JPH09509838A - クニッツドメイン拮抗剤蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＶＩＩａ因子、ＸＩａ因子、血漿カリクレインまたはプラスミンを阻害することのできる強力なセリンプロテアーゼ阻害剤を提供する。この阻害剤はＶＩＩａ因子、ＸＩａ因子、血漿カリクレインまたはプラスミンの阻害を必要とする疾患の処置用に医薬的組成物の形で提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 クニッツドメイン拮抗剤蛋白質 発明の分野 この発明は組織因子−ＶＩＩａ因子阻害活性を有する新規クニッツドメイン蛋 白質、これら蛋白質をコードするＤＮＡおよびこれら因子ＶＩＩａ阻害剤の組換 え物質および製造方法に関する。本発明は、さらにＶＩＩａ因子、ＸＩａ因子、 血漿カリクレインおよびプラスミンの阻害が必要とされる疾患に対する処置のた めのＶＩＩａ因子阻害剤を含有する医薬的組成物に関する。 発明の背景 血栓症は米国における死因の約４０％を占める。最新の血栓症疾患の治療は非 特異的作用機構を持つ抗凝固剤（たとえば、ヘパリン、クマジン）の使用を包含 する。これら薬剤は出血を起こすことがあり、それらの使用は限定される。凝血 カスケードの初期段階を阻害し、内因性または外因性経路のどちらかに特異的な （図１参照）抗凝固剤は出血症状を誘発せずに血栓発生の事態を抑制するので、 効果および安全性に優れた特性を持つに違いない。ＶＩＩａ因子 組織因子−ＶＩＩａ因子複合体（ＴＦ−ＦＶＩＩａ）は血液凝固の一次的開始 剤である（Ｃａｒｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．とＢｒｏｚｎａ，Ｊ．Ｐ．、Ｂｌｏｏｄ・Ｃ ｏａｇ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．、４巻：２８１〜２９２頁［１９９３年］；Ｄａｖ ｉｅ，Ｅ．Ｗ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：１０３６３〜１０３ ７０頁［１９９１年］；Ｒａｐａｐｏｒｔ，Ｓ．Ｉ．とＬ．Ｖ．Ｍ．Ｒａｏ、Ａ ｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．、１２巻：１１１１〜１１２１頁［１ ９９２年］）（図１参照）。５０ｋＤａのビタミンＫ依存性血漿セリンプロテア ーゼであるＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）は血漿中に約０．５μｇ／ｍＬで存在す るチモーゲンであるＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）からペプチド結合一個の蛋白分解に よって発生する。組織因子（ＴＦ）は２６３残基を含有し、血管内皮により血漿 から分離される細胞中に構成的に発現する膜内在性補助因子である（Ｃａｒｓｏ ｎ，Ｓ．Ｄ．とＪ．Ｐ．Ｂｒｏｚｎａ、Ｂｌｏｏｄ・Ｃｏａｇ．Ｆｉｂｒｉｎｏ ｌ．、４巻：２８１〜２９２頁［１９９３年］）。組織が傷害を受けると、露出 したＴＦの細胞外ドメインはＦＶＩＩに結合し、活性化して高親和性のＴＦ−Ｆ ＶＩＩａ複合体を形成する。ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）もＦＶＩＩの活性化に 関連付けられている。ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体はＸ因子（ＦＸ）をＸａ因子（Ｆ Ｘａ）まで、ＩＸ因子（ＦＩＸ）をＩＸａ因子（ＦＩＸａ）まで、さらにＦＶＩ ＩをＦＶＩＩａまで活性化することによって、凝固カスケードの外因性経路を開 始する。これがプロトロンビンのトロンビンへの変換を招き、これが多数の生物 学的機能を発揮する（Ｂａｄｉｍｏｎ，Ｌ．など、Ｔｒｅｎｄｓ・Ｃａｒｄｉｏ ｖａｓｃ．Ｍｅｄ．、１巻：２６１〜２６７頁［１９９１年］）。トロンビンの 最重要な機能の中にはフィブリノーゲンのフィブリンへの変換かあり、これが重 合して血餅を形成する。 血液凝固の制御は止血の維持に重要である。血液凝固カスケード開始に続き、 ＴＦ−ＦＶＩＩａはそれ以上のチモーゲン基質活性化を止めるフィードバック阻 害剤の一つである組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）の制御を受ける（Ｂｒｏｚｅ ・Ｊｒ．Ｇ．Ｊ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：７５３９〜７５４ ６頁［１９９０年］；Ｂｒｏｚｅ・Ｊｒ．，Ｇ．Ｊ．、Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔ ｏｌ．、２９巻：１５９〜１６９頁［１９９２年］）。ＴＦＰＩはリポ蛋白質関 連凝固阻害剤ＬＡＣＩおよび外因性経路阻害剤ＥＰＩとも呼ばれる。ＴＦＰＩは 酸性アミノ末端領域、続いてクニッツドメイン３個および塩基性カルボキシ末端 領域を包含する。ＴＦＰＩは最初に第２クニッツドメインでＦＸａに結合し、続 いて第１クニッツドメインでＦＶＩＩａに結合する様式でＦＸａ依存的にＴＦ− ＦＶＩＩａを阻害すると推測されている（Ｇｉｒａｒｄ，Ｔ．Ｊ．など、Ｎａｔ ｕｒｅ、３３８巻：５１８〜５２０頁［１９８９年］）。ＦＸａ不在下ではＴＦ ＰＩはＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体の弱い阻害剤である（Ｇｉｒａｒｄ，Ｔ．Ｊ．な ど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８巻：１４２１〜１４２４頁［１９９０年］）。最近 、セルピンの一つアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）もヘパリン存在下にＴ Ｆ− ＦＶＩＩａ活性を阻害することが示された（Ｒａｏ，Ｌ．Ｖ．Ｍ．など、Ｂｌｏ ｏｄ、８１巻：２６００〜２６０７頁［１９９３年］；Ｌａｗｓｏｎ，Ｊ．Ｈ． など、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻：７６７〜７７０頁［１９９３年］ ；Ｂｒｏｚｅ・Ｊｒ．Ｇ．Ｊ．など、Ｂｌｏｏｄ、８２巻：１６７９〜１６８０ 頁［１９９３年］；Ｍａｎｎ，Ｋ．Ｇ．、Ｂｌｏｏｄ、８２巻：１６８０〜１６ ８１頁［１９９３年］）。ＴＦＰＩによるＴＦ−ＦＶＩＩａの阻害は可逆的であ るが、ＡＴＩＩＩによる阻害は本質的に不可逆的である。ＴＦ−ＦＶＩＩａにつ いてＡＴＩＩＩ／ヘパリン阻害対ＴＦＰＩ阻害の生体内での相対的重要性は知ら れていない。 ＴＦ−ＦＶＩＩａ活性を阻害するＴＦＰＩの変種が作製されている。殊に最初 のクニッツドメイン２個（第１〜１６１残基）を含む変種が作製され、特徴付け された（Ｈａｍａｍｏｔｏなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻：８７０ ４〜８７１０頁［１９９３年］；Ｐａｔｅｒｓｏｎなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．、２６８巻：１３３４４〜１３３５１頁［１９９３年］）。ＴＦＰＩおよび その変種が、血栓溶解後の動脈再閉鎖（Ｈａｓｋｅｌ，Ｅ．Ｊ．など、Ｃｉｒｃ ｕｌａｔｉｏｎ、８４巻 ８２１〜８２７頁［１９９１年］）、蛇毒血栓症（Ｈ ｏｌｓｔ，Ｊ．など、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、２３巻（補１）：１１２〜１１ ７頁［１９９３年］）および敗血症ショック由来汎発性血管内凝固症（Ｃｒｅａ ｓｅｙ，Ａ．Ａ．など、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９１巻：２８５０〜２ ８６０頁［１９９３年］）の動物モデルにおいて止血に影響を与えることが示さ れている。しかしながら、ＴＦＰＩは血栓症疾患の処置用抗凝固剤に望まれるす べての性質を持ちえない。ＴＦ−ＦＶＩＩａの阻害以前のＴＦＰＩによるＦＸａ 阻害の依存性は望ましくない効果を持ちうる。例えば、ＦＸａは内因性および外 因性経路の双方により生産されるので、ＦＸａの阻害は凝固を全般的に阻害し、 例えば出血のような望ましくない副作用を招きうるが、外因性または内因性経路 の選択的阻害剤ならこの問題を招かないであろう。これに加え、ヘパリンはＴＦ ＰＩの活性に影響しうる。ＴＦＰＩのカルボキシル末端は最大活性に必須であろ う（Ｗｅｓｓｅｌｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．など、Ｂｌｏｏｄ、７９巻：２００４〜 ２０１０頁［１９９２年］；Ｎｏｒｄｆａｎｇ，Ｏ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ、３０巻：１０３７１〜１０３７６頁［１９９１年］）。さらにＴＦＰＩ はヒト白血球エラスターゼによって最初のクニッツドメイン２個の間で切断され てＴＦ−ＦＶＩＩａ阻害活性の喪失を招く（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｄ．Ａ．など、Ｂ ｌｏｏｄ、７９巻：１７１２〜１７１９頁［１９９２年］）。 アプロチニンとも呼ばれるウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）は最近、親 和性は比較的弱い（Ｋ_i＝３０μＭ）けれども、ＴＦ−ＦＶＩＩａ活性を競合的 に阻害することが証明された（Ｃｈａｂｂａｔ，Ｊ．など、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅ ｓ．、７１巻：２０５〜２１５頁［１９９３年］）。これに加えて、ＢＰＴＩが 最近になってＴＦ−誘発凝固を阻害することを示された。しかしながら、ＰＴ− 検定による凝血時間を１．４倍延長するためには約７５μＭが必要であった（ｖ ａｎ・ｄｅｎ・Ｂｅｓｓｅｌａａｒ，Ａ．Ｍ．Ｈ．Ｐ．など、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈ ａｅｍｏｓｔａｓ．、６９巻：２９８〜２９９頁［１９９３年］）。 ＸＩａ因子 ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）はチモーゲンであるＸＩ因子（ＦＸＩ）から血液中で 生産されたグリコシル化セリンプロテアーゼである。これはジスルフィド結合を した各々分子量８００００Ｄａを持つ同一蛋白質２個のホモ２量体から構成され ている（Ｋｉｔｃｈｅｎｓ，Ｃ．Ｓ．、Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏ ｓｔａｓ．、１７巻：５５〜７２頁［１９９１年］）。血中では、この蛋白質の 殆どは高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）に結合して循環している。ＦＸＩは正 常には約４．５μｇ／ｍＬの濃度で存在している。これは多種のセリンプロテア ーゼにより活性化されることができる。ＦＸＩＩａは主な活性化剤であると考え られているが、最近、トロンビンも関連付けがなされた（Ｇａｌｉａｎｉ，Ｄ． とＢｒｏｚｅ・Ｊｒ．，Ｇ．Ｊ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３巻：９０９〜９１２ 頁［１９９１年］）。高分子量キニノーゲン存在下、ＦＸＩＩａはプレカリクレ インをカリクレインに、ＦＸＩをＦＸＩａに活性化でき、ここに生成したカリク レインは追加的なＸＩＩ因子をＦＸＩＩａに活性化することができる。ＦＸＩａ はＦＩＸをＦＩＸａに活性化し、これがＶＩＩＩ因子存在下にＦＸａ形成を、究 極的にはフィブリン血餅の形成を招く（図１参照）。 ＦＸＩａの主要な生理学的阻害剤はα１−プロテイナーゼ阻害剤としても知ら れているセルピンであるα１−アンチトリプシンであると考えられている（Ｓｃ ｏｔｔ，Ｃ．Ｆ．など、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、６９巻：８４４〜８５ ２頁［１９８２年］）。たとえばα１−プロテイナーゼ阻害剤のようなセルピン （セリンプロテアーゼ阻害剤）は血栓症、ショックおよび炎症疾患における蛋白 質分解を制御する治療上の潜在的可能性の故に（Ｓｃｈａｐｉｒａ，Ｍ．など、 Ｔｒｅｎｄｓ・Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．、４巻：１４６〜１５１頁［１ ９９１年］；Ｐａｔｓｔｏｎ，Ｐ．Ａ．など、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６ ５巻：１０７８６〜１０７９１頁［１９９０年］）、およびＰ₁残基での自然突 然変異（Ｍ３５８Ｒ、α１−プロテイナーゼ阻害剤、ピッツバーグ）がプロテア ーゼ阻害剤特異性を劇的に変える故に（Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｆ．など、Ｊ．Ｃｌｉ ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７７巻：６３１〜６３４頁［１９８６年］）、種々のプロ テアーゼに対する阻害能についてよく特徴付けられている。しかしながら、他の セルピンもＦＸＩａを阻害するかもしれない。これらには、Ｃ１阻害剤、α２− アンチプラスミンおよびアンチトロンビン−ＩＩＩを包含する。α２−マクログ ロブリンはもう一つのＦＸＩａ阻害剤である。ＰＩＸＩと命名された低分子量阻 害剤も血小板から確認された（Ｃｒｏｎｌｕｎｄ，Ａ．Ｌ．とＷａｌｓｈ，Ｐ． Ｎ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻：１６８５〜１６９４頁［１９９２年 ］）。 ＦＸＩａのもう一つの阻害剤はプロテアーゼであるネキシン−２で、アルツハ イマー病アミロイドのβ−蛋白質前駆体の分泌型であって、時にはこの蛋白質の 異なるアイソフォームはＡβＰＰ₇₅₁およびＡβＰＰ₇₇₀と呼ばれる（Ｖａｎ・Ｎ ｏｓｔｒａｎｄ，Ｗ．Ｅ．など、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻：９５９ １〜９５９４頁［１９９０年］；Ｗｅｇｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍ ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１８６巻：１１３８〜１１４５頁 ［１９９２年］；Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｐ．など、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８巻：１１ ２６〜１１２８頁［１９９０年］）。この蛋白質はクニッツドメインを含有し、 ＫＰ Ｉ（６１残基）（Ｗａｇｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１８６巻：１１３８〜１１４５頁［１９９２年］ ）またはＡＰＰＩ（５８残基）（Ｈｙｎｅｓ，Ｔ．Ｒ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ、２９巻：１００１８〜１００２２頁［１９９０年］）と命名されてい る。このＫＰＩドメイン自体もＦＸＩａに対する強力な阻害剤である（Ｗａｇｎ ｅｒ，Ｓ．Ｌ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ ．、１８６巻：１１３８〜１１４５頁［１９９２年］）。ヘパリンはプロテアー ゼであるネキシン−２によるＦＸＩａの阻害を強化することが示されているが、 ＫＰＩドメイン自体では阻害しない（Ｗａｇｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．など、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１８６巻：１１３８〜１１４ ５頁［１９９２年］）。１５位にアルギニンを持つＢＰＴＩの変種が半合成的に 調製され、相対的に高い親和性でＦＸＩａを阻害することが発見されている（Ｓ ｃｏｔｔ，Ｃ．Ｆ．など、Ｂｌｏｏｄ、６９巻：１４３１〜１４３６頁［１９８ ７年］）。 カリクレイン プレカリクレインは単一のポリペプチド鎖からなるグリコプロテインで、分子 量８００００Ｄａを持ち、正常な血漿には約５０μｇ／ｍＬ（６００ｎＭ）の濃 度で存在する。プレカリクレインの７５％は血中ではＨＭＷＫに結合して循環し ている。これはセリンプロテアーゼのチモーゲンであって、ＦＸＩＩａによって 活性化されることができる（図１参照）。カリクレインは４３０００および３３ ０００〜３６０００Ｄａのジスルフィドで結合した鎖２本から構成される。カリ クレインの軽鎖は酵素ドメインを含むが、重鎖は表面依存性活性化凝固を必要と するように思われる。 カリクレインはＨＭＷＫを切断してブラジキニン（強力な血管拡張剤であり、 内皮細胞活性化剤である）を形成し、プロウロキナーゼおよびプラスミノーゲン を活性化する（フィブリン分解的）ことができ、表面結合ＦＸＩＩをＦＸＩＩａ に逆に活性化してフィードバックする（図１参照）。それに加え、これはまた好 中球を刺激してエラスターゼの放出を起こす。ＸＩＩａ因子およびカリクレイン は双方ともプラスミン発生を招いてフィブリン分解を起こす。 カリクレインの主要な生理学的阻害剤は不可逆的に阻害するセルピンであるＣ １阻害剤である。精製された系内ではこれらの両蛋白質はカリクレインの異なる 部位に結合するのであるが、ＨＭＷＫはＣ１阻害剤による阻害からカリクレイン を保護することが証明されている。α２−マクログロブリンはカリクレインの別 の主要な阻害剤の一つである。アンチトロンビン−ＩＩＩもカリクレインを阻害 できるがヘパリン存在下でさえ低速である。α２−アンチプラスミンおよびα１ −アンチトリプシンはカリクレインの弱い阻害剤である。α１−プロテイナーゼ 阻害剤の変異体（α１−プロテイナーゼ阻害剤−ピッツバーグ）はＰ₁位にＡｒ ｇ、Ｐ₂位にＡｌａを含有しており、ＸＩＩｆ因子（ＦＸＩＩｆ）およびカリク レインの阻害剤であることが証明されているが、これらプロテアーゼの最強力天 然阻害剤であるＣ１阻害剤と比較してもさらに強力である（Ｓｃｈａｐｉｒａ， Ｍ．など、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８０巻：５８２〜５８５頁［１９８ ７年］；Ｐａｔｓｔｏｎ，Ｐ．Ａ．など、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻 ：１０７８６〜１０７９１頁［１９９０年］）。この変異体で処理したラットは ＦＸＩＩｆの注射が起こした低血圧から部分的に保護された。 塩基性膵トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ、アプロチニン）は血漿カリクレインな らびにプラスミンおよび他の多数のセリンプロテアーゼを可逆的に阻害するが、 ＢＰＴＩのＰ₁残基はＬｙｓである。１５位にアルギニンを持つＢＰＴＩの変種 の一つが半合成的に調製され、Ｋ_i＝１５ｎＭというＢＰＴＩよりも約２０倍も 高親和性で血漿カリクレインを阻害することが発見された（Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｆ ．なと、Ｂｌｏｏｄ、６９巻：１４３１〜１４３６頁［１９８７年］）。ＢＰＴ Ｉは急性膵臓炎の患者の処置に使用されている（Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．とＷｕｎｄｅ ｒｅｒ，Ｇ．、Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．Ｄｒｕｇ・Ｒｅｓ．、３３巻 ：４７９〜４９４頁［１９８３年］）。外科手術後出血の削減（Ｒｏｙｓｔｏｎ ，Ｄ．、Ｂｌｏｏｄ・Ｃｏａｇ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．、１巻：５５〜６９頁［１ ９９０年］）および心肺バイパス手術においてまた体外循環モデルでの使用につ いて（Ｆｕｈｒｅｒ，Ｇ．など、Ｂｌｏｏｄ・Ｃｏａｇ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．、 ３巻：９９〜１０４頁［１９９２年］；Ｗａｃｈｔｆｏｇｅｌ，Ｙ．Ｔ．など、 Ｊ． Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、１０６巻：１〜１０頁［１ ９９３年］）、アプロチニンの利用および接触経路の関与（下記参照）も記載さ れている。同様に、大豆トリプシン阻害剤がブラジキニン形成およびラットにお けるエンドトキシンが誘発する初期低血圧を阻害することが証明されている（Ｋ ａｔｏｒｉ，Ｍ．など、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、９８巻：１３８３〜 １３９１頁［１９８９年］）。 疾病におけるＴＦ−ＦＶＩＩａ（血栓症） ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体の形成は凝固カスケード開始の鍵となる現象であると 考えられている（Ｃａｒｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．とＪ．Ｐ．Ｂｒｏｚｎａ、Ｂｌｏｏｄ ・Ｃｏａｇ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．、４巻：２８１〜２９２頁［１９９３年］；Ｄ ａｖｉｅ，Ｅ．Ｗ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：１０３６３〜１ ０３７０頁［１９９１年］；Ｒａｐａｐｏｒｔ，Ｓ．Ｉ．とＬ．Ｖ．Ｍ．Ｒａｏ 、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．、１２巻：１１１１〜１１２１頁 ［１９９２年］）。ＴＦは内皮ならびに単球の表面に見られ、炎症反応の間に活 性化されてくるようである（Ａｌｔｉｅｒｉ，Ｄ．Ａ．、Ｂｌｏｏｄ、８１巻： ５６９〜５７９頁［１９９３年］）。そこで、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体の阻害剤 は抗凝固剤として、および抗炎症剤として有用でありうる。ＴＦに対するモノク ローナル抗体は敗血症ショックのヒヒのモデルにおいて死亡を防御することが証 明されている（Ｔａｙｌｏｒ・Ｊｒ．，Ｆ．Ｂ．など、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ、 ３３巻：１２７〜１３４頁［１９９１年］）。ＴＦ抗体はＴＦが病巣脳虚血で一 定の役割を果たすことを証明した（Ｔｈｏｍａｓ，Ｗ．Ｓ．など、Ｓｔｒｏｋｅ 、２４巻：８４７〜８５４頁［１９９３年］）。血栓症のウサギモデルで、ウサ ギＴＦに対するモノクローナル抗体は頚動脈において血栓形成を阻害した（Ｐａ ｗａｓｈｅ，Ａ．Ｂ．など、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７４巻：５６〜６３頁［１９ ９４年］）。 疾患における接触活性化経路 接触活性化は、凝固、キニン、フィブリン分解、補体および他の関連する経路 を介して、炎症および血栓症を部分的に調節する能力のある表面介在経路である （図１参照）。この経路に関与する蛋白質にはＦＸＩＩ（Ｈａｇｅｍａｎ因子） 、プレカリクレイン（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ因子）、ＦＸＩ、高分子量キニノーゲン （ＨＭＷＫ）、およびＣ１阻害剤を包含する（ＤｅＬａ・Ｃａｄｅｎａ，Ｒ．Ａ ．など、「止血および血栓症：基本原理と臨床診療（Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ・ａ ｎｄ・Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：Ｂａｓｉｃ・Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ・ａｎｄ・Ｃ ｌｉｎｉｃａｌ・Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（Ｃｏｌｍａｎ，Ｒ．Ｗ．、Ｈｉｒｓｈ ，Ｊ．、Ｍａｒｄｅｒ，Ｖ．、Ｓａｌｚｍａｎ，Ｅ．Ｗ．編）、２１９〜２４０ 頁、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ社、フィラデルフィア［１９９４年］；Ｗａ ｃｈｔｆｏｇｅｌ，Ｙ．Ｔ．など、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．、７２巻：１〜２１ 頁［１９９３年］）。この血漿プロテアーゼ系の関与が敗血症ショック、成人呼 吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、汎発性血管内凝固症（ＤＩＣ）、心肺バイパス手術 、外科手術後出血およびその他の疾患状態を含む種々の臨床的症状の発現に重要 な役割を演じていることが示唆されている（Ｃｏｌｍａｎ，Ｒ．Ｗ．、Ｎ．Ｅｎ ｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２０巻：１２０７〜１２０９頁［１９８９年］；Ｂｏｎ ｅ，Ｒ．Ｃ．、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、１５２巻：１３８１〜１３ ８９頁［１９９２年］）。 敗血症ショック 敗血症ショックは米国の集中治療病棟における、ヒトの最も通常の死因である （Ｐａｒｉｌｌｏ，Ｊ．Ｅ．など、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．、１１３巻：２２ ７〜２４２頁［１９９０年］；Ｓｃｈｍｅｉｃｈｅｌ，Ｃ．Ｊ．とＭｃＣｏｒｍ ｉｃｋ，Ｄ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：２６４〜２６７頁［１９９２ 年］）。これは通常、血流に侵入する感染症の局所的病巣によって開始される。 敗血症およびショックの発症はグラム陰性、グラム陽性いずれの細菌または真菌 微生物での感染症から起きることがある。これらの生物はすべて循環器機能障害 という共通なパターンを誘発するように思われる。近年、積極的補液点滴療法が 敗血症ショックの一次的処置法として受入れられている。補液の適当な補充は心 排出量増強および血管抵抗低下に関連がある。処置にもかかわらず、敗血症ショ ックは全身的血管抵抗の重篤な減少および一般的な血流分布不全をもたらす。積 極 的治療はショックおよび死５０％の症例で逆転する。非常に低い血管抵抗に由来 する無反応の低血圧は補液点滴によっては修正できない。これら敗血症ショック による死亡例の中で、約７５％が継続的低血圧で死亡し、残りは多臓器不全によ って死亡する（図１参照）。 敗血症ショックにおける心排出量増加および血管拡張は炎症媒介物質の作用に 起因する。敗血症ショック、ＤＩＣおよび低血圧を招く実際の事象は解明されて はいないが、多数の生理学的系内の様々な成分の間の解明済み相互作用が図１に 示すように接触経路の活性化が敗血症ショック、多臓器不全、および死の症状を 招きうることを示唆する（Ｂｏｎｅ，Ｒ．Ｃ．、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅ ｄ．、１５２巻：１３８１〜１３８９頁［１９９２年］）。内因性凝固の接触系 および補体系は敗血症および敗血症ショック、特に致死的敗血症ショックの症例 では過剰に活性化される。接触系はたとえばブラジキニン、ＦＸＩＩａ、ＦＸＩ ＩｆおよびＣ５ａのように致死的ショックの病因論に一定の役割を果たすと思わ れる血管作用性媒介物質多数の発生に関与できる。ブラジキニン、ＦＸＩＩａお よびＦＸＩＩｆは強力な低血圧の誘発剤であるが、Ｃ５ａは血管拡張および血管 透過性誘発剤である。ＦＸＩＩ、プレカリクレインおよび高分子量キニノーゲン の水準は非致死的ショックの間には明確に低下するが、致死的敗血症ショックの 間には各々正常値の約３０％、５７％および２７％まで激しく低下する。これら の変化は敗血症症状がグラム陽性またはグラム陰性の細菌のいずれで起きている かに関わらず観察される。接触活性化経路はフィブリン沈着および分解ならびに 好中球活性化の始動、補体の活性化および血圧の調節にも関与している。 プレカリクレイン水準の低下は肝臓疾患、ＤＩＣ、慢性腎不全および腎炎症候 群においても観察される。敗血症ショックにおいてはカリクレイン−キニン系の 成分が欠乏して、この系の活性化が示唆される。これは心臓性ショックでは起き ず、カリクレイン−キニン系が敗血症ショックにおける中心的存在であることを 示唆する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｂｒｏｔｏｎｓ，Ｆ．など、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａ ｅｍｏｓｔａｓ．、５８巻：７０９〜７１３頁［１９８７年］）。 ＡＲＤＳ ＡＲＤＳは複雑な肺疾患であって米国では毎年１５００００人が罹患し、死亡 率５０％を示す。白血球、血小板および凝固や補体の蛋白質分解経路がＡＲＤＳ を媒介する。ＡＲＤＳは接触活性化経路の活性化およびＣ１阻害剤の欠乏に関与 する。敗血症誘発ＡＲＤＳは外傷誘発性ＡＲＤＳに比較してさらに重症のＤＩＣ およびフィブリン分解、フィブリン分解産物増加およびＡＴＩＩＩ濃度低下を招 く（Ｃａｒｖａｌｈｏ，Ａ．Ｃ．など、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１１ ２巻：２７０〜２７７頁［１９８８年］）。 汎発性血管内凝固症 汎発性血管内凝固症（ＤＩＣ）は組織損傷および微生物侵入に反応して起きる 疾患であって、フィブリンの広範な沈着およびフィブリノーゲン水準の低下によ って特徴付けられる（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｂｅｒｇｈａｕｓ，Ｇ．、Ｓｅｍｉｎ．Ｔ ｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、１５巻：５８〜８７頁［１９８９年］）。 プロトロンビンおよび活性化部分トロンボプラスチン時間の延長が存在する。Ｄ ＩＣは種々の疾患の臨床的設定において観察されている（Ｆｒｕｃｈｔｍａｎ， Ｓ．Ｍ．とＲａｎｄ，Ｊ．Ｈ．、「循環器疾患における血栓症（Ｔｈｒｏｍｂｏ ｓｉｓ・ｉｎ・Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ・Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」（Ｆｕｓ ｔｅｒ，Ｖ．とＶｅｒｓｔｒａｅｔｅ，Ｍ．編）、５０１〜５１３頁、Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ社、フィラデルフィア［１９９２年］）。 低血圧、ＤＩＣおよび好中球活性化はすべてＸＩＩａ因子、血漿キニノーゲン およびカリクレインの相互作用によって始動する。これら３蛋白質のどれかが不 足すると血小板、他種凝固因子および内皮細胞に起因する系内での余剰によって 欝血性疾患は起きない。 敗血症ショックなど関連疾患に対しては、サイトカイン拮抗剤、Ｍａｂ（エン ドトキシン、組織因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、好中球などに対する）、キニ ン拮抗剤、細菌性透過性増加蛋白質、ＰＡＦ拮抗剤、Ｃ１阻害剤、ＤＥＧＲ−Ｆ Ｘａ、活性化Ｃ蛋白質および他種の手法多数を含む、治療的手法多数が確認され ている。この疾患の複雑な性質のために、多くの経路に影響する薬剤または多数 の薬剤を含む手法が敗血症ショックの処置において成功するであろう可能性もあ る（Ｓｃｈｍｅｉｃｈｅｌ，Ｃ．Ｊ．とＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｄ．、ＢｉｏＴｅ ｃｈｎｏｌ．、１０巻：２６４〜２６７頁［１９９２年］）。 セリンプロテアーゼのクニッツドメイン阻害剤 ＴＦＰＩに認められるクニッツ型プロテアーゼ阻害剤ドメインは、ＢＰＴＩ、 アルツハイマーアミロイドβ−蛋白質前駆体およびインター−α−トリプシン阻 害剤を含む他種の哺乳類蛋白質の中にも発見される（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ． Ｅ．とＩ．Ｇ．Ｃｈａｒｌｅｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｓｙ ｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５２巻：５１１〜５１９頁［１９８７年］；Ｓ ａｌｖｅｓｅｎ，Ｇ．とＰｉｚｚｏ，Ｓ．、「止血および血栓症：基本原理と臨 床診療（Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ・ａｎｄ・Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：Ｂａｓｉｃ・ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ・ａｎｄ・Ｃｌｉｎｉｃａｌ・Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（Ｃ ｏｌｍａｎ，Ｒ．Ｗ．、Ｈｉｒｓｈ，Ｊ．、Ｍａｒｄｅｒ，Ｖ．、Ｓａｌｚｍａ ｎ，Ｅ．Ｗ．編）中、２４１〜２５８頁、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ社、フ ィラデルフィア［１９９４年］）（図２）。クニッツ型プロテアーゼ阻害剤はヒ トＶＩ型コラーゲンのα−３鎖からも調製されている（ＷＯ９３／１４１１９参 照）。これらは多数のヘビの蛇毒中にも確認されている。最近、ＴＦ−ＦＶＩＩ ａのクニッツ阻害剤がＢＰＴＩからファージディスプレー技術を使用して調製さ れた（Ｄｅ・Ｍａｅｙｅｒなど、血栓症および止血抄録集、国際血栓症および止 血学会第ＸＩＶ次総会、８８８頁、抄録番号１２４５［１９９３年］）。これら 著者はＫ_i＝０．５ｎＭを持っているＴＦ−ＦＶＩＩａ変異体ＢＰＴＩ（Ｔ１１ Ｄ、Ｋ１５Ｒ、Ｒ１７Ｌ、Ｉ１８Ｈ、Ｉ１９Ｌ、Ｖ３４Ｙ、Ｒ３９ＬおよびＫ４ ６Ｅ）を報告している。 クニッツドメインは一般に安定な蛋白質であって、約６０残基およびジスルフ ィド結合を形成して特異的な間隔を持つシステイン６個が存在する。これらはセ リンプロテアーゼに対する低速で、強固に結合する、可逆的な阻害剤であって活 性部位に結合して、標準的機序に従って阻害することが知られている。それに続 くＰ₁とＰ₁’残基との間の切断はあるとしても非常に低速で起きる（Ｂｏｄｅ， Ｗ．とＨｕｂｅｒ，Ｒ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０４巻：４３３〜 ４５ １頁［１９９２年］；Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｊｒ．とＫａｔｏ，Ｉ．、Ａ ｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９巻：５９３〜６２６頁［１９８０年］ ）。セリンプロテアーゼのサブサイトとクニッツドメインの一次結合ループ（Ｐ₅ −Ｐ₄’）の側鎖との間には多数の相互作用が存在する（Ｂｏｄｅ，Ｗ．とＨｕ ｂｅｒ，Ｒ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０４巻：４３３〜４５１頁［ １９９２年］；Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｊｒ．とＫａｔｏ，Ｉ．、Ａｎｎｕ ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９巻：５９３〜６２６頁［１９８０年］）。しか しながら、Ｐ₁残基と特異性ポケットとの間の相互作用はエネルギー的に最重要 であって、それ故に、一次特異性決定基を代表する（図３参照）。ＴＦ−ＦＶＩ Ｉａおよび、たとえばＦＸＩａおよびカリクレインのような他のトリプシン様プ ロテアーゼの基質と阻害剤とはＰ₁残基にＡｒｇまたはＬｙｓを持つ。それ故に 、１５位（Ｐ₁）において、ＡｒｇもＬｙｓもどちらも一般的には好適である。 しかしながら、Ｐ₁には時々メチオニンが見られ、これもセリンプロテアーゼの 良好な阻害には好適でありうる（ＭｃＧｒａｔｈ，Ｍ．Ｅ．など、Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：６６２０〜６６２５頁［１９９１年］）。クニッツド メインのＰ₁位に、たとえばＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅのような残基を導入すると ヒトの白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）に対する強い阻害作用および同時に野生型 阻害活性の喪失に到る（Ｂｅｃｋｍａｎｎ，Ｊ．など、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．、１７６巻：６７５〜６８２頁［１９８８年］；Ｓｉｎｈａ，Ｓ．など、 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２１０１１〜２１０１３頁［１９９１年 ］）。天然起源アミノ酸以外の残基もクニッツドメインおよびその他関連プロテ アーゼ阻害剤ドメインに化学的合成法によって置換されている（Ｂｅｃｋｍａｎ ｎ，Ｊ．など、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７６巻：６７５〜６８２頁［ １９８８年］；Ｂｉｇｌｅｒ，Ｔ．Ｌ．など、Ｐｒｏｃ．Ｓｃｉ．、２巻：７８ ６〜７９９頁［１９９３年］）。 クニッツドメインの結晶構造はＦＶＩＩａおよび他種セリンプロテアーゼのセ リンプロテアーゼドメインに接触させると思われる鍵となる残基を明示する（Ｈ ｙｎｅｓ，Ｔ．Ｒ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：１００１８〜１ ００２２頁［１９９０年］；Ｂｏｄｅ，Ｗ．とＨｕｂｅｒ，Ｒ．、Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０４巻：４３３〜４５１頁［１９９２年］：Ｋｏｓｓｉａ ｋｏｆｆ，Ａ．Ａ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、２１巻：６ １４〜６１８頁［１９９３年］）。Ｐ₁位にあるアミノ酸は一般にセリンプロテ アーゼ活性部位に対する阻害剤の親和性を支配する（Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｆ．など 、Ｂｌｏｏｄ、６９巻：１４３１〜１４３６頁［１９８７年］；Ｌａｓｋｏｗｓ ｋｉ，Ｍ．，Ｊｒ．とＫａｔｏ，Ｉ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、 ４９巻：５９３〜６２６頁［１９８０年］；Ｂｅｃｋｍａｎｎ，Ｊ．など、Ｅｕ ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７６巻：６７５〜６８２頁［１９８８年］；Ｓｉ ｎｈａ，Ｓ．など、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２１０１１〜２１０ １３頁［１９９１年］）けれども、この領域外の残基も結合親和性およびセリン プロテアーゼに対する特異性に一定の役割を演じることも知られている（Ｋｏｓ ｓｉａｋｏｆｆ，Ａ．Ａ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、２１ 巻：６１４〜６１８頁［１９９３年］；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｂ．Ｌ．など、Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８９巻：２４２９〜２４３３頁［ １９９２年］）。結合ループ内の接触残基のいくつか（１１、１５、１７および １９位）はクニッツドメインの内部では比較的に変化可能である（Ｃｒｅｉｇｈ ｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．とＩ．Ｇ．Ｃｈａｒｌｅｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒ ｂｏｒ・Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５２巻：５１１〜５１９頁［１９ ８７年］）。１３位は正常にはＰｒｏである。しかしながら、ここには他の残基 も時々見出される。１２位は殆ど常にＧｌｙである。何か側鎖相互作用を補充す ることに加え、Ｐｒｏの代わりの他の残基による置換およびその逆も結合に影響 できるかも知れない主鎖における高次構造の変化を招きうる。ジスルフィド結合 を形成する１４位および３８位におけるシステイン残基はクニッツドメインに常 に見出される。しかしながら、たとえばＡｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＴｈｒの ような他種残基もシステインに置換しうる（Ｍａｒｋｓ，Ｃ．Ｂ．など、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ、２３５巻：１３７０〜１３７３頁［１９８７年］）。 ＡＰＰＩおよびその他のクニッツドメインにおいて、残基１３と３９ならびに 残基１７と３４は近接している（図３）（Ｈｙｎｅｓ，Ｔ．Ｒ．など、Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：１００１８〜１００２２頁［１９９０年］）。それ 故に、残基３４および３９とＡＰＰＩの一次結合ループとの潜在的相互作用がこ れらの位置が結合に影響するかどうかに注目して研究した。残基１６および１８ は一般にクニッツドメイン内では比較的不変である（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ． Ｅ．とＩ．Ｇ．Ｃｈａｒｌｅｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｓｙ ｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５２巻：５１１〜５１９頁［１９８７年］）。 しかしながら、これらの位置における他の残基も結合を変化しうる。それ故に、 １１位から１９位、３４、３８および３９位における残基はすべて結合親和性お よびセリンプロテアーゼに対する特異性に影響しうる（図３）。しかしながら、 他の残基も同様に重要である。例えば、ＡＰＰＩおよびＢＰＴＩは５２位にメチ オニンを持つけれども、他種のクニッツドメインはこの位置に様々な残基を持つ （図２）。この位置のメチオニンはこの蛋白質の形成に関して有益であろう種々 の残基により置換できる。例えば、メチオニンは酸化されてメチオニンスルホキ シドを形成できるが、これが精製を困難にする。蛋白質は組換え的に融合蛋白質 として製造し、続いてメチオニン残基において切断するＣＮＢｒによって切断す ることができる（Ａｕｅｒｓｗａｌｄ，Ｅ．Ｗ．など、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈ ｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ、３６９巻：２７〜３５頁［１９８８年］）。それ故、 無傷の生成物を調製するためには、目的蛋白質内の他のメチオニン残基を除去す ることが必要である。５２位における置換はクニッツドメインの一次結合ループ からかなり離れているので、阻害活性に対して重要な影響を与えるとは期待され ない（図３）。 アルツハイマーアミロイドのβ−蛋白質前駆体（ＫＰＩ）のクニッツプロテア ーゼ阻害ドメイン６１残基は高い親和性で哺乳類セリンプロテアーゼであるトリ プシン、キモトリプシンおよびＸＩａ因子の活性部位に結合する（Ｗａｇｎｅｒ ，Ｓ．Ｌ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、 １８６巻：１１３８〜１１４５頁［１９９２年］）。同様な結果はこのドメイン を含有する融合蛋白質でも見出されている（Ｓｉｎｈａ，Ｓ．など、Ｊ．Ｂｉｏ ｌ． Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２１０１１〜２１０１３頁［１９９１年］）。ＫＰＩド メインもそれから誘導されてきたプロテアーゼであるネキシン−２よりも強度は 小さいけれども、ＦＩＸａ活性を阻害することが証明されている（Ｓｃｈｍａｉ ｅｒ，Ａ．Ｈ．など、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２巻：２５４０〜２５ ４５頁［１９９３年］）。１００μＭにおけるＫＰＩドメインは血漿中でＸａ因 子およびＶＩＩａ因子の両者の凝固活性を対照の２倍以上独立に阻害した。しか しながら、この阻害はＫＰＩドメインによるＸＩａ因子の阻害が〜０．５μＭに おいてＸＩａ因子凝固検定法での２倍の延長を示したのと比較して少なくとも２ 桁弱かった。我々は（ａ）大腸菌のような細菌（Ｃａｓｔｒｏ，Ｍ．など、ＦＥ ＢＳ・Ｌｅｔｔ．、２６７巻：２０７〜２１２頁［１９９０年］）およびＰ．ｐ ａｓｔｏｒｉｓのような酵母内で容易に発現されること、（ｂ）この蛋白質のＸ 線結晶構造が既知であること（Ｈｙｎｅｓ，Ｔ．Ｒ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ、２９巻：１００１８〜１００２２頁［１９９０年］）および（ｃ）これ がヒトの配列から誘導されたものであって、治療上有用な変種に対する免疫原性 を最低にするであろうことから、ＡＰＰＩを手懸かりとして選択した。ヒトおよ び他種哺乳類源からの他のクニッツドメインも同様に使用しうる。 従って、この発明の目的の一つは凝固、接触活性化、フィブリン分解、炎症、 補体活性化および低血圧経路のプロテアーゼを可逆的に阻害する強力なセリンプ ロテアーゼ阻害剤をこれらの経路により影響される疾患の処置のために提供する ことである。この発明の別の目的はＶＩＩａ因子、ＸＩａ因子、カリクレインお よびプラスミンを阻害あることのできる強力な阻害剤を提供することである。こ れらに加えて、治療的処置のためにこれらの阻害剤を製造するための合成方法を 提供することも目的の一つである。これらおよび他の目的はこの出願全体を考慮 すれば明白となる。 発明の要約 本発明によって前記の諸目的が達成されることになり、従ってここにＶＩＩａ 因子、ＸＩａ因子、血漿カリクレインおよびプラスミンから選択されたセリンプ ロテアーゼを阻害することができ、構造式Ｉ： Ｒ₁−Ｘａａ₁₁−Ｘａａ₁₂−Ｘａａ₁₃−Ｘａａ₁₄−Ｘａａ₁₅−Ｘａａ₁₆−Ｘａａ_{1 7} −Ｘａａ₁₈−Ｘａａ₁₉−Ｒ₂−Ｘａａ₃₄−Ｒ₃−Ｘａａ₃₈−Ｘａａ₃₉−Ｒ₄ （Ｉ） ［ここに、 Ｒ₁は天然起源アミノ酸残基５個から２５０個までを含有するペプチドを示す が、その中で少なくとも１残基はＣであるものとする。 Ｒ₂はアミノ酸残基１４個を持つペプチドを示すが、その中で少なくとも１残 基はＣであるものとする。 Ｒ₃はトリペプチドを示す。 Ｒ₄はアミノ酸残基１２個から２５０個までを含有するペプチドを示すが、そ の中で少なくとも１残基はＣであるものとする。 Ｘａａ₁₁はＰ、Ｒ、Ａ、Ｅ、ＧおよびＴの群から選択された天然起源アミノ酸 残基である。 Ｘａａ₁₂はＧを示す。 Ｘａａ₁₃はＰ、Ｌ、Ｗ、Ｖ、Ｇ、Ｆ、Ｈ、Ｙ、Ａ、Ｉ、ＥおよびＱの群から選 択された天然起源アミノ酸残基である。 Ｘａａ₁₄はＣ、Ａ、Ｓ、ＴおよびＧから選択された天然起源アミノ酸残基であ る。 Ｘａａ₁₅はＭ、ＲおよびＫから選択された天然起源アミノ酸残基である。 Ｘａａ₁₆はＧおよびＡから選択された天然起源アミノ酸残基である。 Ｘａａ₁₇はＭ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、ＹおよびＳの群から選択された天然起源アミノ酸 残基である。 Ｘａａ₁₈はＩ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、ＹおよびＦの群から選択された天然起源アミノ酸 残基である。 Ｘａａ₁₉はＬ、Ｒ、Ａ、ＫおよびＩの群から選択された天然起源アミノ酸残基 である。 Ｘａａ₃₄はＦ、Ｉ、Ｓ、Ｌ、Ｙ、ＷおよびＶの群から選択された天然起源アミ ノ酸残基である。 Ｘａａ₃₈はＣ、Ａ、Ｓ、ＴおよびＧから選択された天然起源アミノ酸残基であ る。 Ｘａａ₃₉はＹ、Ｇ、Ｗ、ＨおよびＦの群から選択された天然起源アミノ酸残基 である。 但しここに、Ｒ₁はＸ¹ＤＩＣＫＬＰＫＤ（配列番号１） ［ここに、Ｘ¹はＨまたはアミノ酸残基１個から５個までである］ ではなく、さらに Ｘａａ₁₁からＸａａ₁₉までは ＰＧＦＡＫＡＩＩＲ（配列番号２）、 ＴＧＬＣＫＡＹＩＲ（配列番号３）、 ＴＧＬＣＫＡＲＩＲ（配列番号４）または ＡＧＡＡＫＡＬＬＡ（配列番号５） ではないものとする。］ で示されるアミノ酸配列を持つ精製ポリペプチドを含む物体が提供される。 式Ｉで示される好適なポリペプチドは組織因子−ＶＩＩａ因子に関して見掛け の解離定数（Ｋ_i*）約１００ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、さらに、 最も好ましくは３ｎＭまたはそれ以下を持つ。要すれば、この好適なポリペプチ ドはＸＩａ因子およびカリクレインの両方に関しても見掛けの解離定数（Ｋ_i*） 約１０ｎＭ以下、さらに最も好ましくは２ｎＭまたはそれ以下を持つ。ＴＦ−Ｆ ＶＩＩａ、ＦＸＩａおよびカリクレインの三者全ての強力な阻害剤である式Ｉで 示されるポリペプチドは、好ましくはＸａａ₁₈−Ｘａａ₁₉としてＩ−Ｌを持つ。 要すれば、この好適なポリペプチドはＴＦ−ＦＶＩＩａを特異的に阻害し、ＸＩ ａ因子およびカリクレインの双方に関する見掛けの解離定数（Ｋ_i*）約５０ｎＭ 以上、さらに最も好ましくは約８０ｎＭ以上を持つ。ＴＦ−ＦＶＩＩａの特異的 な強力な阻害剤である式Ｉで示されるポリペプチドは好ましくはＸａａ₁₈−Ｘａ ａ₁₉としてＭ−Ｋ／Ｒを持つ。 構造式Ｉで示される好適なポリペプチドは約５８アミノ酸残基を含み、ここに Ｒ₁は１０残基ペプチドであり、Ｒ₂は１４残基ペプチドであり、Ｒ₃はトリペプ チドであり、Ｒ₄は１９残基ペプチドであって、ここでは残基５、１４、３０、 ３８、５１および５５はＣであるものとする。また、好ましくは、残基１２およ び３７はＧであり。残基３３および４５はＦであり、残基３５はＹであり、残基 ４３はＮである。 構造式Ｉで示されるポリペプチドの好適例は次の通りである： Ｒ₁は次の群から選択する： ＶＲＥＶＣＳＥＱＡＥ（配列番号６）、 ＭＨＳＦＣＡＦＫＡＤ（配列番号７）、 ＫＰＤＦＣＦＬＥＥＤ（配列番号８）、 ＧＰＳＷＣＬＴＰＡＤ（配列番号９）、 ＫＥＤＳＣＱＬＧＹＳ（配列番号１０）、 ＴＶＡＡＣＮＬＰＩＶ（配列番号１１）、 ＬＰＮＶＣＡＦＰＭＥ（配列番号１２）および ＲＰＤＦＣＬＥＰＰＹ（配列番号１３）。 Ｒ₂は次の群から選択する： ＲＷＹＦＤＶＴＥＧＫＣＡＰＦ（配列番号１４）、 ＲＦＦＦＮＩＦＴＲＱＣＥＥＦ（配列番号１５）、 ＲＹＦＹＮＮＱＴＫＱＣＥＲＦ（配列番号１６）、 ＲＦＹＹＮＳＶＩＧＫＣＲＰＦ（配列番号１７）、 ＲＹＦＹＮＧＴＳＭＡＣＥＴＦ（配列番号１８）、 ＬＷＡＦＤＡＶＫＧＫＣＶＬＦ（配列番号１９）、 ＫＷＹＹＤＰＮＴＫＳＣＡＲＦ（配列番号２０）、 ＲＷＦＦＮＦＥＴＧＥＣＥＬＦ（配列番号２１）および ＲＹＦＹＮＡＫＡＧＬＣＱＴＦ（配列番号２２）。 Ｒ₃は次の群から選択する： ＹＧＧおよびＹＳＧ。 Ｒ₄は次の群から選択する： ＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＡＡＶＣＧＳＡ（配列番号２３）、 ＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＭＡＶＣＧＳＡ（配列番号２４）、 ＧＮＱＮＲＦＥＳＬＥＥＣＫＫＭＣＴＲＤ（配列番号２５）、 ＧＮＭＮＮＦＥＴＬＥＥＣＫＮＩＣＥＤＧ（配列番号２６）、 ＧＮＥＮＮＦＴＳＫＱＥＣＬＲＡＣＫＫＧ（配列番号２７）、 ＧＮＧＮＮＦＶＴＥＫＥＣＬＱＴＣＲＴＶ（配列番号２８）、 ＧＮＧＮＫＦＹＳＥＫＥＣＲＥＹＣＧＶＰ（配列番号２９）、 ＧＮＥＮＫＦＧＳＱＫＥＣＥＫＶＣＡＰＶ（配列番号３０）、 ＧＮＳＮＮＦＬＲＫＥＫＣＥＫＦＣＫＦＴ（配列番号３１）および ＡＫＲＮＮＦＫＳＡＥＤＣＭＲＴＣＧＧＡ（配列番号３２）。 Ｘａａ₁₁はＰである。 Ｘａａ₁₂はＧである。 Ｘａａ₁₃はＰ、Ｖ、ＬおよびＷの群から選択する。 Ｘａａ₁₄はＣである。 Ｘａａ₁₅はＲまたはＫである。 Ｘａａ₁₆はＡである。 Ｘａａ₁₇はＭまたはＬである。 Ｘａａ₁₈はＭまたはＩである。 Ｘａａ₁₉はＬ、ＫまたはＲである。 Ｘａａ₃₄はＦ、Ｖ、ＩまたはＹである。 Ｘａａ₃₈はＣである。 Ｘａａ₃₉はＹ、Ｇ、またはＨである。 さらに好適な態様において、式： Ｒ₁−Ｘａａ₁₁−Ｘａａ₁₂−Ｘａａ₁₃−Ｘａａ₁₄−Ｘａａ₁₅−Ｘａａ₁₆−Ｘａａ_{1 7} −Ｘａａ₁₈−Ｘａａ₁₉−Ｒ₂−Ｘａａ₃₄−Ｒ₃−Ｘａａ₃₈−Ｘａａ₃₉−Ｒ₄ ［ここに、いずれの場合も Ｒ₁は配列：ＶＲＥＶＣＳＥＱＡＥ（配列番号６）を持つ。 Ｒ₂は配列：ＲＷＹＦＤＶＴＥＧＫＣＡＰＦ（配列番号１４）を持つ。 Ｒ₃は配列ＹＧＧを持つ。 Ｒ₄は配列：ＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＡＡＶＣＧＳＡ（配列番号２３）また はＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＭＡＶＣＧＳＡ（配列番号２４）を持つ。］ で示される配列のポリペプチドは特に好適である。それ故、次の呼称と構造式と を持つポリペプチドは好適である： Ｉ−１８ Ｒ₁ＰＧＶＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号４３） Ｉ−４９ Ｒ₁ＰＧＷＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号４４） Ｉ−１４ Ｒ₁ＰＧＦＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号４５） Ｉ−１６ Ｒ₁ＧＧＷＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号４６） ［ここに、Ｒ₄は配列番号２４で示される配列である］および ＩＩ−４ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＭＩＳＲ₂ＦＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号４７） ＩＩ−３ Ｒ₁ＰＧＷＣＲＡＭＩＳＲ₂ＩＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号４８） ＩＩ−６ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＭＩＳＲ₂ＩＲ₃ＣＷＲ₄（配列番号４９） ＩＩＩ−２７ Ｒ₁ＴＧＰＣＲＡＬＩＳＲ₂ＷＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号５０） ＩＩＩ−３０ Ｒ₁ＴＧＰＣＲＡＬＩＳＲ₂ＹＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号５１） ＴＦ７１−ＶＹ Ｒ₁ＰＧＶＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号５２） ＴＦ７１−ＬＹ Ｒ₁ＰＧＬＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号５３） ＴＦ７１−ＷＹ Ｒ₁ＰＧＷＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号５４） ＴＦ７１−ＰＧ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号５５） ＩＶ−４７Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＭＭＫＲ₂ＩＲ₃ＣＨＲ₄（配列番号５６） ＩＶ−５４Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＬＭＫＲ₂ＶＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号５７） ＩＶ−３１Ｂ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＬＭＫＲ₂ＶＲ₃ＣＦＲ₄（配列番号５８） ＩＶ−４９Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＭＭＫＲ₂ＩＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号５９） ＩＶ−５０Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＭＹＫＲ₂ＩＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号６０） ＩＶ−５７Ｃ Ｒ₁ＰＧＶＣＲＡＭＭＫＲ₂ＩＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号６１） ＩＶ−５１Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＬＭＲＲ₂ＹＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号６２） ＩＶ−３５Ｂ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＩＭＫＲ₂ＩＲ₃ＣＨＲ₄（配列番号６３） ＩＶ−５８Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＬＭＫＲ₂ＹＲ₃ＣＨＲ₄（配列番号６４） ＩＶ−４８Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＬＭＫＲ₂ＷＲ₃ＣＷＲ₄（配列番号６５） ＩＶ−４６Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＭＩＫＲ₂ＬＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号６６） ＩＶ−５５Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＬＭＫＲ₂ＦＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号６７） ＩＶ−３２Ｂ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＬＭＫＲ₂ＹＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号６８） ＩＶ−３６Ｂ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＬＭＫＲ₂ＶＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号６９） ＩＶ−４０Ｂ Ｒ₁ＰＧＡＣＫＡＭＹＫＲ₂ＩＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号７０） ５３ｂ Ｒ₁ＰＧＰＧＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＡＹＲ₄（配列番号７１） ＴＦ７１−Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号７２） ［ここに、Ｒ₄は配列番号２３で示される配列である］。しかしながら前記の通 り本発明に従えば、Ｒ₁はアミノ酸残基５個から２５０個を持ついかなるペプチ ドであることもできるが、ここでは少なくとも残基１個がＣである。特定的態様 ではＲ₁は（配列番号６）、（配列番号７）、（配列番号８）、（配列番号９） 、（配列番号１０）、（配列番号１１）、（配列番号１２）または（配列番号１ ３）から構成される群から選択される。Ｒ₂はアミノ酸１４個を持ついかなるペ プチドであることもできるが、ここでは少なくとも残基１個がＣである。特定的 な態様では、Ｒ₂は（配列番号１４）、（配列番号１５）、（配列番号１６）、 （配列番号１７）、（配列番号１８）、（配列番号１９）、（配列番号２０）、 （配列番号２１）、（配列番号２２）から構成される群から選択される。Ｒ₃は トリペプチドであって、特にＹＧＧまたはＹＳＧから構成される群から選択され る。Ｒ₄はアミノ酸残基１２個から２５０個を持ついかなるペプチドであること もできるが、ここでは少なくとも残基１個がＣである。特定的な態様ではＲ₄は （配列番号２３）、（配列番号２４）、（配列番号２５）、（配列番号２６）、 （配列番号２７）、（配列番号２８）、（配列番号２９）、（配列番号３０）、 （配列番号３１）、（配列番号３２）から構成される群から選択される。 本発明では前記の変化に加えて、ＡＰＰＩの残基２０、４４および４６に対応 する残基が修正されたポリペプチドも意図されている。本発明のこの側面に従え ば、このポリペプチドと凝固カスケードの特定のセリンプロテアーゼとの間の好 ましい相互作用を促進するアミノ酸置換も意図されている。本発明のこの側面に 従えば、Ｒ₂の第一アミノ酸残基と均等な残基２０が修飾される。本発明のこの 側面に従えば、好ましくはＡＰＰＩの位置２０におけるアミノ酸はＡ、Ｖ、Ｓ、 Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、ＬまたはＩに修正される。それ故に、Ｒ₂の第一アミノ酸 がＸａａ₂₀で表され、ここにＸａａ₂₀がＡ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｌお よびＩから構成される群から選択したものが好適である。 本発明のこの側面に従えば、Ｒ₄の第５および第７残基に相当するＡＰＰＩの 残基４４および４６が修飾されてポリペプチドと、たとえば組織因子−ＶＩＩａ 因子複合体のような凝固カスケードの特定のセリンプロテアーゼとの間の望まし い相互作用を促進する。それ故に、Ｘａａ₄₄とＸａａ₄₆とで示される４４位およ び４６位が各々そのポリペプチドと組織因子−ＶＩＩａ因子との間の望ましい相 互作用を促進するように修飾されているポリペプチドが好適である。Ｘａａ₄₆に おける例示的残基にはＤまたはＥを包含する。他の置換基は本出願の教示を基に すれば、当業者には明白となろう。得られるポリペプチドは組織因子−ＶＩＩａ 因子に関して見掛けのＫ_i*が約１００ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、 および最も好ましくは３ｎＭまたはそれ以下になる。要すれば、このポリペプチ ドはＸＩａ因子およびカリクレインの両者に関して見掛けのＫ_i*が約１０ｎＭ以 下、より好ましくは２ｎＭまたはそれ以下である。 さらに別の態様では、本発明は構造式Ｉで示されるポリペプチドを含む物体の 蛋白質成分をコードする分離された核酸、好ましくはＤＮＡ、を含む物体も包含 する。本発明はさらにこのＤＮＡ分子に作動可能に連結している発現制御配列、 発現ベクター、好ましくはＤＮＡ分子を含むプラスミドであって、制御配列がそ のベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されるもの、およびこのベク ターで形質転換された宿主細胞も包含する。 本発明の好適な発現ベクターはｐＢＲ３２２、ｐｈＧＨ１、ｐＢＯ４７５、ｐ ＲＩＴ５、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＫＫ２３３−２、ｐＤＲ５４０およびｐＰＬ−ラム ダから選択しうるが、最も好適なベクターはｐＳＡｌｚ１である。 本発明の発現ベクターを含有する好適な宿主細胞は、大腸菌Ｋ１２の２９４株 （ＡＴＣＣ３１４６６）、大腸菌ＪＭ１０１株、大腸菌Ｂ株、大腸菌Ｘ１７７６ 株（ＡＴＣＣ３１５３７）、大腸菌ｃ６００株、大腸菌Ｗ３１１０株（Ｆ−、ガ ンマー、原栄養株、ＡＴＣＣ２７３２５）、枯草菌、サルモネラ・チフィムリウ ム菌およびセラチア・マルセッセンス菌およびシュードモナスの種から選択しう るが最も好適な宿主細胞は大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）または、 たとえばプロテアーゼ欠失株２７Ｃ７のようにそれから誘導された菌である。 本発明の物体は前記アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸配列を分離また は合成する段階、その核酸配列を適切な宿主中でその核酸配列を発現できる適当 な発現ベクター中に結合する段階、その核酸配列を結合した発現ベクターでその 宿主を形質転換する段階、その核酸配列の発現に適する条件下に宿主を培養し、 それによって選択した核酸配列がコードする蛋白質を宿主により発現する段階を 包含する工程によって製造しうる。この工程において、結合段階ではさらに、核 酸が適当な分泌シグナルに作動可能に連結して宿主がアミノ酸配列を分泌するよ う、核酸を適当な発現ベクター中に結合することも意図しうる。分泌シグナルは ｓｔＩＩ、ｌａｍＢ、ヘルペスｇＤ、ｌｐｐ、アルカリホスファターゼ、インベ ルターゼおよびα因子から構成される群から選択しうるが、好ましくはｓｔＩＩ である。 本発明はさらに本文に記載した物体の治療的応用にも展開する。かくして本発 明は医薬的に許容される添加剤および精製された式Ｉで示されるアミノ酸配列を 含有する医薬的組成物を包含する。 これらの応用は、例えば、哺乳類に医薬的有効量の医薬的物体を投与すること からなる哺乳類で血栓形成を阻害する方法を包含する。医薬的有効量は約０．０ ０１ｎＭおよび１．０ｍＭとの間でありうるが、好ましくは約０．１ｎＭと１０ ０μＭとの間、最も好ましくは約１．０ｎＭと５０μＭとの間である。これに加 えて、医薬的物体は、たとえば組織プラスミノーゲン活性化剤、ストレプトキナ ーゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼおよびこれらの修飾体のようなフィブリ ン溶解剤または血栓溶解剤の投与前、後または同時に投与しうる。あるいは医薬 的物体は抗凝固剤と組合せても投与しうる。 これに加えて、他の応用は、例えば、本医薬的物体の医薬的有効量を哺乳類に 投与することからなるＶＩＩａ因子、ＸＩａ因子、血漿カリクレインまたはプラ スミンの阻害が指示される哺乳類の処置法を包含する。このような徴候には、炎 症、敗血症ショック、低血圧、ＡＲＤＳ、ＤＩＣ、心肺バイパス手術、および外 科手術後の出血が含まれる。 図面の簡単な説明 図１．凝固、接触、フィブリン溶解、炎症および補体の各経路を制御する酵素 および媒介物質の代表的なものの図式的概要。これら経路の活性化が記載の臨床 的症状を招くことになる。 図２．哺乳類源からのクニッツドメインの配列列記。列記したものは本文記載 のＴＦ７１−Ｃ（残基１〜５８）（配列番号３３）、ＡＰＰＩ（残基１〜５８） （配列番号３４）；ヒトのアルツハイマー病アミロイドβ−前駆体残基２８７〜 ３４４（Ｃａｓｔｒｏ，Ｍ．など、ＦＥＢＳ・Ｌｅｔｔ．、２６７巻：２０７〜 ２１２頁［１９９０年］）；各々ヒトＴＦＰＩからのＴＦＰＩ−ＫＤＩ（残基２ ２〜７９）（配列番号３５）、ＴＦＰＩ−ＫＤ２（残基９３〜１５０）（配列番 号３６）およびＴＦＰＩ−ＫＤ３（残基１８５〜２４２）（配列番号３７）（Ｂ ｒｏｚｅ・Ｊｒ．Ｇ．Ｊ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：７５３９ 〜７５４６［１９９０年］）；各々ヒトのインター−α−トリプシン阻害剤のＩ ＴＩ−ＫＤ１およびＩＴＩ−ＫＤ２（残基２２〜７９および７８〜１３５）（配 列番号３８および３９）（Ｖｅｔｒ，Ｈ．など、ＦＥＢＳ・Ｌｅｔｔ．、２４５ 巻：１３７〜１４０頁［１９８９年］）；コラーゲンα３（ＶＩ）鎖前駆体のコ ラーゲンα３（ＶＩ）（残基２８９９〜２９５６）（配列番号４０）（Ｃｈｕな ど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、９巻：３８５〜３９３頁［１９９０年］）；ヒトのクニッ ツ型プロテアーゼ阻害剤ＨＫＩＢ９のＨＫＩＢ９（７〜６０）（配列番号４１） （Ｎｏｒｒｉｓ，Ｋ．、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中（１９９３年１２月３１ 日、リリース３９．０）、サブミット１９９４年１月１９日；ウシ塩基性膵トリ プシン阻害剤アプロチニンのＢＰＴＩ（１〜５８）（配列番号４２）（Ｃｒｅｉ ｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．およびＣｈａｒｌｅｓ，Ｉ．Ｇ．、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎ ｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５２巻：５１１〜５１ ９頁［１９８７年］）である。非変異残基のモチーフを比較した。 図３．ＡＰＰＩおよびその他のクニッツドメインの模型。番号はＡＰＰＩその 他のクニッツドメインにある残基を示し、残基１５はＰ₁残基に相当する。影付 きの部分はＡＰＰＩおよびその他のクニッツドメインの一次（残基１１〜１９） および二次（残基３４〜３９）結合ループを示す。 図４．クニッツドメイン変異体の配列および見掛けの平衡解離定数。ＡＰＰＩ におけるものに対応するアミノ酸位置を表示した。 図５．ＴＦ７ＩおよびＡＰＰＩとＴＦ−ＦＶＩＩａに関する見掛けの平衡解離 定数の測定。阻害活性は様々な阻害剤濃度における比活性（阻害された速度／阻 害されていない速度）として表現した。この測定のために、ＦＶＩＩａおよびＴ Ｆ_1〜243濃度は各々１０ｎＭおよび５０ｎＭであった。見掛けの平衡解離定数は 等式１を使用してデータの非線形回帰分析によって決定し、Ｋ_i*値としてＴＦ７ Ｉ−Ｃ（●）には２．１ｎＭ、ＡＰＰＩ（○）には３００ｎＭを得た。曲線は算 出したＫ_i*に対するデータの等式１への最適適合を表す。データはＴＦ７Ｉ−Ｃ では９回、ＡＰＰＩでは７回の独立した測定を代表する。１：１化学量論的阻害 に対する比活性を破線で表示した。 図６．ＰＴ検定による正常ヒト血漿中での凝血時間延長。ＴＦ７Ｉ−Ｃ（●） およびＡＰＰＩ（○）の濃度をＴＦ膜での始動による凝血時間延長倍数に対して プロットする。非阻害凝血時間は３１秒であった。 図７ ＡＰＴＴ検定による正常ヒト血漿中での凝血時間の延長。ＴＦ７Ｉ−Ｃ （●）およびＡＰＰＩ（○）の濃度をエラジン酸での始動による凝血時間延長倍 数に対してプロットする。非阻害凝血時間は３１秒であった。 発明の詳細な説明 Ａ．定義 請求項および明細書に使用する用語は特段の指摘がない限り次に記載する通り に定義する。 本文で使用する用語「アミノ酸またはアミノ酸残基」は特段の指摘がない限り 天然起源のＬ−α−アミノ酸または残基である。アミノ酸について通常に使用す る１字および３字の略号をここでは使用する（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｌ．、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２版、７１〜９２頁、Ｗｏｒｔｈ出版社、Ｎ．Ｙ． ［１９７５年］）。 変異体または変種を示す時に、野生型アミノ酸残基に続けて残基番号および新 または置換アミノ酸残基を記載する。例えば、１１位の野生型ＴをＰで置換する 時にはＴ１１Ｐと称する。 Ｐ₁残基はＳｃｈｅｃｈｔｅｒおよびＢｅｒｇｅｒが定義したように、基質ま たは阻害剤の切断可能なペプチド結合の前の位置を示す（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ， Ｉ．およびＢｅｒｇｅｒ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ ｏｍｍｕｎ．、２７巻：１５７〜１６２頁［１９６７年］）。 「発現ベクター」は適当な宿主中でＤＮＡがコードする蛋白質の発現を起こす ことができる適当な制御配列に作動可能に結合するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築 物を示す。かかる制御配列は一般に転写を起こすプロモーター、要すれば転写を 制御するオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配 列、および転写および翻訳の終止を制御する配列を含有する。このベクターはプ ラスミド、ファージ粒子または「ファージミド」または単に潜在的可能性のある ゲノム挿入物でありうる。 適当な宿主中に形質転換されると、このベクターは宿主のゲノムとは独立に複 製されて機能するか、または、ある場合には、ゲノム自体の中に組み込まれる。 現在プラスミドは最も通常にはベクターの形で使用されるので、この明細書では 「プラスミド」、「ベクター」および「ファージミド」は場合により互換的に使 用する。しかしながら、本発明は均等な機能を果たすことが当該技術分野で公知 であるか公知となる別型の発現ベクターも包含することを意図している。 ＤＮＡまたはポリペプチド配列２個の間の関連で記載する時、「作動可能に連 結」は、単にそれらが互いに機能的に関連していることを意味する。例えば、も しもシグナル配列として機能し、多分シグナル配列の切断を含む成熟型蛋白質の 分泌に参画しているなら、ある前駆配列はペプチドに作動可能に連結している。 もしもその配列の転写を制御するなら、プロモーターはコード配列に作動可能に 連結している。もしも転写させるように位置しているなら、リボソーム結合部位 は作動可能にコード配列に作動可能に連結している。 本文中で使用する略号は次の通りである。ＴＦ：組織因子。ＦＶＩＩａ：ＶＩ Ｉａ因子。ＴＦＰＩ：組織因子経路阻害剤。ＡＴＩＩＩ：アンチトロンビンＩＩ Ｉ。ＦＸａ：Ｘａ因子。ＦＸＩａ：ＸＩａ因子。ＦＸＩＩａ：ＸＩＩａ因子。Ａ ＰＰＩ：アルツハイマー病アミロイドβ−蛋白質前駆体阻害剤。Ｔ_1〜243：残基 １〜２４３を含有する大腸菌誘導組換えヒト組織因子。ＢＰＴＩ：塩基性膵トリ プシン阻害剤。Ｋ_i*：見掛けの平衡解離定数。ＣＨＡＰＳ：３−［（３−コラミ ドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸塩。ＰＢＳ：燐酸 緩衝生理食塩水。ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン。ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグ ラフィー。ＰＴ：プロトロンビン時間。ＡＰＴＴ：活性化部分トロンボプラスチ ン時間。Ｂ．発見および好適な態様 本発明者はクニッツドメインセリンプロテアーゼ阻害剤の一次および二次結合 ループ内および周囲にある鍵となるあるアミノ酸位置における置換が組織因子− ＦＶＩＩａ複合体に対する阻害剤の力価を劇的に改善できることを発見した。そ れ故、本発明はこれら変異クニッツドメインセリンプロテアーゼ阻害剤１個また はそれ以上を含有するポリペプチドを提供する。本発明に従って、ＡＰＰＩおよ びその他のクニッツドメイン蛋白質の特定のアミノ酸残基を変化させて新規セリ ンプロテアーゼ阻害剤を提供ある。このクニッツドメイン変異体は多数の蛋白質 のいずれかの一部を含有して、凝固カスケードの組織因子−ＦＶＩＩａならびに その他のセリンプロテアーゼを阻害できる蛋白質を提供できる。例えば、本発明 のクニッツドメイン変異体はクニッツドメインを持つことが公知の他の蛋白質の クニッツドメインを置換し組織因子−ＦＶＩＩａならびに凝固カスケードにおけ るその他のセリンプロテアーゼを阻害できる新規ポリペプチドを提供できる。 本発明に従って、残基１１〜１９、３４および３８〜３９が実施例１に記載の ようにしてクンケル変異によって変換された。変異体を次にＴＦ−ＦＶＩＩａと 他の数種のセリンプロテアーゼとを阻害する性能について検定した。最善のＴＦ −ＦＶＩＩａクニッツドメイン阻害剤は１５位におけるＡｒｇおよびＬｙｓに強 い優先性を示した。しかしながら、１５位にＭｅｔを持つ蛋白質も阻害剤であっ た。予期の通り、１２位のＧｌｙおよび１６位のＡｌａは最良の阻害剤を与えた （図４参照）。Ｇｌｙは殆ど常にクニッツドメインの残基１２に見出される（Ｃ ｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．とＩ．Ｇ．Ｃｈａｒｌｅｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎ ｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５２巻：５１１〜５１ ９頁［１９８７年］）。クニッツドメインの１６位で通常ＧｌｙまたはＡｌａで ある（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．とＩ．Ｇ．Ｃｈａｒｌｅｓ、Ｃｏｌｄ・Ｓ ｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５２巻：５１ １〜５１９頁［１９８７年］）。これに加え、１４位および３８位にＣｙｓを維 持することで一般により良好な阻害剤に到るが、この要件は絶対的ではない。 結合ループ内の他の位置における最好適な残基は１１位におけるＰｒｏ、１７ 位におけるＬｅｕおよびＭｅｔ、１８位におけるＭｅｔおよびＩｌｅおよび１９ 位におけるＬｅｕおよびＬｙｓであった。しかしながら、ＴＦ−ＦＶＩＩａの阻 害は１１位にＡｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＴｈｒ、１７位にＩｌｅ、 Ａｒｇ、ＴｙｒまたはＳｅｒ、１８位にＬｅｕ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅ、 および１９位にＡｒｇ、ＡｌａまたはＩｌｅがクニッツドメインに導入された時 にも観察された。３４位ではＶａｌ、ＩｌｅおよびＴｙｒを含む多数の残基が最 も好適である。ここでは他の残基はＬｅｕ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＳｅｒを包含 していた。互いに近接する１３位および３９位にする残基も（Ｈｙｎｅｓ，Ｔ． Ｒ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：１００８１〜１００２２頁［１ ９９０年］）（図３参照）ＴＦ−ＦＶＩＩａ阻害活性に影響した。３９位におけ る最適切な残基にはＧｌｙおよびＴｙｒが包含されていた。Ｔｒｐ、Ｐｈｅおよ びＨｉｓも好適であった。Ｇｌｙが３９位に存在する時は、１３位の残基はＴＦ −ＦＶＩＩａ阻害に対して明瞭な効果を持っていた。１３位における親水性の嵩 高なアミノ酸はこの位置ではＰｒｏよりも４倍強力であった。Ｔｙｒが３９位に 存在する時には、最も強力な阻害剤（Ｋ_i*＝２〜３ｎＭ）が発見され、１３位の 残基は結合親和性には殆ど差を示さなかった。それ故、ＴＦ−ＦＶＩＩａの強力 な阻害に関しては１３位および３９位のどちらかまたは双方における親水性残基 が好適である。これら望ましい相互作用の除去は強度の低下した阻害剤に到る。 図４に掲載した阻害剤数種はＦＸａ不在下にＴＦ−ＦＶＩＩａを強力に阻害す ることのできるクニッツドメイン阻害剤を代表する。例えば、ＴＦ７Ｉ−Ｃ変種 は野生型ＡＰＰＩと比較して主要アミノ酸４個が相違し（Ｔ１１Ｐ、Ｍ１７Ｌ、 Ｓ１９ＬおよびＧ３９Ｙ）、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体に対する親和性は１５０倍 よりも大きい増加に到った。ＢＰＴＩは最近ＴＦ−ＦＶＩＩａ活性を競合的に阻 害することが証明されたが、その親和性は比較的に弱い（Ｋ_i＝３０ｎＭ）（Ｃ ｈａｂｂａｔ，Ｊ．など、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．、７１巻：２０５〜２１５頁 ［１９９３年］）。これに加えて、ＴＦＰＩの一次クニッツドメイン自体はＫ_i* 約６００ｎＭを持ち、ＴＦ−ＦＶＩＩａを阻害しない。 ＴＦ−ＦＶＩＩａに関してＡＰＰＩと比べてＴＦ７Ｉ−Ｃの強い親和性はプロ トロンビン時間検定における凝血時間延長性能に反映している（図６）。４０μ ＭではＡＰＰＩは殆ど影響がない（１．５倍延長）が、ＴＦ７Ｉ−ＣはＴＦ膜で 始動する凝血時間を３．５倍に延長した。ＢＰＴＩは最近ＴＦ誘発凝固を阻害す ることが証明された。しかしながらＰＴ検定法で凝血時間を１．４倍に延長する には約７５μＭが必要であった（ｖａｎ・ｄｅ・Ｂｅｓｓｅｌａａｒ，Ａ．Ｍ． Ｈ．Ｐ．など、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．、６９巻：２９８〜２９９ 頁［１９９３年］）。 興味深いことに、ＴＦ−ＦＶＩＩａに対する結合親和性増加に到った阻害剤の 多くはＦＸＩａおよびカリクレインの強力な阻害剤を与えた。これはＦＶＩＩａ とＦＸＩａとの活性部位がある程度似ていることを暗示しているが、このことは ＦＩＸが両プロテアーゼの基質であることから、それ程驚くべきことではなかろ う。ＡＰＰＩはＦＸＩａの強力な阻害剤である（Ｗａｇｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．など、 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１８６巻：１１３ ８〜１１４５頁［１９９２年］）。カリクレインの阻害は予期できなかったが、 カリクレインの活性部位も類似しているかも知れないことを示唆する。これとは 対照的に、例えばＴＦ７Ｉ−Ｃはトロンビン、ＸＩＩａ因子または活性化Ｃ蛋白 質（Ｋ_i*＞１０μＭ）を阻害せず、ＦＸａ（Ｋ_i*＝９０ｎＭ）およびプラスミン （Ｋ_i*＝４０±６ｎＭ）の阻害はごく弱かった。ＴＦ７Ｉ−Ｃは内因性凝固経路 を測定するＡＰＴＴ検定では凝血時間延長ではＡＰＰＩよりもはるかに有効であ る（図７）。これはＦＸＩａおよびカリクレインがＡＰＰＩよりＴＦ７Ｉ−Ｃに 強く阻害されることと一致する。血漿検定における凝血時間延長には試験管内で の強力な阻害に必要な条件と比較してさらに高い阻害剤濃度（＞１００Ｋ_i*）が 必要である。可能性ある説明には試験管内凝血検定において提供される結合条件 が最適でないこと、プロテアーゼ阻害の溶液対膜結合、阻害の機構、および他種 セリンプロテアーゼとの交差反応性が含まれる。 一方、図４の阻害剤数種はＦＸＩａおよびカリクレインに対するＫ_i*＞１００ ｎＭを持ちつつＴＦ−ＦＶＩＩａを特異的に阻害するに到った。これら阻害剤で は一般に１９位にＬｙｓおよび１８位にＭｅｔが存在する。１９位では、Ｌｙｓ またはＡｒｇがＴＦ−ＦＶＩＩａの特異的阻害のためには好適である。ＦＸＩａ およびカリクレインを阻害する性能は低下しているが、なおＴＦ−ＦＶＩＩａの 強力な阻害剤である（図４参照）。 本発明に従い、ＡＰＰＩの残基２０および４６ならびに残基４４は、一次結合 ループにおける推測上の接触残基（残基１１〜１９）および二次結合ループにお ける推測上の接触残基（残基３４、３８および３９）（図２参照）に加えて、主 要な鍵となる残基であると確認された。クニッツドメインに関するセリンプロテ アーゼのＸ線結晶構造から誘導された情報に加えて、トリプシンとＦＶＩＩａの セリンプロテアーゼドメインとのアミノ酸配列を並列してＦＶＩＩａとＡＰＰＩ との間の潜在的可能性ある相互作用を比較研究できる。ＦＶＩＩａにおける可変 領域２（残基５９〜６２、キモトリプシノーゲン番号系、例えばＧｅｅｒ，Ｊ． （１９９０年）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、７巻：３１７〜３３４頁参照）はトリプシ ン中における３個のみと比較して８個を含有する。どの理論に限定される訳では ないが、これは、この表面ループが結合したクニッツドメインに接触させるもの でありうる。ＦＶＩＩａにおいて、このループの５９ｂ残基はＬｙｓであり、こ れがどの理論に限定されるものでもないが、ＡＰＰＩにおけるＡｒｇ２０残基と 立体的にオーバーラップするかもしれない。これは望ましくない相互作用である （立体的と静電気的との両方で）。ＡＰＰＩ結晶構造では表面残基Ａｒｇ２０は おそらくＡＰＰＩにおける他の側鎖の詰込みのため殊に明確に決っており、どの 理論に限定されるものではないが、ＦＶＩＩａにおけるＬｙｓ５９ｂとの衝突を 避ける回転が不可能であることを示唆する。対照的に、依拠する理論はないので あるが、ＦＶＩＩａの残基５９ｂはおそらく自由に回転でき、ＡＰＰＩのＡｓｐ ４６またはＡＰＰＩの１８位の適当な残基と望ましい接触をするかもしれない。 これに加えて、ＡＰＰＩの１８位はＦＶＩＩａ（Ｌｙｓ５９ｂ）およびＡＰＰＩ （Ａｒｇ２０）に近く、これらの結合相互作用において一定の役割を演じうる。 これらの観察を基に、ＡＰＰＩのクニッツドメインの残基２０および４４、お よび４６ならびに本文中に記載するポリペプチドを改変した。本発明のこの側面 に従って、Ａｒｇ２０はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａ ｓｐ、Ｇｌｕ、ＬｅｕまたはＩｌｅに改変しうる。残基４６ではいかなる水素結 合受容体もＡｓｐに置換しうる。態様の一つではＡｓｐまたはＧｌｕが４６位に 存在する。４４位ならびに２０位および４６位における残基、ならびに一次およ び二次結合ループの残基はすべてクニッツドメイン蛋白質と組織因子−ＶＩＩａ 因子複合体との間の望ましい相互作用の促進を志向する。そのような望ましい相 互作用は本文中に記載する組織因子−ＶＩＩａ因子に関する見掛けのＫ_i*を測定 する検定法に従って評価できる。Ｃ．有用性 前記のように、ヒトの病気の多くが特性としては過凝固症状に関連し、血管内 血栓および塞栓を導く（「循環器疾患における血栓症（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ・ ｉｎ・Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ・Ｄｉｓｅａｓｅｓ）」（Ｆｕｓｔｅｒ， Ｖ．とＶｅｒｓｔｒａｅｔｅ，Ｍ．編）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ社、フィラ デルフィア［１９９２年］）。これらは静脈炎、梗塞、および発作を招く医学的 病的状態および肺臓および心臓塞栓からの死亡の主要な原因である。このような 患者の大多数は先行危険因子を持たず、判明した原因なしに血管血栓静脈炎およ び後続する肺塞栓を発症する。静脈血栓を形成する他の患者はこれらの症候群に 素因のあることが知られている基礎疾患を持つ。 これら患者のある者では、たとえばアンチトロンビンＩＩＩのように正常なら 過凝固性を阻止する因子に遺伝的または後天的不全がある。他の者は血管流に、 たとえば腫瘍塊のような機械的閉塞があり、流量低下状態および血栓症に到る。 悪性腫瘍の患者では理由不明確の血栓現象が高率で起きる。この状態での、現在 入手可能な薬剤による抗血栓療法は危険であり、また、しばしば無効である。 アテローム状動脈硬化症の患者には様々な理由から動脈血栓塞栓現象の素因が ある。アテローム状動脈硬化斑は血小板栓および血栓の病巣を形成し、血管狭窄 および閉塞を招き、心筋および脳虚血疾患を起こす。分離して循環に放出された 血栓は、特に脳、四肢、心臓および腎臓など種々の器官に梗塞を起こす。心筋梗 塞の後、弱く、機能の劣った心室内に血餅が生じて循環に放出されて塞栓を起こ す。心房細動の患者は全て発作の危険が大で、抗血栓療法を必要とするものと感 じられる。 これに加え、急性心筋梗塞の血栓溶解療法は多くの患者について確立された処 置になってきた（Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．とＳｔｕｍｐ，Ｄ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍ ｅｄ．、３９巻：４０５〜４２３頁［１９８８年］）。しかしながら、現在入手 可能な血栓溶解剤は患者全部に有効なのではなく、再閉塞、再潅流への抵抗、正 常な冠状動脈流達成に到る長時間などの徴候が現れる。 たとえば人工器官の合成心臓弁または股関節置換または体外潅流装置のような 人工的表面を血液が流れる患者には血小板栓、血栓および塞栓の発症の危険があ る。人工心臓弁を持つ患者に慢性的に抗凝固療法を行うのは標準的処置である。 このように、癌、アテローム状動脈硬化症、冠状動脈疾患（ＰＴＣＡ、ＣＡＢ Ｇ、ポストＭＩなど）、不安定狭心症、人工心臓弁、および一過性虚血発作、心 房細動、深部静脈血栓症、静脈炎または肺臓塞栓の発作病歴を持つ患者の大多数 は限定的または慢性抗血栓療法の対象である。しかしながら、この療法はしばし ば無効であるか、それ自身として病的状態である。この原因は部分的には入手可 能な治療薬の数が少ないことである。アスピリンのような抗血小板剤は血小板の シクロオキシゲナーゼー誘発活性化のみを阻害し、しばしば治療用には不適当で ある。入手可能な抗凝固剤にはヘパリンおよびワルファリンを含むが、これらは 必ずしも有効ではなく、しばしば出血の危険増加の副作用およびこれらの療法監 視に関連する問題を伴う。 フィブリノーゲンからのフィブリン形成を有効に阻害する薬剤は、それ故、過 凝固状態が特徴である疾患の大部分の患者への治療的処置には殊に有用である。 しかしながら、一般的に血栓塞栓および炎症疾患の管理において、本発明の化 合物は医薬的に許容される注射投与用添加剤とともに組成物として、または経口 投与用の、たとえば錠剤、カプセル剤またはエリキシール剤のような混合物中で 利用される。本発明の化合物を用いる処置が必要な動物には最適な効果を提供す るであろう用量を投与できる。用量および投与方法は動物ごとに異なり、体重、 食餌、同時的医療およびその他医学関係者なら認識すべき因子に依存する。 血液凝固の制御への手法には現在使用されている非特異的阻害剤ワルファリン およびヘパリンから、たとえばトロンビンまたはＦＸａ阻害剤のような選択性の ある阻害剤に到る多数が存在する。外因性または内因性経路による凝固を始動ま たは関与できるので、ＦＶＩＩａ、ＦＸＩａおよび血漿カリクレインは血液凝固 の制御用の他の標的を代表する。これらチモーゲンは血漿中にプロトロンビンよ りも低濃度で存在し、それらの止血に対する効果はかなり増幅される。このよう に非阻害酵素はこのカスケードのさらなる活性化に寄与するので、これら酵素の 阻害剤は非常に強力でなけらばならない。現用の抗凝固剤療法（ヘパリン、ワル ファリン）は非特異的阻害剤である。特異的阻害剤は、たとえば出血のような副 作用に関して有利でありうる。一方、数種のプロテアーゼの共同的阻害はある種 の徴候に対して望ましいと思われる。凝固の制御と病気との関係は非常に錯綜し た過程である。 カスケードを始動する（図１参照）と思われるので（Ｂｒｏｚｅ・Ｊｒ．，Ｇ ．Ｊ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：７５３９〜７５４６頁［１９ ９０年］；Ｂｒｏｚｅ・Ｊｒ．，Ｇ．Ｊ．、Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、２ ９ 巻：１５９〜１６９頁［１９９２年］）、ＴＦ−ＦＶＩＩａは凝固過程での臨床 的処理への適切な標的である。こうしてＦＶＩＩａ、ＦＸＩａおよび／または血 漿カリクレインの本文記載の薬剤による阻害は種々の血栓疾患における臨床的処 置の一つの手法を代表する。こうして本文記載の薬剤は血栓症の処置において有 用である。さらに特定的には、本阻害剤は血栓症、不安定狭心症、深部血管血栓 症、股関節置換、冠状動脈バイパス移植、経皮管腔経由冠状動脈血管形成術、肺 塞栓、敗血症ショックおよびＤＩＣのためのアジュバント療法として特に有用で ある。 本文記載の薬剤はまた接触経路または好中球の活性化における処理を指示すべ き疾患（たとえば、炎症、凝固、フィブリン分解および補体活性化）の処置にも 有用である。より特定的には本阻害剤はＦＸＩａ、カリクレイン、ＦＸＩＩａ、 ＦＸａおよびＨＬＥ、補体の阻害を指示すべき疾患（図１参照）、たとえば敗血 症または敗血症ショック、炎症、ＡＲＤＳ、ＤＩＣ、低血圧、心肺バイパス手術 の処置および外科手術後の出血の処置には特に有用である。 本文記載の薬剤は急性的または慢性的治療を要する臨床的状況において有用で ありうる。急性的治療を指示すべきものは慢性的治療を指示すべきものより好適 であると予想される。外来蛋白質またはヒト変異体蛋白質の医薬的使用は免疫原 的でありうる。しかしながら、外来蛋白質は急性の徴候を処置するためには使用 される。このような蛋白質の一例はストレプトコッカス由来の蛋白質で、フィブ リン分解剤として作用し、急性心筋梗塞の処置に使用されるストレプトキナーゼ である。本文記載の薬剤は免疫反応を誘導するかもしれない。しかしながら、た とえばＢＰＴＩのような関連する外来蛋白質はヒトで臨床的に使用されており、 重症な免疫反応を誘導するとは予想されていない。本文記載の薬剤へのポリエチ レングリコール（ＰＥＧ）の共有結合的付加は免疫原性および毒性を低下させ、 他種蛋白質について観察されているように（Ｋａｔｒｅ，Ｎ．Ｖ．、Ｊ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ．、１４４巻：２０９〜２１３頁［１９９０年］；Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ ，Ｍ．Ｊ．など、ＦＥＢ、２３９巻：１８〜２２頁［１９８８年］；Ａｂｕｃｈ ｏｗｓｋｉ，Ａ．など、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２巻：３５８２〜３５ ８ ６頁［１９７７年］）、半減期を延長することもありうる。Ｄ．製造方法 化学合成 式Ｉで示されるクニッツドメインポリペプチドの製造法の一つはこの蛋白質の 化学合成および、それに続く野生型高次構造、即ち、正しいジスルフィド結合を 得るのに適切な酸化条件下の処理を含む。これは当業者に公知の方法論を使用し て達成される（Ｋｅｌｌｙ，Ｒ．Ｆ．とＷｉｎｋｌｅｒ，Ｍ．Ｅ．、「遺伝子工 学・原理および方法（Ｇｅｎｅｔｉｃ・Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ・Ｐｒｉｎｃｉ ｐｌｅｓ・ａｎｄ・Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、（Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．編）中、Ｐ ｌｅｎｕｍ・Ｐｒｅｓｓ社、Ｎ．Ｙ．、１２巻：１〜１９頁［１９９０年］；Ｓ ｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．とＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌ ｉｄ・Ｐｈａｓｅ・Ｐｅｐｔｉｄｅ・Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｐｉｅｒｃｅ・ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ロックフォード、ＩＬ［１９８４年］参照）。 本発明のポリペプチド、特にアミノ酸残基５８個またはそれ以下を含有するも のは、固相ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ ．、８５巻：２１４９頁［１９６４年］；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８２巻：５１３２頁［１９８５年］）を使用 して製造しうる。固相合成は前記ＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇの２頁および４頁 に記載の図１−１および図１−２に示すように推測上のペプチドのカルボキシ末 端において保護アミノ酸を適当な樹脂に結合することによって開始する。 本発明のポリペプチド合成においてα−アミノ基を適切に保護したカルボキシ 末端アミノ酸をクロロメチル化ポリスチレン樹脂に結合する（前記Ｓｔｅｗａｒ ｔとＹｏｕｎｇの１０頁に記載の図１−４参照）。α−アミノ保護基を、例えば 塩化メチレン中でトリクロロ酢酸（ＴＦＡ）で除去し、例えばＴＥＡで中和すれ ば、合成の次サイクルを進める準備が完了する。 残ったα−アミノ−および、要すれば側鎖保護アミノ酸を次に順次所望の順序 で縮合して樹脂に結合する中間体化合物を得る。あるいは、ある種のアミノ酸を 互いに結合してペプチドを形成してからそのペプチドを成長させている固相ポリ ペプチド鎖に付加する。 アミノ酸２個の間またはアミノ酸とペプチドとの間またはペプチドとペプチド との間の縮合は、たとえばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（ジシクロヘキシ ルカルボジイミド）法、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル法、ＢＯ Ｐ［ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニ ウムヘキサフルオロホスフェート］法、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル 法、その他）およびウッドワード試薬Ｋ法のような通常の縮合方法に従って実施 できる。固相法でペプチド鎖を伸長する場合には、ペプチドを不溶性担体にＣ− 末端アミノ酸で付着させる。不溶性担体にはＣ−末端アミノ酸のカルボキシ基と 反応して結合を生じ、後で容易に切断される、例えばクロロメチル樹脂およびブ ロモメチル樹脂のようなハロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、アミノメチル 樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂およびｔ−アルキルオキシカルボニル−ヒドラ ジド樹脂を使用できる。 ペプチドの化学合成に共通であるが種々のアミノ酸基の活性側鎖基を適当な保 護基で鎖が完全に結合し終わった後に除去するまでそれを保護する。また、その 化合物のカルボキシ基での反応と後続するα−アミノ保護基の選択的除去でその 場所で後続反応を起こさせる間のアミノ酸または断片上のα−アミノ基の保護も 共通である。それ故合成の一段階として、ペプチド鎖中の所望の配列に位置し、 側鎖保護基を持つ種々の残基を持つ各アミノ酸残基を含む中間体化合物を製造す ることも共通である。次に所望の目的生成物を得、続いて精製するように実質的 に同時にこれらの保護基を常法で除去する。 α−およびε−アミノ側鎖基の保護のために適用可能な保護基としてはベンジ ルオキシカルボニル（略号Ｚ）、イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ） 、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＮＯ₂］、ｐ−メトキシベンジル オキシカルボニル［Ｚ（ＯＭｅ）］、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ− ア ミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル、アダマンチ ルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル （Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスル ホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホル ミル、２−ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオ イル（Ｐｐｔ）、ジメチロホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）、その他によって例示 される。 カルボキシ基の保護基としては、例えばベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シク ロヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４−ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、ｔ− ブチルエステル（Ｏｂｕｔ）、４−ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）、その 他を例示できる。アミノ基およびカルボキシル基の他に官能基を持つアルギニン 、システインおよびセリンのような特定のアミノ酸は要すれば適当な保護基で保 護するのが望ましい。例えば、アルギニン中のグアニジノ基はニトロ、ｐ−トル エンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、 ｐ−メトキシベンゼンスルホニル、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンス ルホニル（Ｍｄｓ）、１，３，５−トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）、 その他で保護しうる。システインにおけるチオール基はｐ−メトキシベンジル、 トリフェニルメチル、アセチルアミノメチル エチルカルバモイル、４−メチル ベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル（Ｔｍｂ）、その他で保護しうる。 およびセリンのヒドロキシ基はベンジル、ｔ−ブチル、アセチル、テトラヒドロ ピラニル、その他で保護できる。 前記ＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇはペプチド製造のための操作に関する詳細な 情報を提供する。α−アミノ基の保護は１４〜１８頁に記載し、側鎖の閉鎖は１ ８〜２８頁に記載している。アミン、ヒドロキシルおよびスルフヒドリル官能基 のための保護基の表は１４９〜１５１頁に記載がある。 所望のアミノ酸配列が完成した後、中間体ペプチドを樹脂担体から、たとえば 液体ＨＦのような試薬および含硫スカベンジャー１種またはそれ以上で処理し、 ペプチドを樹脂から切断するのみならず、残余の側鎖保護基も切断する。ＨＦで の切断後、蛋白質配列をエーテルで洗浄し、多量の希酢酸に移し、撹拌し、水酸 化アンモニウムでｐＨを約８．０に調整する。 好ましくはポリペプチド中の残基のアルキル化を回避するために（例えば、メ チオニン、システインおよびチロジン残基のアルキル化）、チオークレゾールお よびクレゾール捕捉剤混合物を使用する。樹脂をエーテルで洗浄し、直ちに大量 の希酢酸に移し、溶解して分子間交差連結を減少させる。２５０μＭ−ポリペプ チド濃度を０．１Ｍ−酢酸溶液２Ｌ中に希釈する。次に溶液を撹拌し、そのｐＨ を水酸化アンモニウムを使用して約８．０に調整する。ｐＨ調整に際し、ポリペ プチドは所期の高次構造を取る。 クニッツドメインは前記化学合成または半合成により製造できる。化学合成ま たは半合成法は非天然アミノ酸残基を導入する可能性を与える。これは報告され ているように（Ｂｅｃｋｍａｎｎ，Ｊ．など、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、 １７６巻：６７５〜６８２頁［１９８８年］；Ｂｉｇｌｅｒ，Ｔ．Ｌ．など、Ｐ ｒｏｔ．Ｓｃｉ．、２巻：７８６〜７９９頁［１９９３年］）、クニッツドメイ ンおよび関連する蛋白質について実施できる。 遺伝子合成、クローニングおよび発現 一般的操作 式Ｉに記載したアミノ酸配列から、精製蛋白質を標準的組換えＤ ＮＡ技術を使用して製造しうる。これらの技術は単純化された形で言えば、式Ｉ で示されるクニッツドメインポリペプチドをコードする遺伝子を取り、それを適 切なベクターに挿入し、そのベクターを適当な宿主細胞に挿入し、その宿主細胞 を培養して式Ｉで示されるクニッツドメインポリペプチドの発現を起こさせ、そ こで製造された蛋白質を精製するものを企図する。 幾分特定的には、式Ｉで示されるクニッツドメインポリペプチドをコードする ＤＮＡ配列をクローニングし、便利な宿主中で発現しうるように操作する。式Ｉ で示されるポリペプチドをコードするＤＮＡはＤＮＡ配列を合成的に構築するこ とによって得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．など、「分子クローニン グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（２版）、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎ ｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．［１９８９年］）。 式ＩペプチドをコードするＤＮＡを次に適当なプラスミドまたはベクターに挿 入して宿主細胞を形質転換するために使用する。一般に、宿主細胞に適合する種 から由来する複製および制御配列を含むプラスミドベクターをその宿主に関して 使用する。ベクターは通常複製部位ならびに形質転換された細胞の中で表現型の 選択を提供できる蛋白質をコードする配列を持っている。 例えば、大腸菌はｐＢＲ３２２を使用して形質転換しうるが、このプラスミド は大腸菌の種に由来する（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．など、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、 ５３巻：１５４頁［１９７０年］）。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリンお よびテトラサイクリン耐性用遺伝子を含有し、選択用の簡単な手段を提供する。 他のベクターはたとえば発現でしばしば重要になる種々のプロモータのような種 々の特性を含む。例えば、プラスミドｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ７２０およびｐ ＰＬ−ラムダはｔａｃ、ｔｒｐ、Ｐ_Lプロモーターを持ち、現在入手可能（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ・Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）な発現ベクターを代表する。 式Ｉで示されるクニッツドメインポリペプチドの直接発現 好適なベクターの 一つはｐＳＡ１ｚｌである。このベクターは実施例１に記載のように作製し、大 腸菌用の複製開始点、アルカリホスファターゼプロモーター、ｓｔＩＩシグナル 配列およびＡＰＰＩ変種遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を含む。他の好適 なベクターはｐＢＯ４７５、ｐＲ１Ｔ５およびｐＲ１Ｔ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ・Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）である。これらのベクターは適当なプロモ ーターと、それに続いてＡ蛋白質のドメインを含み、ベクターに挿入された遺伝 子に融合蛋白質としての発現をさせる。これらのベクターに関するさらに詳細な 議論は後記する。 他の好適なベクターは標準的技術を用いて本文記載のベクター関連特性を結合 して構築できる。このベクター関連特性には、プロモーター、リボソーム結合部 位、ＡＰＰＩ変種遺伝子または遺伝子融合（Ａ蛋白質のＺドメインおよびＡＰＰ Ｉ変種およびそのリンカー）、シグナル配列、抗生物質耐性マーカー、コピー数 および適切な複製開始点を包含する。 大腸菌において、クニッツドメインは無傷の分泌蛋白質（Ｃａｓｔｒｏ，Ｍ． など、ＦＥＢＳ・Ｌｅｔｔ．、２６７巻：２０７〜２１２頁［１９９０年］）、 細胞内発現蛋白質（Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．など、Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｅｎｇ．、 ４巻：５９３〜６００頁［１９９１年］）または融合蛋白質（Ｓｉｎｈａ，Ｓ． など、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２１０１１〜２１０１３頁［１９ ９１年］；Ｌａｕｒｉｔｚｅｎ，Ｃ．など、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒ ｉｆ．、２巻：３７２〜３７８頁［１９９１年］；Ａｕｅｒｓｗａｌｄ，Ｅ．Ａ ．など、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ、３６９巻：２７〜３ ５頁［１９８８年］）として発現されている。 宿主細胞は原核生物または真核生物でありうる。原核生物はＤＮＡ配列をクロ ーニングし、発現して、親ポリペプチド、断片置換ポリペプチド、残基置換ポリ ペプチドおよびポリペプチド変種を生産するには好適である。例えば、大腸菌Ｋ １２の２９４株（ＡＴＣＣ３１４４６）は大腸菌Ｂ株、大腸菌Ｘ１７７６株（Ａ ＴＣＣ３１５３７）、大腸菌ｃ６００株、大腸菌ｃ６００ｈｆｌ株、大腸菌Ｗ３ １１０株（Ｆ−、ガンマ−、原栄養株／ＡＴＣＣ２７３２５）、枯草菌のような バチルス属菌およびその他腸内細菌科の、たとえばサルモネラ・ティフィムリウ ムまたはセラチア・マルセッセンスおよび種々のシュードモナス属の種と同様に 使用しうる。好適な原核生物は大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）であ る。原核生物により発現される時、ポリペプチドは典型的にはＮ−末端メチオニ ンまたはホルミルメチオニンを含有し、グリコシル化されていない。融合蛋白質 の場合には、Ｎ−末端メチオニンまたはホルミルメチオニン残基は融合蛋白質の アミノ末端または融合蛋白質のシグナル配列上に存在する。これら実例は勿論、 例示のためであって、限定のためではない。 原核生物に加え、たとえば酵母培養物または多細胞生物に由来する細胞のよう な真核生物も使用しうる。原理的にはいかなる細胞培養物も使用できる。しかし ながら、脊椎動物細胞が最も注目に価し、培養基での脊椎動物細胞の増殖（組織 培養）は再現性ある操作になってきている（「組織培養（Ｔｉｓｓｕｅ・Ｃｕｌ ｔｕｒｅ）」（ＫｒｕｓｅとＰａｔｔｅｒｓｏｎ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ．Ｐｒ ｅｓｓ社［１９７３年］）。このように有用な宿主細胞系列の例はＶＥＲＯおよ びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系列、Ｗ１３８、 ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞系列である。酵母発現系はクニ ッツドメインの製造に使用されている（Ｗａｇｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．など、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１８６巻：１１３８〜１１ ４５頁［１９９２年］；Ｖｅｄｖｉｃｋ，Ｔ．など、Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ．、７巻：１９７〜２０２頁［１９９１年］）。殊に酵母Ｐｉｃｈ ｉａ・ｐａｓｔｏｒｉｓはサッカロミセス・セレビシエα−接合因子のプレプロ シグナル配列およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのアルコールオキシダーゼＡＯＸ１プ ロモーターおよび終止配列を使用して成功裡に使用されている。異種蛋白質発現 のために通常使用されている他の酵母発現ベクターおよび宿主も意図するもので ある。 遺伝子融合 前記操作の変種として遺伝子融合の使用を企図しており、そこで はＡＰＰＩ変種をコードする遺伝子がベクター中で他種蛋白質またはその断片を コードする遺伝子と結合している。これで宿主細胞により生産されるＡＰＰＩ変 種は他種蛋白質との融合体として与えられる。「他種」蛋白質はしばしばその細 胞が分泌できる蛋白質またはペプチドであり、培養培地から分離、精製でき、細 胞内部に所期の蛋白質が残留する時に起きる宿主細胞破壊の必要性を排除するこ とを可能にする。あるいは融合蛋白質を細胞内に発現できる。これは発現の高度 な融合蛋白質を使用するために有用である。 遺伝子融合の使用は、必須ではないが、大腸菌内での異種蛋白質の発現ならび に後続する遺伝子生成物の精製を促進できる（Ｈａｒｒｉｓ，Ｔ．Ｊ．Ｒ．、「 遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ・Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、（Ｗｉｌｌｉａｍ ｓｏｎ，Ｒ．編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ社、ロンドン、４巻：１２７頁［１９８３ 年］；Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．とＭｏｋｓ，Ｔ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ・Ｅｎｚｙｍｏｌ． 、１８５巻：１２９〜１４３頁［１９９０年］）。Ａ蛋白質、より特定的にはＡ 蛋白質のＺドメイン、のＩｇＧへの結合は融合蛋白質精製に「親和性ハンドル」 を提供するので、Ａ蛋白質融合は度々使用される（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．とＡｂ ｒａｈｍｓｅｎ，Ｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ・Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５巻：１４４ 〜１ ６１頁［１９９０年］）。大腸菌中で直接発現される時には異種蛋白質多数が分 解されるが、融合蛋白質として発現される時には安定であることも証明されてい る（Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ．Ａ．Ｏ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２４０巻：１頁［ １９８６年］）。 融合蛋白質として発現されたＡＰＰＩ変種は正しく折畳まれているかもしれな いし、天然構造を得るには折畳みを要するかもしれない。正しく折畳まれた融合 蛋白質は活性があり、セリンプロテアーゼ阻害剤として有用でありうる。さらに 好適なものは、融合蛋白質から当分野で公知の方法により得られた正しく折畳ま れた天然蛋白質であろう。融合蛋白質は、たとえばメチオニンにおいて切断する 臭化シアノーゲンまたはＡｓｎとＧｌｙとの間で切断するヒドロキシルアミンの ような化学薬剤を使用して切断できる。標準的組換えＤＮＡ方法論を使用して、 これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対をＡＰＰＩ変種遺伝子の５’ −末端の直前に挿入できる。 あるいは、最近の綜説にある融合蛋白質の蛋白分解的切断を採用できる（Ｃａ ｒｔｅｒ，Ｐ．、「蛋白質の精製：分子機構から大量生産プロセスまで（Ｐｒｏ ｔｅｉｎ・Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｍｅｃ ｈａｎｉｓｍ・ｔｏ・Ｌａｒｇｅ・Ｓｃａｌｅ・Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）」（Ｌａ ｄｉｓｃｈ，Ｍ．Ｒ．、Ｗｉｌｌｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．、Ｐａｉｎｔｏｎ，Ｃ．Ｃ． とＢｕｉｌｄｅｒ，Ｓ．Ｅ．編）、米国化学会シンポジウム・シリーズ番号４２ ７、Ｃｈ１３、１８１〜１９３頁［１９９０年］）。 Ｘａ因子、トロンビン、サブチリシンおよびこれらの変異体のようなプロテア ーゼは融合蛋白質を切断するために成功裡に使用されている。典型的には、使用 するプロテアーゼによる切断に利用できるペプチドリンカーを「他種」の蛋白質 （たとえば、Ａ蛋白質のＺドメイン）と、例えばＡＰＰＩ変種のような目的蛋白 質との間に挿入する。組換えＤＮＡ方法論を使用して、リンカーをコードするヌ クレオチド塩基対を、他種の蛋白質をコードする遺伝子または遺伝子断片の間に 挿入する。正しいリンカーを含み、部分的に精製された融合蛋白質の蛋白分解的 切断は、生成した融合蛋白質または還元または変性した融合蛋白質について実施 できる。 この蛋白質は融合蛋白質として発現された時には正しく折畳まれていてもいな くてもよい。また、切断部位を含有する特異的ペプチドリンカーはそのプロテア ーゼが利用できてもできなくてもよい。これら因子はその融合蛋白質を変性し、 再折畳みしなければならないかどうか、もしそうなら、この操作を切断前または 切断後のどちらで採用するのかを決定する。 変性および再折畳みが必要な時には、典型的には蛋白質を、たとえば塩酸グア ニジンのようなカオトロープ剤で処理し、次に、例えば還元型および酸化型ジチ オスレイトールまたはグルタチオンを適当な比率、ｐＨおよび温度で含む酸化還 元緩衝液で、目的蛋白質が再折畳みして天然型構造になるように処理する。 変異ＤＮＡの製造 前記討議の通り種々の技術が入手でき、これを親ＡＰＰＩ 分子と比べて得られる蛋白質のアミノ酸配列中の付加、欠失または変化をコード する変異体ＡＰＰＩのＤＮＡの生産に採用しうる。 例示としては、ＡＰＰＩをコードする発現ベクターを手にすれば、部位特異的 突然変異（Ｋｕｎｋｅｌなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０４巻： １２５〜１３９頁［１９９１年］；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．など、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ ｄｓ．Ｒｅｓ．、１３巻：４３３１頁［１９８６］；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．な ど、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１０巻：６４８７頁［１９８２年］）、 カセット突然変異（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．など、Ｇｅｎｅ、３４巻：３１５頁［ １９８５年］）、制限選択的突然変異（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．など、Ｐｈｉｌｏ ｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ、Ｓｅｒ．Ａ、３１７巻：４１５頁 ［１９８６年］）または他の公知技術をＡＰＰＩのＤＮＡについて実行できる。 親ＤＮＡの代わりにこの変異体ＤＮＡを前記の発現ベクターに挿入して使用でき る。変異体ＤＮＡを持つ発現ベクターを含有する宿主細菌の成育は、本文記載の ように単離できる変異体ＡＰＰＩ（すなわち、ＡＰＰＩの類似体または同族体） の生産を可能にする。 精製および構造決定 ＡＰＰＩ変種の精製と同定はゲル濾過、イオン交換、親 水性相互作用および親和性クロマトグラフィーを含むいずれの標準的技術によっ ても実施しうる。本件の場合は、組換えＡＰＰＩ変種を１０Ｌ発酵槽または振盪 フラスコ中で大腸菌を成長させた培地からトリプシン親和性カラム上のクロマト グラフィーおよびそれに続く逆相Ｃ１８ＨＰＬＣによって精製される。 ＡＰＰＩ遺伝子の部位指向突然変異およびＤＮＡ配列分析によるクローンの確 認に続いて、変種蛋白質を大腸菌中に発現させ、それから精製する。クニッツド メインを濃縮し、親和性カラムを使用して培地から部分的に精製する。最終精製 は逆相Ｃ１８によるＨＰＬＣを使用して実施例２に記載のようにして実行する。 殆どの変種の発現水準は振盪フラスコ中で約１ｍｇ／Ｌ、１０Ｌ発酵槽中で８０ 〜１００ｍｇ／Ｌである。精製に続き、蛋白質配列を質量スペクトル術によって ジスルフィド結合３個全てが形成されているものと仮定して配列から予測される 正当な質量について、およびこの測定の誤差範囲内（±２ａｍｕ）であることを 検証する。Ｍｅｔを含有する阻害剤のＨＰＬＣでは通常、主な阻害剤ピークの少 し前または少し後に小さな溶離ピークが見られる。これはメチオニンがスルホキ シドに酸化された結果である。Ｅ．分析方法 見掛けの平衡解離定数（Ｋ_i*）はクニッツドメインとセリンプロテアーゼとの 相互作用で観察されている（Ｂｏｄｅ，Ｗ．とＲ．Ｈｕｂｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．、２０４巻：４３３〜４５１頁［１９９２年］；Ｌａｓｋｏｗｓ ｋｉ，Ｍ．Ｊｒ．とＩ．Ｋａｔｏ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９ 巻：５９３〜６２６頁［１９８０年］）ように酵素と阻害剤とが１：１の化学量 論的に可逆的複合体を形成すると仮定して、強固に結合する阻害剤用に誘導され た方法（Ｂｉｅｔｈ，Ｊ．、Ｐｒｏｔｅａｓｅ・Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、４６３ 〜４６９頁［１９７４年］；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｗ．とＭｏｒｒｉｓｏｎ， Ｊ．Ｆ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ・Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６３巻：４３７〜４６７頁［１ ９７９年］）を使用して決定した。データは等式１： ［ここに、Ｖ_i／Ｖ₀は比活性（定常状態阻害速度を非阻害速度で割った商）、 ［Ｅ₀］はＦＶＩＩａ活性部位の全濃度、 ［Ｉ₀］は阻害剤の全濃度である］ の非線形回帰分析に適合した。変種はそのＴＦ−ＦＶＩＩａに対する結合親和性 について検定し、約１〜５００ｎＭの範囲にわたるＫ_i*値を持つ物を図４に表示 した。平衡条件下におけるＴＦ７Ｉ−ＣおよびＡＰＰＩによるＴＦ−ＦＶＩＩａ の阻害は図５に表示した。ＴＦ−ＦＶＩＩａについての見掛けのＫ_i*値１．９± ０．４ｎＭおよび３０１±４４ｎＭが各々ＴＦ７Ｉ−ＣおよびＡＰＰＩについて 算出された（図４）。 ヒト血漿中に存在するその他の関連セリンプロテアーゼについて見掛けのＫ_i* 値を測定して、野生型ＡＰＰＩ、ＴＦ７Ｉ−Ｃ、およびその他の変異体阻害剤の 相対的特異性を決定した。順次希釈した阻害剤の適量に活性化Ｃ蛋白質、トロン ビン、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、血漿カリクレインまたはプラスミンのい ずれかを添加した。インキュベーションおよび適切な基質の添加後に、比活性対 阻害剤濃度のプロットを実施例３のようにして作成した。見掛けの平衡解離定数 （Ｋ_i*）を等式（１）から算出し、図４に報告する。前記報告の結果と良く一致 してＡＰＰＩはＦＸＩａの強力な阻害剤であり（Ｗａｇｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．など、 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１８６巻：１１３ ８〜１１４５頁［１９９２年］）、ＴＦ−ＦＶＩＩａ、プラスミンおよび血漿カ リクレインの中庸な阻害剤であった。活性化Ｃ蛋白質、トロンビン、ＦＸａまた はＦＸＩＩａのＫ_i*は＞１０μＭであった。強力に阻害するＴＦ−ＦＶＩＩａに 加え、ＴＦ７Ｉ−ＣもＦＸＩａおよび血漿カリクレインの強力な阻害剤であり、 プラスミンの中庸な阻害剤である（図４）。Ｋ_i*はＦＸａでは９０ｎＭであり、 活性化Ｃ蛋白質、トロンビンまたはＦＸＩＩａには＞１０μＭであった。他の阻 害剤はＦＸＩａ、血漿カリクレインまたはプラスミンとの関連でさらに特異性の あるＴＦ−ＦＶＩＩａの阻害剤であった。 実施例４に記載した、組織因子開始プロトロンビン時間（ＰＴ）検定法によれ ば、ＴＦ７Ｉ−ＣおよびＡＰＰＩは凝血時間を濃度依存的に延長した（図６）。 これはＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体の阻害を通じてこれら阻害剤がＦＸ活性化を阻止 する性能と一致する。この検定でＴＦ７Ｉ−Ｃは凝血時間を約４０μＭにおいて ３．５倍延長したが、一方、同濃度のＡＰＰＩは凝血時間の１．５倍しか増加し なかった。実施例４に記載した活性化部分トロンボプラスチン時間検定法（ＡＰ ＴＴ）による測定によれば、ＴＦ７Ｉ−Ｃは約７μＭにおいて１０倍を越える凝 血時間の延長が観察され（図７）、表面媒介接触活性化経路の濃度依存的阻害も 示した。ＡＰＴＴではＴＦ７Ｉ−Ｃと比較してＡＰＰＩは同じ濃度で約３倍の凝 血時間を持ち、いくらか弱かった。Ｆ．医薬的組成物 治療的応用のために使用する本発明の化合物の用量製剤は無菌でなければなら ない。無菌性は、たとえば０．２μ膜のような無菌濾過膜を通す濾過により容易 に達成される。蛋白質製剤は通常は凍結乾燥型または水溶液として保存される。 蛋白質製品のｐＨは典型的には約３と１１との間、より好ましくは約５から９ま で、最も好ましくは約７から８とする。好適な投与経路は皮下注射針によるもの である。 治療用蛋白質製剤は一般に無菌アクセスポートを持つ容器、例えば皮下注射針 により穿孔できる栓を持つ静脈内溶液バッグまたはバイアル中に入れる。 治療的に有効な用量は試験管内（前記検定法参照）または生体内法のいずれか によって決定しうる。かかる検定技術を基にして、治療的に有効な用量範囲を決 定しうる。治療的に有効な用量範囲が投与経路によって影響を受けるのは当然で ある。皮下注射針による注射ではその用量が体液内に放出されることを仮定しう る。他の投与経路については、薬学においてよく公知な方法によって各ＡＰＰＩ 変種について吸収効率を個々に測定しなければならない。 治療的用量は約０．００１ｎＭから約１．０ｍＭまで、より好ましくは約０． １ｎＭから約１００μＭまで、また最も好ましくは約１．０ｎＭから約５０μＭ までの範囲でありうる。 医薬的組成物としてのＡＰＰＩ変種の典型的製剤は約０．５から５００ｍｇま での化合物または化合物混合物を遊離酸型または塩基型のいずれかとしてまたは 医薬的に許容される塩として含有する。これら化合物または混合物を次に生理学 的に許容しうる基剤、担体、添加剤、結合剤、保存剤または安定化剤、その他と 共に許容された医薬的慣例が要求するように混合する。これらの組成物中の活性 成分の量は先に指摘した適切な用量が得られるようなものである。 注射のための無菌組成物は通常の医薬的慣例に従って製剤化できる。例えば、 水またはゴマ油、ピーナッツ油または綿実油などような天然起源植物油またはオ レイン酸エチルなどのような合成脂肪酸基剤、その他の基剤中に活性化合物の溶 解または懸濁を所望しうる。緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、その他も許容された医 薬的慣例に従って加えることができる。 本文中では必要に応じてある特定の方法および物質に関連させて本発明を討議 した。これら特定の方法および物質の討議は決して本発明の範囲にいかなる限定 をも構成するものではなく、本発明の帰結を達成するに適当な選択肢全ての物質 および方法にも展開することを理解すべきものである。 実施例 材料 ヒトＶＩＩａ因子、Ｘａ因子、ＸＩａ因子、活性化Ｃ蛋白質およびトロンビン はＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（エセックスジャン クション、ＶＴ）から購入した。ヒトの血漿カリクレインおよびＸＩＩａ因子は Ｅｎｚｙｍｅ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（サウスベンド 、ＩＮ）から購入した。組換えヒト組織因子_1〜243（ＴＦ_1〜243）は以前の記載 通りに大腸菌中で製造し、精製した（Ｐａｂｏｒｓｋｙ，Ｌ．Ｒ．など、Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８巻：８０７２〜８０７７頁［１９８９年］；Ｐａｂｏ ｒｓｋｙ，Ｌ．Ｒ．など、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２１９１１〜 ２１９１６頁［１９９１年］）。ウシのトリプシン、４−メチルウンベリフェリ ルｐ−グアニジノ安息香酸およびＣＨＡＰＳはＳｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ 社から購入した。ウシ血漿アルブミン（ＢＳＡ）、第Ｖ分画はＣａｌｂｉｏｃｈ ｅｍ社（ラホヤ、ＣＡ）から入手した。Ｎ^α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ −ニトロアニリドはＢａｃｈｅｍ・Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ社（Ｔｏｒｒａｎｃｅ 、Ｃ Ａ）から購入した。ヒトのプラスミン、Ｓ−２３０２、Ｓ−２２５１およびＳ− ２３６６はＫａｂｉ・Ｖｉｔｒｕｍ社（スウェーデン）から購入し、Ｓｐｅｃｔ ｒｏｚｙｍｅ・ｆＸａはＡｍｅｒｉｃａｎ・Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社（グリニ ッチ、ＣＴ）から購入した。Ａｆｆｉｇｅｌ−１０はＢｉｏ−Ｒａｄ・Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ社（リッチモンド、ＣＡ）から入手した。他の試薬は全て商業 的に入手できる最高級のものを入手した。 実施例１ プラスミド構築および変異誘発 ＡＰＰＩ配列をコードする合成遺伝子を適当な発現ベクターに挿入して、周縁 細胞質および培地にＡＰＰＩを分泌するようにプラスミドｐＳＡｌｚ１を構築し た。このｐＳＡｌｚ１ベクターはＣａｓｔｒｏなど（Ｃａｓｔｒｏ，Ｍ．など、 ＦＥＢＳ・Ｌｅｔｔ．、２６７巻：２０７〜２１２頁［１９９０年］）が記載し た通り、アルカリホスファターゼプロモーター、ｓｔＩＩ分泌シグナル、ＡＰＰ Ｉ遺伝子、ｆ１およびｃｏｌＥ１複写開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を含 有していた。ｐＳＡｌｚ１ベクターを使用するＡＰＰＩ変異体の構築は部位指向 オリゴヌクレオチド変異誘発法を使用して以前の記載通り（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ． Ａ．など、Ｍｅｔｈｏｄｓ・Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０４巻：１２５〜１３９頁［ １９９１年］）に行い、選択したクローンをジデオキシ配列分析法（Ｓａｎｇｅ ｒ，Ｆ．など、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、７４巻：５ ４６３〜５４６７頁［１９７７年］）によって分析した。 実施例２ 阻害剤の発現、精製および特性 ＡＰＰＩかまたは選択した変異体かをコードするファージミドで大腸菌Ｗ３１ １０株に由来する大腸菌２７Ｃ７株を形質転換し、クニッツドメイン阻害剤を発 現させた。一夜で飽和した培養物をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する低燐 酸最小培地（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｎ．など、Ｇｅｎｅ、５５巻：１８９〜１９６頁 ［１９８７年］）２５０ｍＬ中に植種（１％）し、３７℃で２０時間培養した。 阻害剤はｓｔＩＩシグナル配列のため周縁細胞質に分泌され、最終的には培地中 に漏出した。細胞および破砕物を遠心分離（８０００×ｇ、１０分間）して除去 し、上清液を１Ｍ−ＮａＯＨでｐＨ７．５〜８．５に調整し、次に製造社の推薦 に従って調製したトリプシン−Ａｆｆｉｇｅｌ・１０親和性カラム１ｍＬ上に負 荷した。カラムを１００ｍＭ−トリス、ｐＨ８、１００ｍＭ−ＮａＣｌおよび２ ０ｍＭ−ＣａＣｌ₂で洗浄し、阻害剤を１０ｍＭ−ＨＣｌ、０．５Ｍ−ＫＣｌ４ ｍＬで溶離した。阻害剤はＣ１８逆相ＨＰＬＣ（２５０×４．６ｍｍ、ＶＹＤＡ Ｃ社）を使用してさらに精製した。これに０．１％トリフルオロ酢酸を負荷し、 ５％から４０％までのＣＨ₃ＣＮ勾配で、１ｍＬ／分で溶離した。溶離物の特性 はＡ₂₁₄およびＡ₂₈₀の双方で監視した。各阻害剤について単一の良好に分離した ピークが３０から３５％ＣＨ₃ＣＮまでの間で検出された。阻害剤の配列は質量 分析用に明瞭化エレクトロスプレー装置を装着したＳｃｉｅｘ・ＡＰＩ・３質量 スペクトロメータを使用して正しい質量について検証した。ウマのミオグロブリ ン（ＭＷ＝１６９５１Ｄａ）の多重荷電イオンを装置の補正に使用した。 実施例３ 平衡解離定数の決定 酵素阻害検定をマイクロタイター形式で行い、Ｂｉｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ社の ＤｅｌｔａＳｏｆｔＩＩソフトウエアを装着したＭａｃｉｎｔｏｓｈ・ＳＥ・コ ンピュータで制御しつつＳＬＴ・ＥＡＲ３４０ＡＴプレートリーダーで吸光度を 監視した。ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ・ｖ３．０１（Ｓｙｎｅｒｇｙ・Ｓｏｆｔ ｗａｒｅ社）を使用して非線形回帰分析を行った。 貯蔵阻害剤を５〜２０００ｎＭの範囲に希釈し、４−メチルウンベリフェリル ・ｐ−グアニジノ安息香酸を使用して活性部位を滴定しておいた（Ｊａｍｅｓｏ ｎ，Ｇ．Ｗ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１３１巻：１０７〜１１７頁［１９ ７３年］）トリプシンでの滴定により濃度を精密に決定した。８０ｎＭ−トリプ シンに加え適量の希釈した阻害剤を５０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．０、１００ｍＭ −ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ₂および０．０５％トリトンＸ−１００中、室 温で１時間のインキュベーション後、５ｍＭ−Ｎ^α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニ ン−ｐ−ニトロアニリド２０μＬを添加して全容１５０μＬとした。４０５ｎｍ における吸光度を次に監視した。決定した濃度は阻害剤とトリプシンとの１：１ 化学量論を仮定してある。 ＡＰＰＩ、ＴＦ７Ｉ−Ｃおよびその他の変異体の凝固プロテアーゼに対する活 性を試験する検定は次の形式を使用して行った。順次希釈した阻害剤を含むマイ クロタイタープレートの各ウェルからの適量（２５μＬ）を種々のプロテアーゼ （１００μＬ）を適切な緩衝液中に入れた新しいマイクロタイタープレートに移 した。検査したプロテアーゼ（プロテアーゼ濃度、緩衝液、基質）はＦＶＩＩａ （１０ｎＭ）緩衝液Ａ、０．７ｍＭ−Ｓ２３６６）、ＦＸＩａ（１．０ｎＭ、Ｂ ＳＡ１ｍｇ／ｍＬ含有緩衝液Ｂ、０．７ｍＭ−Ｓ２３６６）、血漿カリクレイン （３．５ｎＭ、緩衝液Ｂ、０．５ｍＭ−Ｓ２３０２）およびプラスミン（１５ｎ Ｍ、緩衝液Ｂ、１ｍＭ−Ｓ２２５１）であった。緩衝液Ａは５０ｍＭ−トリス、 ｐＨ７．５、１００ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＣａＣｌ₂、０．５％ＢＳＡ、 ６０ｎＭ−ＴＦ_1〜243および１ｍＭ−ＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ社）を含有する。 緩衝液Ｂは５０ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭ−ＮａＣｌ、２ｍＭ−Ｃ ａＣｌ₂、０．００５％トリトン・Ｘ−１００を含有する。 基質／阻害剤混合物を室温で１〜３時間インキュベーション後に、適切な基質 （２０μＬ）を添加し、４０５ｎｍにおける吸光度を監視した。阻害剤と酵素と を含まない対照も検定して非阻害体と基質加水分解速度との各々を測定した。比 速度対阻害剤濃度のプロットは等式１への非線形回帰分析に適合し、見掛けの平 衡解離定数（Ｋ_i*）を決定した。ＦＸａ、ＦＸＩＩａおよびカリクレインの濃度 は大腸菌から得たこれら酵素の可逆的強固結合阻害剤であって、以前の記載通り 過剰発現して精製したエコチンの標本（米国特許出願ＳＮ０８／１２１００４、 １９９３年９月１４日出願）を使用して活性部位滴定で測定した。ＦＶＩＩａ、 ＦＸＩａおよびカリクレインの濃度は定量してあるＴＦ７Ｉ−Ｃ標本を使用して 活性部位滴定で測定した。ＴＦ７Ｉ−Ｃおよびエコチンは双方とも活性部位滴定 したトリプシンを使用して定量した。ＦＶＩＩａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩ ａおよびカリクレインの濃度は製造社の規格書と良く一致（±１０％）した（デ ータ不記載）。活性化Ｃ蛋白質、トロンビンおよびプラスミンの濃度は提供各社 記載の濃度に基づいたものである。 結果 野生型ＡＰＰＩ、ＴＦ７Ｉ−Ｃならびに変異体阻害剤２９種のＴＦ−ＦＶＩＩ ａ、時にはＦＸＩａ、カリクレインおよびプラスミンに対する見掛けのＫ_i*値を 決定した。ＡＰＰＩ、ＴＦ７Ｉ−Ｃおよび他種変異体阻害剤のアミノ酸配列は図 ４に記載した。変異体阻害剤Ｉ−１８、Ｉ−４９、Ｉ−１４、Ｉ−１６、ＩＩ− ４、ＩＩ−３、ＩＩ−６、ＩＩＩ−２７、ＩＩＩ−３０、ＴＦ７Ｉ−ＶＹ、ＴＦ ７Ｉ−ＬＹ、ＴＦ７Ｉ−ＷＹ、ＴＦ７Ｉ−ＰＧ、ＩＶ−４７Ｃ、ＩＶ−５４Ｃ、 ＩＶ−３１Ｂ、ＩＶ−４９Ｃ、ＩＶ−５０Ｃ、ＩＶ−５７Ｃ、ＩＶ−５１Ｃ、Ｉ Ｖ−３５Ｂ、ＩＶ−５８Ｃ、ＩＶ−４８Ｃ、ＩＶ−４６Ｃ、ＩＶ−５５Ｃ、ＩＶ −３２Ｂ、ＩＶ−３６Ｂ、ＩＶ−４０Ｂおよび５３ｂ、ならびにＴＦ７Ｉ−Ｃの 配列は全て： Ｒ₁−Ｘａａ₁₁−Ｘａａ₁₂−Ｘａａ₁₃−Ｘａａ₁₄−Ｘａａ₁₅−Ｘａａ₁₆−Ｘ ａａ₁₇−Ｘａａ₁₈−Ｘａａ₁₉−Ｒ₂−Ｘａａ₃₄−Ｒ₃−Ｘａａ₃₈−Ｘａａ₃₉−Ｒ₄ で示される野生型ＡＰＰＩの配列に基づく。いずれの場合も Ｒ₁は配列：ＶＲＥＶＣＳＥＱＡＥ（配列番号６）を持つ。 Ｒ₂は配列：ＲＷＹＦＤＶＴＥＧＫＣＡＰＦ（配列番号１４）を持つ。 Ｒ₃は配列：ＹＧＧを持つ。 Ｒ₄は配列：ＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＡＡＶＣＧＳＡ（配列番号２３）または ＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＭＡＶＣＧＳＡ（配列番号２４）を持つ。 それ故、本実施例で検査した変異体阻害剤の配列は次の通り： Ｉ−１８ Ｒ₁ＰＧＶＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号４３） Ｉ−４９ Ｒ₁ＰＧＷＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号４４） Ｉ−１４ Ｒ₁ＰＧＦＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号４５） Ｉ−１６ Ｒ₁ＧＧＷＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号４６） ［ここに、Ｒ₄は配列番号２４で定義される配列である］ ＩＩ−４ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＭＩＳＲ₂ＦＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号４７） ＩＩ−３ Ｒ₁ＰＧＷＣＲＡＭＩＳＲ₂ＩＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号４８） ＩＩ−６ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＭＩＳＲ₂ＩＲ₃ＣＷＲ₄（配列番号４９） ＩＩＩ−２７ Ｒ₁ＴＧＰＣＲＡＬＩＳＲ₂ＷＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号５０） ＩＩＩ−３０ Ｒ₁ＴＧＰＣＲＡＬＩＳＲ₂ＹＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号５１） ＴＦ７Ｉ−ＶＹ Ｒ₁ＰＧＶＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号５２） ＴＦ７Ｉ−ＬＹ Ｒ₁ＰＧＬＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号５３） ＴＦ７Ｉ−ＷＹ Ｒ₁ＰＧＷＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号５４） ＴＦ７Ｉ−ＰＧ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号５５） ＩＶ−４７Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＭＭＫＲ₂ＩＲ₃ＣＨＲ₄（配列番号５６） ＩＶ−５４Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＬＭＫＲ₂ＶＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号５７） ＩＶ−３１Ｂ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＬＭＫＲ₂ＶＲ₃ＣＦＲ₄（配列番号５８） ＩＶ−４９Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＭＭＫＲ₂ＩＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号５９） ＩＶ−５０Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＭＹＫＲ₂ＩＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号６０） ＩＶ−５７Ｃ Ｒ₁ＰＧＶＣＲＡＭＭＫＲ₂ＩＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号６１） ＩＶ−５１Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＬＭＲＲ₂ＹＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号６２） ＩＶ−３５Ｂ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＩＭＫＲ₂ＩＲ₃ＣＨＲ₄（配列番号６３） ＩＶ−５８Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＬＭＫＲ₂ＹＲ₃ＣＨＲ₄（配列番号６４） ＩＶ−４８Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＬＭＫＲ₂ＷＲ₃ＣＷＲ₄（配列番号６５） ＩＶ−４６Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＭＩＫＲ₂ＬＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号６６） ＩＶ−５５Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＬＭＫＲ₂ＦＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号６７） ＩＶ−３２Ｂ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＬＭＫＲ₂ＹＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号６８） ＩＶ−３６Ｂ Ｒ₁ＰＧＰＣＫＡＬＭＫＲ₂ＶＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号６９） ＩＶ−４０Ｂ Ｒ₁ＰＧＡＣＫＡＭＹＫＲ₂ＩＲ₃ＣＧＲ₄（配列番号７０） ５３ｂ Ｒ₁ＰＧＰＧＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＡＹＲ₄（配列番号７１） ＴＦ７Ｉ−Ｃ Ｒ₁ＰＧＰＣＲＡＬＩＬＲ₂ＦＲ₃ＣＹＲ₄（配列番号７２） ［ここに、Ｒ₄は配列番号２３で定義される配列である］ Ｋ_i*値の測定結果を図４に示す。場合によってはＫ_i*はＦＸＩａ、カリクレイ ンおよびプラスミンならびにＴＦ−ＦＶＩＩａについて測定した。図示の通り、 ＩＩ−６、ＩＩＩ−２７、ＩＩＩ−３０およびＩＶ−４０Ｂを例外として、野生 型ＡＰＰＩよりもさらに強力なＴＦ−ＦＶＩＩａ阻害剤を得られた。 実施例４ 凝固検定 正常ヒト血漿の凝血時間をＡＣＬ３００Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｃｏａｇｕｌａｔ ｉｏｎ・Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定した。プロトロンビン時間（ＰＴ）検 定法ではインキュベーション時間を１２０秒に、捕捉時間は予期される検定結果 に応じて１２０から６００秒に設定した。全長ＴＦを発現する細胞２９３（Ｐａ ｂｏｒｓｋｙ，Ｌ．Ｒ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８巻：８０７２〜 ８０７７頁［１９８９年］）からの膜をＣａＣｌ₂と前混合した。２分間３７℃ でインキュベーション後、標本（血漿および阻害剤）および試薬（ＣａＣｌ₂／ ＴＦ）を自動混合した。凝血時間は光学的評価によって決定した。ＣａＣｌ₂／ ＴＦ添加前における阻害剤と血漿との全インキュベーション時間は約５分間であ った。最終濃度は２から２０μＭ−阻害剤、３．７ｎＭ−ＴＦ（蛋白質含量で０ ．９μｇ／ｍＬ）、２２．５ｍＭ−ＣａＣｌ₂および５０％血漿で全容は１６０ μＬであった。 活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）検定については、活性化時間 は１２０秒に、捕捉時間は予期される検定結果に依存して３００から６００秒に 設定した。クエン酸化正常ヒト血漿および阻害剤を合わせてインキュベーション した。標本（血漿および阻害剤）と活性化剤（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のエラジン酸／ホスホリピドミックス試験試薬） とを自動でピペット採取し、合わせて２分間３７℃でインキュベーションし、次 にＣａＣｌ₂を添加して凝血時間を光学的評価によって決定した。活性化剤添加 前における阻害剤と血漿との全インキュベーション時間は約３分間、ＣａＣｌ₂ 添加前においては５分間であった。最終濃度は０．０１から１５μＭ−阻害剤、 １５．３μｇ蛋白質／２９３細胞膜ｍＬ、８．３μＭ−エラジン酸、８．３ｍＭ −ＣａＣｌ₂および３３．３％血漿で全容は１６２μＬであった。 結果 結果を次の表Ｉに示す。 阻害剤不在下での凝血時間はＰＴについて３０秒、ＡＰＴＴについては３１秒で あった。表記した延長倍数は４０μＭ−阻害剤濃度におけるものである。 実施例５ ウサギ深在中央外傷モデル 雄性ニュージーランド白ウサギ（〜４ｋｇ）をケタミン／キシラキシンの筋肉 内注射で麻酔して手術用麻酔プレーンに固定した。ウサギを拘束ボード上で背位 に置き、３７℃に温め、頚部および内大腿部分を剃毛した。テフロンカテーテル を各々薬剤投与および標本採取のために周縁耳静脈および大腿動脈に挿入した。 処置前に血液標本を取り、凝固試験（ＡＰＴＴおよびＰＴ）を行った。出血時間 は後肢爪の表皮部分に作った切口から評価した。頚部を切開し、左総頚動脈とそ の枝部を外科的に分離した。超音波流量計（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃｓ（商品名）） を総頚動脈上、総内分岐の約５ｃｍ尾側に設置した。血流が安定なベースライン に達した後、薬剤（食塩水または被検化合物）を周縁耳動脈から注入した。収縮 した塞栓切除カテーテル（Ｆｏｇａｒｔｙ（商品名）、３Ｆ）を総管腔に舌分枝 の切開口を通して導入した。カテーテル挿入の間暫時動脈を通る血流を止め、さ らに２−０絹紐で切開部位を緩く固定した。カテーテルの位置が決まり、固定し たら、血流を再開した。収縮したバルーンを流量計の２ｍｍ以内まで進めて食塩 水で血管壁の抵抗を感じるまで膨張させた。カテーテルを一様な動きで第一分岐 まで引戻し、次に収縮させた。この操作を各動物について６回反復した後、カテ ーテルを取外した。バルーン操作は最初の挿入からカテーテルの取外しまで３分 から５分を要し、長さ１．５から２ｃｍまでの損傷領域ができた。４０分にわた ってＡＰＴＴおよびＰＴ測定用に血液標本を採取し、表皮出血時間を評価し、頚 部 を通る血流を監視した。開通性の継続時間は観測可能な血流が動脈に検出された 全時間（最大＝４０分）として定義した。開通率は頚動脈血流≧５分間を持った 被検動物の百分率を示す。実験終了後、ウサギを安楽死させ、頚動脈を取り、切 開した。もし血栓が存在したら取出して水分を除き、重量を記録した。 結果 ウサギ血漿の標本をＭＬＡ８００凝固計およびＤａｄｅ試薬を使用して検定し た。ＡＰＴＴ検定ではＡｃｔｉｎ・ＦＳ（商品名）を活性化剤とした。Ｃａ⁺⁺を 含むウサギトロンボプラスチンをＰＴ検定に使用した。ウサギトロンボプラスチ ンを２倍希釈した。検査した全変異阻害剤は凝血を少なくとも１倍延長した。活 性化部分トロンボプラスチン時間検定では表面媒介接触活性化経路について、Ｔ Ｆ７Ｉ−Ｃが最大の阻害を示した。１０倍より大きい凝血時間の延長が４０ｍＭ において観察された。 ［ヘパリンは２５ｕ／ｋｇを一括投与し、続いて（１）０．５ｕ／ｋｇ／分また は（２）１ｕ／ｋｇ／分を連続点滴した。他の試薬は２ｍｇ／ｋｇＩＶ−括投与 した。開通性データ以外の測定値は平均±標準誤差平均値を表示した］ 食塩水対照と比較して、ヘパリンおよび変異ＡＰＰＩ阻害剤ＴＦ７Ｉ−Ｃおよ びＩＶ−４９Ｃは検討した時間内には開通性を明瞭に延長し、血餅サイズを低下 させた。ＴＦ７Ｉ−ＣおよびＩＶ−４９Ｃの両者では開通が５分間に等しいか、 それ以上であった動物の百分率は、野生型ＡＰＰＩの４０％と比較して、８３％ であった。 次の表３は投薬１０分後における表皮出血時間検定法の結果を示す。 表皮出血時間検定法の結果が示すように、たとえばＴＦ７Ｉ−ＣおよびＩＶ− ４９Ｃのような変異体ＡＰＰＩ阻害剤はヘパリンのような現用抗凝固薬剤と比較 して改善された安全性特性を持つようである。これら変異体阻害剤２種は１０分 後では食塩水対照と比較して出血延長を誘発しなかった。 ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊ 本文中に示す文献は全て参考として引用するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/81 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＢ Ｃ１２Ｎ 9/99 9051−4Ｃ 37/465 Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ 37/553 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．構造式（Ｉ）： Ｒ₁−Ｘａａ₁₁−Ｘａａ₁₂−Ｘａａ₁₃−Ｘａａ₁₄−Ｘａａ₁₅−Ｘａａ₁₆−Ｘａａ_{1 7} −Ｘａａ₁₈−Ｘａａ₁₉−Ｒ₂−Ｘａａ₃₄−Ｒ₃−Ｘａａ₃₈−Ｘａａ₃₉−Ｒ₄ （Ｉ） ［ここに、 Ｒ₁はアミノ酸残基５個から２５０個までを持つペプチドであるが、その中で 少なくとも残基１個はＣである。 Ｒ₂はアミノ酸残基１４個を持つペプチドであるが、その中で少なくとも残基 １個はＣである。 Ｒ₃はトリペプチドである。 Ｒ₄はアミノ酸残基１２個から２５０個までを持つペプチドであるが、その中 で少なくとも残基１個はＣである。 Ｘａａ₁₁はＰ、Ｒ、Ａ、Ｅ、ＧおよびＴの群から選択される。 Ｘａａ₁₂はＧである。 Ｘａａ₁₃はＰ、Ｌ、Ｗ、Ｖ、Ｇ、Ｆ、Ｈ、Ｙ、Ａ、Ｉ、ＥおよびＱの群から選 択される。 Ｘａａ₁₄はＣ、Ａ、Ｓ、ＴおよびＧから選択される。 Ｘａａ₁₅はＭ、ＲおよびＫから選択される。 Ｘａａ₁₆はＧおよびＡから選択される。 Ｘａａ₁₇はＭ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、ＹおよびＳの群から選択される。 Ｘａａ₁₈はＩ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、ＹおよびＦの群から選択される。 Ｘａａ₁₉はＬ、Ｒ、Ａ、ＫおよびＩの群から選択される。 Ｘａａ₃₄はＦ、Ｉ、Ｓ、Ｌ、Ｙ、ＷおよびＶの群から選択される。 Ｘａａ₃₈はＣ、Ａ、Ｓ、ＴおよびＧから選択される。 Ｘａａ₃₉はＹ、Ｇ、Ｗ、ＨおよびＦの群から選択される。 但しここに、Ｘ¹がＨまたは１〜５個のアミノ酸残基の場合、Ｒ₁はＸ¹ＤＩＣＫ ＬＰＫＤ（配列番号１）ではなく、 さらに Ｘａａ₁₁からＸａａ₁₉までは ＰＧＦＡＫＡＩＩＲ（配列番号２）、 ＴＧＬＣＫＡＹＩＲ（配列番号３）、 ＴＧＬＣＫＡＲＩＲ（配列番号４）および ＡＧＡＡＫＡＬＬＡ（配列番号５） ではないものとする］ で示されるポリペプチド。 ２．Ｒ₁が残基１０個のペプチドであって、その１０残基ペプチドの第５残基が Ｃである請求項１のポリペプチド。 ３．ポリペプチドの第３０残基がＣである請求項２のポリペプチド。 ４．ポリペプチドの第５１残基がＣである請求項３のポリペプチド。 ５．Ｒ₄が残基１９個のペプチドであって、そのポリペプチドの第５５残基がＣ である請求項４のポリペプチド。 ６．Ｒ₃がＹＧＧおよびＹＳＧの群から選択される請求項５のポリペプチド。 ７．Ｒ₁が： ＶＲＥＶＣＳＥＱＡＥ（配列番号６）、 ＭＨＳＦＣＡＦＫＡＤ（配列番号７）、 ＫＰＤＦＣＦＬＥＥＤ（配列番号８）、 ＧＰＳＷＣＬＴＰＡＤ（配列番号９）、 ＫＥＤＳＣＱＬＧＹＳ（配列番号１０）、 ＴＶＡＡＣＮＬＰＩＶ（配列番号１１）、 ＬＰＮＶＣＡＦＰＭＥ（配列番号１２）および ＲＰＤＦＣＬＥＰＰＹ（配列番号１３） の群から選択される請求項６のポリペプチド。 ８．Ｒ₂が： ＲＷＹＦＤＶＴＥＧＫＣＡＰＦ（配列番号１４）、 ＲＦＦＦＮＩＦＴＲＱＣＥＥＦ（配列番号１５）、 ＲＹＦＹＮＮＱＴＫＱＣＥＲＦ（配列番号１６）、 ＲＦＹＹＮＳＶＩＧＫＣＲＰＦ（配列番号１７）、 ＲＹＦＹＮＧＴＳＭＡＣＥＴＦ（配列番号１８）、 ＬＷＡＦＤＡＶＫＧＫＣＶＬＦ（配列番号１９）、 ＫＷＹＹＤＰＮＴＫＳＣＡＲＦ（配列番号２０）、 ＲＷＦＦＮＦＥＴＧＥＣＥＬＦ（配列番号２１）および ＲＹＦＹＮＡＫＡＧＬＣＱＴＦ（配列番号２２） の群から選択される請求項７のポリペプチド。 ９．Ｒ₄が： ＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＡＡＶＣＧＳＡ（配列番号２３）、 ＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＭＡＶＣＧＳＡ（配列番号２４）、 ＧＮＱＮＲＦＥＳＬＥＥＣＫＫＭＣＴＲＤ（配列番号２５）、 ＧＮＭＮＮＦＥＴＬＥＥＣＫＮＩＣＥＤＧ（配列番号２６）、 ＧＮＥＮＮＦＴＳＫＱＥＣＬＲＡＣＫＫＧ（配列番号２７）、 ＧＮＧＮＮＦＶＴＥＫＥＣＬＱＴＣＲＴＶ（配列番号２８）、 ＧＮＧＮＫＦＹＳＥＫＥＣＲＥＹＣＧＶＰ（配列番号２９）、 ＧＮＥＮＫＦＧＳＱＫＥＣＥＫＶＣＡＰＶ（配列番号３０）、 ＧＮＳＮＮＦＬＲＫＥＫＣＥＫＦＣＫＦＴ（配列番号３１）および ＡＫＲＮＮＦＫＳＡＥＤＣＭＲＴＣＧＧＡ（配列番号３２） の群から選択される請求項８のポリペプチド。 １０．Ｘａａ₁₁がＰ、Ｒ、Ａ、Ｅ、ＧおよびＴの群から選択され、 Ｘａａ₁₂がＧであり、 Ｘａａ₁₃がＰ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、ＱおよびＥの群から選択され、 Ｘａａ₁₄がＣ、Ｇ、ＡおよびＳの群から選択され、 Ｘａａ₁₅がＲおよびＫから選択され、 Ｘａａ₁₆がＡ、ＧおよびＳから選択され、 Ｘａａ₁₇がＬ、ＭおよびＩの群から選択され、 Ｘａａ₁₈がＭ、Ｉ、ＬおよびＹの群から選択され、 Ｘａａ₁₉がＫ、ＬおよびＲの群から選択され、 Ｘａａ₃₄がＦ、Ｖ、Ｉ、Ｙ、ＬおよびＷの群から選択され、 Ｘａａ₃₈がＣ、ＧおよびＡから選択され、 Ｘａａ₃₉がＹ、Ｇ、Ｗ、ＨおよびＦの群から選択される ものである請求項９のポリペプチド。 １１．Ｘａａ₁₁がＰであり、 Ｘａａ₁₂がＧであり、 Ｘａａ₁₃がＰ、Ｖ、ＬおよびＷの群から選択され、 Ｘａａ₁₄がＣであり、 Ｘａａ₁₅がＲおよびＫから選択され、 Ｘａａ₁₆がＡであり、 Ｘａａ₁₇がＬ、ＭおよびＩの群から選択され、 Ｘａａ₁₈がＭ、Ｉ、ＬおよびＹの群から選択され、 Ｘａａ₁₉がＬ、ＫおよびＲの群から選択され、 Ｘａａ₃₄がＦ、Ｖ、Ｉ、ＷおよびＹの群から選択され、 Ｘａａ₃₈がＣであり、 Ｘａａ₃₉がＨ、ＹおよびＧから選択される ものである請求項１０のポリペプチド。 １２．Ｒ₁がＶＲＥＶＣＳＥＱＡＥ（配列番号６）である請求項１１のポリペプ チド。 １３．Ｒ₂がＲＷＹＦＤＶＴＥＧＫＣＡＰＦ（配列番号１４）である請求項１２ のポリペプチド。 １４．Ｒ₄がＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＡＡＶＣＧＳＡ（配列番号２３）である 請求項１３のポリペプチド。 １５．Ｘａａ₁₁がＰであり、 Ｘａａ₁₂がＧであり、 Ｘａａ₁₃がＰ、Ｖ、ＬおよびＷの群から選択され、 Ｘａａ₁₄がＣであり、 Ｘａａ₁₅がＫおよびＲの群から選択され、 Ｘａａ₁₆がＡであり、 Ｘａａ₁₇がＭおよびＬの群から選択され、 Ｘａａ₁₈がＭおよびＩの群から選択され、 Ｘａａ₁₉がＫ、ＲおよびＬの群から選択され、 Ｘａａ₃₄がＶ、Ｉ、ＹおよびＦの群から選択され、 Ｘａａ₃₈がＣであり、 Ｘａａ₃₉がＧ、ＨおよびＹから選択される ものである請求項１４のポリペプチド。 １６．医薬的に許容される添加剤および請求項１のポリペプチドを含む医薬的組 成物。 １７．請求項１６の組成物の医薬的有効量を哺乳類に投与することを含む哺乳類 における血栓形成を阻害する方法。 １８．該組成物を血栓溶解剤と組合せて投与することをさらに含む請求項１７の 方法。 １９．該組成物を抗凝固剤と組合せて投与することをさらに含む請求項１７の方 法。 ２０．請求項１６の組成物の医薬的有効量を哺乳類に投与することを含むＶＩＩ ａ因子、ＸＩａ因子、血漿カリクレインまたはプラスミンの阻害が必要とされる べき哺乳類を処置する方法。 ２１．請求項１のポリペプチドをコードする分離されたＤＮＡ分子。 ２２．さらに該ＤＮＡ分子に作動可能に連結する発現制御配列を含む請求項２１ のＤＮＡ分子。 ２３．制御配列がそのベクターで形質転換した宿主細胞によって認識される請求 項２２のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。 ２４．プラスミドである請求項２３のベクター。 ２５．請求項２４のプラスミドで形質転換した宿主細胞。 ２６．請求項２５の宿主細胞を該阻害剤の発現に適する条件下に培養することを 含む宿主細胞中でセリンプロテアーゼ阻害剤をコードするＤＮＡ分子を発現する 方法。 ２７．培養培地から阻害剤を回収することをさらに含む請求項２６の方法。