CN102348462B - Tfpi抑制剂和使用方法 - Google Patents

Tfpi抑制剂和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102348462B
CN102348462B CN200980156547.8A CN200980156547A CN102348462B CN 102348462 B CN102348462 B CN 102348462B CN 200980156547 A CN200980156547 A CN 200980156547A CN 102348462 B CN102348462 B CN 102348462B
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
aminoacid
tfpi
blood coagulation
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980156547.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102348462A (zh
Inventor
迈克尔·多卡尔
哈特穆特·厄尔里希
弗雷德里希·舍弗林格
乌尔夫·雷默尔
乌尔里希·雷内克
托马斯·波拉克沃斯基
埃贝尔哈德·施奈德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Baxter Healthcare SA
Baxter International Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxter Healthcare SA, Baxter International Inc filed Critical Baxter Healthcare SA
Priority to CN201510260670.1A priority Critical patent/CN104984319A/zh
Publication of CN102348462A publication Critical patent/CN102348462A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102348462B publication Critical patent/CN102348462B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A61K47/557—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells the modifying agent being biotin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了结合组织因子途径抑制剂(TFPI)的肽，包括TFPI-1抑制肽，及其组合物。所述肽可用来抑制TFPI，提高凝血因子缺乏对象的凝血酶形成，增加对象的血凝块形成，和/或治疗对象的凝血障碍。

Description

TFPI抑制剂和使用方法
发明的技术领域
本发明总的涉及结合组织凝血因子途径抑制剂(TFPI)的肽及其使用。
与相关申请的交叉参考和引为参考
本申请要求2008年12月提交的美国临时专利申请No.61/139,272的优先权，所述申请的公开内容以其全文引为参考。
发明背景
止血依赖于复杂的凝血级联，其中凝血因子介导的一系列事件导致凝血酶原向凝血酶转变。凝血因子X(FX)活化是凝血级联的内源和外源途经的中心事件。外源途径已经被提议为凝血级联的主要激活因素(Mackman等，Arterioscler.Thromb.Case.Biol，27，1687-1693(2007))。循环组织凝血因子(TF)和活化的凝血因子VII(FVIIa)相互作用，形成介导FX活化的“外源复合物”。凝血级联被内源途径放大，在此期间凝血因子XII、XI、IX和VIII的连续活化导致形成同样介导FX活化的“内源”FIXa-FVIIIa复合物。活化的FX促进凝血酶形成，凝血酶形成是身体产生纤维蛋白和有效制止流血所需的。
严重的出血疾病，例如血友病，由凝血级联的破坏所引起。甲型血友病是最常见类型的血友病，起源于凝血因子VIII缺陷，而乙型血友病与凝血因子IX(FIX)缺陷有关。丙型血友病由凝血因子XI(FXI)缺陷引起(Cawthern等，Blood，91(12)，4581-4592(1998))。目前对于血友病及其他凝血障碍不能治愈。凝血因子替代疗法是凝血疾病最通用的治疗。但是，凝血因子典型在给药之后不久从血流中清除。为了有效，患者必须频繁接受静脉内输入血浆衍生的或重组的凝血因子浓缩剂，这并不舒适，需要临床环境，并且昂贵耗时。另外，凝血因子替代疗法的疗效在形成抑制性抗体后急剧减弱。大约30％患有严重甲型血友病的患者产生中和凝血因子(FVIII)的抑制性抗体(Peerlinck andHermans，Haemophilia，12，579-590(2006))。对于有抗凝血因子抗体的患者，治疗选择很少。
因此，在本技术领域中对于治疗凝血障碍的组合物和方法存在需要。本发明提供这样的组合物和方法。
发明概要
本发明提供与组织因子途径抑制剂(TFPI)结合的肽，包括具有调节凝血级联能力的TFPI拮抗肽。例如，本发明提供包含氨基酸序列X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21(SEQ ID NO：3109)的肽，所述序列中
X7选自L、P、K、S、W、V、N、和Q；
X8选自L、R、N、F、和I；
X9选自Y、V、P、和C；
X10选自F、L、和G；
X11选自L、W、V、A、M、T、和S；
X12选自T、F、V、R、A、D、L、E、S、和Y；
X13选自I、M、G、Q、D、和R；
X14选自G、W、Y、L、M、和H；
X15选自N、P、F、H、K、和Y；
X16选自M、D、E、V、G、和K；
X17选自G、I、R、S、T、和L；
X18选自M、K、L、和I；
X19选自Y、G、R、和S；
X20选自A、E、S、C、和Y；和
X21选自A、V、K、和E。
在一个方面，肽包含一个或多个直接与X7连接的N末端氨基酸，其中所述N末端氨基酸包含选自下列的氨基酸序列
X6，
X5X6，
X4X5X6，
X3X4X5X6(SEQ ID NO：3110)，
X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：3111)，和
X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：3112)，其中
X1选自T和G；X2选自F和V；X3选自V、W、Y和F；X4选自D、Q和S；X5选自E、T、N和S；以及X6选自R、H、K和A。
另外或附加地，肽包含一个或多个直接与X21连接的C末端氨基酸，其中所述C末端氨基酸包含选自下列的氨基酸序列
X22，
X22X23，
X22X23X24，
X22X23X24X25(SEQ ID NO：3113)，
X22X23X24X25X26(SEQ ID NO：3114)，和
X22X23X24X25X26X27(SEQ ID NO：3115)，其中
X22选自Q、I、E、W、R、L、和N；X23选自L、V、M、和R；X24选自K、L、A、和Y；X25是F；X26是G；和X27是T。
在一个方面，本发明提供包含SEQ ID NOs：1-7所示氨基酸序列的肽，例如包含JBT0132、JBT0303、JBT0193、JBT0178、JBT0120和JBT0224的任何一个所示的氨基酸序列的肽，所述肽抑制凝血级联内TFPI活性。本发明还提供了结合TFPI的肽，其包含的氨基酸序列与序列Phe-Gln-Ser-Lys-Gly-Asn-Val-Phe-Val-Asp-Gly-Tyr-Phe-Glu-Arg-Leu-Arg-Ala-Lys-Leu(FQSKGNVFVDGYFERLRAKL)(SEQ ID NO：32)有至少60％的同一性。
另外，本发明提供结合TFPI的肽，其中所述肽包含式(I)的结构：X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019-X1020(SEQ ID NO：3116)。在式(I)中，
X1001是选自Bhf、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、Q、R、T、V、W和Y的氨基酸；
X1002是选自G、K和Q的氨基酸；
X1003是选自A、Aib、Bhs、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1004是选自A、Aib、Bhk、C、D、E、F、G、H、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1005是选自a、A、Aib、Bal、C、D、d、E、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1006是选自A、Aib、Btq、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1007是选自A、F、G、I、K、L、Nmv、P、Q、S、V、W和Y的氨基酸；
X1008是选自F、H、K、W和Y的氨基酸；
X1009是选自A、Aib、f、I、K、S、T和V的氨基酸；
X1010是选自A、Aib、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1011是选自Aib、C、K、G和Nmg的氨基酸；
X1012是Y；
X1013是选自A、Aib、C、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、W和Y的氨基酸；
X1014是选自A、Aib、Bhe、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1015是选自(ω-甲基)-R、D、E、K和R的氨基酸；
X1016是L；
X1017是选自(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、D、Dab、Dap、E、Eag、Eew、F、G、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1018是选自A、Bal、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1019是选自Bhk、K、R和V的氨基酸；和
X1020存在或不存在，在X1020存在的情况下，它是选自Aib、Bhl、C、F、G、H、I、K、L、Nml、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸。
在一个方面，结合TFPI的肽包含式(III)的结构：X1001-Q-X1003-X1004-X1005-X1006-I/V-X1008-V-X1010-G-Y-C/F-X1014-R-L-X1017-X1018-K-K/L(III)(SEQ ID NO：3117)。式(III)中，X1001、X1003、X1004、X1005、X1006、X1008、X1010、X1014、X1017和X1018各自独立地选自任何氨基酸。
本发明还提供包含式(V)结构的TFPI结合肽：X2001-X2002-X2003-X2004-X2005-X2006-[X2007-X2008-X2009-X2010-X2011-X2012-X2013-X2014-X2015-X2016-X2017-X2018]-X2019-X2020-X2021-X2022-X2023(V)(SEQ ID NO：3118)。在式(V)中，X2001、X2002和X2023独立地存在或不存在。当存在时，X2001是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V和W的氨基酸；和X2002是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V和W的氨基酸。
另外，
X2003是选自A、F、I、K、L、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X2004是选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和W的氨基酸；
X2005是W；
X2006是选自F、H、I、K、L、R、V和W的氨基酸；
X2007是选自C、Hcy、Dap和K的氨基酸，优选自C和Hcy；
X2008是选自A、G、R、S和T的氨基酸；
X2009是选自a、A、I、K、L、M、m、Nle、p、R和V的氨基酸；
X2010是选自A、G、I、K、L、P、R、S、T和V的氨基酸；
X2011是选自D、E、G、S和T的氨基酸；
X2012是选自A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、K、k、L、l、M、m、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、T、t、V、v、W和w的氨基酸；
X2013是选自A、D、d、E、e、F、G、I、K、L、R、S、s、T、V和W的氨基酸；
X2014是选自A、D、E、F、G、I、K、L、M、R、S、T、V和W的氨基酸；
X2015是选自A、D、E、F、G、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V和W的氨基酸；
X2016是选自A、D、E、F、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X2017是选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X2018是选自C和D的氨基酸(优选X2018是C)；
X2019是选自A、F、I、L、S、T、V和W的氨基酸；
X2020是选自F和W的氨基酸；
X2021是选自I、L和V的氨基酸；和
X2022是选自A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V、和W的氨基酸。
当肽中存在X2023时，X2023是选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y的氨基酸。所述肽包含由X2007和X2018之间的键产生的环状结构，在式(V)中由括号标出。
本发明还提供了结合TFPI的肽，其中所述肽包含式(VI)的结构：X2001-X2002-F/Y-K-W-F/H-[C-X2008-M/V-X2010-D-X2012-X2013-G-I/T-X2016-S/T-C]-A/V-W-V-X2022-X2023(VI)(SEQ ID NO：3119)。在式(VI)中，X2001、X2002和X2023各自独立地存在或不存在。X2008、X2010、X2012、X2013、X2016和X2022，以及X2001、X2002和X2023，当存在时，各自独立地选自任何氨基酸。所述肽包含由X2007和X2018之间的键产生的环状结构，在式(VI)中由括号标出。
在一个方面，本发明提供了TFPI结合肽，其中所述肽包含式(VIII)的结构：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-X3012-X3013-X3014-X3015-X3016-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(VIII)(SEQ ID NO：3120)。在式(VIII)中，X3001和X3002各自独立地存在或不存在。当存在时，X3001是选自A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H和Y的氨基酸；和X3002是选自A、C、D、F、H、K、M、N、P、R、S、T、W、Y、G、I和L的氨基酸。至于式(VIII)的其余部分，
X3003是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W和Y的氨基酸；
X3004是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y和P的氨基酸；
X3005是选自C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X3006是选自A、W、C、K、P、R和H的氨基酸；
X3007是选自Q、A、C、F、G、H、I、K、L、N、R、S、T、W和Y的氨基酸；
X3008是选自A、C、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y和I的氨基酸；
X3009是选自A、C、F、G、H、I、L、M、R、S、T、V、W、Y和K的氨基酸；
X3010是选自A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X3011是选自A、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y、C、F和H的氨基酸；
X3012是选自A、C、H、I、K、L和R的氨基酸；
X3013是选自A、C、F、G、H、K、L、M、R、S、V、W、Y和I的氨基酸；
X3014是选自A、C、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y和K的氨基酸；
X3015是选自A、K和R的氨基酸；X3016是选自A、F、K和R的氨基酸；
X3017是选自A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、Y、H、A和M的氨基酸；
X3018是选自A、C、F、I、K、L、M、Q、R、V、W和Y的氨基酸；
X3019是选自A、C、D、E、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、V、W、Y和I的氨基酸；
X3020是选自A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、I和P的氨基酸；和
X3021是选自A、C、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、F和G的氨基酸。
另外，本发明提供了包含式(IX)结构的TFPI结合肽：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-H-X3013-X3014-K/R-R-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(IX)(SEQ ID NO：3121)，其中X3001、X3002、X3003、X3004、X3005、X3006、X3007、X3008、X3009、X3010、X3011、X3013、X3014、X3017、X3018、X3019、X3020和X3021各自独立地选自任何氨基酸。另外，本发明包括结合TFPI的肽，其中所述肽包含的氨基酸序列与式(X)的序列具有至少60％同一性：Ac-GYASFPWFVQLHVHKRSWEMA-NH2(SEQ ID NO：223)。在公开内容的范围中，由式(I)至(X)的任一个包涵的任何肽和本文描述的任何TFPI结合肽也被称为“本发明的肽”和“本文描述的肽”。
在一些实施方案中，本发明的肽结合TFPI-I(例如TFPI-1α)，并任选在FVIII、FIX、和/或FXI不存在的情况下改善TFPI-调节的凝血酶产生。还提供了包含所述肽的组合物(例如药物组合物)。
另外，本发明提供使用本发明肽的方法。例如，本发明提供抑制TFPI的方法，所述方法包含将TFPI与如本文描述肽接触。本发明还提供了在凝血因子缺陷的对象中提高凝血酶形成的方法、用于增加对象中血凝块形成的方法、和治疗对象的凝血障碍的方法。所述方法以它们的整体在本文中被称为例如“本发明的方法”。所述方法包含将本文提供的肽以有效提高凝血酶形成的量、有效提高血凝块形成的量或有效治疗对象凝血障碍的量施用于对象。除非明确指出与此相反，本文提供的关于本发明的一个肽或本发明方法的说明分别适用于本发明的每个和所有肽以及本发明方法。本发明的其它方面包括本发明的肽在制造药剂中的应用、靶向显示TFPI的细胞的方法、治疗或诊断患有疾病或处于患病风险的对象的方法、和纯化TFPI的方法。前面的方法以它们的整体在本文中也称为，例如，“本发明的方法”。
附图说明
图1是凝血级联的示意图。
图2是组织因子途径抑制剂-1的二级结构的示意图。
图3是包含组织因子、凝血因子Xa(FXa)、凝血因子VIIa(FVIIa)和TFPI的四元复合物形成的示意图。
图4是各种TFPI抑制肽的氨基酸序列的列表，指出了参照肽JBT0293的氨基酸取代(粗体和下划线)。
图5是TFPI抑制肽的mRNA展示筛选的示意图。
图6A是EC50结合ELISA的示意图，图6B是实施例1描述的IC50ELISA的示意图。
图7是生物素化肽JBT0132的％OD(y轴)对比浓度[nM](x轴)的结合ELISA曲线。
图8A-8D是本发明示例性肽的％OD(y轴)对比浓度[nM](x轴)的竞争ELISA曲线。
图9A和9B是绘出肽JBT0120和JBT0132的RU(y轴)对时间(秒)(x轴)的感应图。
图10A和10B是绘出肽JBT0120与组织因子途径抑制剂-1和组织因子途径抑制剂-2相互作用的RU(y轴)对时间(秒)(x轴)的感应图。
图11A和11B是在基于血浆的分析中，肽JBT0120和肽JBT0132的凝血酶产生量(nM)(y轴)对比时间(分钟)(x轴)的图。
图12-18的表列出了各种TFPI抑制肽的氨基酸序列；在FXa抑制分析中观察到的TFPI的EC50和抑制百分率；在外源tenase抑制分析中观察到的TFPI的EC50和抑制百分率；和在基于血浆的测定中，FEIBA、凝血因子VIII(FVIII)Immunate或凝血因子IX(FIX)的当量活性(mU/mL)。“*”表示阴性对照。
图19-21的表列出了几个TFPI结合肽的BIAcore分析结果。“*”表示阴性对照。
图22-30的表列出了各种TFPI结合肽的氨基酸序列；在FXa抑制分析中观察到的TFPI的EC50和抑制百分率；在外源tenase抑制分析中观察到的TFPI的EC50和抑制百分率；和在基于血浆的测定中，FEIBA、FVIII Immunate或FIX的当量活性(mU/mL)。“*”表示阴性对照。
图31是聚乙二醇化的TFPI-结合肽的药代动力学特征(肽浓度(y轴)对给药后时间(x))与缺乏PEG的相同肽的药代动力学特征的比较。所述肽以10mg/kg的剂量静脉内施用于C57B16小鼠。每个时点分析三个生物样品中肽的存在。
图32-39的表列出了各种本发明肽的氨基酸序列和IC50或EC50值。“*”表示阴性对照。
发明的具体内容
本发明提供了阻断凝血级联中的组织因子途径抑制剂-1(本文称为TFPI)的肽。血管损伤后，组织因子(TF)复合物与凝血因子VIIa形成“外源复合物”或“外源tenase复合物”，其激活凝血因子IX和X(图1)。TFPI是TF/FVIIa外源复合物活性的主要天然调节物，并通过扩展，在控制凝血酶产生中发挥作用(Panteleev等，Eur.J.Biochem.，249，2016-2031(2002))。TFPI是43kDa的丝氨酸蛋白酶抑制剂，包含三个Kunitz型抑制结构域(图2)。TFPI的Kunitz结构域1结合FVIIa和Kunitz结构域2结合FXa，使所述抑制剂能够形成阻断TF/FVIIa外源复合物活性的四元FXa-TFPI-FVIIa-TF复合物(图3)。TFPI结合FXa也下调凝血级联的共同途径，FXa在共同途径期间将凝血酶原转变成凝血酶(Audu等，Anesth.Analg.，103(4)，841-845(2006))。本发明提供了例如TFPI抑制肽，其阻断TFPI对凝血级联的抑制作用，从而提高凝血酶形成。
本文提供了几个TFPI结合肽的氨基酸序列。常规氨基酸按照它们的标准——单字母或三字母代码进行鉴别，如表1所示。
表1
非常规氨基酸和其它的肽结构单元按照见于表2的三字母代码鉴别(除Ttds之外，它是普通的四字母缩写)。
表2
本文提供的肽的氨基酸序列以普通技术人员所了解的典型肽序列形式描述。例如，常规氨基酸的三字母代码或单字母代码、或者非常规氨基酸的三字母代码或缩写，表明肽序列内指定位置中存在所述氨基酸。每个非常规氨基酸的代码与序列中下一个和/或前面的氨基酸的代码通过连字符连接。相邻的氨基酸通过化学键(典型为酰胺键)连接。化学键的形成是当氨基酸位于相邻氨基酸左侧(例如Hle-相邻氨基酸)时，从所述氨基酸除去一个羟基，和当氨基酸位于相邻氨基酸的右侧(例如相邻氨基酸-Hle)时，从所述氨基酸的氨基除去一个氢。要理解，这两种修饰都可适用于同一氨基酸和适用于没有明确示出连字符的氨基酸序列中存在的相邻常规氨基酸。在氨基酸在氨基酸侧链中包含一个以上氨基和/或羧基的情况下，2-或3-氨基和/或1-羧基一般用于形成肽键。对于非常规氨基酸而言，使用3-字母代码，其中首字母指出C-α-原子的立体化学。例如，大写的首字母表明肽序列中存在L-形式的氨基酸，而小写的首字母表明肽序列中存在D-形式的相应氨基酸。当使用单字母代码时，小写字母表示D-氨基酸，而大写字母表示L-氨基酸。除非指出与此相反，本文以N-至C-末端方向呈现氨基酸序列。
本文描述的几个TFPI结合肽序列的C末端通过包含OH、NH2，、或通过连字符与C末端氨基酸代码连接的具体末端胺的缩写而明确表明。本文描述的几个肽的N末端通过包含氢(用于游离N末端)、或通过连字符与N末端氨基酸连接的具体末端羧酸或其他化学基团的缩写而明确表明。
本发明提供包含氨基酸序列X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21(SEQ ID NO：3109)的肽，所述序列中(使用氨基酸的单字母代码)
X7选自L、P、K、S、W、V、N、和Q；
X8选自L、R、N、F、和I；
X9选自Y、V、P、和C；
X10选自F、L、和G；
X11选自L、W、V、A、M、T、和S；
X12选自T、F、V、R、A、D、L、E、S、和Y；
X13选自I、M、G、Q、D、和R；
X14选自G、W、Y、L、M、和H；
X15选自N、P、F、H、K、和Y；
X16选自M、D、E、V、G、和K；
X17选自G、I、R、S、T、和L；
X18选自M、K、L、和I；
X19选自Y、G、R、和S；
X20选自A、E、S、C、和Y；和
X21选自A、V、K、和E。
除了上面显示的核心结构X7-X21之外，具体设想的其他结构是其中一个或多个另外的氨基酸与核心结构X7-X21连接的结构(例如，与氨基酸序列的N末端或C末端连接)。因此，本发明包括包含核心结构和进一步包含一个或多个N末端氨基酸的肽，所述N末端氨基酸包含选自下列的氨基酸序列：
X6，
X5X6，
X4X5X6，
X3X4X5X6(SEQ ID NO：3110)，
X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：3111)，和
X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：3112)；
其中X6与核心结构氨基酸序列的X7直接连接，并且
X1选自T和G；
X2选自F和V；
X3选自V、W、Y和F；
X4选自D、Q和S；
X5选自E、T、N和S；以及
X6选自R、H、K和A。
在一个方面，本发明的肽包含氨基酸序列QSKKNVFVFGYFERLRAK(SEQ ID NO：1)或由其构成。
在另一个实施方案中，包含核心结构的本发明肽包含一个或多个C末端氨基酸，所述C末端氨基酸包含选自下列的氨基酸序列：
X22，
X22X23，
X22X23X24，
X22X23X24X25(SEQ ID NO：3113)，
X22X23X24X25X26(SEQ ID NO：3114)，和
X22X23X24X25X26X27(SEQ ID NO：3115)，
其中X22与核心结构氨基酸序列的X21直接连接，并且
X22选自Q、I、E、W、R、L、和N；
X23选自L、V、M、和R；
X24选自K、L、A、和Y；
X25是F；
X26是G；和
X27是T。
在一个方面，本发明的肽包含氨基酸序列VIVFTFRHNKLIGYERRY(SEQ ID NO：4)或由其构成。还设想了本发明的肽在核心结构的N末端和C末端均包含另外的氨基酸。在这种情况下，所述肽包含下列氨基酸序列或由其构成：TFVDERLLYFLTIGNMGMYAAQLKF(SEQ ID NO：3)，GVWQTHPRYFWTMWPDIKGEVIVLFGT(SEQ ID NO：5)，KWFCGMRDMKGTMSCVWVKF(SEQ ID NO：6)，或ASFPLAVQLHVSKRSKEMA(SEQ ID NO：7)。
本发明还包括包含下列氨基酸序列的肽：X3X4X5-F-X7-NVF-X11X12-GY-X15X16-RLRAK-X22(SEQ ID NO：2)，其中X3是Y或F；X4是Q或S；X5是N或S；X7是K、N或Q；X11是V、A、S或T；X12是F、A、D、L、Q、S或Y；X15是F、K或Y；X16是E或D；和X22是L或N。
另外，本发明提供结合TFPI的肽，其中所述肽包含式(I)的结构：X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019-X1020(SEQ ID NO：3116)。在式(I)中，
X1001是选自Bhf、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、Q、R、T、V、W和Y的氨基酸；
X1002是选自G、K和Q的氨基酸；
X1003是选自A、Aib、Bhs、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1004是选自A、Aib、Bhk、C、D、E、F、G、H、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1005是选自a、A、Aib、Bal、C、D、d、E、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1006是选自A、Aib、Btq、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1007是选自A、F、G、I、K、L、Nmv、P、Q、S、V、W和Y的氨基酸；
X1008是选自F、H、K、W和Y的氨基酸；
X1009是选自A、Aib、f、I、K、S、T和V的氨基酸；
X1010是选自A、Aib、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1011是选自Aib、C、K、G和Nmg的氨基酸；
X1012是Y；
X1013是选自A、Aib、C、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、W和Y的氨基酸；
X1014是选自A、Aib、Bhe、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1015是选自(ω-甲基)-R、D、E、K和R的氨基酸；
X1016是L；
X1017是选自(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、D、Dab、Dap、E、Eag、Eew、F、G、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1018是选自A、Bal、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X1019是选自Bhk、K、R和V的氨基酸。
X1020在式(I)中存在或不存在(即，在某些情况下，本发明的肽包含下面的结构：X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019(SEQ ID NO：3116)。当X1020存在时，它是选自Aib、Bhl、C、F、G、H、I、K、L、Nml、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸。
例如，本发明的肽包含式(I)的结构，其中X1001是选自C、F、I、K、L、Nmf、V、M、W和Y的氨基酸；X1002是Q；X1003是选自A、C、D、E、H、K、M、I、N、Q、R、S、T和V的氨基酸；X1004是选自A、Aib、C、D、E、G、H、F、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、V、W和Y的氨基酸；X1005是选自a、A、Aib、Bal、C、d、E、D、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T和Y的氨基酸；X1006是选自A、Btq、C、D、G、I、K、H、L、M、N、Q、R、S、V和Y的氨基酸；X1007是选自I、K、L、Q、V和Y的氨基酸；X1008是选自F、H和Y的氨基酸；X1009是选自f、I和V的氨基酸；X1010是选自A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；X1011是选自G和Nmg的氨基酸；X1012是Y；X1013是选自Aib、C、F、H、L、W和Y的氨基酸；X1014是选自A、Aib、Bhe、C、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；X1015是选自E和R的氨基酸；X1016是L；X1017是选自(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、Dab、Dap、Eag、Eew、F、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、T、V和Y的氨基酸；X1018是选自A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、R、V和W的氨基酸；X1019是选自K和R的氨基酸；和X1020是选自Aib、Bhl、F、K、L、R和W的氨基酸(当肽中存在X 1020时)。
在一个方面，本发明的肽包含式(I)的结构，其中X1001是选自F、L、Y和M的氨基酸；X1002是Q；X1003是选自M、Q、R、S、T和C的氨基酸；X1004是选自Aib、K、L、P、R、E、G、I、Y、M和W的氨基酸；X1005是选自a、Aib、D、d、G、H、K、k、N、Nmg、p、Q、R、A、E、C和M的氨基酸；X1006是选自A、C、D、G、H、K、N、Q、R、S和M的氨基酸；X1007是选自I和V的氨基酸；X1008是选自F、H和Y的氨基酸；X1009是V；X1010是选自A、D、E、K、M、N、Q、R、F、H、P、S、V、W和Y的氨基酸；X1011是G；X1012是Y；X1013是C或F；X1014是选自A、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V和Aib的氨基酸；X1015是R；X1016是L；X1017是选自A、Aib、C、Cha、Dab、Dap、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、K、Nle、Nva、Opa、Orn、R、I、L、S和M的氨基酸；X1018是选自A、L、N、M和R的氨基酸；X1019是K；和X1020是K或L。
当式(I)不存在氨基酸X1020时，本发明的肽在一个方面还包含在式(I)N末端的氨基酸X1000，使得肽包含式(II)的结构或由其构成：X1000-X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019(II)(SEQ ID NO：3122)。当肽中存在X1000时，X1000是选自A、E和P的氨基酸，而X1001-X1019的氨基酸如上定义。
在另一个方面，本发明的TFPI-结合肽包含式(III)的结构：X1001-Q-X1003-X1004-X1005-X1006-I/V-X1008-V-X1010-G-Y-C/F-X1014-R-L-X1017-X1018-K-K/L(III)(SEQ ID NO：3117)。式(III)中的X1001、X1003、X1004、X1005、X1006、X1008、X1010、X1014、X1017和X1018各自独立地选自任何氨基酸。例如，在式(III)中，
X1001任选是选自Bhf、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、Q、R、T、V、W和Y的氨基酸，例如选自C、F、I、K、L、Nmf、V、M、W和Y的氨基酸(例如，选自F、L、Y和M的氨基酸)；
X1003任选是选自A、Aib、Bhs、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，例如选自A、C、D、E、H、K、M、I、N、Q、R、S、T和V的氨基酸(例如，所述氨基酸是M、Q、R、S、T或C)；
X1004任选是选自A、Aib、Bhk、C、D、E、F、G、H、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，例如选自A、Aib、C、D、E、G、H、F、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、V、W和Y的氨基酸(例如选自Aib、K、L、P、R、E、G、I、Y、M和W的氨基酸)；
X1005任选是选自a、A、Aib、Bal、C、D、d、E、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，例如选自a、A、Aib、Bal、C、d、E、D、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T和Y的氨基酸(例如，所述氨基酸是a、Aib、D、d、G、H、K、k、N、Nmg、p、Q、R、A、E、C或M)；
X1006任选是选自A、Aib、Btq、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，例如选自A、Btq、C、D、G、I、K、H、L、M、N、Q、R、S、V和Y的氨基酸(例如选自A、C、D、G、H、K、N、Q、R、S和M的氨基酸)；
X 1008任选是选自F、H、K、W和Y的氨基酸，例如选自F、H和Y的氨基酸；
X1010任选是选自A、Aib、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，例如选自A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸(例如，选自A、D、E、K、M、N、Q、R、F、H、P、S、V、W和Y的氨基酸)；
X1014任选是选自A、Aib、Bhe、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，例如选自A、Aib、Bhe、C、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸(例如A、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V或Aib)；
X1017任选是选自(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、D、Dab、Dap、E、Eag、Eew、F、G、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，例如选自(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、Dab、Dap、Eag、Eew、F、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、T、V和Y的氨基酸(例如，选自A、Aib、C、Cha、Dab、Dap、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、K、Nle、Nva、Opa、Orn、R、I、L、S和M的氨基酸)；和/或
X1018任选是选自A、Bal、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，例如选自A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、R、V和W的氨基酸(例如，选自A、L、N、M和R的氨基酸)。
在一些实施方案中，本发明的肽包含一个或多个与氨基酸序列的N-或C-端相连的另外的氨基酸残基。例如，在一些实施方案中，包含式(I)-(III)的任一种结构的肽还包含一个或多个与X1001直接连接的N末端氨基酸，其中所述N末端氨基酸包含选自下列的氨基酸序列：
X1000，
X999-X1000，
X998-X999-X1000，
X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3123)，
X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3124)，
X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3125)，
X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3126)，
X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3127)，
X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ IDNO：3128)，
X991-X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQID NO：3129)，和
X990-X991-X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO：3130)。
当肽包含一个或多个N末端氨基酸时，X1000是A或K；X999是V或K；X998是Q或K；X997是L或K；X996是R或K；X995是G或K；X994是V或K；X993是G或K；X992是S或K；X991是K；和X990是K。
除了式(I)-(III)显示的核心结构之外，具体设想的其他结构是其中一个或多个另外的氨基酸与核心结构的C末端相连的结构，而所述C末端又与X1020直接连接。例如，C末端附加物任选包含选自下列的氨基酸序列：X1021，X1021-X1022，X1021-X1022-X1023和X1021-X1022-X1023-X1024(SEQ ID NO：3131)，其中X1021是T或K；X1022是S或K；和X1023和X1024是K。
本发明还包含一种TFPI-结合肽，该结合肽包含与氨基酸序列Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(式IV)(SEQ ID NO：164)具有至少60％同一性(例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或100％同一性)的氨基酸序列或由其构成。如本文所述，在一些情况下，所述肽包含式(I)-(III)任一个的氨基酸序列或由其构成。本发明还包括含有选自SEQ ID NOs：8-978的氨基酸序列或由其构成的肽(例如，包含选自SEQ ID NOs：8-741和962-972(例如SEQ ID NOs：8-741、962-968、971或972)和/或选自742-961(例如SEQ ID NOs：744-961)和/或选自SEQ ID NOs：973-978的氨基酸序列或由它们构成的肽)。
在有些情况下，本发明的肽包含分子内二硫键。在这时，包含式(I)-(III)结构的肽含有由至少三个氨基酸残基间隔开的至少两个半胱氨酸残基(例如，所述肽包含两个半胱氨酸残基)，使得所述半胱氨酸形成分子内二硫键。在一些情况下，半胱氨酸被超过三个氨基酸残基间隔开。例如，在包含式(I)、(II)或(III)结构的肽中，X1000、X1001、X1003、X1004、X1005、X1006、X1010、X1011、X1013、X1014、X1017、X1018、X1020和X1021中的任何两个任选是能够形成二硫桥的半胱氨酸。因此，在一些方面，所述肽包含两个半胱氨酸残基：X1000、X1005、X1010和X1014之一是半胱氨酸，和X1006、X1010、X1017和X1021之一是半胱氨酸。本发明构想了半胱氨酸对的所有可能组合，例如X1000和X1006是C；X1000和X1010是C；X1000和X1017是C；X1005和X1017是C；X1010和X1017是C；X1010和X1021是C；或X1014和X1021是C。
本发明还提供了一种TFPI结合肽，所述肽包含式(V)的结构：X2001-X2002-X2003-X2004-X2005-X2006-[X2007-X2008-X2009-X2010-X2011-X2012-X2013-X2014-X2015-X2016-X2017-X2018]-X2019-X2020-X2021-X2022-X2023(V)(SEQ ID NO：3118)，其中所述肽通过X2007和X2018之间的键、例如二硫键(表示为式(V)内的括号)，形成环状结构。在式(V)中，X2001、X2002，和X2023独立地存在或不存在。当存在时，X2001是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V和W的氨基酸；X2002是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V和W的氨基酸；和X2023是选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y的氨基酸。另外，
X2003是选自A、F、I、K、L、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X2004是选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和W的氨基酸；
X2005是W；
X2006是选自F、H、I、K、L、R、V和W的氨基酸；
X2007是选自C、Hcy、Dap和K的氨基酸(例如，C或Hcy)；
X2008是选自A、G、R、S和T的氨基酸；
X2009是选自a、A、I、K、L、M、m、Nle、p、R、Sem和V的氨基酸；
X2010是选自A、G、I、K、L、P、R、S、T和V的氨基酸；
X2011是选自D、E、G、S和T的氨基酸；
X2012是选自A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、K、k、L、l、M、m、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、Sem、T、t、V、v、W和w的氨基酸；
X2013是选自A、D、d、E、e、F、G、I、K、L、R、S、s、T、V和W的氨基酸；
X2014是选自A、D、E、F、G、I、K、L、M、R、S、T、V和W的氨基酸；
X2015是选自A、D、E、F、G、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V和W的氨基酸；
X2016是选自A、D、E、F、I、K、L、M、Nle、R、S、Sem、T、V、W和Y的氨基酸；
X2017是选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X2018是选自C和D的氨基酸(例如，X2018是C)；
X2019是选自A、F、I、L、S、T、V和W的氨基酸；
X2020是选自F和W的氨基酸；
X2021是选自I、L和V的氨基酸；和
X2022是选自A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V和W的氨基酸。
在一些情况下，本发明的肽包含式(V)的结构，
X2001任选是选自A、D、F、G、H、K、L、P和S的氨基酸，例如选自A、D、F、G、H、K、L和S的氨基酸(当X2001存在时).；
X2002任选是选自A、D、F、G、H、K、L、P、R和S的氨基酸，例如选自A、F、H、K、L、M、R和S的氨基酸(例如H、F、M或R)(当X2002存在时)；
X2003任选是选自A、F、K、L、S和Y的氨基酸，例如选自F、S和Y的氨基酸(例如，F或Y)；
X2004任选是选自A、D、F、G、K、L和S的氨基酸(例如K)；
X2005任选是W；
X2006任选是选自F、H、K和L的氨基酸(例如F或H)；
X2007任选是选自C和HcY的氨基酸(例如，X2007是C)；
X2008任选是选自A、G和S的氨基酸；
X2009任选是选自a、A、K、L、V、M、m、Nle、Sem和p的氨基酸，例如选自M、Nle、p和V的氨基酸(例如M、Sem或V)；
X2010任选是选自A、G、K、L、P、R和S的氨基酸，例如选自A、K、L、P、R和S的氨基酸(例如K、P或R)；
X2011任选是选自D、G和S的氨基酸(例如D或S)；
X2012任选是选自A、a、D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、m、Nle、P、S和s的氨基酸，例如选自D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、Nle、P、S和Sem的氨基酸(例如，选自F、L、l、Sem和M的氨基酸)；
X2013任选是选自A、D、d、F、G、K、L、S和s的氨基酸，例如选自A、D、F、G、K、L和S的氨基酸(例如D、G、K或S)；
X2014任选是选自D、F、G、K、L和S的氨基酸(例如D或G)；
X2015任选是选自A、D、F、G、I、K、L、M、Nle、S和T的氨基酸(例如I或T)；
X2016任选是选自D、F、K、L、M、Nle、S和Y的氨基酸，例如选自D、F、K、L、M、Nle、S、Sem和Y的氨基酸(例如D、F、M、Sem或Y)；
X2017任选是选自A、D、F、G、K、L、S、T和Y的氨基酸(例如S或T)；
X2018任选是C；
X2019任选是选自A、F、L、S和V的氨基酸(例如A或V)；
X2020任选是选自F和W的氨基酸(例如W)；
X2021任选是选自L和V的氨基酸(例如V)；
X2022任选是选自A、D、F、G、K、L、P、R、S和W的氨基酸，例如选自A、F、G、K、L、P、R、S和W的氨基酸(例如选自F、L、K、R、P和W的氨基酸)；和
X2023任选是选自A、D、F、G、K、L、M、S和Y的氨基酸，例如选自A、D、F、G、L、M、S和Y的氨基酸(例如选自A、D、F、M、S和Y的氨基酸)(当X2023存在时)。
本发明还包含一种TFPI结合肽，其中所述肽包含式(VI)的结构：X2001-X2002-F/Y-K-W-F/H-[C-X2008-M/V-X2010-D-X2012-X2013-G-I/T-X2016-S/T-C]-A/V-W-V-X2022-X2023(VI)(SEQ ID NO：3119)。包含式(VI)结构的肽中，X2001、X2002和X2023各自独立地存在或不存在。如果X2001、X2002、和/或X2023存在，则X2001、X2002和X2023的任一个独立地选自任何氨基酸。另外，X2008、X2010、X2012、X2013、X2016和X2022各自独立地选自任何氨基酸。
在某些情况下，在式(VI)的肽中，
X2001任选是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V和W的氨基酸，例如选自A、D、F、G、H、K、L、P和S的氨基酸(例如选自A、D、F、G、H、K、L和S的氨基酸)(当X2001存在时)；
X2002任选是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V和W的氨基酸，例如选自A、D、F、G、H、K、L、M、P、R和S的氨基酸(例如选自A、F、H、K、L、M、R和S的氨基酸，例如H、F、M或R)(当X2002存在时)；
X2008任选是选自A、G、R、S和T的氨基酸，例如选自A、G和S的氨基酸；
X2010任选是选自A、G、I、K、L、P、R、S、T和V的氨基酸，例如选自A、G、K、L、P、R和S的氨基酸(例如选自A、K、L、P、R和S的氨基酸，例如K、P或R)；
X2012任选是选自A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、I、K、k、L、l、M、m、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、Sem、T、t、V、v、W和w的氨基酸，例如选自A、a、D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、m、Nle、P、S、s和Sem的氨基酸(例如选自D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、Nle、P、S和Sem的氨基酸，例如F、L、l、Sem或M)；
X2013任选是选自A、D、d、E、e、F、G、I、K、L、R、S、s、T、V和W的氨基酸，例如选自A、D、d、F、G、K、L、S和s的氨基酸(例如选自A、D、F、G、K、L和S的氨基酸，例如D、G、K或S)；
X2016任选是选自A、D、E、F、I、K、L、M、Nle、R、S、Sem、T、V、W和Y的氨基酸，例如选自D、F、K、L、M、Nle、S、Sem和Y的氨基酸(例如选自D、F、K、L、M、Nle、S、Sem的氨基酸，例如F、Sem或M)；
X2022任选是选自A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V和W的氨基酸，例如选自A、D、F、G、K、L、P、R、S和W的氨基酸(例如选自A、F、G、K、L、P、R、S和W的氨基酸，例如F、L、K、R、P或W)；和/或
X2023任选是选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、M、S、T、V、W和Y的氨基酸，例如选自A、D、F、G、K、L、M、S和Y的氨基酸(例如选自A、D、F、G、L、M、S和Y的氨基酸，例如A、D、F、M、S或Y)(当X2023存在时)。
在一个方面，本发明的TFPI结合肽包含的氨基酸序列与式VII的序列：Ac-FYYKWH[CGMRDMKGTMSC]AWVKF-NH2(VII)(SEQ IDNO：1040)具有至少60％同一性(例如，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或100％同一性)。任选，所述肽包含本文定义的式(V)-(VII)的氨基酸序列或由其构成。本发明还包括包含选自SEQ ID NOs：1001-1293的氨基酸序列或由其构成的肽(例如，包含选自SEQ ID NOs：1001-1212和1290-1291(例如SEQID NOs：1001-120、1290或1291)和/或选自SEQ ID NOs：1213-1289和/或选自1292和1293的氨基酸序列或由所述序列构成的肽)。
本发明还提供了一种TFPI-结合肽，所述肽包含式(VIII)的结构：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-X3012-X3013-X3014-X3015-X3016-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(VIII)(SEQ ID NO：3120)。在式(VIII)中，X3001和X3002在所述肽中独立地存在或不存在。如果存在，X3001是选自A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H和Y的氨基酸；和X3002是选自A、C、D、F、H、K、M、N、P、R、S、T、W、Y、G、I和L的氨基酸。另外，
X3003是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W和Y的氨基酸；
X3004是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y和P的氨基酸；
X3005是选自C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X3006是选自A、W、C、K、P、R和H的氨基酸；
X3007是选自Q、A、C、F、G、H、I、K、L、N、R、S、T、W和Y的氨基酸；
X3008是选自A、C、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y和I的氨基酸；
X3009是选自A、C、F、G、H、I、L、M、R、S、T、V、W、Y和K的氨基酸；
X3010是选自A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸；
X3011是选自A、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y、C、F和H的氨基酸；
X3012是选自A、C、H、I、K、L和R的氨基酸；
X3013是选自A、C、F、G、H、K、L、M、R、S、V、W、Y和I的氨基酸；
X3014是选自A、C、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y和K的氨基酸；
X3015是选自A、K和R的氨基酸；
X3016是选自A、F、K和R的氨基酸；
X3017是选自A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、Y、H、A和M的氨基酸；
X3018是选自A、C、F、I、K、L、M、Q、R、V、W和Y的氨基酸；
X3019是选自A、C、D、E、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、V、W、Y和I的氨基酸；
X3020是选自A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、I和P的氨基酸；和
X3021是选自A、C、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、F和G的氨基酸。
在本发明的一些方面中，肽包含式(VIII)的序列，其中
X3001任选是选自A、C、D、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H和Y的氨基酸，例如选自A、C、D、G、K、L、M、N、P、R、S、T、E、H和Y的氨基酸(当X3001存在时)；
X3002任选是选自C、F、H、K、R、S、W、Y、G、I和L的氨基酸，例如选自C、K、R、W、Y、G、I和L的氨基酸(当X3002存在时)；
X3003任选是选自A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T和W的氨基酸，例如选自A、C、G、H、I、K、L、M、R、S、T和W的氨基酸；
X3004任选是选自A、C、D、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V和P的氨基酸，例如选自A、C、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T和P的氨基酸；
X3005任选是选自C、F、H、I、K、M、R、T、W和Y的氨基酸，例如选自C、F、H、K、R和W的氨基酸；
X3006任选是选自P、H和A的氨基酸；
X3007任选是选自C、G、R、W、A和L的氨基酸，例如选自L、C、R和W的氨基酸；
X3008任选是选自A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、Y和I的氨基酸，例如选自A、C、F、H、K、R、V、W、Y和I的氨基酸；
X3009任选是选自C、I、R、V和K的氨基酸，例如选自C、R、V和K的氨基酸；
X3010任选是选自A、C、G、H、I、K、L、M、Q、R、S和T的氨基酸，例如选自A、C、K、L、Q、R和S的氨基酸；
X3011任选是选自A、I、K、L、M、R、S、V、W、C、F和H的氨基酸，例如选自I、K、L、M、R、V、W、C、F和H的氨基酸；
X3012任选是选自H和R的氨基酸(例如H)；
X3013任选是选自C、F、K、L、M、R、V和I的氨基酸，例如选自C、K、R、V和I的氨基酸；
X3014任选是选自A、M、C、F、H、I、L、N、R、S、V、W和K的氨基酸，例如选自A、S、C、F、H、I、R和K的氨基酸；
X3015任选是K或R；
X3016任选是K或R；
X3017任选是选自A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、H、A和M的氨基酸，例如选自C、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、H、A和M的氨基酸；
X3018任选是选自A、K、C、I、L、R和W的氨基酸(例如K、C、I、R或W)；
X3019任选是选自A、C、E、H、K、N、Q、R和I的氨基酸，例如选自C、E、H、K、R和I的氨基酸；
X3020任选是选自C、H、L、M、R、V、I和P的氨基酸(例如C、M、I或P)；和
X3021任选是选自A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、F和G的氨基酸，例如选自A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、F和G的氨基酸。
本发明还提供了一种TFPI结合肽，其包含式(IX)的结构：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-H-X3013-X3014-K/R-R-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(IX)(SEQ ID NO：3121)。在式(IX)中，X3001和X3002在所述肽中独立地存在或不存在。如果存在，X3001和/或X3002独立地选自任何氨基酸。同样，X3003、X3004、X3005、X3006、X3007、X3008、X3009、X3010、X3011、X3013、X3014、X3017、X3018、X3019、X3020和X3021各自独立地选自任何氨基酸。当存在时，X3001任选是选自A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H和Y的氨基酸，例如选自A、C、D、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H和Y的氨基酸(例如，选自A、C、D、G、K、L、M、N、P、R、S、T、E、H和Y的氨基酸)。同样，当存在时，X3002任选是选自A、C、D、F、H、K、M、N、P、R、S、T、W、Y、G、I和L的氨基酸，例如选自C、F、H、K、R、S、W、Y、G、I和L的氨基酸(例如，选自C、K、R、W、Y、G、I和L的氨基酸)。关于式(IX)还有，
X3003任选是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W和Y的氨基酸，例如选自A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T和W的氨基酸(例如，选自A、C、G、H、I、K、L、M、R、S、T和W的氨基酸)；
X3004任选是选自A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y和P的氨基酸，例如选自A、C、D、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V和P的氨基酸(例如，选自A、C、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T和P的氨基酸)；
X3005任选是选自C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，例如选自C、F、H、I、K、M、R、T、W和Y的氨基酸(例如，选自C、F、H、K、R和W的氨基酸)；
X3006任选是选自A、W、C、K、P、R和H的氨基酸，例如选自P、H和A的氨基酸；
X3007任选是选自Q、A、C、F、G、H、I、K、L、N、R、S、T、W和Y的氨基酸，例如选自C、G、R、W、A和L的氨基酸(例如，L、C、R或W)；
X3008任选是选自A、C、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y和I的氨基酸，例如选自A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、Y和I的氨基酸(例如，选自A、C、F、H、K、R、V、W、Y和I的氨基酸)；
X3009任选是选自A、C、F、G、H、I、L、M、R、S、T、V、W、Y和K的氨基酸，例如选自C、I、R、V和K的氨基酸(例如，C、R、V或K)；
X3010任选是选自A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y的氨基酸，例如选自A、C、G、H、I、K、L、M、Q、R、S和T的氨基酸(例如，选自A、C、K、L、Q、R和S的氨基酸)；
X3011任选是选自A、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y、C、F和H的氨基酸，例如选自A、I、K、L、M、R、S、V、W、C、F和H的氨基酸(例如，选自I、K、L、M、R、V、W、C、F和H的氨基酸)；
X3013任选是选自A、C、F、G、H、K、L、M、R、S、V、W、Y和I的氨基酸，例如选自C、F、K、L、M、R、V和I的氨基酸(例如，C、K、R、V或I)；
X3014任选是选自A、C、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y和K的氨基酸，例如选自A、M、C、F、H、I、L、N、R、S、V、W和K的氨基酸(例如，选自A、S、C、F、H、I、R和K的氨基酸)；
X3017任选是选自A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、Y、H、A和M的氨基酸，例如选自A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、H、A和M的氨基酸(例如，选自C、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、H、A和M的氨基酸)；
X3018任选是选自A、C、F、I、K、L、M、Q、R、V、W和Y的氨基酸，例如选自A、K、C、I、L、R和W的氨基酸(例如，K、C、I、R或W)；
X3019任选是选自A、C、D、E、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、V、W、Y和I的氨基酸，例如选自A、C、E、H、K、N、Q、R和I的氨基酸(例如，C、E、H、K、R或I)；
X3020任选是选自A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、I和P的氨基酸，例如选自C、H、L、M、R、V、I和P的氨基酸(例如，C、M、I或P)；和/或
X3021任选是选自A、C、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、F和G的氨基酸，例如选自A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、F和G的氨基酸(例如，选自A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、F和G的氨基酸)。
在一些情况下，本发明的TFPI结合肽包含的氨基酸序列与式(X)的序列：AC-GYASFPWFVQLHVHKRSWEMA-NH2(X)(SEQ ID NO：223)具有至少60％同一性(例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或100％同一性)。任选，所述肽包含本文定义的式(VIII)-(IX)的氨基酸序列或由其构成。用于本文时，“至少60％同一性”和类似的术语包括从例如60％到100％的任何整数，例如60％、61％、62％等。此外，术语“至少[百分比]同一性”包括大于或等于同一的氨基酸数除以本发明肽氨基酸总数的任何百分比([至少百分比同一性]≥[同一的氨基酸数]/[本发明肽的氨基酸总数])。
本发明还包括含有选自SEQ ID NOs：2001-2498的氨基酸序列或由所述序列构成的肽(例如，包含选自SEQ ID NOs：2001-2296和2498(例如SEQ ID NOs：2001-2126、2128-2296或2498)和/或选自SEQ IDNOs：2297-2497(例如SEQ ID NOs：2298-2497)的氨基酸序列或由所述序列构成的肽)。本发明还提供含有选自SEQ ID NOs：3001-3108的氨基酸序列或由所述序列构成的肽(例如，包含选自SEQ ID NOs：3001-3064(例如SEQ ID NOs：3001-3048、3051-3053、3055或3057-3064)和/或选自SEQ ID NOs：3065-3084(例如SEQ ID NOs：3066-3084)和/或选自SEQ ID NOs：3085-3108的氨基酸序列或由所述序列构成的肽)。
SEQ ID NOs：1-7的肽在一些情况下还包含在SEQ ID NOs：1-7的N-或C-端连接的一个或多个氨基酸。例如，本发明包括含有下列氨基酸序列或由其构成的肽：JBT0047、JBT0051、JBT0055、JBT0131、JBT0132、JBT0133、JBT0155、JBT0158、JBT0162、JBT0163、JBT0164、JBT0166、JBT0169、JBT0170、JBT0171、JBT0174、JBT0175或JBT0293，所有的序列都包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。包含氨基酸序列SEQ IDNO：2的示例性肽包括含有下列氨基酸序列或由其构成的肽：JBT0294、JBT0295、JBT0296、JBT0297、JBT0298、JBT0299、JBT0300、JBT0301、JBT0302、JBT0303、JBT0304、JBT0305、JBT0306、JBT0307、JBT0308、JBT0309、JBT0310或JBT0311。包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的示例性肽含有下列氨基酸序列或由其构成：JBT0049、JBT0053、JBT0057、JBT0190、JBT0193或JBT0197。本发明还包括含有下列氨基酸序列或由其构成的肽：JBT0050、JBT0054、JBT0058、JBT0129、JBT0130、JBT0205、JBT0208、JBT0211、JBT0212、JBT0217、JBT0218或JBT0219，所有的序列都包含氨基酸序列SEQ ID NO：4。包含氨基酸序列SEQ IDNO：5的示例性肽包括含有下列氨基酸序列或由其构成的肽：JBT0101、JBT0052、JBT0103、JBT0178或JBT0182。本发明还包括含有下列氨基酸序列或由其构成的肽：JBT0120、JBT0124、JBT0247、JBT0248、JBT0251或JBT0252，它们每个都包含氨基酸序列SEQ ID NO：6。本发明还提供包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的肽，例如，含有下列氨基酸序列或由其构成的肽：JBT0122、JBT0126、JBT0221、JBT0224、JBT0225、JBT0226、JBT0228、JBT0232或JBT0233。本文描述的肽显示在实施例1的表5中和图12-18中。
在某些实施方案中，本发明的肽包含氨基酸序列JBT0047、JBT0049、JBT0101、JBT0120或JBT0122或本文描述的任何本发明肽或前述的任何变体、或由其构成(例如，包含氨基酸序列SEQ ID NOs：1-3108中任一种或由其构成的肽，例如包含SEQ ID NOs：8-741、744-968、971-978、1001-1210、1213-1289、1290-1293、2001-2126、2128-2296、2298-2498、3001-3048、3051-3053、3055、3057-3064和3067-3108任一种的氨基酸序列或由所述序列构成的肽)。“变体”是指相对于亲本氨基酸序列包含一个或多个氨基酸取代、氨基酸缺失或氨基酸添加的肽。变体包括但不限于，所具有的氨基酸序列与本文提供的任何氨基酸序列至少60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一、同时保持结合TFPI和/或抑制TFPI活性的能力的肽。在一个实施方案中，肽包含氨基酸序列JBT0132、JBT0303、JBT0193、JBT0178、JBT0120或JBT0224，或由所述序列构成。
在一个方面，本发明的肽由40个以下的氨基酸构成，例如35个以下的氨基酸。任选，本发明的肽由25个以下的氨基酸、或10个以下的氨基酸构成。在各种实施方案中，肽包含15-35个氨基酸残基(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸残基)。但是，也设想了本文描述的、包含一个或多个缺失的肽也适合本发明的范围，只要所述肽阻断凝血级联的TFPI抑制并任选结合TFPI即可。在一个方面，包含一个或多个缺失的肽适合本发明的范围，只要所述肽结合TFPI并任选阻断凝血级联的TFPI抑制即可。在一些情况下，氨基酸取自氨基酸序列内部、N末端和/或C末端。这样的肽片段可以包含3-14个氨基酸残基(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸残基)。
任选，本发明的肽包含不破坏肽结合和/或抑制TFPI的能力的一个或多个氨基酸取代(比照本文提供的任何氨基酸序列)。例如，包含选自JBT0294、JBT0295、JBT0296、JBT0297、JBT0298、JBT0299、JBT0300、JBT0301、JBT0302、JBT0303、JBT0304、JBT0305、JBT0306、JBT0307、JBT0308、JBT0309、JBT0310或JBT0311的氨基酸序列或由所述序列构成的肽是JBT0293的氨基酸序列的取代突变体(氨基酸序列SEQ IDNO：1在N末端与苯基丙氨酸残基和在C末端与赖氨酸残基直接连接)(参见图4)。氨基酸取代包括但不限于下述取代：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变结合亲合力，和/或(4)提供或改变肽的其他生理化学性质或功能性质。在一个方面，取代是保守取代，其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基代替。具有类似侧链的氨基酸残基家族在本技术领域内已经定义，包括有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)、β-支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)的氨基酸。但是要体会，实施者不局限于制造保守取代，只要所产生的肽保持完全或部分下调TFPI活性的能力即可。本发明也包括TFPI抑制肽，其包含非典型、非天然存在的氨基酸，所述氨基酸是本技术领域公知的。示例性的非天然存在氨基酸包括鸟氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘酪氨酸、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、y-氨基丁酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、正亮氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、3-甲基氨基酸、α-C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸、2-氨基异丁酸、β-高谷氨氨酸、β-高苯丙氨酸、β-高赖氨酸、β-高亮氨酸、β-高天冬酰胺、β-高谷氨酰胺、β-高精氨酸、β-高丝氨酸、β-高酪氨酸、β-高天冬氨酸、β-高缬氨酸、β-高天冬酰胺、(S)-环己基丙氨酸、(S)-瓜氨酸、(S)-2，4-二氨基丁酸、(S)-2，4-二氨基丁酸、(S)-二氨基丙酸、(S)-2-炔丙基甘氨酸、(S)-N(ω)-硝基精氨酸、L-高苯丙氨酸、(S)-高精氨酸、(S)-高瓜氨酸、(S)-高半胱氨酸、(S)-2-氨基-5-甲基己酸、(S)-高赖氨酸、(S)-正亮氨酸、(S)-N-甲基丙氨酸、(S)-N-甲基天冬氨酸、(S)-N-甲基谷氨酸、(S)-N-甲基苯丙氨酸、N-甲基甘氨酸、(S)-N-甲基赖氨酸、(S)-N-甲基亮氨酸、(S)-N-甲基精氨酸、(S)-N-甲基丝氨酸、(S)-N-甲基缬氨酸、(S)-N-甲基酪氨酸、(S)-2-氨基戊酸、(S)-2-吡啶基丙氨酸、(S)-鸟氨酸、L-苯基甘氨酸、4-苯基丁酸和硒甲硫氨酸。虽然肽中的所有氨基酸典型采用L立体化学，但在适当时，各个氨基酸可以具有L或D立体化学。
本发明还包括TFPI抑制肽变体，所述变体包含插入本文提供的氨基酸序列内和/或与N末端或C末端相连的一个或多个氨基酸。在一个方面，肽还包含促进肽的合成、操作、或使用的一个或多个氨基酸，所述氨基酸包括但不限于N末端和/或C末端的一个或两个赖氨酸，以增加肽的溶解度。适当的融合蛋白包括但不限于包含TFPI抑制肽与一个或多个一般不被认为是所述蛋白序列的部分的多肽、多肽片段或氨基酸连接的蛋白质。在一个方面，融合肽包含两个或多个肽的整个氨基酸序列，或者包含两个或多个肽的部分(片段)。除了本文描述的TFPI抑制肽的全部或部分之外，融合蛋白还任选包括包含想要的生物活性/功能的任何适当肽的全部或部分。事实上，在一些情况下，TFPI抑制肽与例如一个或多个以下物质可操作地连接：循环半衰期长的肽，标志蛋白，促进TFPI抑制肽纯化的肽，促进形成多聚体蛋白的肽序列，或前述任一种的片段。在一个实施方案中，两个或多个TFPI抑制肽通过多聚结构域连接、或通过化学键相连而融合在一起，产生TFPI抑制肽复合物。TFPI抑制剂肽可以相同或不同。
“衍生物”被归入本发明并包括以不同于氨基酸的添加、缺失或取代的一些方式被化学修饰。在这方面，本文提供的本发明肽与聚合物、脂质、其他有机部分和/或无机部分化学键合。肽和蛋白质修饰的例子提供在Hermanson，Bioconjugate Techniques(生物接合技术)，Academic Press，(1996)中。在一些情况下制备衍生物来增加溶解度、稳定性、吸收或循环半衰期。各种各样的化学修饰消除或减少了药剂的任何不良副作用。在这方面，本发明包括TFPI抑制肽共价修饰以包括一个或多个水溶性聚合物连接物。本技术领域已知的有用聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)(例如，大小约40kD或1kD的PEG)、聚氧乙二醇、聚丙二醇、单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇，以及上述任何的混合物。在一个方面，本发明的肽是PEG化的肽。对于水溶性聚合物连接物的进一步讨论，参见美国专利Nos.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；和4,179,337。在另一种情况下，肽衍生物包括特异性针对具体细胞类型、组织和/或器官的寻靶部分。或者，肽与一个或多个促进纯化、检测、多聚化和肽活性表征的化学部分连接。示例性的化学部分是生物素。另外，在一个方面，本发明的肽在所述肽的N末端氨基酸处被酰化。在另一种情况下，本发明的肽在所述肽的C末端氨基酸处被酰胺化。在又一种情况下，本发明的肽在所述肽的N末端氨基酸处被酰化并在所述肽的C末端氨基酸处酰胺化。
衍生物也包括含有修饰或非蛋白质氨基酸或修饰的接头基团的肽(参见，例如，Grant，Synthetic Peptides：A User′s Guide(合成肽：用户指南)，Oxford University Press(1992))。修饰的氨基酸包括，例如氨基和/或羧基被另一个基团代替的氨基酸。非限制性例子包括掺入硫代酰胺、脲、硫脲、酰基酰肼、酯、烯烃(olefines)、磺酰胺、磷酸酰胺、酮、醇、硼酸酰胺、苯二氮卓和其他的芳族或非芳族杂环的修饰氨基酸(参见Estiarte等，Burgers Medicinal Chemistry，6th edition，Volume 1，Part 4(《Burgers药物化学》，第六版，第一册，第四部分)，John Wiley&Sons，New York(2002))。修饰的氨基酸经常以至少一个上述官能团而不是酰胺键与肽连接。非蛋白质氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(Bal)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、4-氨基丁酸(γ-Abu)、2-氨基异丁酸(Aib)、6-氨基己酸(ε-Ahx)、鸟氨酸(Orn)、羟脯氨酸(Hyp)、牛磺酸、肌氨酸、瓜氨酸(Cit)、半胱磺酸(Coh)、环己基丙氨酸(Cha)、甲硫氨酸亚砜(Meo)、甲硫氨酸砜(Moo)、高丝氨酸甲酯(Hsm)、炔丙基甘氨酸(Eag)、5-氟色氨酸(5Fw)、6-氟色氨酸(6Fw)、3′，4′-二甲氧基苯基丙氨酸(Ear)、3′，4′-二氟苯基丙氨酸(Dff)、4′-氟苯基丙氨酸(Pff)、1-萘基丙氨酸(1Ni)、1-甲基色氨酸(1Mw)、青霉胺(Pen)、高丝氨酸(Hse)、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸(Phg)、苯并噻吩基丙氨酸(Bta)、L-高半胱氨酸(Hcy)、N-甲基苯丙氨酸(Nmf)、2-噻吩基丙氨酸(Thi)、3，3-二苯基丙氨酸(Ebw)、高苯基丙氨酸(Hfe)和S-苄基-L-半胱氨酸(Ece)。这些和其他的非蛋白质氨基酸可以作为D或L异构体存在。修饰接头的例子包括但不限于柔性接头4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺(Ttds)、甘氨酸、6-氨基己酸、β-丙氨酸(Bal)，以及Ttds、甘氨酸、6-氨基己酸和Bal的组合。
构成本发明肽的氨基酸的同系物可以如表3所示。
表3
在一些实施方案中，连接本发明肽内氨基酸的肽(CO-NH)键反向，产生“反向修饰(retro-modified)”肽，即与参照肽相比，肽包含以相反方向装配的氨基酸残基(NH-CO键)。反向修饰肽包含与参照肽相同的氨基酸手性。“倒转修饰(inverso-modified)”肽是本发明的肽包含的氨基酸残基的装配方向与参照肽相同，但氨基酸的手性倒转。因此，在参照肽包含L-氨基酸的情况下，“倒转修饰”肽包含D-氨基酸，反之亦然。倒转修饰肽包含CO-NH肽键。“反向-倒转修饰”肽是指包含以相反方向装配的氨基酸残基并且手性倒转的肽。反向-倒转类似物具有反向的末端和反向的肽键方向(即NH-CO)，同时大致保持参照肽中所见的侧链拓扑结构。使用标准方法制造反向-倒转拟肽，包括Meziere等，J.Immunol.，159，3230-3237(1997)中描述的方法，所述文献在此引为参考。部分反向-倒转肽是只有部分氨基酸序列反向和被对映异构的氨基酸残基替换的肽。
本发明的TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)以各种各样的方式制造。在一个方面，所述肽通过固相合成技术合成，所述技术包括在下列文献中描述的技术：Merrifield，J.Am.Chem.Soc，85，2149(1963)；Davis等，Biochem.Intl.，10，394-414(1985)；Larsen等，J.Am.Chem.Soc，115，6247(1993)；Smith等，J.Peptide Protein Res.，44，183(1994)；O′Donnell等，J.Am.Chem.Soc，118，6070(1996)；Stewart和Young，Solid PhasePeptide Synthesis(固相肽合成)，Freeman(1969)；Finn等，The Proteins，3rd ed.，vol.2(《蛋白质》，第三版，第二册)，p105-253(1976)；和Erickson等，The Proteins，3rd ed.，vol.2(《蛋白质》，第三版，第二册)，p257-527(1976)。或者，通过向宿主细胞中引入编码TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)的核酸，并培养宿主细胞表达所述肽，从而重组表达所述TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)。这样的肽使用标准蛋白纯化技术从细胞培养物中纯化。
本发明还涵盖包含编码本发明的TFPI抑制肽的核酸序列的核酸。DNA和/或RNA分子的制备方法在本技术领域中是公知的。在一个方面，使用化学合成技术和/或使用聚合酶链反应(PCR)产生编码本文提供的肽的DNA/RNA分子。如果需要，TFPI抑制肽编码序列合并到表达载体中。本领域普通技术人员将领会，本技术领域已知的许多表达载体中的任一种均适合本发明的背景，例如但不限于质粒、质粒-脂质体复合物和病毒载体。这些表达载体中的任一种都可使用下列文献描述的标准重组DNA技术来制备：例如，Sambrook等，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，2d edition(《分子克隆，实验室指南》，第二版)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物现行方案)，GreenePublishing Associates and John Wiley&Sons，New York，N.Y.(1994)。任选，所述核酸与一个或多个调节序列例如启动子、激活子、增强子、帽信号、聚腺苷酸化信号或者参与转录或翻译控制的其他信号可操作地连接。
任何本发明的TFPI抑制肽或编码所述肽的核酸还以组合物提供(例如药物组合物)。在这方面，所述肽用本文生理可接受的(即药理可接受的)载体、缓冲液、赋形剂或稀释剂配制，这些将在本文进一步描述。任选，所述肽是生理可接受的盐的形式，所述盐包涵在本发明中。“生理可接受的盐”是指可药用的任何盐。适当的盐的一些例子包括乙酸盐、盐酸盐、氢溴化物、硫酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乙醇酸酯和草酸盐。如果需要，组合物包含一种或多种另外的有效药剂。
本文提供的肽任选抑制至少一个组织因子途径抑制剂-1(例如TFPI-1)的活性、例如但不限于下调凝血级联的活性。不受任何具体作用机制的制约，提出的抑制机制可以包括防止四元TF-FVIIA-FXA-TFPI复合物的形成。肽可以抑制TFPI与FXa结合(例如，抑制TFPI的库尼(Kunitz)结构域2与凝血因子Xa结合)、与TF/FVIIa复合物结合(例如，抑制TFPI的库尼结构域1与TF/FVIIa复合物结合)、与单独的TF结合、和/或与单独的FVIIa结合。随着TFPI活性减小，TF和FVIIa自由地活化FX，FX随后增强凝血酶原向凝血酶的转化。
在一个方面，本发明的肽在模型和/或血浆系统中显示TFPI拮抗活性。用于确定TFPI抑制活性的示例性模型系统是外源tenase分析，它测试候选肽在TFPI(其是FX活化反应的天然抑制剂)存在下恢复外源复合物介导的FX活化的能力(参见，例如，Lindhout等，Thromb.Haemost.，74，910-915(1995))。用于鉴定TFPI抑制活性的另一个模型系统是FXa抑制分析，其中在TFPI存在下测量FXa活性(参见Sprecher等，PNAS，91，3353-3357(1994))。外源tenase分析和FXa抑制分析在实施例3中进一步描述。任选，本发明的肽在TFPI存在下增强FX活化的半数最大有效浓度(EC50)小于或等于1x10-4M、小于或等于1x10-5M、小于或等于1x10-6M、或小于或等于1x10-7M。
在一个方面，TFPI拮抗活性在基于血浆的分析中鉴定。在候选肽存在下，在基本上缺乏FVIII或FIX活性(例如，残余凝血因子活性低于1％)的血浆中引发凝血酶形成。可以如实施例4所述，使用发荧光或显色底物检测凝血酶形成。测量凝血酶活性的系统由Thrombino scopeBV(Maastricht，荷兰)提供。凝血酶原转化使用例如ThrombographTM(Thermo Scientific，Waltham，MA)测量，和得到的数据收集到从Thrombinoscope BV获得的ThrombinoscopeTM软件所产生的自动校正凝血酶曲线法(Calibrated Automatic Thrombogram)。在某些实施方案中，TFPI抑制肽增加所述分析期间产生的峰值凝血酶量和/或降低达到峰值凝血酶形成需要的时间。例如，所述肽在FVIII不存在(例如，贫FVIII血浆)下，提高TFPI调节的凝血酶产生，达到正常血浆中TFPI依赖性凝血酶产生水平的至少1％。一般而言，正常(未患病)血浆包含约0.5U/mL至约2U/mL凝血因子VIII。因此，在有些情况下，TFPI抑制剂肽将在FVIII不存在下提高凝血酶形成，达到在0.5U/mL至2U/mLFVIII存在下观察到水平的至少约1％。在其它实施方案中，所述肽在凝血因子VIII不存在下增强凝血酶形成，达到正常血浆、即生理水平的凝血因子VIII存在下凝血酶形成水平的至少约2％、至少约3％、至少约5％、至少约7％或至少约10％。在各种情况下，将所述肽施用于凝血酶缺陷或血友病的动物模型，以鉴定体内TFPI抑制活性。这样的体内模型在技术领域中是已知的，包括例如小鼠施用抗FVIII抗体以引起甲型血友病(Tranholm等，Blood，102，3615-3620(2003))；凝血因子敲除模型，例如但不限于FVIII敲除小鼠(Bi等，Nat.Genet.，10(1)，119-121(1995))和FIX敲除小鼠(Wang等，PNAS，94(21)，11563-66(1997))；兔子诱发甲型血友病(Shen等，Blood，42(4)，509-521(1973))；和ChapelHill HA狗(Lozier等，PNAS，99，12991-12996(2002))。
不受任何具体理论或机制的制约的情况下，本文提供的本发明肽可以通过(竞争性或变构性地)阻断TFPI与FXa结合而抑制TFPI活性。另外或附加地，所述肽可以抑制TFPI与组织因子(TF)/凝血因子VIIa复合物结合。因此，在某些情况下，所述肽特异性结合TFPI。各种肽结合任何来源包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、母牛、马、猪、豚鼠和灵长类动物的TFPI。在一个实施方案中，所述肽结合人类TFPI。任选，TFPI抑制肽结合来自超过一个物种的TFPI(即，所述肽在多个物种之间具有交叉反应性)。在某些情况下，所述肽与TFPI结合的解离常数(KD)小于或等于1x10-4M、小于或等于1x10-5M、小于或等于1x10-6M或小于或等于1x10-7M。亲合性可以使用例如并且不限于各种技术的任何一种、两种或多种来确定，所述技术例如亲合性ELISA分析、竞争性ELISA分析、和/或表面等离子体共振(BIAcoreTM)分析。当使用竞争性(IC50)ELISA分析鉴定时，本发明的肽任选表现出IC50小于或等于约50,000nM。例如，所述肽表现出IC50小于或等于约10,000nM，例如IC50小于或等于约5,000nM、小于或等于约1,000nM、或小于或等于约500nM。在一个方面，所述肽表现出IC50小于或等于约250nM、小于或等于约100nM、或小于或等于约50nM。示例性的肽和它们的IC50值提供于图32-39中；在有些情况下，肽根据它们的IC50值被分类为A、B、C、D、E、F和G组(参见实施例1的表4)。在不同的方面中，本发明提供了属于如表4定义的A、B、C、D、E、F和/或G组的肽。亲合性还可以通过动力学方法或平衡/溶液法确定。这样的方法在本文中进一步详细描述或在本技术领域中已知。
关于所有的结合剂结合分析，本技术领域的专业人员认识到，为了生物学(例如治疗上)有效，结合剂不应该测出与之结合的各种部分(moieties)将是穷举的，列举出来是不切实际的。因此，术语“特异性结合”是指肽结合TFPI的亲合性比它结合非TFPI的无关对照蛋白更高的能力。例如，所述肽与TFPI结合的亲合性可以比与对照蛋白的亲合性高至少5、10、15、25、50、100、250、500、1000或10,000倍。在一些实施方案中，所述肽结合TFPI的亲合性比它结合“抗靶”更高，“抗靶”是蛋白或人类中其他天然存在的物质，所述肽与其结合可能导致不良作用。几个类别的肽或蛋白质是可能的“抗靶”。因为TFPI抑制肽在血流中和/或内皮处发挥它们的活性，血浆蛋白代表可能的抗靶。包含库尼结构域(KDs)的蛋白质是可能的抗靶，因为不同蛋白质的KDs共有明显的相似性。组织因子途径抑制剂-2(TFPI-2)高度类似于TFPI-1α，并且像TFPI-1α那样含有KDs(Sprecher等，PNAS，91，3353-3357(1994))。因此，在一个方面，本发明的肽与TFPI结合的亲合性比与抗靶、例如TFPI-2的亲合性高至少5、10、15、25或50倍。
本发明进一步包括抑制组织因子途径抑制剂-1(TFPI)的方法。所述方法包含如本文描述将TFPI与TFPI结合肽接触。设想了任何程度的TFPI活性抑制。例如，TFPI抑制肽降低外源途径的TFPI抑制至少约5％(例如，至少约10％，至少约25％，或至少约30％)。在一些实施方案中，与TFPI抑制肽不存在时的TFPI活性相比，所述TFPI抑制肽降低外源途径内的TFPI活性至少约50％、至少约75％或至少约90％。
本发明进一步包括靶向TFPI定位的生物结构(包括但不限于细胞表面和内皮内衬)的方法。所述方法包括将所述生物结构(例如，包括但不限于细胞表面上显示TFPI的细胞)与本文描述的TFPI结合肽接触，所述TFPI结合肽任选与向所述肽增添附加功能的部分结合。所述部分可以是染料(例如，荧光染料)、放射性核素或含放射性核素的复合物、蛋白(例如酶，毒素或抗体)或细胞毒性剂。例如，所述肽与促进肽检测和/或纯化和/或包含治疗性质的效应部分连接或结合。在一个方面，将TFPI结合肽或肽接合物施用于哺乳动物，以靶向哺乳动物内显示TFPI的细胞。任选，所述方法进一步包含检测TFPI结合肽与TFPI的结合。所述方法可用于治疗和诊断其中TFPI是适合的诊断标志或TFPI表达细胞是治疗方法的靶的疾病。
在一些情况下，间接检测肽-TFPI结合。在这种情况下，将肽与结合本发明的肽且不显著干扰肽-TFPI结合的相互作用配偶体接触，并检测所述相互作用配偶体。示例性的相互作用配偶体包括但不限于抗体、抗原结合性抗体片段、抗运载蛋白(anticalins)和抗体模拟物、适配体和镜像异构体(spiegelmers)。任选地，相互作用配偶体包含检测部分以便于检测相互作用配偶体-肽复合物。检测例如抗体和其片段的方法是技术领域中充分了解的。同样，检测部分广泛地用于本技术领域以鉴别生物物质，并包括例如染料(例如荧光染料)、放射性核素和含放射性核素的复合物、和酶。
因此，本发明提供了用于诊断患有疾病或病症、或有患疾病或病症的风险的对象，其中所述疾病或病症与TFPI活性异常有关或由其引起。所述方法包含向对象施用本发明的TFPI结合肽和检测TFPI-肽复合物。在一些情况下，本发明的肽与可检测部分结合，方法包含检测所述可检测部分。在其他的情况下，方法包含向对象施用结合所述TFPI结合肽的TFPI结合肽相互作用配偶体，并检测所述相互作用配偶体。如果需要，所述相互作用配偶体包含可检测部分或与可检测部分结合，并检测所述可检测部分。可检测部分的存在表明TFPI的存在，从而允许诊断与TFPI有关的疾病或病症(例如，下面的疾病或病症：(i)可以通过抑制TFPI治疗，或(ii)包含可以通过抑制TFPI缓解或预防的症状)。如果不想要向对象施用所述肽的话，则从所述对象获得生物样品，将生物样品与本文描述的TFPI结合肽接触，和检测TFPI-肽复合物。
本发明的肽结合TFPI，并因此可用于从生物样品(例如生物流体，如血清)、发酵提取物、组织制备物、培养基等纯化TFPI或重组TFPI。本发明包括在TFPI的工业生产中或鉴定TFPI分子的方法中利用TFPI结合。例如，本发明包括纯化TFPI的方法。所述方法包括将含有TFPI的样品与本文限定的肽在适合形成TFPI和肽之间复合物的条件下接触；从样品取出复合物；并任选解离所述复合物以释放TFPI。适合于形成TFPI和肽之间复合物的示例性条件公开在实施例中，这样的条件容易加以改变以解离TFPI-肽复合物。在一些实施方案中，肽固定在载体、例如固体载体上，以便于TFPI的回收。例如，在一个实施方案中，所述肽固定在层析固定相上(例如，二氧化硅，亲和层析珠，或层析树脂)，包含TFPI的样品施加到固定相上，使得TFPI-肽复合物形成，从固定相除去样品的其余部分，从固定相洗脱TFPI。在这方面，在一个方面，本发明的肽适合用于亲和层析技术。
还提供了在凝血因子缺陷的对象中提高凝血酶形成的方法。方法包括在有效抑制TFPI的条件下向对象施用本文提供的肽。在这方面，TFPI抑制肽以有效提高对象形成凝血酶的量和条件施用。“凝血因子缺陷”是指对象患有凝血酶形成需要的一种或多种血液因子、例如FVIII、FIX或FXI的缺陷。在一个实施方案中，对象FVIII缺陷。另外或附加地，对象凝血因子IX缺陷。凝血因子缺陷通过检查临床样品中凝血因子的量来鉴别。执业医师根据凝血因子缺陷的幅度来分类血友病。患有轻度血友病的对象的凝血因子VIII或凝血因子IX是正常量(1U/ml)的大约5％至30％。中度血友病的特点在于是正常凝血因子VIII、凝血因子IX或凝血因子XI水平的大约1％至5％，而患有严重血友病的对象具有凝血因子VIII、凝血因子IX或凝血因子XI正常量的小于1％。缺陷可以通过活化部分凝血活酶时间(APTT)检验来间接鉴别。APTT检验测量了形成血凝块需要的时间长度，与凝血因子水平正常的患者相比，凝血因子VIII缺陷(甲型血友病)、凝血因子IX缺陷(乙型血友病)和凝血因子XI缺陷(丙型血友病)的患者时间较长。严重和中度凝血因子VIII缺陷的患者几乎100％可以用APTT诊断。本发明进一步包括在未患凝血因子缺陷的对象中提高凝血酶形成。方法包括在有效提高凝血酶形成的条件下，向对象(例如，包含正常生理水平的凝血因子的对象)施用本文提供的肽。
在一个方面，TFPI抑制肽用于提高对象的血凝块形成。提高血凝块形成的方法包括以有效增加血凝块形成的量和条件，向对象施用本文描述的肽。要领会，所述方法不需要完全恢复凝血级联来达到有益的(例如治疗)效果。设想了降低与凝血因子缺陷有关的症状发作或严重度的任何增强或增加凝血酶或血凝块形成。确定所述方法促进凝血酶形成和凝血的效力的方法在本技术领域中已知并在本文描述。
本发明进一步包括治疗对象凝血障碍的方法，方法包括以有效治疗对象凝血障碍的量和条件，向对象施用一种或多种TFPI-抑制肽，例如本文描述的任何一种或多中肽。在一个方面，所述肽不是抑制TFPI活性的天然存在的肽。“凝血障碍”包括由凝血因子活性缺陷和血小板活性缺陷引起的出血性障碍。凝血因子包括但不限于凝血因子V(FV)、FVII、FVIII、FIX、FX、FXIII、FII(造成低凝血酶原血症)和von Willebrand因子。凝血因子缺陷由例如凝血因子的体内半衰期缩短、凝血因子的结合性质改变、凝血因子的遗传缺陷和凝血因子的血浆浓度降低引起。凝血障碍可以是先天的或获得性的。可能的遗传缺陷包括编码凝血因子的核苷酸序列内的缺失、添加和/或取代，而所述核苷酸序列的不存在、存在和/或取代相应对凝血因子的活性有负面影响。凝血障碍还源自产生针对凝血因子的抑制物或自体免疫(例如抗体)。在一个例子中，凝血障碍是甲型血友病。或者，凝血障碍是乙型血友病或丙型血友病。
血小板病症由血小板功能缺陷或循环血小板数量异常低引起。血小板计数低可能是由于例如生产不足、血小板隔离或不受抑制的明显破坏所致。血小板减少症(血小板不足)可能存在种种原因，包括化疗和其他的药物疗法、放疗、手术、意外失血和其他的疾病状况。涉及血小板减少症的示例性疾病状况是：再生障碍性贫血；特发性或免疫血小板减少症(ITP)，包括与乳腺癌有关的特发性血小板减少性紫癜；HIV相关的ITP和HIV相关的血栓性血小板减少性紫癜；引起血小板减少症的转移性肿瘤；系统性红斑狼疮，包括新生儿狼疮综合征脾肿大，Fanconi综合征；维生素B12缺乏；叶酸缺乏；May-Hegglin异常；Wiskott-Aldrich综合征；慢性肝病；与血小板减少症有关的脊髓发育不良综合征；阵发性夜间血红蛋白尿；C7E3 Fab(阿昔单抗)治疗后的急性严重血小板减少症；同种免疫血小板减少症，包括母体同种免疫血小板减少症；与抗磷脂抗体有关的血小板减少症以及血栓形成；自身免疫血小板减少症；药物引起的免疫血小板减少症，包括卡铂引起的血小板减少症和肝素引起的血小板减少症；胎儿血小板减少症；妊娠期血小板减少症；Hughes综合征；类狼疮血小板减少症；意外和/或大量失血；骨髓增生殖性疾病；恶性肿瘤患者血小板减少症；血栓性血小板减少症紫癜；包括表现为癌症患者的血栓性血小板减少性紫癜/溶血尿毒症综合征的血栓性微血管病；输血后紫癜(PTP)；自身免疫性溶血性贫血；隐匿性空肠憩室穿孔；纯红细胞再生障碍；自身免疫血小板减少症；流行性肾病；利福平相关的急性肾衰竭；Paris-Trousseau血小板减少症；新生儿同种免疫血小板减少症；阵发性夜间血红蛋白尿；胃癌血液改变；溶血尿毒症综合征(例如；儿童尿毒症病)；和与病毒感染、包括甲型肝炎病毒相关的血液表现和CMV相关的血小板减少症。血小板病症还包括但不限于，Von Willebrand病，副肿瘤血小板机能障碍，Glanzman血小板机能不全，和Bernard-Soulier病。适于用TFPI抑制肽治疗的其它出血病症包括但不限于，创伤引起的出血性状况；一种或多种接触因子、例如FXI、FXII、前激肽释放酶和高分子量激肽原(HMWK)缺陷；维生素K缺乏症；纤维蛋白原病，包括无纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症和纤维蛋白原异常血症；和α2-抗纤维蛋白酶缺陷。在一个实施方案中，TFPI抑制肽用来治疗大量出血，例如手术、创伤、脑内出血、肝病、肾病、血小板减少症、血小板机能障碍、血肿、内出血、关节积血、体温过低、月经、妊娠和登革热(Dengue)出血热引起的大量出血。以上所有被认为是本公开内容范围中的“凝血障碍”。
在一个方面，本发明的TFPI抑制肽用来逆转对象中一种或多种抗凝血剂的作用(完全或部分)。众多的抗凝血剂是本技术领域已知的，包括，例如肝素；香豆素衍生物，例如华法令或双香豆素；TFPI；AT III；狼疮抗凝物；线虫抗凝肽(NAPc2)；FVIIa抑制剂；活性部位封闭的FVIIa(FVIIai)；活性部位封闭的FIXa(FIXai)；FIXa抑制剂；FXa抑制剂，包括磺达肝素、依达肝素、DX-9065a和拉扎沙班(DPC 906)；活性部位封闭的FXa(FXai)；FVa或FVIIIa的抑制剂，包括活化的蛋白C(APC)和可溶性血栓调节蛋白；凝血抑制因子，包括水蛭素、比伐卢定、阿加曲班和希美加群；和抗体或结合凝血因子的抗体片段(例如，FV，FVII，FVIII，FIX，FX，FXIII，FII，FXI，FXII，von Willebrand因子、前激肽释放酶或高分子量激肽原(HMWK))。
在本文使用时，“治疗”是指与凝血病症有关的症状的严重度和/或发作的任何降低。因此，“治疗”包括医治和预防措施。本领域普通技术人员将领会，任何程度的防御或缓解凝血病症或与之相关的症状均有益于对象，例如人类患者。通过以任何程度减少对象症状的严重度和/或延迟症状出现，改善了患者的生活质量。因此，在一个方面，所述方法在已经确定对象有发生凝血障碍(例如检测到凝血因子(例如FVIII、FIX或FXI)缺乏)风险后尽快执行或在测出凝血障碍(例如甲型血友病、乙型血友病或丙型血友病)后尽快执行。在另外的情况下，施用所述肽完全或部分防御受伤或手术期间的过度失血。
鉴于上述，本发明提供了在对象的治疗方法中使用的肽，所述方法例如治疗其中抑制TFPI有益的疾病的方法。在一个方面，疾病或病症是凝血障碍。对象患有疾病或病症、或者有患疾病或病症的风险(或不良生物事件，例如过度失血)。方法包括在有效地完全或部分治疗或预防疾病或病症的量和条件下，向对象施用本发明的肽。本发明还提供了用来制造药剂的肽。例如，所述肽可用于制造如本文详细描述的凝血障碍的治疗药剂。
在一些实施方案中，向对象施用包含编码本发明TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)的核酸序列的核酸是有利的。在一个方面，提供这样的核酸而不是TFPI抑制肽或与TFPI抑制肽一起提供。表达载体、核酸调节序列、给药方法等在本文和美国专利公布No.20030045498中进一步描述。
具体对象的具体给药方案将部分取决于所使用的本发明TFPI抑制肽、施用的TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)的量、给药途径、治疗的具体病患、与接受者有关的考虑、和任何副作用的原因和程度。向对象(例如哺乳动物，如人类)施用的肽量和给药条件(例如给药时间、给药途径、剂量方案)足以实现在合理的时限内的想要的生物反应。剂量一般取决于各种因素，包括具体使用的TFPI抑制肽、对象的年龄和体重、以及对象中任何疾病或病症的存在和严重度。剂量大小还将由给药途径、时间和频率决定。因此，临床医生可以滴定剂量和改变给药途径，以获得最佳治疗效果，传统的范围寻找技术是技术领域的普通专业人员已知的。纯粹作为说明，在一个方面，方法包括根据上述因素施用例如约0.1μg/kg至约100mg/kg或更多。在其他的实施方案中，所述剂量可以从1μg/kg直至约75mg/kg；或5μg/kg直至约50mg/kg；或10μg/kg直至约20mg/kg。在某些实施方案中，剂量包含约0.5mg/kg至约20mg/kg(例如，约1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.3mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg)的肽。鉴于许多凝血障碍的慢性性质，可以想象对象将在持续数周、数月、或数年的疗程中接受TFPI抑制肽，并可能需要每日或每周一剂或多剂。在其他的实施方案中，在相对短的治疗期间、例如1至14天中施用TFPI抑制肽，以治疗急性病况(例如，由手术或外伤引起的出血，或接受凝血替代疗法的对象凝血因子抑制/自身免疫事件)。
施用生理可接受的组合物、例如包含本文描述的肽的药物组合物的适当方法，是本技术领域中公知的。虽然可以使用一种以上途径来施用肽，但特定的途径可以提供比其它途径更直接和更有效的反应。根据情况，药物组合物被施加或滴注到体腔中、通过皮肤或粘膜吸收、服用、吸入和/或导入循环。在一个方面，包含TFPI抑制肽的组合物通过静脉内、动脉内或腹膜内给药，以将本发明的肽引入循环。非静脉内给药也是适当的，特别是在低分子量治疗剂的情况下。在某些情况中，适宜通过口服、局部、舌下、阴道、直肠；通过脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、门静脉内、病灶内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、鼻内、尿道或经肠注射；通过持续释放系统；或通过植入装置来递送包含TFPI抑制肽的药物组合物。如果需要，TFPI抑制肽可以通过动脉内或静脉内给药局部施用而提供给目标区，例如通过股动脉递送至腿。在一个实施方案中，所述肽合并到微粒中，如，例如下列美国专利所述：5,439,686和5,498,421，以及美国专利公布2003/0059474、2003/0064033、2004/0043077、2005/0048127、2005/0170005、2005/0142205、2005/142201、2005/0233945、2005/0147689、2005/0142206、2006/0024379、2006/0260777、2007/0207210、2007/0092452、2007/0281031和2008/0026068。或者，所述组合物通过将上面已经吸收或包裹了目标分子的膜、海绵或其它适当的材料植入来施用。在使用植入装置时，所述装置一方面植入任何适当的组织中，并以多个方面通过扩散、时间释放团注剂、或连续给药来递送目标分子。在其他的情况下，TFPI抑制肽在外科程序或治疗受伤期间直接施用于暴露的组织，或通过输血程序施用。治疗剂递送途径是专业技术人员公知的，其中的一些进一步描述在例如美国专利No.5,399,363中。
为了便于给药，在一个实施方案中所述TFPI结合肽(例如，TFPI抑制肽)配制在包含载体(即介质、佐剂、缓冲液或稀释剂)的生理可接受的组合物中。具体使用的载体仅受物理化学因素、例如溶解度和与肽缺乏反应性以及给药途径的限制。生理可接受的载体在技术领域中是公知的。适合于注射使用的说明性药物形式包括但不限于无菌水溶液或分散体，和用于临时配制无菌注射溶液或分散体的无菌粉末(例如参见美国专利No.5,466,468)。注射制剂进一步描述在，例如，Pharmaceutics and Pharmacy Practice(药剂学和药剂实践)，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia.Pa.，Banker和Chalmers编著，238-250页(1982)，和ASHP Handbook on Injectable Drugs(ASHP注射药物手册)，Toissel，第四版，622-630页(1986))。包含本文提供的肽的药物组合物任选放置在容器内，带有提供关于这样的药物组合物使用说明书的包装材料。一般而言，这样的说明书包括实质性的表述，描述试剂浓度、以及在某些实施方案中重构药物组合物可能必要的赋形剂成分或稀释剂的相对量。
适当时，本发明的TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)与其他物质和/或其他治疗形式组合，以达到附加的或加强的生物效应。联合治疗包括但不限于血浆来源或重组的凝血因子、血友病预防治疗、免疫抑制剂、血浆凝血因子抑制性抗体拮抗剂(即抗-抑制剂)、抗纤维蛋白溶解剂、抗生素、激素疗法、抗炎剂(例如，非甾体抗炎药物(NSAIDs)或甾体抗炎物质)、促凝剂、和止痛药。在一个方面，方法是对传统的替代凝血因子治疗方案的辅助疗法，所述传统治疗方案包括向对象施用，例如，FXIII、FXII、FXI(例如，HEMOLEVEN(Laboratoire francais duFractionnement et des Biotechnologies，Les Ulis，法国)和FXI浓缩剂(BioProducts Laboratory，Elstree，Hertfordshire，UK))、FX、FIX(例如，BENEFIX凝血因子IX(Wyeth，Madison，NJ)；ALPHANINESD(Grifols，Los Angeles，CA)；MONONINE(CSL Behring，King of Prussia，PA)；BEBULIN-VHTM(Baxter，Deerfield，IL)；PROFILNINESD(Grifols，Los Angeles，CA)；或PROPLEX TTM(Baxter，Deerfield，IL))、FVIII(例如，ADVATETM(Baxter，Deerfield，IL)；HELIXATEFS(CSLBehring，King of Prussia，PA)；REFACTO(Wyeth，Madison，NJ)、XYNTHATM(Wyeth，Madison，NJ)、KOGENATE和KOGENATEFS(Bayer，Pittsburgh，PA)；ALPHANATE(Grifols，Los Angeles，CA)；HEMOPHIL MTM(Baxter，Deerfield，IL)；KOATE-DVI(TalecrisBiotherapeutics-USA，Research Triangle Park，NC)；或MONARC-MTM(Baxter，Deerfield，IL))、FVIIa(例如，NOVOSEVENFVIIa(NovoNordisk，Princeton，NJ)和FVII浓缩剂(Baxter Bioscience，Vienna，Austria，或BioProducts Laboratory，Elstree，Hertfordshire，UK))、FV、Fva、FII和/或Fill。在某些情况下，对象还接受FEIBA VH ImmunoTM(Baxter BioScience，Vienna，澳大利亚)，这是冻干的无菌人血浆级分，具有凝血因子VIII抑制剂旁路活性。FEIBA VH ImmunoTM包含大致等单位的凝血因子VIII抑制剂旁路活性和凝血酶原复合物因子(凝血因子II、VII、IX、和X，以及C蛋白)。其他示例性的联合治疗包括但不限于前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、Von Willebrand因子、组织因子、和凝血酶。另外或附加地，TFPI抑制肽与一个或多个不同的TFPI抑制肽共同配制。
因此，本发明包括向对象施用本发明的TFPI结合肽(例如TFPI抑制肽)(或多个TFPI抑制肽)与一种或多种其它适当的物质的组合，每种其它物质都根据适合于该药物的方案给药。给药策略包括TFPI抑制肽和一种或多种其他适当药剂同时给药(即，基本上同时间给药)和非同时给药(即在不同的时间以任何顺序给药，不管是否重叠)。要领会，不同的组分任选在相同或分开的组合物中、和通过相同或不同的给药途径施用。
在一些实施方案中，本发明的肽与部分、例如治疗或诊断部分如检测部分和上面描述的联合治疗物结合。另外或附加地，所述肽与下述作用的相互作用配偶体(例如抗体、抗体片段、抗运载蛋白、适配体或镜像异构体)组合：(a)与所述肽结合和(b)有治疗活性和/或与向相互作用配偶体提供附加功能的部分(例如治疗剂、诊断剂或检测剂)连接。适合的部分包括但不限于染料、放射性核素、含放射性核素的复合物、酶、毒素、抗体、抗体片段、和细胞毒性剂，在有些情况下，所述部分具有治疗活性(即，达到有利的或想要的生物效应)。肽结合物或肽-相互作用配偶体对适合用于本文描述的任何方法，例如治疗患有疾病或病症或有患疾病或病症风险的对象的方法。
本说明书引用的所有的出版物、专利和专利申请在此引为参考，如同具体和个别地指出各个出版物或专利申请被引为参考一样。另外，整个文件旨在按照一体化的公开内容关联起来，应该理解设想了本文描述特征的所有组合，即便在本文件的同一句子、或段落、或章节中没有一起发现所述特征组合。例如，在描述蛋白疗法之处，具体设想了包括多核苷酸疗法(使用编码蛋白的多核苷酸/载体)，反过来也同样。虽然为了清楚了解的目的，借助说明和实例已经较详细地描述了上述发明，但技术领域的普通专业人员应该容易认识到，根据本发明的教导可以作出某些改变和修改而不背离所附权利要求的内涵或范围。本发明包括，例如，在范围上以任何方式比上述具体提到的变体窄的本发明实施方案。关于作为类属描述的本发明的方面，所有个体种类都被个别认为是本发明的单独的方面。关于本发明用不带数量的指示物描述或主张的方面，要了解这是指“一个或多个”，除非上下文明确地要求了更限定的含意。关于在组内描述为一个或多个的要素，要了解设想了组内的所有组合。
实施例
实施例1
以下实施例描述结合TFPI的肽的产生、鉴别和筛选。
肽候选物从供应商(例如，Polypeptide Laboratories SAS(Strasbourg，法国)和JPT Peptide Technologies GmbH(Berlin，德国))获得。上面提供了合成候选肽的方法。候选肽合成为三氟乙酸盐(TFA)，纯度为＞90％或＞60％。所有肽溶解在DMSO中达储存浓度10mM。TFPI结合肽序列使用mRNA展示文库鉴别。mRNA展示技术优于其他的文库筛查技术，允许在起始合并物内多样性达1014的不同序列，并避免了例如噬菌体展示需要的体内步骤。简言之，所述技术包括将mRNA与它编码的候选肽通过嘌呤霉素分子直接连接(图5)。mRNA展示方法进一步描述在国际专利公布No.WO 2005/051985和Liu等，Methods in Enzymology，318，268-293(2000)中。TFPI通过生物素固定到固体载体上并暴露于候选肽-RNA复合物。分离结合了TFPI的候选肽-RNA复合物，并将所述RNA反转录以获得编码DNA。使用竞争性规避策略，在六到十轮选择之后，获得高亲合性结合剂。许多候选肽的长度是31个氨基酸(27个随机化氨基酸和在两端旁侧的2个氨基酸)。
将选出的肽合成并使用基于微阵列的扫描分析进行肽优化，以鉴别维持TFPI结合亲合性的肽片段。例如，使用所述肽的一系列20氨基酸片段执行JBT0047的基于微阵列的扫描，所述片段的序列有19个氨基酸重叠。N和C末端截断分析补充了扫描分析。微阵列扫描结果证明肽JBT0293结合TFPI的亲合性最高。产生基于氨基酸序列JBT0293的一系列取代突变体，并测试TFPI结合性。
一部分肽对TFPI的亲合性通过用生物素化肽执行的酶联免疫吸附分析(结合(EC50)ELISA)证明。96孔MaxiSorp板(Nunc)用含3μg/mLTFPI的涂层缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH 9.6)包被过夜。350μl洗涤缓冲液(HNaT：175mM NaCI，25mM HEPES，5mMCaCl2，0.1％Tween 80，pH 7.35)洗涤三次，随后用含200μl 2％酵母提取物的HNaT封闭2小时。板用350μl HNaT洗涤三次。生物素化候选肽的DMSO储液在HNaT中1/200稀释。如果10mM肽储液1/200稀释期间没有出现沉淀，那么初始肽浓度是50μM。如果形成沉淀，那么实施肽储液在DMSO中的预稀释。稀释的肽施加到Maxisorp板，产生连续稀释液(1/3)，将所述稀释稀释液在室温下温育1.5小时。温育后接着三个洗涤步骤(350μl HNaT)。通过用辣根过氧化酶结合的链亲和素温育(1小时)，然后用HNaT进行三个洗涤步骤，和随后添加TMB(3，3′5，5′-四甲基联苯氨)显色转化，来检测结合的肽。所述分析图示在图6A中。
一般而言，肽结合固定化的TFPI将显著超过背景信号。图32-39给出了生物素化肽的EC50值。图7描绘了一个TFPI结合性肽JBTO132的结合曲线。JBT0132的EC50经计算为约2.2nM。
另外，使用生物素化的TFPI结合性肽作为“示踪剂”执行竞争(IC50)ELISA，与非生物素化的候选肽竞争与TFPI结合。分析原理描绘在图6B中。96孔MaxiSorp板(Nunc)用含3μg/mL TFPI的涂层缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH 9.6)包被过夜。350μl洗涤缓冲液(HNaT：175mM NaCl，25mM HEPES，5mM CaCl2，0.1％Tween 80，pH 7.35)洗涤三次，并用含200μl 2％酵母提取物的HNaT封闭2小时。板用350μl HNaT洗涤三次。生物素化的示踪肽以对应于它们在结合ELISA中测定的相应EC90值(中值，如果n＞2)的浓度施加。肽的竞争剂储液(10mM)在没有HSA的HNaT中1/33.3稀释，用含3％DMSO的HNaT制备一系列1/3稀释液。所述稀释液用生物素化的示踪肽以1∶6的比率进一步稀释(20μl竞争剂稀释液和100μl示踪肽)。竞争剂和示踪肽的混合物施加到包被TFPI的微量滴定板上，温育1.5小时。板用350μl HNaT洗涤三次。向微量滴定板施加结合HRP的链亲和素，温育所述混合物一小时，用350μl HNaT洗板三次，施加TMB(3，3′5，5′-四甲基联苯胺)，检测随后TMB通过HRP的显色转化。图8A-8D提供了代表性的非生物素化肽的IC50图。JBT0303、JBT0120和JBT0224的IC50测量结果示于表3。
表3
除了竞争ELISA(IC50)分析外，利用筛选分析来并行测量数目较多的肽。筛选ELISA类似于竞争IC50ELISA，不同之处在于仅仅使用三个不同浓度的竞争剂(对于JBT0047类为300nM、100nM和33.3nM，对于JBT0122类为50000nM、16667nM和5556nM)。在一些情况中，筛选结果表示为相对于竞争肽，示踪信号的抑制百分率(JBT0047家族的竞争肽是JBT0477，JBT0122家族的竞争肽是JBT1697)。图32-39提供了根据本文说明的方法制备和筛选的肽的竞争IC50分析结果和筛选分析结果。图32-39显示的平均IC50值是基于比表3中显示的值更大量的分析，因此，所述值稍有差别。筛选ELISA的结果表示为示踪肽JBT0131结合抑制的百分率。使用IC50ELISA分析的几个肽根据它们在表4显示的结合亲合性，在图32-39中分类。
表4
  TFPI竞争ELISA IC50[nM]   组
  ＜50nM   A
  50≤x＜100nM   B
  100≤x＜250nM   C
  250≤x＜1000nM   D
  1000≤x＜5000nM   E
  5000≤x＜10000nM   F
  10000≤x＜50000nM   G
利用本文描述的描述鉴别的示例性TFPI结合肽显示在表5中。一些肽是生物素化的，并且很多包含N和C末端赖氨酸以提高溶解度。如下所述，几个肽在模型和/或血浆分析系统中呈现TFPI抑制活性。
表5
本实施例提供了生成和鉴定TFPI抑制肽的示例性方法。发现表5中所有肽均结合人类TFPI-1α。突变分析证明，TFPI结合肽中至少一个氨基酸可以取代，同时保持对TFPI的亲合性。在ELISA分析中测试的表5肽与TFPI-1α结合的EC50小于10μM(1x10～5M)和IC50小于50μM。
实施例2
选出的TFPI结合肽在“抗靶”结合方面进一步进行鉴定。本实施例证明，TFPI抑制肽表现出对非TFPI-1蛋白质的亲合性降低。
TFPI-2由于它与TFPI-1的相似性，被选为抗靶。TFPI-结合肽与人类TFPI-1(残基29-282在C末端处与10His-标签融合；MW 41kDa(R&D Systems，Minneapolis，MN；目录号2974-PI))、鼠类TFPI-I(残基29-289在C末端处与10His-标签融合；MW 41kDa(R&D Systems；目录号2975-PI))和TFPI-2(R&D Systems，Minneapolis，MN)的结合动力学使用BIAcore 3000TM表面等离子体共振分析(GE Healthcare，Chalfont St.Giles，UK)研究。TFPI蛋白通过胺连接化学而固定在C1芯片上(GEHealthcare，订货代码：BR-1005-40)，目标为500RU。使用几个TFPI结合肽作为分析物，与固定化的TFPI蛋白相互作用。采用的流速为30μl/min。180秒后，注射180μl范围从3.84nM至656.25nM的六个不同浓度的肽溶液，然后是480秒的解离时间。芯片用45μl10mM NaOH再生。在每个结合试验之前和之后用HBS-P缓冲液(10mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，0.005％P20)加上1％DMSO和0.8％P80进行四次测量。利用BIAevaluation4.1版软件(GE Healthcare)分析数据。将感应图针对1:1Langmuir结合曲线进行拟合，以确定kon和koff，并计算KD。
某些被测肽，例如JBT0050、JBT0121、JBT0205和JBT0211，与空白孔结合，从那些感应图不能确定结合常数。JBT0133显示与TFPI-1弱结合。来自其他肽的感应图给出了可靠的结合常数。表6和图19-21提供了几个TFPI-1抑制肽的BIAcore分析结果。表6列出的每个肽显示KD小于10μM。两种肽的感应图提供为图9A和9B。
表6
  肽   kon(l/Ms)   koff(l/s)   KD(M)
  JBT0047   4.0x105   1.9x10-2   4.7x10-8
  JBT0120   1.17x106   4.78x10-2   4.08x10-8
  JBT0131   1.4x105   6.0x10-2   4.31x10-7
  JBT0132   3.55x104   3.26x10-2   9.17x10-7
  JBT0224   6.39x104   1.95x10-2   3.05x10-7
  JBT0293   6.0x105   5.6x10-2   9.5x10-8
  JBT0297   5.0x105   1.4x10-2   2.9x10-8
  JBT0303   8.13x105   2.75x10-2   3.4x10-8
  JBT0305   7.5x105   3.1x10-2   6.1x10-8
还检查了与TFPI-2抗靶的相互作用。候选肽与人类TFPI-2相互作用产生的最大信号比用TFPI-1作为相互作用配偶体获得的信号低得多。低TFPI-2结合信号的动力学分析容易产生误差；因此，感应图的视觉比较用于估计结合亲合性。图10A和10B提供了表明JBT0120与TFPI-1和TFPI-2结合的感应图。JBT0120结合TFPI-2的亲合性比它结合TFPI-1的亲合性低10倍。还发现JBT0132对TFPI-1的亲合性比TFPI-2高10倍。
本实施例提供的数据证实，TFPI-1抑制肽特异性结合TFPI-1。
实施例3
下面的实施例描述了使用FXa抑制和外源tenase抑制分析，鉴定实施例1中鉴别的选择肽的TFPI-1抑制活性。所述两个分析预测血浆系统中的活性。外源tenase分析用于了解所述肽对以下作用的影响：(a)FXa和TFPI的相互作用，和(b)FXa-TFPI复合物与TF-FVIIa复合物的相互作用。FXa抑制分析仅测量肽对FXa和TFPI相互作用的影响。
外源tenase复合物在凝血过程开始后，造成FX和FIX活化。所述外源复合物由FVIIa、组织因子(TF)和FX底物构成。为了确定肽对外源tenase复合物的TFPI介导抑制的影响，建立了酶联分析。肽从10mM储液(在DMSO中)1/6.25稀释，并通过在DMSO中连续1/4稀释而进一步稀释，以防止不想要的沉淀。TFPI在HNaCa-HSA(25mMHEPES；175mM NaCl；5mM CaCl2；0.1％HSA；pH 7.35)中稀释。向96孔板加入全部都在HNaCa-HAS中稀释的FVIIa、脂质化TF、磷脂囊泡(DOPC/POPS 80/20)和FXa特异性显色底物(S-2222(得自DiaPharma，West Chester，OH))。温育期后，添加TFPI和肽稀释液，使得终浓度为2.5％DMSO。通过向孔中添加FX，启动FX活化。通过使用微型版读数器观察吸光度增加，确定FXa介导的显色底物转化。由OD读数计算某些时点产生的FXa的量。考虑反应开始后20分钟产生的FXa用于从肽浓度对比TFPI抑制(％)的图中计算EC50。
使用FXa抑制分析还检查了TFPI的功能抑制。FXa特异性显色底物(S-2222)和TFPI均在HNaCa-HSA中稀释，将它们加到96孔板中。肽从10mM储液(在DMSO中)1/6.25稀释，并通过在DMSO中连续1/4稀释而进一步稀释，以防止不想要的沉淀。向96孔板添加肽稀释液(2.5μl)，使得终浓度为2.5％DMSO。通过添加FXa引发显色底物的转化，转化动力学在微型板读数器中测量。因为TFPI缓慢抑制FXa，所以考虑115分钟后的OD读数用于从肽浓度对比TFPI抑制(％)的图中计算EC50。
表7和图22-27提供了外源tenase分析和FXa抑制分析的结果。
表7
参考表7，JBT0120、JBT0132和JBT0224在TFPI-1存在下恢复外源复合物介导的FX活化，EC50为＜2μM，产生约20％至约60％的TFPI活性抑制。JBT0047(EC50＝1.4μM)、JBT0131(EC50＝2.2μM)和JBT0293(EC50＝2.9μM)也在TFPI-1存在下恢复外源复合物活性。另外，在FXa抑制分析中，JBT0120、JBT0132、JBT0224和JBT0303在TFPI-1存在下恢复FXa活性，EC50为＜5μM，产生约5％至约50％的TFPI活性抑制。在Fxa抑制分析中，JBT0047(EC50＝0.7μM)、JBT0131(EC50＝8.2μM)、JBT0293(EC50＝1.3μM)、JBT0297(EC50＝0.6μM)和JBT0305(EC50＝2.3μM)也在TFPI-1存在下恢复FXa活性。本实施例证实本发明的肽是TFPI拮抗剂。
实施例4
在本实施例中，使用基于血浆的分析确定肽的TFPI抑制活性。
在缓慢裂解凝血酶特异性荧光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC(Hemker，Pathophysiol.Haemost.Thromb.，33，4-15(2003))后，在FluoroskanAscent读数器(Thermo Labsystems，Helsinki，芬兰；滤光片390nm激发光和460nm发射光)中通过自动校准的血栓图像，双份测量肽对凝血酶生成的影响。获取FVIII或FIX缺乏患者的血浆(George KingBio-Medical Inc.，Overland Park，KN)供测试。每个血浆的残余凝血因子活性低于1％。作为用于抗体介导的FVIII缺乏的模型，将冷冻的正常血浆合并物(George King Bio-Medical Inc.，Overland Park，KN)与在山羊中产生的高滴度、热灭活的抗人类FVIII血浆(4490BU/ml；BaxterBioScience，Vienna，澳大利亚)一起温育，达到50BU/mL。血浆与玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)(Hematologic Technologies，Inc.，Essex Junction，VT)混合，以抑制凝血因子XIIa杂质，导致终浓度为40μg/mL。
预温的(37℃)血浆(80μL)加到96孔微型板(Immulon 2HB，透明U型底；Thermo Electron，Waltham，MA)的每个孔中。为了触发通过组织因子产生凝血酶，添加10μL包含低量(12pM)重组人类组织因子和由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷酯酰乙醇胺构成的磷脂囊泡(48μM)(Thrombinoscope BV，Maastricht，荷兰)的低PPP试剂。肽从10mM储液用DMSO 1/7.5稀释，并用Aqua-Dest进一步1/8.33稀释，导致DMSO浓度为12％，在最终分析混合物中提供0.5％DMSO浓度。在马上要把板放入预温的(37℃)读数器之前，加入5μL含有5mg/mL人血清白蛋白(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，Missouri，USA)的HEPES缓冲盐水或含12％DMSO的Aqua-Dest，然后加入肽稀释液或参比蛋白(FVIII Immunate参比标准品(Baxter BioScience，Vienna，澳大利亚)、凝血因子VIII抑制剂旁路活性(FEIBA)参比标准品(Baxter BioScience，Vienna，澳大利亚)、NovoSeven(Novo Nordisk，丹麦)、和纯化的人血浆FIX(Enzyme Research Laboratories，South Bend，IL))。通过向每孔分配20μL含有荧光底物和HEPES-缓冲的CaCl2(100mM)的FluCa试剂(Thrombinoscope BV，Maastricht，荷兰)，启动凝血酶生成。37℃下记录荧光强度。
使用ThrombinoscopeTM软件(Thrombinoscope BV，Maastricht，荷兰)和凝血酶校正器来校正内部滤光片和底物消耗作用，计算所得到的凝血酶生成曲线的参数(Hemker，Pathophysiol.Haemost.Thromb.，33，4-15(2003))。为了计算某些与参比蛋白(例如，FVIII Immunate参比标准品，FEIBA参比标准品)等效的肽浓度的凝血酶生成活性，针对标准浓度绘制各凝血酶生成曲线的峰值凝血酶量(峰值凝血酶，nM)，并通过非线性算法拟合。根据该校正，计算FVIII Immunate、FIX、FEIBA或NovoSeven的等效活性。图12-18和28-30提供了各种肽的结果。代表性结果提供在表8中。(*表示从不同供体获得的FVIII缺乏血浆。)
表8
参考表8，JBT0120、JBT0132、JBT0224和JBT0303在贫FVIII血浆中，将TFPI依赖性凝血酶生成提高到超过在含有FVIII的血浆中凝血酶生成水平的1％(％FVIII-等效活性)。被测肽在贫FVIII血浆中表现出大约5％-40％的FVIII-等效活性。如图11A和11B所示，JBT0120和JBT0132剂量依赖性地提高峰值凝血酶和峰值时间。
实施例5
下面的实施例证明本发明的可以通过添加提高肽的物理化学或药代动力学性质的部分加以修饰。如下面所说明，向本文描述的肽添加40kDa PEG显著改善了肽的药代动力学行为。
向肽结合化学或生物部分的方法是技术领域中已知的。为了向本文描述的肽加入PEG(聚乙二醇)，向所述肽的N末端添加官能团(AOA＝氨基氧乙酸)，用于联接醛和酮。或者，向所述肽的C末端部分添加半胱氨酸，用于与马来酰亚胺结合(Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press(1996))。将肽(JBT1586)AOA-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO：166)和(JBT1587)Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2(SEQ ID NO：167)用于分别用PEG进行N-端和C-端修饰。AOA-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO：166)和Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2(SEQ ID NO：167)分别与过量的40kDa mPEG-丙醛(SUNBRIGHT ME-400AL2，NOF，日本)和40kDa mPEG-马来酰亚胺(SUNBRIGHT ME-400MA，NOF，日本)一起温育。得到的PEG化肽，JBT1853和JBT1855，与起始结构Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(JBT0740)(SEQ ID NO：66)相比，表现出类似的亲和性。
得到的PEG化肽在小鼠中表现出血浆稳定性显著增加和血浆半衰期延长。图31示出了游离肽JBT0740(Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO：66)与C-端PEG化肽JBT1855(Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC(PEG(40kD))-NH2)(SEQ IDNO：252)比较的药代动力学分析结果。与未PEG化的肽形成对比，PEG化的肽在施用后100分钟时在小鼠血浆中以高浓度存在。未PEG化的肽则迅速从血浆清除。

Claims (35)

1.一种结合组织凝血因子途径抑制剂(TFPI)的肽，其由SEQ IDNO:178所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:178具有至少90％同一性的氨基酸序列构成。
2.权利要求1的肽，其中所述肽的IC50小于250nM。
3.权利要求1的肽，其中所述肽的IC50小于50nM。
4.权利要求3的肽，其中IC50通过竞争性酶联免疫吸附分析(ELISA)确定。
5.权利要求1的肽，其中氨基酸序列同一性是至少95％或100％。
6.一种肽，其由选自SEQ ID NOs:49、56-58、63-66、71、96、104、106、163、164、166、167、174-176、181、252、383、583、606、659、943或956的氨基酸序列构成。
7.权利要求1的肽，其中所述肽与TFPI 1-α结合的解离常数小于10μM。
8.权利要求1的肽，其中所述肽抑制TFPI活性。
9.权利要求1至8任一项的肽，其中所述肽与聚乙二醇(PEG)部分结合。
10.权利要求1至8任一项的肽在制造用于治疗凝血障碍的药物中的应用。
11.权利要求9的肽在制造用于治疗凝血障碍的药物中的应用。
12.一种用于治疗疾病或病症的药物组合物，所述疾病或病症可通过抑制TFPI治疗、或者包含可通过抑制TFPI缓解或预防的症状，其中所述组合物包含权利要求1-8任一项中限定的肽和可药用载体。
13.权利要求12的药物组合物，其中所述组合物包含其它药物有效剂。
14.一种用于治疗疾病或病症的药物组合物，所述疾病或病症可通过抑制TFPI治疗、或者包含可通过抑制TFPI缓解或预防的症状，其中所述组合物包含权利要求9中限定的肽和可药用载体。
15.靶向体外细胞的方法，所述体外细胞展示TFPI，其中所述方法包含将所述细胞与权利要求1至8任一项中限定的肽接触。
16.根据权利要求15的方法，其中所述方法还包含检测肽与细胞上展示的TFPI的结合。
17.权利要求15的方法，其中所述肽与部分接合，其中这样的部分选自染料、荧光染料、放射性核素、含放射性核素的复合物、酶、毒素、抗体和细胞毒性剂。
18.权利要求16的方法，其中通过检测与所述肽或所述部分复合的相互作用配偶体，来检测肽-TFPI结合。
19.权利要求18的方法，其中所述相互作用配偶体选自抗体、抗运载蛋白、适配体和镜像异构体。
20.根据权利要求18的方法，其中所述相互作用配偶体包含检测部分。
21.权利要求20的方法，其中所述检测部分选自染料、荧光染料、放射性核素、含放射性核素的复合物和酶。
22.权利要求1-8任一项的肽在制备用于治疗患有凝血障碍或具有患凝血障碍风险的对象的药物中的应用，其中所述肽与治疗剂结合。
23.权利要求1-8任一项的肽在制备用于治疗患有凝血障碍或具有患凝血障碍风险的对象的药物中的应用，其中所述对象被施用相互作用配偶体，所述相互作用配偶体：(a)结合所述肽，和(b)是治疗剂或与治疗剂结合。
24.权利要求23的应用，其中所述相互作用配偶体选自抗体、抗运载蛋白、适配体和镜像异构体。
25.权利要求22的应用，其中所述治疗剂选自染料、荧光染料、放射性核素、含放射性核素的复合物、酶、毒素、抗体和细胞毒性剂。
26.权利要求23的应用，其中所述治疗剂选自染料、荧光染料、放射性核素、含放射性核素的复合物、酶、毒素、抗体和细胞毒性剂。
27.权利要求1-8任一项中限定的肽在制备用于诊断对象患有凝血障碍或具有患凝血障碍风险的药物中的应用，其中肽与可检测部分结合，和检测所述可检测部分指示所述对象患有凝血障碍或具有患凝血障碍风险。
28.权利要求1-8任一项中限定的肽在制备用于诊断对象患有凝血障碍或具有患凝血障碍风险的药物中的应用，其中所述对象被施用与可检测部分结合的相互作用配偶体，和检测所述可检测部分指示所述对象患有凝血障碍或具有患凝血障碍风险。
29.权利要求28的应用，其中所述相互作用配偶体选自抗体、抗运载蛋白、适配体和镜像异构体。
30.权利要求27的应用，其中所述可检测部分选自染料、荧光染料、放射性核素、含放射性核素的复合物、酶、毒素、抗体和细胞毒性剂。
31.权利要求28的应用，其中所述可检测部分选自染料、荧光染料、放射性核素、含放射性核素的复合物、酶、毒素、抗体和细胞毒性剂。
32.纯化TFPI的方法，其中所述方法包含
a)将包含TFPI的样品与权利要求1-8任一项中限定的肽在适合于形成TFPI和所述肽之间复合物的条件下接触；
b)从样品取出所述复合物；并任选，
c)解离所述复合物以释放TFPI。
33.权利要求32的方法，其中所述肽固定在固体载体上。
34.根据权利要求32的方法，其中所述肽固定在层析固定相上，和步骤(c)包含洗脱与所述固定化肽结合的TFPI。
35.权利要求34的方法，其中所述肽经亲和层析纯化。
CN200980156547.8A 2008-12-19 2009-12-21 Tfpi抑制剂和使用方法 Active CN102348462B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510260670.1A CN104984319A (zh) 2008-12-19 2009-12-21 Tfpi抑制剂和使用方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13927208P 2008-12-19 2008-12-19
US61/139,272 2008-12-19
PCT/US2009/069060 WO2010071894A2 (en) 2008-12-19 2009-12-21 Tfpi inhibitors and methods of use

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510260670.1A Division CN104984319A (zh) 2008-12-19 2009-12-21 Tfpi抑制剂和使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102348462A CN102348462A (zh) 2012-02-08
CN102348462B true CN102348462B (zh) 2015-06-17

Family

ID=42269298

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980156547.8A Active CN102348462B (zh) 2008-12-19 2009-12-21 Tfpi抑制剂和使用方法
CN201510260670.1A Pending CN104984319A (zh) 2008-12-19 2009-12-21 Tfpi抑制剂和使用方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510260670.1A Pending CN104984319A (zh) 2008-12-19 2009-12-21 Tfpi抑制剂和使用方法

Country Status (16)

Country Link
US (3) US8466108B2 (zh)
EP (1) EP2379096B1 (zh)
JP (3) JP5739816B2 (zh)
KR (3) KR102165021B1 (zh)
CN (2) CN102348462B (zh)
AU (1) AU2009327338B2 (zh)
BR (2) BR122021014783B1 (zh)
CA (1) CA2747721C (zh)
DK (1) DK2379096T3 (zh)
ES (1) ES2773766T3 (zh)
HR (1) HRP20192282T8 (zh)
HU (1) HUE046951T2 (zh)
LT (1) LT2379096T (zh)
NZ (2) NZ607892A (zh)
SI (1) SI2379096T1 (zh)
WO (1) WO2010071894A2 (zh)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5739816B2 (ja) 2008-12-19 2015-06-24 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ Ｔｆｐｉインヒビターおよび使用法
PL2379600T5 (pl) 2008-12-22 2021-03-08 Novo Nordisk A/S Przeciwciała przeciwko inhibitorowi szlaku czynnika tkankowego
CA2777700A1 (en) * 2009-10-14 2011-04-21 Aileron Therapeutics, Inc. Improved peptidomimetic macrocycles
KR101807894B1 (ko) 2010-03-01 2017-12-12 바이엘 헬스케어 엘엘씨 조직 인자 경로 억제제 (ｔｆｐｉ)에 대한 최적화된 모노클로날 항체
NZ603028A (en) * 2010-03-19 2014-11-28 Baxter Healthcare Sa Tfpi inhibitors and methods of use
US9228022B2 (en) 2010-06-30 2016-01-05 Novo Nordisk A/S Antibodies that are capable of specifically binding tissue factor pathway inhibitor
TW201212938A (en) 2010-06-30 2012-04-01 Novo Nordisk As Antibodies that are capable of specifically binding tissue factor pathway inhibitor
TWI483733B (zh) * 2011-02-11 2015-05-11 Baxter Int Ｔｆｐｉ抑制劑及使用方法
WO2012109675A1 (en) * 2011-02-11 2012-08-16 Baxter International Inc. Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics
WO2012178063A1 (en) 2011-06-23 2012-12-27 The Regents Of The University Of Michigan Compound and method for modulating opioid receptor activity
KR102263685B1 (ko) 2012-03-21 2021-06-11 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 Tfpi 저해제 및 사용 방법
CN104215707B (zh) * 2014-09-02 2016-01-20 福建中医药大学 栝楼桂枝汤的质量检测方法
EP4279128A3 (en) 2015-02-25 2024-02-28 Mogam Institute for Biomedical Research Novel antibody binding to tfpi and composition comprising the same
KR20230074843A (ko) * 2015-08-19 2023-05-31 화이자 인코포레이티드 조직 인자 경로 억제제 항체 및 그의 용도
JP7152084B1 (ja) * 2022-02-22 2022-10-12 株式会社血栓トランスレーショナルリサーチラボ 組織因子経路インヒビターの抗凝固活性の検査試薬、検査試薬セット、および検査方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7015194B2 (en) * 2000-05-10 2006-03-21 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition comprising factor VIIa and anti-TFPI

Family Cites Families (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS607193B2 (ja) 1978-01-10 1985-02-22 トヨタ自動車株式会社 熱風循環型乾燥炉
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5733175A (en) 1980-07-31 1982-02-23 Mitsubishi Electric Corp Transmitter for signal of elevator
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4791192A (en) * 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4966852A (en) * 1987-07-23 1990-10-30 Monsanto Company DNA clone of human tissue factor inhibitor
IL87171A (en) 1987-11-23 1995-08-31 Monsanto Co ANDC of human tissue factor inhibitor
US5663143A (en) 1988-09-02 1997-09-02 Dyax Corp. Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase
US5219994A (en) * 1988-11-08 1993-06-15 W. Alton Jones Cell Science Center, Inc. Inhibitor of tissue factor activity
JPH07504152A (ja) * 1990-02-08 1995-05-11 マゲイニン　ファーマスーティカルズ，　インコーポレーテッド 生物活性ペプチドおよび標的細胞、ウイルス、あるいはウイルス感染細胞の成長を抑制する方法
US5466468A (en) 1990-04-03 1995-11-14 Ciba-Geigy Corporation Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids
US5622988A (en) * 1990-06-15 1997-04-22 Novo Nordisk A/S Use of a low molecular weight metabolite from fungus for reducing prolonged coagulation time
DK146190D0 (da) 1990-06-15 1990-06-15 Novo Nordisk As Hidtil ukendte forbindelser
US5849703A (en) * 1990-08-27 1998-12-15 G. D. Searle & Co. Pre-formed anticoagulant heparin/TFPI complexes
DK261490D0 (da) 1990-10-31 1990-10-31 Novo Nordisk As New pharmaceutical compound
US5197973A (en) * 1990-12-14 1993-03-30 Creative Biomolecules, Inc. Synthetic bioadhesive
US5399363A (en) 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
JPH04252954A (ja) 1991-01-29 1992-09-08 Asahi Chem Ind Co Ltd タンパクの測定方法、試薬及びキット
US5833982A (en) 1991-02-28 1998-11-10 Zymogenetics, Inc. Modified factor VII
US5997864A (en) * 1995-06-07 1999-12-07 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
JPH067193A (ja) 1991-11-29 1994-01-18 Teijin Ltd モノクローナル抗体
EP0539975A1 (en) * 1991-10-31 1993-05-05 Teijin Limited Method for immunological assay of free lipoprotein-associated coagulation inhibitor (LACI) and kit therefor
IL104324A0 (en) 1992-01-07 1993-05-13 Novo Nordisk As Variant of human kunitz-type protease inhibitor
IL104326A0 (en) 1992-01-07 1993-05-13 Novo Nordisk As Variant of human kunitz-type protease inhibitor
IL104314A0 (en) 1992-01-07 1993-05-13 Novo Nordisk As Human kunitz-type protease inhibitor and variants thereof,their production and pharmaceutical compositions containing them
IL104325A (en) * 1992-01-07 2000-10-31 Novo Nordisk As Variants of human kunitz-type protease inhibitor domain II of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) pharmaceutical compositions containing them a DNA construct encoding them their expression vectors a cell containing said DNA constructs and methods for the production of all the above
IL104327A0 (en) * 1992-01-07 1993-05-13 Novo Nordisk As Variant of human kunitz-type protease inhibitor
AU4784693A (en) 1992-07-24 1994-02-14 Oklahoma Medical Research Foundation Blockade of protein c activation reduces microvascular surgical blood loss
JPH06153985A (ja) 1992-11-16 1994-06-03 Teijin Ltd モノクローナル抗体
US5439686A (en) 1993-02-22 1995-08-08 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods for in vivo delivery of substantially water insoluble pharmacologically active agents and compositions useful therefor
DK0693924T4 (da) 1993-02-22 2008-08-04 Abraxis Bioscience Inc Fremgangsmåde til (in vivo) levering af biologiske materialer og sammensætninger, der er egnede dertil
CA2170030A1 (en) * 1993-09-14 1995-03-23 Robert A. Lazarus Pharmaceutical compositions containing ecotin and homologs thereof
US5455338A (en) 1993-11-05 1995-10-03 Zymogenetics, Inc. DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto
PT737207E (pt) 1994-01-11 2005-02-28 Dyax Corp Inibidores de plasmina humana derivados de dominios kunitz
US5902582A (en) * 1995-09-05 1999-05-11 Chiron Corporation Use of TFPI inhibitor for treatment of cancer
JP3681206B2 (ja) 1995-12-26 2005-08-10 株式会社三菱化学ヤトロン 抗ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用
AU6042298A (en) 1997-01-31 1998-08-25 Human Genome Sciences, Inc. Tissue factor pathway inhibitor-3
US20050032690A1 (en) * 1997-09-10 2005-02-10 Rojkjaer Lisa Payne Factor VII polypeptides for preventing formation of inhibitors in subjects with haemophilia
WO1999042119A1 (en) * 1998-02-18 1999-08-26 Harbor-Ucla Research And Education Institute Antimicrobial peptides and derived metapeptides
JP2000128803A (ja) 1998-10-19 2000-05-09 Shionogi & Co Ltd ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビター−２抗体
AU3395900A (en) * 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides
CN1368886A (zh) 1999-07-23 2002-09-11 斯克里普斯研究所 用于测定全血中的凝固因子活性的方法
US6180607B1 (en) * 1999-08-05 2001-01-30 Christopher Davies Protein having proteinase inhibitor activity
US6458387B1 (en) 1999-10-18 2002-10-01 Epic Therapeutics, Inc. Sustained release microspheres
AU2236201A (en) 1999-11-16 2001-05-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Compositions and methods for regulating tumor-associated antigen expression
US6821775B1 (en) * 2000-02-11 2004-11-23 Genvec, Inc. Viral vector encoding pigment epithelium-derived factor
DE60112429T2 (de) * 2000-05-10 2006-06-01 Novo Nordisk Health Care Ag Verwendung von faktor vii-a und faktor xiii enthaltenden pharmazeutischen verbindungen
WO2001087323A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Genentech, Inc. Method for treating cartilage disorders
WO2002033089A2 (en) * 2000-10-05 2002-04-25 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Ixodes scapularis tissue factor pathway inhibitor
WO2002038744A2 (en) 2000-10-18 2002-05-16 Incyte Genomics, Inc. Proteases
US7374782B2 (en) 2000-10-27 2008-05-20 Baxter International Inc. Production of microspheres
US20040142892A1 (en) * 2001-04-30 2004-07-22 The University Of British Columbia Autogene nucleic acids encoding a secretable RNA polymerase
JP2004534855A (ja) 2001-07-20 2004-11-18 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 第ｖｉｉ因子ポリペプチドおよび第ｘｉ因子ポリペプチドを含んでなる医薬組成物
US20030040480A1 (en) * 2001-07-20 2003-02-27 Rasmus Rojkjaer Pharmaceutical composition comprising factor VII polypeptides and factor XI polypeptides
US20080026068A1 (en) * 2001-08-16 2008-01-31 Baxter Healthcare S.A. Pulmonary delivery of spherical insulin microparticles
DK1418890T3 (da) 2001-08-16 2008-08-11 Baxter Int Drivmiddel-baserede mikropartikelformuleringer
US20050233945A1 (en) * 2003-07-18 2005-10-20 Larry Brown Methods for fabrication, uses and compositions of small spherical particles of insulin prepared by controlled phase separation
US20030056474A1 (en) * 2001-09-26 2003-03-27 Chieh Szu Chung Method of inspecting newly purchased or reground materials for making printed circuit boards
US20030124132A1 (en) * 2001-09-27 2003-07-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined compositions for tumor vasculature coaguligand treatment
US7291587B2 (en) * 2001-11-09 2007-11-06 Novo Nordisk Healthcare A/G Pharmaceutical composition comprising factor VII polypeptides and TAFI polypeptides
WO2003039579A1 (en) 2001-11-09 2003-05-15 Novo Nordisk Health Care Ag Pharmaceutical composition comprising factor vii polypeptides and tafi polypeptides
US20050214836A1 (en) * 2002-08-30 2005-09-29 Oncotherapy Science, Inc. Method of diagnosing ovarian endometriosis
WO2005029089A2 (en) 2003-09-24 2005-03-31 Oncotherapy Science, Inc. Method of diagnosing ovarian endometriosis using tfpi-2 protein
AU2003265866A1 (en) 2002-09-03 2004-03-29 Vit Lauermann Targeted release
EP1403638A1 (en) 2002-09-25 2004-03-31 Mondobiotech SA Molecular methods for diagnosing interstitial lung diseases
DE602004031589D1 (de) 2003-01-07 2011-04-14 Dyax Corp Kunitz-domäne-bibliothek
AU2003229678A1 (en) 2003-04-15 2004-11-04 Dirk Koczan Method for diagnosing rheumatoid arthritis or osteoarthritis
CA2528631C (en) 2003-07-04 2010-06-08 Beijing Grand Golden-Bright Engineering & Technologies Co. Ltd. A process for catalytic hydrocarbon recombination
US20070092452A1 (en) 2003-07-18 2007-04-26 Julia Rashba-Step Methods for fabrication, uses, compositions of inhalable spherical particles
US20050142205A1 (en) 2003-07-18 2005-06-30 Julia Rashba-Step Methods for encapsulating small spherical particles prepared by controlled phase separation
US20050048127A1 (en) * 2003-07-22 2005-03-03 Larry Brown Small spherical particles of low molecular weight organic molecules and methods of preparation and use thereof
WO2005024006A2 (en) 2003-09-09 2005-03-17 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii polypeptides
ES2381110T3 (es) * 2003-09-09 2012-05-23 Novo Nordisk Health Care Ag Polipéptidos de factor VII de coagulación
WO2005034844A2 (en) 2003-09-12 2005-04-21 Cleveland State University Exosite-directed thrombin inhibitors
EP1667743B1 (de) 2003-09-29 2008-01-02 Hemoteq AG Biokompatible, biostabile beschichtung von medizinischen oberflächen
US20090232866A1 (en) * 2003-10-07 2009-09-17 Mariann Pavone-Gyongyosi Oligopeptides as coating material for medical products
BRPI0416461A (pt) 2003-11-20 2007-03-06 Novo Nordisk Healthcare Ag método para o tratamento de episódios de sangramento, formulação farmacêutica, e, uso de um polipeptìdeo fxi
US20050181978A1 (en) * 2003-11-20 2005-08-18 Rasmus Rojkjaer Therapeutic use of factor XI
KR101337320B1 (ko) 2003-11-20 2013-12-06 사노피 파스퇴르 인크 백일해 독소의 정제방법 및 이에 유용한 펩타이드
US20050147689A1 (en) * 2003-12-30 2005-07-07 Egilmez Nejat K. Method for inhibiting the growth of gastrointestinal tract tumors
EP1718347B1 (de) * 2004-02-28 2017-03-08 Hemoteq AG Biokompatible beschichtung, verfahren und verwendung von medizinischen oberflächen
JP2007537205A (ja) 2004-05-11 2007-12-20 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 熱傷外傷の治療のためのＶＩＩａ因子の使用
US8333995B2 (en) * 2004-05-12 2012-12-18 Baxter International, Inc. Protein microspheres having injectable properties at high concentrations
US8728525B2 (en) 2004-05-12 2014-05-20 Baxter International Inc. Protein microspheres retaining pharmacokinetic and pharmacodynamic properties
WO2005115442A1 (en) 2004-05-25 2005-12-08 Novo Nordisk Health Care Ag Use of coagulation factor xiii for treatment of post surgical bleedings
RU2347574C2 (ru) * 2004-05-27 2009-02-27 Эвиджен, Инк. Способы лечения коагулопатий с использованием сульфатированных полисахаридов
EP1761630A2 (en) 2004-06-21 2007-03-14 Novo Nordisk Health Care AG Glycosylation-disrupted factor vii variants
WO2006008267A2 (en) 2004-07-16 2006-01-26 Novo Nordisk Health Care Ag Methods for optimizing forming viiia-based hemostatic treatment
US20060040896A1 (en) 2004-08-18 2006-02-23 Paringenix, Inc. Method and medicament for anticoagulation using a sulfated polysaccharide with enhanced anti-inflammatory activity
BRPI0406057B1 (pt) 2004-09-15 2021-10-26 União Química Farmacêutica Nacional S/A Sequência nucleotídica de um inibidor de proteases do tipo kunitz obtida a partir de uma biblioteca de cdna de glândulas salivarares de carrapatos amblyomma cajennese uso da proteína recombinante
JP4252954B2 (ja) 2004-12-02 2009-04-08 インターナショナル・ビジネス・マシーンズ・コーポレーション 情報処理装置、情報処理装置のパワーマネージメント方法、およびそのためのプログラム
JP5236952B2 (ja) * 2005-02-28 2013-07-17 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 改善された特性を有するｆｘｉｉｉバリアント
US7682808B2 (en) * 2005-03-04 2010-03-23 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Coagulation and fibrinolytic cascades modulator
AU2006241145B2 (en) 2005-04-27 2011-04-28 Baxter Healthcare S. A. Surface-modified microparticles and methods of forming and using the same
KR20080008364A (ko) * 2005-05-05 2008-01-23 헤모텍 아게 관 스텐트의 전면 코팅
WO2006128497A1 (en) 2005-06-01 2006-12-07 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulation of factor xi
WO2007014749A2 (en) 2005-07-29 2007-02-08 Universiteit Van Maastricht Regulation of tissue factor activity by protein s and tissue factor pathway inhibitor
DE102005039579B4 (de) * 2005-08-19 2022-06-30 Magforce Ag Verfahren zur Einschleusung von therapeutischen Substanzen in Zellen
GB0525999D0 (en) 2005-12-21 2006-02-01 Ares Trading Sa Novel members of the kazal family of serine protease inhibitors
ES2809173T3 (es) * 2006-02-09 2021-03-03 Braun Melsungen Ag Método de revestimiento de balón plegable
US20070192033A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-16 Microsoft Corporation Molecular interaction predictors
WO2007127834A2 (en) 2006-04-26 2007-11-08 Medtronic, Inc. Compositions and methods of preparation thereof
US20070281031A1 (en) * 2006-06-01 2007-12-06 Guohan Yang Microparticles and methods for production thereof
EP1892303A1 (en) 2006-08-22 2008-02-27 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Methods for identifying therapeutical targets in tumors and for determining and targeting angiogenesis and hemostasis related to adenocarcinomas of the lung
EP1895436A1 (en) * 2006-08-31 2008-03-05 Silicos NV Method for evolving molecules and computer program for implementing the same
EP1913962A1 (en) 2006-10-22 2008-04-23 Ophir Perelson Expandable medical device for the treatment and prevention of cardiovascular diseases
JP5679663B2 (ja) 2007-02-23 2015-03-04 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 海藻抽出物からのフコイダン精製のためのプロセスの方法
EP1972687A1 (en) 2007-03-23 2008-09-24 GenOdyssee Polynucleotides and polypeptides of human factor VII gene, SNPs
US20100137211A1 (en) 2007-04-11 2010-06-03 Monahan Paul E Methods and compositions for intra-articular coagulation proteins
WO2008157824A2 (en) * 2007-06-21 2008-12-24 Conjuchem Biotechnologies Inc. Thrombopoietin peptide conjugates
BRPI0816837B1 (pt) 2007-09-28 2022-10-18 Portola Pharmaceuticals, Inc Composições farmacêuticas, polipeptídeo isolado de duas cadeias e uso de uma composição farmacêutica
WO2009061697A1 (en) 2007-11-09 2009-05-14 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Anticoagulant antagonist and hemophilia procoagulant
US20110027337A1 (en) 2007-12-21 2011-02-03 Ifxa A/S Protease inhibitor
FR2934052B1 (fr) 2008-07-17 2011-11-25 Stago Diagnostica Dosage de l'activite du facteur tissulaire circulant
UA112050C2 (uk) 2008-08-04 2016-07-25 БАЄР ХЕЛСКЕР ЛЛСі Терапевтична композиція, що містить моноклональне антитіло проти інгібітора шляху тканинного фактора (tfpi)
JP5977945B2 (ja) 2008-08-06 2016-08-24 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 長期のインビボ有効性を有するコンジュゲートタンパク質
KR100994996B1 (ko) 2008-08-06 2010-11-18 한국과학기술연구원 페난트렌 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한확인 방법
JP5739816B2 (ja) 2008-12-19 2015-06-24 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ Ｔｆｐｉインヒビターおよび使用法
NZ603028A (en) 2010-03-19 2014-11-28 Baxter Healthcare Sa Tfpi inhibitors and methods of use
PL2694544T3 (pl) 2011-04-01 2019-07-31 Bayer Healthcare Llc Przeciwciała monoklonalne przeciwko inhibitorowi szlaku czynnika tkankowego (TFPI)
EP2808081A4 (en) 2012-01-23 2015-08-26 N E Chemcat Corp BARIUM SULPHATE CONTAINING ALUMINUM MATERIAL AND EXHAUST GAS CLEANING CATALYST THEREOF
JP6153985B2 (ja) 2015-10-16 2017-06-28 株式会社スクウェア・エニックス ビデオゲーム処理プログラム、ビデオゲーム処理システム及びビデオゲーム処理方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7015194B2 (en) * 2000-05-10 2006-03-21 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition comprising factor VIIa and anti-TFPI

Also Published As

Publication number Publication date
US20100173847A1 (en) 2010-07-08
CN104984319A (zh) 2015-10-21
CA2747721C (en) 2021-07-20
JP6567577B2 (ja) 2019-08-28
KR102165021B1 (ko) 2020-10-14
WO2010071894A2 (en) 2010-06-24
KR20110134378A (ko) 2011-12-14
LT2379096T (lt) 2019-12-27
KR20180137609A (ko) 2018-12-27
JP5739816B2 (ja) 2015-06-24
KR101792032B1 (ko) 2017-11-02
US11001613B2 (en) 2021-05-11
US20130274193A1 (en) 2013-10-17
CN102348462A (zh) 2012-02-08
SI2379096T1 (sl) 2020-03-31
EP2379096A2 (en) 2011-10-26
JP6095717B2 (ja) 2017-03-15
HUE046951T2 (hu) 2020-04-28
ES2773766T3 (es) 2020-07-14
HRP20192282T1 (hr) 2020-03-06
JP2015178502A (ja) 2015-10-08
EP2379096B1 (en) 2019-10-30
JP2012512915A (ja) 2012-06-07
US8466108B2 (en) 2013-06-18
KR20170121334A (ko) 2017-11-01
AU2009327338B2 (en) 2015-07-02
HRP20192282T8 (hr) 2020-07-10
KR101977846B1 (ko) 2019-05-14
WO2010071894A3 (en) 2010-10-07
BR122021014783B1 (pt) 2023-03-14
US9777051B2 (en) 2017-10-03
EP2379096A4 (en) 2012-09-05
NZ593815A (en) 2013-05-31
US20180072784A1 (en) 2018-03-15
NZ607892A (en) 2014-11-28
CA2747721A1 (en) 2010-06-24
JP2017095518A (ja) 2017-06-01
AU2009327338A1 (en) 2011-06-30
BRPI0922344A2 (pt) 2017-10-24
DK2379096T3 (da) 2019-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102348462B (zh) Tfpi抑制剂和使用方法
JP2019108360A (ja) Ｔｆｐｉ阻害剤および使用方法
JP6711761B2 (ja) ペプチド及びその使用方法
AU2017203999B2 (en) Tfpi inhibitors and methods of use
EA041584B1 (ru) Пептиды, ингибирующие активность белка s, и их применение для лечения нарушения свертывания крови

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20170811

Address after: Illinois State

Co-patentee after: Hundred deep limited liability company

Patentee after: Hundred deep company

Address before: Illinois State

Co-patentee before: Baxter Healthcare S. A.

Patentee before: Baxter International Inc.

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210716

Address after: Osaka, Japan

Patentee after: TAKEDA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Address before: Illinois, USA

Patentee before: Baishen Co.

Patentee before: BAXALTA GmbH