CZ284911B6 - Lidská varianta inhibitoru proteasy Kunitzova typu - Google Patents

Lidská varianta inhibitoru proteasy Kunitzova typu Download PDF

Info

Publication number
CZ284911B6
CZ284911B6 CZ941649A CZ164994A CZ284911B6 CZ 284911 B6 CZ284911 B6 CZ 284911B6 CZ 941649 A CZ941649 A CZ 941649A CZ 164994 A CZ164994 A CZ 164994A CZ 284911 B6 CZ284911 B6 CZ 284911B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
lys
cys
gly
glu
phe
Prior art date
Application number
CZ941649A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ164994A3 (en
Inventor
Fanny Norris
Kjeld Norris
Soren Erik Bjorn
Lars Christian Petersen
Ole Hvilsted Olsen
Original Assignee
Novo Nordisk A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk A/S filed Critical Novo Nordisk A/S
Publication of CZ164994A3 publication Critical patent/CZ164994A3/cs
Publication of CZ284911B6 publication Critical patent/CZ284911B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Production Of Liquid Hydrocarbon Mixture For Refining Petroleum (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Amplifiers (AREA)

Abstract

Varianta lidské domény II inhibitoru proteasy Kunitzova typu inhibitoru tkáňového faktoru (TFPI) obsahující sekvenci aminokyselin obecného vzorce I, v níž X.sup.1.n. znamená atom vodíku nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys, X.sup.2.n. až X.sup.14.n. znamenají nezávisle na sobě zbytek přirozeně se vyskytující aminokyseliny a X.sup.15.n. znamená hydroxylovou skupinu nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys s tím, že alespoň jeden z aminokyselinových zbytků X.sup.1.n. až X.sup.15.n. znamená jiný zbytek aminokyseliny, než je odpovídající zbytek aminokyseliny než je odpovídající zbytek aminokyseliny přirozené sekvence. ŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká vyrianty lidské domény II inhibitoru proteázy Kunitzova typu inhibitoru tkáňového faktoru TEPI, DNA konstrukce obsahující DNA sekvenci kódující tuto variantu, rekombinantního expresního vektoru s uvedenou DNA konstrukcí, buňky s uvedenou DNA konstrukcí, způsobu výroby varianty lidské domény II inhibitoru proteázy Kunitzova typu, farmaceutického přípravku k prevenci nebo léčení onemocnění nebo stavů souvisejících s patologickou proteolýzou a použití uvedené varianty.
Dosavadní stav techniky
Polymorfonukleámí leukocyty (neutrofily nebo PMN) a mononukleámí fagocyty (monocyty) hrají důležitou roli při poranění tkáně, infekci, akutním a chronickém zánětu a při hojení ran. Tyto buňky migrují z krve do místa zánětu a po příslušné stimulaci uvolňují oxidující sloučeniny (O2, Of, H2O2 a HOC1) a také granule, které obsahují rozmanité proteolytické enzymy. Sekretované granule obsahují mimo jiné alkalickou fosfatasu, metaloproteinasy, jako je gelatinasa a kolagenasa, a serinové proteázy, jako je neutrofilní elastasa, kathepsin G a proteinasa-3.
Latentní metaloproteinasy se uvolňují společně s tkáňovým inhibitorem metaloproteinasy (TIMP). Mechanismus aktivace není dosud zcela objasněn, ale je pravděpodobné, že v tomto procesu hraje roli oxidace thiolových skupin a/nebo proteolýza. Také aktivita volné metaloproteinasy je závislá na deaktivaci TIMP.
V azurofílních granulích leukocytů existují serinová proteázová neutrofilní elastasa, kathepsin G a proteinasa-3 jako aktivní enzymy komplexované s glukosaminoglykany. Tyto komplexy nejsou aktivní, ale při sekreci disociují a uvolňují aktivní enzymy. Pro neutralizování proteázové aktivity se v plasmě nacházejí velká množství inhibitorů inhibitoru αι-proteinasy (cti—PI) a inhibitoru ap-chymotrypsinu (ct|—Chl). PMN jsou však schopny deaktivovat inhibitory místně, ct|-PI, který je nejdůležitějším inhibitorem neutrofilní elastasy, je tedy citlivý na oxidaci v reakčním centru (Met-358) metabolity kyslíku produkovanými aktivovanými PMN. To snižuje přibližně 2000-krát afinitu aj-PI na neutrofilní elastasu.
Po místní neutralizaci cti—PI je elastasa schopna degradovat četné inhibitory jiných proteolytických enzymů. Elastasa štěpí αι-Chl a podporuje tedy aktivitu kathepsinu G. Také štěpí TIMP, což vede k tkáňové degradaci metaloproteinasami. Elastasa dále štěpí antitrombin III, heparinový kofaktor II a inhibitor tkáňového faktoru TFPI (tissue factor pathway inhibitor), což možná podporuje tvorbu sraženiny. Na druhé straně se předpokládá schopnost neutrofilní elastasy degradovat koagulační faktory, což má opačný efekt, takže celkový účinek elastasy není jasný. Vliv neutrofilní elastasy na fíbrinolysu je méně nejednoznačný. Fibrinolytická aktivita stoupá, jestliže elastasa štěpí inhibitor plasminogenového aktivátoru a inhibitor a2 plasminu. Kromě toho oba tyto inhibitory jsou oxidovány a deaktivovány metabolity O2.
PMN obsahují velká množství serinových proteáz. Denně se uvolňuje asi 200 mg každé z leukocytových proteáz, aby působily na invazivní činidla v těle. Akutní zánět vede k mnohonásobnému zvýšení množství uvolňovaného enzymu. Za normálních podmínek je proteolýza udržována na přijatelně nízké úrovni velkými množstvími inhibitorů αι-PI, aj-Chl aa2 makroglobulinu. Existují však některé náznaky, že četná chronická onemocnění jsou
- 1 CZ 284911 B6 způsobována patologickou proteolýzou díky přestimulaci PMN, způsobené například autoimunitní odpovědí, chronickou infekcí, tabákovým kouřem nebo jinými dráždivými činidly atd.
O aprotininu (inhibitor hovězího pankreatického trypsinu) je známo, že inhibuje různé serinové proteázy, mezi něž patří trypsin, chymotrypsin, plasmin a kalikrein, a že se terapeuticky používá při léčení akutní pankreatitidy, různých stavů syndromů šoku, hyperfibrinolytické hemoragie a infarktu myokardu (viz například J. E. Trapnell aspol.: Brit. J. Surg. 61, 177 (1974), J. McMichan a spol.: Circulatory Shock 9, 107 (1982), L. M. Auer a spol.: Acta Neurochir. 49, 207 (1979), G. Sher: Am. J. Obstet. Gynecol. 129, 164 (1977) a B. Schneider: Artzneim.-Forsch. 26, 1606 (1976).). Podávání aprotininu ve vysokých dávkách významně snižuje ztrátu krve při srdeční chirurgii včetně operací s kardiopulmonámím obchvatem (viz například Β. P. Bidstrup aspol.: J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 364 (1989) a W. van Oeveren aspol.: Ann. Thorac. Surg. 44, 640 (1987).). Již dříve bylo ukázáno (viz H. R. Wenzel a H. Tschesche: Angew. Chem. Internát. Ed. 20, 295 (1981).), že některé analogy aprotininu, např. aprotinin (1-58, Vall5) vykazuje relativně vysokou selektivitu na granulocytovou elastasu a inhibiční efekt na kolagenasu, aprotinin (1-58, Alal5) má slabý vliv na elastasu, zatímco aprotinin (3-58, Argl5, Alal7, Ser42) vykazuje vynikající inhibiční účinek plasmového kalikreinu (viz spis Světového úřadu WO 89/10374).
Bylo však zjištěno, že v případě podávání in vivo, má aprotinin nefrotoxický účinek na krysy, králíky a psy po opakovaných injekcích s relativně vysokými dávkami aprotininu (Bayer: Trasylol. Inhibitor of proteinase, E. Glaser a spol. v Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft fur Innere Medizin, 78. Kongress, Bergmann, str. 1612 až 1614, Mnichov, 1972.). Nefrotoxicita (projevující se mimo jiné jako poranění) pozorovaná u aprotininu by mohla být připisována akumulaci aprotininu v proximálních tubulámích buňkách ledvin jako výsledek vysokého positivního náboje aprotininu, který způsobuje, že je navázán na negativně nabité povrchy těchto kanálků. Tato nefrotoxicita způsobuje, že aprotinin je méně vhodný pro klinické účely, zvláště takové, které vyžadují podávání velkých dávek inhibitoru (jako jsou operace s kardiopulmonámím obchvatem). Vedle toho je aprotinin hovězím proteinem, který tedy může obsahovat jeden nebo více epitopů, což může při podávání člověku vést k nežádoucí imunitní odpověď.
Předmětem tohoto vynálezu je tedy identifikovat lidské inhibitory proteázy stejného typu jako je aprotinin (tj. inhibitory Kunitzova typu) s podobným inhibičním profilem nebo modifikovaným tak, aby vykazoval žádoucí inhibiční profil.
Předmětem vynálezu je varianta lidské domény II inhibitoru proteázy Kunitzova typu inhibitoru tkáňového faktoru TFPI, obsahující následující sekvenci aminokyselin
X1 Asp Phe Cys Phe Leu Glu Asp X2 Gly X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn X16 Gin X17 Lys Gin Cys Glu Arg Phe X10 Tyr Gly Gly Cys X11 X12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X13 (sekvence id. č. 2), v níž X1 znamená atom vodíku nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys, X2 až X14 znamenají nezávisle na sobě zbytek přirozeně se vyskytující aminokyseliny a X15 znamená hydroxylovou skupinu nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys s tím, že alespoň jeden z aminokyselinových zbytků X1 až X15 znamená jiný zbytek aminokyseliny než je odpovídající zbytek aminokyseliny přirozené sekvence. X16 znamená Asn, Gin, Gly, Ala, Ser, Val, nebo Phe a X17 znamená Thr nebo Ala, stou výjimkou, že alespoň jeden zaminkyselinových zbytků X1 až X15 se liší od odpovídajícího aminokyselinového zbytku přirozené sekvence a s tím, že X4 má jiný význam než Leu.
-2CZ 284911 B6
Jedno provedení vynálezu představuje varianta obsahující následující sekvenci aminokyselin
X1 Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X2 Gly X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe X10 Tyr Gly Gly Cys Xn X12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X15 (sekvence id. č. 1), v níž X1 je atom vodíku nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys, X2 až X14 znamenají nezávisle na sobě zbytek přirozeně se vyskytující aminokyseliny a X15 znamená hydroxylovou skupinu nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys stím, že alespoň jeden z aminokyselinových zbytků X1 až X13znamená jiný zbytek aminokyseliny než je odpovídající zbytek aminokyseliny přirozené sekvence a dále s tím, že X4 má jiný význam než Leu.
Výhodná je varianta, v níž X1 je Lys-Pro nebo v níž X2 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Ala, Arg, Thr, Asp, Pro, Glu, Lys, Gin, Ser, Ile a Val.
Konkrétnější je varianta, v níž X2 je Thr nebo Pro.
Jiným provedením vynálezu je uvedená varianta, v níž X3 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Pro, Thr, Leu, Arg, Val a Ile.
Výhodná je v tomto případě varianta, v níž X3 je Pro nebo Ile.
Dalším provedením vynálezu je varianta, v níž X4 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr, Gin, Asn a Ala.
Výhodná je zde uvedená varianta, v níž X4 je Lys, Val, Ile, Thr, Met, Gin nebo Arg.
Jiným provedením vynálezu je varianta, v níž X5 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Ala, Gly, Thr, Arg, Phe, Gin a Asp.
Výhodná je zde varianta, v níž X5 je Ala, Thr, Asp nebo Gly.
Další provedení vynálezu představuje variantu, v níž X6 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Arg, Ala, Lys, Leu, Gly, His, Ser, Asp, Gin, Glu, Val, Thr, Tyr, Phe, Asn, Ile a Met.
Výhodná je zde varianta, v níž X6 je Arg, Phe, Ala, Leu nebo Tyr.
Jiným provedením vynálezu je varianta, v níž X7 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Ile, Met, Gin, Glu, Thr, Leu, Val a Phe.
Výhodná je zde varianta, v níž X7 je Ile.
Dalším provedením vynálezu je varianta, v níž X8 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Ile, Thr, Leu, Asn, Lys, Ser, Gin, Glu, Arg, Pro a Phe.
Výhodná je v tomto případě varianta, v níž X8 je Ile nebo Thr.
Dalším provedením tohoto vynálezu je varianta, v níž X9 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Arg, Ser, Ala, Gin, Lys a Leu.
V tomto případě je výhodná varianta, v níž X9 je Arg.
-3 CZ 284911 B6
Jiným provedením vynálezu je varianta, v níž X10 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Gin, Pro, Phe, Ile, Lys, Trp, Ala, Thr, Leu, Ser, Tyr, His, Asp, Met, Arg a Val.
Zde je výhodná varianta, v níž X10 je Val nebo Lys.
Další provedení vynálezu představuje varianta, v níž X11 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Gly, Met, Gin, Glu, Leu, Arg, Lys, Pro a Asn.
Výhodná je zde varianta, v níž X11 je Arg nebo Leu. Ještě dalším provedením vynálezu je varianta, v niž X12 je Ala nebo Gly.
Jiné provedení vynálezu představuje varianta, v níž X13 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Lys, Asn a Asp.
Zde je výhodná varianta, v níž X13 je Lys nebo Asn.
Dalším provedením vynálezu je varianta, v níž X14 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Val, Tyr, Asp, Glu, Thr, Gly, Leu, Ser, Ile, Gin, His, Asn, Pro, Phe, Met, Ala, Arg, Trp a Lys.
V tomto případě je výhodná varianta, v níž X14 je Lys nebo Glu.
Dalším možným případem je varianta, v níž X15 je Gly. Jinou možností je varianta, v níž X1 je Lys-Pro a X15 je Gly.
Jiné provedení vynálezu představuje varianta, obsahující následujcí sekvenci aminokyselin
X1 Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X2 Gly X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn X16 Gin X17 Lys Gin Cys Glu Arg Phe X10 Tyr Gly Gly Cys X11 X12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X1’ (sekvence id. č. 2), v níž X1 až X13 mají významy uvedené v nároku 2, X16 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Gin,
Gly, Ala, Ser, Val a Phe, zejména Gin nebo Ala, a X17 je zbytek aminokyseliny vybraný ze skupiny zahrnující Thr a Ala.
Dalším provedením vynálezu je varianta, obsahující následující sekvenci aminokyselin.
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (sekvence id. č. 3).
Dále je vhodná varianta, obsahující následující sekvenci aminokyselin
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (sekvence id. č. 4).
Dalším provedením vynálezu je varianta, obsahující následující sekvenci aminokyselin
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (sekvence id. č. 5).
-4CZ 284911 B6
V dalším provedení může varianta obsahovat následující sekvenci aminokyselin
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (sekvence id. č. 6).
Předmětem vynálezu je také DNA konstrukce obsahující DNA sekvenci kódující lidskou variantu inhibitoru proteázy Kunitzova typu.
Dalším předmětem vynálezu je rekombinantní expresní vektor obsahující uvedenou DNA konstrukci.
Předmětem vynálezu je dále buňka obsahující uvedenou DNA konstrukci nebo uvedený expresní vektor.
Dalším předmětem vynálezu je způsob výroby lidské varianty inhibitoru proteázy Kunitzova typu, jehož podstata je v tom, že se kultivuje buňka podle vynálezu za podmínek vedoucích k expresi proteinu a výsledný protein se izoluje z kultury.
Předmětem tohoto vynálezu je také farmaceutický přípravek k prevenci nebo léčení onemocnění nebo stavů souvisejících s patologickou proteolýzou, který jako účinnou látku obsahuje lidskou variantu inhibitoru proteázy Kunitzova typu podle vynálezu ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem.
Farmaceutický přípravek podle vynálezu s výhodou dále obsahuje heparin.
Předmětem vynálezu je rovněž použití lidské domény II inhibitoru proteázy Kunitzova typu TFPI nebo její varianty podle vynálezu pro přípravu léčiva k prevenci nebo léčení onemocnění nebo stavů souvisejících s patologickou proteolýzou.
Pojem zbytek přirozeně se vyskytující aminokyseliny znamená zbytek jakékoliv z 20 přirozeně se vyskytujících aminokyselin, tj. Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg a His.
TFPI, známý také jako inhibitor vnější cesty (EPI) nebo koagulační inhibitor asociovaný s lipoproteinem (LÁCI), byl isolován Brožem aspol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 1886 (1997) a evropský patent 300 988). Gen, který kóduje tento protein, byl klonován, viz evropský patent 318 451. Analýza sekundární struktury proteinu ukazuje, že tento protein má tři domény inhibitoru Kunitzova typu, od aminokyseliny 22 k aminokyselině 79 (I), od aminokyseliny 93 k aminokyselině 150 (II) a od aminokyseliny 185 k aminokyselině 242 (III). Bylo ukázáno, že doména Kunitzova typu I TFPI váže TF/FVIIa, zatímco doména II Kunitzova typu váže FXa (Girard a spol.: Nátuře 338, 518 (1989).).
Substituováním jedné nebo více aminokyselin v jedné nebo ve více shora uvedených polohách je možné změnit profil inhibitoru TFPI domény II Kunitzova typu, takže preferenčně inhibuje neutrofilní elastasu, kathepsin G a/nebo proteinasu-3. Dále je možné zkonstruovat varianty, které specificky inhibují enzymy, které jsou přítomny při koagulaci nebo fibrinolyse (např. plasmin nebo plasmový kalikrein), nebo doplňkovou kaskádu.
Jednou z výhod TFPI domény II Kunitzova typu je to, že má negativní náboj na rozdíl od aprotininu, který má, jak bylo shora uvedeno, silný positivní náboj. Je tedy možné zkonstruovat varianty podle vynálezu s nižším positivním nábojem než má aprotinin a tím snížit riziko poškození ledvin při podávání velkých dávek těchto variant. Jinou výhodou je to, že na rozdíl od
-5 CZ 284911 B6 aprotininu jde o lidský protein (fragment), takže nežádoucí imunologické reakce při podávání lidem jsou významně sníženy.
Příklady výhodných variant domény I Kunitzova typu TFPI jsou varianty, v nichž X1 znamená 5 Lys-Pro, nebo v nichž X2 znamená zbytek aminokyselin, který je vybrán ze skupiny sestávající z Ala, Arg, Thr, Asp, Pro, Glu, Lys, Gin, Ser, Ile a Val, zvláště takové, v nichž X2 znamená Thr nebo Pro, nebo v nichž X3 znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Pro, Thr, Leu, Arg, Val a Ile, zvláště takové, v nichž X3 znamená Pro nebo Ile, nebo v nichž X4 znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, 10 Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr, Gin, Asn a Ala, zvláště takové, v nichž X4 znamená Lys, Val, Leu,
Ile, Thr, Met, Gin nebo Arg, nebo v nichž X5 znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Ala, Gly, Thr, Arg, Phe, Gin a Asp, zvláště takové, v nichž X5 znamená Ala, Thr, Asp nebo Gly, nebo v nichž X6 znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Arg, Ala, Lys, Leu, Gly, His, Ser, Asp, Gin, Glu, Val, Thr, Tyr, Phe, Asn, Ile a Met, zvláště 15 takové, v nichž X6 znamená Arg, Phe, Ala, Leu nebo Tyr, nebo v nichž X7 znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Ile, Met, Gin, Glu, Thr, Leu, Val a Phe, zvláště takové, v nichž X7 znamená Ile, nebo v nichž X8 znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Ile, Thr, Leu, Asn, Lys, Ser, Gin, Glu, Arg, Pro a Phe, zvláště takové,
R Q C v nichž X znamená Ile nebo Thr, nebo v nichž X znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze 20 skupiny sestávající z Arg, Ser, Ala, Gin, Lys a Leu, zvláště takové, v nichž X9 znamená Arg, nebo v nichž X10 znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Gin, Pro, Phe, Ile, Lys, Trp, Ala, Thr, Leu, Ser, Tyr, His, Asp, Met, Arg a Val, zvláště takové, v nichž X10 znamená Val nebo Lys, nebo v nichž X11 znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Gly, Met, Gin, Glu, Leu, Arg, Lys, Pro a Asn, zvláště takové, v nichž X11 znamená 25 Arg nebo Leu, nebo v nichž X12 znamená Ala nebo Gly, nebo v nichž X13 znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Lys, Asn a Asp, zvláště takové, v nichž X13 znamená Lys nebo Asn, nebo v nichž X14 znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Val, Tyr, Asp, Glu, Thr, Gly, Leu, Ser, Ile, Gin, His, Asn, Pro, Phe, Met, Ala, Arg,
Trp a Lys, zvláště takové, v nichž X14 znamená Lys nebo Glu, nebo v nichž X15 znamená Gly. Ve 30 výhodném uspořádání X1 znamená Lys-Pro aX15 znamená Gly, při čemž X2 až X14 znamenají jak shora uvedeno.
Varianty TFPI domény II Kunitzova typu podle vynálezu by s výhodou neměly obsahovat zbytek
Met ve vazebné oblasti proteázy (tj. zbytcích aminokyselin X3 až X14). Analogicky ke shora 35 popsanému al-PI by zbytek Met v kterékoliv z těchto poloh způsobil, že inhibitor by byl citlivý na oxidační deaktivaci metabolity kyslíku produkovanými PMN a naopak, nedostatek zbytku Met v těchto polohách by způsobil, že inhibitor by byl v přítomnosti těchto metabolitů kyslíku stabilnější.
Může být žádoucí změnit způsob, kterým je varianta TFPI domény II Kunitzova typu glykosylována během své produkce hostitelskou buňkou. V jednom uspořádání může mít varianta následující sekvenci aminokyselin:
X1 Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X2 Gly X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn X16 45 Gin X17 Lys Gin Cys Glu Arg Phe X10 Tyr Gly Gly Cys X1' X12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr
Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X1’ (sekvence id. č. 2), v níž X1 až X15 znamenají jak uvedeno v nároku 1, X16 znamená zbytek aminokyseliny, která je vybrána ze skupiny sestávající z Gin, Gly, Ala, Ser, Val a Phe, zvláště Gin nebo Ala, aX17 50 znamená zbytek aminokyseliny, která je vybrána ze skupiny sestávající z Thr a Ala.
Běžně výhodnými variantami podle vynálezu jsou ty varianty, v nichž je jeden nebo více zbytků aminokyselin umístěných na proteázovém vazebném místě Kunitzovy domény (tj. jedno nebo
-6CZ 284911 B6 více míst zX3 až X14 odpovídajících polohám 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 34, 39, 40, 41 a 46 v aprotininu) substituováno aminokyselinami přítomnými ve stejných (stejné) polohách (poloze) přírodního aprotininu. Příklady takových variant jsou:
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (sekvence id. č. 3),
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (sekvence id. č. 4),
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (sekvenmce id. č. 5),
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (sekvence id. č. 6).
V jiném aspektu se tento vynález tyká DNA konstrukce kódující lidskou variantu domény inhibitoru Kunitzova typu podle vynálezu. DNA konstrukce podle vynálezu se může připravit synteticky vypracovanými standardními způsoby, např. fosfoamiditovou metodou popsanou S. L. Beaucagem aM. H. Caruthersem: Tetrahedron Letters 22. 1859 (1981) nebo způsobem popsaným Matthesem a spol.: EMBO J. 3, 801 (1984). Podle fosfoamiditové metody se oligonukleotidy syntetizují např. v automatickém DNA syntetizátoru, vyčistí, anelují, ligují a klonují se ve vhodných vektorech.
Je možné také používat genomovou nebo cDNA kódující TFPI doménu II Kunitzova typu (např. získané testováním (prohledáváním) genomové nebo cDNA knihovny na DNA kódující TFPI pomocí syntetických oligonukleotidových sond a isolováním DNA sekvence, která kóduje doménu II). Tato DNA sekvence je modifikována na jednom nebo více místech odpovídajících místu (místům), v němž (nichž) je žádoucí provést substituce aminokyselin, např. místně řízenou mutagenesou s použitím syntetických oligonukleotidů kódujících žádanou sekvenci aminokyselin pro homologní rekombinaci podle dobře známých postupů.
Podle dalšího aspektu se tento vynález týká rekombinantního expresního vektoru, který obsahuje DNA konstrukci podle vynálezu. Rekombinantní expresní vektor může znamenat jakýkoliv vektor, který může být vhodně podroben postupům rekombinace DNA. Výběr vektoru bude často záviset na hostitelské buňce, do které se má zavést. Vektorem tedy může být autonomně se replikující vektor, tj. vektor, který existuje jako extrachromosomální jednotka, jehož replikace je nezávislá na chromosomální replikaci, např. plasmid. Vektorem může být také taková jednotka, která se po zavedení o hostitelské buňky integruje do genomu hostitelské buňky a replikuje se společně s chromosomem (chromosomy), do něhož (nichž) je integrována.
Ve vektoru by měla být DNA sekvence kódující variantu TFPI domény II Kunitzova typu podle vynálezu odštěpitelně napojena na vhodnou promotorovou sekvenci. Promotorem může být jakákoliv DNA sekvence, která má transkripční aktivitu ve zvolené hostitelské buňce. Může být odvozen od genů kódujících proteiny, které jsou s hostitelskou buňkou buď homologní, nebo heterologní. Příklady vhodných promotorů pro řízení transkripce DNA kódující variantu TFPI domény II Kunitzova typu podle vynálezu v savčích buňkách jsou SV 40 promotor (Subramani a spol.: Mol. Cell Biol. 1, 854 (1981).), MT-1 (metalothioneinový gen) protomor (Palmiter a spol.: Science 222, 809 (1983).) nebo adenovirus 2 hlavní pozdní promotor. Mezi promotory vhodné pro použití v kvasinkových hostitelských buňkách patří promotory z kvasinkových
-7CZ 284911 B6 glykolytických genů (Hitzeman a spol.: J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980), Alber a Kawasaki: J. Mol. Appl. Gen. 1, 419 (1982).) nebo alkohol-dehydrogenasových genů (Young a spol. v Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, (Hollaender a spol., red.), Plenům Press. New York, 1982.), TPI1 (USA patent 4 599 311) nebo ADH2-4c (Russell a spol.: Nátuře 304, 652 (1983).) promotory. Vhodnými promotory pro použití v hostitelských buňkách vláknitých hub jsou například promotor ADH3 (McKnight a spol.: The EMBO J. 4, 2093 (1985).) nebo promotor tpiA.
DNA sekvence kódující variantu TFPI domény II Kunitzova typu podle vynálezu může být také odštěpitelně napojena na vhodný terminátor, jako je terminátor lidského růstového hormonu (Palmiter a spol.: shora uvedená citace) nebo (pro houbové hostitele) TPI1 (Alber a Kawasaki: shora uvedená citace) nebo ADH3 (McKnight a spol.: shora uvedená citace) promotory. Tento vektor může dále obsahovat takové prvky, jako jsou polyadenylační signály (např. z SV 40 nebo Elb oblasti adenovirů 5), transkripční zesilovací sekvence (např. zesilovač SV 40) a translační zesilovací sekvence (např. ty, které kódují adenovirus VA RNA).
Rekombinantní expresní vektor podle vynálezu může dále obsahovat DNA sekvenci, která umožňuje, aby se vektor replikoval v příslušné hostitelské buňce. Příklady takové sekvence (jestliže hostitelskou buňkou je savčí buňka) je počátek replikace SV 40 nebo (jestliže hostitelskou buňkou je buňka kvasinky) kvasinkové plasmidové 2 μ replikační geny REP 1-3 a počátek replikace. Vektor může obsahovat také selektovatelný markér, např. gen, jehož produkt doplňuje defekt v hostitelské buňce, jako je gen kódující dihydrofolátreduktasu (DHFR) nebo takový, který uděluje resistenci na léčivo, např. na neomycin, hygromycin nebo methotrexát, nebo Schizosaccharomyces pombe TPI gen (popsaný P. R. Russellem: Gene 40, 125 (1985).).
Postupy, které jsou používány pro ligování DNA sekvencí kódujících variantu TFPI domény II Kunitzova typu podle vynálezu, promotor a terminátor, a postupy, jak je vložit do vhodných vektorů obsahujících informace nutné pro replikaci, jsou dobře známy odborníkům (viz např. Sambrook a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor. New York, 1989).
Hostitelskou buňkou, do níž se zavádí expresní vektor podle vynálezu, může být jakákoliv buňka, která je schopna produkovat variantu TFPI domény II Kunitzova typu podle vynálezu. Touto buňkou je s výhodou eukaryotická buňka, jako je savčí, kvasinková nebo houbová buňka.
Kvasinkovým organismem používaným jako hostitelská buňka podle vynálezu může být jakýkoliv kvasinkový organismus, který při kultivaci produkuje velká množství varianty TFPI domény I Kunitzova typu podle vynálezu. Příklady vhodných kvasinkových organismů jsou kmeny kvasinek druhů Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe nebo Saccharomyces uvarum. Transformace kvasinkových buněk se může provádět například tvorbou protoplastů a následující transformací, která je známa sama o sobě.
Příklady vhodných savčích buněčných linií jsou buněčné linie COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) nebo CHO (ATCC CCL 61). Způsoby, kterými se provádí transfekce savčích buněk, a způsoby, při nichž dochází k expresi DNA sekvencí zavedených do buněk, jsou popsány například Kaufmanem a Sharpem: J. Mol. Biol. 159, 601 (1982), Southemem a Bergem: J. Mol. Appl. Genet. j., 327 (1982), Loyterem a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79, 422 (1982), Wiglerem a spol.: Cell 14, 725 (1978), Corsarem a Pearsonem: Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981), Grahamem a van der Ebem: Virology 52, 456 (1973) a Neumannem a spol.: EMBO J. 1, 841 (1982).
Jako hostitelské buňky podle vynálezu se mohou používat také buňky hub. Příklady vhodných buněk hub jsou buňky vláknitých hub, např. Aspergillus sp. nebo Neurospora sp., zvláště pak
-8CZ 284911 B6 kmenů Aspergillus oryzae nebo Aspergillus niger. Použití Aspergillus sp. pro expresi proteinů je popsáno např. v evropském patentu 238 023.
Tento vynález se dále týká způsobu výroby varianty TFPI domény II Kunitzova typu podle tohoto vynálezu, způsobu kultivace buněk jak shora popsáno za podmínek podporujících expresi varianty a isolace výsledné varianty z kultury.
Médiem, které se používá ke kultivaci buněk, může být jakékoliv konvenční médium, které je vhodné pro růst savčích buněk nebo buněk hub (včetně kvasinkových buněk), podle toho, jaká hostitelská buňka se vybere. Varianta je hostitelskými buňkami sekretována do růstového média. Z tohoto média se isoluje konvenčními postupy, mezi něž patří oddělení buněk od média odstřeďováním nebo filtrací, vysrážení proteinových složek supematantu nebo filtrátu solí, např. síranem amonným, vyčištění různými chromatograflckými postupy, např. chromatografii na ionexu nebo afinitní chromatografii, nebo podobné postupy.
Tento vynález se týká také farmaceutického prostředku, který obsahuje variantu TFPI domény II Kunitzova typu podle vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem. Při přípravě prostředku podle vynálezu se varianta zpracovává jakýmikoliv známými způsoby přípravy farmaceutických prostředků, např. tak, jak je to popsáno v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 1985. Prostředek se typicky připravuje ve formě vhodné pro systémovou injekci nebo infusi, může být připraven jako roztok se sterilní vodou, isotonickým solným roztokem nebo roztokem glukosy.
Varianta TFPI domény II Kunitzova typu podle vynálezu je tedy určena s výhodou pro použití pro takové terapeutické aplikace, které předpokládají použití přírodního aprotininu nebo analog aprotininu s jinými inhibičními profily, zvláště tehdy, jestliže je nutné používat velké dávky aprotininu. Mezi terapeutické aplikace, pro které je indikováno použití variant podle vynálezu jako důsledek jejich schopnosti inhibovat lidské serinové proteázy, např. trypsin, plasmin, kalikrein, elastasu, kathepsin G a proteinasu-3, patří (ale není na ně omezeno) akutní pankreatitida, zánět, trombocytopenie, ochrana funkce krevních destiček, ochrana orgánů, hojení ran, šok (včetně plicního šoku) a stavy zahrnující hyperfibrinolytickou hemoragii, emfyzém, reumatickou artritidu, syndrom úzkosti při dýchání u dospělých, chronické zánětlivé střevní onemocnění apsoriasu, jinými slovy onemocnění, o kterých se předpokládá, že jsou způsobena patologickou proteolýzou elastasou, kathepsinem G a proteinasou-3 uvolňovanou z aktivovaných PMN.
Dále se tento vynález týká použití TFPI domény II inhibitoru Kunitzova typu nebo její varianty jak shora popsáno pro přípravu léčiva pro prevenci nebo léčení onemocnění nebo stavů souvisejících s patologickou proteolýzou proteázami uvolňovanými z přestimulovaných PMN. Jak bylo shora uvedeno, může být výhodné podávat heparin souběžně s TFPI doménou II inhibitoru Kunitzova typu nebo její variantou.
Vedle shora uvedeného farmaceutického použití se TFPI doména II Kunitzova typu nebo její varianta jak shora uvedeno mohou používat pro isolaci užitečných přírodních látek, např. proteáz nebo receptorů z lidského materiálu, které se vážou přímo nebo nepřímo na TFPI doménu II Kunitzova typu, například vyhledáváním testováním nebo afinitní chromatografii.
Příklady provedení vynálezu
Obecná metodika
Standardní DNA techniky byly prováděny tak, jak je to popsáno v literatuře (Sambrook J., Fritsch E. F. a Maniatis T.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
-9CZ 284911 B6
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Syntetické oligonukleotidy byly připraveny na automatickém DNA syntetizátoru (3808, Applied Biosystems) fosforamiditovou chemií na skleněném nosiči s regulovanou velikost pórů (Beaucage S. L. a Caruthers Μ. H.: Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981).). Sekvence DNA byly stanovovány dideoxy technikou (Sanger F., Micklen S., Coulson A. R.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977).). Polymerasové řetězové reakce (PCR) byly prováděny na přístroji DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus).
Analýza aminokyselin byla prováděna po hydrolýze v 6M HC1 při 110 °C ve zkumavce (zatavené ve vakuu) po dobu 24 hodin. Analýzy byly prováděny na automatickém analyzátoru aminokyselin Beckmam 121MB modifikovaném pro práce v mikroměřítku.
Sekvenční analýza aminokyselin zN-konce byla prováděna automatizovanou Edmanovou degradací sekvenátorem Applied Biosystems 470A gas-phase sequencer. Detegování a kvantitativní stanovení uvolněných pTH aminokyselin z každého sekvenčního cyklu se provádí průběžnou analýzou HPLC s obrácenými fázemi.
Molekulové hmotnosti byly stanovovány na hmotovém spektrometru BIO-ION 20 s plasmovou desorpcí (PDMS) s náletovou trubicí o přibližné délce 15 cm, pracujícím v positivním modu. 5 μΐ podíly byly analyzovány při urychlujícím napětí nastaveném na 15 kV. Byly isolovány ionty odpovídající 5 milionům štěpení. Přesnost přiřazení molekulových iontů je pro dobře definovaná maxima přibližně 0,1 %, v ostatních případech je poněkud menší.
Příklad 1
Výroba druhé Kunitzovy domény inhibitoru tkáňového faktoru. TFPI-2 z kvasinkového kmene KFN-1593 cDNA kódující TFPI spinou délkou se isoluje z buněčných linií HepG2 (ATCC HB 8065) odvozených od lidských jater a vloží se jako BamHI-Xbal fragment o 900 párech nukleotidů do savčího expresního vektoru pK.FN-1168, jak je v literatuře popsáno (Pedersen A. H., Nordfang O., Norris F., Wiberg F. C., Christensen P. M., Moeller K. B., Meidahl-Pedersen J., Beck T. C., Norris K., Hedner U., Kisiel W.: J. Biol. Chem. 265, 16786 (1990).). DNA sekvence tohoto insertu je uvedena v sekvenci id. č. 7. TFPI-2 je kodován nukleotidy 365 až 538 jak uvedeno.
TFPI-2:0,l pg BamHI-Xbal fragmentu o 900 párech nukleotidů z pKFN-1168 se použije jako templát v PCR reakci se 100 pmoly obou primerů: NOR-2526 (GCTGAGAGATTGGAGAAGA-GAAAGCCAGATTTCTGCTT)a NOR-2528 (CTGGAATCTAGATTAACCATCTTCACAAA-TGTT). Sedmnáct nukleotidů na 3'-konci NOR-2526 je identických s nukleotidy 365 až 381 v TFPI-2 genu v sekvenci id. č. 7 a 21 nukleotidů na 5'-konci je identických s nukleotidy 215 až 235 v genu syntetického leaderu (viz obr. 2) z níže popsaného pKFN-1000. Primer NOR-2528 je doplňkový k nukleotidům 521 až 540 v sekvenci id. č. 7 a má 5' prodloužení obsahující translační stop kodon následovaný místem Xbal.
PCR reakce se provádí v objemu 100 μΐ pomocí komerční sestavy (GeneAmp. Perkin Elmer Cetus) v následujícím cyklu: 94 °C po dobu 20 sekund, 50 °C po dobu 20 sekund a 72 °C po dobu 30 sekund. Po 19 cyklech byl proveden konečný cyklus, v němž byl stupeň se 72 °C udržován po dobu 10 minut. PCR produkt, fragment o 211 párech nukleotidů, se isoluje elektroforesou na 2 % agarosovém gelu.
Signál-leader: 0,1 pg PvuII fragmentu o 700 párech nukleotidů z níže popsaného pKFN-1000 se použije jako templát v PCR reakci obsahující po 100 pmolů obou primerů: NOR-1478 (GTAAAACGACGGCCAGT) aNOR-2523 (TCTCTTCTCCAATCTCTCAGC). NOR-1478
- 10CZ 284911 B6 páruje sekvenci proti směru vlákna od místa EcoRI v sekvenci id. č. 9. Primer NOR-2523 je doplňkový k 17 nukleotidům na 3' konci syntetického leader genu plasmidu pKFN-1000, viz sekvence id. č. 9. PCR reakce se provede jak shora uvedeno. Získá se tak fragment o 257 párech nukleotidů.
Plasmid pKFN-1000 je derivátem plasmidu pTZ19R (Mead D. A., Szczesna-Skorupa E. aKemper B.: Prot. Engin. 1, 67 (1986).) obsahujícího DNA kódující syntetický kvasinkový signál-leader peptid. Plasmid pKFN-1000 je popsán ve spisu Světového úřadu WO 90/10075. DNA sekvence o 235 párech nukleotidů po směru vlákna od místa EcoRI plasmidu pKFN-1000 a kódovaná sekvence aminokyselin syntetického kvasinkového signál-leaderu je uvedena v sekvenci id. č. 9.
Signál-leader-TFPI-2: Smíchá se přibližně 0,1 pg obou shora popsaných PCR fragmentů. Provede se PCR reakce se 100 pmoly obou primerů NOR-1478 aNOR-2528 a následující cyklus: 94 °C po dobu 1 minuty, 50 °C dvě minuty a 72 °C tři minuty. Po 16 cyklech se provede konečný cyklus, při kterém se teplota 72 °C udržuje 10 minut.
Výsledný fragment o 442 párech nukleotidů se vyčistí elektroforesou na 1 % agarosovém gelu. Potom se rozštěpí působením EcoRI aXbal. Výsledný fragment o 412 párech nukleotidů se liguje s Ncol-Xbal fragmentem o 9500 párech nukleotidů z pMT636 a NcoI-EcoRI fragmentem o 1400 párech nukleotidů zpMT636. Plasmid pMT636 je popsán v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT//DKBB/00138.
Plasmid pMT636 je E. coli-S. cerevisiae vektor pro více hostitelů obsahující Schizosaccharomyces pombe TPI gen (POT) (Russell P. R.: Gene 40, 125 (1985).), S. cerevisiae triosefosfátisomerasový promotor a terminátor. TPIP a TPIT (Alber T. a Kawasaki G.: J. Mol. Appl. Gen. 1, 419(1982).).
Tato ligační směs se použije pro transformaci příslušného kmene E. coli (r~, m+) vybraného pro ampicilinovou resistenci. DNA sekvenování ukázalo, že plasmidy z výsledných kolonií obsahovaly správnou DNA sekvenci pro TFPI-2 správně napojený na syntetický kvasinkový signál-leader gen.
Pro další použití se vybere jeden plasmid pKFN-1605. Konstrukce plasmidu pKFN-1605 je ilustrována na obrázku 1.
Expresní kazeta plasmidu pKFN-1605 obsahuje následující sekvenci:
TPIp - KFNIOOO signál-leader - TFPI2 - TPIT.
DNA sekvence EcoRI-Xbal fragmentu o 412 párech nukleotidů z pKFN-1605 je uvedena v sekvenci id. č. 11.
Transformace kvasinek: S. cervisiae kmen MT663 (E2-78 XE11-36, a/α, deltatpi/deltatpi, pep 4-3/pep 4-3) se nechá růst na YPGaL (1 % Bacto kvasinkový extrakt, 2 % Bacto pepton, 2 % galaktosa, 1 % laktát) na optickou hustotu 0,6 při 600 nm.
100 ml kultury se zpracuje odstřeďováním, promytím vodou (10 ml), opětovným odstřeďováním a resuspendováním v 10 ml roztoku, který obsahuje 1,2 M sorbitol, 25 mM Na2EDTA, pH 8,0, a 6,7 mg/ml dithiothreitolu. Tato suspenze se inkubuje 15 minut při 30 °C, odstřeďuje a buňky se resuspendují v 10 ml roztoku obsahujícího 1,2 M sorbitol, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M citran sodný, pH 5,8, a 2 mg Novozymu(R) 234. Tato suspenze se inkubuje 30 minut při 30 °C, buňky se isolují odstřeďováním, promyjí se 10 ml 1,2M sorbitolu a 10 ml CAS (1,2M sorbitol, 10 mM
- 11 CZ 284911 B6 chlorid vápenatý, lOmM Tris HC1 (Tris znamená tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH 7,5) a resuspendují se ve 2 ml CAS. Pro transformaci se buňky resuspendované vCAS (0,1 ml) smíchají s přibližně 1 pg plasmidu pKFN-1605 a nechají se za teploty místnosti 15 minut. Přidá se 1 ml směsi (20 % polyethylenglykol 4000,20 mM chlorid vápenatý, 10 mM chlorid vápenatý, 10 mM Tris HC1, pH 7,5) a směs se nechá dalších 30 minut za teploty místnosti. Tato směs se pak odstřeďuje. Peleta se resuspenduje v 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33% (obj. díly k obj. dílům) YPD, 6,7 mM chlorid vápenatý, 14 pg/ml leucinu) a inkubuje se 2 hodiny při 30 °C. Suspenze se odstřeďuje. Paleta se resuspenduje v 0,5 ml 1,2 M sorbitolu. Potom se při 52 °C přidá 6 ml vrchního agaru (SC médium podle Shermana aspol.: Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), obsahující 1,2 M sorbitol a 2,5% agar) a suspenze se nalije na povrch desek obsahujících ztuhlý agar a médium obsahující sorbitol.
Transformované kolonie se odeberou po 3 dnech při 30 °C, opět se isolují a použijí se pro nastartování kapalných kultivaceí. Jeden z těchto transformantů KFN-1593 se vybere pro další charakterizaci.
Fermentace: Kvasinkový kmen KFN-1593 se nechá růst na médiu YPD (1 % kvasinkový extrakt, 2 % pepton (od Difco Laboratories) a 3 % glukosa). Jeden litr kultury tohoto kmene se třepe při 30 °C do optické hustoty 24 při 650 nm. Po odstřeďování se supematant isoluje.
Čištění: Hodnota pH kvasinkového supematantu (1000 ml) se kyselinou fosforečnou upraví na 3,0, nanese se na kolonu s nosičem S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, 2,6x3,6 cm) ekvilibrovanou se 25 mM dihydrogenfosforečnanem sodným, pH 3,5. Po promytí ekvilibračním pufrem se TFPI-2 testovaný na aktivitu inhibování trypsinu eluuje pufrem obsahujícím IM chlorid sodný (40 ml). Odsolení se provede na koloně s nosičem Sephadex G-25 (Pharmacia, 2,6x34 cm)) ekvilibrované aeluované hydrogenuhličitanem amonným, pH 7,5. Další čištění se provádí na koloně s nosičem Mono S (Pharmacia, 0,5x5 cm) gradientovou elucí po dobu 23 minut rychlostí 1 ml/minutu od 0 do 0,43 M chloridu sodného v 25mM dihydrogenfosforečnanu sodném s 10% (objemové díly kobj. dílům) acetonitrilu, pH 3,5. N-Glykosylovaný TFPI-2 a neglykosylovaný TFPI-2 se eluovaly 0,20 M a 0,26 M chloridem sodným. Konečné vyčištění neglykosylovaného TFPI-2 se provede na koloně C18 (Novo Nordisk A/S, 0,4x25 cm) HPLC na obrácených fázích gradientovou elucí po dobu 30 minut rychlostí 1 ml/minutu od 0 do 55 % acetonitrilu s 0,1 % kyseliny trifluoroctové.
TFPI-2 se eluuje 40 % acetonitrilem. Vyčištěný produkt se lyofilizuje a znovu se rozpustí ve vodě na koncentraci přibližně 200 nM. Podíly vzorků tohoto roztoku se analyzují na složení aminokyselin (tabulka 1), sekvenci aminokyselin, molekulovou hmotnost (PDMS, molekulová hmotnost: nalezeno: 6840,8, vypočteno: 6840,6 a aktivity inhibitorů proteázy.
Příklad 2
Výroba [R15K, G16A, Y17R, TI91]—TFPI—2 z kvasinkového kmene KFN-1811
Jako templát ve dvou PCR reakcích se použije 0,1 pg Sphl-BamHI fragmentu o 1300 párech nukleotidů kódující TFPI-2 z plasmidu pKFN-1605. V první PCR reakci se použije 100 pmolů obou primerů: NOR-2022 (GGAGTTTAGTGAACTTGC) a M-460 (GTTATAAAATACCTGATAATACGAGCTTTACATATTCCAGGATC). V druhé PCR reakci se použije po 100 pmolech obou primerů: NOR-1495 (TAAGTGGCTCAGAATGA) aM-459 (GATCCTGGAATATGTAAAGCTCGTATTATCAGGTATTTTTATAAC).
NOR-2022 se očkuje v poloze 94 párů nukleotidů po směru vlákna od místa Sphl. M-460 je doplňkový k polohám 263 až 307 TFPI-2 DNA sekvence, sekvence id. č. 11, až na šest
- 12CZ 284911 B6 chybných spárování. NOR-1495 se očkuje do místa 561 párů nukleotidů proti směru vlákna od místa BamHl. M-459 je doplňkový k M-460.
PCR reakce se provádí v objemu 100 μΐ komerční sestavou (GeneAmp. Perkin Elmer Cetus) následujícím cyklem: 95 °C po dobu 1 minuty, 50 °C jednu minutu a 72 °C dvě minuty. Po 24 cyklech se provede konečný cyklus, při kterém se teplota 72 °C udržuje 10 minut. PCR produkty, fragment o 444 párech nukleotidů z první PCR a fragment o 285 párech nukleotidů z druhé reakce, se isolují elektroforesou na 2 % agarosovém gelu.
Smíchá se přibližně 0,1 pg každého z těchto dvou shora popsaných PCR-fragmentů. Provede se PCR reakce se 100 pmoly obou primerů NOR-2022 a NOR-1495 s následujícím cyklem: 95 °C po dobu 1 minuty, 50 °C dvě minuty a 72 °C tři minuty. Po 22 cyklech se provede konečný cyklus, při kterém se teplota 72 °C udržuje 10 minut.
Výsledný fragment o 687 párech nukleotidů se vyčistí elektroforesou na 1 % agarosovém gelu. Potom se rozštěpí působením EcoRI aXbal. Výsledný fragment o 412 párech nukleotidů se liguje s Ncol-Xbal fragmentem o 9500 párech nukleotidů z plasmidu pMT636 a s NcoI-EcoRI fragmentem o 1400 párech nukleotidů z plasmidu pMT636. Plasmid pMT636 je popsán v příkladu 1.
Tato ligační směs se použije pro transformaci příslušného kmene E. coli (r_, m+) vybraného pro ampicilinovou resistenci. DNA sekvenování ukázalo, že plasmidy z výsledných kolonií obsahovaly správnou DNA sekvenci pro [R15K, G16A, Y17R, T19I]-TFPI-2 napojený na syntetický kvasinkový signál-leader gen.
Jeden plasmid pKFN-1798 byl vybrán pro další použití. DNA sekvence EcoRI-Xbal fragmentu o 412 párech nukleotidů z pKFN-1798 je uvedena v sekvenci id. č. 13.
Plasmid pKFN-1798 se transformuje v kvasinkovém kmenu MT663 jak shora popsáno v příkladu 1. Získá se tak kvasinkový kmen K.FN-1811.
Kultivace transformovaného kmenu KFN-1811 v médiu YPD, analýza na [R15K, G16A, Y17R, T191]—TFPI—2 v supematantu a čištění se provádí jak shora popsáno v příkladu 1.
Příklad 3
Inhibice serinových proteinas působením TFPI (doménou II) KFN 1593
KFN 1593 se vyčistí z kultivační kvasinkového média jak shora popsáno v příkladu 1. Koncentrace KFN 1593 se stanoví s použitím 1 % E280nm ~ 8,3 a Mw = 6 500. Vepřový trypsin se získá od Novo Nordisk (Bagsvaerd, Dánsko), hovězí chymotrypsin (zpracovaný TLCK) a vepřový pankreatický kalikrein se získá od firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo., USA). Lidský plasmin a lidský plasmový kalikrein byl od firmy Kabi (Stockholm, Švédsko).
Lidská neutrofilní elastasa a kathepsin G se vyčistí z extraktů PMN podle způsobu popsaného Baughem aTravisem (Biochemistry 15, 836 (1876).). Peptidyl-nitroanilidové substráty S2251, S2586, S2266 a S2302 se získají od Kabi (Stockholm. Švédsko). M4765a S7388 se získá od firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo., USA) a FXa-1 se získá od firmy NycoMed (Oslo, Norsko).
- 13 CZ 284911 B6
Serinové proteinasy se inkubují různými koncentracemi KFN 1593 po dobu 30 minut. Potom se přidá substrát a výsledná proteinasová aktivita se měří při 405 nm. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 2 a na obrázku 3.
Nemodifikovaná TFPI Kunitzova doména II (KFN 1593) je inhibitorem trypsinu (K; = 5,10-9 M) afaktorux(Kj = 150 nM). KFN 1593 vykazuje mírnou inhibici plasminu aneutrofilní elastasy, zatímco inhibice kathepsinu G a kalikreinů v podstatě není přítomna.
Tabulka 1
aminokyselina TFPI-2 teor. Nalezeno
Ala 0 0,31
Cys 6 5,14
Asx 9 8,94
Glx 9 9,25
Phe 5 4,89
Gly 6 6,01
His 0 0,13
Ile 3 2,82
Lys 4 4,12
Leu 3 3,04
Met 1 0,82
Pro 2 2,08
Arg 3 2,86
Ser 0 0,17
Thr 3 2,92
Val 0 0,16
Trp 0 -
Tyr 4 3,75
celkem 58 57,41
Příklad 4
Výroba [R15K, G16A, Y17R, TI91, L39RJ-TFPI-2 z kvasinkového kmene KFN-1867
Jako templát ve dvou PCR reakcích se použije 0,1 pg Sphl-BamHI fragmentu o 1300 párech nukleotidů kódujícího [R15K, G16A, Y17R, T19IJ-TFPI-2 zplasmidu pKFN-1798. V první PCR reakci se použije po 100 pmolech obou primerů: NOR-2022 (GGAGTTTAGTGAACTTGC) a M-462 (CCAGTGTCTCAAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC). V druhé PCR reakci se použije po 100 pmolech obou primerů: NOR-1495 (TAAGTGGCTCAGAATGA) aM-461 (GGTGGATGCAGGGGCAATATGAACAATTTTGAGACACTGG).
NOR-2022 se očkuje v poloze 94 párů nukleotidů po směru vlákna od místa Sphl. M-462 je doplňkový k polohám 341 až 380 TFPI-2 DNA sekvence, sekvence id. č. 11, až na dvě chybná spárování. NOR-1495 se očkuje vmiste 561 párů nukleotidů proti směru vlákna od místa BamHI. M-461 je doplňkový k M-462.
PCR reakce se provádí v objemu 100 μΐ komerční sestavou (GeneAmp. Perkin Elmer Cetus) následujícím cyklem: 95 °C po dobu 1 minuty, 50 °C jednu minutu a 72 °C dvě minuty. Po 24
- 14CZ 284911 B6 cyklech se provede konečný cyklus, při kterém se teplota 72 °C udržuje 10 minut. PCR produkty, fragment o 518 párech nukleotidů z první PCR a fragment o 209 párech nukleotidů z druhé reakce, se isolují elektroforesou na 2 % agarosovém gelu.
Smíchá se přibližně 0,1 pg každého z těchto dvou shora popsaných PCR-fragmentů. Provede se PCR reakce se 100 pmoly obou primerů NOR-2022 aNOR-1495 s následujícím cyklem: 95 °C po dobu 1 minuty, 50 °C dvě minuty a 72 °C tři minuty. Po 22 cyklech se provede konečný cyklus, při kterém se teplota 72 °C udržuje 10 minut.
Výsledný fragment o 687 párech nukleotidů se vyčistí elektroforesou na 1 % agarosovém gelu. Potom se rozštěpí působením EcoRI aXbal. Výsledný fragment o 412 párech nukleotidů se liguje sNcoI-Xbal fragmentem o 9500 párech nukleotidů z plasmidu pMT636 aaNcoI-EcoRI fragmentem o 1400 párech nukleotidů z plasmidu pMT636. Plasmid pMT636 je popsán v příkladu 1.
Tato ligační směs se použije pro transformaci příslušného kmene E. coli (r-, m+) vybraného pro ampicilinovou resistenci. DNA sekvenování ukázalo, že plasmidy z výsledných kolonií obsahovaly správnou DNA sekvenci pro [R15K, G16A, Y17R, T19I, L39RJ-TFPI-2 napojený na syntetický kvasinkový signál-leader gen.
Jeden plasmid pKFN-1861 byl vybrán pro další použití. DNA sekvence EcoRI-Xbal fragmentu o 412 párech nukleotidů z pKFN-1861 je uvedena v sekvenci id. č. 15.
Plasmid pKFN-1861 se transformuje v kvasinkovém kmenu MT663 jak shora popsáno v příkladu 1. Výsledkem je kvasinkový kmen KFN-1867.
Kultivace transformovaného kmene KFN-1867 v médiu YPD, analýza na [R15K, G16A, Y17R, TI91, L39RJ-TFPI-2 v supematantu a čištění se provádějí jak shora popsáno v příkladu 1.
Příklad 5
Výroba [R15K, G16A, Y17R, TI91, L39R, E46K]-TFPI-2 z kvasinkového kmene KFN-1868
Jako templát ve dvou PCR reakcích se použije 0,1 pg Sphl-BamHI fragmentu o 1300 párech nukleotidů kódujícího [R15K, G16A, Y17R, T19IJ-TFPI-2 z plasmidu pKFN-1798. V první PCR reakci se použije 100 pmolů obou primerů: NOR-2022 (GGAGTTTAGTGAACTTGC) a M-464 (CCAGTGTCTTAAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC). V druhé PCR reakci se použije po 100 pmolech obou primerů: NOR-1495 (TAAGTGGCTCAGAATGA) a M—463 (GGTGGATGCAGGGGCAATATGAACAATTTTAAGACACTGG).
NOR-2022 se očkuje v poloze 94 párů nukleotidů po směru vlákna od místa Sphl. M-464 je doplňkový k polohám 341 až 380 TFPI-2 DNA sekvence, sekvence id. č. 11, až na tři chybná spárování. NOR-1495 se očkuje do místa 561 párů nukleotidů proti směru vlákna od místa BamHI. M-463 je doplňkový k M-464.
PCR reakce se provádí v objemu 100 μΐ komerční sestavou (GeneAmp. Perkin Elmer Cetus) následujícím cyklem: 95 °C po dobu 1 minuty, 50 °C jednu minutu a 72 °C dvě minuty. Po 24 cyklech se provede konečný cyklus, při kterém se stupeň s teplotou 72 °C udržuje 10 minut. PCR produkty, fragment o 518 párech nukleotidů z první PCR a fragment o 209 párech nukleotidů z druhé reakce, se isolují elektroforesou na 2 % agarosovém gelu.
- 15 CZ 284911 B6
Smíchá se přibližně 0,1 pg každého z těchto dvou shora popsaných PCR-fragmentů. Provede se PCR reakce se 100 pmoly obou primerů NOR-2022 aNOR-1495 s následujícím cyklem: 95 °C po dobu 1 minuty, 50 °C dvě minuty a 72 °C tři minuty. Po 22 cyklech se provede konečný cyklus, při kterém se stupeň s teplotou 72 °C udržuje 10 minut.
Výsledný fragment o 687 párech nukleotidů se vyčistí elektroforesou na 1 % agarosovém gelu. Potom se rozštěpí působením EcoRI a Xbal. Výsledný fragment o 412 párech nukleotidů se liguje sNcoI-Xbal fragmentem o 9500 párech nukleotidů z plasmidu pMT636 asNcoI-EcoRI fragmentem o 1400 párech nukleotidů z plasmidu pMT636. Plasmid pMT636 je popsán v příkladu 1.
Tato ligační směs se použije pro transformaci příslušného kmene E. coli (r~, m+) vybraného pro ampicilinovou resistenci. DNA sekvenování ukázalo, že plasmidy z výsledných kolonií obsahovaly správnou DNA sekvenci pro [R15K, G16A, Y17R, T19I, L39R, E46KJ-TFPI-2 napojený na syntetický kvasinkový signál-leader gen.
Jeden plasmid pKFN-1862 byl vybrán pro další použití. DNA sekvence EcoRI-Xbal fragmentu o 412 párech nukleotidů z pKFN-1862 je uvedena v sekvenci id. č. 17.
Plasmid pKFN-1862 se transformuje v kvasinkovém kmenu MT663 jak shora popsáno v příkladu 1. Výsledkem je kvasinkový kmen KFN-1868.
Kultivace transformovaného kmene KFN-1868 v médiu YPD, analýza na [R15K, G16A, Y17R, T19I, L39R, E46KJ-TFPI-2 v supematantu a čištění se provádějí jak shora popsáno v příkladu 1.
Příklad 6
Násobná mutace TFPI-2 v poloze 15 a 16
Jako templát ve dvou PCR reakcích se použije 0,1 pg Sphl-BamHI fragmentu o 1300 párech nukleotidů z plasmidu pKFN-1605. V první PCR reakci se použije 100 pmolů obou primerů: NOR-2022 (GGAGTTTAGTGAACTTGC) aM-749 (AATACCTGGTAATATAA(C/G)C(C/G)A(A/C)ACATATTCCAGGATC). V druhé PCR reakci se použije po 100 pmolech obou primerů: NOR-1495 (TAAGTGGCTCAGAATGA) a M-750 (GATCCTGGAATATGT(T/G)T(C/G)G(C/G)TTATATTACCAGGTATT). NOR-2022 se očkuje v poloze 94 párů nukleotidů po směru vlákna od místa Sphl. M-749 je doplňkový k polohám 263 až 299 TFPI-2 DNA sekvence, sekvence id. č. 11, až na čtyři chybná spárování. NOR-1495 se očkuje do místa 561 párů nukleotidů proti směru vlákna od místa BamHI. M-750 je doplňkový k M-749.
PCR reakce se provádí v objemu 100 μΐ komerční sestavou (GeneAmp. Perkin Elmer Cetus) následujícím cyklem: 95 °C po dobu 1 minuty, 50 °C jednu minutu a 72 °C dvě minuty. Po 24 cyklech se provede konečný cyklus, při kterém se stupeň s teplotou 72 °C udržuje 10 minut. PCR produkty, fragment o 439 párech nukleotidů z první PCR a fragment o 285 párech nukleotidů z druhé reakce, se isolují elektroforesou na 2 % agarosovém gelu.
Smíchá se přibližně 0,1 pg každého z těchto dvou shora popsaných PCR-fragmentů. Provede se PCR reakce se 100 pmoly obou primerů NOR-2022 aNOR-1495 s následujícím cyklem: 95 °C po dobu 1 minuty, 50 °C dvě minuty a 72 °C tři minuty. Po 22 cyklech se provede konečný cyklus, při kterém se stupeň s teplotou 72 °C udržuje 10 minut.
- 16CZ 284911 B6
Výsledný fragment o 687 párech nukleotidů se vyčistí elektroforesou na 1 % agarosovém gelu. Potom se rozštěpí působením EcoRI aXbal. Výsledný fragment o 412 párech nukleotidů se liguje s EcoRI-Xbal fragmentem o 2800 párech nukleotidů z plasmidu pTZI9R (Mead D. A., Szczesna-Skopura E., Kemper Β.: B. Prot. Engin. 1, 67 (1986).).
Tato ligační směs se použije pro transformaci příslušného kmene E. coli (r, m+) vybraného pro ampicilinovou resistenci. DNA sekvenováním bylo identifikováno následujících šest plasmidů kódujících uvedené analogy TFPI-2 napojené na syntetický kvasinkový signál-leader gen:
plasmid analog
pKFN-1885 [R15FJ-TFPI-2
pKFN-1883 [R15 F, G16A]-TFPI-2
pKFN-1905 [R15LJ-TFPI-2
pKFN-1882 [R15L, G16A]-TFPI-2
pKFN-1887 [R15V]-TFPI-2
pKFN-1886 [R15 V, G16AJ-TFPI-2
EcoRI-Xbal fragmenty o 412 párech nukleotidů z těchto plasmidů se použijí pro zkonstruování expresních plasmidů jak shora popsáno v příkladu 1.
Transformace kvasinkového kmene MT-663 podle postupu shora popsaného v příkladu 1 vede k následujícím kvasinkovým kmenům:
kvasinkový kmen analog
KFN-1896 [R15FJ-TFPI-2
KFN-1894 [R15 F, G16AJ-TFPI-2
KFN-1928 [R15LJ-TFPI-2
KFN-1893 [R15L, G16AJ-TFPI-2
KFN-1898 [R15VJ-TFPI-2
KFN-1897 [R15 V, G16A]-TFPI-2
Kultivace transformovaných kvasinkových kmenů v médiu YPD, analýza supematantu na analogy TFPI-2 a čištění se provádějí jak shora popsáno v příkladu 1.
Příklad 8 s
Inhibice serinových proteinas TFPI (doménou II) KFN 1811, 1867 a 1868
Z kvasinkového kultivačního média se vyčistí tři TFPI (doména II) varianty. Jejich koncentrace se stanoví z absorbance při 214 nm s BPTI jako standardem. Konečná koncentrace se stanoví titrací trypsinem. Vepřový trypsin a lidské rekombinantní proteiny, faktor Vila, aktivovaný aprotin C (ACP) atPA se získají od Novo Nordisk A/S (Bagsvaerd. Dánsko) stejně jako lidský trombin. Hovězí chymotrypsin agrandulámí kalikrein se získají od firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo., USA). Lidský useknutý rekombinantní tkáňový faktor se získá od firmy Corvas (San Diego, Ka., USA). Lidský neutrofilní kathepsin G se vyčistí z extraktů PMN podle způsobu popsaného Baughem aTravisem (Biochemistry 15, 836 (1976).). Lidský plasmin je od firmy Kabi (Stockholm, Švédsko), uPA od firmy Serono (Milán, Itálie), lidský faktor Xa je dar Dr. W. Kisiela (Albuquerque, N. M., USA) a lidský plasmový kalikrein je dar od Dr. I. Schousboe (Kodaň, Dánsko).
- 17CZ 284911 B6
Peptidylnitroanilidové substráty S2251, S2302, S2266, S2586, S2288, S2444, S2366 a S2238 se získají od firmy Kabi (Stockholm, Švédsko), S7388 aM4765 se získají od firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo., USA) a FXa-1 se získá od firmy Nycomed (Oslo, Norsko).
Serinové proteinasy se inkubují různými koncentracemi varianty Kunitzovy domény po dobu 30 minut. Potom se přidá substrát (0,6 mM) a výsledná proteinasová aktivita se měří při 405 nm. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.
Tyto tři varianty jsou silnými specifickými inhibitory plasminu bez významné inhibice jiných 10 proteinás s testované plasmy.
Tabulka 1
enzym konc. enzymu substrát KFNIB11 zdánlivá K, (nM)
KFN 1867 KFN 1868
trypsin 10 nM S2251 «1 «1 «1
plasmin 4nM S2251 3 3 3
n. elastasa 10 nM M4765 n.i. n.i. n.i.
n. kathepsin G 50 nM S7388 m.i. n.i. n.i.
pl. kalikrein 3 nM S2302 >100 >100 >100
gl. kalikrein 1 j./ml S2266 >100 >100 >100
chymotrypsin 2,5 nM S2586 10 20 20
tPA 10 nM S2288 n.i. n.i. n.i.
faktor VIIa/TF 10 nM/ /15 nM FXa-1 n.i. n.i. n.i.
faktor Xa 3 nM FXa-1 n.i. n.i. n.i.
uPA 5nM S2444 n.i. n.i. n.i.
APC 5 nM S2366 n.i. n.i. n.i.
thrombin 3NIHu/ml S2238 n.i. n.i. n.i.
Příklad 9
Inhibice serinových proteinás TFPI (doména II) KFN 1893, 1897, 1898 a 1928
Z kvasinkového kultivačního média se vyčistí čtyři varianty. Jejich koncentrace se stanoví zabsorbance při 214 nm s BPTI jako standardem. Vepřový trypsin se získá od Novo Nordisk A/S (Bagsvaerd, Dánsko), hovězí chymotrypsin (zpracovaný TLCK) se získá od firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo., USA). Lidský useknutý rekombinantní tkáňový faktor se získá od 25 firmy Corvas (San Diego, Ka., USA). Lidský plasmin se získá od firmy Kabi (Stockholm, Švédsko). Lidský neutrofilní kathepsin G aelastasa se vyčistí z extraktů PMN podle způsobu popsaného Baughem a Travisem (Biochemistry 15, 836 (1976).).
Peptidyl-nitroanilidové substráty S2251 a S2586 se získají od firmy Kabi (Stockholm, Švédsko), 30 S7388 a M4765 se získají od firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo., USA).
Serinové proteinasy se inkubují různými koncentracemi variant po dobu 30 minut. Potom se přidá substrát (0,6 nM) a zbytková proteinasová aktivita se měří při 405 nm. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.
Bylo zjištěno, že tyto čtyři varianty TFPI Kunitzovy domény II (KFN 1893, 1897, 1898, 1928) jsou silnými inhibitory neutrofilní elastasy.
- 18CZ 284911 B6
Tabulka 2
enzym konc. enzymu substrát zdánlivá K, (nM)
KFN1893 KFN1897 KFN1898 KFN1928
trypsin 10 nM S2251 n.i. n.i. n.i. n.i.
chymotrypsin 2,5 nM S2586 <5 w.i. w.i. <5 n.
elastasa 4nM M4765 0,23 0,46 0,35 2,2
n. kathepsin G 50 nM S7388 n.i. n.i. n.i. n.i.
plasmin 4nM S2251 n.i. n.i. n.i. n.i.
n.i. znamená žádnou inhibici při koncentraci menší než 1 μΜ
w.i. znamená slabou inhibici při 100 nM
Seznam sekvencí (1) Obecné informace:
(i) Žadatel:
(A) jméno: Novo Nordisk A/S (B) ulice: Novo Alle (C) město: Bagsvaerd (E) země: Dánsko (F) poštovní směrovací číslo: DK-2880 (G) telefon: +45 4444 8888 (H) fax: +45 4449 3256 (I) telex: 37304 (ii) Název vynálezu: Lidská varianta inhibitoru proteázy Kunitzova typu (iii) Počet sekvencí: 18 (iv) Počítačová čtecí forma:
(A) typ média: floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) počítačový program (software): Patentln Release č. 1,0, verse č. 1,25 (EPO) (2) Informace o sekvenci id. č. 1:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 57 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (vi) původní zdroj:
(A) organismus: syntetický (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 1:
- 19CZ 284911 B6
Xaa 1 Asp Phe Cys Phe 5 Leu Glu Glu Asp Xaa 10 Gly Xaa Cys Xaa Xaa 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu
20 25 30
Arg Phe Xaa Tyr Gly Gly Cys Xaa Xaa Xaa Met Asn Asn Phe Xaa
35 40 45
Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Xaa
55 (2) Informace o sekvenci id. č. 2:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 57 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (vi) původní zdroj:
(A) organismus: syntetický (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 2:
Xaa 1 Asp Phe Cys Phe 5
Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 20
Arg Phe Xaa Tyr Gly 35
Thr Leu Glu Glu Cys 50
Leu Glu Glu Asp Xaa 10 Gly Xaa Cys Xaa Xaa 15
Phe Tyr Asn Xaa Gin Xaa Lys Gin Cys Glu
25 30
Gly Cys Xaa Xaa Xaa Met Asn Asn Phe Xaa
40 45
Lys Asn Ile Cys Glu Asp Xaa
55
(2) Informace o sekvenci id. č. 3:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 58 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (vi) původní zdroj:
(A) organismus: syntetický (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 3:
Lys 1 Pro Asp Phe Cys 5 Phe
Ala Arg Ile Thr Arg 20 Tyr
Glu Arg Phe Lys Tyr 35 Gly
Glu Thr Leu Glu Glu 50 Cys
Leu Glu Glu Asp 10 Pro Gly Ile Cys Lys 15
Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys
25 30
Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe
40 45
Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
55
-20CZ 284911 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 4:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 58 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (vi) původní zdroj:
(A) organismus: syntetický (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 4:
Lys 1 Pro Asp Phe Cys 5 Phe Leu Glu Glu Asp 10 Pro Gly Ile Cys Lys 15
Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys
20 25 30
Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe
35 40 45
Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
55 (2) Informace o sekvenci id. č. 5:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 58 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (vi) původní zdroj:
(A) organismus: syntetický (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 5:
Lys 1 Pro Asp Phe Cys 5 Phe Leu Glu Glu Asp 10 Pro Gly Ile Cys Lys 15
Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys
20 25 30
Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe
35 40 45
Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
50 55
(2) Informace o sekvenci id. č. 6:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 58 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (vi) původní zdroj:
-21 CZ 284911 B6 (A) organismus: syntetický (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 6:
Lys 1 Pro Asp Phe Cys 5 Phe Leu Glu Glu Asp 10 Pro Gly Pro Cys Lys 15
Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys
20 25 30
Glu Arg Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Met Asn Asn Phe
35 40 45
Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
50 55
(2) Informace o sekvenci id. č. 7:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 945 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Homo sapiens (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 365. .538 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 7:
GGATCCGAAT TCCACCATGA AGAAAGTACA TGCACTTTGG GCTTCTGTAT 50
GCCTGCTGCT TAATCTTGCC CCTGCCCCTC TTAATGCTGA TTCTGAGGAA 100
GATGAAGAAC ACACAATTAT CACAGATACG GAGTTGCCAC CACTGAAACT 150
TATGCATTCA TTTTGTGCAT TCAAGGCGGA TGATGGCCCA TGTAAAGCAA 200
TCATGAAAAG ATTTTTCTTC AATATTTTCA CTCGACAGTG CGAAGAATTT 250
ATATATGGGG GATGTGAAGG AAATCAGAAT CGATTTGAAA GTCTGGAAGA 300
GTGCAAAAAA ATGTGTACAA GAGATAATGC AAACAGGATT ATAAAGACAA 350
CATTGCAACA AGAA AAG CCA GAT TTC TGC TTT TTG GAA GAA GAT 394
Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp
1 5 10
CCT GGA ATA TGT CGA GGT TAT ATT ACC AGG TAT TTT TAT AAC 436
Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn
15 20
AAT CAG ACA AAA CAG TGT GAA CGT TTC AAG TAT GGT GGA TGC 478
Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys
25 30 35
CTG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA CTG GAA GAA TGC AAG 520
Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys
40 45 50
-22CZ 284911 B6
AAC ATT TGT GAA GAT GGT CCGAATGGTT TCCAGGTGGA TAATTATGGA 568
Asn Ile Cys 55 Glu Asp Gly
ACCCAGCTCA ATGCTGTGAA TAACTCCCTG ACTCCGCAAT CAACCAAGGT 618
TCCCAGCCTT TTTGAATTTC ACGGTCCCTC ATGGTGTCTC ACTCCAGCAG 668
ACAGAGGATT GTGTCGTGCC AATGAGAACA GATTCTACTA CAATTCAGTC 718
ATTGGGAAAT GCCGCCCATT TAAGTACAGT GGATGTGGGG GAAATGAAAA 768
CAATTTTACT TCCAAACAAG AATGTCTGAG GGCATGTAAA AAAGGTTTCA 818
TCCAAAGAAT ATCAAAAGGA GGCCTAATTA AAACCAAAAG AAAAAGAAAG 868
AAGCAGAGAG TGAAAATAGC ATATGAAGAG ATCTTTGTTA AAAATATGTG 918
AATTTGTTAT AGCAATGTAA CTCTAGA 945
(2) Informace o sekvenci id. č. 8:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 58 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 8:
Lys 1 Pro Asp Phe Cys 5 Phe Leu Glu Glu Asp 10 Pro Gly Ile Cys Arg 15
Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys
20 25 30
Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe
35 40 45
Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly
50 55
(2) Informace o sekvenci id. č. 9:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 235 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj:
(A) organismus: syntetický (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 77. .235 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 5:
-23CZ 284911 B6
GAATTCCATT
CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA
CTATCAATT T
CATACACAAT ATAAACGACC AAAAGA GTT Met 1 ATG Lys AAG Ala GCT Val GTT Phe 5 TTC Leu TTG Val 97
TTG TCC TTG ATC GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC 139
Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Val Thr Gly
10 15 20
GAT GAA TCA TCT GTT GAG ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC 181
Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile
25 30 35
GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC GTC GCC ATG GCT GAG AGA 223
Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu Arg
45
TTG GAG AAG
AGA
235
Leu Glu Lys Arg (2) Informace o sekvenci id. č. 10:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 53 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 10:
Met 1 Lys Ala Val Phe 5 Leu Val Leu Ser Leu 10 Ile Gly Phe Cys Trp 15
Ala Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu
20 25 30
Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala
35 40 45
Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg
(2) Informace o sekvenci id. č. 11:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 418 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj:
-24CZ 284911 B6 (A) organismus: syntetický/lidský (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: ΊΊ. .409 (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: sig_peptid (B) umístění: 77. .235 (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: mat_peptid ίο (B) umístění: 236. .409 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 11:
GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT 50
CATACACAAT ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT 97
Met Lys Ala Val Phe Leu Val
-53 -50
TTG TCC TTG ATC GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC 139
Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Val Thr Gly
-45 -40 -35
GAT GAA TCA TCT GTT GAG ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC 181
Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile
-30 -25 -20
GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC GTC GCC ATG GCT GAG AGA 223
Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu Arg
-15 -10 -5
TTG GAG AAG AGA AAG CCA GAT TTC TGC TTT TTG GAA GAA GAT 5
Leu Glu Lys Arg Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp
1 5 10
CCT GGA ATA TGT CGA GGT TAT ATT ACC AGG TAT TTT TAT AAC 307
Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn
15 20
AAT CAG ACA AAA CAG TGT GAA CGT TTC AAG TAT GGT GGA TGC 349
Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys
25 30 35
CTG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA CTG GAA GAA TGC AAG 391
Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys
40 45 50
AAC ATT TGT GAA GAT GGT TAATCTAGA 418
Asn Ile Cys Glu Asp Gly
-25CZ 284911 B6 (2) Informace o sekvenci id. č. 12:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 111 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence id.č. 12:
Met -53 Lys Ala Val -50 Phe Leu Val Leu Ser -45 Leu Ile Gly Phe Cys -35 Trp
Ala Gin Pro Val -30 Thr Gly Asp Glu Ser -30 Ser Val Glu Ile Pro -25 Glu
Glu Ser Leu Ile -20 Ile Ala Glu Asn Thr -15 Thr Leu Ala Asn Val -10 Ala
Met Ala Glu Arg -5 Leu Glu Lys Arg Lys 1 Pro Asp Phe Cys Phe 5 Leu
Glu Glu Asp 10 Pro Gly Ile Cys Arg 15 Gly Tyr Ile Thr Arg 20 Tyr Phe
Tyr Asn Asn 25 Gin Thr Lys Gin Cys 30 Glu Arg Phe Lys Tyr 35 Gly Gly
Cys Leu Gly 40 Asn Met Asn Asn Phe 45 Glu Thr Leu Glu Glu 50 Cys Lys
Asn Ile Cys Glu Asp Gly
(2) Informace o sekvenci id. č. 13:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 418 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj:
(A) organismus: syntetický (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 77. .409 (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: sig_peptid (B) umístění: 77. .235
-26CZ 284911 B6 (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: mat_peptid (B) umístění: 236. .409 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 13:
GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT 50
CATACACAAT ATAAACGACC AAAAGA ATG Met -53 AAG GCT GTT Val -50 TTC Phe TTG Leu GTT Val 97
Lys Ala
TTG TCC TTG ATC GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC 139
Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Val Thr Gly
-45 -40 -35
GAT GAA TCA TCT GTT GAG ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC 181
Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile
-30 -25 -20
GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC GTC GCC ATG GCT GAG AGA 223
Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu Arg
-15 -10 -5
TTG GAG AAG AGA AAG CCA GAT TTC TGC TTT TTG GAA GAA GAT 5
Leu Glu Lys Arg Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp
1 5 10
CCT GGA ATA TGT AAA GCT CGT ATT ATC AGG TAT TTT TAT AAC 307
Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn
15 20
AAT CAG ACA AAA CAG TGT GAA CGT TTC AAG TAT GGT GGA TGC 349
Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys
25 30 35
CTG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA CTG GAA GAA TGC AAG 391
Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys
40 45 50
AAC ATT TGT GAA GAT GGT TAATCTAGA 418
Asn Ile Cys Glu Asp Gly
(2) Informace o sekvenci id. č. 14:
(i) Vlastnosti sekvence:
ío (A) délka: 111 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 14:
-27CZ 284911 B6
Met -53 Lys Ala Val -50 Phe Leu Val Leu Ser -45 Leu Ile Gly Phe Cys -35 Trp
Ala Gin Pro Val -30 Thr Gly Asp Glu Ser -30 Ser Val Glu Ile Pro -25 Glu
Glu Ser Leu Ile -20 Ile Ala Glu Asn Thr -15 Thr Leu Ala Asn Val -10 Ala
Met Ala Glu Arg -5 Leu Glu Lys Arg Lys 1 Pro Asp Phe Cys 5 Phe Leu
Glu Glu Asp 10 Pro Gly Ile Cys Lys 15 Ala Arg Ile Ile Arg 20 Tyr Phe
Tyr Asn Asn 25 Gin Thr Lys Gin Cys 30 Glu Arg Phe Lys Tyr 35 Gly Gly
Cys Leu Gly 40 Asn Met Asn Asn Phe 45 Glu Thr Leu Glu Glu 50 Cys Lys
Asn Ile Cys Glu Asp Gly (2) Informace o sekvenci id. č. 15:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 418 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj:
(A) organismus: syntetický (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 77. .409 (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: sig_peptid (B) umístění: 77. .235 (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: mat_peptid (B) umístění: 236. .409 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 15:
-28CZ 284911 B6
GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT 50
CATACACAAT ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC Phe TTG Leu GTT Val 97
Met -53 Lys Ala Val -50
TTG TCC TTG ATC GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC 139
Leu Ser -45 Leu Ile Gly Phe Cys ^10 Trp Ala Gin Pro Val -35 Thr Gly
GAT GAA TCA TCT GTT GAG ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC 181
Asp Glu Ser -30 Ser Val Glu Ile Pro -25 Glu Glu Ser Leu Ile -20 Ile
GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC GTC GCC ATG GCT GAG AGA 223
Ala Glu Asn Thr -15 Thr Leu Ala Asn Val -10 Ala Met Ala Glu Arg -5
TTG GAG AAG AGA AAG CCA GAT TTC TGC TTT TTG GAA GAA GAT 5
Leu Glu Lys Arg Lys 1 Pro Asp Phe Cys 5 Phe Leu Glu Glu Asp 10
CCT GGA ATA TGT AAA GCT CGT ATT ATC AGG TAT TTT TAT AAC 307
Pro Gly Ile Cys Lys 15 Ala Arg Ile Ile Arg 20 Tyr Phe Tyr Asn
AAT CAG ACA AAA CAG TGT GAA CGT TTC AAG TAT GGT GGA TGC 349
Asn 25 Gin Thr Lys Gin Cys 30 Glu Arg Phe Lys Tyr 35 Gly Gly Cys
AGG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA CTG GAA GAA TGC AAG 391
Arg Gly 40 Asn Met Asn Asn Phe 45 Glu Thr Leu Glu Glu 50 Cys Lys
AAC ATT TGT GAA GAT GGT TAATCTAGA 418
Asn Ile Cys Glu Asp Gly
(2) Informace o sekvenci id. č. 16:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 111 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (i i) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 16:
-29CZ 284911 B6
Met -53 Lys Ala Val -50 Phe Leu Val Leu Ser -45 Leu Ile Gly Phe Cys -35 Trp
Ala Gin Pro Val -30 Thr Gly Asp Glu Ser -30 Ser Val Glu Ile Pro -25 Glu
Glu Ser Leu Ile -20 Ile Ala Glu Asn Thr -15 Thr Leu Ala Asn Val -10 Ala
Met Ala Glu Arg -5 Leu Glu Lys Arg Lys 1 Pro Asp Phe Cys 5 Phe Leu
Glu Glu Asp 10 Pro Gly Ile Cys Lys Ala 15 Arg Ile Ile Arg 20 Tyr Phe
Tyr Asn Asn 25 Gin Thr Lys Gin Cys Glu 30 Arg Phe Lys Tyr 35 Gly Gly
Cys Arg Gly 40 Asn Met Asn Asn Phe Glu 45 Thr Leu Glu Glu 50 Cys Lys
Asn Ile Cys Glu Asp Gly (2) Informace o sekvenci id. č. 17:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 418 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj:
(A) organismus: syntetický (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 77. .409 (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: sig_peptid (B) umístění. 77. .235 (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: mat_peptid (B) umístění: 236. .409 (i) popis sekvence: sekvence id. č.
-30CZ 284911 B6
GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT
CATACACAAT ATAAACGACC AAAAGA ATG Met -53 AAG GCT GTT TTC Phe TTG Leu GTT Val 97
Lys Ala Val -50
TTG TCC TTG ATC GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC 139
Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala Gin Pro Val Thr Gly
-45 ^10 -35
GAT GAA TCA TCT GTT GAG ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC 181
Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile
-30 -25 -20
GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC GTC GCC ATG GCT GAG AGA 223
Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu Arg
-15 -10 -5
TTG GAG AAG AGA AAG CCA GAT TTC TGC TTT TTG GAA GAA GAT 5
Leu Glu Lys Arg Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp
1 5 10
CCT GGA ATA TGT AAA GCT CGT ATT ATC AGG TAT TTT TAT AAC 307
Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn
15 20
AAT CAG ACA AAA CAG TGT GAA CGT TTC AAG TAT GGT GGA TGC 349
Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys
25 30 35
AGG GGC AAT ATG AAC AAT TTT AAG ACA CTG GAA GAA TGC AAG 391
Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys
40 45 50
AAC ATT TGT GAA GAT GGT TAATCTAGA 418
Asn Ile Cys Glu Asp Gly
(2) Informace o sekvenci id. č. 18:
(i) Vlastnosti sekvence:
(A) délka: 111 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (i) popis sekvence: sekvence id. č. 1
-31 CZ 284911 B6
Met Lys -53 Ala Val -50 Phe Leu Val Leu Ser -45 Leu Ile Gly Phe Cys -35 Trp
Ala Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu
-30 -30 -25
Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala
-20 -15 -10
Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu
-5 1 5
Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe
10 15 20
Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly
25 30 35
Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys
40 45 50
Asn Ile Cys Glu Asp Gly

Claims (42)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Varianta lidské domény II inhibitoru proteázy Kunitzova typu inhibitoru tkáňového faktoru TFPI, obsahující následující sekvenci aminokyselin
    X1 Asp Phe Cys Phe Leu Glu Asp X2 Gly X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn X16 Gin X17 Lys Gin Cys Glu Arg Phe X10 Tyr Gly Gly Cys X11 X12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X15 (sekvence id. č. 2), v níž X1 znamená atom vodíku nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys, X2 až X14 znamenají nezávisle na sobě zbytek přirozeně se vyskytující aminokyseliny, X15 znamená hydroxylovou skupinu nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys s tím, že alespoň jeden z aminokyselinových zbytků X1 až X15 znamená jiný zbytek aminokyseliny než je odpovídající zbytek aminokyseliny přirozené sekvence, X16 znamená Asn, Gin, Gly, Ala, Ser, Val, nebo Phe a X17 znamená Thr nebo Ala, stou výjimkou, že alespoň jeden z aminokyselinových zbytků X1 až X15 se liší od odpovídajícího aminokyselinového zbytku přirozené sekvence a s tím, že X4 má jiný význam než Leu.
  2. 2. Varianta podle nároku 1, obsahující následující sekvenci aminokyselin
    X1 Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X2 Gly X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe X10 Tyr Gly Gly Cys X11 X12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X15 (sekvence id. č. 1),
    -32CZ 284911 B6 v níž X1 je atom vodíku nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys, X2 až X14 znamenají nezávisle na sobě zbytek přirozeně se vyskytující aminokyseliny a X15 znamená hydroxylovou skupinu nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys s tím, že alespoň jeden z aminokyselinových zbytků X1 až X15 znamená jiný zbytek aminokyseliny než je odpovídající zbytek aminokyseliny přirozené sekvence a dále s tím, že X4 má jiný význam než Leu.
  3. 3. Varianta podle nároku 2, v níž X1 je Lys-Pro.
  4. 4. Varianta podle nároku 2, v níž X2 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Ala, Arg, Thr, Asp, Pro, Glu, Lys, Gin, Ser, Ile a Val.
  5. 5. Varianta podle nároku 4, v níž X2 je Thr nebo Pro.
  6. 6. Varianta podle nároku 2, v níž X3 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Pro, Thr, Leu, Arg, Val a Ile.
  7. 7. Varianta podle nároku 6, v níž X3 je Pro nebo Ile.
  8. 8. Varianta podle nároku 2, v niž X4 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr, Gin, Asn a Ala.
  9. 9. Varianta podle nároku 8, v níž X4 je Lys, Val, Ile, Thr, Met, Gin nebo Arg.
  10. 10. Varianta podle nároku 2, v níž X3 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Ala, Gly, Thr, Arg, Phe, Gin a Asp.
  11. 11. Varianta podle nároku 10, v níž X3 je Ala, Thr, Asp nebo Gly.
  12. 12. Varianta podle nároku 2, v níž X6 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Arg, Ala, Lys, Leu, Gly, His, Ser, Asp, Gin, Glu, Val, Thr, Tyr, Phe, Asn, Ile a Met.
  13. 13. Varianta podle nároku 12, v níž X6 je Arg, Phe, Ala, Leu nebo Tyr.
  14. 14. Varianta podle nároku 2, v níž X7 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Ile, Met, Gin, Glu, Thr, Leu, Val a Phe.
  15. 15. Varianta podle nároku 14, v níž X7 je Ile.
  16. 16. Varianta podle nároku 2, v níž Xs je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Ile, Thr, Leu, Asn, Lys, Ser, Gin, Glu, Arg, Pro a Phe.
  17. 17. Varianta podle nároku 16, v níž X8 je Ile nebo Thr.
  18. 18. Varianta podle nároku 2, v níž X9 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Arg, Ser, Ala, Gin, Lys a Leu.
  19. 19. Varianta podle nároku 18, v níž X9 je Arg.
  20. 20. Varianta podle nároku 2, v níž X10 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Gin, Pro, Phe, Ile, Lys, Trp, Ala, Thr, Leu, Ser, Tyr, His, Asp, Met, Arg a Val.
    -33 CZ 284911 B6
  21. 21. Varianta podle nároku 20, v níž X10 je Val nebo Lys.
  22. 22. Varianta podle nároku 2, v níž X11 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Gly, Met, Gin, Glu, Leu, Arg, Lys, Pro a Asn.
  23. 23. Varianta podle nároku 22, v níž X11 je Arg nebo Leu.
  24. 24. Varianta podle nároku 2, v níž X12 je Ala nebo Gly.
  25. 25. Varianta podle nároku 2, v níž X13 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Lys, Asn a Asp.
  26. 26. Varianta podle nároku 25, v níž X13 je Lys nebo Asn.
  27. 27. Varianta podle nároku 2, v níž X14 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Val, Tyr, Asp, Glu, Thr, Gly, Leu, Ser, Ile, Gin, His, Asn, Pro, Phe, Met, Ala, Arg, Trp a Lys.
  28. 28. Varianta podle nároku 27, v níž X14 je Lys nebo Glu.
  29. 29. Varianta podle nároku 2, v níž X15 je Gly.
  30. 30. Varianta podle nároku 2, v níž X1 je Lys-Pro a X15 je Gly.
  31. 31. Varianta podle nároku 2 obsahující následujcí sekvenci aminokyselin
    X1 Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X2 Gly X3 Cys X4 X5 X6 X7 X8 X9 Tyr Phe Tyr Asn X16 Gin X17 Lys Gin Cys Glu Arg Phe X10 Tyr Gly Gly Cys X!I X12 X13 Met Asn Asn Phe X14 Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X15 (sekvence id. č. 2), v níž X1 až X15 mají významy uvedené v nároku 2, X16 je zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující Gin, Gly, Ala, Ser, Val a Phe, zejména Gin nebo Ala, a X17 je zbytek aminokyseliny vybraný ze skupiny zahrnující Thr a Ala.
  32. 32. Varianta podle nároku 2 obsahující následující sekvenci aminokyselin
    Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (sekvence id. č. 3).
  33. 33. Varianta podle nároku 2 obsahující následující sekvenci aminokyselin
    Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (sekvence id. č. 4).
  34. 34. Varianta podle nároku 2 obsahující následující sekvenci aminokyselin
    Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Lys Ala Arg Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (sekvence id. č. 5).
  35. 35. Varianta podle nároku 2 obsahující následující sekvenci aminokyselin
    -34CZ 284911 B6
    Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Pro Cys Lys Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Met Asn Asn Phe Lys Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly (sekvence id. č. 6).
  36. 36. DNA konstrukce obsahující DNA sekvenci kódující lidskou variantu inhibitoru proteázy Kunitzova typu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 35.
  37. 37. Rekombinantní expresní vektor obsahující DNA konstrukci podle nároku 36.
  38. 38. Buňka obsahující DNA konstrukci podle nároku 36 nebo expresní vektor podle nároku 37.
  39. 39. Způsob výroby lidské varianty inhibitoru proteázy Kunitzova typu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 35, vyznačující se tím, že se kultivuje buňka podle nároku 38 za podmínek vedoucích k expresi proteinu a výsledný protein se izoluje z kultury.
  40. 40. Farmaceutický přípravek k prevenci nebo léčení onemocnění nebo stavů souvisejících spatologickou proteolýzou, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje lidskou variantu inhibitoru proteázy Kunitzova typu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 35 ve sspojení s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem.
  41. 41. Přípravek podle nároku 40, v y z n a č u j í c í se t í m , že dále obsahuje heparin.
  42. 42. Použití lidské domény II inhibitoru proteázy Kunitzova typu TFPI nebo její varianty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 35 pro přípravu léčiva k prevenci nebo léčení onemocnění nebo stavů souvisejících s patologickou proteolýzou.
CZ941649A 1992-01-07 1993-01-07 Lidská varianta inhibitoru proteasy Kunitzova typu CZ284911B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK9200001 1992-01-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ164994A3 CZ164994A3 (en) 1994-12-15
CZ284911B6 true CZ284911B6 (cs) 1999-04-14

Family

ID=8153770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ941649A CZ284911B6 (cs) 1992-01-07 1993-01-07 Lidská varianta inhibitoru proteasy Kunitzova typu

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5576294A (cs)
EP (1) EP0621871B1 (cs)
JP (1) JP3350549B2 (cs)
KR (1) KR100278036B1 (cs)
AT (1) ATE154938T1 (cs)
AU (1) AU676145B2 (cs)
CA (1) CA2127249A1 (cs)
CZ (1) CZ284911B6 (cs)
DE (1) DE69311893T2 (cs)
ES (1) ES2104121T3 (cs)
FI (1) FI943233A0 (cs)
HU (1) HU218104B (cs)
IL (1) IL104325A (cs)
NO (1) NO942550L (cs)
NZ (1) NZ246569A (cs)
PL (1) PL175422B1 (cs)
WO (1) WO1993014121A1 (cs)
ZA (1) ZA9395B (cs)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060134087A1 (en) * 1988-09-02 2006-06-22 Dyax Corp. ITI-D1 Kunitz domain mutants as hNE inhibitors
US5455338A (en) 1993-11-05 1995-10-03 Zymogenetics, Inc. DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto
ES2227545T3 (es) * 1994-01-11 2005-04-01 Dyax Corporation Proteinas y sus analogos del "dominio de kunitz" inhibidores de calicreina.
US6057287A (en) * 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
PT737207E (pt) * 1994-01-11 2005-02-28 Dyax Corp Inibidores de plasmina humana derivados de dominios kunitz
US5795954A (en) * 1994-03-04 1998-08-18 Genentech, Inc. Factor VIIa inhibitors from Kunitz domain proteins
JP3779728B2 (ja) * 1994-08-05 2006-05-31 カイロン コーポレイション 組織因子活性インヒビターの産生
US5589359A (en) * 1994-08-05 1996-12-31 Chiron Corporation Chimeric proteins
US5780265A (en) * 1995-06-05 1998-07-14 Genentech, Inc. Kunitz type plasma kallikrein inhibitors
US5786328A (en) * 1995-06-05 1998-07-28 Genentech, Inc. Use of kunitz type plasma kallikrein inhibitors
US6242414B1 (en) 1995-06-07 2001-06-05 Chiron Corporation Regulation of cytokine synthesis and release
US20030199450A1 (en) * 2001-04-27 2003-10-23 Chiron Corporation Regulation of cytokine synthesis and release
US6346510B1 (en) 1995-10-23 2002-02-12 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions
KR100356956B1 (ko) 1996-03-11 2003-03-15 베이어 코오포레이숀 사람비쿠닌
JP3819239B2 (ja) * 1998-12-22 2006-09-06 バイエル アクチェンゲゼルシャフト 粘膜線毛クリアランスの速度を促進する方法
US20070140979A1 (en) * 1998-12-22 2007-06-21 Bayer Aktiengesellschaft Method for accelerating the rate of mucociliary clearance
GB9916913D0 (en) * 1999-07-19 1999-09-22 Natural Enviromental Research Inhibitor proteins
US20040054082A1 (en) * 2001-12-03 2004-03-18 Bank David H Toughened polymer blends with improved surface properties
AU2003243394B2 (en) * 2002-06-07 2008-06-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Prevention and reduction of blood loss
US7153829B2 (en) * 2002-06-07 2006-12-26 Dyax Corp. Kallikrein-inhibitor therapies
EP2386310B1 (en) 2002-08-28 2018-11-07 Dyax Corp. Methods for preserving organs and tissues
DE602004031589D1 (de) * 2003-01-07 2011-04-14 Dyax Corp Kunitz-domäne-bibliothek
US6989369B2 (en) 2003-02-07 2006-01-24 Dyax Corp. Kunitz domain peptides
WO2005021557A2 (en) 2003-08-29 2005-03-10 Dyax Corp. Poly-pegylated protease inhibitors
US7235530B2 (en) * 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
US7276480B1 (en) 2005-12-30 2007-10-02 Dyax Corp. Prevention and reduction of blood loss
JP2009529542A (ja) * 2006-03-10 2009-08-20 ダイアックス コーポレーション エカランチドに関する配合物
JP5739816B2 (ja) 2008-12-19 2015-06-24 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ Ｔｆｐｉインヒビターおよび使用法
US8637454B2 (en) 2009-01-06 2014-01-28 Dyax Corp. Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors
CN101798346B (zh) * 2009-02-06 2013-05-29 复旦大学 一种酵母表达的长效重组人组织因子途径抑制物
LT3459564T (lt) 2010-01-06 2022-03-10 Takeda Pharmaceutical Company Limited Plazmos kalikreiną surišantys baltymai
NZ603028A (en) 2010-03-19 2014-11-28 Baxter Healthcare Sa Tfpi inhibitors and methods of use
KR102320178B1 (ko) 2011-01-06 2021-11-02 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 혈장 칼리크레인 결합 단백질
KR101391988B1 (ko) 2011-11-04 2014-05-08 동아대학교 산학협력단 항섬유소용해 기능을 가진 호박벌 독액의 쿠니츠 타입 세린 프로테아제 저해 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 염기서열
KR102263685B1 (ko) 2012-03-21 2021-06-11 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 Tfpi 저해제 및 사용 방법
EP3122782A4 (en) 2014-03-27 2017-09-13 Dyax Corp. Compositions and methods for treatment of diabetic macular edema
AU2016366557B2 (en) 2015-12-11 2024-01-25 Takeda Pharmaceutical Company Limited Plasma kallikrein inhibitors and uses thereof for treating hereditary angioedema attack

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5106833A (en) * 1987-07-23 1992-04-21 Washington University Coagulation inhibitors
DK408089D0 (da) * 1989-08-18 1989-08-18 Novo Nordisk As Proteiner

Also Published As

Publication number Publication date
FI943233A (fi) 1994-07-06
ES2104121T3 (es) 1997-10-01
DE69311893D1 (de) 1997-08-07
US5576294A (en) 1996-11-19
FI943233A0 (fi) 1994-07-06
HU9401991D0 (en) 1994-09-28
HUT70295A (en) 1995-09-28
PL175422B1 (pl) 1998-12-31
IL104325A (en) 2000-10-31
NO942550D0 (no) 1994-07-06
CA2127249A1 (en) 1993-07-22
EP0621871B1 (en) 1997-07-02
AU676145B2 (en) 1997-03-06
JP3350549B2 (ja) 2002-11-25
HU218104B (hu) 2000-06-28
CZ164994A3 (en) 1994-12-15
KR100278036B1 (ko) 2001-01-15
AU3345993A (en) 1993-08-03
NZ246569A (en) 1996-05-28
NO942550L (no) 1994-09-07
JPH07506335A (ja) 1995-07-13
ZA9395B (en) 1993-08-20
DE69311893T2 (de) 1998-02-05
KR940703854A (ko) 1994-12-12
IL104325A0 (en) 1993-05-13
WO1993014121A1 (en) 1993-07-22
EP0621871A1 (en) 1994-11-02
ATE154938T1 (de) 1997-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ284911B6 (cs) Lidská varianta inhibitoru proteasy Kunitzova typu
CZ164494A3 (en) Human variant of kunitz-type protease inhibitor
US5373090A (en) Aprotinin analogues and a process for the production thereof
AU675925B2 (en) A human kunitz-type protease inhibitor variant
AU671611B2 (en) Human kunitz-type protease inhibitor variants
JP3345420B2 (ja) 新規のヒトクニツ型プロテアーゼインヒビター及びその変異体
JPH09509838A (ja) クニッツドメイン拮抗剤蛋白質
JPH05508150A (ja) 酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20030107