KR100278036B1

KR100278036B1 - 사람 쿠니즈형 프로테아제 저해제 변이체

Info

Publication number: KR100278036B1
Application number: KR1019940702351A
Authority: KR
Inventors: 노리스 파니; 노리스 키엘트; 에릭 비외른 쇠렌; 크리스티안 페테르센 라르스; 흐빌스테트 올센 올레
Original assignee: 한센 핀 베네드, 안네 제헤르, 웨이콥 마리안느; 노보 노르디스크 에이/에스
Priority date: 1992-01-07
Filing date: 1993-01-07
Publication date: 2001-01-15
Also published as: PL175422B1; JPH07506335A; HUT70295A; DE69311893D1; ES2104121T3; IL104325A0; JP3350549B2; US5576294A; AU3345993A; CZ164994A3; FI943233A0; DE69311893T2; NO942550D0; NO942550L; EP0621871A1; FI943233A; HU218104B; CZ284911B6; HU9401991D0; NZ246569A

Abstract

조직인자 경로저해제(TFPI)의 사람 쿠니즈형(Kunitz-type) 프로테아제 저해제 도메인 II의 변이체로서, 다음의 아미노산서열

X¹Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp X²Gly X³Cys X⁴X⁵X⁶X⁷X⁸X⁹Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe X¹⁰Tyr Gly Gly Cys X¹¹X¹²X¹³Met Asn Asn Phe X¹⁴Thr Ley Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X¹⁵(SEQ ID NO. 1)로 이루어지며, 여기서 X1은 H 또는 Cys를 제외한 1-5개 자연발생 아미노산잔기를 나타내고, X²-X¹⁴는 각각 독립적으로 자연발생 아미노산잔기를 나타내고, X¹⁵는 OH 또는 Cys를 제외한 1-5개의 자연발생 아미노산잔기를 나타내며, 단 아미노산잔기 X¹-X¹⁵중 적어도 하나는 천연서열의 대응 아미노산 잔기와 다르다.

Description

[발명의 명칭]

사람 쿠니즈형 프로테아제 저해제 변이체

[도면의 간단한 설명]

제1도는 본 발명의 TFPI 쿠니즈형 도메인Ⅱ변이체를 코드화하는 DNA서열을 함유하는 플라스미드 pKFN-1605의 제조를 예시하는 도면,

제2도 및 제3도는 405nm에서 측정한 잔류 세린 프로테이나제활성을 여러농도의 KFN 1593에 대해 도시한 TFPI 쿠니즈 도메인Ⅱ(KFN 1593)에 의한 세린 프로테이나제의 저해활성을 나타내는 그래프이다.

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본 발명은 사람 쿠니즈형 프로테아제 저해제 도메인의 변이체, 변이체를 코드화하는 DNA, 변이체의 제조방법 그리고 변이체를 함유하는 약학조성물에 관한 것이다.

[발명의 배경]

다형핵 백혈구(뉴트로필 또는 PMN) 및 단핵식세포(단구)는 조직상처, 감염, 급성 및 만성염증 및 상처 치유에 중요한 역할을 한다. 세포들은 혈액으로 부터 염증 부위로 이동하고 적당한 자극에 이어서 그것들을 다양한 단백질분해 효소들을 함유하는 입자들뿐만 아니라 산화제화합물들(O₂·, O₂-, H₂0₂및 HOCI)을 방출한다. 분비과립은 그중에서도 알칼리성 포스파타제, 젤라티나제 및 콜라게나제와 같은 메탈로프로테이나제 그리고 뉴트로필엘라스타제, 카텝신 G 및 프로테이나제 3과 같은 세린프로테아제를 함유한다.

잠재적 메탈로프로테이나제는 메타로프로테이나제의 조직저해제(TIMP)와 함께 방출된다. 활성화 메카니즘은 충분히 밝혀지지 않았으나 티올기의 산화 및/또는 단백질분해가 그 과정에서 역할을 하는것 같다. 또한, 유리의 메타로프로테이나제 활성은 TIMP의 불활성화에 의존한다.

백혈구의 아주로필(azurophil) 과립에서, 세린프로테아제 뉴트로필엘라스타제, 카텝신 G 및 프로테이나제-3은 글루코사미노글리칸과 복합체로된 활성효소로서 충전된다. 이들 복합체는 불활성이나, 분비시 해리하여 활성효소를 방출한다. 프로테아제활성을 중화시키기 위해, 다량의 저해제들 α₁-프로테이나제 저해제(α₁-PI) 및 α₁-키모트립신 저해제(α₁-ChI)가 혈장에서 발견된다.그러나, PMN은 국소적으로 저해제를 불활성화 시킬 수 있다. 따라서, 뉴트로필 엘라스타제의 가장 중요한 저해제인 α₁-PI는 계기가된 PMN에 의해 생성된 산소대사물에 의해 반응성중심(Met-358)에서 산화에 민감하다. 이것은 뉴트로필 엘라스타제에 대한 α₁-PI의 친화도를 대략 2000배 감소시킨다.

α₁-PI의 국소중화후, 엘라스타제는 많은 다른 단백질분해 효소의 저해제들을 분해시킬 수 있다. 엘라스타제는 α₁-ChI를 절단하고 이로써 카텝신 G활성을 촉진한다. 그것은 또한 TIMP를 절단하여 메탈로프로테이나제에 의한 조직분해를 가져온다. 더나아가서, 엘라스타제는 아티트롬빈Ⅲ와 헤파린 보조인자Ⅱ, 그리고 아마도 응괴형성을 촉진하는 조직인자경로 저해제(TFPI)를 절단한다. 반면에, 뉴트로필 엘라스타제가 응고인자를 분해하는 능력은 반대의 효과를 가져 엘라스타제의 전체효과가 불분명해지는 것으로 추정된다. 섬유소용해에 대한 뉴트로필 엘라스타제의 효과는 덜 모호하다. 섬유소용해 활성은 엘라스타제가 플라스미노겐 활성인자 저해제 및 α₂플라스민 저해제를 절단할때 증가한다. 게다가, 이들저해제는 둘다 O₂대사물에 의해 산화되고 불활성화 된다. PMN은 다량의 세린프로테아제를 함유하며, 체내에서 침입제를 처리하기 위해 하루에 약 200㎎의 각각의 백혈구 프로테아제가 방출된다. 급성염증은 방출된 효소의 양에 있어서 수배증가를 가져온다. 정상상태에서, 단백질분해는 다량의 저해제들 α₁-PI, α₁-ChI 및 α₂마크로글로불린에 의해 허용되는 낮은 수준에서 유지된다. 그러나, 많은 만성질환들은 예를들면 자동면역반응, 만상감염, 담배연기 또는 기타 자극제 등으로 말미암는 PMN의 과도자극으로 인한 병리학적 단백질분해로 말미암는다.

아프로티닌(소췌장 트립신 저해제)은 트립신, 키모트립신, 플라스민 및 칼리크레인을 포함하여 여러가지 세린프로테아제를 저해하며, 급성췌장염, 쇼크증상의 여러가지상태, 과다 섬유소용해성 출혈 및 심근경색의 치료에서 치료학적으로 사용된다(예를들면, J.E. Trapnell et al, Bri, J. Surg. 61. 1974, p. 177; J. McMichan et al., Circulatory shock 9, 1982, p. 107; L. M. Auer et al., Acta Neurochir. 49, 1979, p. 207; G. Sher, Am. J. Obstet. Gynecol. 129, 1977, p. 164; 및 B. Schneider, Artzneim, -Forsch. 26, 1976, p. 1606 참조). 높은 투여량으로 아프로티닌의 투여는 심폐우회로 수술을 포함하는 심장수술과 관련하여 혈액손실을 상당히 감소시킨다(예를들면, B. P. Bidstrup et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 1989, pp. 364-372; W. van Oeveren et al., Ann. Thorac. Surg. 44, 1987, pp. 640-645 참조). 어떠한 아프로티닌 유사체들, 예를들면 아프로티닌(1-58, Val 15)은 과립구 엘라스타제에 대한 비교적 높은 선택성과 콜라게나제에 대한 저해효과를 나타내며 아프로티닌(1-58, Ala 15)은 엘라스타제에 대한 약한효과를 갖는다는 것을 앞서 증명한 한편(H. R. Wenzel 및 H. Tschesche, Angew. Chem. Internat. Ed. 20, 1981, p. 295참조), 아프로티닌(3-58, Arg 15, Ala 17, Ser 42)은 탁월한 혈장 칼리크레인 저해효과를 나타낸다(WO 89/10374참조).

그러나, 체내에 투여했을때, 아프로티닌은 비교적 높은 투여량의 아프로티닌의 반복주사후 래트, 토끼 및 개에서 신(腎) 세포 독성효과를 갖는 것으로 발견되었다(Bayer, Trasylol, Inhibitor of proteinase; E. Glaser et al. in "Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft78. Kongress",아프로티닌에 대해 관찰된 신세포독성(특히 병변의 형태로 나타남)은 세관의 음으로 하전된 표면에 결합되게 하는 원인이되는 아프로티닌의 높은 양의 순전하의 결과 신장의 기부세관 세포들에서 아프로티닌의 축적에 기인할 수도 있다.

이 신세포독성은 아프로티닌이 임상목적, 특히 큰 투여량의 저해제의 투여를 요하는것들(심폐우회로 수술같은것)에 덜 적합하게 만든다. 게다가, 아프로티닌은 소단백질인데, 따라서 이것은 아프로티닌의 사람에의 투여에 대한 원하지 않는 면역반응을 일으킬 수도 있는 하나 또는 그이상의 에피토프를 함유할 수도 있다.

그러므로 유사한 저해제 프로화일을 갖거나 원하는 저해제 프로화일을 나타내도록 변형된 아프로티닌과 같은 유형의 사람 프로테아제 저해제(즉, 쿠니즈형 저해제)를 확인하는 것이 본 발명의 목적이다.

[발명의 개요]

본 발명은 조직인자 경로저해제(TFPI)의 사람 쿠니즈형(Kunitz-type) 프로테아제 저해제 도메인Ⅱ의 변이체로서, 다음의 아미노산 서열

X¹Asp Phe Cys Phe Ley Glu Glu Asp X²Gly X³Cys X⁴X⁵X⁶X⁷X⁸X⁹Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe X¹⁰Tyr Gly Gly Cys X¹¹X¹²X¹³Met Asn Asn Phe X¹⁴Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp X¹⁵(SEQ ID NO. 1) 로 이루어지며, 여기서 X¹은 H 또는 Cys를 제외한 1-5개의 자연발생 아미노산잔기를 나타내고, X²- X¹⁴는 각각 독립적으로 Cys를 제외한 자연발생 아미노산잔기를 나타내고, X¹⁵는 OH 또는 Cys를 제외한 1-5개의 자연발생 아미노산 잔기를 나타내며, 단, 아미노산잔기 X¹-C¹⁵중 적어도 하나는 천연서열의 대응아미노산 잔기와 다르다.

본문에서 용어 "자연발생 아미노산 잔기"는 20개의 통상 일어나는 아미노산들, 즉, Ala, Val, Ley, Ile, Pro, Phe, Trp, Met Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg 및 His중 어느 하나를 가리킴을 뜻한다.

외부경로 저해제(EPI) 또는 지단백질 관련응고 저해제(LACI)로도 알려진 TFPI는 브로즈등(Broze et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1987, pp. 1886-1890 및 EP 300 988)에 의해 분리되었고 단백질을 코드화하는 유전자가 클로닝되었다. EP 318 451참조. 단백질의 2차 구조의 분석은 단백질이 아미노산 22에서 아미노산79(I), 아미노산 93에서 아미노산 150(Ⅱ) 그리고 아미노산 185에서 아미노산242(Ⅲ)의 3개의 쿠니즈형 저해제 도메인을 갖는 것으로 나타났다.

TFPI의 쿠니즈형 도메인 I은 TF/FVⅡa 를 결합하는 것으로 나타난 한편, 쿠니즈형 도메인 Ⅱ는 FXa를 결합하는 것으로 나타났다(Girard et al., Nature 338, 1989, pp. 518-520).

상기 지적한 위치중 하나 또는 그이상에 하나 또는 그이상의 아미노산을 치환함으로써, TFPI쿠니즈형 도메인 Ⅱ의 저해제 프로화일을 변화시켜 그것이 뉴트로필 엘라스타제, 카뎁신 G 및/또는 프로테이나제-3을 선호적으로 저해하도록하는 것이 가능할 수도 있다. 더나아가서, 응고 또는 섬유소용해에 수반된 효소들(예를들면 플라스민 또는 혈장 칼리크레인)을 특이적으로 저해하는 변이체 또는 보체 캐스케이드를 제조하는 것이 가능할 수도 있다.

TFPI 쿠니즈형 도메인 Ⅱ의 한가지 이점은 상기 지적한 바와같이 강하게 양의 순전하를 갖는 아프로티닌에 반대되는 음의 순전하를 갖는다는 것이다.

그러므로 아프로티닌 보다 더낮은 양의 순전하를 갖는 본 발명의 변이체를 제조하는 것이 가능하여, 이로써 큰투여량의 변이체의 투여에 대한 신장손상의 위험을 감소시킨다. 또다른 이점은 아프로티닌과는 반대로 그것은 사람 단백질(단편) 이어서 사람에의 투여에 대한 원하지 않는 면역반응이 상당히 감소된다는 것이다.

[발명의 상세한 설명]

TFPI의 쿠니즈형 도메인 Ⅱ의 바람직한 변이체의 예들은 X¹이 Lys-Pro인 변이체, 또는 X²가 Ala, Arg, Thr, Asp, Pro, Glu, Lys, Gln, Ser, Ile 및 Val로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 변이체, 특히 X²가 Thr 또는 Pro 인 변이체, 또는 X³가 Pro 또는 Ile인 변이체, 또는 X⁴가 Lys, Arg, Val, Thr, Ile Ley, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr, Gln, Asn 및 Ala로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 변이체, 특히 X⁴가 Lys, Val, Ley, Ile, Thr, Met, Gln 또는 Arg인 변이체, 또는 X⁵가 Ala, Gly, Thr, Arg, Phe, Gln 및 Asp로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 변이체, 특히 X⁵가 Ala, Thr, Asp 또는 Gly인 변이체, 또는 X⁶가 Arg, Ala, Lys, Ley, Gly, His, Ser, Asp, Gln, Glu, Val, Thr, Tyr, Phe, Asn, Ile 및 Met로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 변이체, 특히 X⁶가 Arg, Phe, Ala, Leu, 또는 Tyr인 변이체, 또는 X⁷이 Ile, Met, Gln, Glu, Thr, Ley, Val 및 Phe로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 변이체, 특히 X⁷이 Ile 인 변이체, 또는 X⁸이 Ile, Thr, Asn, Lys, Ser, Gln, Glu, Arg, Pro 및 Phe로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 변이체, 특히 X⁸이 Ile 또는 Thr인 변이체, 또는 X⁹이 Arg, Ser, Ala, Gln, Lys 및 Leu로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 변이체, 특히 X⁹이 Arg인 변이체 , 또는 X¹⁰이 Gln, Pro, Phe, Ile, Lys, Trp Ala, Thr, Ley, Ser, Tyr, His, Asp, Met, Arg 및 Val로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 변이체, 특히 X¹⁰ 이Val 또는 Lys인 변이체, 또는 X¹¹이 Gly, Met, Gln, Glu, Leu, Arg, Lys, Pro 및 Asn으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 변이체, 특히 X¹¹이 Arg 또는 Leu인 변이체, 또는 X¹²가 Ala 또는 Gly인 변이체, 또는 X¹³이 Lys, Asn 및 Asp로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 변이체, 특히 X¹³이 Lys 또는 Asn 인 변이체, 또는 X¹⁴가 Val, Tyr, Asp, Glu, Thr, Gly, Ley, Ser, Ile, Gln, His, Asn, Pro, Phe, Met, Ala, Arg, Trp 및 Lys로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 변이체, 특히 X¹⁴가 Lys 또는 Glu인 변이체, 또는 X¹⁵가 Gly인 변이체들이다. 바람직한 구체예에서, X¹은 Lys-Pro이고 X¹⁵는 Gly인 한편, X²-X¹⁴는 상기한 것과 같다.

본 발명의 TFPI 쿠니즈형 도메인 Ⅱ의 변이체는 바람직하게는 프로테아제 결합영역에서 Met 잔기(즉, X³-X¹⁴로 표시되는 아미노산잔기)를 함유하지 않아야 한다.

상기한 α₁-PI 에의 상동성에 의해, 이들 위치중 어느하나에서 Met잔기는 저해제로하여금 PMN에 의해 생성된 산소대사물에 의한 산화성 불활성화에 민감하게 할것이며, 역으로 이들 위치에서 Met잔기의 결핍은 저해제로하여금 이러한 산소대사물의 존재하에서 더 안정하게 할 것이다.

TFPI 쿠니즈형 도메인 Ⅱ변이체는 숙주세포에 의해 생성되었을때 글리코실화되는 방법을 변화시키는 것이 바람직할 수도 있다. 따라서, 한구체예에서, 본 발명의 변이체는 다음의 아미노산 서열을 가질 수도 있다.

여기서 X¹- X¹⁵는 제 1항에 기재된 것과 같으며, X¹⁶은 Gln, Gly, Ala, Ser, Val 및 Phe 로 구성되는 군으로 부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Gln 또는 Ala이며, X¹⁷은 Thr 또는 Ala로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이다.

본 발명의 현재 바람직한 변이체들은 쿠니즈 도메인의 프로테아제 결합부위에 위치된 하나 또는 그 이상의 아미노산잔기(즉 아프로티닌의 13,15,16,17,18,19,20,34,39,40,41 및 46위치들에 해당하는 하나 또는 그이상의 X³- X¹⁴)가 천연 아프로티닌의 같은 위치에 존재하는 아미노산에 치환되는 것들이다. 이러한 변이체의 예들은 다음과 같다.

또다른 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 사람 쿠니즈형 저해제 도메인 변이체를 코드화하는 DNA 구조물에 관련된다. 본 발명의 DNA구조물은 확립된 표준방법들, 예를들면 보케이지와 카루터스(S. L. Beaucage 및 M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859-1869)에 의해 기술된 포스포아미다이트법, 또는 마테스등 (Matthes et al., EMBO Journal 3, 1984, pp. 801-805)에 의해 기술된 방법에 의해 합성에 의해 제조될 수도 있다. 포스포아미다이트법에 따르면, 예를들어서 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 정제, 어니일링, 연결반응 그리고 적합한 벡터에서 클로닝시킨다.

또다르게는 TFPI쿠니즈형 도메인 Ⅱ를 위한 게놈 또는_CDNA 코드화를 사용하는 것이 가능하다(예를들면, 합성올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용하여 TFPI를 코드화하는 DNA를 위한 게놈 또는_CDNA 라이브러리를 스크리닝하고 그로부터 도메인 Ⅱ를 코드화하는 DNA 서열을 분리함으로써 얻어진다). DNA 서열은 예를들면 공지의 방법에 따라 상동적 재조합을 위한 원하는 아미노산서열을 코드화하는 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 부위 유도된 돌연변이 유발에 의해 아미노산 치환들을 도입하는 것이 요망되는 부위에 해당하는 하나 또는 그이상의 부위들에서 변형된다.

여전히 더이상의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 DNA구조물로 이루어지는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 재조합 발현벡트는 재조합 DNA과정을 편리하게 시킬 수 있는 어떤 벡터도 될 수 있으며, 벡터의 선택은 종종 그것이 도입되는 숙주세포에 의존한다. 따라서 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터 즉 복제가 염색체 복제와 무관한 염색체외 실재로서 존재하는 벡터, 예를들면 플라스미드가 될 수 있다. 또 다르게는, 벡터는 숙주세포에 도입했을때 숙주세포 게놈에 일체화 되고 그것이 일체화된 염색체와 함께 복제되는 것일 수 있다.

벡터에서, 본 발명의 TFPI 쿠니즈형 도메인 Ⅱ변이체를 코드화하는 DNA 서열은 적합한 프로모터서열에 실시가능하게 연결되어야 한다. 프로모터는 고르고 고른 숙주세포에서 전사활성을 나타내는 어떤 DNA 서열로 될 수 있고, 숙주세포에 상동성이거나 아니면 이종의 단백질들을 코드화하는 유전자로 부터 유도될 수도 있다. 포유동물세포에서 본 발명의 TFPI 쿠니즈형 도메인 Ⅱ변이체를 코드화하는 DNA의 전사를 유도하는 적합한 프로모터의 예들은 SV 40 프로모터(Subramani et al., Mol Cell Biol. 1, 1981, pp. 854-864), MT-1(메탈로티오네인 유전자) 프로모터(Palmiter et al., Science 222, 1983, pp. 809-814) 또는 아데노바이러스 2 주요후기 유전자이다. 효모숙주세포에서 사용을 위한 적합한 프로모터는 효모해당(解糖) 유전자(Hitzeman et al., J. Biol Chem. 255, 1980, pp. 12073-12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp. 419-434) 또는 알코올 탈수소효소 유전자(Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender et al, eds), Plenum Press, New York, 1982), 또는 TPI1(US 4599,311)로부터의 프로모터 또는 ADH2-4C(Russell et al., Nature 304, 1983, pp. 652-654) 프로모터를 포함한다. 필라멘트상 균류숙주 세포들에 사용을 위한 적합한 프로모터들은, 예를들면, ADH 3 프로모터(McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, pp. 203-2099)또는 tpi A 프로모터이다.

본 발명의 TFPI 쿠니즈형 도메인 Ⅱ변이체를 코드화하는 DNA서열은 또한 사람성장호르몬 터미네이터(Palmiter et al., op. cit.)와 같은 적합한 터미네이터 또는(균류숙주에 대해) TPI1(Alber and Kawasaki, op. cit.) 또는 ADH3(McKnight et al., op cit.)프로모터에 실시가능하게 연결될 수도 있다.

벡터는 또한 폴리아데닐화신호 (예를들면 SV40 또는 아데노바이러스 5 Elb영역) 전사인핸서서열( 예를들면 SV 40인핸서) 및 번역 인핸서서열( 예를들면 아데노바이러스 VA RNA를 코드화하는 것들)과 같은 요소들로 더 이루어진다.

본 발명의 재조합 발현벡터는 백터로하여금 당해의 숙주세포에서 복제할 수 있게하는 DNA서열로 더 이루어진다.

이러한 서열의 예는(숙주세포가 포유동물세포일때) 복제의 SV 40원점 또는(숙주세포가 효모세포일때) 효모플라스미드 2μ복제유전자 REP 1-3및 복제의 원점이다.

벡터는 또한 선택가능한 마커, 예를들면 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 코드화하는 유전자 또는 약품, 예를들어서, 네오마이신 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에의 내성을 초래하는 것과 같은 그것의 생성물이 숙주세포에서 결함을 보충하는 유전자 또는 Schizosaccharomyces pombe TPI 유전자(P. R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130에 기술되어 있음)로 이루어진다.

본 발명의 TFPI 쿠니즈형 도메인 Ⅱ변이체를 코드화하는 DNA서열, 프로모터 및 터미네이터를 각각 연결하고 그것들을 복제에 필요한 정보를 함유하는 적합한 벡터에 삽입하기 위해 사용되는 과정들은 당업자들에게 잘 공지되었다(예를들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring harbor, New York, 1989참조).

본 발명의 발현벡터가 도입되는 숙주세포는 본 발명의 TFPI 쿠니즈형 도메인 Ⅱ변이체를 생성할 수 있는 어떤 세포도 될 수 있으며 포유동물, 효모 또는 균류세포와 같은 진핵세포가 바람직하다.

본 발명에 따르는 숙주세포로서 사용되는 효모유기체는 배양시 다량의 본 발명 TFPI 쿠니즈형 도메인 Ⅱ변이체를 생성하는 어떤 효모유기체도 될 수 있다. 적합한 효모유기체들의 예들은 효모종의 균주들 Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombo 또는 Saccharomyces uvarum이다. 효모세포의 형질전환은 예를들면 원형질체형성과 이어서 자체는 공지인 방법으로 형질전환에 의해 실행될 수도 있다.

적합한 포유동물 세포주의 예들은 COS(ATCC CRL 1650), BHK(ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10)또는 CHO(ATCC CCL 61)세포주들이다. 포유동물세포를 트랜스펙션하고 세포들에 도입된 DNA 서열을 발현하는 방법은 예를들어서 코프맨과 샤프(Kafvman and sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, pp. 601-602), 서던과 버그(Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 1982, pp. 327-341), 로이터등(Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1982, pp. 422-426), 위글러등(Wigler et al., Cell 14, 1978, p. 725)코르사로와 피어슨(Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 1981, p. 603)그래함과 반데르엡(Graham and van der Eb, Virology 52, 1973, p. 456) 그리고 뉴맨등(Neumann et al., EMBO J. 1, 1982, pp. 841-845)에 의해 기술되었다.

또 다르게는 균류세포들이 본 발명의 숙주세포로서 사용될 수도 있다. 적합한 균류세포들의 예들은 필라멘트상균류, 예를들면 Aspergillus spp. 또는 Neurospora spp. 의 세포들, 특히 Aspergillus oryzae 또는 Aspergillus niger의 균주들이다.

단백질의 발현을 위한 Aspergillus spp. 의 사용은 예를들면 EP 238 023에 기술되어 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따르는 TFPI 쿠니즈형 도메인 Ⅱ변이체의 제조방법에 관련되며, 그 방법은 변이체의 발현에 도움이되는 조건하에서 상기한 바와같이 세포를 배양하고 배양액으로부터 결과된 변이체를 회수하는 것으로 이루어진다.

세포를 배양하기 위해 사용되는 배지는 숙주세포의 선택에 따라 포유동물세포 또는 균류(효모포함) 세포를 성장시키기에 적합한 어떤 종래의 배지도 될 수 있다. 변이체는 숙주세포에 의해 성장배지에 분비될 것이며, 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 세포를 분리하고 염 예를들면 황산암모늄에 의해 상징액 또는 여액의 단백질 성분들을 침전시키며, 다양한 크로마토그래피 과정, 예를들면 이온교환 크로마토그라피 또는 친화도 크로마토그라피등에 의한 정제를 포함하는 종래의 과정들에 의해 그로부터 회수될 수도 있다.

본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 본 발명의 TFPI 쿠니즈형 도메인 Ⅱ변이체로 이루어지는 약학조성물에도 관련된다. 본 발명의 조성물에서, 변이체는 예를들면 Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985에 기술된 바와같이 약학조성물을 조제하는 확립된 방법중 어떤것에 의해서도 조제될 수 있다.

조성물은 전형적으로 전신주사 또느 주입에 적합한 형태일 수도 있고 그대로 살균수 또는 등장식염수 또는 글루코스용액과 조제될 수도 있다.

그러므로 본 발명의 TFPI 쿠니즈형 도메인 Ⅱ변이체는 다른 저해제 프로화일과 함께 천연 아프로티닌 또는 아프로티닌유사체에 대해 제안된 치료학적 이용분야, 특히 큰아프로티닌 투여량의 사용을 필요로하는 것들에 사용하기에 유리한 것으로 생각된다.

본 발명의 변이체의 사용이 사람 세린프로테아제, 예를들면 트립신, 플라스민, 칼리크레인 엘라스타제, 카텝신 G 및 프로테이나제-3을 저해하는 능력의 결과 가리키는 치료학적 이용분야는 급성췌장염, 염증, 혈소판감소증, 혈소판기능의 보존, 기관보존, 상처 치유, 쇼크(쇼크폐포함) 그리고 과다섬유소용해성 출혈, 기종, 류마티스성 관절염, 성인호흡 고통증상 만성염증성 장질환 및 건선을 수반하는 상태들, 다시말하면 계기가된 PMN으로 부터 방출된 엘라스타제, 카텝신 G 및 프로테이나제-3에 의한 병리학적 단백질분해로 말미암는 것으로 추정되는 질환들을 포함하며 이들에 제한되지 않는다.

더나아가서, 본 발명은 과도자극된 PMN으로부터 방출된 프로테아제에 의한 병리학적 단백질 분해와 관련된 질환 또는 상태들의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조를 위해 상기한 바와같은 TFPI 쿠니즈형 저해제 도메인Ⅱ 또는 그의 변이체의 사용에 관련된다. 상기한 바와같이, TFPI쿠니즈형 저해제 도메인Ⅱ 또는 변이체와 동시적으로 헤파린을 투여하는 것이 이점일 수도 있다.

상기 지적한 약학적 사용은 별문제로하고, 상기 명시한 바와같은 TFPI 쿠니즈형 도메인Ⅱ 또는 그의 변이체는 예를들면 스크리닝 분석법에 의해 또는 친화도 크로마토그라피에 의해 TFPI 쿠니즈형 도메인 Ⅱ에 직접 또는 간접적으로 결합하는 유용한 자연물질, 예를들면 사람의 물질로부터의 프로테아제 또는 리셉터를 분리하기 위해 사용될 수도 있다.

[실시예]

[일반적방법]

표준 DNA기술은 기술된 바와같이 수행되었다(Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). 합성올리고뉴클레오티드는 조절된 기공유리 지지체상에 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 자동 DNA합성기(380B, Applide Biosystems)에서 제조하였다(Beaucage, S. L. and Caruters, M. H. Tetrahedron Letters 22, (1981) 1859-1869). DNA 서열결정은 디데옥시 사슬종결 기술에 의해 수행되었다(Sanger, F., Micklen, S., and Coulson, A. R., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 74 (1977)5463-5467). 폴리머라제 사슬반응(PCR)은 DNA 열 사이클러(Thermal Cycler)(Perkin Elmer Cetus)에서 수행되었다.

110℃에서 진공밀봉된 관에서 24시간동안 6M HCl에서 가수분해후 아미노산 분석을 수행하였다.

분석은 마이크로관강(microbore) 조작을 위해 변형된 베크만 121MB 자동아미노산 분석기에서 수행하였다.

N-말단 아미노산 서열분석은 Applied Biosystems 470A 기상 시켄서를 사용하여 자동화된 에드만(Edman) 분해에 의해 얻어졌다. 온라인 역상 HPLC에 의한 분석을 각시켄서사이클로부터 유리된 PTH아미노산의 검출 및 정량화를 위해 수행하였다.

분자량 결정은 대략 15㎝의 플라이트관이 장치되고 포지티브 방식으로 작동된 BIO-ION 20 플라즈마 탈리질량분광계(PDMS)에서 얻어졌다. 5μl의 알리큇을 15kv로 설정된 가속전압에서 분석하였고 이온들을 5백만회 분열에 대해 수집하였다. 할당된 분자이온들에 대한 정확도는 잘 정의된 피크에 대해 대략 0.1%이고 그렇지 않으면 다소 적다.

[실시예 1]

효모균주 KFN-1593 으로부터 조직인자경로 저해제, TFPI-2의 제 2쿠니즈 도멘인의 생성

전길이 TFPI를 코드화하는 cDMA를 사람간 유도된 세포주 Hep G2(ATCC HB 8065)로부터 분리하고 기술된 바와같이 포유동물 발현벡터 pKFN-1168로 0.9kb Bam HI-Xba I 단편으로서 삽입하였다(Pedersem, A. H., Nordfang, O., Norris, F., Wiberg, F. C., Christensen, P. M., Moeller K. B., Meidahl-Pedersen, J., Beck, T. C., Norris, K., Hedner, U., and Kisiel, W. 1990, J. Biol. Chem. 265, 16786-16793). 삽입물의 DNA서열은 SEQ ID No. 7에 주어진다. TFPI-2는 표시한 바와같이 뉴클레오티드 365-538에 의해 코드화된다.

TFPI-2: pKFN-1168로부터의 0.9kb Bam HI-Xba I 단편 0.1μg을 프라이머 NOR-2526(GCTGAGAGATTGGAGAAGAGAAAGCCAGATTTCTGCTT)DHK NOR-2528(CTGGAATCTAGATTAACCATCTTCACAAATGTT)각각 100pmloe 을 함유하는 PCR반응에서 주형(template)으로서 사용하였다. NOR-2526의 17개 3'-말단 염기들은 SEQ ID No. 7에서 TFPI-2 유전자에서 염기 365 내지 381과 동일하고 21개 5'-말단 염기들은 하기한 pKFN-1000으로부터 합성리더 유전자(제 2도참조)에서 염기 215 내지 235와 동일하다. 프라이머 NOR-2528은 SEQ ID No. 7에서 염기 521 내지 540에 상보적이며 번역중지 코돈과 이어서 XbaI 부위를 함유하는 5' 연장부를 갖는다.

PCR 반응은 시판킷트(GeneAmp, Perkin Elmer Cetus)와 다음의 사이클: 20초간 94°, 20초간 50°, 및 30초간 72°를 사용하여 100μℓ부피에서 수행하였다. 19회 사이클 후, 72°단계를 10분간 유지시키는 최종 사이클을 수행하였다.

PCR 생성물, 210bp 단편을 2% 아가로스겔상에서 전기영동에 의해 분리하였다.

신호-리더: 이하 기술된 pKFN-1000으로 부터의 0.7kb PvuII단편 0.1μg을 각각 100pmole의 프라이머 NOR-1478(GTAAAACGACGGCCAGT)와 NOR-2523(TCTCTTCTCCAATCTCTCAGC)를 함유하는 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. NOR-1478은 SEQ ID No.0에서 EcoRI부위의 바로 상류의 서열에 들어맞는다.

프라이머 NOR-2523은 pKFN-100의 합성리더 유전자의 17개 3-말단 염기들에 상보적이다. SEQ ID No.9 참조. PCR 반응을 상기한 바와 같이 수행하였고 257b단편을 가져왔다.

플라스미드 pKFN-1000은 합성효모신호-리더펩티드를 코드화하는 DNA를 함유하는 플라스미드 pTZ 19R(Mead, D.A., Szczesna-Skorupa, E. and Kemper, B. Prot. Engin. 1(1986)67-74)의 유도체이다. 플라스미드 pKFN-1000은 WO 90/10075에 기술되어 있다. pKFN-100의 EcoRI 부위로 부터 하류의 235bp의 DNA서열과 합성효모신호-리더의 코드화된 아미노산 서열이 SEQ ID No.9에 주어져 있다.

신호-리더-TFPI-2:상기한 두개의 PCR-단편 각각 대략 0.1μg을 혼합하였다. 프라이머 NOR-1478과 NOR-2528 각각 100pmole과 다음의 사이클: 1분간 94°, 2분간 50°및 3분간 72°을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.

16사이클후 72° 단계를 10분간 유지시킨 최종사이클을 수행하였다.

결과된 442bp 단편을 1% 아가로스겔상에서 전기영동에 의해 정제한 다음 EcoRI와 XbaI로 소화시켰다.

결과된 412bp 단편을 pMT636으로 부터 9.5kB NcoI-XbaI단편으로와 PMT636으로부터 1.4kb NcoI-EcoRI단편으로 연결시켰다. 플라스미드 pMT636은 국제특허출원 No. PCT/DK88/00138에 기술되었다.

pMT 636은 Schizosaccharomyces pombe TPI gene (POT) (Russell, P.R., Gene 40 (1985) 125-130)를 함유하는 E. coli-S. cerevisiae 셔틀벡터, S. cerevisiae 트리오세포스페이트 이소머라제프로머터 및 터미네이터, TPI_P및 TPI_T(Alber, T., and Kawasaki, G. J. Mol. Appl. Gen. 1(1982), 419-434)이다.

연결반응혼합물을 암피실린 내성에 대해 선별하는 경쟁적 E. coli 균주(r^-, m⁺)를 형질 전환하기 위해 사용하였다. DNA 서열결정은 결과된 콜로니로 부터의 플라스미드가 합성 효모 신호-리더 유전자에 올바르게 융합된 TFPI-2에 대한 올바른 DNA서열을 함유한 것으로 나타났다.

한 플라스미드 pKFN-1605를 더 이상의 용도를 위해 선별하였다. 플라스미드 pKFN-1605의 제조는 제 1도에 예시한다.

플라스미드 pKFN-1605의 발현 카세트는 다음의 서열을 함유한다.

TPIp-KFN 100 신호-리더-TFPI2-TPI_T

pKFN-1605로 부터의 412 EcoRI-XbaI단편의 DNA서열은 SEQ ID No. 11에 나타낸다.

효모 형질전환: S. cerevisiae 균주 MT663(E2-7B XE11-36 a/ α, △tpi/△tpi, pep 4-3/pep 4-3)를 600nm에서의 O.D.0.6으로 YPGal(1% Bacto 효모추출물, 2% Bacto 펩톤, 2%갈락토오스, 1%락테이트)에서 성장시켰다.

배양액 100m를 원심분리에 의해 수확하고 10ml의 물로 세척하고 재원심분리하고 1.2M 소르비톨, 25mM Na₂EDTA pH=8.0 및 6.7mg/ml 디티오트레이톨을 함유하는 용액 10ml에 재현탁시켰다.

현탁액을 30℃에서 15분간 배양하고 원심분리하고 세포를 1.2M 소르비톨, 10mM Na₂EDTA, 0.1M시트르산나트륨, pH=5.8, 및 2mg Novozym234를 함유하는 용액 10ml에 재현탁시켰다.

현탁액을 30℃에서 30분간 배양하고 세포를 원심분리에 의해 수집하고 1.2M소르비톨 10ml와 CAS(1.2M 소르비톨, 10mM CaCl₂, 10mM Tris HCl(Tris=Tris(hydroxymethy)aminomethane)pH=7.5)10ml 에서 세척하고 2ml의 CAS에 재현탁시켰다.

형질전환을 위해 0.1ml 의 CAS-재현탁된 세포들을 대략 1μg의 플라스미드PKFN-1605와 혼합하고 실온에서 15분간 방치하였다. 1ml의 (20% 폴리에틸렌글리콜 4000, 20mM CaCl₂, 10mM Tris HCl, pH=7.5)를 가하고 혼합물을 실온에서 30분 더 방치하였다. 혼합물을 원심분리하고 펠릿을 0.1ml의 SOS(1.2M소르비톨, 33% v/v YPD, 6.7mM CaCl₂, 14μg/ml류신)에 재현탁시키고 30℃에서 2시간 동안 배양하였다.

그다음 현탁액을 원심분리하고 펠릿을 0.5ml의 1.2M 소르비톨에 재현탁시켰다.

그다음 6ml의 상면한천(1.2M 소르비톨과 2.5% 한천을 함유하는 셔만(Sherman et al. Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory(1982))의 SC배지)을 52℃에서 첨가하고 현탁액을 같은 한천-고화된 소르비톨함유 배지를 함유하는 플레이트의 상면에 부었다.

형질전환체 콜로니를 30℃에서 3일후 집어서 재분리하고 액체배양을 시작하기 위해 사용하였다. 하나의 이러한 형질전환체 KFN-1593을 더 특징화를 위해 선별하였다.

발효: 효모균주 KFN-1593을 YPD배지(1% 효모추출물, 2%펩톤(Difco Laboratories 로부터), 및 3%글루코오스)에서 성장시켰다. 1리터배양액의 균주를 650nm에서의 광학밀도 24로 30℃에서 진탕하였다. 원신분리후 상징액을 분리하였다.

정제: 인산으로 pH 3.0으로 조절한 효모상징액(1000ml)을 25mM 인산이수소나트륨, pH=3.5으로 평형화시킨 S-세파로스패스트플로우(Pharmacia, 2.6 × 3.6cm)의 컬럼에 적용시켰다. 평형완충액으로 세척후, 트립신저해 활성으로서 분석된 TFPI-2를 1M 염화나트륨을 함유하는 완충액(40ml)으로 용리하였다. 탈염은 탄산수소암모늄, pH=7.5로 평형화 시키고 용리한 세파덱스 G-25 컬럼(Pharmacia, 2.6 × 34cm)에서 얻어졌다. 더 이상의 정제를 25mM 인산이수소나트륨, 10% w/v 아세토니트릴, pH=3.5에서 0-0.43M 염화나트륨 1ml/분으로 23분에 걸여 기울기용리에 의해 모노 S컬럼(Pharmacia, 0.5 × 5cm)에서 수행하였다. N-글리코실화된 TFPI-2와 비글리코실화된 TFPI-2는 각각 0.20M과 0.26M염화나트륨에서 용리하였다. 비글리코실화된 TFPI-2의 최종정제를 0-50%아세노니트릴, 0.1%트리플루오로 아세트산 1ML/분으로 30분에 걸쳐 기울기용리에 의해 C18컬럼(Novo Nordisk A/S, 0.4 × 25cm)에서 역상 HPLC에 의해 수행하였다.

TFPI-2는 40%아세토니트릴에서 용리하였다.

정제된 생성물을 동결건조하고 물에 대략 200nM의 농도로 재용해시켰다. 이용액의 알리큇샘플을 아미노산조성(표1), 아미노산서열, 분자량(PDMS, 실측치: MW 6840.8, 계산치: 6840.6) 및 프로테아제 저해활성에 대해 분석하였다.

[실시예 2]

효모균주 KFN-1811 로부터 [R15K, G16A, Y17R, T19I]-TFPI-2의 생성

플라스미드 pKFN=1605로부터 TFPI-2를 코드화하는 1.3kb SphI-BamHI 단편 0.1μg을 두 PCR 반응에 주형으로서 사용하였다. 제 1의 PCR반응에서 각각 100pmole의 프라이머 NOR-2022(GGAGTTTAGTGAACTTGC)와 M-460(GTTATAAAAATACCTGATAATACGAGCTTTACATATTCCAGGATC)를 사용하였다. 제 2의 PCR반응에서 각각 100pmole의 프라이머 NOR-1495(TAAGTGGCTCAGAATGA)와 M-459(GATCCTGGAATATGTAAAGCTCGTATTATCAGGTATTTTTATAAC)가 사용되었다.

NOR-2022는 SphI 부위의 하류의 위치 94bp에서 프라이밍한다. M-460은 6개의 부정합을 제외하고는 TFPI-2 DNA-서열 위치 263-307, SEQ IN No. 11에 상보적이다.

NOR-1495는 BamHI부위로부터 상류에 위치 561 bp에서 프라이밍한다.

M-459는 M-460에 상보적이다.

PCR 반응은 시판킷트(GeneAmp, Perkin Elmer Cetus)와 다음의 사이클:1분간 95, 1분간 50°및 2분간 72°를 사용하여 100μl 부피에서 수행되었다.

24사이클후, 72°단계를 10분간 유지시키는 최종사이클을 수행하였다. PCR 생성물, 제 1의 PCR로부터 444bp단편과 제 2의 PCR로부터 285bp단편을 2% 아가로스겔상의 전기영동에 의해 분리하였다.

상기한 두 PCR단편들 각각 대략 0.1μg을 혼합하였다. PCR 반응을 각각 100pmole의 프라이머 NOR-2022 및 NOR-1495와 다음의 사이클:

1분간 95°, 2분간 50°, 및 3분간 72°를 사용하여 수행하였다. 22사이클후 72°단계를 10분간 유지시키는 최종사이클을 수행하였다.

결과된 687bp 단편을 1% 아가로스겔상에서 전기영동에 의해 정제한 다음 EcoRI와 XbaI로 소화시켰다. 결과된 412bp 단편을 pMT 636으로부터의 9.5kb NcoI-XbaI 단편과 pMT636 으로부터의 1.4kb NcoI-EcoRI 단편에 연결시켰다. 플라스미드 PMT 636은 실시예 1에 기술되어 있다.

연결반응 혼합물을 사용하여 암피실린 내성에 대해 선별하는 경쟁적 E. coli균주(r^-, m⁺)를 형질전환시켰다. DNA 서열결정은 결과된 콜로니로부터의 플라스미드가 합성효모 신호-리더 유전자에 융합된[R15K, G16K, Y17R, T19I]-TFPI-2에 대한 올바른 DNA서열을 함유하였음을 나타내었다.

한 플라스미드 pKFN-1798을 더이상의 용도를 위해 선별하였다. pKFN-1798로부터의 412bp EcoRI-XbaI 단편의 DNA서열을 SEQ ID No. 13에 나타내었다.

플라스미드 pKFN-1798을 실시예 1에 기술된 바와같이 효모균주 MT663에서 형질전환시켜 효모균주 KFN-1811을 가져왔다.

YPD-배지에서, 형질전환된 균주 KFN-1811의 배양, 상징액에서 [R15K, G16K, Y17R, T19I]-TFPI-2에 대한 분석, 그리고 정제를 실시예 1에 기술된 것과 같이 수행하였다.

[실시예 3]

TFPI(도메인 II)KF1593에 의한 세린프로테이나제의 저해

KFN1593을 실시예 1에 기술된 것과 같이 효모배지로부터 정제하였다. KFN1593의 농도를 1% E 280 nm=8.3 및 Mw=6500을 사용하여 결정하였다. 돼지트립신은 노보노르 디스크 아크티에 셀스카브(Bagsvaerd, Denmark)로부터 얻었고 소키모트립신(TLCK 처리됨)과 돼지췌장 칼리크레인은 시그마 케미칼 컴퍼니(St. Louis, MO, USA)로부터 얻었고, 사람 플라스민과 사람혈장 칼리크레인은 카비(Kabi, Stockholm, Sweden) 로부터 얻었다.

사람 뉴트로필 엘라스타제와 카텝신 G는 바우와 트래비스(Baugh and Travis, Biochemistry 15(1976)836-843)에 의해 기술된 방법에 따라 PMN의 추출물로부터 정제하였다.

펩티딜 니트로아닐리드 기질, S2251, S2586, S2266 S2302을 카비(Stockholm, Sweden)로 부터 얻었고, M4765 와 S7388은 시그마 케미칼 컴퍼니(St. Louis, MO, USA)로부터 얻었고 FXa-1은 니코메드(NycoMed Oslo, Norway)로부터 얻었다.

세린 프로테이나제를 여러농도의 KFN 1593과 30분간 배양하였다. 그다음 기질을 첨가하고 잔류 프로테이나제활성을 405nm에서 측정하였다. 결과를 제 2도와 제 3도에 나타내었다.

변형되지 않은 TFPI 쿠니즈 도메인II(KFN 1593)은 트립신(Ki=5×10^-9)과 인자 X(Ki=150nM)의 저해제이다.

KFN 1593은 플라스민과 뉴트로필 엘라스타제의 알맞은 저해를 나타내는 한편, 카텝신 G와 칼리크레인의 저해는 본질적으로 없다.

[표 1]

[실시예 4]

효모균주 KFN-1867 로부터 [R15K, G16A, Y17R, T19I, L39R]-TFPI-2의 생성

플라스미드 pKFN-1798로부터 [R15K, G16A, Y17R, T19I]-TFPI-2를 코드화하는 1.3kb SphI-Bam HI단편 0.1μg을 두 PCR반응에서 주형으로서 사용하였다.

제 1의 PCR반응에서, 각각 100pmole 의 프라이머 NOR-2022(GGAGTTTAGTGAACTTGC)와 M-462(CCAGTGTCTCAAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC)가 사용되었다.

제 2의 PCR반응에서 각각 100pmole 의 프라이머 NOR-1495(TAAGTGGCTCAGAATGA)와 M-461(GGTGGATGCAGGGGCAATATGAACAATTTTGAGACACTGG)가 사용되었다.

NOR-2022는 SphI 부위의 하류의 위치 94bp에서 프라이밍한다. M-462는 2개의 부정합을 제외하고는 TFPI-2 DNA-서열위치 341-380, SEQ ID No. 11에 상보적이다.

NOR-1495는 Bam HI 부위로부터 상류에 위치 561bp에서 프라이밍한다. M-461은 M-462에 상보적이다.

PCR 방은은 시판킷트(GeneAmp, Perkin Elmer Cetus)와 다음의 사이클: 1분간 95°, 1분간 50°및 2분간 72°를 사용하여 100 μl 부피에서 수행되었다.

24사이클후, 72°단계를 10분간 유지시키는 최종사이클을 수행하였다. PCR 생성물, 제 1의 PCR로부터 518bp단편과 제 2의 PCR로부터 209bp단편을 2% 아가로스겔상의 전기영동에의해 분리하였다.

결과된 687bp 단편을 1% 아가로스겔상에서 전기영동에 의해 정제한 다음 EcoRI와 XbaI로 소화시켰다. 결과된 412bp 단편을 pMT 636으로부터의 9.5kb NcoI-XbaI단편과 pMT636으로부터의 1.4kb NcoI-EcoRI 단편에 연결시켰다. 플라스미드 PMT 636은 실시예 1에 기술되어 있다.

연결반응 혼합물을 사용하여 암피실린 내성에 대해 선별하는 경쟁적 E. coli균주(r^-, m⁺)를 형질전환시켰다. DNA 서열결정은 결과된 콜로니로부터의 플라스미드가 합성효모 신호-리더 유전자에 융합된 [R15K, G16A, Y17R, T19I]-TFPI-2에 대한 올바른 DNA 서열을 하유하였음을 나타내었다.

한 플라스미드 pKFN-1861을 더이상의 요도를 위해 선별하였다. pKFN-1861을 더이상의 용도를 위해 선별하였다. pKFN-1861로부터의 412b EcoRI-XbaI 단편의 DNA 서열을 SEQ ID No. 15에 나타내었다.

플라스미드 pKFN-1861을 실시예 1에 기술된 바와같이 효모균주 MT663에서 형질전환시켜 효모균주 KFN-1867을 가져왔다.

YPD-배지에서, 형질전환된 균주 KFN-1867의 배양, 상징액에서 [R15K, G16A, Y17R, T19I, L39R]-TFPI-2에 대한 분석, 그리고 정제를 실시예 1에 기술된 것과 같이 수행하였다.

[실시예 5]

효모균주 KNF-1868로부터 [R15K, G16A, Y17R, T19I, L39R, E46K]-TFPI-2의 생성

플라스미드 pKFN-1798로부터 [R15K, G16A, Y17R, T19I]-TFPI-2를 코드화하는 1.3kb SphI-Bam HI단편 0.1μg 을 두 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다.

제 1의 PCR반응에서, 각각 100pmole 의 프라이머 NOR-2022(GGAGTTTAGTGAACTTGC)와 M-464(CCAGTGTCTTAAATTGTTCATATTGCCCCTGCATCCACC)가 사용되었다.

제 2의 PCR반응에서 각각 100pmole의 프라이머 NOR-1495(TAAGTGGCTCAGAATGA)와 M-463(GGTGGATGCAGGGGCAATATGAACAATTTTAAGACACTGG)가 사용되었다.

NOR-2022는 SphI부위의 하류의 위치 94bp에서 프라이밍한다. M-464는 3개의 부정합을 제외하고는 TFPI-2 DNA-서열위치 341-380, SEQ ID No. 11에 상보적이다.

NOR-1495는 Bam HI 부위로부터 상류에 위치 561bp에서 프라이밍한다. M-463은 M-464에 상보적이다.

PCR 반응은 시판킷트(GeneAmp, Perkin Elmer Cetus)와 다음의 사이클: 1분간 95°, 1분간 50° 및 2분간 72°를 사용하여 100μl 부피에서 수행되었다.

24사이클후, 72° 단계를 10분간 유지시키는 최종사이크을 수행하였다. PCR 생성물, 제 1의 PCR로부터 518bp단편과 제 2의 PCR로부터 209bp 단편을 2% 아가로스겔상의 전기영동에 의해 분리하였다.

상기한 두 PCR 단편들 각각 대략 0.1μg을 혼합하였다. PCR 반응을 각각 100pmole의 프라이머 NOR-2022 및 NOR-1495와 다음의 사이클: 1분간 95°, 2분간 50°, 및 3분간 72°를 사용하여 수행하였다. 22사이클후 72°단계를 10분간 유지시키는 최종사이클을 수행하였다.

연결반응 혼합물을 사용하여 암피실린 내성에 대해 선별하는 경쟁적 E. coli균주(r^-, m⁺)를 형질전환시켰다. DNA 서열결정은 결과된 콜로니로부터의 플라스미드가 합성효모 신호-리더 유전자에 융합된[R15K, G16A, Y17R, T19I, L39R, E46K]-TFPI-2에 대한 올바른 DNA 서열을 함유하였음을 나타내었다.

한 플라스미드 pKFN-1862를 더이상의 용도를 위해 선별하였다. pKFN-1862로부터의 412bp EcoRI-XbaI 단편의 DNA 서열을 SEQ ID No. 17에 나타내었다.

플라스미드 pKFN-1862를 실시예 1에 기술된 바와같이 효모균주 MT663에서 형질전한시켜 효모균주 KFN-1868을 가져왔다.

YPD-배지에서, 형질전환된 균주 KFN-1868의 배양, 상징액에서[R15K, G16A, Y17R, T19I, L39R, E46K]TFPI-2에 대한 분석, 그리고 정제를 실시예 1에 기술된 것과 같이 수행하였다.

[실시예 6]

위치 15 및 16에서 TFPI-2의 다중돌연변이

플라스미드 pKFN-1605로부터 TFPI-2를 코드화하는 1.3kb SphI-BamHI 단편 0.1μg을 두 PCR 반응에 주형으로서 사용하였다. 제 1의 PCR반응에서 각각 100pmole 의 프라이머 NOR-2022(GGAGTTTAGTGAACTTGC)와 M-749(AATACCTGGTAATATAA(C/G)C(C/G)A(A/C)ACATATTCCAGGATC)를 사용하였다. 제 2의 PCR반응에서 각각 100pmole 의 프라이머 NOR-1495(TAAGTGGCTCAGAATGA)와 M-750(GATCCTGGAATATGT(T/G)T(C/G)G(C/G)TTATATTACCAGGTATT)를 사용하였다.

NOR-2022는 SphI 부위의 하류의 위치 94bp에서 프라이밍한다. M-749은 4개의 부정합을 제외하고는 TFPI-2 DNA-서열 위치 263-299, SEQ ID No. 11에 상보적이다.

NOR-1495는 BamHI부위로부터 상류에 위치 561bp에서 프라이밍한다.

M-750은 M-749에 상보적이다.

24사이클후, 72°단계를 10분간 유지시키는 최종사이클을 수행하였다. PCR 생성물, 제 1의 PCR로부터 439bp 단편과 제 2의 PCR로부터 285bp 단편을 2% 아가로스겔상의 전기영동에 의해 분리하였다.

결과된 687bp 단편을 1% 아가로스겔상에서 전기영동에 의해 정제한 다음 EcoRI와 XbaI로 소화시켰다. 결과된 412bp단편을 플라스미드 pTZ 19R로부터의 2.8kb EcoRI-XbaI 단편에 연결시켰다.(Mead, D. A. Szczesna-Skopura, E., and Kemper, B. Prot. Engin. 1 (1986) 67-74).

연결반응 혼합물을 사용하여 암피실린 내성에 대해 선별하는 경쟁적 E. coli균주(r^-, m⁺)를 형질전환시켰다.

DNA 서열결정에 의해 합성효모신호- 리더 유전자에 융합된 표시된 TFPI-2 유사체를 코드화하는 다음의 6개의 플라스미드가 확인되었다.

이들 플라스미드로부터의 412bp EcoRI-XbaI 단편을 실시예 1에 기술된 바와같이 발현 플라스미드의 제조를 위해 사용하였다.

실시예 1에 기술된 바와같이 효모균주 MT-663의 형질전환은 다음의 효모균주를 가져왔다.

YPD-배지에서 형질전환된 효모균주의 배양, 상징액에서 TFPI-2 유사체에 대한 분석, 그리고 정제를 실시예 1에 기술된 바와같이 수행하였다.

[실시예 8]

TFPI(도메인II)KFN 1811, 1867 및 1868에 의한 세린프로테아제의 저해

세개의 TFPI(도메인II) 변이체를 효모배지로 부터 정제하였다. 그것들의 농도를 표준으로서 BPTI를 사용하여 214nm에서 흡광도로부터 결정하였다. 최종농도를 트립신으로 적정에 의해 구하였다. 돼지트립신과 사람재조합 트립신, 인자VIIa, 활성화된 단백질 C(ACP), 및 tPA를 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브(Bagsvaerd, Denmark)로부터 얻었고 사람트롬빈도 그로부터 얻었다. 소키모트립신과 선(腺) 칼리크레인을 시그마 케미칼 컴퍼니(St. Louis, MO. USA)로부터 얻었다. 절두형 사람재조합 조직인자를 코르바스(Corvas, San Diego, CA, USA)로부터 얻었다. 사람뉴트로필카텝신 G를 바우와 트래비스(Baugh and Travis, Biochemistry 15 (1976) 836-843)에 의해 기술된 방법에 따라 PMN의 추출물로부터 정제하였다. 사람플라스민은 카비(Stockholm, Sweden)로부터, uPA는 세로노(Serono, Milan, Italy)로부터 얻었고, 사림인자 Xa는 닥터 더블유. 키시엘(Dr. W. Kisiel, Albuquerque, NM, USA)로부터 선사받았고, 사람혈장 칼리크레인은 닥터 아이. 쇼우스뵈(Dr. I. Schousboe)(openhagen, Denmark)로부터 선사받았다.

펩티딜 니트로아닐리드 기질, S2251, S2302, S2266, S2568, S2288, S2444, S2366, 및 S2238은 카비(Stockholm, Sweden)로부터 얻었다. S7388과 M4765는 시그마 케이칼 컴퍼니(St. Louis, Mo, USA)로부터 얻었고 FXa-1은 니코메드(Mycomed, Oslo, Norway)로부터 얻었다.

세린프로테이나제를 30분간 여러가지 농도의 쿠니즈 도메인 변이체와 배양하였다. 그다음 기질(0.6mM)을 첨가하고 잔류 프로테이나제활성을 405nm에서 측정하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

세개의 변이체는 시험한 혈장으로부터 다른 프로테이나제의 상당한 저해없이 강한 특이적 플라스민 저해제이다.

[표 1]

[실시예 9]

TFPI(도메인 II)KFN 1893, 1897, 1898 및 1928 에 의한 세린프로테이나제의 저해

네개의 변이체들을 효모배지로부터 정제하였다.

그것들의 농도를 표준으로서 BTPI를 사용하여 214nm에서 흡광도로부터 구하였다. 돼지트립신은 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브(Bagsvaerd, Denmark)로부터 얻었고, 소키모트립신(TLCK 처리됨)은 시그마 케이칼 컴퍼니(St. Louis, MO. USA)로부터 얻었다. 절두형 사람재조합 조직인자를 코르바스(San Diego, CA, USA)로부터 얻었다.

사람뉴트로필 카텝신 G와 엘라스타제를 바우와 트래비스(Biochemistry 15 (1976) 836-843)에 의해 기술된 방법에 따라 PMN의 추출물로부터 정제하였다.

펩티딜 니트로아닐리드 기질 S2251, S2586 을 카비(Stockholm, Sweden)로부터 얻었다. S7388 및 M4765를 시그마 케미칼 컴퍼니(St. Louis, MO. USA)로부터 얻었다.

세린프로테이나제를 30분간 여러가지 농도의 변이체들과 배양하였다. 그다음 기질(0.6nM)을 첨가하고 잔류 프로테이나제활성을 405nm에서 측정하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

네개의 TFPI 쿠니즈 도메인II변이체(KFN 1983, 1897, 1898, 1928)는 뉴트로필 엘라스타제의 강한 저해제인 것으로 발견되었다.

[표 2]

[서열목록]

(1) 일반정보

(i) 출원인:

(A) 명칭: 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브

(B) 거리: 노보알레

(C) 도시: 박스베르트

(E) 국가: 덴마크

(F) 우편번호 (ZIP): DK-2880

(G) 전화: +45 4444 8888

(H) 텔레팩스 : +45 4449 3256

(I) 텔렉스: 37304

(ii) 발명의 명칭: 사람 쿠니즈형 프로테아제 저해제 변이체

(iii) 서열의 수: 18

(iv) 컴퓨터 판독형태:

(A) 매체유형: 플로피디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종

(C) 오페리이팅시스템 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.25(EPO)

(2) SEQ ID NO: 1에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 57아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: 단백질

(vi) 원출처:

(A) 유기체: 합성

(xi) 서열기술 : SEQ ID NO: 1:

(2) SEQ ID NO: 2에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 57 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: 단백질

(vi) 원출처:

(A) 유기체: 합성

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 2:

(2) SEQ ID NO: 3에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 58 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: 단백질

(vi) 원출처:

(A) 유기체: 합성

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 3:

(2) SEQ ID NO: 4에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 58 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: 단백질

(vi) 원출처:

(A) 유기체: 합성

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 4:

(2) SEQ ID NO: 5에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 58 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: 단백질

(vi) 원출처:

(A) 유기체: 합성

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 5:

(2) SEQ ID NO: 6에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 58 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: 단백질

(vi) 원출처:

(A) 유기체: 합성

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 6:

(2) SEQ ID NO: 7에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 945 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(c) 가닥형태 : 단일

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: cDNA

(vi) 원출처:

(A) 유기체: 호모 사피엔스

(ix) 특징:

(A) 명칭/ 키이: CDS

(B) 위치: 365..538

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 7:

(2) SEQ ID NO: 8에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 58 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: 단백질

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 8:

(2) SEQ ID NO: 9에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 235 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥형태 : 단일

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: cDNA

(vi) 원출처:

(A) 유기체: 합성

(ix)특징:

(A) 명칭/ 키이: CDS

(B) 위치: 77..235

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 9:

(2) SEQ ID NO: 10에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 53 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: 단백질

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 10:

(2) SEQ ID NO: 11에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 418 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥형태: 단일

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: cDNA

(vi) 원출처:

(A) 유기체: 합성/ 사람

(ix) 특징:

(A) 명칭/ 키이: CDS

(B) 위치: 77..409

(ix) 특징:

(A) 명칭/ 키이: sig_펩티드

(B) 위치: 77.235

(ix) 특징:

(A) 명칭/ 키이: mat_펩티드

(B) 위치: 236..409

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 11:

(2) SEQ ID NO: 12에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 111 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: 단백질

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 12:

(2) SEQ ID NO: 13에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 418 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥형태: 단일

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: cDNA

(vi) 원출처:

(A) 유기체: 합성

(ix) 특징:

(A) 명칭/ 키이: CDS

(B) 위치: 77..409

(ix) 특징:

(A) 명칭/ 키이: sig_펩티드

(B) 위치: 77.235

(ix) 특징:

(A) 명칭/ 키이: mat_펩티드

(B) 위치: 236..409

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 13:

(2) SEQ ID NO: 14에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 111 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: 단백질

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 14:

(2) SEQ ID NO: 15에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 418 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥형태: 단일

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: cDNA

(vi) 원출처:

(A) 유기체: 합성

(ix) 특징:

(A) 명칭/ 키이: CDS

(B) 위치: 77..409

(ix) 특징:

(A) 명칭/ 키이: sig_펩티드

(B) 위치: 77.235

(ix) 특징:

(A) 명칭/ 키이: mat_펩티드

(B) 위치: 236..409

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 15:

(2) SEQ ID NO: 16에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 111 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: 단백질

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 16:

(2) SEQ ID NO: 17에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 418 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥형태: 단일

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: cDNA

(vi) 원출처:

(A) 유기체: 합성

(ix) 특징:

(A) 명칭/ 키이: CDS

(B) 위치: 77..409

(ix) 특징:

(A) 명칭/ 키이: sig_펩티드

(B) 위치: 77.235

(ix) 특징:

(A) 명칭/ 키이: mat_펩티드

(B) 위치: 236..409

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 17:

(2) SEQ ID NO: 18에 대한 정보:

(i) 서열특성

(A) 길이: 111 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자유형: 단백질

(xi) 서열기술: SEQ ID NO: 18:

Claims

세린 프로테아제(serine protease) 저해 활성을 가지며, 다음의 아미노산 서열로 이루어지는 조직인자 경로 저해제(TFPI)의 사람 쿠니즈형(Kunitz-type) 프로테아제 저해제 도메인 II의 변이체.

여기서, 제 1위치의 X_aa는 LyS;

제 2위치의 X_aa는 Pro;

제 3위치의 X_aa는 결실(absent);

제 4위치의 X_aa는 결실;

제 5위치의 X_aa는 결실;

제 14위치의 X_aa는 Pro;

제 16위치의 X_aa는 Ile;

제 18위치의 X_aa는 Lys, Arg, Val, Thr, Ley, Phe, Trp 또는 Tyr;

제 19위치의 X_aa는 Ala 또는 Gly;

제 20위치의 X_aa는 Arg, Lys 또는 Tyr;

제 21위치의 X_aa는 Ile;

제 22위치의 X_aa는 Ile, Thr 또는 Leu;

제 23위치의 X_aa는 Arg;

제 37위치의 X_aa는 Ile, Lys, Thr, Ley 또는 Val;

제 42위치의 X_aa는 Arg 또는 Lys;

제 43위치의 X_aa는 Gly;

제 44위치의 X_aa는 Asn;

제 49위치의 X_aa는 Asp, Glu, Gln, Asn, Arg 또는 Lys;

제 61위치의 X_aa는 결실;

제 62위치의 X_aa는 결실;

제 63위치의 X_aa는 결실

제 64위치의 X_aa는 결실; 및

제 65위치의 X_aa는 Gly 이고, 단 X_aa로 표시된 아미노산 잔기중 적어도 하나는 천연서열의 아미노산 잔기와 다르다.
제 1항에 있어서, 다음의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 1항에 있어서, 다음의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 1항에 있어서, 다음의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 1항에 있어서, 다음의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 변이체.
제 1항에 따르는 사람 쿠니즈형 프로테아제 저해제를 코드화하는 DNA 서열로 이루어지는 DNA 구조물.
제 6항에 따르는 DNA 구조물로 이루어지는 재조합 발현벡터.
제 6항에 따르는 DNA 구조물을 함유하는 세포.
제 7항에 따르는 발현벡터를 함유하는 세포.
단백질의 발현에 도움이 되는 조건하에 제 8항에 따르는 세포를 배양하고, 결과된 단백질을 배양액으로부터 회수하는 것으로 이루어지는, 제 1항에 따르는 사람 쿠니즈형 프로테아제 저해제 변이체의 제조방법.
단백질의 발현에 도움이 되는 조건하에 제 9항에 따르는 세포를 배양하고, 결과된 단백질을 배양액으로부터 회수하는 것으로 이루어지는, 제 1항에 따르는 사람 쿠니즈형 프로테아제 저해제 변이체의 제조방법.
키모트립신, 트립신, 플라스민, 카텝신 G, 혈장 칼리크레인, 선 칼리크레인(grandular kallikrein) 및 엘라스타제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프로테아제를 저해하는 것을 특징으로 하는 청구항 제 1항에 따른 변이체.