JP2011231115A - ポリペグ化されたプロテアーゼインヒビター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(i)プロテアーゼに結合して、それを阻害するKunitzドメインを含む、Kunitzドメインポリペプチド、および(ii)Kunitzドメインポリペプチドに結合した複数のポリエチレングリコール部分を含む化合物。Kunitzドメインポリペプチドの接触可能な各第一級アミンは、前記部分の一つに結合することができる。上記化合物は、12、14または16kDaの分子量を有し、各非タンパク質部分の平均分子量は、約4、5、6、7または8kDaである。
【選択図】なし
Description
本出願は、米国特許出願番号第60/498,845号(2003年8月29日出願)および米国特許出願番号第60/598,967号(2004年8月4日出願)の優先権を主張する。
本発明は、改変されたプロテアーゼインヒビターに関する。
(項目1)
化合物であって、該化合物は、以下:
(i)プロテアーゼに結合して、これを阻害するKunitzドメインを含む、Kunitzドメインポリペプチド;および
(ii)該Kunitzドメインポリペプチドに結合した複数のポリエチレングリコール部分であって、ここで、該各部分の各々の平均分子量が12kDaよりも小さく、かつ、該Kunitzドメインポリペプチドの接触可能な各第一級アミンが、該部分の一つに結合している、化合物。
(項目2)
前記部分の各々の平均分子量が8kDaよりも小さい、項目1に記載の化合物。
(項目3)
各部分が、3〜8kDaの間の分子量を有する、項目1に記載の化合物。
(項目4)
前記Kunitzドメインポリペプチドが8kDaよりも小さい分子量を有し、かつ、前記化合物は、16kDaより大きい分子量を有する、項目1に記載の化合物。
(項目5)
前記複数のポリエチレングリコール部分が、4つまたは5つの部分からなり、各々が、異なる接触可能な第一級アミンに結合している、項目1に記載の化合物。
(項目6)
各リジンが前記複数部分の一つに結合している、項目1に記載の化合物。
(項目7)
前記Kunitzドメインポリペプチドが、N末端第一級アミンを含み、各リジンおよび該N末端第一級アミンが、前記部分の一つに結合している、項目6に記載の化合物。
(項目8)
前記Kunitzドメインポリペプチドが、該Kunitzドメイン結合ループの中にリジンを含まない、項目1に記載の化合物。
(項目9)
前記Kunitzドメインポリペプチドが、該Kunitzドメインのフレームワーク領域の中に少なくとも2つのリジンを含む、項目1に記載の化合物。
(項目10)
前記Kunitzドメインポリペプチドが、該Kunitzドメインのフレームワーク領域の中に3つのリジンを含む、項目1に記載の化合物。
(項目11)
前記Kunitzドメインポリペプチドが、該Kunitzドメインのフレームワーク領域の中に4つのリジンを含む、項目10に記載の化合物。
(項目12)
前記Kunitzドメインポリペプチドが、ヒトKunitzドメインの対応する領域と同一のフレームワーク領域を含む、項目1に記載の化合物。
(項目13)
前記Kunitzドメインポリペプチドが、LACI KunitzドメインまたはITI Kunitzドメインにおける対応する残基と同一のフレームワーク領域を含む、項目12に記載の化合物。
(項目14)
前記プロテアーゼがエラスターゼである、項目1に記載の化合物。
(項目15)
Kunitzドメインポリペプチドが、DX−890のアミノ酸配列、またはDX−890と少なくとも1個は異なるが、アミノ酸の変化が6個よりは少ない配列を含む、項目14に記載の化合物。
(項目16)
前記Kunitzドメインポリペプチドが、DX−890の結合ループのアミノ酸配列を含む、項目14に記載の化合物。
(項目17)
前記プロテアーゼがカリクレインである、項目1に記載の化合物。
(項目18)
Kunitzドメインポリペプチドが、DX−88のアミノ酸配列、またはDX−88と少なくとも1個は異なるが、アミノ酸の変化が6個よりは少ない配列を含む、項目17に記載の化合物。
(項目19)
Kunitzドメインポリペプチドが、DX−88の結合ループのアミノ酸配列を含む、項目17に記載の化合物。
(項目20)
前記プロテアーゼがプラスミンである、項目1に記載の化合物。
(項目21)
Kunitzドメインポリペプチドが、DX−1000のアミノ酸配列、またはDX−1000と少なくとも1個は異なるが、アミノ酸の変化が6個よりは少ない配列を含む、項目20に記載の化合物。
(項目22)
Kunitzドメインポリペプチドが、DX−1000の結合ループのアミノ酸配列を含む、項目20に記載の化合物。
(項目23)
プロテアーゼに特異的に結合して、これを阻害するKunitzドメインポリペプチドを含む調製物であって、ここで、該調製物中の該Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%が、(i)該プロテアーゼに結合して、これを阻害し、そして、(ii)第一の共通部位で結合しているポリエチレングリコール部分、および第二の共通部位で結合しているポリエチレングリコール部分を有し、ここで、該結合している各ポリエチレングリコール部分の平均分子量が12kDaよりも小さい、調製物。
(項目24)
前記結合している各ポリエチレングリコール部分の平均分子量が10kDaよりも小さい、項目23に記載の調製物。
(項目25)
前記結合している各ポリエチレングリコール部分の平均分子量が8kDaよりも小さい、項目24に記載の調製物。
(項目26)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも95%が、第一の共通部位で結合しているポリエチレングリコール部分および第二の共通部位で結合しているポリエチレングリコール部分を有する、項目23に記載の調製物。
(項目27)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%が、さらに第三の共通部位で結合しているポリエチレングリコール部分を有する、項目23に記載の調製物。
(項目28)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%が、さらに第三の共通部位で結合しているポリエチレングリコール部分および第四の共通部位で結合しているポリエチレングリコール部分を有する、項目23に記載の調製物。
(項目29)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%が、第三の共通部位で結合しているポリエチレングリコール部分、第四の共通部位で結合しているポリエチレングリコール部分、および第五の共通部位で結合しているポリエチレングリコール部分を有する、項目23に記載の調製物。
(項目30)
前記調製物中の各Kunitzドメインポリペプチドが、前記プロテアーゼに結合して、これを阻害する、項目23に記載の調製物。
(項目31)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの95%が、前記プロテアーゼに結合して、これを阻害する、項目23に記載の調製物。
(項目32)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%が、各接触可能な第一級アミンに結合したポリエチレングリコール部分を有する、項目23に記載の調製物。
(項目33)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%について、各リジンが前記部分の一つに結合している、項目32に記載の調製物。
(項目34)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%について、各リジンおよびN末端第一級アミンが前記部分の一つに結合している、項目32に記載の調製物。
(項目35)
第一の共通部位がN末端第一級アミンであって、第二の共通部位がリジンである、項目23に記載の調製物。
(項目36)
前記プロテアーゼに特異的に結合して、これを阻害する前記Kunitzドメインポリペプチドが、該Kunitzドメイン結合ループの中にリジンを含まない、項目23に記載の調製物。
(項目37)
前記プロテアーゼに特異的に結合して、これを阻害する前記Kunitzドメインポリペプチドが、該Kunitzドメインのフレームワーク領域の中に少なくとも2つのリジンを含む、項目23に記載の調製物。
(項目38)
前記プロテアーゼに特異的に結合して、これを阻害する前記Kunitzドメインポリペプチドが、該Kunitzドメインのフレームワーク領域の中に3つのリジンを含む、項目23に記載の調製物。
(項目39)
前記プロテアーゼに特異的に結合して、これを阻害する前記Kunitzドメインポリペプチドが、該Kunitzドメインのフレームワーク領域の中に4つのリジンを含む、項目23に記載の調製物。
(項目40)
前記プロテアーゼに特異的に結合して、これを阻害する前記Kunitzドメインポリペプチドが、ヒトKunitzドメインの対応する領域と同一のフレームワーク領域を含む、項目23に記載の調製物。
(項目41)
前記プロテアーゼに特異的に結合して、これを阻害する前記Kunitzドメインポリペプチドが、LACI KunitzドメインまたはITI Kunitzドメインと同一のフレームワーク領域を含む、項目23に記載の調製物。
(項目42)
前記プロテアーゼがエラスターゼである、項目23に記載の調製物。
(項目43)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%について、該ポリペプチドが、DX−890のアミノ酸配列またはDX−890と少なくとも1個は異なるが、アミノ酸の変化が6個よりは少ない配列を含む、項目42に記載の調製物。
(項目44)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%について、該ポリペプチドが、DX−890の結合ループのアミノ酸配列を含む、項目42に記載の調製物。
(項目45)
前記プロテアーゼがカリクレインである、項目23に記載の調製物。
(項目46)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%について、該ポリペプチドが、DX−88のアミノ酸配列またはDX−88と少なくとも1個は異なるが、アミノ酸の変化が6個よりは少ない配列を含む、項目45に記載の調製物。
(項目47)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%について、該ポリペプチドが、DX−88の結合ループのアミノ酸配列を含む、項目45に記載の調製物。
(項目48)
前記プロテアーゼがプラスミンである、項目23に記載の調製物。
(項目49)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%について、該ポリペプチドが、DX−1000のアミノ酸配列またはDX−1000と少なくとも1個は異なるが、アミノ酸の変化が6個よりは少ない配列を含む、項目48に記載の調製物。
(項目50)
前記調製物中の前記Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%について、該ポリペプチドが、DX−1000の結合ループのアミノ酸配列を含む、項目48に記載の調製物。
(項目51)
プロテアーゼに特異的に結合して、これを阻害するKunitzドメインポリペプチドを含む調製物であって、ここで、該調製物中の該Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%が、(i)該プロテアーゼに結合して、これを阻害し、そして(ii)該Kunitzドメインに結合している複数のポリエチレングリコール部分を有し、ここで、該結合したポリエチレングリコール部分の各々の平均分子量が12kDaよりも小さい、調製物。
(項目52)
DX−890のアミノ酸配列を含むKunitzドメインポリペプチドを含む調製物であって、ここで、該調製物中の前記DX−890含有Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%が、該ポリペプチドの4つのリジン残基のそれぞれおよびN末端に結合しているポリエチレングリコール部分を有する、調製物。
(項目53)
DX−88のアミノ酸配列を含むKunitzドメインポリペプチドを含む調製物であって、ここで、該調製物中の前記DX−88含有Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%が、該ポリペプチドの3つのリジン残基のそれぞれおよびN末端に結合しているポリエチレングリコール部分を有する、調製物。
(項目54)
DX−1000のアミノ酸配列を含むKunitzドメインポリペプチドを含む調製物であって、ここで、該調製物中の前記DX−1000含有Kunitzドメインポリペプチドの少なくとも80%が、該ポリペプチドの3つのリジン残基のそれぞれおよびN末端に結合しているポリエチレングリコール部分を有する、調製物。
(項目55)
ペグ化Kunitzドメインを提供する方法であって、該方法は、以下:
該Kunitzドメインのフレームワーク領域の中に少なくとも1つのリジンを有するKunitzドメインを含むポリペプチドを提供する工程、および
該ポリペプチドを、12kDaよりも小さい平均分子量の活性化ポリエチレングリコールと、複数のポリエチレングリコール部分が該ポリペプチドに結合しており、その少なくとも1つがリジンに結合しており、かつ少なくとも1つがN末端第一級アミンに結合しているという条件下で接触させる工程を包含する、方法。
(項目56)
ペグ化Kunitzドメインを提供する方法であって、該方法は、以下:
Kunitzドメインのフレームワーク領域の中に少なくとも2つの第一級アミン基を有するKunitzドメインを含むポリペプチドを提供する工程、および
該ポリペプチドを、12kDaよりも小さい平均分子量の活性化ポリエチレングリコールと、複数のポリエチレングリコール部分が該ポリペプチドに結合しているという条件下で接触させる工程を包含する、方法。
(項目57)
前記フレームワークが少なくとも2つのリジンを含む、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記ポリペプチドの各リジンの第一級アミンが、ポリエチレングリコール部分に結合している、項目57に記載の方法。
(項目59)
收率が40%よりも高い、項目56に記載の方法。
(項目60)
各接触可能な第一級アミンがPEG部分に結合している、項目56に記載の方法。
(項目61)
前記接触のための条件が7.5よりも高いpHである、項目56に記載の方法。
(項目62)
複数のポリペプチドが提供され、また該複数のペプチドの各々が、リジンである第一の共通部位でポリエチレングリコール部分に結合するようになり、N末端第一級アミンである第二の共通部位で結合するようになる項目56に記載の方法。
(項目63)
前記条件が、少なくとも70%の前記分子が、各接触可能な第一級アミン上でペグ化されるという条件である、項目56に記載の方法。
(項目64)
前記条件が、少なくとも85%の前記分子が、各接触可能な第一級アミン上でペグ化されるという条件である、項目56に記載の方法。
(項目65)
前記条件が、ペグ化された分子の少なくとも70%が、同数の結合PEG部分を有し、該部分が同じ位置に結合しているという条件である、項目56に記載の方法。
(項目66)
前記条件が、ペグ化された分子の少なくとも85%が、同数の結合PEG部分を有し、該部分が同じ位置に結合していることである、項目65に記載の方法
(項目67)
前記ペグ化ポリペプチドを薬学的組成物として処方する工程をさらに包含する、項目56に記載の方法。
(項目68)
過剰または望ましくないプロテアーゼの活性により特徴付けられる障害を処置する方法であって、該方法は、該障害を有するか、該障害を有すると疑われている被験体に、項目1に記載の調製物を含む薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、該調製物のKunitzドメインポリペプチドは、該プロテアーゼを阻害する、方法。
(項目69)
前記プロテアーゼがエラスターゼであり、前記Kunitzドメインポリペプチドが、DX−890のアミノ酸配列またはDX−890と少なくとも1個は異なるが、アミノ酸の変化が6個よりは少ない配列を含む、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記障害が嚢胞性線維症、COPDまたは炎症性障害である、項目69に記載の方法。
(項目71)
前記プロテアーゼがカリクレインであり、前記Kunitzドメインポリペプチドが、DX−88のアミノ酸配列またはDX−88と少なくとも1個は異なるが、アミノ酸の変化が6個よりは少ない配列を含む、項目68に記載の方法。
(項目72)
前記障害が血友病、術後出血、周術期出血または遺伝性血管浮腫である、項目71に記載の方法。
(項目73)
前記プロテアーゼがプラスミンであり、前記Kunitzドメインポリペプチドが、DX−1000のアミノ酸配列、またはDX−1000と少なくとも1個は異なるが、アミノ酸の変化が6個よりは少ない配列を含む、項目68に記載の方法。
(項目74)
前記障害が線維素溶解または線維素原溶解、血栓溶解に伴う過剰出血、術後出血、周術期出血および不適切な雄核発生である、項目73に記載の方法。
(項目75)
調製物であって、該調製物は、以下:
(i)プロテアーゼに結合して、これを阻害するKunitzドメインを含むKunitzドメインポリペプチド、および
(ii)該Kunitzドメインポリペプチドに結合した複数のポリエチレングリコール部分
を含み、ここで、該部分の各々の平均分子量が12kDaよりも小さい、調製物。
(項目76)
前記Kunitzドメインの少なくとも50%が、2つ以上の部位に結合しているポリエチレングリコール部分を有し、該ポリエチレングリコール部分の各々の平均分子量が12kDaよりも小さい、項目75に記載の調製物。
(項目77)
前記Kunitzドメインの少なくとも50%が、3つ以上の部位に結合しているポリエチレングリコール部分を有し、該ポリエチレングリコール部分の各々の平均分子量が12kDaよりも小さい、項目76に記載の調製物。
(項目78)
前記Kunitzドメインの少なくとも50%が、4つ以上の部位に結合しているポリエチレングリコール部分を有し、該ポリエチレングリコール部分の各々の平均分子量が12kDaよりも小さい、項目76に記載の調製物。
(項目79)
過剰または望ましくないプロテアーゼの活性によって特徴付けられる障害を処置する方法であって、該障害を有するか、該障害を有すると疑われている被験体に、項目75に記載の調製物を含む薬学的組成物を投与する工程を包含し、ここで、該調製物のKunitzドメインポリペプチドが該プロテアーゼを阻害する、方法。
(要旨)
一つの態様において、本発明は、a)プロテアーゼに特異的に結合し、そして/またはそれを阻害するKunitzドメインを含むポリペプチド、およびb)上述のペプチドに物理的に結合して、上述の化合物の分子量を増加させる複数の非タンパク質部分を含む化合物を特徴とする。「ポリペグ化されたKunitzドメイン」という用語は、本明細書においては、上記の化合物を意味する。一般的に、ポリペグ化されたKunitzドメインの非タンパク質部分はポリエチレングリコールを含む。
P−X0−[(CR’R”)n−X1]a−(CH2)m−X2−Rt
ただし、式中、Pはポリペプチドであり、
R’およびR”のそれぞれは、互いに独立してH、C1−C12アルキル基であり、
X0は、O、N−R1、Sまたは無であるが、ここで、R1は、H、C1−C12アルキル基またはアリール基であり、
X1は、O、N−R2、Sであるが、ここで、R2は、H、アルキル基またはアリール基であり、
X2は、O、N−R3、Sまたは無であり、ここで、R3は、H、アルキル基またはアリール基であり、
各nは1から5まで、例えば2であり、
aは4以上であり、
mは0から5までであり、
Rtは、HまたはC1−C12アルキル基またはアリール基であり、
R’およびR”はHでもよい。一つの実施態様において、R’またはR”は互いに独立して、H、C1−C4、C1−C6またはC1−C10アルキル基である。
P−X0−[CH2CH2O]a−(CH2)m−X2−Rt
ただし、式中、Pはポリペプチドであり、
aは4以上であり、
mは0から5までであり、
X2は、O、N−R1、Sまたは無であるが、ここで、R1は、H、アルキル基またはアリール基であり、
X0は、O、N−R2、Sまたは無であるが、ここで、R2は、H、アルキル基またはアリール基であり、そして
Rtは、H、C1−C12アルキル基またはアリール基である。例えば、X2はO、そしてRtはCH3である(mPEGを使用することが好適である)。
一つの実施態様において、上述の化合物は、その非タンパク質部分を含まないポリペプチドと比べて、5と8との間のpHかつ0.5M NaClのイオン強度未満のイオン強度を有する水溶液の中で溶解度が高い(例えば1.5倍、2倍、4倍または8倍よりも高い)。
[Bound] = N・[Free]/((1/Ka)+[Free])。
本発明の一つ以上の実施態様の詳細は、添付図面および下記の説明に記載されている。本発明のその他の特徴、目的および利点は、明細書および図面から、また、特許請求の範囲からも明らかであろう。本明細書で引用した公開済みの特許出願、特許および参考文献はすべて、その全体が参考として援用される。特に、米国特許第5,663,143号;第5,223,409号、第6,010,080号、第6,103,499号および第6,333,402号は、その全体が参考として援用される。
本発明は、一つとして、プロテアーゼ(例えば、好中球エラスターゼなどのエラスターゼなど)に結合して、これを阻害する化合物を提供する。この化合物は、(i)Kunitzドメインを含むポリペプチド、および(ii)ポリペプチドだけのときに較べて化合物の分子量を増加させる複数の部分(ポリマー部分など)を含む。化合物に上述の部分を付加すると、化合物のインビボにおける循環半減期を長期化させることができる。実施態様によっては、上述の化合物は、高い親和性と選択性をもって、好中球エラスターゼを阻害することができる。
さまざまな部分を用いて、Kunitzドメインまたは別のプロテアーゼを含むポリペプチドの分子量を増加させることができる。一つの実施態様において、この部分はポリマー、例えば、ホモポリマーまたは非生物学的ポリマーなどの水溶性ポリマーおよび/または実質的に非抗原性のポリマーである。実質的に非抗原性のポリマーとしては、例えば、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドなどが挙げられる。この部分は、例えば、血液、血清、リンパ液またはこれら以外の組織などでの循環において、Kunitzドメインの安定化および/または保持を、例えば、1.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、75倍または100倍まで向上させることができる。複数の部分がKunitzドメインに結合することができる。例えば、ポリペプチドは、ポリマーの少なくとも3つの部分に結合する。ポリペプチドの各リジンは、ポリマーの一つの部分に結合し得る。
HO−(CH2CH2O)n−CH2CH2−OH
PEGは、エポキシド環上の水酸化物イオンを求核攻撃することによって開始される、エチレンオキシドのアニオン開環重合によって合成することができる。ポリペプチドの改変にとって特に有用なのは、モノメトキシPEGすなわちmPEGであり、以下の一般構造を有する:
CH3O−(CH2CH2O)n−CH2CH2−OH。
ここで、「Kunitzドメイン」は、51アミノ酸以上で、少なくとも2個および好ましくは3個のジスルフィドを含むポリペプチドドメインである。このドメインは折りたたまれて、1番目と6番目のシステイン、2番目と4番目および3番目と5番目のシステインがジスルフィド結合を形成する(例えば、58アミノ酸を有するKunitzドメインでは、下記に示すBPTI配列の番号によれば、5、14、30、38、51および55番目のアミノ酸に相当する位置にシステインが存在し、また、5位と55位との間、14位と38位の間、ならびに30位と51位の間のシステイン間でジスルフィドが形成されうる)かまたは、2個のジスルフィドが存在する場合には、それらは対応するシステインのサブセットの間で形成される。それぞれのシステインの間隔は、下記に示すBPTI配列の番号によれば、5から55位、14から38位、および30から51位に相当する間隔の7、5、4、3または2アミノ酸以内となろう。BPTI配列は、一般的なKunitzドメインにおける特定の位置を示すための参照として使用することができる。目的とするKunitzドメインとBPTIとの比較は、整列したシステインの数が最大になる最も適合したアラインメントを同定して行われる。
ヒト好中球エラスターゼ(hNE)に結合してこれを阻害する典型的なポリペプチドの一つはDX−890(「EPI−hNE4」としても知られている)。DX−890は、ヒト好中球エラスターゼ(hNE)の非常に特異的かつ強力(Ki=4×10−12M)なインヒビターである。DX−890は、以下のアミノ酸配列を含む:
さまざまな方法を用いて、プロテアーゼに結合および/またはこれを阻害するタンパク質を同定することができる。これらの方法を用いて、本明細書に記載されている化合物の成分として用いることができる天然および非天然のKunitzドメインを同定することができる。
本節では、ディスプレイ・ライブラリーをスクリーニングして、エラスターゼと相互作用するポリペプチドを同定する方法の例を説明する。これらの方法は、別の標的、例えば別のプロテアーゼまたはその他のタンパク質と相互作用する別のポリペプチドを同定するために改変することができる。また、これらの方法は、別のタイプのライブラリー、例えば発現ライブラリーまたはタンパク質アレイなどと組み合わせて改変および使用することも可能である。
一つの好適な実施態様において、ディスプレイ・ライブラリー技術を反復様式で利用する。第1のディスプレイ・ライブラリーを用いて、標的と相互作用する一つ以上のタンパク質を同定する。そして、第2のディスプレイ・ライブラリーを作成するために変異誘発法を用いて、同定されたタンパク質を変異させる。次に、この第2のライブラリーから、例えば、より高ストリンジェンシー、またはより競合的な結合および洗浄条件を用いて、より親和性の強いタンパク質を選抜する。
特に、タンパク質とその標的の間の相互作用に関して解離速度が遅いと高い親和性があると予測されることから、本明細書に記載の方法を用いて、標的との結合相互作用について所望の(すなわち低い)解離反応速度を有するタンパク質を単離することができる。
本明細書に記載されたディスプレイ・ライブラリーのスクリーニング法は、非標的分子、例えば、トリプシンのようなエラスターゼ以外のプロテアーゼに結合するディスプレイ・ライブラリーのメンバーを除去する選抜法またはスクリーニング法を含むこともある。一つの実施態様においては、非標的分子は、例えば、共有結合インヒビターなど、不可逆的に結合したインヒビターによる処置によって活性化されているエラスターゼである。
本明細書に記載のタンパク質を変異させて、類似または改善または変更された特性をもつ変異タンパク質を得ることも可能である。典型的には、多数の変異体が可能である。変異体は、調製してから、例えば、本明細書に記載された結合アッセイ法(蛍光異方性など)を用いて試験することができる。
タンパク質(例えば、Kunitzドメインを含むポリペプチド)の結合特性は、さまざまなアッセイ法を用いて容易に測定することができる。例えば、タンパク質の結合特性は、特定の標的に対するタンパク質の解離定数(KD)または結合定数(Ka)の簡便かつ正確な測定法を提供する蛍光異方性によって、溶液中で測定することができる。このような方法の一つにおいて、評価すべきタンパク質をフルオレセインで標識する。フルオレセイン標識されたタンパク質を、マルチウェル測定用プレートのウェルの中でさまざまな濃度の特定の標的(例えば、エラスターゼ)と混合する。蛍光異方性測定法を、蛍光偏光プレート読み取り装置を用いて行う。
結合相互作用も、ELISAアッセイ法を用いて解析することができる。例えば、評価すべきタンパク質を、その底の表面が、標的、例えば限定された量の標的でコートされているマイクロタイター・プレートと接触させる。分子がプレートに接触する。プレートをバッファーで洗浄して、非特異的に結合した分子を除去する。そして、上述のタンパク質を認識する抗体によってプレートを探索して、プレートに結合したタンパク質の量を測定する。例えば、タンパク質には、エピトープタグも含まれうる。抗体は、アルカリホスファターゼなど、適当な基質が提供されると比色生成物を産生する酵素に結合することもできる。ディスプレイ・ライブラリーのメンバーに、試験すべきタンパク質が含まれる場合には、この抗体が、ディスプレイ・ライブラリーのメンバーすべてにとって不変な領域、例えば、ファージディスプレイ・ライブラリーのメンバーにとっては主要なファージコートタンパク質を認識することができる。
タンパク質と特定の標的との間の結合相互作用を、ホモジニアスアッセイ法を用いて分析することができる。すなわち、アッセイの構成成分をすべて加えた後は、さらなる液体操作を行う必要がない。例えば、蛍光エネルギー移動(FET)をホモジニアスアッセイ法として用いることができる(例えば、Lakowicz et al.,米国特許第5,631,169号;Stavrianopoulos,et al.,米国特許第4,868,103号参照)。第一の分子(例えば、画分中で同定される分子)上のフルオロフォア標識を選択して、それが放出する蛍光エネルギーを、第二の分子(例えば標的)が第一の分子の近傍にあれば、第二の分子上の蛍光標識によって吸収させるようにすることができる。第二の分子上にある蛍光標識は、移動エネルギーに吸収されると蛍光を発する。標識間でのエネルギー移動の効率が、上述の分子を隔てる距離に関係しているため、上述の分子間の空間関係を測定することができる。結合が分子間で起きる場合には、アッセイにおける「受容体」分子標識の蛍光放出が最大になるはずである。FET結合は、当上述の技術分野において公知の標準的な蛍光分析検出手段(例えば、蛍光光度計)によって簡便に測定することができる。第一または第二の結合分子の量を滴定することによって結合曲線を作成して、平衡結合定数を推定することができる。
タンパク質と特定の標的との間の結合相互作用を、SPRを用いて分析することができる。例えば、試料中に存在するディスプレイ・ライブラリーのメンバーの配列を決定し、また、選択的には、例えばELISAによって確認した後、提示されたタンパク質を多量に産生させ、SPRを用いて、標的への結合を測定することができる。SPRまたはリアルタイム生体分子相互作用解析法(BIA)によって、相互作用物(例えば、BIAcore)のいずれも標識することなく、リアルタイムで生体特異的な相互作用を検出する。BIAチップの結合表面での分子量の変化(結合が起きたことを示す)は、表面付近での光の屈折率の変化(表面プラズモン共鳴(SPR)という光学現象)をもたらす。屈折率の変化は、検出可能なシグナルを発生させ、それを、生体分子間のリアルタイムの反応を示すものとして測定する。SPRを使用する方法は、例えば、米国特許第5,641,640号;Raether(1988)Surface Plasmons Srpinger Verlag;Sjolander,S.and Urbaniczky,C.(1991)Anal.Chem.63;2338−2345;Szabo et al.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699−705に記載されている。
化合物が、エラスターゼに特異的なKunitzドメインを有するポリペプチドを含む実施態様に関しては、上述のポリペプチドのエラスターゼ阻害能力について特徴を調べておくことが有益であろう。
プロテアーゼは、炎症および組織損傷など広範な生体内作用に関係している。好中球などの炎症性細胞によって産生されるセリンプロテアーゼは、肺気腫など、さまざまな障害に関与している。好中球エラスターゼは、細胞外基質成分および病原体に対して活性を有する多形核白血球によって産生されるセリンプロテアーゼである。肺気腫は、肺機能の主な障害をもたらす肺胞の破壊を特徴とする。
(ポリペプチドの組換えによる産生)
標準的な組換え核酸法を用いて、本明細書に記載の化合物(例えば、Kunitzドメインを含むポリペプチド)のポリペプチド成分を発現させることができる。通常、ポリペプチドをコードする核酸配列は、核酸発現ベクターにクローニングする。例えば、タンパク質が50アミノ酸よりも少ないペプチドであるなど、ポリペプチドが十分に小さければ、自動有機合成法を用いて上述のタンパク質を合成することができる。
化合物のポリペプチド成分はまた、合成的方法によって生成され得る。例えば、Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. , 85: 2149を参照のこと。例えば、合成ペプチドまたは合成ペプチド模倣物の分子量は、約250ダルトンから約8,0000ダルトンまでであり得る。ペプチドは、例えば、このペプチドの有効分子量を増加させる部分への結合によって改変され得る。このペプチドが、例えば、(例えば、このペプチドの親和性および/または活性を増大させる)親水性ポリマーで、オリゴマー化、二量体化および/または誘導体化されるとき、この分子量は、増大し得、そして約500から約50,000ダルトンまでの範囲で変化し得る。
例えば、薬学的に受容可能な組成物など、ポリペグ化されたKunitzドメインを含む組成物もまた、特徴とされる。一つの実施態様において、Kunitzドメインは、エラスターゼ、プラスミンまたはカリクレインなどのプロテアーゼに結合する。本明細書において、「薬学的組成物」は、治療または予防に利用する化合物だけでなく、診断(例えば、インビボ画像化)に使用する化合物(例えば、標識化合物)を含む。
ポリペグ化Kunitzドメインは、治療および予防にも役立つ。
ある部分(例えばポリマー)と物理的に結合しているhNEインヒビター・ポリペプチドを用いて、肺気腫、嚢胞性線維症、COPD、気管支炎、肺高血圧症、急性呼吸窮迫症候群、間質性肺炎、ぜんそく、喫煙中毒、気管支肺異形成症、肺炎、熱傷および肺移植片拒絶反応などの肺障害を治療することができる。
嚢胞性線維症(CF)は、米国において約30,000人の子供と大人に影響を与えている遺伝病である。CF遺伝子に欠損があると、身体は、肺を塞ぎ、生死に関わる感染症をもたらす、異常に濃い粘着性の粘液を産生するようになる。この遺伝性障害の診断は、ガーゼまたは濾紙上に集めた汗の中の塩化物濃度の測定、ガーゼまたは濾紙上に集めた汗中のナトリウム濃度ならびに集めた汗におけるピロカルピン送達および電流密度の測定を含みうる、発汗試験を含む。CFの原因となる遺伝子は同定されており、上述の遺伝子における多数の変異が知られている。
一つの実施態様において、hNEを阻害するポリペグ化Kunitzドメインを用いて、例えば、潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性大腸炎の少なくとも一つの症状を緩和する。
(診断用途)
ポリペグ化Kunitzドメインは、診断にも利用できる。
化合物は、タンパク質アレイに固定することもできる。タンパク質アレイは、診断用のツールとして、例えば、医療用試料(単離された細胞、血液、血清、生検など)をスクリーニングするためなどに用いることもできる。ポリペプチドアレイを作製する方法は、例えば上に記載されている。
さらに別の実施態様において、本発明は、標的プロテアーゼまたは標的プロテアーゼ発現組織の存在をインビボで検出する方法を提供する。上述の方法は、(i)被験体(例えば、肺または呼吸器に障害をもつ患者)に、Kunitzドメインを含み、ポリペグ化されている化合物を検出用マーカーに結合したものを投与する工程、(ii)上述の被験体を、標的プロテアーゼを発現する組織または細胞に対する上述の検出用マーカーを検出するための装置に曝露する工程を包含する。例えば、NMRまたは他の断層撮影装置によって被験体を画像化する。
核磁気共鳴画像法(MRI)は、NMRを用いて、生体の内部的な特徴を可視化するため、予後、診断、治療および手術に役立つ。放射性の追跡化合物なしで使用することが可能であることが、MRIの明らかな利点である。いくつかのMRI技術が、欧州特許番号EP−A−0502814号に要約されている。通常、異なった環境における水プロトンの緩和時間定数T1およびT2に関する差異を利用して、画像を生成する。しかし、これらの違いは、鮮明で高解像度の画像を提供するには不十分である。
(GenBank(登録商標)にも、gi|4502549|ref|NP_001963.1|エラスターゼ2、好中球[ホモ・サピエンス]としてリストされている。)
上記の実施例は、多数または全ての可能な反応性部位で目的のタンパク質をペグ化する以下の方法によってさらに詳細に説明され、以下の実施形態において、上述の方法は、多数または全ての可能な第一級アミンにおいてKunitzドメインをポリペグ化するために用いられる。
・mPEG−SPA、分子量5,000Da、NEKTAR Therapeutics、 カタログ番号:2M4M0H01
(メトキシ−キャップをもつプロピオン酸リエチレングリコールのスクシンイミジルエステル)
・DX−88 API、分子量7,054Da、PBS,pH7.0中で約10mg/ml
・DX−890 API、分子量6,231Da、10mM NaAc,pH3.0中で約10mg/ml
・DX−1000 API、分子量7,167Da、 PBS,pH7.0中で約10mg/ml
・0.2〜0.3M Hepes,pH7.8〜8.5
・1M Tris,pH8.0
・1N HCl
(ペグ化反応I:)
1)ペグ:反応基を約10:1のモル比で、Kunitzドメインポリペプチドを反応させるのに必要なペグの量を算出する。例えば、DX−890は、全部で5つの反応基を有するので、ペグ:DX−890を50:1のモル比で用いる。Kunitzドメインポリペプチドおよび/または反応条件によって、典型的には25:1から50:1の比率を用いる。例えば、10mgのDX−890(分子量 6,231Da)を、ペグ:ペプチドを50:1のモル比でペグ化するには、401mgのPEG(分子量 5,000Da)が用いられよう。
2)KunitzドメインポリペプチドをPEGと反応させる直前に、必要量のKunitzドメインポリペプチドの貯蔵液を0.2M Hepes,pH7.8〜8.5のバッファーと1:1に希釈する。ペプチド貯蔵液は、一般的には約10.0mg/mlである。従って、希釈時のKunitzドメインポリペプチドの濃度は、0.1M Hepes,pH7.8〜8.5のバッファー中で、約5.0mg/mlである。DX−88およびDX−1000はともに、希釈時の可溶性に関して比較的安定している。しかし、DX−890は、希釈すると最初は溶けやすいが、時間がたつうちに沈殿する可能性がある。沈殿を最少にするために、反応時間を選ぶことができる。
3)1:1に希釈したKunitzドメインポリペプチド溶液を、直ちにPEG粉末に直接添加し、ボルテックス処理によってPEGを速やかに溶解する。完全に溶解したら、チューブにキャップをして、ホイルで包んで、2〜8℃から25℃までで2.5〜3時間ゆっくり振とう/回転させながら反応を行わせる。
4)2〜8℃から25℃までで30〜60分間穏やかに振とう/回転させながら、1/9量の1M Tris,pH8.0を添加して反応を終わらせる。
5)撹拌しながら1N HClを少しずつ添加して、反応停止させた反応混合物のpHが約7になるまで慎重かつゆっくり調整する。
6)中和反応物は、精製するまで、2〜8℃で保存するか、または−20℃から−80℃で凍結させてもよい。
以下は、ポリペプチドをポリペグ化する別法である。
1)反応Iについて記載したように、PEGを検量して、反応直前に使うために取って置く。
2)0.3M Hepes,pH7.8〜8.5中で、Kunitzドメインポリペプチドを3〜5mg/mlに希釈する。
3)反応直前に、あらかじめ脱泡およびN2飽和させてあるdH2Oの中で、200〜250mg/mlのPEG溶液(僅かに過剰)を素早く調製する。
4)混合しながら、Kunitzドメインポリペプチド溶液に、必要量のPEG溶液を直ちに添加する。チューブにキャップをして、ホイルで包み、2〜8℃から25℃までで、2.5〜3時間ゆっくりと振とう/回転させながら反応させる。
5)上記の工程4)から6)までを続ける。
改変されたKunitzドメインは、多様な方法によって分析および特性評価を行うことができる。例示的な方法には、以下のものがある:
未精製の反応混合物は、別のプロトコールに記載されているように、クマシーおよびヨウ素染色法と、屈折率(RI)および280nm(UV)での吸光度を観察して、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SEC−HPLC)と還元/非還元SDS−PAGE分析法によって、ペグ化の程度を解析することが可能である。クマシー染色によるSDS−PAGE分析は、反応混合物(遊離および結合している)のポリペプチド成分のみを検出するが、一方、ヨード染色法は、(遊離および結合した)PEGを選択的に検出する。UV(abs. 280nm)によるSEC−HPLC分析法は(遊離および結合した)ペプチドを検出し、RIはペプチドおよびPEGを検出する。動的光散乱(LS)検出法により、絶対分子量および分子量分布の決定が可能になる。
1本または2本のバンドのみに分離するペグ化試料について、まず、約2〜3mgのタンパク質(DX−1000、DX−88およびDX−890に対する)をゲルにロードする。結合に成功していれば、このようなローディングが、PEG:タンパク質の比率が25:1および50:1の反応にとって適当であることが非常に多い。しかし、より低い反応比率(1:1、5:1、および10:1)でペグ化した試料であって、多数のペグ化分子種を示すと予想される試料については、レーン当たり10〜15μgのタンパク質の方がより適当である(4〜5バンドが出現するかもしれないので)。試料を適量のNuPAGE LDS 試料用バッファーと混合する。ロードする前に、試料を70℃で10分間ボルテックスして加熱した。
ここで用いたクロマトグラフィー装置(Waters Corporation)は、717プラス・オートサンプラー、996フォトダイオードアレイ検出器(PDA)および2414屈折率検出器を備えた、登録商標EMPOWERソフトウエアを実行する600システム(ポンプ/制御装置)であった。さらに、PD2010+動的光拡散(LS)検出器(Precision Detectors, Inc.)も続けて実行した。
MALDI−TOF(マトリックス補助レーザー離脱イオン化飛行時間)質量分析装置(ABI,Applied Biosystem Voyager−DE)を用いて、反応生成物および被験体の実際の質量を測定できる。ポリペプチド分析には(例えば、反応の前に)、アルファ−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸を基質として用いることができる。反応産物またはポリペグ化種の分析には、2,5−ジヒドロキシ安息香酸(DHB)を基質として使用することができる。チップに試料:基質を1:1(0.5μL:0.5μL)の比率でスポッティングして、解析前に風乾することができる。
ポリペグ化タンパク質(例えば、ポリペグ化DX−890)の平衡阻害定数(Ki)を、可逆性複合体(1:1の化学量)を形成する強力結合阻害モデルに従って測定することができる。100pMの酵素(例えば、エラスターゼ)および50mM HEPES,pH7.5、150mM NaClおよび0.1%TritonX−100の中、30℃である範囲のインヒビター濃度(0〜4nM)を用いて反応を調整する。24時間インキュベートした後、基質を酵素インヒビター溶液に添加(25μM)して、基質の加水分解速度を360nmの励起および460nmの放射で観測する。非線形回帰分析による活性インヒビター濃度に対する残存活性の割合のプロットは、平衡解離定数を求める式1に適合する。非改変タンパク質およびポリペグ化タンパク質を、比較のために分析することができる。
%A = 活性%
I = Kunitzドメインタンパク質濃度(例えば、DX−890)
E = 酵素(例えば、HNE)濃度
Ki = 平衡阻害定数。
以下の方法を用いて、例えば、マウスやウサギなどの動物中のポリペグ化タンパク質のようなタンパク質の薬物動態(PK)を評価することができる。
y=投与後の時間=tにおいて血漿中に残存している標識の量
A=「速い」クリアランス相における全標識
B=「遅い」クリアランス相における全標識
C=「最も遅い」クリアランス相における全標識
α=「速い」クリアランス相の崩壊定数
β=「遅い」クリアランス相の崩壊定数
γ=「最も遅い」クリアランス相の崩壊定数
t=投与後経過時間。
α相の半減期 = 0.69(1/α)
β相の半減期 = 0.69(1/β)
γ相の半減期 = 0.69(1/γ)。
%α相=[A/(A+B)]x100
%β相=[B/(A+B)]x100。
%α相=[A/(A+B+C)]x100
%β相=[B/(A+B+C)]x100
%γ相=[C/(A+B+C)]x100。
一つの例示的な精製方法は以下の通りである:
1)過剰/未反応PEG、および極微量の高分子量ペグ化分子種および低分子量のペグ化分子種の両方からのポリペグ化タンパク質の精製は、AKTA Basic10/100クロマトグラフィー装置(Amersham)におけるイオン交換クロマトグラフィーによって行うことができる。
2)例えば、少なくともペグ化DX−88およびペグ化DX−1000の場合では、強陽イオン交換樹脂(すなわち、Poros 50NS、Applied Biosystems、製品コード:1−3359−11)を、適当なサイズおよび容量のカラムに詰めることができる。
3)簡単に言うと、一定量のペグ化反応混合液を、必要に応じて、水で5から15倍に希釈してから、1M 酢酸(最終濃度100〜200mM)でpHを約3.0にpH調整し、伝導率を3mS/cmより小さく調製する。
4)カラムをまず、pH3.0の100mM 酢酸で平衡化する。線流速100cm/時。
5)同じ液で、約5カラム容量分をロードして洗浄する。ロード中の線流速は50cm/時である。
6)ペグ化タンパク質を、一連の段階勾配の中でカラムから溶出する。
7)第一段階の溶出は、HMW成分を除去するために、20mM NaCl入りの100mM 酢酸,pH3.2で行う。
8)第二段階の溶出は、50mM NaCl入りの100mM 酢酸,pH3.8(100cm/時で約10CV)で行い、主な生成物(すなわち、DX−88およびDX−1000については4×5kDa PEG/ペプチド)を溶出する。
9)第三の最終段階の溶出は、極微量のLMWペグ化種を除去するために、PBS,pH7.2(約5CV 100cm/時)で行う。
10)続いて、0.2M NaOHで洗浄する(30分の接触時間で約5CV)。
11)続いて、20%エタノール中でカラムを保存する(約10CV)。
12)プロファイルを横断して画分を回収し、まとめる前に、SDS−PAGEにより分析する。
13)そして、精製したペグ化タンパク質の最終プールは、利用可能な通常の手段を用いて、pH7.2のPBS中にUF/DFする。次に、最終物質を、0.22umで濾過し、(上記記載のように)abs.280nmによって定量し、小分けにして、使用するまで−20℃〜−80℃で凍結する。
ポリペグ化DX−88を含む画分を、約6mLの試料全量となるようにまとめた。試料は、バッファーをInvitrogen(エンドトキシン規格<0.25EU/ml)から1×DPBS,pH7.2(未改変)に交換して、分子量カットオフ量10,000kDaおよび遠心分離力4500×gで2つのAmicon Ultra−15 Centrifugal Filter Deviceを用いて濃縮した。登録商標CENTRICONを0.1N NaOH(エンドトキシン産生を低下させるために1N NaOH、Acros、から希釈)で1時間洗浄した。最終交換因子は1×DPBSの中に300倍であった。濃縮され精製されたDX−88−PEG5Kをセントリコンから全量で3mL回収した。試料を1:10に希釈し、DX−88の吸光係数0.954を用いて、1×DPBSに対する吸光度280nmを測定して、上述の試料の最終濃度を4.97mg/mLと測定した。試料の最終pHは、Whatman pH Indicatorストリップ(pH0〜14)を用いて、約2と測定された。全濾液(全量33mL)をタンパク質含量について分析したところ、1×DPBSに対して、0.003以下の吸光度280nmを示した。精製したDX−88−PEG5Kの試料を、無菌チューブの中に0.5mL画分(それぞれ2.5mg)に小分けして、−80℃で凍結した。1:10で希釈した試料を、段階希釈してSDS−PAGEで分析して、目的の主生成物である4−PEG5K−DX−88の純度を推定した。4−PEG5K−DX−88の純度は約90%である。
本発明者らは、ポリペグ化DX−890を調製した。ゲル電気泳動およびクロマトグラフ分析は、5KPEG試薬に対して1:50または1:63という比率でDX−890を用いた反応が、主に(>85%)、5つの結合PEG部分を有する修飾DX−890である反応産物を生成することを示した。様々な比率でペグ化したDX−890は、コントロール(約10 U/mg)と較べて、その特異活性を維持した。
本発明者らは、ポリペグ化DX−88を調製した。ゲル電気泳動およびクロマトグラフ分析は、pH7.8の5KPEG試薬に対して1:50という比率でDX−890を用いた反応によって、主に(>85%)4つの結合PEG部分を有する修飾DX−88である反応産物が生成されることを示した。
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