapas siguientes:

(1)

combinar una solución del factor Xa marcado con biotina con una solución de dicho fago;

(2)

incubar esta mezcla;

(3)

poner en contacto una fase sólida marcada con estreptavidina con esta mezcla;

(4)

incubar la fase sólida con la mezcla;

(5)

separar la fase sólida de la mezcla y poner en contacto la fase sólida con tampón para eliminar el fago no ligado;

(6)

poner en contacto la fase sólida con un segundo tampón para separar el fago ligado de la fase sólida;

(7)

aislar dicho fago;

(8)

transformar las células hospedadoras con dicho fago;

(9)

cultivar las células hospedadoras transformadas;

(10)

infectar las células hospedadoras transformadas con el fago auxiliar VCSM13;

(11)

aislar el fago del cultivo de células hospedadoras; y

(12)

repetir las etapas (1) a (11) cuatro veces más.

Un método especialmente preferido de aislamiento de dicho fago incluye el método detallado en el Ejemplo 10.

Se preparó ADN monocatenario a partir de los fagos aislados y sus inserciones 3’ con el gen 6 del fago filamentoso secuenciado.

La Figura 9 describe la molécula de ADNc recombinante, AcaNAPc2, aislada por el método de presentación del fago. En esta figura se muestra también la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína de la presente invención codificada por AcaNAPc2.

(C) Preparación de la NAP recombinante

Las moléculas de ADNc recombinante de la presente invención cuando se aislan tal como se describe se utilizan para obtener la expresión de las NAP de la presente invención. Generalmente, una molécula de ADNc recombinante de la presente invención se incorpora en un vector de expresión, este vector de expresión se introduce en una célula hospedadora apropiada, se cultiva la célula hospedadora y se aísla la proteína expresada.

Los vectores de expresión son secuencias de ADN que se requieren para la transcripción de las copias clonadas de genes y la traducción de sus ARNm en un hospedador apropiado. Estos vectores pueden expresar genes procarióticos o eucarióticos en una variedad de células tales como bacterias, levaduras, células de mamífero, de plantas y de insectos. Las proteínas pueden expresarse también en numerosos sistemas víricos.

Los vectores de expresión construidos de forma adecuada contienen un origen de replicación para la replicación autónoma en células hospedadoras, o son capaces de integrarse en los cromosomas de la célula hospedadora. Dichos vectores contendrán además marcadores selectivos, un número limitado de secuencias útiles de enzima de restricción, un gran número de copias y activadores potentes. Los activadores son secuencias de ADN que dirigen la ARN polimerasa para unirse al ADN e inician la síntesis de ARN; los activadores potentes dan lugar a dicha iniciación con mucha frecuencia. Los vectores e expresión preferidos de la presente invención están ligados funcionalmente a una molécula de ADNc recombinante de la presente invención, es decir, los vectores son susceptibles de dirigir tanto la replicación de la molécula de ADNc recombinante acoplada como la expresión de la proteína codificada por la molécula de ADNc recombinante. Los vectores de expresión pueden incluir, pero no se limitan a los vectores de clonación, a los vectores de clonación modificados y específicamente a los plásmidos o virus diseñados.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de las proteínas de la presente invención comprenden bacterias, levaduras, células de mamífero, de plantas y de insectos. En cada tipo de célula y especie en esta memoria determinados vectores de expresión son apropiados como se dará a conocer a continuación.

Pueden utilizarse procariotas para la expresión de las proteínas de la presente invención. Las células hospedadoras de bacterias adecuadas incluyen varias cepas de E. coli, Bacillus subtilis, y varias especies de Pseudomonas. En estos sistemas, se utilizan los vectores del plásmido que contienen secuencias de replicación y secuencias de referencia derivadas de especies compatibles con el hospedador. Los vectores adecuados para E. coli son los derivados de pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli por Bolívar et al., Gene, 2:95 (1977). Las secuencias procarióticas de referencia, que se definen en la presente memoria para incluir los activadores para la transcripción, iniciación, opcionalmente con un operador, junto con las secuencias de la zona de unión del ribosoma, incluyen los sistemas activadores de la beta-lactamasa y de la lactosa (Chang et al., Nature, 198:1056 (1977)), el sistema activador del triptófano (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)) y el activador P_{L} derivado de lambda y la zona de fijación al ribosoma del gen N (Shimatake et al., Nature, 292:128 (1981)). Sin embargo, puede utilizarse cualquier sistema activador disponible compatible con los procariotas. Los sistemas de expresión de procariotas preferidos incluyen E. coli y sus vectores de expresión.

Para la expresión de las proteínas de la presente invención pueden utilizarse eucariotas. Los eucariotas están representados normalmente por la levadura y las células de mamífero. Las células hospedadoras de levadura incluyen Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Las células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen las células COS y CHO (ovario de hámster chino).

Los vectores de expresión para los eucariotas están compuestos de activadores procedentes de genes eucarióticos adecuados. Los activadores adecuados para los vectores de expresión de la célula de levadura incluyen activadores para la síntesis de enzimas glucolíticas, incluyendo los que son para el gen de 3-fosfoglicerato cinasa en Saccharomyces cerevisiae (Hitzman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) y los que son para el metabolismo de metanol como el gen de alcohol oxidasa en Pichia pastoris (Stroman et al., patente US nº 4.808.537 y nº: 4.855.231). Otros activadores adecuados comprenden los del gen de enolasa (Holland, M. J. et al., J. Biol. Chem., 256:1385 (1981)) o del gen Leu2 obtenido de YEp13 (Broach, J. et al., Gene, 8:121 (1978)).

Los sistemas de expresión de levadura preferidos incluyen Pichia pastoris y sus vectores de expresión. Los ADNc que codifican a NAP expresados en Pichia pastoris pueden ser mutados opcionalmente para codificar una proteína NAP que incorpora un resto de prolina en el terminal C. En algunos casos la proteína NAP se expresa a un nivel superior y puede ser más resistente a la proteólisis no deseada. Dicho ADNc, y su expresión en Pichia pastoris, se describe en el Ejemplo 17.

Los activadores adecuados para los vectores de expresión de células de mamífero incluyen los activadores precoces y tardíos de SV40 (Fiers, et al., Nature, 273:113 (1978)) u otros activadores víricos tales como los derivados de polioma, adenovirus II, papilomavirus bovino o los virus del sarcoma aviar. Los potenciadores víricos y de mamífero adecuados pueden incorporarse también en estos vectores de expresión.

Los activadores adecuados para los vectores de expresión de células vegetales incluyen el activador de la síntesis de nopalina descrito por Depicker, A. et al., Mol. Appl. Gen., 1:561 (1978).

Los activadores adecuados para los vectores de expresión de células de insectos incluyen versiones modificadas del sistema descrito por Smith et al., patente US nº 4.745.051. El vector de expresión comprende un activador de polihedrina de baculovirus bajo cuyo control puede colocarse una molécula de ADNc que codifica una proteína.

Las células hospedadoras se transforman mediante la introducción de vectores de expresión de la presente invención en las mismas. La transformación se realiza utilizando técnicas normalizadas apropiadas para cada tipo de célula. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio descrito en Cohen, S. N., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1972), o el método de RbCl descrito en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pág. 254, Cold Spring Harbor Press (1982) se utiliza para las células procariotas u otras que contienen barreras sustanciales de la pared celular. La transformación de levadura se realiza como se describe en Van Solingen, P. et al., J. Bacter., 130:946 (1977) y Hsiao, C. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3829 (1979). Se transforman células de mamífero sin mucha pared celular utilizando el procedimiento de fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:546 (1978). Las células vegetales se transforman por infección con Agrobacterium tumefaciens como se describe en Shaw, C. et al., Gene, 23:315 (1983). Los métodos preferidos de transformación de E. coli y Pichia pastoris con vectores de expresión incluyen la electroporación.

Se cultivan células hospedadoras transformadas en condiciones, tales como el tipo de medio, temperatura, contenido en oxígeno, movimiento del fluido, etc., bien conocidas en las técnicas biológicas.

Se aíslan proteínas recombinantes de la presente invención de la célula hospedadora o del medio por métodos normalizados bien conocidos en las técnicas bioquímicas, que incluyen la utilización de métodos cromatográficos. Los métodos preferidos de purificación incluirían la cromatografía secuencial de un extracto a través de columnas que contienen la matriz de intercambio anión-iónico Poros20 HQ o la matriz de intercambio catiónico Poros20 HS, la matriz de filtración del gel Superdex30 y una matriz en fase inversa C18. Las fracciones recogidas después de dicha columna cromatográfica pueden seleccionarse por su capacidad para aumentar el tiempo de coagulación del plasma humano, medido mediante los ensayos PT y aPTT o su capacidad para inhibir la actividad amidolítica del factor Xa en un análisis colorimétrico, o la demostración de la actividad en cualquiera de los otros ensayos descritos en la presente memoria. Ejemplos de métodos preferidos de purificación de una proteína recombinante de la presente invención son los dados a conocer en los Ejemplos 3, 4, 6, 8, 14 y 15.

4. Métodos de utilización de NAP

En un aspecto, la presente invención incluye métodos de recogida de plasma de mamífero de manera que la coagulación de dicho plasma está inhibida, que comprenden la adición a un tubo de recogida de sangre de una cantidad de una proteína de la presente invención suficiente para inhibir la formación de un coágulo cuando la sangre de mamífero se extrae en el tubo, añadiendo sangre de mamífero a dicho tubo, separando los glóbulos rojos de la sangre del plasma del mamífero y recogiendo el plasma del mamífero.

Los tubos de recogida de sangre incluyen los tubos de ensayo con tapón que tienen un vacío en los mismos como medio para extraer la sangre obtenida por punción venosa en los tubos. Los tubos de ensayo preferidos incluyen los que son de vidrio de borosilicato, y tienen las dimensiones de, por ejemplo, 10,25 \times 47 mm, 10,25 \times 50 mm, 10,25 \times 64 mm, 10,25 \times 82 mm, 13 \times 75 mm, 13 \times 100 mm, 16 \times 75 mm, 16 \times 100 mm o 16 \times 125 mm. Los tapones preferidos incluyen los que pueden pincharse fácilmente con una aguja de extracción de sangre y que cuando se colocan en el tubo de ensayo proporcionan un sello suficiente para impedir la fuga de aire en el tubo.

Las proteínas de la presente invención se añaden a los tubos de recogida de sangre en varias formas bien conocidas en la materia, tales como una composición líquida de las mismas, una composición sólida de las mismas, o una composición líquida que está liofilizada hasta un sólido en el tubo. La cantidad añadida a dichos tubos es la cantidad suficiente para inhibir la formación de un coágulo cuando se extrae sangre del mamífero en el tubo. Las proteínas de la presente invención se añaden a los tubos de recogida de sangre en cantidades tales que, cuando se combinan con 2 a 10 ml de sangre de mamífero, la concentración de tales proteínas será suficiente para inhibir la formación del coágulo. Típicamente, esta concentración eficaz será aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000 nM, siendo preferida de 10 a 1.000 nM. Alternativamente, pueden añadirse proteínas de la presente invención a dichos tubos en combinación con otros aditivos inhibidores del coágulo, tales como sales de heparina, sales de EDTA, sales de citrato o sales de oxalato.

Una vez extraída la sangre del mamífero en un tubo de recogida de sangre que contiene una proteína de la presente invención o la misma en combinación con otros aditivos inhibidores del coágulo, los glóbulos rojos de la sangre se separan del plasma del mamífero por centrifugación. La centrifugación se realiza a fuerzas de g, temperaturas y tiempos bien conocidos en las técnicas sanitarias. Las condiciones típicas para la separación del plasma de los glóbulos rojos de la sangre incluyen la centrifugación a una fuerza centrífuga entre aproximadamente 100\timesg y aproximadamente 1.500\timesg, a unas temperaturas entre aproximadamente 5 y aproximadamente 25ºC, y durante un tiempo entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 minutos.

El plasma de mamífero puede recogerse vertiéndolo en un recipiente separado, sacándolo en una pipeta o por otros medios bien conocidos por los expertos en las técnicas sanitarias.

En otro aspecto, la presente invención incluye métodos para prevenir o inhibir la trombosis (formación del coágulo) o la coagulación de la sangre en un mamífero, que comprenden la administración a dicho mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína o de una composición farmacéutica de la presente invención.

Las proteínas o las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran in vivo, normalmente en un mamífero, preferentemente en un ser humano. Empleándolas in vivo, las proteínas o las composiciones farmacéuticas pueden administrarse a un mamífero en varias formas, incluyendo por vía oral, parenteral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, por el colon, por vía rectal, nasal o intraperitoneal, empleando varias formas galénicas. La administración es preferentemente parenteral, tal como intravenosa a diario. Alternativamente, la administración es preferentemente oral, tal como mediante comprimidos, cápsulas o elixires tomados a diario. Al poner en práctica los métodos de la presente invención, las proteínas o las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran solas o en combinación una con otra, o en combinación con otro agente terapéutico o en agentes de diagnóstico in vivo.

Como resulta evidente para un experto en la técnica sanitaria, una cantidad terapéuticamente eficaz de las proteínas o composiciones farmacéuticas de la presente invención oscilará dependiendo de la edad, peso y de la especie de mamífero tratada, de las proteínas específicas empleadas, del modo concreto de administración y de los efectos deseados y la indicación terapéutica. Debido a que estos factores y su relación para determinar esta cantidad son bien conocidos en las técnicas sanitarias, la determinación de las concentraciones de dosificación terapéuticamente eficaz, la cantidad necesaria para conseguir el resultado necesario de la prevención de la trombosis, estarán comprendidas dentro del ámbito de un experto en estas técnicas.

Típicamente, la administración de las proteínas o de la composición farmacéutica de la presente invención comienza a las concentraciones de dosificación inferiores, aumentándose las concentraciones de dosificación hasta que se consiga el efecto deseado de prevención de la trombosis in vivo que definiría una cantidad terapéuticamente eficaz. Para las proteínas de la presente invención, solas o como parte de una composición farmacéutica, dichas dosis están comprendidas entre aproximadamente 0,01 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 0,01 y 10 mg/kg de peso corporal.

5. Utilidad

Las proteínas de la presente invención cuando se preparan y se seleccionan como se da a conocer son útiles como inhibidores potentes de la coagulación sanguínea in vitro e in vivo. Como tales, estas proteínas son útiles como reactivos de diagnóstico in vitro para impedir la coagulación de la sangre y también son útiles como agentes farmacéuticos in vivo para impedir o inhibir la trombosis o la coagulación de la sangre en los mamíferos.

Las proteínas de la presente invención son útiles como reactivos de diagnóstico in vitro para inhibir la coagulación en tubos de extracción de sangre. La utilización de tubos de ensayo con tapón con vacío en los mismos como medio para extraer la sangre obtenida por punción venosa en los tubos es bien conocida en las técnicas sanitarias. Kasten, B. L., "Specimen Collection", Laboratory Test Handbook, 2ª edición, Lexi-Comp. Inc., Cleveland págs. 16-17 (edits. Jacobs, D. S. et al. 1990). Dichos tubos con vacío pueden estar exentos de aditivos para la inhibición del coágulo, en cuyo caso, son útiles para el aislamiento del suero del mamífero de la sangre. Alternativamente pueden contener aditivos para la inhibición del coágulo (tales como sales de heparina, sales de EDTA, sales de citrato o sales de oxalato), en cuyo caso, son útiles para el aislamiento del plasma de mamífero de la sangre. Las proteínas de la presente invención son potentes inhibidores de la coagulación sanguínea y como tales, pueden incorporarse en los tubos de recogida de sangre para impedir la coagulación de la sangre del mamífero extraída en los mismos.

Las proteínas de la presente invención se utilizan solas, en combinación con otras proteínas de la presente invención, o en combinación con otros inhibidores de coagulación conocidos, en tubos de recogida de sangre, por ejemplo, con sales de heparina, sales de EDTA, sales de citrato o sales de oxalato.

La cantidad que debe añadirse a dichos tubos, o cantidad eficaz, es la cantidad suficiente para inhibir la formación de un coágulo de sangre cuando se extrae sangre del mamífero en el tubo. Las proteínas de la presente invención se añaden a los tubos de recogida de sangre en cantidades tales que, cuando se combinan con 2 a 10 ml de sangre de mamífero, la concentración de dichas proteínas será suficiente para inhibir la formación de coágulos sanguíneos. Típicamente, esta cantidad eficaz es la requerida para dar una concentración final en la sangre de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000 nM, prefiriéndose de 10 a 1.000 nM.

Las proteínas de la presente invención pueden utilizarse también para preparar composiciones para diagnóstico. En una forma de realización, se preparan composiciones para diagnóstico disolviendo las proteínas de la presente invención en vehículos aceptables para diagnóstico, vehículos que incluyen solución salina tamponada con fosfato (fosfato sódico 0,01 M + cloruro sódico 0,15 M, pH 7,2 o solución salina tamponada con Tris (Tris-HCl 0,05 M + cloruro sódico 0,15 M, pH 8,0). En otra forma de realización, las proteínas de la presente invención pueden mezclarse con otros portadores sólidos aceptables para el diagnóstico por los métodos bien conocidos en la materia para proporcionar composiciones composiciones sólidas para diagnóstico. Estos portadores incluyen las sales de tampón.

La adición de las proteínas de la presente invención a los tubos de recogida de sangre puede realizarse por métodos bien conocidos en la materia, métodos que incluyen la introducción de una composición líquida de diagnóstico de las mismas, una composición sólida de diagnóstico de las mismas o una composición líquida de diagnóstico que está liofilizada en dichos tubos hasta un tampón sólido de una composición de diagnóstico sólida.

La utilización de los tubos de recogida de sangre que contienen las composiciones de diagnóstico de la presente invención comprende poner en contacto una cantidad eficaz de dicha composición de diagnóstico con la sangre de mamífero extraída en el tubo. Típicamente, cuando se extrae una muestra de 2 a 10 ml de sangre de mamífero en un tubo de recogida de sangre y se pone en contacto con dicha composición de diagnóstico en el mismo; la cantidad eficaz que debe utilizarse incluirá las concentraciones de las proteínas formuladas como composición de diagnóstico que en la muestra de sangre son suficientes para inhibir la formación de coágulos sanguíneos. Las concentraciones eficaces preferidas deberían ser aproximadamente de 1 a 10.000 nM, prefiriéndose específicamente de 10 a 1.000 nM.

Según un aspecto alternativo de la invención, las proteínas de la presente invención son también útiles como agentes farmacéuticos para prevenir o inhibir la trombosis o la coagulación de la sangre en un mamífero. Esta prevención o inhibición de la trombosis o de la coagulación sanguínea comprende la prevención o la inhibición de la trombosis anormal.

Las condiciones caracterizadas por la trombosis anormal son bien conocidas en las técnicas sanitarias e incluyen las que involucran al sistema vascular arterial y venoso de los mamíferos. Con respecto al sistema vascular de la arteria coronaria, la trombosis anormal (formación del trombo) se caracteriza por la rotura de una placa aterosclerótica creada que es la principal causa de infarto de miocardio agudo y de la angina de pecho inestable, y caracteriza asimismo la formación del trombo oclusivo coronario resultante de la terapia trombolítica o de la angioplasia coronaria transluminal percutánea (PTCA). Con respecto al sistema vascular venoso, la trombosis anormal caracteriza la enfermedad observada en los pacientes que se someten a cirugía importante en las extremidades inferiores o en la zona abdominal quienes padecen con frecuencia de la formación de trombo en el sistema vascular venoso que da como resultado la circulación sanguínea reducida en la extremidad afectada y una predisposición a la embolia pulmonar. La trombosis anormal caracteriza además la coagulopatía intravascular diseminada que se produce normalmente en ambos sistemas vasculares durante el choque séptico, determinadas infecciones víricas y el cáncer, una enfermedad en la que existe un consumo rápido de los factores de coagulación y la coagulación generalizada que produce la formación de trombos con riesgo para la vida que se producen en todo el sistema capilar lo que conduce a la insuficiencia orgánica
diseminada.

Las proteínas NAP de la presente invención son también inmunógenos útiles contra los que se producen anticuerpos. Los anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales, dirigidos contra una NAP son útiles a título de diagnóstico y para la identificación de los niveles de concentración de NAP en varios fluidos biológicos. Como ensayo de diagnóstico puede emplearse inmunoanálisis que utiliza estos anticuerpos, tal como para detectar la infección de un mamífero hospedador mediante un gusano parásito en un tejido del mamífero hospedador. También, puede utilizarse dicho inmunoanálisis en la detección y aislamiento de NAP de los homogenizados del tejido, células clonadas y similares.

Puede utilizarse NAP, con adyuvantes adecuados, como una vacuna contra las infecciones por gusano parásito en mamíferos. La inmunización con la vacuna de NAP puede utilizarse tanto en la profilaxis como en la terapia de infecciones parasitarias. Las enfermedades producidas por gusanos parásitos pueden ser tratadas administrando anticuerpo anti-NAP a un animal infectado por estos parásitos.

Las proteínas NAP de la presente invención con actividad inhibidora de serina proteasa son también útiles en condiciones o análisis en los que se desea la inhibición de la serina proteasa. Por ejemplo, las proteínas NAP que inhiben la tripsina o elastasa de la serina proteasa son útiles para el tratamiento de la pancreatitis aguda o de la respuesta inmunitaria aguda mediada por leucocitos, respectivamente.

Las moléculas de ADNc recombinante que codifican las proteínas de la presente invención son útiles en un aspecto para aislar otras moléculas de ADNc recombinante que también codifican las proteínas de la presente invención. En otro aspecto, son útiles para la expresión de las proteínas de la presente invención en células hospedadoras.

Las sondas nucleotídicas de la presente invención son útiles para identificar y aislar las NAP que codifican el ácido nucleico procedentes de nemátodos o de otros organismos. Además, las sondas nucleotídicas son reactivos para diagnóstico útiles para detectar la presencia de ácido nucleico que codifica el nemátodo en una muestra, tal como un fluido o tejido corporal de un mamífero sospechoso de infección por nemátodos. Las sondas pueden utilizarse directamente, con nivel apropiado de detección, para detectar la presencia del ácido nucleico del nemátodo, o pueden utilizarse de manera más indirecta, tal como en la reacción del tipo PCR, para ampliar el ácido nucleico del nemátodo que puede estar presente en la muestra para su detección. Las condiciones de dichos métodos y los análisis de diagnóstico están fácilmente disponibles en la técnica.

Para ayudar a la comprensión, la presente invención se ilustrará a continuación con mayor detalle mediante los ejemplos siguientes.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de la nueva proteína anticoagulante (NAP) de Ancylostoma caninum (A) Preparación del lisado de Ancylostoma caninum

Se adquirieron anquilostomas caninos congelados, Ancylostoma caninum, en Antibody Systems (Bedford, TX). Se almacenaron los anquilostomas a -80ºC hasta ser utilizados para homogeneizar.

Se congelaron los anquilostomas en nitrógeno líquido y se molieron en un mortero seguido de una homogenización en hielo en tampón de homogeneización utilizando un homogenizador PotterS con un pistón de teflón (B. Braun Melsungen AG, Alemania). El tampón de homogenización contenía: Tris-HCl 0,02 M, pH 7,4, NaCl 0,05 M, MgCl_{2} 0,001 M, CaCl_{2} 0,001 M, inhibidor de E-64 proteasa 1,0 \times 10^{-5} M (Boehringer Mannheim, Alemania), pepstatina A 1,0 \times 10^{-5} M (ácido isovaleril-Val-Val-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanoil-Ala-4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, ICN Biomedicals, CA), quimiostatina 1,0 \times 10^{-5} M (Boehringer), leupeptina 1,0 \times 10^{-5} M (ICN), AEBSF (fluoruro de 4-(2-aminoetil)-bencensulfonilo, ICN) 5 \times 10^{-5} M y glicerol al 5% (v/v). Se utilizaron aproximadamente 4 ml de tampón de homogenización para homogenizar cada gramo de gusanos congelados (aproximadamente 500 gusanos). Se sedimentó el material insoluble mediante dos etapas de centrifugación sucesivas: 19.000 \times g_{máx} a 4ºC durante 30 minutos seguido de 110.000 \times g_{máx} a 4ºC durante 40 minutos. Se clarificó la solución sobrenadante por pasadas a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 micrómetros (Corning, NY) para dar el lisado de Ancylostoma caninum.

(B) Cromatografía en Sepharose concanavalina A

Se absorbió el lisado de Ancylostoma caninum (100 ml) en 22 ml de Sepharose concanavalina A (Pharmacia, Suecia) preequilibrada con tampón Con A (Tris-HCl 0,01 M, pH 7,4, NaCl 1 M, CaCl_{2} 0,002 M) cargándolo en una columna de 1,6 \times 11 cm de este gel a un caudal de 3 ml/minuto (90 cm/hora). Se mantuvo la columna a temperatura ambiente mientras se mantenía el depósito de lisado a la temperatura del baño de hielo a lo largo del procedimiento. Se lavó la columna posteriormente con 2 volúmenes de columna de tampón Con A. Se recogieron el flujo a través de la columna y el lavado (aproximadamente 150 ml) y se almacenaron a -80ºC hasta realizar el tratamiento posterior.

(C) Cromatografía de intercambio aniónico

El flujo a través y el lavado de la columna de concanavalina A Sepharose se tamponó añadiendo acetato sódico sólido hasta una concentración final de 12,5 mM. Se redujo la conductividad por dilución con agua milliQ y se ajustó el pH con HCl a pH 5,3. El precipitado formado durante el ajuste de pH se sedimentó por centrifugación a 15.000 \times g_{máx} a 4ºC durante 15 minutos. Se clarificó la solución sobrenadante por pasadas a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 micrómetros (Corning, NY).

Esta solución clarificada (volumen total aproximadamente de 600 ml) se cargó en una columna Poros20 HQ (Perseptive Biosystems, MA) de 1 \times 2 cm preequilibrada con tampón Anion (acetato Na 0,05 M, pH 5,3, NaCl 0,1 M) a un caudal de 10 ml/minuto (800 cm/hora). La columna y la solución añadida estaban a temperatura ambiente durante esta etapa de purificación. La columna se lavó posteriormente con 10 volúmenes de columna de tampón Anion.

El material que presentaba actividad inhibidora, detectado tras el procedimiento siguiente, en el ensayo amidolítico con factor Xa se eluyó con tampón Cation que contenía NaCl 0,55 M a un caudal de 5 ml/minuto (400 cm/hora).

Se ensayó una muestra de la solución en un ensayo amidolítico con factor Xa de la forma siguiente. Se prepararon mezclas de reacción (150 microlitros) en placas de 96 pocillos que contenían factor Xa y varias diluciones de la muestra en tampón de análisis (Tris-HCl 100 mM, pH 7,4; NaCl 140 mM; BSA al 0,1%). El factor X humano se adquirió en los Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN, USA) y se activó con veneno de víbora de Russell utilizando el procedimiento de Bock, P. E., Craig, P. A., Olson, S. T. y Singh P., Arch. Biochem. Biophys., 273:375-388 (1989). Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, se iniciaron las reacciones enzimáticas mediante la adición de 50 microlitros de una solución 1 mM de sustrato en agua (dihidrocloruro de p-nitroanilida de N-alfa-benciloxicarbonil-D-arginil-L-glicil-L-arginina; S-2765; Chromogenix, Mölndal, Suecia) para dar concentraciones finales de factor Xa 0,2 nM y S-2765 0,25 mM. La hidrólisis del sustrato se controló por medición continua de la absorbancia a 405 nm utilizando un lector de placas cinético Vmáx (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA).

(D) Tratamiento térmico

Se neutralizó la mitad de la mezcla de elución de NaCl 0,55 M (3 ml) de la cromatografía por intercambio aniónico añadiendo Tris-HCl 1 M, pH 7,5 hasta una concentración final de 50 mM, se incubó durante 5 minutos a 90ºC en un tubo de vidrio y se enfrió rápidamente en hielo posteriormente. El material insoluble se sedimentó por centrifugación a 19.000 \times g_{máx} a 4ºC durante 20 minutos. El sobrenadante contenía material que inhibió el factor Xa en el ensayo amidolítico del factor Xa. Después de este tratamiento térmico tras el recuento por dilución, se recuperó aproximadamente el 89% de la actividad inhibidora del factor Xa en el sobrenadante.

(E) Cromatografía de tamices moleculares utilizando Superdex30 (alternativa para la etapa de tratamiento térmico)

La mitad de la mezcla de elución con NaCl 0,55 M (3 ml) de la cromatografía de intercambio aniónico se cargó en una columna Superdex30 PG (Pharmacia, Suecia) de 1,6 \times 66 cm preequilibrada con fosfato sódico 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M a 24ºC. La cromatografía se realizó a un caudal de 2 ml/minuto. La actividad inhibidora del factor Xa (determinada en el ensayo amidolítico del factor Xa) eluyó 56 a 64 ml en la serie (K_{av} de 0,207). Este volumen de elución sería de esperar para una proteína globular con una masa molecular de 14.000 daltons.

(F) Cromatografía en fase inversa

El lisado de anquilostoma que se fraccionó por cromatografía en Concanavalina A Sepharose, intercambio aniónico y Superdex30 (o en la etapa de tratamiento térmico alternativo) se cargó en una columna C18 de 0,46 \times 25 cm (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) que se desarrolló a continuación con un gradiente lineal de acetonitro del 10 al 35% en ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v) a un caudal de 1 ml/minuto con una tasa de intercambio de 0,625% en acetonitrilo/minuto. La actividad inhibidora de FXa (determinada en el ensayo amidolítico del factor Xa) eluyó en acetonitrilo aproximadamente al 30%. Se realizaron series de HPLC en una Vista 5500 conectada con un detector Polychrom 9600 ajustado a 215 nm (Varian, CA). Las señales del detector se integraron en un integrador 4290 adquirido en la misma compañía. Las fracciones que contienen actividad inhibidora del factor Xa se secaron al vacío y a continuación se redisolvieron en PBS (fosfato sódico 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M).

Estas fracciones se agruparon y a continuación se cargaron en una columna C18 de 0,46 \times 25 cm (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) que se desarrolló con un gradiente lineal de acetonitrilo del 10 al 35% en ácido trifluoroacético al 0,1% a un caudal de 1 ml/minuto con una velocidad más lenta de intercambio del 0,4% en acetonitrilo/minuto. Las actividades inhibidores del factor Xa que contienen fracciones se agruparon y se secaron al vacío posteriormente.

(G) Determinación del peso molecular de NAP en Ancylostoma caninum

Se determinó la masa estimada para la NAP aislada como se describe en este ejemplo utilizando espectrometría de masas con ionización por electroatomización.

Un sedimento de NAP secado al vacío se disolvió en acetonitrilo al 50% (v/v) y ácido fórmico al 1% (v/v). Se realizó el análisis de masas utilizando un VG Bio-Q (Fisons Instruments, Manchester UK).

Se bombeó la muestra de NAP a través de un capilar y en su punta se aplicó un alto voltaje de 4 kV. Bajo la influencia del campo eléctrico elevado, se atomizó la muestra en gotitas que contenían las moléculas de proteína. Con la ayuda del efecto de secado de un gas neutro (N_{2}) a 60ºC, las gotitas se redujeron más de tamaño hasta que todo el disolvente se había evaporado y únicamente quedaban especies de proteína en forma gaseosa. Surgió una población de especies de proteína que se diferenciaba de las demás en una carga. Con un analizador de cuadrupolo, se detectaron los diferentes valores de Da/e (masa/carga). La calibración del instrumento se realizó utilizando mioglobina de corazón de caballo (Sigma, Missouri).

La masa estimada de la NAP aislada descrita en los apartados A, B, C, D y F de este ejemplo es de 8.734,60 daltons. La masa estimada de la NAP natural aislada se describe en los apartados A, B, C, E y F es de 8.735,67 daltons.

(H) Secuencias de aminoácidos de NAP de Ancylostoma caninum

La determinación de aminoácidos se realizó en un secuenciador de proteína/péptido equipado con un analizador On Board Microgradient PTH y el sistema de análisis de datos modelo 610A (Applied Biosystems, CA). La cuantificación de los residuos se realizó mediante análisis en línea en el ordenador del sistema (Applied Biosystems, CA). La asignación del residuo se realizó por análisis visual de los cromatogramas de HPLC. Se determinó que los veinte primeros aminoácidos del terminal amino de la NAP natural eran los siguientes:

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp Cys Gly Thr Gln Lys Pro [SEC. ID. nº 97].

Los restos de cisteína no se detectaron directamente en este análisis porque la muestra no estaba reducida y posteriormente alquilada. Las cisteínas se asignaron a las posiciones en las que no se identificó ningún aminoácido específico.

Ejemplo 2 Clonación y secuenciado de NAP de Ancylostoma caninum (A) Preparación de la sonda de hibridación

Los clones de ADNc completo que codifican a NAP se aislaron por cribado de un banco de ADNc, preparado a partir del ARNm aislado del nemátodo, Ancylostoma caninum, con un oligonucleótido degenerado radiomarcado cuya secuencia estaba basada en los primeros once aminoácidos del terminal amino de NAP de A. caninum:

Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp [SEC. ID. nº 93].

La sonda de hibridación del oligonucleótido de 33 monómeros, denominada YG99, presentó la secuencia siguiente:

AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [SEC. ID. nº 94]

en la que "R" se refiere a A o G; "Y" se refiere a T o C; e "i" se refiere a inosina. Se radiomarcó YG99 por fosforilación del terminal 5’-enzimática (kit de marcado del extremo 5’; Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) utilizando gamma-^{32}P-ATP (actividad específica >7.000 Ci/mmoles; ICN, Costa Mesa, CA, USA) y se pasó posteriormente sobre una columna NAP^{TM}10 (Pharmacia, Uppsala, Suecia).

(B) Preparación del banco de ADNc

Se construyó un banco de ADNc utilizando los procedimientos descritos (protocolos de Promega y guía de aplicaciones 2ª ed.; Promega Corp., Madison, WI, USA).

Se adquirieron anquilostomas adultos, Ancylostoma caninum, en Antibody Systems (Bedford, TX). Se preparó poli(A+) ARN utilizando el kit de purificación de ARNm QuickPrep (Pharmacia). Aproximadamente 3 microgramos de ARNm se transcribieron a la inversa utilizando un cebador/adaptador oligo(dT)-NotI, AATTCGCGGCCGC(T)_{15}
[SEC. ID. nº 95], (Promega Corp.) y transcriptasa inversa de AMV (virus de la mieloblastosis aviar) (Boehringer Mannheim, Alemania). Las enzimas utilizadas para la síntesis del ADNc de doble cadena fueron las siguientes: ADN polimerasa I de E. coli y RNasaH de Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) y ADN polimerasa de T4 de Pharmacia.

Se ligaron enlazadores de EcoRI (pCGGAATTCCG) [SEC. ID. nº 98] en el ADNc obtenido después del tratamiento con EcoRI metilasa (RiboClone EcoRI Linker Ligation System; Promega).

Se digirieron los ADNc con NotI y EcoRI, se pasaron sobre un gel de agarosa al 1,5% (se eluyó todo el material en cantidad considerable utilizando el protocolo Geneclean, BIO101 Inc., La Jolla, CA), y se ligó en una dirección en los ramales EcoRI-NotI del vector lambda gt11 Sfi-NotI (Promega). Tras el encapsulado in vitro (GigapackII-Gold, Stratagene, La Jolla, CA) se obtuvieron fagos recombinantes infectando la cepa Y1090 (Promega).

La utilidad del banco de ADNc fue demostrada por análisis PCR (Taq polimerasa de Boehringer; 30 ciclos de temperatura: 1 minutos a 95ºC; 1 minuto a 50ºC; 3 minutos a 72ºC) de un número de clones seleccionados al azar utilizando el cebador lambda gt11 nº 1218, que prsenta la secuencia, GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) [SEC. ID. nº 96]; secuencias de direccionamiento situadas corriente arriba de la inserción del ADNc) en combinación con el cebador/adaptador oligo(dT)-NotI mencionado anteriormente; la mayoría de los clones se descubrió que contenían inserciones de ADNc de tamaño variable.

(C) Identificación de clones

Se cribaron aproximadamente 1\times10^{6} clones de ADNc (los filtros elevadores de placa se prepararon por duplicado utilizando Hybond^{TM}-N; Amersham) con el oligonucleótido YG99 radiomarcado utilizando las condiciones de prehibridación e hibridación siguientes: 5\times SSC (SSC: NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM), 5\times solución de Denhardt, SDS al 0,5%, 100 microgramos/ml de ADN de esperma de pescado tratado con ultrasonidos (Boheringer) durante la noche a 42ºC. Se lavaron los filtros 4 veces en 2\times SSC, SDS al 0,1% a 37ºC. Tras la exposición (aproximadamente 72 horas) a película de rayos X, se identificaron un total de entre 350 y 500 puntos de hibridación.

Veinticuatro clones positivos, denominados NAP1 a NAP24, se sometieron a una segunda ronda de hibridación a una densidad de placa inferior; excepto para NAP24, se identificaron las placas individuales que contenían una población homogénea de fago lambda. Los clones retenidos se analizaron mediante ampliaciones por PCR (Taq polimerasa de Boehringer; 30 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95ºC; 1 minuto a 50ºC; 1,5 minutos a 72ºC) utilizando el cebador oligo(dT)-NotI (AATTCGCGGC CGC(T)_{15}) [SEC. ID. nº 95] en combinación con (i) YG99 o (ii) el cebador nº 1218 lambda gt11. La mayoría de los clones (20 de 23) proporcionaron un fragmento de aproximadamente 400 bp cuando se utilizó el conjunto del cebador oligo(dT)-NotI/YG99 y un fragmento de aproximadamente 520 bp cuando se utilizó la pareja de cebadores oligo(dT)-NotI/nº 1218. Se caracterizaron además diecinueve de dichos posibles clones completos.

Las inserciones de ADNc de cinco clones se subclonaron como fragmentos SfiI-NotI tanto en pGEM-5zf(-) como en pGEM-9zf(-) (Promega). Debido a que las secuencias SfiI de lambda gt11 y pGEM-5zf(-) no son compatibles entre sí, la clonación de este vector requirió la utilización de un pequeño fragmento adaptador obtenido tras la hibridación de los dos oligonucleótidos fosforilados en el extremo 5’ siguientes: pTGGCCTAGCG tcaggagt [SEC. ID. nº 99] y pCCTGACGCTA GGCCATGG [SEC. ID. nº 100]. Tras la preparación del ADN monocatenario, se determinaron las secuencias de estos ADNc por el método de la terminación de la cadena didesoxi utilizando el cebador nº 1233 que presenta la secuencia, AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGA (New England Biolabs) [SEC. ID. nº 101]. Se descubrió que los cinco clones eran completos incluyendo una señal de secreción completa. Se descubrió que los clones NAP5, NAP7 y NAP22 tenían una zona de codificación idéntica. Los clones NAP6 y NAP11 son también idénticos pero se diferencian de los del tipo NAP5 de la zona de codificación. La Figura 1 describe la secuencia nucleotídica del gen de NAP5 y la Figura 2 describe la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada, AcaNAP5. Asimismo, la Figura 3 describe la secuencia nucleotídica del gen de NAP6 [SEC. ID. nº 5] y la Figura 4 describe la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada, AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6].

Otros catorce posibles clones completos se sometieron a un análisis de restricción. El producto de PCR de 400 bp mencionado anteriormente obtenido con el par cebador YG99/oligo(dT)-NotI, se digirió con cuatro enzimas diferentes capaces de discriminar entre el tipo NAP5 y NAP6 del clon: Sau96I, Sau3AI, DdeI y HpaII. Los resultados eran coherentes con 10 de cada 14 clones que son del tipo NAP5 (p. ej. NAP4, NAP8, NAP9, NAP15, NAP16, NAP17, NAP18, NAP20, NAP21 y NAP23) mientras que los cuatro restantes eran del tipo NAP6 (p. ej. NAP10, NAP12, NAP14 y NAP19).

Estos clones se renombraron para reflejar el origen de Ancylostoma caninum colocando las letras Aca inmediatamente antes de la denominación de NAP. Por ejemplo, NAP5 se convierte en AcaNAP5, NAP6 se convierte en AcaNAP6 y así sucesivamente.

Ejemplo 3 Producción y purificación de AcaNAP5 recombinante en P. pastoris (A) Construcción del vector de expresión

El sistema de expresión de la levadura Pichia pastoris, que incluye el vector lanzadera E. coli / P. pastoris, pHILD2 ha sido descrito en numerosas patentes de Estados Unidos. Véase, p. ej., las patentes US nº 5.330.901; nº 5.268.273; nº 5.204.261; nº 5.166.329; nº 5.135.868; nº 5.122.465; nº 5.032.516; nº 5.004.688; nº 5.002.876; nº 4.895.800; nº 4.885.242; nº 4.882.279; nº 4.879.231; nº 4.857.467; nº 4.855.231; nº 4.837.148; nº 4.818.700; nº 4.812.405; nº 4.808.537; nº 4.777.242; y nº 4.683.293.

El vector pYAM7SP8 utilizado para dirigir la expresión y secreción de AcaNAP5 recombinante en P. pastoris era un derivado del plásmido pHILD2 (Despreaux, C. W. y Manning, R. F., Gene 131: 35-41 (1993)), que presenta la misma estructura general. Además de los elementos de transcripción y recombinación de pHILD2 requeridos para la expresión y la integración cromosómica en P. pastoris (véase Stroman, D. W. et al., put 4.855.231), este vector contenía una secuencia principal prepro híbrida insertada corriente abajo del activador de la alcohol oxidasa (AOX1). La secuencia principal prepro consistía en la señal de secreción de la fosfatasa ácida (PHO1) de P. pastoris condensada con una pro-secuencia sintética de 19 aminoácidos. Esta pro-secuencia era una de las dos pro-secuencias de 19 aminoácidos diseñada por Clements et al., Gene 106: 267-272 (1991) basándose en la secuencia principal del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae. Modificada genéticamente inmediatamente corriente abajo de la secuencia principal prepro había una secuencia de multiclonación sintética con secuencias de reconocimiento para las enzimas StuI, SacII, EcoRI, BglII, NotI, XhoI, SpeI y BamHI para facilitar la clonación de genes extraños. NAP tal como se expresa en pYAM7SP8 en Pichia pastoris se tradujo en primer lugar como prepro-producto y fue procesada posteriormente por la célula hospedadora para eliminar las pre- y pro- secuencias.

La estructura de este vector se presenta en la Figura 12. La secuencia señal (S) presenta la secuencia de ácido nucleico: ATG TTC TCT CCA ATT TTG TCC TTG GAA ATT ATT TTA GCT TTG GCT ACT TTG CAA TCT GTC TTC GCT [SEC. ID. nº 102]. La pro secuencia (P) presenta la secuencia de ácido nucleico: CAG CCA GGT ATC TTC ACT ACC GTT GGT TCC GCT GCC GAG GGT TCT TTG GAC AAG AGG [SEC. ID. nº 103]. La secuencia de clonación múltiple (MCS) presenta la secuencia de ácido nucleico: CCT ATC CGC GGA ATT CAG ATC TGA ATG CGG CCG CTC GAG ACT AGT GGA TCC [SEC. ID. nº 104].

El vector pGEM-9Zf (-) (Promega) que contiene el ADNc de AcaNAP5 se utilizó para aislar por ampliación ("recuperación por PCR") la zona que codifica la proteína AcaNAP5 madura (utilizando Vent polimerasa de New England Biolabs, Beverly, MA; 20 ciclos de temperatura: 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC y 1,5 minutos a 72ºC). Se utilizaron los siguientes cebadores de oligonucleótido:

YG101:

GCTCGC\underbar{TCTA-GAAGCTT}CAG-ACATGTATAA-TCTCATGTTG-G [SEC. ID. nº 105]

YG103:

AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [SEC. ID. nº 89]

\newpage

Las secuencias de direccionamiento C-terminales del cebador YG101, contenían una extensión sin hibridación que incluía las secuencias de restricción XbaI y HindIII (subrayadas).

Tras la digestión con la enzima XbaI, el producto de la ampliación, que presenta el tamaño esperado, se aisló del gel y se fosforiló a continuación enzimáticamente (T4 polinucleótido cinasa de New England Biolabs, Beverly, MA). Después de la inactivación térmica (10 minutos a 70ºC) de la cinasa, el fragmento XbaI con extremo truncado se clonó direccionalmente en el vector pYAM7SP8 para su expresión. El vector-fragmento del receptor de pYAM7SP8 fue preparado por restricción de StuI-SpeI y se purificó en gel de agarosa. La cepa WK6 de E. coli [Zell, R. y Fritz, H.-J., EMBO J., 6: 1809-1815 (1987)], se transformó con la mezcla de ligadura y se seleccionaron clones resistentes a la ampicilina.

Basándose en el análisis de restricción, un clon del plásmido que contenía una inserción de las dimensiones esperadas, denominado pYAM7SP-NAP5, se conservó para su posterior caracterización. La determinación de la secuencia del clon pYAM7SP-NAP5 confirmó la inserción precisa de la zona de codificación AcaNAP5 madura en fusión con la señal prepro principal, tal como estaba previsto por el esquema de construcción, así como la ausencia de mutaciones no deseadas en la zona de codificación.

(B) Expresión de AcaNAP5 recombinante en P. pastoris

La cepa GTS115 (his4) de Pichia pastoris, ha sido descrita en Stroman, D. W. et al., patente US nº 4855.231. Todas las manipulaciones en P. pastoris se realizaron esencialmente como se describe en Stroman, D. W. et al., patente US nº 4855.231.

Se electroporó aproximadamente 1 microgramo de ADN del plásmido pYAM7SP-NAP5 en la cepa GTS115 utilizando un protocolo de electroporación normalizado. Se linealizó previamente el plásmido por digestión con SalI, que teóricamente facilita el direccionamiento y la integración del plásmido en el locus cromosómico his4.

La selección de una cepa high-expressor de AcaNAP5 se realizó esencialmente como se describe a continuación. Se recuperaron los transformantes His+ en placas MD (base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (DIFCO), 13,4 g/l; 400 microgramos/l de biotina; 20 g/l de D-glucosa; 15 g/l de agar-agar). Las colonias aisladas (n=60) que proceden de la electroporación se inocularon en 100 microlitros de medio FM22-glicerol-PTM1 en pocillos de una placa de 96 pocillos y se dejaron desarrollar en un agitador de placas a 30ºC durante 24 horas. Un litro de medio FM22-glicerol-PTM1 contenía 42,87 g de KH_{2}PO_{4}, 5 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g de CaSO_{4}\cdot2H_{2}O, 14,28 g de K_{2}SO_{4}, 11,7 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 50 g de glicerol esterilizado como 100 ml de solución y 1 ml de mezcla mineral con vestigios de PTM1 filtrada y esterilizada. La parte FM22 del medio se preparó como 900 ml de solución ajustada a pH 4,9 con KOH y esterilizada y filtrada. Un litro de la mezcla PTM1 contenía 6 g de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,8 g de KI, 3 g de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 0,2 g de NaMoO_{4}, 0,02 g de H_{3}BO_{3}, 0,5 g de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 20 g de ZnCl_{2}, 5 ml de H_{2}SO_{4}, 65 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O y 0,2 g de biotina.

Se sedimentaron a continuación las células y se volvieron a poner en suspensión en medio reciente FM22-metanol-PTM1 (la misma composición que anteriormente excepto que los 50 g de glicerol se sustituyeron por metanol al 0,5% (v/v) para producir la expresión del activador de AOX1). Después de un periodo de incubación adicional de 24 horas a 30ºC, se analizó la presencia de AcaNAP5 segregada en los sobrenadantes de los minicultivos. Se seleccionaron dos clones que dirigían un alto nivel de síntesis y secreción de AcaNAP5, como se muestra por el aspecto de la actividad inhibidora elevada del factor Xa en el medio de cultivo (medida mediante el ensayo amidolítico con factor Xa en el Ejemplo 1). Después de una segunda ronda de cribado, utilizando el mismo procedimiento, pero esta vez a nivel de agitador-frasco, se seleccionó una célula hospedadora aislada y se denominó GTS115/7SP-NAP5 de P. pastoris.

Se demostró que la célula hospedadora, GTS115/7SPNAP5, tenía un fenotipo para utilización en metanol natural (Mut^{+}), que demostraba que la integración de la casete de expresión en el cromosoma de GTS115 no alteraba la funcionalidad del gen AOX1 genómico.

La producción posterior de material AcaNAP5 recombinante se realizó en cultivos en matraz de agitación, como se describe en Stroman, D. W. et al., patente US nº 4855.231. Se purificó el producto recombinante procedente del sobrenadante celular de Pichia pastoris como se describe a continuación.

(C) Purificación de AcaNAP5 recombinante (1) Cromatografía de intercambio catiónico

Después de la expresión, el sobrenadante del cultivo de GTS115/75SP-NAP5 (100 ml) se centrifugó a 16.000 r.p.m. (aproximadamente 30.000\timesg) durante 20 minutos antes de ajustar el pH con HCl 1 N a pH 3. Se redujo la conductividad del sobrenadante a menos de 10 mS/cm añadiendo agua MilliQ. Se clarificó el sobrenadante diluido mediante el paso a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,22 micrómetros (Corning Inc., Corning, NY, USA).

Se cargó el volumen total (aproximadamente 500 ml) de sobrenadante en una columna Poros20 HS (Perseptive Biosystems, MA) de 1 \times 2 cm preequilibrada con tampón Cation (citrato de sodio 0,05 M, pH 3) a un caudal de 5 ml/minuto (400 cm/hora). La columna y la muestra estuvieron a temperatura ambiente a lo largo de esta etapa de purificación. Se lavó la columna posteriormente con 50 volúmenes de columna de tampón Cation. El material que presentaba actividad inhibidora en un ensayo amidolítico con factor Xa se eluyó con tampón Cation que contenía NaCl 1 M a un caudal de 2 ml/minuto.

(2) Cromatografía en tamices moleculares utilizando Superdex30

La mezcla de elución con NaCl 1 M que contenía material inhibidor (3 ml) procedente de la columna de intercambio catiónico se cargó en una columna Superdex30 PG (Pharmacia, Suecia) de 1,6 \times 66 cm preequilibrada con fosfato sódico 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M a temperatura ambiente. Se realizó la cromatografía a un caudal de 2 ml/minuto. La actividad inhibidora del factor Xa eluyó 56 a 64 ml en la serie (K_{av} de 0,207). Este es el mismo volumen de elución determinado para la molécula natural (Ejemplo 1, parte E).

(3) Cromatografía en fase inversa

Se cargó 1 ml de las fracciones mezcladas en la cromatografía por filtración en gel en una columna C18 de 0,46 \times
25 cm (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) que se desarrolló a continuación con un gradiente lineal de acetonitrilo del 10 al 35% en ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v) a 1 ml/minuto con un caudal de intercambio de 0,4% en acetonitrilo/minuto. La actividad inhibidora del factor Xa, analizada como en el Ejemplo 1, eluyó alrededor del 30 al 35% de acetonitrilo y estuvo presente en varias fracciones. Se realizaron series de HPLC en el mismo sistema descrito en el Ejemplo 1. Las fracciones de varias series de esta columna que contienen la actividad inhibidora del factor Xa se agruparon y se secaron al vacío.

(4) Determinación del peso molecular de AcaNAP5 recombinante

Se determinó la masa estimada del principal constituyente aislado descrito en los apartados (1) a (3) de este ejemplo utilizando el mismo sistema de espectrometría de masas con ionización por electroatomización descrito en el Ejemplo 1.

La masa estimada de AcaNAP5 recombinante fue de 8.735,69 daltons.

(5) Secuenciado de aminoácidos de AcaNAP5 recombinante

Tras la purificación por el apartado (1) a (3) de este ejemplo, la AcaNAP5 recombinante de Pichia pastoris se sometió al análisis de la secuencia de aminoácidos descrita en el Ejemplo 1. Se determinaron los cinco primeros aminoácidos del terminal amino de AcaNAP5 que fueron: Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu [SEC. ID. nº 106]. La secuencia fue idéntica a la proteína NAP natural (véase Ejemplo 1).

Ejemplo 4 Producción y purificación de AcaNAP6 recombinante en P. pastoris (A) Construcción del vector de expresión

Se construyó el vector de expresión pYAM7SP-NAP6 de la misma manera descrita para pYAM7SP-NAP5 en el Ejemplo 3.

(B) Expresión de AcaNAP6 recombinante en P. pastoris

Se utilizó el vector pYAM7SP-NAP6 para transformar la cepa GTS115 (his4) de Pichia como se describe en el Ejemplo 3.

(C) Purificación de AcaNAP6

La AcaNAP6 recombinante, expresada a partir de la cepa GTS115 (his4) de Pichia transformada con el vector de expresión, pYAM7SP-NAP6, se purificó como se describe para AcaNAP5 recombinante en el Ejemplo 3.

Se determinó que la masa estimada de AcaNAP6 recombinante, tal como se describe en el Ejemplo 3, era de 8.393,84 daltons.

La mayor parte de la preparación de AcaNAP6 presentaba el terminal de aminoácidos siguiente: Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu [SEC. ID. nº 106].

Ejemplo 5 Expresión de Pro-AcaNAP5 recombinante en células COS (A) Construcción del vector de expresión

El vector pGEM-9Zf(-) (Promega Corporation, Madison, WI, USA) en el que se subclonó el ADNc de AcaNAP5, sirvió como diana para la recuperación por PCR de la zona de codificación completa de AcaNAP5, que incluye la señal de secreción natural (utilizando Vent polimerasa de New England Biolabs, Beverly, MA, USA; 20 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC y 1,5 minutos a 72ºC). Los cebadores de oligonucleótido utilizados fueron: (1) YG101, que dirige el extremo 3’ del gen que codifica una NAP y que presenta la secuencia, GCTCGCTCTA
GAAGCTTCAG ACATGTATAA TCTCATGTTG G [SEC. ID. nº 105] y (2) YG102, que dirige el extremo 5’ del gen que codifica una NAP que presenta la secuencia, GACCAGTCTA GACAATGAAG ATGCTTTACG CTATCG [SEC. ID. nº 107]. Estos cebadores contienen extensiones sin hibridación que incluyen las secuencias de restricción XbaI (subrayadas).

Después de la digestión con la enzima XbaI, el producto de ampliación que presenta el tamaño esperado se aisló de un gel de agarosa y se sustituyó posteriormente para los 450 pares de bases aproximadamente del fragmento de relleno XbaI del vector pEF-BOS [Mizushima, S. y Nagata, S., Nucl. Acids Res., 18: 5322 (1990)] con fines de expresión. Se preparó el receptor vector-fragmento por digestión con XbaI y se purificó en un gel de agarosa.

Se transformó la cepa WK6 de E. coli [Zell, R. y Fritz, H.-J., EMBO J., 6: 1809-1815 (1987)] con la mezcla de ligadura. Treinta transformantes resistentes a ampicilina seleccionados al azar se sometieron a análisis PCR (Taq polimerasa de Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA; 30 ciclos de ampliación con el siguiente programa de temperatura: 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC y 1 minuto a 72ºC). Se utilizaron cebadores de oligonucleótido: (i) YG103 que presenta la secuencia, AAGGCATACC CGGAGTGTGG TG [SEC. ID. nº 89] y emparejando el terminal amino de la zona que codifica la NAP madura, y (ii) YG60 que presenta la secuencia, GTGGGAGACC TGATACTCTC AAG [SEC. ID. nº 108], y dirigiendo las secuencias del vector corriente abajo de la secuencia de inserción, es decir, en la zona 3’ no traducida de la casete de expresión pEF-BOS. Únicamente los clones que albergan la inserción en la orientación deseada pueden proporcionar un fragmento de PCR de longitud previsible (aproximadamente 250 pares de bases). Dos de dichos clones se caracterizaron más mediante la determinación de la secuencia y se descubrió que contenían la inserción XbaI deseada. Uno de los clones, denominado pEF-BOS-NAP5, se utilizó para transfectar células COS.

(B) Transfección de células COS

Se transfectaron células COS-7 (ATCC CRL 1651) con pEF-BOS-NAP5, pEF-BOS que contenían una inserción inapropiada o con omisión de ADN (falsas transfecciones) utilizando DEAE-dextrano. Se utilizaron los medios y soluciones madre siguientes por el método DEAE-dextrano:

(1) Medio COS: DMEM; FBS al 10% (incubado durante 30 minutos a 56ºC); L-glutamina al 0,03%; penicilina (50 I.U./ml) y estreptomicina (50 microgramos/ml) (todos los productos de Life Technologies).

(2) MEM-HEPES: medio MEM de Life Technologies Inc., redisuelto según las especificaciones del fabricante; que contiene una concentración final 25 mM de HEPES; ajustado a pH 7,1 antes de la filtración (0,22 micrómetros).

(3) Solución de ADN: 6 microgramos de ADN por 3 ml de MEM-HEPES;

(4) Solución de DEAE-dextrano: 30 microlitros de solución madre de DEAE-dextrano (Pharmacia, Uppsala, Suecia; 100 mg/ml en H_{2}O) por cada 3 ml de MEM-HEPES.

(5) Mezcla de transfección: se añaden 3 ml de la solución DEAE-dextrano a 3 ml de la solución de ADN y la mezcla se deja en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiente.

(6) Solución de cloroquina: dilución 1:100 de solución madre de cloroquina (Sigma, St. Louis, MO, USA; 10 mM en agua; filtrada a través de una membrana de 0,2 micrómetros) en medio COS.

La transfección transitoria de las células COS se realizó de la forma siguiente. Se lavaron una vez con MEM-HEPES células COS (aproximadamente 3,5 \times 10^{6}), cultivadas en un matraz TC de 175 cm^{2} de Nunc (Life Technologies Inc.). Se pipetearon seis ml de la mezcla de transfección en las células lavadas. Tras la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 48 ml de la solución de cloroquina y se incubaron las células durante otras 4 horas a 37ºC. Se lavaron las células una vez con medio COS reciente y finalmente se incubaron en 50 ml del mismo medio a 37ºC.

(C) Cultivo de células COS transfectadas

Tres, cuatro y cinco días después de la transfección se analizó una muestra de los sobrenadantes del cultivo en un ensayo amidolítico de factor Xa según el procedimiento del Ejemplo 1. Los resultados demostraron claramente que la actividad inhibidora del factor Xa se acumuló en el sobrenadante del cultivo de las células transfectadas con pEF-BOS-NAP5.

Se recogió el sobrenadante del cultivo de COS cinco días después de la transfección y la proteína NAP se purificó tal como se describe en el Ejemplo 6.

Ejemplo 6 Purificación de Pro-AcaNAP5 recombinante (A) Cromatografía de intercambio aniónico

El sobrenadante del cultivo de COS que contiene Pro-AcaNAP5 se centrifugó a 1.500 r.p.m. (aproximadamente 500\timesg) durante 10 minutos antes de añadir acetato sódico sólido hasta una concentración final de 50 mM. Se añadieron los inhibidores de proteasa siguientes (todos los inhibidores de proteasa eran de ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA, USA): pepstatina A 1,0 \times 10^{-5} M (ácido isovaleril-Val-Val-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanoil-Ala-4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico), leupeptina 1,0 \times 10^{-5} M, AEBSF (fluoruro de 4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilo) 5 \times 10^{-5} M. Se ajustó el pH con HCl a pH 5,3. Se clarificó el sobrenadante mediante paso a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 micrómetros (Corning, Inc., Corning, NY, USA).

Se cargó el sobrenadante clarificado (volumen total aproximadamente de 300 ml) en una columna Poros20 HQ (Perseptive Biosystems, MA) de 1 \times 2 cm preequilibrada con tampón Anion (acetato sódico 0,05 M, pH 5,3, NaCl 0,1 M) a un caudal de 10 ml/minuto (800 cm/hora). La columna y la muestra estaban a temperatura ambiente durante esta etapa de purificación. La columna se lavó posteriormente con por lo menos 10 volúmenes de columna de tampón Anion. El material que tenía actividad inhibidora en un ensayo amidolítico con factor Xa se eluyó con tampón Anion que contenía NaCl 0,55 M a un caudal de 5 ml/minuto (400 cm/hora) y se recogió.

(B) Utilización de la cromatografía en tamices moleculares Superdex30

Se cargó la mezcla de elución de NaCl 0,55 M (3 ml) de la cromatografía de intercambio aniónico en una columna Superdex30 PG (Pharmacia, Suecia) de 1,6 \times 66 cm preequilibrada con fosfato sódico 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M a 24ºC. Se realizó la cromatografía a un caudal de 2 ml/minuto. El material que era inhibidor en el ensayo amidolítico con factor Xa eluyó 56 a 64 ml en la serie (K_{av} de 0,207). Éste fue exactamente el mismo volumen de elución que el determinado para la molécula natural.

(C) Tratamiento térmico

El grupo total de fracciones que tienen actividad inhibidora del factor Xa se incubó durante 5 minutos a 90ºC en un tubo de vidrio y posteriormente se enfrió rápidamente en hielo. El material insoluble se sedimentó por centrifugación 19.000 \times g_{máx} a 4ºC durante 20 minutos. El sobrenadante contenía toda la actividad inhibidora del factor Xa.

(D) Cromatografía HPLC en fase inversa

Se cargó el sobrenadante de la muestra tratada térmicamente en una columna C18 de 0,46 \times 25 cm (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) que se desarrolló a continuación con un gradiente lineal de acetonitrilo al 35% en ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v) a 1 ml/minuto con una velocidad de cambio del 0,4% en acetonitrilo/minuto. Las series de HPLC se realizaron en el mismo sistema descrito en el Ejemplo 1. Las fracciones que contienen actividad inhibidora del factor Xa se secaron al vacío.

(E) Determinación del peso molecular

Se determinó la masa estimada para Pro-AcaNAP5 recombinante aislada como se describió en los apartados A a D de este ejemplo, utilizando el mismo sistema de espectrometría de masas por ionización por electroatomización descrito en el Ejemplo 1.

La masa estimada de Pro-AcaNAP5 fue de 9.248,4 daltons.

(F) Secuenciado de aminoácidos

Tras la purificación, Pro-AcaNAP5 recombinante de las células COS se sometió a análisis de aminoácidos para determinar su secuencia del terminal amino como se describe en el Ejemplo 1. Se determinó que los nueve primeros aminoácidos del terminal amino de Pro-AcaNAP5 eran: Arg Thr Val Arg Lys Ala Tyr Pro Glu [SEC. ID. nº 109]. En comparación con la proteína AcaNAP5 natural (véase el Ejemplo 1), Pro-AcaNAP5 posee cuatro aminoácidos adicionales en su terminal N. En la Figura 5 se presenta la secuencia de aminoácidos de Pro-AcaNAP5.

Ejemplo 7 Expresión de Pro-AcaNAP6 recombinante en células COS

Se produjo temporalmente Pro-AcaNAP6 en células COS esencialmente como se describe para Pro-AcaNAP5 en el Ejemplo 5.

Se recuperó por PCR la zona de codificación AcaNAP6, incluyendo la señal de secreción, con los mismos dos cebadores de oligonucleótido utilizados para AcaNAP5: (1) YG101, que dirige el extremo 3’ del gen y que presenta la secuencia, GCTCGCTCTA GAAGCTTCAG ACATGTATAA TCTCATGTTG G [SEC. ID. nº 105] y (2) YG102, que dirige el extremo 5’ del gen y que presenta la secuencia, GACCAGTCTA GACAATGAAG ATGCTTTACG CTATCG [SEC. ID. nº 107]. El cebador YG101 contiene un nucleótido no compatible cuando se utiliza con AcaNAP6 como diana (resto T subrayado; compárese con la Figura 1 y la Figura 3). Esta incompatibilidad produce la sustitución de un codón Ile para ATT por un codón Ile para ATA. La incompatibilidad no influye notablemente en la eficacia de la ampliación.

Se introdujo la siguiente modificación del Ejemplo 5: veinticuatro horas después de la transfección de las células COS (que se describe en el Ejemplo 5, apartado B), el medio COS que contiene FBS al 10% se sustituyó con 50 ml de un medio constituido por una mezcla 1:1 de DMEM y mezcla nutriente F-12 de Ham (Life Technologies). Las células se incubaron más a continuación a 37ºC y la producción de la actividad inhibidora del factor Xa se detectó tal como se describe en el Ejemplo 5.

Ejemplo 8 Purificación de Pro-AcaNAP6 recombinante (A) Cromatografía de intercambio aniónico

El sobrenadante del cultivo de COS que contiene Pro-AcaNAP6 se centrifugó a 1.500 r.p.m. durante 10 minutos antes de añadir acetato sódico sólido hasta una concentración final de 50 mM. Se añadieron los inhibidores de proteasa siguientes (todos los inhibidores de proteasa eran de ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA, USA): pepstatina A 1,0 \times
10^{-5} M (ácido isovaleril-Val-Val-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanoil-Ala-4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico), leupeptina 1,0 \times 10^{-5} M, AEBSF (fluoruro de 4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilo) 5 \times 10^{-5} M. Se ajustó el pH con HCl a pH 5,3. Se clarificó el sobrenadante mediante paso a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 micrómetros (Corning, Inc., Corning, NY, USA).

Se cargó el sobrenadante clarificado (volumen total aproximadamente de 300 ml) en una columna Poros20 HQ (Perseptive Biosystems, MA) de 1 \times 2 cm preequilibrada con tampón Anion (acetato sódico 0,05 M, pH 5,3, NaCl 0,1 M) a un caudal de 10 ml/minuto (800 cm/hora). La columna y la muestra estaban a temperatura ambiente durante esta etapa de purificación. La columna se lavó posteriormente con por lo menos 10 volúmenes de columna de tampón Anion. El material que tenía actividad inhibidora en un ensayo amidolítico con factor Xa se eluyó con tampón Anion que contenía NaCl 0,55 M a un caudal de 5 ml/minuto (400 cm/hora) y se recogió.

(B) Utilización de la cromatografía en tamices moleculares Superdex30

Se cargó la mezcla de elución de NaCl 0,55 M (3 ml) de la cromatografía de intercambio aniónico en una columna Superdex30 PG (Pharmacia, Suecia) de 1,6 \times 66 cm preequilibrada con fosfato sódico 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M a 24ºC. Se realizó la cromatografía a un caudal de 2 ml/minuto. El material que era inhibidor en el ensayo amidolítico con factor Xa eluyó 56 a 64 ml en la serie (K_{av} de 0,207). Éste fue exactamente el mismo volumen de elución que el determinado para la NAP natural.

(C) Cromatografía HPLC en fase inversa

Se cargaron las fracciones mezcladas de la filtración del gel en una columna C18 de 0,46 \times 25 cm (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) que se desarrolló a continuación con un gradiente lineal de acetonitrilo del 10 al 35% en ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v) a un caudal de 1 ml/minuto con una velocidad de cambio del 0,4% en acetonitrilo/minuto. La actividad inhibidora del factor Xa (analizado según el Ejemplo 1) eluyó en aproximadamente acetonitrilo al 30%. Las series de HPLC se realizaron en el mismo sistema descrito en el Ejemplo 1. Las fracciones que contienen actividad inhibidora del factor Xa se secaron al vacío.

(D) Determinación del peso molecular

Se determinó la masa estimada para Pro-AcaNAP6 recombinante aislada como se describió en los apartados A a C de este ejemplo, utilizando el mismo sistema de espectrometría de masas por ionización por electroatomización descrito en el Ejemplo 1.

La masa estimada de Pro-AcaNAP6 fue de 8.906,9 daltons.

(E) Secuenciado de aminoácidos

Tras la purificación, la Pro-AcaNAP5 recombinante de las células COS se sometió a análisis de la secuencia de aminoácidos tal como se describe en el Ejemplo 1. Se determinaron que los cinco primeros aminoácidos del terminal N de Pro-AcaNAP6 eran: Arg Thr Val Arg Lys [SEC. ID. nº 110]. En comparación con la proteína NAP natural (véase el Ejemplo 1), Pro-AcaNAP6 posee cuatro aminoácidos adicionales en su terminal amino. En la Figura 6 se presenta la secuencia de aminoácidos de Pro-AcaNAP6.

Ejemplo 9 Utilización de las secuencias de ADN de NAP para aislar los genes que codifican otras proteínas NAP

Las secuencias de ADNc de AcaNAP5 y AcaNAP6 (del Ejemplo 2) se utilizaron para aislar las moléculas relacionadas de otras especies parásitas por hibridación por cruzamiento.

Los vectores pGEM-9Zf(-) (Promega) que contenían los ADNc con AcaNAP5 y AcaNAP6 se utilizaron para la recuperación por PCR de las zonas que codifican las proteínas NAP maduras (Taq polimerasa de Life Technologies; 20 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC y 1,5 minuto a 72ºC). Los cebadores de oligonucleótido utilizados fueron: (1) YG109, que dirige las secuencias C-terminales del ADNc que codifica a NAP y que tiene la secuencia, TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [SEC. ID. nº 88], y (2) YG103 que presenta la secuencia AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [SEC. ID. nº 89]. El cebador YG109 contiene una única incompatibilidad de nucleótidos (resto T subrayados; en comparación con las secuencias presentadas en las Figuras 1 y 3) cuando se utiliza con AcaNAP6 como diana. Esto no influyó notablemente en la eficacia de la ampliación. Los productos de PCR de dimensiones correctas (aproximadamente 230 pares de bases) se aislaron ambos en un gel de agarosa al 1,5%. Se radiomarcó una mezcla equimolar por ampliación del cebador al azar (kit T7 QuickPrime; Pharmacia) y se pasaron a continuación sobre una columna Bio-Spin 30 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

Se prepararon bancos de ADNc de Ancylostoma ceylanicum (Ace), Ancylostoma duodenale (Adu) y Heligmosomoides polygyrus (Hpo) esencialmente como se describe para Ancylostoma caninum en el Ejemplo 2.

Ancylostoma ceylanicum y Heligmosomoides polygyrus se adquirieron en Dr. D. I. Pritchard, Department of Life Science, University of Nottingham, Nottingham, UK. Ancylostoma duodenale se adquirió en Dr. G. A. Schad, The School of Veterinary Medicine, Department of Pahtobiology, University of Pennsylvania, Filadelfia, USA.

En cada caso, los ADNc se clonaron direccionalmente como fragmentos EcoRI-NotI en lambda gt11. Aproximadamente 2\times10^{5} clones de ADNc de cada banco (se prepararon filtros de elevador de placas por duplicado utilizando Hibond^{TM}-N; Amersham) se cribaron con fragmentos de AcaNAP5 y AcaNAP6 radiomarcados utilizando las condiciones de prehibridación e hibridación siguientes: 5\times SSC (SSC: NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), 5\times solución de Denhardt, SDS al 0,5%, formamida al 20%, 100 microgramos/ml de ADN de esperma de pescado sometido a ultrasonidos (Boehringer), toda la noche a 42ºC. Se lavaron los filtros 4 veces durante 30 minutos en 2\times SSC, SDS al 0,1% a 37ºC. Tras la exposición (aproximadamente 60 horas) a película de rayos X, se identificaron un total de entre 100 y 200 puntos de hibridación en el caso de Ace y Adu. Un pequeño número de puntos muy poco perceptibles fueron visibles en el caso del banco de ADNc de Hpo. Para cada uno de los bancos, ocho positivos se sometieron a una segunda ronda de hibridación a una densidad de placas inferior para aislar placas individua-
les.

Los clones retenidos se continuaron caracterizando por ampliación por PCR de las inserciones con ADNc utilizando el cebador oligo(dT)-NotI (Promega; este es el mismo cebador utilizado para preparar la primera cadena de ADNc; véase el Ejemplo 2) [SEC. ID. nº 95] en combinación con el cebador nº 1218 lambda-gt11 que presenta la secuencia, GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [SEC. ID. nº 96] (New England Biolabs; el cebador nº 1218 dirige las secuencias lambda localizadas corriente arriba de la secuencia de inserción del ADNc). Las ampliaciones por PCR se realizaron de la forma siguiente: Taq polimerasa de Boehringer; 30 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95ºC; 1 minuto a 50ºC; 1,5 minutos a 72ºC. El análisis electroforético en gel de los productos de PCR demostró claramente que los ADNc de aproximadamente el mismo tamaño que el ADNc de AcaNAP5 (p. ej., 400 a 500 bp) se extrajeron de cada especie. Además de estos ADNc del tamaño de AcaNAP5, algunos ADNc de Ace y Adu se estimó que eran de aproximadamente 700 bp de longitud.

Para la determinación de la secuencia se seleccionaron numerosos clones, que contenían una inserción de 500 bp o de 800 bp. Con este fin se subclonaron las inserciones de ADNc, como fragmentos de SfiI-NotI, en fagómidos de tipo pGEM (Promega; referirse al Ejemplo 2 para detalles) que permiten la preparación de ADN monocatenario. Los resultados del secuenciado condujeron a la identificación de seis proteínas diferentes nuevas similares a NAP, denominadas de la forma siguiente: AceNAP4, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AduNAP7 y HpoNAP5. Las secuencias nucleotídicas de los ADNc así como las secuencias deducidas de los aminoácidos de las proteínas codificadas se presentan en la Figura 7A (AceNAP4 [SEC. ID. nº 9]), Figura 7B (AceNAP5) [SEC. ID. nº 10], Figura 7C (AceNAP7) [SEC. ID. nº 11], Figura 7D (AduNAP4) [SEC. ID. nº 12], Figura 7E (AduNAP7) [SEC. ID. nº 13] y Figura 7F (HpoNAP5) [SEC. ID. nº 14]. Los ADNc con AceNAP4 [SEC. ID. nº 9] y AduNAP7 [SEC. ID. nº 13], cada uno de aproximadamente 700 bp de longitud, codificó cada uno las proteínas que incorporaban dos dominios de NAP; los demás ADNc aislados codificaban una proteína con un único dominio de NAP. El clon de ADNc AduNAP4 [SEC. ID. nº 12] no estaba completo, es decir, el clon carecía de la parte 5’-terminal de la zona de codificación; el marco de lectura correcto, sin embargo, pudo asignarse basándose en la homología de la secuencia de aminoácidos con la familia NAP de las moléculas citadas.

Las secuencias de ADNc identificadas pueden utilizarse para producir las proteínas codificadas como se describe en los Ejemplos 3, 4, 5 y 7 utilizando los mismos o alternativos sistemas de expresión adecuada. El medio acondicionado o los lisados celulares, dependiendo del sistema utilizado, pueden ser ensayados como tales o después del fraccionamiento (utilizando dicha metodología esbozada en los Ejemplos 3, 4, 6 y 8) para la actividad inhibidora y anticoagulante de la proteasa. Las proteínas que están codificadas por los ADNc que se hibridan con las sondas procedentes de fragmentos del gen de AcaNAP5 (Figura 1) [SEC. ID. nº 3] y/o del gen de AcaNAP6 (Figura 3) [SEC. ID. nº 5] y que poseen propiedades inhibidoras y/o anticoagulantes de serina proteasa se consideran que pertenecen a la familia NAP de las moléculas citadas.

Ejemplo 10 Identificación de NAP por presentación funcional de las proteínas codificadas por ADNc (A) Serie pDONG de vectores

Las secuencias nucleotídicas de los vectores pDONG, pDONG61 [SEC. ID. nº 15], pDONG62 [SEC. ID. nº 16] y pDONG63 [SEC. ID. nº 17], derivadas de pUC119 [Vieira, J. y Messing, J., Methods in Enzymology, 153:3-11 (1987)], se describen en las Figuras 8A a 8C respectivamente.

Para construir estos tres vectores, se añadieron las secuencias de restricción HindIII y SfiI en el extremo 5’ y el extremo 3’ del gen 6 del fago filamentoso por ampliación por PCR del ADN monocatenario M13K07 [Vieira, J. y
Messing, J., Ibid] con el cebador complementario G6BACKHIND y G6FORSFI61, G6FORSFI62 o G6FORSFI63 como cebadores transcritos. En una segunda PCR, los tres fragmentos obtenidos se volvieron a amplificar con
G6BACKHIND y G6FORNOTBAMH como cebador transcrito para agregar las secuencias NotI y BamHI en el extremo 3’ de los fragmentos. Las secuencias de los cebadores de PCR mencionados anteriormente son las siguientes (las secuencias de restricción están subrayadas):

G6BACKHIND:

ATCCG\underbar{AAGCT T}TGCTAACAT ACTGCGTAAT AAG [SEC. ID. nº 111]

G6FORSFI61:

TATGGGAT\underbar{GG CCGACTTGGC C}TCCGCCTGA GCCTCCACCT TTATCCCAAT CCAAATAAGA [SEC. ID. nº 112]

G6FORSFI63:

TATGGGAT\underbar{GGC CGACTTGGC C}GATCCGCCT GAGCCTCCAC CTTTATCCCA ATCCAAATAA [SEC. ID. nº 114]

GAG6FORNOTBAMH:

AGGAGG\underbar{GGAT CCGCGGGCCGC} GTGATATGGG ATGGCCGACT TGGCC [SEC. ID. nº 115]

Por último, los productos de PCR se purificaron en gel, se digirieron cada uno con HindIII y BamHi y se insertaron entre las secuencias correspondientes de pUC119. La determinación de la secuencia confirmó que pDONG61, pDONG62 y pDONG63 contenían todas la inserción deseada.

La serie de vectores pDONG permite la clonación de los ADNc, como fragmentos SfiI-NotI. Esta clonación fusiona los ADNc en cada uno de los tres marcos de lectura (traducción) al extremo 3’ del gen 6 del fago filamentoso que codifica una de las proteínas del recubrimiento del fago. La infección de una cepa de E. coli específica del macho que alberga un derivado de pDONG, con fago auxiliar VCSM13 (Stratagene, La Jolla, CA), produce el rescate de los pseudoviriones que encapsulan una sola cadena específica del derivado pDONG y que pueden incorporar también una proteína de fusión la proteína 6 (p6) recombinante en su recubrimiento. Los ADNc que son de modo que la proteína codificada se presenta funcionalmente en la superficie del fago como una proteína de fusión p6 recombinante se vuelven identificables mediante un experimento de selección (panning) descrito a continuación.

(B) Transferencia del banco de ADNc de Ancylostoma caninum desde lambda gt11 hasta la serie de vectores pDONG

Una preparación de fago lambda de los clones de ADNc de A. caninum agrupados (aproximadamente 1 \times 10^{6} placas, véase Ejemplo 2) se utilizó para el rescate por PCR de las inserciones de ADNc (Taq polimerasa de Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA; 20 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC y 3 minutos a 72ºC seguido de 10 minutos a 65ºC), con el cebador nº 1218 lambda gt11 que tiene la secuencia, GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [SEC. ID. nº 96] (New England Biolabs, Beverly, MA, USA; secuencias de direccionamiento situadas corriente arriba de la inserción del ADNc) en combinación con el cebador, adaptador oligo(dT)-NotI (Promega) utilizado para la síntesis de la primera cadena del ADNc. Después de la digestión con las enzimas de restricción SfiI y NotI, todo el intervalo de tamaño de los productos de la ampliación se recuperó en el gel de agarosa.

\newpage

Todos los fragmentos se clonaron direccionalmente en los vectores pDONG61, pDONG62 y pDONG63. Se prepararon los fragmentos de vector del receptor por digestión de los vectores purificados en CsCl con SfiI y NotI y purificación con el "Wizard^{TM} PCR Preps DNA Purification System" (Promega Corp., Madison, WI, USA).

La cepa TG1 de E. coli [Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, volúmenes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] fue transformada por electroporación con las mezclas de ligadura pDONG/ADNc. Las células electrotransformadas se incubaron 1 hora a 37ºC en medio SOC [Sambrook, J. et al., Ibid] y se colocaron en LB-agar-agar que contenía glucosa al 0,1% y 100 microgramos/ml de carbenicilina (placas de 245\times245\times25 mm; Nunc). Se obtuvieron 2,2 \times 10^{6}, 1,6 \times 10^{6} y 1,4 \times 10^{6} transformantes resistentes a carbenicilina con pDONG61, pDONG62 y pDONG63, respectivamente. A partir de cada banco respectivo, denominados 20L, 21L y 22L, un número de transformantes seleccionados al azar se sometieron al análisis por PCR (Taq polimerasa de Life Technologies; 30 ciclos de ampliación con el programa de temperaturas siguiente: 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC y 1 a 3 minutos a 72ºC) utilizando dos cebadores que son compatibles con las secuencias que flanquean la secuencia de clonación múltiple de pUC119 (cebadores nº 1224 que presentan la secuencia, CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC [SEC. ID. nº 116] y nº 1233 que presenta la secuencia, AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGA [SEC. ID. nº 101]; New England Biolabs). Los resultados demostraron que la amplia mayoría de los clones contenía una inserción de ADNc de tamaño variable.

(C) Selección por afinidad basada en el factor Xa de los clones de ADNc que codifican una proteína NAP

Se rescataron las partículas de fago de los bancos 20L, 21L y 22L de la forma siguiente: se raspó cada banco de las placas y se cultivó a 37ºC en 100 ml de medio LB enriquecido con glucosa al 1% y 100 microgramos/ml de carbenicilina hasta que la absorbancia óptica a 600 nm alcanza el valor de 0,5. Tras la adición del fago auxiliar VCSM13 (Stratagene) a una multiplicidad de infección (moi) de 20, se dejó en reposo el cultivo durante 30 minutos a 37ºC y a continuación se agitó lentamente durante otros 30 minutos. Se sedimentaron las células por centrifugación y se volvieron a poner en suspensión en 250 ml de medio LB enriquecido con 100 microgramos/ml de carbenicilina y 50 microgramos/ml de kanamicina. Estos cultivos se dejaron desarrollar toda la noche a 30ºC con agitación intensa. Las partículas de fago resultantes se purificaron mediante dos precipitaciones consecutivas con polietilenglicol/NaCl y se volvieron a poner en suspensión en 1\times10^{13} viriones por ml en solución salina tamponada con TRIS (Tris 0,05 M, cloruro sódico 0,15 M, pH 7,4) (TBS). Cantidades iguales de partículas de fago de 20L, 21L y 22L se mezclaron a continuación.

El factor Xa humano (véase el Ejemplo 1 para precipitación) se biotiniló con biotina-XX-NHA según las instrucciones del fabricante (Pierce). La actividad amidolítica de la proteasa no fue afectada por esta modificación como se demuestra mediante un análisis enzimático que utiliza sustrato S-2765 cromógeno (Chromogenix; véase el Ejemplo 1). Perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Dynal; 1 mg por ronda de selección (panning)) se lavaron tres veces con TBS y se bloquearon en TBS enriquecido con leche descremada al 2% (Difco) a temperatura ambiente. Después de una hora, las perlas magnéticas se lavaron dos veces con TBS antes de su utilización.

Para la primera ronda de selección, 1\times10^{13} fagos de los bancos agrupados se incubaron durante 75 minutos a 4ºC en 200 microlitros de tampón TBS enriquecido con factor Xa biotinilado 250 nM, CaCl_{2} 5 mM y leche descremada al 2%. Después de este periodo, 1 mg de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina bloqueadas, se volvieron a poner en suspensión en 200 microlitros de TBS que contenía CaCl_{2} 5 mM y leche descremada al 2%, se añadió a la solución del fago y se incubó durante 1 hora a 4ºC con agitación suave. Con un imán (Dynal), las perlas magnéticas se enjuagaron a continuación diez veces con 500 microlitros de TBS que contienen Tween-20 al 0,1%. El fago unido se eluyó de las perlas magnéticas incubándole con 500 microlitros de tampón de glicina-HCl 0,1 M (pH 2,0) durante 10 minutos. Se neutralizó el sobrenadante con 150 microlitros de tampón Tris-HCl 1 M (pH 8,0).

Para la propagación del fago, la cepa TG1 de E. coli [Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, volúmenes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] se cultivó a 37ºC en 10 ml de medio LB hasta que la absorbancia óptica a 600 nm alcanzó el valor de 0,5. Se infectó el cultivo con 650 microlitros de fago eluído de las perlas magnéticas y se incubó brevemente a 37ºC sin agitación. Tras la centrifugación, las células infectadas se volvieron a poner en suspensión en 2 ml de medio LB y se colocaron en placas de 245\times245\times25 mm rellenas con LB-agar-agar que contenían glucosa al 1% y 100 microgramos/ml de carbenicilina. Tras la incubación durante la noche a 37ºC, se rascaron las células de las placas y se volvieron a poner en suspensión en 40 ml de medio LB enriquecido con glucosa al 1% y 100 microgramos/ml de carbenicilina. Una alícuota de células correspondientes a 15 densidades ópticas a 600 nm se utilizó a continuación para inocular 100 ml de medio LB que contenía glucosa al 1% y 100 microgramos/ml de carbenicilina. El rescate del fago para la siguiente ronda de selección (panning) se realizó como se esbozó anteriormente.

Para la segunda ronda de selección, se incubaron 6\times10^{12} fagos durante 90 minutos con 1 mg de perlas magnéticas bloqueadas recubiertas con estreptavidina en 200 microlitros de TBS que contenían Ca^{2+} 2,5 mM y leche descremada al 2% (esta etapa se introdujo en el procedimiento para evitar la selección de los clones que se unen a la estreptavidina). Después de la eliminación de las perlas, se siguió el mismo protocolo que en la ronda 1. Las rondas 3, 4 y 5 se realizaron como la ronda 2, con la excepción de que la entrada del fago se redujo a 2\times10^{12} fagos.

Veinticuatro clones individuales resistentes a la carbenicilina que se aislaron después de cinco rondas de selección contra el factor Xa biotinilado, se analizaron a continuación por ELISA. Placas de 96 pocillos (Pierce) recubiertas con estreptavidina se bloquearon durante 1 hora con 200 microlitros de TBS que contenía leche descremada al 2% por pocillo, se incubaron a continuación durante 1 hora con 100 microlitros de factor Xa biotinilado 20 mM en TBS al pocillo. Para cada clon, se añadieron a los pocillos aproximadamente 10^{10} fagos diluidos en 100 microlitros de TBS que contenía leche descremada al 2% y Tween-20 al 0,1%. Tras una incubación de 2 horas, se enjuagaron los pocillos cuatro veces con 200 microlitros de TBS que contenía Tween-20 al 0,1%. Se observó el fago unido incubando consecutivamente con un antisuero anti-M13 de conejo (véase el Ejemplo 11), un suero anti-conejo (Sigma) conjugado con fosfatasa alcalina y fosfato de p-nitrofenilo como sustrato (Sigma). Se tomaron absorbancias a 405 nm después de 20 minutos. De cada 24 clones, cinco se unieron fuertemente al factor Xa. No se observó ninguna unión no específica significativa con estos fagos cuando se analizaron en el mismo ELISA con omisión del factor Xa biotinilado.

Se preparó a continuación ADN monocatenario a partir de los cinco clones positivos y las inserciones 3’ en el gen 6 se sometieron a secuenciado de ADN automático utilizando el cebador nº 1224 que presenta la estructura, CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC [SEC. ID. nº 116] (New England Biolabs). Se observó que los cinco clones contenían el mismo ADNc truncado en 5’ que 470 bp fusionado en el marco con el gen 6 en pDONG63. La secuencia nucleotídica de este ADNc así como la secuencia de aminoácidos deducida se describen en la Figura 9 [SEC. ID. nº 19], El ADNc denominado AcaNAPc2 codifica una proteína, denominada isoforma c2 de NAP, que pertenece a la familia NAP de las proteínas citadas.

Ejemplo 11 Preparación de antisuero contra el fago M13

Se preparó antisuero contra el fago M13 en conejos mediante inyecciones subcutáneas de aproximadamente 10^{13} fagos M13K07 en 500 microlitros de PBS (fosfato de sodio 0,01 M, pH 7,4 + cloruro sódico 0,15 M) combinado con un volumen igual de adyuvante. Los fagos M13K07 se purificaron con CsCl esencialmente como describe Glaser-Wuttke, G., Keppner, J., y Rasched, I., Biochim. Biophys. Acta, 985: 239-247 (1989). La inyección inicial se realizó con adyuvante completo de Freund el día 0, seguido de inyecciones posteriores con adyuvante incompleto de Freund los días 7, 14 y 35. El antisuero se recogió el día 42.

La fracción de IgG del antisuero se enriqueció mediante el paso sobre una columna de proteína A-Sepharose utilizando las condiciones bien conocidas en la técnica.

Ejemplo 12 Utilización de las secuencias AcaNAP5 y AcaNAP6 de ADN para aislar las secuencias adicionales que codifican NAP de A. caninum

Se utilizaron las secuencias AcaNAP5 y AcaNAP6 de ADNc (del Ejemplo 2) para aislar las moléculas relacionadas de la misma especie parásita mediante hibridación por cruce.

Los vectores pGEM-9Zf (-) (Promega, Madison, WI) que contenían AcaNAP5 y AcaNAP6 de ADNc se utilizaron para rescatar por PCR las zonas que codifican las proteínas NAP maduras (Taq polimerasa de Life Technologies (Gaithersburg, MD); 20 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95, 1 minuto a 50ºC y 1,5 minutos a 72ºC). Los cebadores de oligonucleótido utilizados fueron: (1) YG109, que dirige las secuencias de codificación C-terminales del ADNc que codifica AcaNAP5 y AcaNAP6, y que presentan la secuencia, TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [SEC. ID. nº 88], y (2) YG103, que dirige las secuencias que codifican el terminal N de las AcaNAP5 y AcaNAP6 maduras, que presentan la secuencia, AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [SEC. ID. nº 89]. El cebador YG109 contiene un desemparejamiento de nucleótidos único cuando se utiliza con AcaNAP6 como diana (resto T subrayado; comparar con la secuencia mostrada en la Figura 3 [SEC. ID. nº 5]). Este desemparejamiento no influye notablemente en la eficacia de la ampliación. Los productos de PCR de tamaño correcto (aproximadamente 230 pares de bases) para AcaNAP5 y AcaNAP6 se aislaron ambos en un gel de agarosa al 1,5%. Se radiomarcó una mezcla equimolecular por ampliación del cebador al azar (T7 QuickPrime kit, Pharmacia (Suecia) y se pasaron ulteriormente sobre una columna Bio-Spin 30 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

Se prepararon aproximadamente 750.000 clones del ADNc de Ancylostoma caninum (Aca) (referirse al Ejemplo 2 (B); se prepararon filtros de ascenso de placas por duplicado utilizando Hybond^{TM}-N; Amersham (Buckinghamshire, Inglaterra) se cribaron con los fragmentos radiomarcados AcaNAP5 y AcaNAP6 de ADNc utilizando las siguientes condiciones de prehibridación y de hibridación: 5\times SSC (SSC: NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), 5\times solución de Denhardt, SDS al 0,5%, formamida al 20%, 100 microgramos/ml de ADN de esperma de pescado tratados con ultrasonidos (Boehringer), toda la noche a 42ºC. Se lavaron los filtros 4 veces durante 30 minutos en 2\times SSC, SDS al 0,1% a 37ºC. Tras la exposición a película de rayos X, se identificaron un total de aproximadamente 300 positivos.

48 de los 300 positivos se sometieron a ampliación por PCR (Taq polimerasa de Boehringer Mannheim, Alemania; 30 ciclos de temperatura: 1 minuto a 95ºC; 1 minuto a 50ºC; 1,5 minutos a 72ºC) utilizando el cebador YG109 mencionado anteriormente, específico para la secuencia que codifica el terminal C de los ADNc AcaNAP5 y AcaNAP6 y el cebador nº 1218 que dirige las secuencias lambda-gt11 localizadas corriente arriba de la secuencia de inserción del ADNc (New England Biolabs, Beverly, MA; GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [SEC. ID. nº 96]). 31 de los 48 positivos proporcionaron un producto de PCR de un tamaño similar al esperado para el ADNc de tipo AcaNAP5/6.

Los 17 positivos restantes se utilizaron como plantilla para la ampliación con el cebador nº 1218 y un cebador específico AcaNAPc2 (p. ej., LJ189, que dirige el terminal-C y que presenta la secuencia GTTTCGAGTT CCGGGA
TATA TAAAGTCC [SEC. ID. nº 117]; referirse al Ejemplo 10 y a la Figura 9). Ninguno de los clones proporcionó un producto de PCR. Los 17 positivos se sometieron a continuación a una segunda ronda de hibridación a una densidad de placa inferior; se identificaron los clones aislados individuales en todos los casos. Los 17 clones aislados de ADNc se volvieron a analizar por PCR utilizando los pares de cebador nº 1218/YG109 y nº1218/LJ189. Tres de los 17 clones proporcionaron un producto de ampliación con los cebadores nº 1218/YG109.

Los 14 clones restantes se analizaron más por ampliación por PCR con los cebadores nº 1218 y oligo(dT)-Not (Promega, Madison, WI; este es el mismo cebador utilizado para preparar el ADNc de la primera cadena; véase el Ejemplo 2). Los 14 clones proporcionaron un producto de PCR. El análisis electroforético en gel de los productos por PCR indicó que los mismos ADNc eran considerablemente mayores que la inserción del ADNc AcaNAP5.

Se seleccionaron diez clones, incluyendo los que tienen las inserciones mayores de ADNc, para la determinación de la secuencia. Con esta finalidad se sublclonaron las inserciones de ADNc como fragmentos SfiI-NotI en fagómidos de tipo pGEM (Promega, Madison, WI), como se describe en el Ejemplo 2. El secuenciado identificó ocho secuencias de proteína NAP adicionales, denominadas de la forma siguiente: AcaNAP23, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP31, AcaNAP44, AcaNAP45, AcaNAP47 y AcaNAP48. Dos clones de ADNc adicionales, denominados AcaNAP42 y AcaNAP46, codificaron las proteínas idénticas a las codificadas por AcaNAP31 [SEC. ID. nº 34]. Las secuencias nucleotídicas de los ADNc así como las secuencias de aminoácidos deducidas de las proteínas codificadas se presentan en la Figura 13A (AcaNAP23 [SEC. ID. nº 31]), Figura 13B (AcaNAP24 [SEC. ID. nº 32]), Figura 13C (AcaNAP25 [SEC. ID. nº 33]), Figura 13D (AcaNAP31 [SEC. ID. nº 34]), Figura 13E (AcaNAP44 [SEC. ID. nº 35]), Figura 13F (AcaNAP45 [SEC. ID. nº 36]), Figura 13G (AcaNAP47 [SEC. ID. nº 37]) y Figura 13H (AcaNAP48 [SEC. ID. nº 38]). Todos los clones estaban completos e incluían una señal de secreción completa. Los ADNc AcaNAP45 [SEC. ID. nº 36] y AcaNAP47 [SEC. ID. nº 37], codifican cada uno las proteínas que incorporan dos dominios de NAP; los demás ADNc codifican una proteína que presenta un solo dominio de NAP.

Ejemplo 13 Utilización de secuencias NAP de ADN para aislar las secuencias que codifican una proteína NAP de Necator americanus

Se utilizaron las secuencias de AcaNAP5 [SEC. ID. nº 3], AcaNAP6 [SEC. ID. nº 5], AcaNAPc2 [SEC. ID. nº 19], AcaNAP23 [SEC. ID. nº 31], AcaNAP24 [SEC. ID. nº 32], AcaNAP25 [SEC. ID. nº 33], AcaNAP315 [SEC. ID. nº 34], AcaNAP44 [SEC. ID. nº 35], AcaNAP45 [SEC. ID. nº 36], AcaNAP47 [SEC. ID. nº 37], AcaNAP48 [SEC. ID. nº 38], AceNAP4 [SEC. ID. nº 9], AceNAP5 [SEC. ID. nº 10], AceNAP7 [SEC. ID. nº 11], AduNAP4 [SEC. ID. nº 12], AduNAP7 [SEC. ID. nº 13], HpoNAP5 [SEC. ID. nº 14] (véase las Figuras 1, 3, 7 y 13) para aislar las moléculas relacionadas procedentes del parásito hematófago Necator americanus mediante clonación por PCR.

Se generaron secuencias de aminoácidos por consenso a partir de las zonas de homología entre las proteínas de NAP. Estas secuencias por consenso se utilizaron a continuación para diseñar los siguientes cebadores por PCR degenerados: NAP-1, 5’-AAR-CCN-TGY-GAR-MGG-AAR-TGY-3’ [SEC. ID. nº 90] correspondiente con la secuencia de aminoácidos NH_{2}-Lys-Pro-Cys-Glu-(Arg/Pro/Lys)-Lys-Cys [SEC. ID. nº 118]; NAP-4.RC, 5’-TW-RWA-NCC-NTC-YTT-RCA-NAC-RCA-3’ [SEC. ID. nº 91], correspondiente con la secuencia NH_{2}-Cys-(Val/Ile/Gln)-Cys-(Lys/Asp/Glu/Gln)-(Asp/Glu)-Gly-(Phe/Tyr)-Tyr [SEC. ID. nº 119]. Estos cebadores se utilizaron como pares para generar las sondas específicas de NAP por PCR utilizando como plantilla el ADNc de N. americanus.

Se adquirieron gusanos adultos, N. americanus en el Dr. David Pritchard, Universidad de Nottingham. Se preparó poli(A+) ARN utilizando el kit QuickPrep de purificación de ARNm (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Se transcribió a la inversa un microgramo de ARNm utilizando transcriptasa inversa AMV y cebadores hexámeros al azar (Amersham, Arlington Hills, IL). Se utilizó una quincuagésima parte del producto de la reacción del ADNc monocatenario como plantilla para \sim400 pmoles de cada NAP-1 y NAP-4.RC, con reactivos GeneAmp de PCR (Perkin Elmer, Norwalk, CT), en un ciclador térmico de ADN Perkin-Elmer. Las condiciones de la PCR fueron: ciclos 1 a 3, desnaturalización a 96ºC durante 2 minutos, hibridación a 37ºC durante 1 minuto y prolongación a 72ºC durante 3 minutos (la duración del gradiente entre 37ºC y 72ºC fue de 2 minutos); ciclos 4 a 5, desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, hibridación a 37ºC durante 1 minuto y prolongación a 72ºC durante 2 minutos (la duración del gradiente entre 37ºC y 72ºC fue de 2 minutos); ciclos 6 a 45, desnaturalización a 96ºC durante 1 minuto, hibridación a 37ºC durante 1 minuto y prolongación a 72ºC durante 2 minutos. Los tiempos de prolongación se aumentaron en 3 segundos/ciclo para los ciclos 6 a 45.

La ampliación por PCR del ADNc de N. americanus con NAP-1 y NAP-4.RC produjo un productos de ampliación de aproximadamente 100 bp. El producto de PCR se marcó con [a-32P]-dCTP (Amersham) utilizando marcaje con cebador aleatorios (Stratagene, La Jolla, CA) y el ADN marcado se separó de los nucleótidos no incorporados utilizando una columna Chromaspin-10 (Clonetech, Palo Alto, CA).

Se construyó un banco de ADNc utilizando el siguiente procedimiento. Se sintetizó ADNc de doble cadena a partir de 1 \mug de poli(A+) ARN de N. americanus utilizando transcriptasa inversa AMV y cebadores hexámeros al azar (Amersham, Arlington Hills, IL). Los fragmentos de ADNc mayores de aproximadamente 300 bp se purificaron en un gel de poliacrilamida al 6% y se ligaron a enlazadores EcoRI (Stratagene, San Diego, CA) utilizando procedimientos normalizados. El ADNc ligado se ligó en el corte EcoRI y lambda gt10 desfosforilado (Stratagene, San Diego, CA) y se encapsuló utilizando un kit Gigapack Gold II de encapsulación (Stratagene, San Diego, CA).

Las condiciones de prehibridación e hibridación fueron 6\times SSC (SSC: NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM, pH 7,0), fosfato sódico 0,02 M pH 6,5, 5\times solución de Denhardt, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado, sulfato de dextrano al 0,23%. La prehibridación y la hibridación fueron a 42ºC y los filtros se lavaron durante 30 minutos a 45ºC con 2\times SSC después de dos prelavados con 2\times SSC durante 20 minutos. Los filtros se expusieron toda la noche a película de rayos X con dos pantallas de intensificación a -70ºC.

Se cribaron aproximadamente 400.000 fagos recombinantes del banco de N. americanus cebados al azar (no ampliados) con el fragmento NAP-1/NAP-4.RC de PCR. Aproximadamente 11 fagos recombinantes se hibridaron con esta sonda, de la cual se aislaron cuatro para el análisis del secuenciado de nucleótidos. El secuenciado de la doble cadena se efectuó subclonando los fragmentos EcoRI del ADNc contenidos en estas cepas de fago en el vector pBluescript II KS+ (Stratagene, San Diego, CA). El ADN se secuenció utilizando el kit Sequenase versión 2.0 (Amersham, Arlington Hills, IL) y cebadores oligonucleotídicos M13 (Stratagene, San Diego, CA).

Las cuatro cepas lambda contenían ADN que codificó un único polipéptido NAP de 79 aminoácidos que se asemeja a las secuencias de NAP de Ancylostoma spp. y H. polygyrus. El polipéptido de NAP de N. americanus tiene un peso molecular calculado de 8.859,6 Daltons. En la Figura 14 se presentan el nucleótido y las secuencias deducidas de aminoácidos.

Ejemplo 14 Expresión de AceNAP4 recombinante en células COS A. Expresión

Se produjo temporalmente AceNAP4 en células COS esencialmente tal como se describió para Pro-AcaNAP5 en el Ejemplo 5 y Pro-AcaNAP6 en el Ejemplo 7.

Un fagómido de tipo pGEM que alberga el ADNc AceNAP4 (del Ejemplo 9), sirvió como diana para el rescate por PCR de la zona de codificación completa de AceNAP4, incluyendo la señal de secreción, que utiliza dos cebadores oligonucleótidos que agregan XbaI. Los cebadores utilizados fueron: (1) SHPCR4, que dirige el extremo 5’ del gen y que tiene la secuencia, GACCAGTCTA GACCACCATG GCGGTGCTTT ATTCAGTAGC AATA [SEC. ID. nº 120] y (2) SHPCR5, que dirige el extremo 3’ del gen y que tiene la secuencia, GCTCGCTCTA GATTATCGTG AGGTTTCTGG TGCAAAAGTG [SEC. ID. nº 121]. Las zonas de restricción de XbaI incluidas en los cebadores están subrayadas. Se utilizaron cebadores para ampliar la secuencia AceNAP4 según las condiciones descritas en el Ejemplo 5.

Después de la digestión con la enzima XbaI, el producto de la ampliación, que presenta el tamaño esperado, se aisló en un gel de agarosa y posteriormente se sustituyó por el fragmento de relleno XbaI de aproximadamente 450 pares de bases del vector pEF-BOS [Mizushima, S. y Nagata, S., Nucl. Acids Res., 18: 5322 (1990)]. Se siguió el protocolo descrito en el Ejemplo 5 para proporcionar el clon pEF-BOS-AceNAP4, que fue presentado en primer lugar para albergar la inserción XbaI en la orientación deseada por PCR utilizando los cebadores SHPCR4 e YG60, y posteriormente se confirmó mediante la determinación de la secuencia. Se utilizó este clon para transfectar las células COS según los métodos del Ejemplo 5.

Veinticuatro horas después de la transfección del las células COS (referirse al Ejemplo 5, apartado B) el medio COS que contiene FBS al 10% se sustituyó por 50 ml de un medio constituido por una mezcla 1:1 de DMEM y mezcla nutriente F-12 de Ham (Life Technologies (Gaithersburg, MD)). A continuación las células se continuaron incubando a 37ºC y se detectó la producción de EGR-factor Xa dependiente de la actividad inhibidora de TF/factor VIIa como se describe en el Ejemplo E.

B. Purificación de AceNAP4 1. Cromatografía de intercambio aniónico

El sobrenadante del cultivo de COS procedente de las células que expresan a AceNAP4 se centrifugó a 1.500 r.p.m. (aproximadamente 500\timesg) durante 10 minutos antes de añadir los siguientes inhibidores de proteasa (ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA), pepstatina A 1,0 \times 10^{-5} M (ácido isovaleril-Val-Val-4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanoil-Ala-4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico) y AEBSF (fluoruro de 4-(2-aminoetil)-bencensulfonilo) 1 \times 10^{-5} M. Se añadió acetato sódico sólido hasta una concentración final de 50 mM antes de ajustar el pH con HCl 1 N a pH 5,3. Se clarificó el sobrenadante por pasadas a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,22 micrómetros (Corning, Inc., Corning, NY, USA).

El sobrenadante clarificado (volumen total aproximadamente de 450 ml) se cargó en una columna Poros20 HQ (Perseptive Biosystems, MA) de 1 \times 2 cm preequilibrada con tampón Anion (acetato Na 0,05 M, NaCl 0,1 M, pH 5,3) a un caudal de 5 ml/minuto. La columna y la muestra estaban a temperatura ambiente durante esta etapa de purificación. La columna se lavó posteriormente con 10 volúmenes de columna de tampón Anion y 10 volúmenes de columna de acetato sódico 50 M, NaCl 0,37 M, pH 5,3.

El material que tenía actividad amidolítica inhibidora de fVIIa/TF dependiente de EGR-FXa (véase el Ejemplo E) se eluyó con acetato sódico 50 mM, NaCl 1 M, pH 5,3 a un caudal de 2 ml/minuto.

2. Cromatografía en fase inversa

Una alícuota del grupo de fracciones recogidas tras la cromatografía de intercambio aniónico se cargó en una columna C18 (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) de 0,46\times25 cm que se desarrolló a continuación con un gradiente lineal de acetonitrilo del 10 al 35% en ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v) a 1 ml/minuto con una velocidad de intercambio de 0,4% en acetonitrilo/minuto. Se controló la actividad inhibidora amidolítica de TF/FVIIa dependiente de EGR-FXa (véase el Ejemplo E) y se aislaron las fracciones que contenían esta actividad inhibidora y se secaron al vacío.

3. Caracterización de AceNAP4 recombinante

El compuesto AceNAP4 demostró movilidad por SDS-PAGE en un gel del 4 al 20%, de acuerdo con su tamaño previsto en la secuencia del ADNc (gel de material teñido con Coomassie después de la RP-cromatografía).

Ejemplo 15 Producción y purificación de AcaNAPc2 recombinante en P. pastoris A. Construcción del vector de expn

La expresión del gen AcaNAPc2 en P. pastoris se llevó a cabo utilizando el protocolo detallado en el Ejemplo 3 para la expresión de AcaNAP5 con las modificaciones siguientes.

El vector pDONG63 que contiene el ADNc de AcaNAPc2, descrito en el Ejemplo 10, se utilizó para aislar por ampliación ("recuperación por PCR") la zona que codifica la proteína AcaNAPc2 madura (utilizando Vent polimerasa de New England Biolabs, Beverly, MA; 20 ciclos de temperatura: 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC y 1,5 minutos a 72ºC). Se utilizaron los siguientes cebadores de oligonucleótido:

LJ190:

AAAGCAACGA-TGCAGTGTGG-TGAG [SEC. ID. nº 122]

LJ191:

GCTCGC\underbar{TCTA-GAAGCTT}CAG-TTTCGAGTTC-CGGGATATAT-AAAGTCC [SEC. ID. nº 123]

El cebador LJ191, que dirige las secuencias con terminal C, contenía una extensión no hibridada que incluía las secuencias de restricción XbaI y HindIII (subrayadas).

Tras la digestión con la enzima XbaI, el producto de la ampliación, que presenta el tamaño esperado, se aisló del gel y después se fosforiló enzimáticamente (T4 polinucleótido cinasa de New England Biolabs, Beverly, MA). Después de la inactivación térmica (10 minutos a 70ºC) de la cinasa, el fragmento XbaI con extremo truncado se clonó direccionalmente en el vector pYAM7SP8 para su expresión. El vector-fragmento receptor de pYAM7SP8 fue preparado por restricción de StuI-SpeI y se purificó en gel de agarosa. La cepa WK6 de E. coli [Zell, R. y Fritz, H.-J., EMBO J., 6: 1809-1815 (1987)], se transformó con la mezcla de ligadura y se seleccionaron clones resistentes a la ampicilina.

Basándose en el análisis de restricción, un clon del plásmido que contenía una inserción de las dimensiones esperadas, denominado pYAM7SP-NAPC2, se conservó para su posterior caracterización. La determinación de la secuencia del clon pYAM7SP-NAPC2 confirmó la inserción precisa de la zona de codificación AcaNAPc2 madura en fusión con la señal prepro principal, tal como estaba previsto por el esquema de construcción, así como la ausencia de mutaciones no deseadas en la zona de codificación.

(B) Expresión de AcaNAPc2 recombinante en P. pastoris

La cepa GTS115 (his4) de Pichia pastoris, ha sido descrita en Stroman, D. W. et al., patente US nº 4855.231. Todas las manipulaciones en P. pastoris se realizaron esencialmente como se describe en Stroman, D. W. et al., patente US nº 4855.231.

Se electroporó aproximadamente 1 microgramo de ADN del plásmido pYAM7SP-NAPC2 en la cepa GTS115 utilizando un protocolo de electroporación normalizado. Se linealizó previamente el plásmido por digestión con SalI, que teóricamente dirige el episodio de integración en el locus cromosómico his4.

La selección de una cepa de elevada expresión de AcaNAPc2 se realizó como se describe en el Ejemplo 3 para la isoforma 5 de NAP (AcaNAP5) utilizando cribado de minicultivos. Se analizó la presencia en minicultivos de AcaNAPc2 segregada utilizando el análisis de fVIIa/TF-EGR-fXa (Ejemplo E) que da como resultado la selección de dos clones. Tras una segunda ronda de cribado, utilizando el mismo procedimiento, pero esta vez a nivel del frasco con agitación, se seleccionó una célula hospedadora aislada y se denominó GTS115/7SP-NAPc2 de P. pastoris.

Se demostró que la célula hospedadora, GTS115/7SP-NAPc2, presentaba un fenotipo para utilización en metanol natural (Mut^{+}), que demostraba que la integración de la casete de expresión en el cromosoma de GTS115 no alteraba la funcionalidad del gen AOX1 genómico.

La producción posterior de material AcaNAPc2 recombinante se realizó en cultivos en matraz de agitación, como se describe en Stroman, D. W. et al., patente US nº 4855.231. Se purificó el producto recombinante procedente del sobrenadante celular de Pichia pastoris como se describe a continuación.

C. Purificación de AcaNAPc2 recombinante 1. Cromatografía de intercambio catiónico

El sobrenadante del cultivo (100 ml) se centrifugó a 16.000 r.p.m. (aproximadamente 30.000\timesg) durante 20 minutos antes de ajustar el pH a 3 con HCl 1 N. Se redujo la conductividad del sobrenadante a menos de 10 mS/cm añadiendo agua MilliQ. Se clarificó el sobrenadante diluido mediante el paso a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,22 micrómetros (Corning Inc., Corning, NY, USA).

Se cargó el volumen total (aproximadamente 500 ml) de sobrenadante en una columna Poros20 HS (Perseptive Biosystems, MA) de 1 \times 2 cm preequilibrada con tampón Cation (citrato de sodio 0,05 M, pH 3) a un caudal de 5 ml/minuto (400 cm/hora). La columna y la muestra estuvieron a temperatura ambiente a lo largo de esta etapa de purificación. Se lavó la columna posteriormente con 50 volúmenes de columna de tampón Cation y 10 volúmenes de columna de tampón Cation que contenían NaCl 0,1 M. El material que presentaba actividad inhibidora en un ensayo de protrombinasa se eluyó con tampón Cation que contenía NaCl 1 M a un caudal de 2 ml/minuto.

2. Cromatografía en tamices moleculares utilizando Superdex30

La mezcla de elución que contenía material inhibidor EGR-fXa-fVIIa/TF (3 ml) procedente de la columna de intercambio catiónico se cargó en una columna Superdex30 PG (Pharmacia, Suecia) de 1,6 \times 66 cm preequilibrada con fosfato sódico 0,1 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M a temperatura ambiente. Se realizó la cromatografía a un caudal de 2 ml/minuto. La actividad inhibidora de la protrombinasa eluyó 56 a 64 ml en la serie y se agrupó.

3. Cromatografía en fase inversa

Se cargó 1 ml de las fracciones mezcladas en la cromatografía por filtración en gel en una columna C18 de 0,46 \times 25 cm (218TP54 Vydac; Hesperia, CA) que se desarrolló a continuación con un gradiente lineal de acetonitrilo del 10 al 30% en ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v) con una velocidad de intercambio de 0,5% en acetonitrilo/minuto. El pico principal que eluyó alrededor de 20 a 25% de acetonitrilo, se recogió manualmente y presentaba actividad inhibidora de protrombinasa.

4. Determinación de la masa molecular

Se determinó la masa estimada del principal constituyente aislado descrito en los apartados (1) a (3) de este ejemplo utilizando espectrometría de masas con ionización por electroatomización. La masa estimada de AcaNAPc2 recombinante fue de 9.640 daltons, totalmente de acuerdo con la masa molecular de esta molécula derivada de la secuencia de ADNc.

Ejemplo 16 Expresión de AcaNAP42 en P. pastoris

El vector pGEM-9zf(-) (Promega) que contenía el ADNc de AcaNAP42 (Ejemplo 12) se utilizó para aislar la zona que codifica la proteína AcaNAP42 madura por ampliación por PCR (utilizando Taq polimerasa de Perkin Elmer, Branchburg, New Jersey; 25 ciclos de temperatura: 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC y 1 minuto a 72ºC). Se utilizaron los cebadores oligonucleotídicos siguientes:

oligo 3:

5’ GAG ACT \underbar{TTT AAA} TCA CTG TGG GAT CAG AAG 3’ [SEC. ID. nº 124]

oligo 2:

5’ TTC AGG \underbar{ACT AGT} TCA TGG TGC GAA AGT AAT AAA 3’ [SEC. ID. nº 125]

El cebador de oligo 3, que dirige la secuencia N-terminal, contenía una extensión no hibridada que incluye la secuencia de restricción DraI (subrayada). El cebador de oligo 2, que dirige la secuencia C-terminal, contenía la secuencia de restricción SpeI.

El producto de la ampliación de NAP, que presenta el tamaño esperado de aproximadamente 250 bp, se digirió con las enzimas DraI y SpeI, se purificó por extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1, volumen/volumen) y se precipitó en alcohol etílico. El receptor vector-fragmento de pYAM7SP8 (Ejemplo 3) se preparó mediante las enzimas de restricción StuI-SpeI, se purificó por extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1, volumen/volumen) y se precipitó en alcohol etílico. La cepa XL1-Blue de E. coli [Bullock, W. O., Fernández, J. M., y Short, J. M. Biotechniques 5: 376-379 (1987)], se transformó con la mezcla de ligadura que contenía los fragmentos de ADN anteriores y se seleccionaron clones resistentes a ampicilina.

Basándose en el análisis de restricción, un clon del plásmido que contenía una inserción de las dimensiones esperadas, denominado pYAM7SP8-NAP42, se conservó para su posterior caracterización. La determinación de la secuencia del clon confirmó la inserción correcta de la zona de codificación madura en fusión con la señal prepro principal de PHO1/factor alfa, tal como estaba previsto por el esquema de construcción, así como la ausencia de mutaciones no deseadas en la zona de codificación.

Se electroporaron aproximadamente 10 microgramos de ADN de pYAM 7SP-NAP 42 en la cepa GTS115 (his4) de Pichia, descrita en el Ejemplo 3. El plásmido fue digerido previamente por la enzima NotI, que dirige el episodio de integración en el locus cromosómico de AOX1.

Se seleccionaron transformantes His+ como se describe en el Ejemplo 3. Colonias aisladas (n=90) procedentes de la electroporación se cultivaron en pocillos de una placa de 96 pocillos que contenía 100 microlitros de medio mínimo en glicerol durante 24 horas en una placa con agitador a temperatura ambiente. Un litro del medio mínimo en glicerol contenía 13,4 g de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (DIFCO); 400 microgramos de biotina; 100 ml de glicerol y fosfato de potasio 10 mM (pH 6,0).

Las células se sedimentaron y se volvieron a poner en suspensión en medio mínimo en metanol reciente (la misma composición que anteriormente excepto que los 10 ml de glicerol se sustituyeron por 5 ml de metanol) para producir el activador AOX1. Después de un periodo de incubación adicional 24 horas en agitación a temperatura ambiente, se analizaron 10 microlitros de sobrenadantes de cultivo mediante el análisis del tiempo de protrombina (Ejemplo B). Se detectó la presencia de AcaNAP42 segregada por la prolongación del tiempo de coagulación del plasma humano.

Ejemplo 17 Expresión de AcaNAPc2/prolina en P. pastoris

Para aumentar la estabilidad y el nivel de expresión de AcaNAPc2, se construyó un ADNc mutante que codificaba un resto adicional de prolina en el terminal C de la proteína (AcaNAPc2/prolina o "AcaNAPc2P"). El vector de expresión, pYAM7SP8-NAPc2/prolina, se preparó de la misma manera que la descrita en el Ejemplo 16. El cebador oligo 8 es el cebador N-terminal con la secuencia de restricción DraI y el cebador oligo 9 es el cebador con terminal C que contiene la secuencia XbaI y el codón de aminoácido, TGG, para añadir un resto de prolina al terminal C de la forma natural de AcaNAPc2.

oligo 8:

5’ GCG \underbar{TTT AAA} GCA ACG ATG CAG TGT GGT G 3’ [SEC. ID. nº 126]

oligo 9:

5’ C GC\underbar{T CTA GA}A GCT TCA TGG GTT TCG AGT TCC GGG ATA TAT AAA GTC 3’ [SEC. ID. nº 127]

Tras la digestión del producto de ampliación (aproximadamente 270 bp) con DraI y XbaI, se purificó el producto de la ampliación y se ligó con el vector-fragmento del pYAM7SP8 preparado por restricción de StuI-SpeI. El clon del plásmido que contenía la inserción AcaNAPc2/prolina fue confirmada por secuenciado del ADN y se denominó pYAM7SP8/-NAPc2/prolina.

Se utilizó el vector pYAM7SP8/-NAPc2/prolina para transformar la cepa GTS115 (his) descrita en el Ejemplo 16. Se seleccionaron transformantes y se cultivaron según el Ejemplo 16. Se detectó la presencia de AcaNAPc2/prolina segregada en el medio de cultivo mediante la prolongación del tiempo de coagulación del plasma humano (véase Ejemplo B).

Ejemplo 18 Métodos alternativos para la purificación de AcaNAP5, AcaNAPc2 y AcaNAPc2P (A) AcaNAP5

Un método alternativo para la purificación de AcaNAP5 del medio de fermentación es el siguiente. Se extrajeron células procedentes de una fermentación de una cepa de Pichia pastoris que expresa AcaNAP5 y se congeló el medio. El protocolo de purificación se inició descongelando el medio congelado durante la noche a 4ºC, a continuación diluyéndolo con aproximadamente cuatro partes de agua Milli Q para reducir la conductividad por debajo de 8 mS. Se ajustó el pH a 3,5 y se filtró el medio utilizando un filtro de acetato de celulosa de 0,22 \mum (Corning Inc., Corning, NY).

\newpage

Se determinó la actividad del material que contenía NAP en el análisis de tiempo de coagulación de protrombina al comienzo del procedimiento de purificación y en cada etapa en el procedimiento utilizando el protocolo del Ejemplo B.

El medio filtrado se aplicó a una columna SP-Fast Flow de Pharmacia, a un caudal de 60 ml/min a temperatura ambiente y se lavó la columna con 10 volúmenes de columna de citrato/fosfato 50 mM, pH 3,5. Se realizó la etapa de elución con NaCl 100 mM, NaCl 250 mM y a continuación NaCl 1.000 mM, todos en citrato/fosfato 50 mM, pH 3,5. Se detectó la actividad de PT en el eluído de NaCl 250 mM. Se dializó el eluído total hasta que la conductividad fue inferior a 8 mS.

Se ajustó el pH del material a 4,5 con ácido acético, y a continuación se aplicó a una columna con sulfoetil aspartamida a temperatura ambiente. Se utilizaron aproximadamente 10 volúmenes de columna de acetato de amonio 50 mM, pH 4,5, acetonitrilo al 40% para lavar la columna. Se eluyó la columna con acetato amónico 50 mM, pH 4,5/acetonitrilo al 40%/NaCl 200 mM, y se dializó o diafiltró el eluído como anteriormente.

Se ajustó el eluído a TFA al 0,1%, se aplicó a una columna Vydac C18 en fase inversa proteína/péptido a temperatura ambiente y se eluyó utilizando TFA al 0,1%/acetonitrilo al 19%, seguido de TFA al 0,1%, acetonitrilo al 25%, a un caudal de 7 ml/min. Se detectó NAP y se recuperó de la elución de TFA al 0,1%/acetonitrilo al 25%.

(B) AcaNAPc2 y AcaNAPc2P

AcaNAPc2 o AcaNAPc2P pueden purificarse como se describió anteriormente con las siguientes modificaciones del protocolo. Después de la descongelación y dilución del medio para conseguir una conductividad superior a 8 mS, se ajustó el pH del medio que contiene AcaNAPc2 a pH 5,0 utilizando NaOH. El medio filtrado se aplicó a una columna SP-Fast Flow de Pharmacia, a un caudal de 60 ml/min a temperatura ambiente y se lavó la columna con 10 volúmenes de columna de ácido acético 50 mM, pH 5,0. Se realizó la etapa de elución con NaCl 100 mM, NaCl 250 mM y a continuación NaCl 1.000 mM, todos en ácido acético 50 mM, pH 5,0. Se detectó la actividad de PT en el eluído de NaCl 250 mM. Se dializó el eluído total hasta que la conductividad fue inferior a 8 mS y se siguió el protocolo esbozado anteriormente utilizando sulfoetil aspartamida y cromatografía RP-HPLC.

Ejemplo A Análisis amidolítico del factor Xa

Se evaluó la capacidad de las NAP de la presente invención para actuar como inhibidores de la actividad catalítica del factor Xa determinando la inhibición inducida por NAP de la actividad amidolítica catalizada por la enzima humana y representada por los índices Ki*.

El tampón utilizado para todos los análisis fue HBSA (HEPES 10 mM, pH 7,5, cloruro sódico 150 mM, albúmina de suero bovino al 0,1%). Todos los reactivos eran de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), a menos que se indique de otra manera.

El análisis se realizó combinando en pocillos apropiados de una placa de microvaloración Corning, 50 microlitros de HBSA, 50 microlitros del compuesto NAP de ensayo diluido (0,025 - 25 nM) en HBSA (o HBSA solo para la medición de la velocidad desinhibida) y 50 microlitros de la enzima del factor Xa diluida en HBSA (preparado a partir del factor X humano purificado adquirido en Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN) según el método descrito por Bock, P. E. et al., Archives of Biochem. Biophys. 273: 375 (1989). La enzima se diluyó en HBSA antes del análisis en la que la concentración final fue de 0,5 nM). Tras una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, se añadieron a los pocillos 50 microlitros del sustrato S2765 (dihidrocloruro de N-alfa-benciloxicarbonil-D-argininil-L-glicil-L-arginina-p-nitroanilida, adquirido en Kabi Diagnostica (o Kabi Pharmacia Hepar Inc., Franklin, OH) y preparado en agua desionizada seguido de dilución en HBSA antes del análisis) proporcionando un volumen total final de 200 microlitros y una concentración final de 250 micromolar (aproximadamente 5 veces K_{m}). La velocidad inicial de la hidrólisis del sustrato cromógeno se midió por el cambio de absorbancia a 405 nm utilizando un lector de microplacas cinético Thermo Max® (Molecular Devices, Palo Alto, CA) durante un periodo de 5 minutos en el que se utilizó menos del 5% del sustrato añadido.

Las relaciones de preequilibrio inhibido, las velocidades en estado estacionario que contienen NAP (V_{i}) a la velocidad desinhibida de fXa libre solo (V_{o}) se representaron frente a las concentraciones correspondientes de NAP. Estos datos se ajustaron a continuación directamente a una ecuación para los inhibidores de enlace fuerte [Morrison, J. F., y Walsh, C. T., Adv. Enzymol. 61:201-300 (1988)], a partir de los cuales se calculó la constante K_{i}* inhibidora de la disociación del equilibrio aparente.

La Tabla 1 proporciona a continuación los valores de K_{i}* para los compuestos del ensayo AcaNAP5 [SEC. ID. nº 4], AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6] y AcaNAPc2 [SEC. ID. nº 59], preparados como se describe en los Ejemplos 3, 4 y 15, respectivamente. Los datos demuestran la utilidad de AcaNAP5 y AcaNAP6 como potentes inhibidores in vitro de FXa humano. En cambio, AcaNAPc2 no inhibe con eficacia la actividad amidolítica de FXa lo que indica que no afecta la actividad catalítica de fXa libre.

TABLA 1

1

Ejemplo B Ensayos de tiempo de protrombina (PT) y de tiempo parcial de la tromboplastina activada (aPTT)

Los efectos anticoagulantes ex vivo de las NAP de la presente invención en el plasma humano fueron evaluados midiendo la prolongación del tiempo parcial de la tromboplastina activada (aPTT) y del tiempo de protrombina (PT) en un intervalo de concentración amplio de cada inhibidor.

Se adquirió plasma humano citrado normal combinado, recién congelado en George King Biomedical, Overland Park, KS. Las mediciones respectivas de aPTT y PT se realizaron utilizando el coagulómetro automático Coag-A-Mate RA4 (General Diagnostics, Organon Technica, Oklahoma City, OK) utilizando el reactivo aPTT Platelin® L automático (Organon Technica, Durham, NC) y Simplatina® Excel (Organon Technica, Durham, NC) respectivamente, como iniciadores de coagulación según las instrucciones del fabricante.

Los ensayos se realizaron haciendo una serie de diluciones de cada NAP analizada en plasma descongelado seguido de adición de 200 microlitros o 100 microlitros de los reactivos mencionados anteriormente a los pocillos del carrusel de análisis para las mediciones de aPTT o PT, respectivamente. Alternativamente, las NAP se diluyeron en serie en HBSA y se añadieron 10 \mul de cada dilución a 100 \mul de plasma humano normal en los pocillos del carrusel de análisis Coag-A-Mate, seguido de adición de reactivo.

Se representaron las concentraciones de NAP frente al tiempo de coagulación y se calculó una concentración del tiempo doble, es decir una concentración especificada de NAP que duplicaba el tiempo de coagulación de referencia del PT o del aPTT. Los tiempos de coagulación de referencia (en ausencia de NAP) en el PT y aPTT fueron de 12,1 segundos y de 28,5 segundos, respectivamente.

La Tabla 2 a continuación presenta los efectos anticoagulantes ex vivo de AcaNAP5 [SEC. ID. nº 4], AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6], AcaNAPc2 [SEC. ID. nº 59] y AceNAP4 [SEC. ID. nº 62] y Pro-AcaNAP5 [SEC. ID. nº 7] representados por la concentración de cada una que duplicaba (concentración doble) el tiempo de coagulación de referencia del plasma humano normal en los ensayos de coagulación PT y aPTT respectivos en comparación con el ensayo de referencia en el que ninguna de dichas NAP estaba presente. Los datos demuestran la utilidad de estos compuestos como potentes anticoagulantes de la coagulación del plasma humano. Los datos demuestran también la equivalencia de NAP natural y de NAP recombinante.

TABLA 2

2

Las Figuras 10A y 10B presentan también la prolongación inducida por NAP del PT (Figura 10A) y aPTT (Figura 10B) en función de la dosis.

Ejemplo C Ensayo de inhibición de protrombinasa

Se evaluó la capacidad de la NAP de la presente invención para actuar como inhibidor de la activación de protrombina por el Factor Xa que ha sido ensamblado en un complejo fisiológico de protrombinasa determinando la constante Ki* de inhibición respectiva.

Se midió la actividad de la protrombinasa utilizando un análisis amidolítico acoplado, donde un complejo preformado de FXa humano, el Factor Va humano (FVa) y las vesículas de fosfolípido activan en primer lugar la protrombina humana a trombina. Se mide la actividad amidolítica de la trombina generada utilizando simultáneamente un sustrato cromógeno. El FVa humano purificado se adquirió en Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT). Se adquirió protrombina humana purificada en Celsus Laboratories, Inc. (Cincinnati, OH). El sustrato cromógeno Pefachrome t-PA (CH_{3}SO_{2}-D-hexahidropirosina-glicil-L-arginina-p-nitroanilida) de Pentapharm Ltd (Basilea, Suiza) se adquirió en Centerchem, Inc. (Tarrytown, NY). Se redisolvió el sustrato en agua desionizada antes de su uso. Se prepararon vesículas de fosfolípido, constituidas por fosfatidil colina (67%, p/v), fosfatidil glicerol (16%, p/v), fosfatidil etanolamina (10%, p/v) y fosfatidil serina (7%, p/v) en presencia de detergente, según describe Ruf et al. [Ruf, W., Miles, D. J., Rehemtulla, A., y Edgington, T. S. Methods in Enzymology 222: 209-224 (1993)]. Los fosfolípidos se adquirieron en Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama).

El complejo de protrombinasa se formó en un tubo de ensayo de polipropileno combinando FVa, FXa y vesículas de fosfolípido (PLV) en HBSA que contenía CaCl_{2} 3 mM durante 10 min. En pocillos apropiados de una placa de microvaloración, se combinaron 50 \mul del complejo con 50 \mul de NAP diluida en HBSA o HBSA solo (para la medición de V_{o} (velocidad no inhibida). Tras una incubación de 30 min a temperatura ambiente, se iniciaron las reacciones por triplicado mediante la adición de una solución del sustrato que contenía protrombina humana y el sustrato cromógeno para la trombina, Pefachrome tPA. La concentración final de los reactivos en un volumen total de 150 \mul de HBSA fue: NAP (0,025-25 nM), FXa (250 fM), PLV (5 \muM), protrombina (250 nM), Pefachrome tPA (250 \muM, 5\timesK_{m}) y CaCl_{2} (3 mM).

Se midió la actividad de protrombinasa de fXa como un aumento de la absorbancia a 405 nm durante 10 min (velocidad), exactamente como se describe en el Ejemplo A, en condiciones en estado estacionario. El aumento de la absorbancia fue sigmoideo a lo largo del tiempo, reflejando las reacciones acopladas de la activación de protrombina por el complejo de protrombinasa que contiene FXa, y la hidrólisis posterior de Pefachrome tPA por la trombina generada. Los datos de cada pocillo por triplicado se combinaron y se ajustaron mediante análisis de regresión lineal de los mínimos cuadrados, reiterativo, en función de la absorbancia frente al tiempo^{2}, tal como describe [Carson, S. D. Comput. Prog. Biomed. 19: 151-157 (1985)] para determinar la velocidad inicial (V_{i}) de la activación de protrombina. Las relaciones de las velocidades iniciales inhibidas en estado estacionario que contienen NAP (V_{i}) a la velocidad desinhibida de protrombinasa fXa sola (V_{o}) se representaron frente a las concentraciones de NAP correspondientes. Estos datos se ajustaron directamente a la ecuación para los inhibidores de enlace ajustado, como en el Ejemplo A anterior, y se calculó la constante K_{i}* inhibidora de la disociación del equilibrio aparente.

La Tabla 3 a continuación proporciona la constante del inhibidor de disociación (K_{i}*) de AcaNAP5 [SEC. ID. nº 4], AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6] y AcaNAPc2 [SEC. ID. nº 59] recombinantes (preparadas todas en Pichia pastoris tal como se describe) frente a la activación de protrombina por fXa humano incorporada en un complejo de protrombinasa. Estos datos demuestran la utilidad de estos compuestos como inhibidores de FXa humano incorporado en el complejo de protrombinasa.

TABLA 3

3

Los datos presentados en los Ejemplos A, B y C sugieren que AcaNAP5 y AcaNAP6 pueden interactuar con FXa de manera similar lo que implica directamente el acceso restrictivo tanto del peptidilo como del sustrato macromolecular (protrombina) al centro catalítico de la enzima. En cambio, AcaNAPc2 parece ser que interactúa con FXa de una manera que solamente perturba las interacciones macromoleculares de esta enzima con la estructura y/o el cofactor (Factor Va), mientras que no inhibe directamente el recambio catalítico del sustrato peptidilo (véase la Tabla 1).

Ejemplo D Ensayos con enzima in vitro de determinación de la especificidad de la actividad

Se evaluó la capacidad de la NAP de la presente invención para actuar como inhibidor selectivo de la actividad catalítica de FXa o la actividad de TF/VIIa determinando si la NAP del ensayo inhibiría otras enzimas en un ensayo a una concentración que fue 100 veces mayor que la concentración de las siguientes serina proteasas relacionadas: trombina, Factor Xa, Factor XIa, Factor XIIa, calicreína, proteína C activada, plasmina, activador de plasminógeno tisular recombinante (rt-PA), urocinasa, quimiotripsina y tripsina. Estos análisis se utilizaron también para determinar la especificidad de las NAP con actividad inhibidora de serina proteasa.

(1) Protocolo general para los ensayos de inhibición enzimática

El tampón utilizado para todos los análisis fue HBSA (Ejemplo A). Todos los sustratos se redisolvieron en agua desionizada, seguido de dilución en HBSA antes del análisis. Se realizó el ensayo amidolítico para determinar la especificidad de la inhibición de las serinas proteasas combinando en pocillos apropiados de una placa de microvaloración Corning, 50 \mul de HBSA, 50 \mul de NAP a una concentración específica diluido en HBSA, o HBSA solo (velocidad de control no inhibida, V_{o}), y 50 \mul de una enzima especificada (véanse las enzimas específicas a continuación). Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 50 \mul del sustrato a pocillos por triplicado. La concentración final de los reactivos en un volumen total de 200 \mul de HBSA fue: NAP (75 nM), enzima (750 pM) y sustrato cromógeno (como se indica a continuación). La velocidad inicial de la hidrólisis del sustrato cromógeno se midió como un cambio de absorbancia a 405 nm durante un periodo de 5 minutos, en el cual menos del 5% del sustrato añadido se hidrolizó. Las velocidades de las muestras de ensayo, que contienen NAP (V_{i}) se expresan a continuación en tanto por ciento de la velocidad de referencia no inhibida (V_{o}) mediante la fórmula siguiente: V_{i}/V_{o} \times 100, para cada una de las enzimas.

(2) Ensayos específicos de la enzima (a) Ensayo de trombina

La actividad catalítica de la trombina se determinó utilizando el sustrato cromógeno Pefachrome t-PA (CH_{3}SO_{2}-D-hexahidropirosina-glicil-L-arginina-p-nitroanilida) de Pentapharm Ltd., (Basilea, Suiza). La concentración final de Pefachrome t-PA fue de 250 \muM (aproximadamente 5 veces K_{m}). La alfa-trombina humana purificada se adquirió en Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN).

(b) Ensayo del Factor Xa

La actividad catalítica del factor Xa se determinó utilizando el sustrato cromógeno S-2765 (N-benciloxicarbonil-D-arginina-L-glicina-L-arginina-p-nitroanilina), adquirido en Kabi Pharmacia Hepar Inc., Franklin, OH). Todos los sustratos se redisolvieron en agua desionizada antes de su utilización. La concentración final de S-2765 fue de 250 \muM (aproximadamente 5 veces K_{m}). El Factor X humano purificado se adquirió en Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN) y el Factor Xa (FXa) se activó y preparó a partir del Factor X tal como se describe [Bock, P. E., Craig, P. A., Olson, S. T., y Singh, P. Arch. Biochem. Biophys. 273:375-388 (1989)].

(c) Ensayo del Factor XIa

La actividad catalítica del factor FXIa se determinó utilizando el sustrato cromógeno S-2366 (L-piroglutamil-L-prolil-L-arginina-p-nitroanilina), adquirido en Kabi Pharmacia Hepar Inc., Franklin, OH). La concentración final de S-2366 fue de 250 \muM. El FXIa humano purificado se adquirió en Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN).

(d) Ensayo del Factor XIIa

La actividad catalítica del Factor FXIIa se determinó utilizando el sustrato cromógeno Spectrozyme FXIIa (H-D-CHT-L-glicil-L-arginina-p-nitroanilina), adquirido en American Diagnostica, Greenwich, CT). La concentración final de Spectrozyme FXIIa fue de 100 \muM. El FXIIa humano purificado se adquirió en Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN).

(e) Ensayo del calicreína

La actividad catalítica de la calicreína se determinó utilizando el sustrato cromógeno S-2302 (H-D-prolil-L-fenilalanil-L-arginina-p-nitroanilina), adquirido en Kabi Pharmacia Hepar Inc., Franklin, OH). La concentración final de S-2302 fue de 400 \muM. La calicreína humana purificada se adquirió en Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN).

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(f) Proteína C activada (aPC)

La actividad catalítica de la proteína C activada se determinó utilizando el sustrato cromógeno Spectrozyma PCa (H-D-lisil(-Cbo)-L-prolil-L-arginina-p-nitroanilina) adquirido en American Diagnostica Inc. (Greenwich, CT). La concentración final fue de 400 \muM (aproximadamente 4 veces K_{m}). La aPC humana purificada se adquirió en Hematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT).

(g) Ensayo de plasmina

La actividad catalítica de plasmina se determinó utilizando el sustrato cromógeno S-2366 (L-piroglutamil-L-prolil-L-arginina-p-nitroanilina, adquirido en Kabi Pharmacia Hepar Inc., Franklin, OH). La concentración final de S-2366 fue de 300 \muM (aproximadamente 4 veces K_{m}). La plasmina humana purificada se adquirió en Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN).

(h) Activador recombinante de plasminógeno tisular (rt-PA)

La actividad catalítica del rt-PA se determinó utilizando el sustrato Pefachrome t-PA (CH_{3}SO_{2}-D-hexahidropirosina-glicil-L-arginina-p-nitroanilida, adquirido en Pentapharm Ltd., Basilea, Suiza). La concentración final de Pefachrome t-PA fue de 500 \muM (aproximadamente 3 veces K_{m}). La rt-PA humana (Activase®) se adquirió en Genentch, Inc. (San Francisco Sur, CA).

(i) Urocinasa

Se determinó la actividad catalítica de urocinasa utilizando el sustrato S-2444 (L-piroglutamil-L-glicil-L-arginina-p-nitroanilina, adquirido en Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH). La concentración final de S-2444 fue de 150 \muM (aproximadamente 7 veces K_{m}). La urocinasa humana (Abbokinase®), purificada a partir de células renales humanas cultivadas, se adquirió en Abbott Laboratories (Chicago Norte, IL).

(j) Quimiotripsina

Se determinó la actividad catalítica de la quimiotripsina utilizando el sustrato cromógeno, S-2586 (metoxi-succinil-L-argininil-L-prolil-L-tirosina-p-nitroanilina, que se adquirió en Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH). La concentración final de S-2586 fue de 100 \muM (aproximadamente 8 veces K_{m}). La quimiotripsina pancreática bovina (cristalizada 3 veces; CDI) se adquirió en Worthington Biochemical Corp. (Freehold, NJ).

(k) Tripsina

Se determinó la actividad catalítica de la tripsina utilizando el sustrato cromógeno S-2222 (N-benzoil-L-isoleucil-L-glutamil [-éster metílico]-L-arginina-p-nitroanilina, que se adquirió en Kabi Pharmacia Hepar, Franklin, OH). La concentración final de S-2222 fue de 300 \muM (aproximadamente 5 veces K_{m}). La tripsina pancreática humana purificada se adquirió en Scripps Laboratories (San Diego, CA).

La Tabla 4 presenta un listado de la inhibición de la actividad amidolítica de FXa y 10 serina proteasas adicionales mediante AcaNAP-5 recombinante [SEC. ID. nº 4] o AcaNAP-6 recombinante [SEC. ID. nº 6] (expresadas ambas en Pichia pastoris, tal como se describe), expresada en porcentaje de velocidad de referencia. Estas NAP demuestran un grado elevado de especificidad para la inhibición de FXa en comparación con las demás serina proteasas citadas.

TABLA 4

4

La Tabla 5 presenta un listado del efecto inhibidor de AcaNAPc2 recombinante [SEC. ID. nº 59] y AceNAP-4 recombinante [SEC. ID. nº 62] (expresadas ambas en Pichia pastoris, tal como se describe) sobre la actividad amidolítica de 11 serina proteasas seleccionadas. La inhibición se expresa en porcentaje de velocidad de referencia. Estos datos demuestran que estas NAP poseen un grado elevado de especificidad para las serina proteasas en la Tabla 5.

TABLA 5

5

Ejemplo E Ensayos para medir la inhibición del complejo fVIIa/TF por NAP (1) Ensayo de activación de fIX por fVIIa/TF

Este Ejemplo mide la capacidad de las NAP de la presente invención para actuar como inhibidores del complejo catalítico de fVIIa/TF, que desempeña una función principal en la iniciación de la respuesta a la coagulación en el ensayo del tiempo de la protrombina ex vivo (Ejemplo B). Se evaluó la activación del Factor IX tritiado por el complejo rFVIIa/rTF/PLV determinando la constante de inhibición intrínseca, K_{i}*.

El Factor VIIa humano recombinante, liofilizado y purificado se adquirió en BiosPacific, Inc. (Emeryville, CA) y se redisolvió en HBS (HEPES 10 mM, pH 7,5, cloruro sódico 150 mM) antes de su uso. El Factor X humano purificado se adquirió en Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN) y el factor Xa (FXa libre) se activó y se preparó a partir del Factor X tal como se describe (Bock, P. E., Craig, P. A., Olson, S. T. y Singh, P. Arch. Biochem. Biophys. 273:375-388 (1989)). El Factor Xa humano con bloqueo de la zona activa (EGR-FXa), que había sido inactivado de forma irreversible con L-glutamil-L-glicil-L-arginil-clorometilcetona, se adquirió en Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT). El factor tisular humano recombinante (rTF) fue producido por un sistema de expresión de baculovirus, y purificado hasta homogeneidad por cromatografía de afinidad a anticuerpo monoclonal (Corvas International, Inc., San Diego, CA).

La apoproteína rTF purificada se incorporó en vesículas de fosfolípido (rTF/PLV), constituidas por fosfatidil colina (75%, p/v), fosfatidil glicerol (25%, p/v) en presencia de detergente, según describe Ruf et al. (Ruf, W., Miles, D. J., Rehemtulla, A., y Edgington, T. S. Methods in Enzymology 222: 209-224 (1993)). Los fosfolípidos se adquirieron en Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama). El tampón utilizado para todos los ensayos fue HBSA (HBS que contiene albúmina de suero bovino al 0,1% (p/v). Todos los reactivos se adquirieron en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), a menos que se indique de otra manera.

Se controló la activación del ^{3}H-Factor IX (FIX) humano mediante el complejo rFVIIa/rTF midiendo la liberación del péptido de activación radiomarcado. El fIX humano purificado se adquirió en Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT) y marcado radioactivamente mediante tritiado reductor como se describe (Van Lenten y Ashwell, 1971, JBC 246, 1889-1894). La preparación tritiada resultante de FIX presentaba una actividad específica de 194 unidades de clonación/mg medida en plasma insuficiente en FIX inmunoeliminado (Ortho) y retuvo el 97% de su actividad. La actividad radioespecífica fue de 2,7 \times 10^{8} dpm/mg. La Km para la actividad de ^{3}H-FIX por rFVIIa/rTF/PLV fue de 25 nM, que era equivalente a la Km obtenida para FIX no tratado (no marcado).

El análisis para las determinaciones de K_{i}* se realizó de la forma siguiente: se combinaron rFVIIa y rTF/PLV en un tubo de ensayo de polipropileno y se dejó que formaran un complejo durante 10 min en HBSA, que contiene CaCl_{2} 5 mM. Se combinaron alícuotas de complejo de rVIIa/rTF/PLV en tubos de microcentrifugadora de polipropileno apropiados con EGR-FXa o FXa libre, cuando se incluyen, y el compuesto de ensayo NAP a varias concentraciones, después de la dilución en HBSA, o HBSA solo (como V_{o \ (velocidad \ no \ inhibida)} de referencia). Después de una incubación de 60 minutos a temperatura ambiente, se iniciaron las reacciones mediante la adición de ^{3}H-FIX. La concentración final de los reactivos en 420 \mul de HBSA fue: rFVIIa [50 pM], rTF [2,7 nM], PLV [6,4 micromolar], bien EGR-FXa o FXa libre [300 pM], NAP recombinante [5-1.500 pM], ^{3}H-FIX [200 nM] y CaCl_{2} [5 mM]. Además, se realizó la reacción de control de fondo que incluía todos los reactivos anteriores, excepto rFVIIa.

En los puntos de tiempo específicos (8, 16, 24, 32 y 40 min), se añadieron 80 \mul de la mezcla de reacción en un tubo eppendorf que contenía un volumen igual de EDTA 50 mM en HBS con BSA al 0,5% para interrumpir la reacción; esto fue seguido de la adición de 160 \mul de ácido tricloroacético al 6% (p/v). Se precipitó la proteína y se separó del sobrenadante por centrifugación a 16.000\timesg durante 6 min a 4ºC. La radioactividad contenida en el sobrenadante resultante se midió eliminando las alícuotas por triplicado que se añadieron a Scintiverse BD (Fisher Scientific, Fairlawn, NJ) y se analizaron cuantitativamente por recuento de centelleo líquido. La velocidad de control de activación fue determinada por análisis de recesión lineal de los recuentos solubles liberados a lo largo del tiempo en condiciones de estado estacionario, en las que menos del 5% de FIX tritiado se consumió. La referencia de fondo (<1,0% de la velocidad de referencia) se sustrajo en todas las muestras. Las relaciones de las velocidades inhibidas en estado estacionario (V_{i}), en presencia de una NAP, a la velocidad de referencia no inhibida de rFVIIa/TF sola (V_{o}) se representaron frente a las concentraciones de NPA correspondientes. Estos datos se ajustaron a continuación directamente a una ecuación para inhibidores de enlace ajustados [Morrison, J. F., y Walsh, C. T., Adv. Enzymol. 61:201-300 (1988)], a partir de los cuales se calculó la constante inhibidora de disociación del equilibrio aparente K_{i}*.

Los datos de AcaNAP5 recombinante, AcaNAP6, AcaNAPc2 y AceNAP4 (preparados tal como se describe), se presentan en la Tabla 6 siguiente apartado B, a continuación.

(2) Ensayo amidolítico del factor VIIa/factor tisular

Se evaluó la capacidad de las NAP de la presente invención para actuar como inhibidores de la actividad amidolítica del complejo fVIIa/TF determinando la constante de inhibición K_{i}* respectiva, en presencia y ausencia del Factor Xa humano activo con la zona bloqueada (EGR-fXa).

Se determinó la actividad amidolítica de rFVIIa/rTF utilizando el sustrato cromógeno S-2288 (H-D-isoleucil-L-prolil-L-arginina-p-nitroanilina), adquirido en Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH). Se redisolvió el sustrato en agua desionizada antes de su uso. Se combinaron rFVIIa y rTF/PLV en un tubo de ensayo de polipropileno, y se dejaron formar un complejo durante 10 min en HBSA, que contenía CaCl_{2} 3 mM. El análisis para las determinaciones de K_{i}* se realizó combinando en pocillos apropiados de una placa de microvaloración Corning 50 \mul del complejo rFVIIa/rTF/PLV, 50 \mul de EGR-FXa y 50 \mul de compuesto de ensayo NAP a varias concentraciones, tras la dilución en HBSA, o HBSA solo (para la medición de V_{o \ (velocidad \ no \ inhibida)}). Después de una incubación de 30 min a temperatura ambiente, se iniciaron las reacciones por triplicado añadiendo 50 \mul de S-2288. La concentración final de los reactivos en un volumen total de 200 \mul de HBSA fue: NAP recombinante (0,025-25 nM), rFVIIa (750 pM), rTF (3,0 nM), PLV (6,4 micromolar), EGR-FXa (2,5 nM) y S-2288 (3,0 mM, 3\times K_{m}).

Se midió la actividad amidolítica de rFVIIa/rTF/PLV como un aumento lineal en la absorbancia a 405 nm durante 10 min (velocidad), utilizando un lector de microplacas cinético Thermo Max® (Molecular Devices, Palo Alto, CA), en condiciones de estado estacionario, en las que se consumió menos del 5% del sustrato. Las relaciones de preequilibrio inhibido, las velocidades en estado estacionario (V_{i}), en presencia de NAP, a velocidad no inhibida en presencia de fXa libre sola (V_{0}) se representaron frente a las concentracones correspondientes de NAP. Estos datos se ajustaron directamente a continuación a la misma ecuación para inhibidores de enlace fuerte, se utilizaron en el Ejemplo E.1., a partir de los cuales se calculó la constante inhibidora de disociación del equilibrio aparente K_{i}*.

La Tabla 6 a continuación proporciona los valores de K_{i}* de AcaNAPc2 recombinante [SEC. ID. nº 59], AceNAP4 [SEC. ID. nº 62], AcaNAP5 [SEC. ID. nº 4] y AcaNAP6 [SEC. ID. nº 6] (preparadas en Pichia pastoris, como se describe) en ensayos inhibidores de la actividad de rFVIIa/rTF. Los datos demuestran la utilidad de AcaNAPc2 y AceNAP4 como potentes inhibidores del complejo rFVIIa/rTF/PLV humano en ausencia y presencia de FXa libre o Fxa activo con la zona bloqueada. La actividad in vitro de AcaNAPc2P (véase el Ejemplo 17) fue sustancialmente la misma que para AcaNAPc2.

TABLA 6

6

NI=sin inhibición

ND=no determinada

Ejemplo F Modelos in vivo de actividad de NAP (1) Evaluación de la actividad antitrombocítica de NAP en el modelo de rata de trombosis arterial dependiente de plaquetas inducida por FeCl_{3}

Se evaluaron las propiedades antitrombocíticas (prevención de la formación del trombo) de NAP utilizando el modelo de rata experimental comprobado de la trombosis vascular aguda.

El modelo de FeCl_{3} de rata es un modelo bien caracterizado de trombosis arterial dependiente de plaquetas que se ha utilizado para evaluar potenciales compuestos antitrombocíticos. Kurz, K. D., Main, B. W., y Sandusky, G. E., Thromb. Res., 60: 269-280 (1990). En este modelo, se forma un trombo oclusivo rico en plaquetas en un segmento de la arteria carótida de rata tratada localmente con una solución reciente de FeCl_{3} absorbida en una pieza de papel de filtro. Se cree que el FeCl_{3} se difunde en el segmento de la arteria tratada y produce la desendoteliación de la superficie del vaso afectado. Esto da como resultado la exposición de la sangre a las estructuras subendoteliales que a su vez producen la adherencia de plaquetas, la formación de trombina y la aglomeración de plaquetas. El resultado total es la formación oclusiva del trombo. El efecto de un compuesto de ensayo sobre la incidencia de la formación del trombo oclusivo tras la aplicación de FeCl_{3} se controla por flujotometría ultrasónica y se utiliza como punto final principal. La utilización de la flujotometría para medir la circulación sanguínea de la arteria carótida, es una modificación del procedimiento original en el que se emplea la detección térmica de la detección del coágulo. Kurz, K. D., Main, B. W., y Sandusky, G. E., Thromb. Res., 60: 269-280 (1990).

(a) Administración intravenosa

Se aclimataron ratas Harlan Sprague Dawley macho (420 a 450 g) por lo menos 72 horas antes de su utilización y se mantuvieron en ayunas durante 12 horas antes de la intervención quirúrgica con libre acceso al agua.

Los animales se prepararon, se anestesiaron con Nembutal y a continuación se insertaron catéteres para el control de la presión sanguínea, administración de fármaco y anestesia. Se aisló la arteria carótida izquierda realizando una incisión cervical en la línea media seguida de una disección roma y extendiendo las técnicas para separar un segmento de 2 cm del vaso de la funda de la carótida. Se inserta una sutura de seda bajo los extremos proximal y distal del vaso aislado para proporcionar la eliminación para la colocación de una sonda de flujo ultrasónica (Transonic) alrededor del extremo proximal del vaso. La sonda se asegura a continuación con un ramal estacionario.

Después de la intervención quirúrgica se seleccionaron al azar animales en un grupo de referencia (solución salina) o de tratamiento (AcaNAP5 recombinante). El compuesto de ensayo (preparado en P. pastoris según el Ejemplo 3) se administró como una única inyección intravenosa a las dosis esbozadas en la Tabla 7 tras la colocación de una sonda de flujo y 5 min antes del estímulo trombógeno. En t=0, se impregnó una pieza de 3 mm de diámetro de papel de filtro (Whatman) nº 3) con 10 \mul de una solución al 35% de FeCl_{3} reciente (preparada en agua) se aplicó al segmento de la arteria carótida distal aislada a la sonda de flujo. Se controlaron la presión sanguínea, la circulación sanguínea, la frecuencia cardíaca y la respiración durante 60 minutos. La frecuencia de la oclusión (definida como la obtención de la circulación sanguínea cero) se registró como punto final primario).

Se demostró la eficacia de AcaNAP [SEC. ID. nº 4] como agente antitrombótico en la prevención de la formación del trombo en este modelo in vivo mediante la reducción en función de la dosis de la frecuencia de la oclusión trombótica, como se presenta en la Tabla 7 a continuación.

TABLA 7

7

* -p\leq0,05 de solución salina de referencia por ensayo de Fisher

La dosis eficaz que impide el 50% de las oclusiones trombóticas en este modelo (ED_{50}) puede determinarse a partir de los datos anteriores representando la frecuencia de la oclusión frente a la dosis administrada. Esto permite una comparación directa de la eficacia antitrombocítica de AcaNAP5 con otros agentes antitrombóticos que se han evaluado también en este modelo como se describió anterior. La Tabla 8 a continuación proporciona un listado de los valores ED_{50} para varios agentes anticoagulantes bien conocidos en este modelo comparados con AcaNAP5.

TABLA 8

8

^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}ED_{50} se define como la dosis que impide la incidencia de la oclusión trombótica completa en el 50% de los animales ensayados\end{minipage}

^{b}péptico anticoagulante de garrapata recombinante, Vlasuk et al., Thromb. Haemostas. 70: 212-216 (1993)

(b) Administración subcutánea

El efecto antitrombótico de AcaNAP5 comparado con la heparina de bajo peso molecular (Enoxaparina; Lovenox, Rhone-Poulenc Rorer) después de la administración subcutánea se evaluó en ratas utilizando el modelo de FeCl_{3}. El modelo se llevó a cabo de manera idéntica a la descrita anteriormente con excepción de que el compuesto se administró por vía subcutánea y se determinó la eficacia en dos momentos diferentes: 30 y 150 minutos después de la administración. Para llevar a cabo esto, se emplearon ambas arterias carótidas de manera sucesiva. Los resultados de estos experimentos indican que AcaNAP5 [SEC. ID. nº 4] es un agente antitrombótico eficaz in vivo después de la administración subcutánea. Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 9.

TABLA 9

9

(2) Medida de la hemorragia en heridas profundas

Se utilizó un modelo de hemorragia en herida profunda para medir el efecto de NAP sobre la hemorragia y comparar el efecto con el de la heparina de bajo peso molecular.

Se anestesiaron ratas macho y se colocaron los instrumentos de manera idéntica a las que experimentaron el modelo de FeCl_{3}. Sin embargo, no se aplicó FeCl_{3} a la arteria carótida. La herida quirúrgica profunda en el cuello que expone la arteria carótida se empleó para cuantificar la pérdida de sangre a lo largo del tiempo. Se midió la pérdida de sangre durante un periodo de 3,5 horas después de la administración subcutánea de AcaNAP5 o LMWH. La herida se vendó con esponjas quirúrgicas que se eliminaban cada 30 minutos. Las esponjas se sumergieron sucesivamente en reactivo de Drabkin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) que lisa los glóbulos rojos y reacciona con la hemoglobina de manera colorimétrica. Las muestras colorimétricas se cuantificaron a continuación midiendo la absorbancia a 550 nM que proporciona una determinación de la cantidad de sangre en la esponja.

En la Figura 15 se presentan las características de la respuesta a la dosis para ambos compuestos de ensayo junto con los datos de eficacia para ambos compuestos. AcaNAP [SEC. ID. nº 4] fue mucho más potente que la heparina de bajo peso molecular para impedir la formación de trombo arterial oclusivo en este modelo. Además, los animales tratados con NAP sangraron menos que los tratados con heparina de bajo peso molecular.

Los datos presentados en las Tablas 7 y 9 y en la Figura 15 demuestran claramente la eficacia de NAP en la prevención de la formación del trombo oclusivo en este modelo experimental. La importancia de estos datos para impedir la trombosis humana es evidente cuando se compara con otros agentes anticoagulantes, listados en la Tabla 8. Estos agentes han sido evaluados en los mismos modelos experimentales descritos en la presente memoria, de manera idéntica a la descrita para las NAP, y en este modelo experimental y han demostrado eficacia antitrombótica para prevenir la formación del trombo clínicamente, como se describe en las siguientes citas bibliográficas: Heparin-Hirsh, J. N. Engl. J. Medicamento. 324:1565-1574, 1992, Cairns, J. A. et al. Chest 102: 456S-481S (1992); Argatroban-Gold, H. K. et al. J. Am. Coll. Cardiol. 21: 1039-1047 (1993); y Hirulog^{TM}-Sharma, G. V. R. K. et al., Am. J. Cardiol. 72: 1357-1360 (1993) y Lidón, R. M. et al., Circulation 88: 1495-1501 (1993).

Ejemplo G Modelo de cerdo de trombosis arterial coronaria aguda

El protocolo utilizado en estos estudios es una modificación de un modelo de trombosis que ha sido descrito anteriormente (Lucchesi, B. R., et al., (1994), Brit. J. Pharmacol. 113:1333-1343).

Se anestesiaron animales y se colocaron instrumentos con catéteres arterial y venoso (carótida izquierda común y yugular externa, respectivamente). Se practicó una toracotomía en el 4º espacio intecostal y se expuso el corazón. Se aisló la arteria coronaria descendiente anterior izquierda (LAD) del tejido conectivo sobreyacente y se colocaron instrumentos con una sonda de flujo Doppler y una estenosis de ligadura de calibre 17. Se implantó también un electrodo anódico en el interior del vaso.

Se tomaron mediciones de la línea de referencia y se administró NAP o placebo que debe ensayarse a través de la vena yugular externa. Cinco minutos después de la administración, se aplicó una corriente continua (300 \muA, DC) al electrodo estimulador para iniciar la lesión de la íntima al endotelio coronario y comenzar la formación del trombo. La corriente continuó durante un periodo de 3 horas. Se observaron los animales hasta 1 hora después del cese de la corriente o de la muerte del animal, lo que ocurriese en primer lugar.

La Tabla 10 presenta datos que demuestran la frecuencia de la oclusión en los animales administrados con AcaNAP5 o AcaNAPc2P (véase el Ejemplo 17) a tres dosis crecientes de NAP. La frecuencia de la oclusión en los animales que reciben placebo fue 8/8 (100%). El tiempo para la oclusión en los animales tratados con placebo fue de 66,6 \pm 7,5 min (media \pm sem). A los vasos en los cerdos tratados con AcaNAP que no pudieron ocluirse durante el periodo de 4 horas de observación se les asignó un tiempo arbitrario para la oclusión de 240 minutos con el fin de facilitar las comparaciones estadísiticas.

Los datos demuestran que AcaNAP5 y AcaNAPc2P fueron similarmente eficaces en esta instalación; ambos prolongaron el tiempo para la oclusión arterial coronaria en función de la dosis. Además, ambas moléculas prolongaron significativamente el tiempo para la oclusión a una dosis (0,03 mg/kg i.v.) que no produjo elevaciones significativas de hemorragia. Estos datos, y otros, sugieren que AcaNAP5 y AcaNAPc2P presentan índices terapéuticos favorables.

TABLA 10 Comparación de los puntos finales primarios entre AcaNAPc2P y AcaNAP5 tras la dosificación intravenosa en modelo de cerdo de la trombosis arterial coronaria aguda

10

<110> Corvas International, Inc.

\hskip1cm Vlasuk, George Phillip

\hskip1cm Stanssens, Patrick Eric Hugo

\hskip1cm Messens, Joris Hila Lieven

\hskip1cm Lauwereys, Marc Josef

\hskip1cm Laroche, Yves Rene

\hskip1cm Jespers, Laurent Stephane

\hskip1cm Gansemans, Yannick Georges Jozef

\hskip1cm Moyle, Matthew

\hskip1cm Bergum, Peter W.

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<120> PROTEÍNAS ANTICOAGULANTES E INHIBIDORES DE LA SERINA PROTEASA EXTRAÍDOS DE NEMÁTODOS

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<130> 018813/0272487

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<140> 09/498,556

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<141> 2000-04-02

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<150> 08/809,455

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<151> 1997-04-17

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/US95/13231

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<151> 1995-10-17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 08/486,399

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<151> 1995-06-05

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 08/486,397

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<151> 1995-06-05

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 08/465,380

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1995-06-05

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 08/461,965

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<151> 1995-06-05

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 08/326,110

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1994-10-18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 357

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> Versión PatentIn 3.1

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<210> 1

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<211> 234

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<212> ADN

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<213> Ancyclostoma caninum

\newpage

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<400> 1

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11

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<210> 2

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<211> 228

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<212> ADN

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<213> Ancyclostoma caninum

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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12

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 461

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<212> ADN

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<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

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<222> (22)..(321)

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<220>

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<221> MOD_RES

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<223> secuencia de ADNc de AcaNAP

\newpage

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<400> 3

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13

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 77

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<212> PRT

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<213> Ascyclostoma caninum

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

14

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<210> 5

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<211> 455

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<212> ADN

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<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)..(315)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de ADNc de AcaNAP6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ascyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ascyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

160

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ascyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 711

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)..(590)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de AceNAP4 de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 425

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(291)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de AceNAP5 de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 471

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (23)..(237)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de AceNAP7 de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 396

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma duodenale

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(237)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de AduNAP4 de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 688

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)..(560)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de AduNAP7 de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 349

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Heligmosomoides polygyrus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (49)..(276)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de HpoNAP5 de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 432

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Heligmosomoides polygyrus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(393)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia del vector pDONG61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 433

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Heligmosomoides polygyrus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(393)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia del vector pDONG62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 434

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Heligmosomoides polygyrus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (140)..(291)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia del vector pDONG63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

310

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia enlazadora del vector pDONG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Ser Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 430

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(282)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "w" significa a o t

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

340

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma duodenale

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma duodenale

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma duodenale

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Helogmosomoides polygyrus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 495

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (36)..(356)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de AcaNAP 23 de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

44

440

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 478

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)..(341)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de AcaNAP24 de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 472

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)..(335)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de AcaNAP25 de la molécula de ADNc recombinante

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 487

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (57)..(347)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de AcaNAP46, AcaNAP42 y AcaNAP31 de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

470

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 477

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)..(338)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de AcaNAP44 de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 685

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(556)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de AcaNAP45 de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 707

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (34)..(576)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de AcaNAP47 de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 529

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)..(309)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de AcaNAP48 de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 361

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Necator americanus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(252)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de NamNAP de la molécula de ADNc recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

63

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

670

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma duodenale

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma duodenale

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma duodenale

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Heligmosomoides polygyrus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Necator americanus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma ceylanicum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

81

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma duodenale

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido, con la condición de que por lo menos uno de entre Xaa en la posición 1 es Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido, con la condición de que por lo menos uno de entre Xaa en la posición 1 es Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

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<212> PRT

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<213> Ancyclostoma caninum

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Phe Tyr Arg Asp}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Phe Tyr Arg Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Tyr Arg Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Tyr Arg Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Leu Tyr Arg Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ile Ile His Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ile Ile Met Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ile Thr Phe Ala Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Glu Ile Ile Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

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<223> Xaa es cualquier aminoácido, con la condición de que por lo menos un Xaa es Glu o Asp

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido, con la condición de que por lo menos un Xaa es Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Gly Phe Tyr Arg Asp}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

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<223> Xaa es cualquier aminoácido, con la condición de que por lo menos un Xaa es Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido, con la condición de que por lo menos un Xaa es Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Gly Phe Tyr Arg Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido, con la condición de que por lo menos un Xaa es Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido, con la condición de que por lo menos un Xaa es Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Gly Tyr Tyr Arg Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido, con la condición de que por lo menos un Xaa es Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido, con la condición de que por lo menos un Xaa es Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Gly Tyr Tyr Arg Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido, con la condición de que por lo menos un Xaa es Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido, con la condición de que por lo menos un Xaa es Glu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Gly Leu Tyr Arg Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagacatgt ataatctcat gttgg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de nucleótido YG101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggcatacc cggagtgtgc tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "r" significa a o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" significa cualquier base

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "y" significa c o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "r" significa a o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "m" significa a o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

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<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" significa cualquier base

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "y" significa c o t

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aarccntgyg armggaartg y

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "w" significa a o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "r" significa a o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "w" significa a o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" significa cualquier base

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "r" significa a o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "y" significa c o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "r" significa a o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "r" significa a o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "r" significa a o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

twrwanccnt cyttrcanac rca

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "r" significa a o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" significa Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "y" significa c o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" significa Inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "r" significa a o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "y" significa c o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "r" significa a o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "r" significa a o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "y" significa c o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Modified_base

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "r" significa a o g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aargcntayc cngartgygg ngaraaygar tgg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattcgcggc cgcttttttt tttttttt

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtggcgacg actcctggag cccg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp Cys Gly Thr}

\sac{Gln Lys Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggaattccg

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggcctagcg tcaggagt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgacgcta ggccatgg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcggataac aatttcacac agga

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

1001

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagccaggta tctccactac cgttggttcc gctgccgagg gttctttgga caagagg

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctatccgcg gaattcagat ctgaatgcgg ccgctcgaga ctagtggatc c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de oligonucleótido YG103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcgctcta gaagcttcag acatgtataa tctcatgttg g

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Tyr Pro Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de oligonucleótido YG102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaccagtcta gacaatgaag atgctttacg ctatcg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgggagacc tgatactctc aag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Thr Val Arg Lys Ala Tyr Pro Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Thr Val Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de cebador de PCR amplificado del vector pDONG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atccgaagct ttgctaacat actgcgtaat aag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de cebador de PCR amplificado del vector pDONG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatgggatgg ccgacttggc ctccgcctga gcctccacct ttatcccaat ccaaataaga

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de cebador de PCR amplificado del vector pDONG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgggatggc cgacttggcc ctccgcctga gcctccacct ttatcccaat ccaaataaga

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de cebador de PCR amplificado del vector pDONG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatgggatgg ccgacttggc cgatccgcct gagcctccac ctttatccca atccaaataa

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de cebador de PCR amplificado del vector pDONG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggaggggat ccgcggccgc gtgatatggg atggccgact tggcc

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Secuencia artificial: pUC119 primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgccagggtt ttcccagtca cgac

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtttcgagtt ccgggatata taaagtcc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Necator americanus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Arg, Pro o Lys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Pro Cys Glu Xaa Lys Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Necator americanus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Val, Ile o Gln

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Lys, Asp, Glu o Gln

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Asp o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Phe o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Cys Xaa Xaa Gly Xaa Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaccagtcta gaccaccatg gcggtgcttt attcagtagc aata

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcgctcta gattatcgtg aggtttctgg tgcaaaagtg

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaagcaacga tgcagtgtgg tgag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcgctcta gaagcttcag tttcgagttc cgggatatat aaagtcc

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagactttta aatcactgtc ggatcagaag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcaggacta gttcatggtg cgaaagtaat aaa

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgtttaaag caacgatgca gtgtggtg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgctctagaa gcttcatggg tttcgagttc cgggatatat aaagtc

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido, con la condición de que por lo menos un

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 203

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 207

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 208

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 210

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 211

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 212

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 217

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 218

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 219

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 219

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 220

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 221

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 222

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 226

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 228

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 229

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 230

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 230

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 231

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 232

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 236

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 237

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 239

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 240

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 241

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 242

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 243

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 244

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 245

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 246

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 247

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 248

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 249

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 250

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 251

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 252

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 253

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 254

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 255

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 256

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 257

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 258

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 259

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 260

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 261

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 261

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 262

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 263

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 263

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 264

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 265

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 265

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 266

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 266

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 267

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 268

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 269

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 270

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 271

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 272

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 273

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 274

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 275

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 275

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 276

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 277

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 278

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 279

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 279

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 280

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 281

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 281

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 282

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 283

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 284

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 284

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 285

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 286

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 287

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 287

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 288

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 289

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 290

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 291

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 292

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 293

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 294

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 295

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 296

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 296

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 297

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 297

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 298

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 298

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 299

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 299

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 300

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 300

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 301

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 302

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 302

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 303

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 304

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 304

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 305

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 306

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 307

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 307

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 308

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 308

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 309

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 309

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 310

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 310

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 311

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 311

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 312

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 313

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 313

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 314

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 314

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 315

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 315

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 316

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 316

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 317

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 317

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 318

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 318

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 319

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 319

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 320

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 320

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 321

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 322

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 323

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 323

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 324

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 325

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 325

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 326

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 326

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 327

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 327

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 328

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 328

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 329

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 330

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 331

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 331

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 332

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 332

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 333

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 333

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 334

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

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<213> Ancyclostoma caninum

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 334

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 335

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 335

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

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<222> (2)..(26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 336

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 337

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 337

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 338

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 338

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(23)

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<223> Xaa es cualquier aminoácido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 339

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 340

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 340

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 341

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 341

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 342

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 342

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 343

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 343

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 344

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 345

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 346

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 346

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 347

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 347

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 348

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 348

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 349

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 349

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 350

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 350

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 351

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 351

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 352

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 352

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 353

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 353

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 354

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 354

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 355

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 355

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\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 356

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 356

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ancyclostoma caninum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

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<222> (2)..(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<222> (4)..(4)

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<223> Xaa es cualquier aminoácido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 357

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Xaa Arg Xaa}

Claims (71)

1. Proteína aislada que presenta actividad anticoagulante y que presenta uno o más dominios de proteína anticoagulante extraída de nemátodo (dominios de NAP), en la que cada dominio de NAP comprende la secuencia:

Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10,

en la que

(a)

A1 es una secuencia de aminoácidos de 7 a 8 restos de aminoácidos;

(b)

A2 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 5 restos de aminoácidos;

(c)

A3 es una secuencia de aminoácidos de 3 restos de aminoácidos;

(d)

A4 es una secuencia de aminoácidos de 6 a 19 restos de aminoácidos;

(e)

A5 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 4 restos de aminoácidos;

(f)

A6 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 5 restos de aminoácidos;

(g)

A7 es un resto de aminoácido;

(h)

A8 es una secuencia de aminoácidos de 11 a 12 restos de aminoácidos;

(i)

A9 es una secuencia de aminoácidos de 5 a 7 restos de aminoácidos; y

(j)

A10 es una secuencia de aminoácidos de 5 a 25 restos de aminoácidos.

2. Proteína según la reivindicación 1, en la que la actividad de dicha proteína comprende la actividad inhibidora del Factor Xa.

3. Proteína según la reivindicación 1 ó 2, en la que A3 presenta la secuencia Glu-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} y A3_{b} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados.

4. Proteína según la reivindicación 3, en la que A3 presenta la secuencia Glu-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} se selecciona de entre el grupo constituido por Ala, Arg, Pro, Lys, Ile, His, Leu y Thr, y A3_{b} se selecciona de entre el grupo constituido por Lys, Thr y Arg.

5. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, en la que A3 se selecciona de entre el grupo constituido por

Glu-Ala-Lys,

Glu-Arg-Lys,

Glu-Pro-Lys,

Glu-Lys-Lys,

Glu-Ile-Thr,

Glu-His-Arg,

Glu-Leu-Lys, y

Glu-Thr-Lys.

6. Proteína según la reivindicación 1, en la que A3 presenta la secuencia Asp-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} y A3_{b} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados.

7. Proteína según la reivindicación 1 ó 6, en la que A3 es Asp-Lys-Lys.

8. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que A4 es una secuencia de aminoácidos que presenta una carga aniónica neta.

\newpage

9. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 6 a 8, en la que A5 presenta la secuencia A5_{a}-A5_{b}-A5_{c}-A5_{d} [SEC. ID. nº 85], en la que A5_{a} a A5_{d} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados.

10. Proteína según la reivindicación 9, en la que A5_{a} es Leu y A5_{c} es Arg.

11. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que A7 se selecciona de entre el grupo constituido por Val e Ile.

12. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que A8 comprende una secuencia de aminoácidos A8_{a}-A8_{b}-A8_{c}-A8_{d}-A8_{e}-A8_{f}-A8_{g} [SEC. ID. nº 68], en la que

(a)

A8_{a} es el primer resto de aminoácido en A8,

(b)

por lo menos uno de entre A8_{a} y A8_{b} se selecciona de entre el grupo constituido por Glu o Asp, y

(c)

A8_{c} a A8_{g} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados.

13. Proteína según la reivindicación 12, en la que

(a)

A8_{a} es Glu o Asp,

(b)

A8_{b} es un resto de aminoácido independientemente seleccionado,

(c)

A8_{c} es Gly,

(d)

A8_{d} se selecciona de entre el grupo constituido por Phe, Tyr y Leu,

(e)

A8_{e} es Tyr,

(f)

A8_{f} es Arg, y

(g)

A8_{g} se selecciona de entre Asp y Asn.

14. Proteína según la reivindicación 12 ó 13, en la que

(a)

A8_{a} es un resto de aminoácido independientemente seleccionado,

(b)

A8_{b} es Glu o Asp,

(c)

A8_{c} es Gly,

(d)

A8_{d} se selecciona de entre el grupo constituido por Phe, Tyr y Leu,

(e)

A8_{e} es Tyr,

(f)

A8_{f} es Arg, y

(g)

A8_{g} se selecciona de entre Asp y Asn.

15. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en la que A8_{c}-A8_{d}-A8_{e}-A8_{f}-A8_{g} se selecciona de entre el grupo constituido por

Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 69],

Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 70],

Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 71],

Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 72] y

Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 73].

16. Proteína según la reivindicación 15, en la que A8_{c}-A8_{d}-A8_{e}-A8_{f}-A8_{g} es Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 70].

\newpage

17. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, en la que A10 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por

Glu-Ile-Ile-His-Val [SEC. ID. nº 74],

Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEC. ID. nº 75],

Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEC. ID. nº 76] y

Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEC. ID. nº 77].

18. Proteína según la reivindicación 17, en la que A10 comprende la secuencia de aminoácidos Glu-Ile-Ile-His-Val [SEC. ID. nº 74].

19. Proteína según la reivindicación 17, en la que A10 comprende la secuencia de aminoácidos Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEC. ID. nº 75].

20. Proteína según la reivindicación 19, que presenta un dominio de NAP con una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de homología con la de AcaNAP48 [Fig. 16].

21. Proteína según la reivindicación 17, en la que A10 comprende la secuencia Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEC. ID. nº 76].

22. Proteína según la reivindicación 21, que presenta un dominio de NAP con una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de homología con un dominio de NAP seleccionado de entre los dominios de NAP de AcaNAP23 [Fig. 16], AcaNAP24 [Fig. 16], AcaNAP25 [Fig. 16], AcaNAP44 [Fig. 16], AcaNAP31 [Fig. 16], AceNAP4-d1 [Fig. 16] y AceNAP4-d2 [Fig. 16].

23. Proteína según la reivindicación 17, en la que A10 comprende la secuencia Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEC. ID. nº 77].

24. Proteína según la reivindicación 23, que presenta un dominio de NAP con una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de homología con un dominio de NAP seleccionado de entre los dominios de NAP de AcaNAP45-d1 [Fig. 16], AcaNAP45-d2 [Fig. 16], AcaNAP47-d1 [Fig. 16], AcaNAP47-d2 [Fig. 16], AduNAP7-d1 [Fig. 16], AduNAP7-d2 [Fig. 16], AduNAP4 [Fig. 16], AceNAP5 [Fig. 16] y AceNAP7 [Fig. 16].

25. Proteína según la reivindicación 1 ó 2, en la que

(a) A3 presenta la secuencia Glu-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} y A3_{b} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados;

(b) A4 es una secuencia de aminoácidos que presenta una carga aniónica neta;

(c) A7 se selecciona de entre el grupo constituido por Val e Ile;

(d) A8 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por

Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 69],

Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 70],

Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 71],

Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 72] y

Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 73]; y

(e) A10 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por

Glu-Ile-Ile-His-Val [SEC. ID. nº 74],

Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEC. ID. nº 75],

Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEC. ID. nº 76] y

Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEC. ID. nº 77].

\newpage

26. Proteína sgún la reivindicación 1 ó 2, en la que

(a) A3 se selecciona de entre el grupo constituido por

Glu-Ala-Lys,

Glu-Arg-Lys,

Glu-Pro-Lys,

Glu-Lys-Lys,

Glu-Ile-Thr,

Glu-His-Arg,

Glu-Leu-Lys y

Glu-Thr-Lys;

(b) A4 es una secuencia de aminoácidos que presenta una carga aniónica neta;

(c) A7 es Val o Ile;

(d) A8 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por

A8_{a}-A8_{b}-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 78],

A8_{a}-A8_{b}-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 79],

A8_{a}-A8_{b}-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 80],

A8_{a}-A8_{b}-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 81], y

A8_{a}-A8_{b}-Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEC. ID. nº 82],

en la que por lo menos uno de entre A8_{a} y A8_{b} es Glu o Asp;

(e) A9 es una secuencia de aminoácidos de cinco restos de aminoácido; y

(f) A10 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por

Glu-Ile-Ile-His-Val [SEC. ID. nº 74],

Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEC. ID. nº 75],

Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEC. ID. nº 76], y

Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEC. ID. nº 77].

27. Proteína según la reivindicación 18, 25 ó 26, que presenta un dominio de NAP que presenta por lo menos 90% de homología con los dominios de NAP seleccionados de entre AcaNAP5 [Fig. 16] y AcaNAP6 [Fig. 16].

28. Proteína según la reivindicación 25 ó 26, que presenta un dominio de NAP que presenta por lo menos el 90% de homología con un dominio de NAP seleccionado de entre el grupo constituido por AcaNAP5 [Fig. 16], AcaNAP6 [Fig. 16], AcaNAP48 [Fig. 16], AcaNAP23 [Fig. 16], AcaNAP24 [Fig. 16], AcaNAP25 [Fig. 16], AcaNAP44 [Fig. 16], AcaNAP31 [Fig. 16], AceNAP4-d1 [Fig. 16], AceNAP4-d2 [Fig. 16], AcaNAP45-d1 [Fig. 16], AcaNAP45-d2 [Fig. 16], AcaNAP47-d1 [Fig. 16], AcaNAP47-d2 [Fig. 16], AduNAP7-d1 [Fig. 16], AduNAP7-d2 [Fig. 16], AduNAP4 [Fig. 16], AceNAP5 [Fig. 16] y AceNAP7 [Fig. 16].

29. Proteína aislada que presenta actividad anticoagulante seleccionada de entre el grupo constituido por AcaNAP5 [Fig. 16], AcaNAP6 [Fig. 16], AcaNAP48 [Fig. 16], AcaNAP23 [Fig. 16], AcaNAP24 [Fig. 16], AcaNAP25 [Fig. 16], AcaNAP44 [Fig. 16], AcaNAP31 [Fig. 16], AceNAP4 [Fig. 16], AcaNAP45 [Fig. 16], AcaNAP47 [Fig. 16], AduNAP7 [Fig. 16], AduNAP4 [Fig. 16], AceNAP5 [Fig. 16] y AceNAP7 [Fig. 16].

30. Proteína aislada que presenta actividad inhibidora del Factor Xa seleccionada de entre el grupo constituido por AcaNAP5 [Fig. 16] y AcaNAP6 [Fig. 16].

31. Proteína según la reivindicación 1 ó 2, en la que

(a) A3 presenta la secuencia Asp-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} y A3_{b} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados;

(b) A4 es una secuencia de aminoácidos que presenta una carga aniónica neta;

(c) A5 presenta la secuencia A5_{a}-A5_{b}-A5_{c}-A5_{d} [SEC. ID. nº 85], en la que A5_{a} a A5_{d} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados, y

(d) A7 se selecciona de entre el grupo constituido por Val e Ile.

32. Proteína según la reivindicación 1, en la que

(a) A3 es Asp-Lys-Lys;

(b) A4 es una secuencia de aminoácidos que presenta una carga aniónica neta;

(c) A5 presenta la secuencia A5_{a}-A5_{b}-A5_{c}-A5_{d}, en la que A5_{a} es Leu, A5_{c} es Arg, y A5_{c} y A5_{d} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados [SEC. ID. nº: 357];

(d) A7 es Val; y

(e) A8 comprende una secuencia de aminoácidos A8_{a}-A8_{b}-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEC. ID. nº 79], en la que por lo menos uno de entre A8_{a} y A8_{b} es Glu o Asp.

33. Proteína según la reivindicación 31 ó 32, que presenta un dominio de NAP con una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de homología con el dominio de NAP de AcaNAPc2 [Fig. 16].

34. Proteína aislada que presenta actividad inhibidora del Factor VIIa/TF que presenta un dominio de proteína anticoagulante extraída de nemátodo (dominio de NAP) con una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de homología con el dominio de NAP de AcaNAPc2 [Fig. 16].

35. Proteína aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34 que presenta actividad anticoagulante, en la que dicha proteína inhibe específicamente la actividad catalítica del complejo fVII/TF en presencia de fXa o del derivado de fXa catalíticamente inactivo y no inhibe específicamente la actividad de FVIIa en ausencia de TF y no inhibe específicamente la protrombinasa.

36. Proteína según la reivindicación 15, en la que la proteína es la AcaNAPc2 [Fig. 16].

37. Proteína que presenta actividad anticoagulante y que presenta una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos el 90% de homología con AcaNAPc2 [Fig. 16].

38. Proteína aislada que presenta actividad inhibidora de serina proteasa y que presenta uno o más dominios de proteína anticoagulante extraída de nemátodo (dominios de NAP) con una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de homología con los dominios de NAP seleccionados de entre HpoNAP5 [Fig. 16] y NamNAP [Fig. 16],

en la que

(a)

A1 es una secuencia de aminoácidos de 7 a 8 restos de aminoácidos;

(b)

A2 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 5 restos de aminoácidos;

(c)

A3 presenta la secuencia Glu-A3_{a}-A3_{b}, en la que A3_{a} y A3_{b} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados;

(d)

A4 es una secuencia de aminoácidos de 6 a 19 restos de aminoácidos que presenta una carga aniónica neta;

(e)

A5 presenta la secuencia A5_{a}-A5_{b}-A5_{c}, en la que A5_{a} a A5_{c} son restos de aminoácidos independientemente seleccionados;

(f)

A6 es una secuencia de aminoácidos de 3 a 5 restos de aminoácidos;

(g)

A7 es Gln;

(h)

A8 es una secuencia de aminoácidos de 10 a 12 restos de aminoácidos;

(i)

A9 es una secuencia de aminoácidos de 5 a 7 restos de aminoácidos; y

(j)

A10 es una secuencia de aminoácidos de 1 a 25 restos de aminoácidos.

39. Proteína según la reivindicación 38, en la que

(a)

A3 es Glu-Pro-Lys;

(b)

A4 es una secuencia de aminoácidos que presenta una carga aniónica neta;

(c)

A5 se selecciona de entre Thr-Leu-Asn y Thr-Met-Asn; y

(d)

A7 es Gln.

40. Proteína aislada que presenta actividad inhibidora de serina proteasa y un dominio de proteína anticoagulante extraída de nemátodo (dominio de NAP) con una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de homología con los dominios de NAP seleccionados de entre el grupo constituido por HpoNAP5 [Fig. 16] y NamNAP [Fig. 16].

41. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 25, 26, 31, 32, 38 ó 39, en la que dicha proteína presenta dos dominios de NAP.

42. Proteína que presenta dos dominios de proteína anticoagulante extraída de nemátodo (NAP), en la que dicha proteína se selecciona de entre el grupo constituido por AceNAP4 [Fig. 17], AcaNAP45 [Fig. 18], AcaNAP47 [Fig. 19] y AduNAP7 [Fig. 20].

43. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, en la que dicha proteína procede de una especie de nemátodo que se selecciona de entre el grupo constituido por Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus y Heligomosomoides polygyrus.

44. Molécula de ADNc recombinante aislada que codifica una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42.

45. Molécula de ADNc que codifica la proteína según la reivindicación 18 ó 25 que presenta una secuencia nucleotídica que presenta por lo menos 90% de homología con la que codifica AcaNAP5 [Fig. 1] y

\hbox{AcaNAP6 [Fig. 3].}

46. Molécula de ADNc que codifica la proteína que presenta actividad inhibidora del Factor Xa seleccionada de entre el grupo constituido por proteínas que presentan dominios de NAP que presentan por lo menos 90% de homología con AcaNAP5 [Fig. 16] y AcaNAP6 [Fig. 16].

47. Molécula de ADNc que codifica la proteína según la reivindicación 20 que presenta una secuencia nucleotídica que presenta por lo menos 90% de homología con la que codifica AcaNAP48 [Fig. 13h].

48. Molécula de ADNc que codifica la proteína según la reivindicación 21 que presenta una secuencia nucleotídica que presenta por lo menos 90% de homología con la seleccionada de entre el grupo constituido por los ADNc que codifican a AcaNAP23 [Fig. 13a], AcaNAP24 [Fig. 13b], AcaNAP25 [Fig. 13c], AcaNAP44 [Fig. 13e], AcaNAP31 [Fig. 13d] y AceNAP4 [Fig. 7a].

49. Molécula de ADNc que codifica la proteína según la reivindicación 23 que presenta una secuencia nucleotídica que presenta por lo menos 90% de homología con la seleccionada de entre el grupo constituido por los ADNc que codifican a AcaNAP45 [Fig. 13f], AcaNAP47 [Fig. 13g], AduNAP7 [Fig. 7e], AduNAP4 [Fig. 7d], AceNAP5 [Fig. 7b] y AceNAP7 [Fig. 7c].

50. Molécula de ADNc que codifica la proteína según la reivindicación 26 que se selecciona de entre el grupo constituido por los ADNc que codifican a AcaNAP5 [Fig. 1], AcaNAP6 [Fig. 3], AcaNAP48 [Fig. 13h], AcaNAP23 [Fig. 13a], AcaNAP24 [Fig. 13b], AcaNAP25 [Fig. 13c], AcaNAP44 [Fig. 13e], AcaNAP31 [Fig. 13d], AceNAP4 [Fig. 7a], AcaNAP45 [Fig. 13f], AcaNAP47 [Fig. 13g], AduNAP7 [Fig. 7e], AduNAP4 [Fig. 7d], AceNAP5 [Fig. 7b] y AceNAP7 [Fig. 7c].

51. Molécula de ADNc que codifica la proteína según la reivindicación 38 que presenta una secuencia nucleotídica que presenta por lo menos 90% de homología con las secuencias seleccionadas de entre los ADNc que codifican a HpoNAP5 [Fig. 7f] y NamNAP [Fig. 14].

52. Molécula de ADNc que codifica una proteína que presenta actividad anticoagulante seleccionada de entre el grupo constituido por los ADNc que presentan por lo menos 90% de homología con los ADNc que codifican a a AcaNAP5 [Fig. 1], AcaNAP6 [Fig. 3], AcaNAP48 [Fig. 13h], AcaNAP23 [Fig. 13a], AcaNAP24 [Fig. 13b], AcaNAP25 [Fig. 13c], AcaNAP44 [Fig. 13e], AcaNAP31 [Fig. 13d], AceNAP4 [Fig. 7a], AcaNAP45 [Fig. 13f], AcaNAP47 [Fig. 13g], AduNAP7 [Fig. 7e], AduNAP4 [Fig. 7d], AceNAP5 [Fig. 7b] y AceNAP7 [Fig. 7c].

53. Molécula de ADNc recombinante aislada según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 52, que codifica una proteína que presenta actividad anticoagulante, en la que dicha proteína inhibe específicamente la actividad catalítica del complejo fVIIa/TF en presencia de fXa o del derivado de fXa catalíticamente inactivo y no inhibe específicamente la actividad de FVIIa en ausencia de TF y no inhibe específicamente la protrombinasa.

54. Molécula de ADNc según la reivindicación 53, en la que el ADN codifica la AcaNAPc2 [Fig. 16].

55. Molécula de ADNc aislada que codifica una proteína que presenta actividad anticoagulante que presenta por lo menos 90% de homología con AcaNAPc2 [Fig. 9].

56. Molécula de ADNc recombinante aislada que codifica una proteína según la reivindicación 32.

57. Molécula de ADNc según la reivindicación 56, que presenta una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de homología con AcaNAPc2 [Fig. 16].

58. Molécula de ADNc según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 57 procedente de una especie de nemátodo.

59. Molécula de ADNc según la reivindicación 58, en la que dicha especie de nemátodo se selecciona de entre el grupo constituido por Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus y Heligomosomoides polygyrus.

60. Oligonucleótido que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de entre

NAP-1:

AAR-CCN-TGY-GAR-MGG-AAR-TGY [SEC. ID. nº 90] y

NAP-4.RC:

TW-RWA-NCC-NTC-YTT-RCA-NAC-RCA [SEC. ID. nº 91].

61. Utilización de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42 para la preparación de una composición farmacéutica destinada a inhibir la coagulación de la sangre.

62. Utilización según la reivindicación 61, en la que la proteína se selecciona de entre el grupo constituido por AcaNAP5 [Fig. 16], AcaNAP6 [Fig. 16], AcaNAPc2 [Fig. 16], HpoNAP5 [Fig. 16] y NamAP [Fig. 16].

63. Utilización según la reivindicación 61, en la que la proteína presenta un dominio de NAP que presenta por lo menos 90% de homología con los dominios de NAP seleccionados de entre el grupo constituido por AcaNAP5 [Fig. 16], AcaNAP6 [Fig. 16], AcaNAP48 [Fig. 16], AcaNAP23 [Fig. 16], AcaNAP24 [Fig. 16], AcaNAP25 [Fig. 16], AcaNAP44 [Fig. 16], AcaNAP31 [Fig. 16], AceNAP4-d1 [Fig. 16], AceNAP4-d2 [Fig. 16], AcaNAP45-d1 [Fig. 16], AcaNAP45-d2 [Fig. 16], AcaNAP47-d1 [Fig. 16], AcaNAP47-d2 [Fig. 16], AduNAP7-d1 [Fig. 16], AduNAP7-d2 [Fig. 16], AduNAP4 [Fig. 16], AceNAP5 [Fig. 16] y AceNAP7 [Fig. 16].

64. Composición farmacéutica que comprende una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42.

65. Composición farmacéutica según la reivindicación 64, que comprende una proteína seleccionado de entre el grupo constituido por AcaNAP5 [Fig. 16], AcaNAP6 [Fig. 16], AcaNAPc2 [Fig. 16], HpoNAP5 [Fig. 16] y NamNAP [Fig. 16].

66. Composición farmacéutica según la reivindicación 64, que comprende una proteína que presenta un dominio de NAP que presenta por lo menos 90% de homología con un dominio de NAP seleccionado de entre el grupo constituido por AcaNAP5 [Fig. 16], AcaNAP6 [Fig. 16], AcaNAP48 [Fig. 16], AcaNAP23 [Fig. 16], AcaNAP24 [Fig. 16], AcaNAP25 [Fig. 16], AcaNAP44 [Fig. 16], AcaNAP31 [Fig. 16], AceNAP4-d1 [Fig. 16], AceNAP4-d2 [Fig. 16], AcaNAP45-d1 [Fig. 16], AcaNAP45-d2 [Fig. 16], AcaNAP47-d1 [Fig. 16], AcaNAP47-d2 [Fig. 16], AduNAP7-d1 [Fig. 16], AduNAP7-d2 [Fig. 16], AduNAP4 [Fig. 16], AceNAP5 [Fig. 16] y AceNAP7 [Fig. 16].

67. Proteína aislada que presenta una secuencia de aminoácidos de AcaNAPc2 [Fig. 16] que presenta un resto de prolina adicional en el terminal C.

68. Proteína aislada que presenta actividad inhibidora del Factor VIIa/Factor tisular y una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 90% de homología con la secuencia de aminoácidos de AcaNAPc2 [Fig. 16] que presenta un resto de prolina adicional en el terminal C.

69. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica la secuencia de aminoácidos de AcaNAPc2 [Fig. 16] que presenta un resto de prolina adicional en el terminal C.

70. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína que presenta actividad inhibidora del Factor VIIa/Factor tisular y que presenta por lo menos 90% de homología con la secuencia de aminoácidos de AcaNAPc2 [Fig. 16] que presenta un resto de prolina adicional en el terminal C.

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71. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína que presenta actividad inhibidora del Factor VIIa/Factor tisular y que presenta por lo menos 90% de homología con la secuencia del ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de AcaNAPc2 [Fig. 16] que presenta un resto de prolina adicional en el terminal C.