JP5977945B2

JP5977945B2 - 長期のインビボ有効性を有するコンジュゲートタンパク質

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Description

本発明は、コンジュゲートタンパク質、特にそれだけに限らないが血液凝固因子、前記コンジュゲートを調製する方法、前記コンジュゲートを含む医薬組成物、および特にそれだけに限らないが、血液凝固因子により緩和される疾患の治療、例えば、血友病の予防的治療のための治療法でのコンジュゲートの使用に関する。

血液凝固は、最終的にはフィブリン塊を産生する様々な血液成分(または因子)の複雑な相互作用からなる過程である。一般に、凝固「カスケード」と称されているものに関与する血液成分は、(それ自体活性凝固因子である)活性化因子の作用によりタンパク質分解酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質(プロ酵素またはチモーゲン)である。このような変換を経た凝固因子は、一般に「活性因子」と称され、凝固因子の名前に「a」の文字を加えて称される(例えば、第VII因子a)。

重症血友病患者に対しては、オンデマンド治療から、出血およびその後の関節損傷を予防するための予防レジメンに向かう傾向がある。しかし、その循環半減期が短いことにより、特にFVIII、FIXおよびFVIIaなどの凝固因子は、高用量と頻繁な投与の両方が、薬理学的に関連する血漿濃度を維持するために必要とされるため、長期予防的治療には理想的でない。したがって、現在、予防的使用により適した長時間作用型類似体の開発に焦点が向けられている。

PEG化は、タンパク質の循環半減期を延長する確立された方法である。しかし、細胞膜内の凝固因子、他の凝固因子および補因子の大きな相互作用界面により、活性の有害な損失なしに化学変化が起こる可能性は限られている。

したがって、血友病の予防的治療のために増加した血漿半減期を有する血液凝固因子を提供することが大いに必要とされている。

国際公開第2005/027978号(Novo Nordisk A/S)は、ポリペプチドが、親水性スペーサーを介してアルブミン結合残基に連結された、延長された作用プロファイルを有するグルカゴン様ペプチド1(GLP-1)誘導体について記載している。

国際公開第2005/027978号国際公開第98/08871号国際公開第98/08872号国際公開第2008/0258556号国際公開第2005/014035号国際公開第2006/134174号米国特許出願公開第2006/0115876号国際公開第2006/122982号国際公開第2005/035553号国際公開第2005/070468号国際公開第2008/025856A2号国際公開第2005/014035A2号米国特許第5156956号米国特許第5252469号特開2003-199569号米国特許第5731183号国際公開第96/06931号国際公開第96/22366号欧州特許第0555649号米国特許第5736356号国際公開第2007/093594号

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したがって、本発明は、改善された薬理学的特性を有する新規のタンパク質コンジュゲート、ならびにその製造方法を提供する。

本発明の第1の態様によれば、タンパク質または糖タンパク質と非水溶性アルブミン結合剤とを、場合により置換されているシクロデキストリン分子の存在下で反応させるステップを含む、コンジュゲートタンパク質または糖タンパク質を調製する方法が提供される。

本発明の第2の態様によれば、親水性スペーサーを介してアルブミン結合残基に連結されたタンパク質もしくは糖タンパク質を含むタンパク質コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグが提供される。

本発明のさらなる態様によれば、式(I)のタンパク質コンジュゲート
(A-W-B)_y-P (I)
(式中、
Pはタンパク質または糖タンパク質を表し、
Bは親水性スペーサーを表し、
WはAとBとを連結する化学基であり、
Aはアルブミン結合残基を表し、
yは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10から選択される整数を表す)
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグが提供される。

本発明の第3の態様によれば、本明細書に記載の血液凝固因子と本明細書に記載の変性剤群とを反応させるステップを含む、コンジュゲート血液凝固因子を調製する方法が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、本明細書に記載の変性剤群にコンジュゲートされる本明細書に記載の血液凝固因子を含む、コンジュゲート血液凝固因子が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、治療有効量の本明細書に記載のコンジュゲート血液凝固因子を患者に投与することを含む、血友病を治療する方法が提供される。

定義
本明細書で使用する場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、ペプチド結合により結合した少なくとも5つの構成アミノ酸からなる化合物を意味する。構成アミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸の群に由来するものであってよく、それらは、遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸、ならびに合成アミノ酸であってよい。遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸は、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、オルニチン、ホスホセリン、D-アラニンおよびD-グルタミンである。合成アミノ酸は、化学合成により製造したアミノ酸、すなわち遺伝暗号によりコードされたアミノ酸のD異性体、例えば、D-アラニンおよびD-ロイシン、Aib(αアミノイソブチル酸)、Abu(αアミノブチル酸)、Tle(tert-ブチルグリシン)、β-アラニン、3-アミノメチル安息香酸およびアントラニル酸を含む。タンパク質または糖タンパク質に関して本明細書で使用する「コンジュゲート」という用語は、本発明によるアルブミン結合残基との特定のコンジュゲーションを指すことが認識されよう。本発明のコンジュゲーションプロセスで使用するタンパク質または糖タンパク質は、他の部分、例えば、糖部分とすでにコンジュゲートされていてもよいことも認識されよう。

本明細書で使用する場合、「糖タンパク質」という用語は、そのポリペプチド側鎖に共有結合したオリゴ糖鎖(グリカン)を含有するタンパク質を指す。糖タンパク質を、本発明のコンジュゲーションプロセスで使用する場合、アルブミン結合残基がグリカン残基を介して前記糖タンパク質に連結できることが認識されよう。

本文脈では、本明細書で使用する場合、「成長ホルモン化合物」という用語は、哺乳動物由来の成長ホルモン、例えば、ヒト、ウシまたはブタの成長ホルモン、および組み換え型成長ホルモン、例えば、組み換え型のヒト、ウシまたはブタの成長ホルモン、ならびにこのような成長ホルモンの変異体を意味する。本明細書で使用する場合、「GH」および「成長ホルモン化合物」は、互換性がある。GHが、哺乳動物由来の成長ホルモンの変異体、例えば、hGHおよび組み換え型hGHである場合、前記変異体は、hGHなどの成長ホルモン配列中の1つもしくは複数のアミノ酸残基を別の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸で置換することにより;かつ/または1つもしくは複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸をhGHなどの成長ホルモン配列に加えることおよび/または1つもしくは複数のアミノ酸残基をhGHなどの成長ホルモン配列から欠失することにより得た化合物であって、これらのステップのいずれかの後で1つまたは複数のアミノ酸残基のさらなる誘導体化が場合により行われてもよい化合物であることが理解される。特に、このような置換基は、1つのアミノ酸残基が、同じ群からの別のアミノ酸残基で、すなわち、同様の特性を有する別のアミノ酸残基で置換されているという意味で保守的である。アミノ酸は、その特性に基づき以下の群に都合よく分類できる:塩基性アミノ酸(例えば、アルギニン、リシン、ヒスチジン)、酸性アミノ酸(例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸)、極性アミノ酸(例えば、グルタミン、システインおよびアスパラギン)、疎水性アミノ酸(例えば、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニンおよびバリン)、芳香族アミノ酸(例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン)および小アミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、セリンおよびスレオニン)。通常GHは、本明細書のアッセイIで決定したとき、少なくとも80%のhGHとの同一性を有し、hGHの成長ホルモン活性の少なくとも20%を有する。

本文脈では、本明細書で使用する場合、「アルブミン結合残基」という用語は、ヒト血清アルブミンに非共有結合する残基を意味する。タンパク質または糖タンパク質に結合したアルブミン結合残基は、ヒト血清アルブミンに結合親和性を有し、それは約10μM未満またはさらに約1μM未満である。アルブミン結合残基の範囲は、12〜40個の炭素原子を含有する直鎖および分岐の親油性部分、シクロペンタノフェナントレン骨格を有する化合物、ならびに/または10〜45個のアミノ酸残基を有するペプチドなどの中で知られている。アルブミン結合特性は、J. Biol. Chem. 277(38)、35035〜35042、(2002)に記載の表面プラズモン共鳴で測定できる。

本明細書で使用する場合、「親水性スペーサー」という用語は、少なくとも5個の非水素原子を含み、その30〜50%がNまたはOのいずれかである化学的部分によって、タンパク質または糖タンパク質とアルブミン結合残基とを分離するスペーサーを意味する。

「非水溶性」という用語は、cLogP>0を有する部分を指す。

「水溶性」という用語は、cLogP<0を有する部分を指す。

本文脈では、「アミノ基転移」という用語および関連する用語は、グルタミンの側鎖中のアミド窒素を、別の化合物からの窒素、特に求核試薬を含有する別の窒素からの窒素と交換する反応を示すことが意図される。

本文脈では、「接近できない」という用語は、それに到達できないという意味で存在しないか、または事実上存在しないものを示すことが意図される。官能基にコンジュゲートするべきタンパク質中で接近できないことが示されている場合、前記官能基が、タンパク質中に存在しないか、または存在する場合、何らかの方法で反応への参加が妨げられていることを示すことが意図される。例証として、前記官能基は、反応への参加から保護されるようにタンパク質構造の深くに埋められている場合がある。反応条件に応じて官能基に接近できるかどうかが認識される。例えば、変性剤の存在下でまたは高温で、タンパク質をアンフォールドして、他の方法では接近できない官能基を露出できることが想定できる。「接近できない」は、「関心のある特定の反応のために選択された反応条件で接近できない」ことを意味することが理解されよう。

「アルカン」または「アルキル」という用語は、飽和、直鎖、分岐および/または環状の炭化水素を示すことが意図される。別の炭素原子数が指定されていない限り、該用語は、1〜30個(両端を含む)、例えば、1〜20個(両端を含む)、例えば、1〜10個(両端を含む)、例えば、1〜5個(両端を含む)の炭素原子を有する炭化水素を示すことが意図される。アルキルおよびアルキレンという用語は各々対応するラジカルおよびビラジカルを指す。

「C_1〜6アルキル」という用語は、1および6を含む1〜6個の炭素原子を有する直鎖または分岐の飽和炭化水素を指す。このような基の例としては、それだけに限らないがメチル、2-プロピル、1-ブチル、2-ブチル、2-メチル-2-プロピル、2-メチル-1-ブチルおよびn-ヘキシルが挙げられる。

「C_3〜10シクロアルキル」という用語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニルおよびシクロデカニルを通常指す。

「アルケン」という用語は、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む、直鎖、分岐および/または環状の炭化水素を示すことが意図される。別の炭素原子数が指定されていない限り、該用語は、2〜30個(両端を含む)、例えば、2〜20個(両端を含む)、例えば、2〜10個(両端を含む)、例えば、2〜5個(両端を含む)の炭素原子を有する炭化水素を示すことが意図される。アルケニルおよびアルケニレンという用語は、各々対応するラジカルおよびビラジカルを指す。

「アルキン」という用語は、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含む、直鎖、分岐および/または環状の炭化水素を示すことが意図され、1つまたは複数の炭素-炭素二重結合を場合により含むことができる。別の炭素原子数が指定されていない限り、該用語は、2〜30個(両端を含む)、例えば、2〜20個(両端を含む)、例えば、2〜10個(両端を含む)、例えば、2〜5個(両端を含む)の炭素原子を有する炭化水素を示すことが意図される。アルキニルおよびアルキニレンという用語は、各々対応するラジカルおよびビラジカルを指す。

「単素環式芳香族化合物」という用語は、芳香族炭化水素、例えば、ベンゼンおよびナフタレンを示すことが意図される。

「複素環式化合物」という用語は、5、6または7個の環原子を含み、そのうちの1、2、3または4個が、N、Oおよび/またはSから選択されるヘテロ原子である、環状化合物を示すことが意図される。例としては、複素環式芳香族化合物、例えば、チオフェン、フラン、ピラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、ならびにそれらの部分的または完全に水素化された等価物、例えば、ピペリジン、ピラゾリジン、ピロリジン、ピロリン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペラジンおよびモルホリンが挙げられる。

「ヘテロアルカン」、「ヘテロアルケン」および「ヘテロアルキン」という用語は、1個または複数のヘテロ原子またはヘテロ基が、前記部分の構造に挿入されている、上記のアルカン、アルケンおよびアルキンを示すことが意図される。ヘテロ基およびヘテロ原子の例としては、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-C(O)-、-C(S)-および-N(R*)-(式中、R*は、水素またはC₁〜C₆アルキルを示す)が挙げられる。ヘテロアルカンの例としては、

が挙げられる。

「ラジカル」または「ビラジカル」という用語は、各々1つまたは2つの水素原子が除去された化合物を示すことが意図される。具体的に示されている場合、ラジカルは、より大きい原子群、例えば、ヒドロキシルを化合物からホルマール除去することにより形成される部分も示すことができる。

「ハロゲン」という用語は、周期律表第7族の構成要素、例えば、F、Cl、BrおよびIを示すことが意図される。

本文脈では、「アリール」という用語は、環の少なくとも1つが芳香族である、炭素環式芳香族環ラジカルまたは縮合芳香族環系ラジカルを示すことが意図される。通常のアリール基としては、フェニル、ビフェニリル、ナフチルなどが挙げられる。

本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール」または「ヘタリール」という用語は、単独でまたは組み合わせて、例えば、5〜7員の原子を有する芳香族環ラジカル、例えば、7〜18員の原子を有する縮合芳香族環系ラジカルであって、少なくとも1つの環は芳香族であり、窒素、酸素または硫黄のヘテロ原子から選択される環原子として1個または複数のヘテロ原子を含有し、N-オキシド、ならびに硫黄モノオキシドおよび硫黄ジオキシドが、許容されるヘテロ芳香族置換基である芳香族環ラジカルを指す。例としては、フラニル、チエニル、チオフェニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリルおよびインダゾリルなどが挙げられる。

本明細書の化学構造で使用するアスタリスクマークは、結合に適した空いている結合の存在を示す。

名詞としての「コンジュゲート」という用語は、変性タンパク質、すなわち前記タンパク質の特性を変更するためにそこに結合した部分を有するタンパク質を示すことが意図される。動詞としての該用語は、前記タンパク質の特性を変更するためにタンパク質にある部分を結合させるプロセスを示すことが意図される。

本明細書で使用する場合、「プロドラッグ」という用語は、生加水分解性アミドおよび生加水分解性エステルを示し、a)このようなプロドラッグの生加水分解性官能基が、本発明による化合物に包含される化合物、およびb)所与の官能基において生物学的に酸化されるか、または還元され、本発明による薬物物質を生成することができる化合物も包含する。これらの官能基の例としては、1,4-ジヒドロピリジン、N-アルキルカルボニル-1,4-ジヒドロピリジン、1,4-シクロヘキサジエン、tert-ブチルなどが挙げられる。

本明細書で使用する場合、「生加水分解性エステル」という用語は、a)親物質の生物学的活性を妨害しないが、該物質に、例えば、作用持続、作用開始などインビボでの有利な特性を与えるか、またはb)生物学的に不活性であるが、対象により生物学的に有効な成分にインビボで容易に変換される、(本発明による化合物の場合)薬物物質のエステルである。利点は、例えば、溶解性の増加、または生加水分解性エステルが、腸から経口吸収され、血漿中で本発明による化合物に変換されることである。これらの多くの例は、当技術分野で知られており、例証として、低級アルキルエステル(例えば、C₁〜C₄)、低級アシルオキシアルキルエステル、低級アルコキシアシルオキシアルキルエステル、アルコキシアシルオキシエステル、アルキルアシルアミノアルキルエステルおよびコリンエステルが挙げられる。

本明細書で使用する場合、「生加水分解性アミド」という用語は、a)親物質の生物学的活性を妨害しないが、該物質に、例えば、作用持続、作用開始などインビボでの有利な特性を与えるか、またはb)生物学的に不活性であるが、対象により生物学的に有効な成分にインビボで容易に変換される、(本発明による化合物の場合)薬物物質のアミドである。利点は、例えば、溶解性の増加、または生加水分解性アミドが、腸から経口吸収され、血漿中で本発明による化合物に変換されることである。これらの多くの例は、当技術分野で知られており、例証として、低級アルキルアミド、αアミノ酸アミド、アルコキシアシルアミドおよびアルキルアミノアルキルカルボニルアミドが挙げられる。

本文脈では、「薬学的に許容される塩」という用語は、患者に有害でない塩を示すことが意図される。このような塩は、薬学的に許容される酸付加塩、薬学的に許容される金属塩、アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩としては、無機酸塩ならびに有機酸塩が挙げられる。適切な無機酸の代表例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸などが挙げられる。適切な有機酸の代表例としては、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サルチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモ酸、ビスメチレンサルチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、EDTA、グリコール酸、p-アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸などが挙げられる。薬学的に許容される無機酸付加塩または有機酸付加塩のさらなる例としては、参照により本明細書に組み込まれているJ. Pharm. Sci. 66、2、(1977)に列挙された薬学的に許容される塩が挙げられる。金属塩の例としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などが挙げられる。アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩の例としては、アンモニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、エチルアンモニウム塩、ヒドロキシエチルアンモニウム塩、ジエチルアンモニウム塩、ブチルアンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩などが挙げられる。

本明細書で使用する化合物の「治療有効量」とは、所与の疾患およびその合併症の臨床症状を治癒するか、緩和するか、または部分的に抑えるのに十分な量を意味する。これを実現するのに適した量が、「治療有効量」と定義される。各目的のための有効量は、疾患または損傷の重症度、ならびに対象の体重および全体的状態に依存するであろう。適切な用量の決定は、値の行列を構成し、その行列の異なる点を試験することにより、常套的実験を用いて実現できることが理解されるであろう。これは、すべて訓練を受けた医師または獣医師の通常の技術範囲内である。

本明細書で使用する場合、「治療」および「治療する」という用語は、状態、例えば、疾患または障害に対抗する目的のための患者の管理およびケアを意味する。該用語は、患者が患っている所与の状態の治療の完全なスペクトル、例えば、症状もしくは合併症を軽減するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、症状および合併症を緩和するか、または軽減するため、および/または疾患、障害もしくは状態を治癒するか、もしくは排除するため、ならびに状態を予防するための活性化合物の投与を含むことが意図され、そこで予防は、疾患、状態または障害に対抗する目的のための患者の管理およびケアとして理解されるべきであり、症状または合併症の発症を予防するための活性化合物の投与を含む。治療されるべき患者は、哺乳動物、特にヒトであることが好ましいが、動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジおよびブタも含むことができる。

ポリペプチドに関して本明細書で使用する場合、「類似体」という用語は、ペプチドの1つもしくは複数のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基で置換されているか、かつ/または1つもしくは複数のアミノ酸残基が、ペプチドから欠失されているか、かつ/または1つもしくは複数のアミノ酸残基が、ペプチドに付加されている変性ペプチドを意味する。アミノ酸残基のこのような付加または欠失は、ペプチドのN末端および/またはペプチドのC末端で起こり得る。光学異性体が示されていないアミノ酸はすべて、L異性体を意味することが理解されるべきである。

「機能的インビボ半減期」という用語は、その通常の意味において使用される。すなわち、変性タンパク質もしくは参照分子の生物学的活性の50%が、体内/標的器官に依然として存在する時間、または変性タンパク質もしくは参照分子の活性がそのピーク値の50%に低下するのにかかる時間である。機能的インビボ半減期を決定する代替案として、「インビボ血漿半減期」、すなわち、変性タンパク質または参照分子の50%が、除去される前に血漿または血流中を循環する時間を決定してもよい。血漿半減期の決定は、機能的半減期を決定するよりもより単純な場合が多く、血漿半減期の大きさは、通常、機能的インビボ半減期の大きさの良好な指標である。血漿半減期に対する代替の用語としては、血清半減期、循環半減期、循環性半減期、血清クリアランス、血漿クリアランスおよびクリアランス半減期が挙げられる。保持されるべき機能性は、凝結促進性、タンパク質分解性、共因子結合性、レセプター結合活性、または特定のタンパク質と関係した他の種類の生物学的活性から通常選択される。

インビボ生物学的半減期の測定は、文献に記載された多くの方法で実施できる。rFVIIaおよびその変異体のインビボ半減期の測定に関するアッセイにおける改変FVIIa(凝固因子VIIa)を使用する例はFDA参照番号96-0597に記載されている。簡単に言えば、FVIIa凝固活性は、変性タンパク質の投与前および投与後24時間以内に採取された血漿で測定される。定常状態での分布における見掛けの中央容積が測定され、中央クリアランス値が決定される。

機能性インビボ半減期または血漿半減期について使用する「増加した」という用語は、変性タンパク質の関連の半減期が、本発明の方法を施していないが、その他の点では同一のタンパク質などの参照分子の半減期に対して、統計的に有意に増加していることを示す。したがって、半減期は、比較できる条件下で決定される。例えば、関連の半減期は、少なくとも約25%、例えば、少なくとも約50%、例えば、少なくとも約100%、150%、200%、250%または500%まで増加し得る。いくつかの実施形態において、本発明の変性タンパク質は、非変性タンパク質の半減期に対して、少なくとも約0.25時間、好ましくは少なくとも約0.5時間、より好ましくは少なくとも約1時間、最も好ましくは少なくとも約2時間の半減期の増加を示す。

「バイオアベイラビリティ」という用語は、投与後所与の時間で血漿中で検出できるコンジュゲートの投与された量の比率を指す。通常、バイオアベイラビリティは、試験動物において、約25〜250μg/kgの間の用量の調製物を投与し、投与後所定の時間に血漿試料を得、試料中のタンパク質含有量を、適切なバイオアッセイもしくは免疫アッセイまたは同等のアッセイを用いて決定することにより測定される。データは、[タンパク質]対時間として通常グラフで示され、バイオアベイラビリティは、曲線下面積(AUC)として示される。試験調製物の相対的なバイオアベイラビリティとは、試験調製物のAUCと非変性タンパク質のAUCとの間の比を指す。

調製物の「免疫原生」という用語は、ヒトに投与したときに、体液性、細胞性またはその両方のいずれであっても有害な免疫反応を誘発する調製物の能力を指す。任意のヒト亜集団において、特定の投与されたタンパク質に対して感受性を示す個人が存在し得る。免疫原生は、当技術分野で公知の従来の方法を用いて、感受性個人における抗タンパク質抗体および/またはタンパク質反応性T細胞の存在を定量することにより測定できる。いくつかの実施形態において、本発明の変性タンパク質は、非変性タンパク質に対する感受性個人の免疫原生と比較して、少なくとも約10%、好ましくは少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約40%、最も好ましくは少なくとも約50%の感受性個人の免疫原生の減少を示す。

また、薬物の免疫原生は、タンパク性薬物が、非感受性対象において免疫原生であってよいという事実に関し、薬物の反復投与により、薬物に対する免疫反応の継続的な増加に至ることを意味する。免疫反応は、薬物の活性を妨害し、それにより治療効果を得るために経時的に増加する量の薬物を投与することが必要となるため、これは大抵の場合、望ましくない。いくつかの実施形態において、本発明の変性タンパク質は、非変性タンパク質に対する感受性個人の免疫原生と比較して、少なくとも約10%、好ましくは少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約40%、最も好ましくは少なくとも約50%の非感受性個人の免疫原生の減少を示す。

タンパク質を示すために本明細書において使用する場合、「プロテアーゼ保護された」という用語は、前記化合物を血漿ペプチダーゼまたは血漿プロテアーゼに対して耐性にするために化学的に変性されたタンパク質を意味する。血漿中プロテアーゼは、いくつかのペプチドホルモンの分解に関与し、より大きなタンパク質の分解においても役割を果たすことが知られている。

例えば、ジペプチジルアミノペプチダーゼIV(DPPIV)による分解に対するタンパク質の耐性は、以下の分解アッセイによって決定される:一定分量のタンパク質(5nmol)を、0.1Mトリエチルアミン-HCl緩衝液100μL、pH7.4中で、10〜180分間、5mUの酵素活性に相当する精製ジペプチジルアミノペプチダーゼIV1μLで37℃にてインキュベートした。酵素反応を、10%トリフルオロ酢酸5μLを加えることによって終了させ、ペプチド分解生成物を分離し、HPLC分析を用いて定量した。この分析を行うための1つの方法は以下の通りである:混合物を、Vydac C18 widepore(細孔径30nm、粒子径5μm)250×4.6mmカラムに施し、Siegelら、Regul. Pept. 1999;79:93〜102およびMentleinら、Eur. J. Biochem. 1993;214:829〜35に従って、0.1%トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの直線状の段階的勾配で流速1ml/分で溶出した(0%アセトニトリルで3分、0〜24%アセトニトリルで17分、24〜48%アセトニトリルで1分)。ペプチドおよびその分解生成物を、220nm(ペプチド結合)または280nm(芳香族アミノ酸)でのそれらの吸光度によりモニターし得、標準ピーク領域に対するそれらのピーク領域の積分により定量する。ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによるペプチドの加水分解速度は、加水分解されるペプチドの10%未満になるインキュベーション時間で推定される。該実験は、アルブミン錯体形成により与えられる遮蔽特性を調査するためにアルブミンの存在下で場合により行ってもよい。

「水性製剤」という用語は、少なくとも50重量%の水を含む製剤として定義される。同様に、「水溶液」という用語は、少なくとも50重量%の水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも50重量%の水を含む懸濁液として定義される。

当技術分野で公知の「同一性」という用語は、配列を比較することにより決定される2つ以上のタンパク質の配列間での関係を表す。当技術分野において、「同一性」とは、2つ以上のアミノ酸残基のストリング間の適合数により決定される、タンパク質間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち「アルゴリズム」)により対処されるギャップアラインメント(存在する場合)を用いて2つ以上の配列の小さい方の同一適合性パーセントを測定する。関連タンパク質の同一性は、公知の方法により容易に算出できる。このような方法は、それだけに限らないが、Computational Molecular Biology、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993; Computer Analysis of Sequence Data、Part 1、Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994; Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje, G.、Academic Press、1987; Sequence Analysis Primer、Gribskov, M.およびDevereux, J.編、M. Stockton Press、New York、1991;ならびにCarilloら、SIAM J. Applied Math.、48、1073(1988)に記載されているものが挙げられる。

同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大の適合性を得るように設計されている。同一性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。2つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、GAP(Devereuxら、Nucl. Acid. Res.、12:387(1984);Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Altschulら、J. Mol. Biol.、215:403〜410(1990))を含むGCGプログラムパッケージが挙げられる。BLASTXプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)および他の供給源(BLAST Manual、Altschulら、NCB/NLM/NIH Bethesda、Md. 20894;Altschulら、上記)から公的に入手可能である。周知のスミスウォーターマンアルゴリズムも同一性を決定するために使用できる。

例えば、コンピュータアルゴリズムGAP(Genetics Computer Group、University of Wisconsin、Madison, Wis.)を使用して、パーセント配列同一性が決定されることになる2つのタンパク質を、その各アミノ酸が最適に適合するように整列化させる(アルゴリズムにより決定される「適合スパン」)。ギャップオープニングペナルティ(平均対角の3倍と算出される;「平均対角」は使用する比較マトリックスの対角の平均である;「対角」とは、特定の比較マトリックスによる、各完全アミノ酸適合に割り当てられるスコアまたは数である)およびギャップ伸長ペナルティ(通常ギャップオープニングペナルティの{分率(1/10)}倍である)、ならびに比較マトリックス、例えば、PAM250またはBLOSUM62が、アルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較マトリックス(PAM250比較マトリックスに関しては、Dayhoffら、Atlas of Protein Sequence and Structure、第5巻supp.3(1978);BLOSUM62比較マトリックスに関しては、Henikoffら、Proc. Natl. Acad. Sci USA、89:10915-10919(1992)を参照)も、アルゴリズムによって使用される。

タンパク質配列比較のために好ましいパラメータとしては、以下のものが挙げられる:
アルゴリズム:Needlemanら、J. Mol. Biol、48:443〜453(1970);比較マトリックス:Henikoffら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89、10915〜10919(1992)のBLOSUM62;ギャップペナルティ:12、ギャップ長ペナルティ:4、類似性の閾値:0。

GAPプログラムは上記パラメータで有用である。上記パラメータは、GAPアルゴリズムを使用するタンパク質比較(末端ギャップに対するペナルティを伴わない)のための初期設定パラメータである。

一実施形態において、タンパク質コンジュゲートは、式(I)のタンパク質コンジュゲート:
(A-W-B)_y-P (I)
(式中、
Pはタンパク質または糖タンパク質を表し、
Bは親水性スペーサーを表し、
WはAとBとを連結する化学基であり、
Aはアルブミン結合残基を表し、
yは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10から選択される整数を表す)
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ（ただし、前記A-W-B-部分は非水溶性部分を含む）である。

本発明により、非変性タンパク質または糖タンパク質と比較して、改善された薬理学的特性を有する変性タンパク質または糖タンパク質が得られる。例えば、改善された薬理学的特性は、バイオアベイラビリティの増加、機能的インビボ半減期の増加、インビボ血漿半減期の増加、免疫原性の低下、プロテアーゼ耐性の増大、アルブミンに対する親和性の増加、レセプターに対する親和性の向上、貯蔵安定性の増加、機能的インビボ半減期の低下およびインビボ血漿半減期の低下からなる群から選択される。

シクロデキストリン(シクロアミロースとしても知られる)は、アミロース(デンプンのフラグメント)と同様に、1→4結合した5以上のD-グルコピラノシド単位からなる、環状オリゴ糖のファミリーを構成する。通常のシクロデキストリンは、環において6〜8単位の範囲のいくつかのグルコースモノマーを含有し、円錐形を形成する。このようなシクロデキストリンの例としては、以下に示すようにαシクロデキストリン(αCD;6員糖環分子)、βシクロデキストリン(βCD;7糖環分子)およびγシクロデキストリン(γCD;8糖環分子)が挙げられる。

一実施形態において、シクロデキストリン分子は、場合により置換されているβシクロデキストリンを含む。

シクロデキストリンの任意選択の置換基としては、各々が、1つまたは複数のヒドロキシル基(例えば、ヒドロキシエチルシクロデキストリンまたはヒドロキシプロピルシクロデキストリン)で場合により置換されていてもよい、1つまたは複数のC_1〜6アルキル基(例えば、メチル、エチルまたはプロピル)が挙げられる。一実施形態において、場合により置換されているシクロデキストリンは、2-ヒドロキシエチル-β-シクロデキストリンを含む。

場合により置換されているシクロデキストリン分子は、1%〜10%(例えば、5%)の間の濃度で加えることができる。

一実施形態において、コンジュゲーション反応は、水性緩衝液、例えば、Hepes緩衝液(例えば、50mM Hepes、100mM NaClおよび10mM CaCl₂)中での反応を含む。一実施形態において、コンジュゲーション反応は、一定のpH(例えば、pH7.0)および一定の温度(例えば、25℃)での反応を含む。一定のpHおよび温度でコンジュゲーション反応を行う利点は、血液凝固因子を変性させる可能性を低下することである。

凝固因子以外に、本発明は、凝固因子と関係のない、またはそれと関係が薄い大きなタンパク質にも適用する。この文脈では、大きなタンパク質は、分子量約10000Daを有するタンパク質である。

したがって、一実施形態において、Pは、分子量約10000Daを有するタンパク質を表す。

別の実施形態において、Pは、分子量約20000Daを有するタンパク質を表す。

別の実施形態において、Pは、分子量約30000Daを有するタンパク質を表す。

別の実施形態において、Pは、分子量約40000Daを有するタンパク質を表す。

Pの範囲内のタンパク質およびペプチドとしては、それだけに限らないが、ヘモグロビン、血清タンパク質、例えば、因子VII、FX、FII、FVを含む血液因子、タンパク質C、タンパク質S、tPA、PAI-1、組織因子、FXI、FXIIおよびFXIIIならびにそれらの連続したFVIIIおよびFIX変異体、免疫グロブリン、サイトカイン、例えば、インターロイキン、α-、β-およびγ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子、血小板由来成長因子およびホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)が挙げられる。

一般に生物学的または治療上関心のある他のタンパク質およびペプチドとしては、インスリン、植物タンパク質、例えば、レクチンおよびリシン、腫瘍壊死因子および関連対立遺伝子、可溶型の腫瘍壊死因子レセプター、インターロイキンレセプターおよび可溶型のインターロイキンレセプター、成長因子、例えば、組織成長因子、例えば、TGFa'sまたはTGFpsおよび上皮成長因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子などが挙げられる。関心のある免疫グロブリンとしては、IgG、IgE、IgM、IgA、IgDおよびそれらのフラグメントが挙げられる。

本発明の一実施形態において、ペプチドはアプロチニン、組織因子経路阻害剤または他のプロテアーゼ阻害剤、インスリンまたはインスリン前駆体、ヒトまたはウシの成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴン、オキシントモジュリン、GLP-1、GLP-2、IGF-I、IGF-II、組織プラスミノーゲン活性化因子、形質転換成長因子γまたはβ、血小板由来成長因子、GRF(成長ホルモン放出因子)、ヒト成長因子、免疫グロブリン、EPO、TPA、タンパク質C、血液凝固因子、例えば、FVII、FVIII、FIX、FX、FII、FV、タンパク質C、タンパク質S、PAI-1、組織因子、FXI、FXIIおよびFXIII、エキセンジン3、エキセンジン4、およびそれらの酵素または機能的類似体である。本文脈では、「機能的類似体」という用語は、天然タンパク質と同様の機能を有するタンパク質を示すことを意味する。タンパク質は、天然タンパク質と構造的に類似していてもよく、1種または複数のアミノ酸を、天然タンパク質のC末端およびN末端のいずれかまたは両方に加えることによって、1種または複数のアミノ酸を天然アミノ酸配列における1つまたはいくつかの異なる部位で置換することによって、1種または複数のアミノ酸を、天然タンパク質のいずれかもしくは一方の末端でまたはアミノ酸配列中の1つもしくはいくつかの異なる部位で欠失することによって、あるいは1種または複数のアミノ酸を、天然アミノ酸配列における1つまたは複数の部位で挿入することによって、天然タンパク質から得ることができる。さらに該タンパク質は、1つまたは複数の位置においてアシル化されてもよい。GLP-1およびその類似体のアシル化を開示している国際公開第98/08871号、ならびにGLP-2およびその類似体のアシル化を開示している国際公開第98/08872号を参照されたい。アシル化されたGLP-1誘導体の例は、Lys26(N^ε-テトラデカノイル)-GLP-1(7-37)であり、これは位置26のLys残基のεアミノ基がテトラデカノイル化されたGLP-1(7-37)である。

タンパク質またはその部分は、組織培養、動物起源からの抽出などの当業者に公知の技法を使用して、または組換えDNA法により調製するか、または単離することができる。タンパク質、ペプチド、アミノ酸配列などのトランスジェニック起源も企図される。このような物質は、トランスジェニック動物、すなわち、マウス、ブタ、ウシなどから得られ、タンパク質は乳、血液または組織中で発現される。トランスジェニック昆虫およびバキュロウイルス発現系も起源として企図される。さらに、タンパク質の突然変異体、例えば、突然変異TNFおよび/または突然変異インターフェロンも、本発明の範囲内に含まれる。関心のある他のタンパク質としては、アレルゲンタンパク質、例えば、ブタクサ、抗原E、ミツバチ毒、ダニアレルゲンなどが挙げられる。

一実施形態において、Pは、血液凝固因子を表す。適切な血液凝固因子の例としては、I(フィブリノゲン)、II(プロトロンビン)、組織因子、V(プロアクセレリン)、VI、VII、VIII、IX(クリスマス因子)、X(スチュアートプラウアー因子)、XI(血漿トロンボプラスチン前駆体)、XII(ハーゲマン因子)、XIII(フィブリン安定化因子)、ヴォンヴィレブランド因子、プレカリクレイン、高分子量キニノゲン(HMWK)、フィブロネクチン、アンチトロンビンIII、ヘパリン補因子II、タンパク質C、タンパク質S、タンパク質Z、タンパク質Z関連プロテアーゼ因子阻害剤(ZPI)、プラスミノーゲン、α2抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1(PAI1)、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-2(PAI2)およびガン凝血促進剤である。さらなる実施形態において、血液凝固因子は、FVII、FX、FII、FV、タンパク質C、タンパク質S、tPA、PAI-1、組織因子、FXI、FXIIおよびFXIIIならびにそれらの連続する配列FVIII、FIX変異体から選択される。

さらなる実施形態において、血液凝固因子は、FVII(すなわち、FVIIa)である。

代替実施形態において、Pは、成長ホルモン(GH)を表す。

一実施形態において、yは、1、2または3から選択される整数を表す。成長ホルモンが、このようなA-W-B-部分、すなわちN-言語、Gln40およびGln141に対して3つの結合点を有するため、この実施形態は、Pが前記成長ホルモンを表す実施形態に特に適している。

一実施形態において、yは、1、2、3、4、5または6から選択される整数を表す。さらなる実施形態において、yは2を表す。代替実施形態において、yは1を表す。

実施形態が本発明のある種の態様または態様に関することが記載されていない限り、上記実施形態ならびに以下に記載されている実施形態は、本明細書に記載の態様の任意の1つ、ならびに本明細書に記載の実施形態の任意の1つを指すとみなされるべきである。

本発明の一実施形態において、親水性スペーサーBは、J. Am. Chem. Soc.、86(1964)5175〜5180「A New Substituent Constant,Π, Derived from Partition Coefficients」に記載されているようにcLogP<0を有し、Tripos (Tripos Associates、1699 South Hanley Road, St. Louis, MO63144〜2319 USA)製のSybylソフトウェアパッケージを使用して計算できる。

式(I)のコンジュゲートのさらなる実施形態において、親水性スペーサーBは、次式
-X₁-X₂-X₃-X₄-
[式中、
X₁は-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-であり、
X₂は-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-であり、
X₃は-[(CHR⁵)_I5-W₆]_m7-であり、
X₄はF-D1-(CH₂)_I6-D2-であり、
I1、I2、I3、I4、I5およびI6は独立に0〜16から選択され、
m1、m3、m4、m6およびm7は独立に0〜10から選択され、
m2およびm5は独立に0〜25から選択され、
n1、n2、n3およびn4は独立に0〜16から選択され、
Fはアリール、ヘテロアリール、ピロリジン-2,5-ジオンであり、アリール基およびヘテロアリール基はハロゲン、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHまたはC_1〜6アルキルで場合により置換されており、
R¹、R²、R³、R⁴およびR⁵は独立に水素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(=NH)-NH₂、C_1〜6アルキル、アリールまたはヘテロアリールから選択され、アルキル基、アリール基およびヘテロアリール基はハロゲン、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CNまたは-OHで場合により置換されており、
D1、D2、E1およびE2は独立に-O-、-NR⁶-、-N(COR⁷)-または原子価結合から選択され、R⁶およびR⁷は独立に水素またはC_1〜6アルキルを表し、
W₁〜W₆は独立に-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-または原子価結合から選択され、s2は0または1である]
を有する。

さらなる実施形態において、W₁は-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-または原子価結合から選択される。通常、W₁は、-C(O)NH-、-NHC(O)-または-C(O)NHS(O)₂-から選択される。

さらなる実施形態において、W₂は-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-または原子価結合から選択される。通常、W₂は、-C(O)NH-、-NHC(O)-または-C(O)NHS(O)₂-から選択される。

さらなる実施形態において、W₃は-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-または原子価結合から選択される。通常、W₃は、-C(O)NH-、-NHC(O)-または-C(O)NHS(O)₂-から選択される。

さらなる実施形態において、W₄は-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-または原子価結合から選択される。通常、W₄は、-C(O)NH-、-NHC(O)-または-C(O)NHS(O)₂-から選択される。

さらなる実施形態において、W₅は-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-または原子価結合から選択される。通常、W₅は、-C(O)NH-、-NHC(O)-または-C(O)NHS(O)₂-から選択される。

さらなる実施形態において、W₆は-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-または原子価結合から選択される。通常、W₆は、-C(O)NH-、-NHC(O)-または-C(O)NHS(O)₂-から選択される。

さらなる実施形態において、R¹は水素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHまたはC_1〜6アルキルから選択され、そこでアルキル基は、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHで場合により置換されている。通常、R¹は-C(O)OH、-C(O)NH₂またはC_1〜6アルキルから選択され、アルキル基は、-C(O)OH、-C(O)NH₂または-S(O)₂OHで場合により置換されている。

さらなる実施形態において、R²は水素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHまたはC_1〜6アルキルから選択され、アルキル基は、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHで場合により置換されている。通常、R²は-C(O)OH、-C(O)NH₂またはC_1〜6アルキルから選択され、アルキル基は、-C(O)OH、-C(O)NH₂または-S(O)₂OHで場合により置換されている。

さらなる実施形態において、R³は水素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHまたはC_1〜6アルキルから選択され、アルキル基は、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHで場合により置換されている。通常、R³は-C(O)OH、-C(O)NH₂またはC_1〜6アルキルから選択され、アルキル基は、-C(O)OH、-C(O)NH₂または-S(O)₂OHで場合により置換されている。

さらなる実施形態において、R⁴は水素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHまたはC_1〜6アルキルから選択され、アルキル基は、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHで場合により置換されている。通常、R⁴は-C(O)OH、-C(O)NH₂またはC_1〜6アルキルから選択され、アルキル基は、-C(O)OH、-C(O)NH₂または-S(O)₂OHで場合により置換されている。

さらなる実施形態において、R⁵は水素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHまたはC_1〜6アルキルから選択され、アルキル基は、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHで場合により置換されている。通常、R⁵は-C(O)OH、-C(O)NH₂またはC_1〜6アルキルから選択され、アルキル基は、-C(O)OH、-C(O)NH₂または-S(O)₂OHで場合により置換されている。

さらなる実施形態において、E1は-O-もしくは-NR⁶-または原子価結合から選択される。通常、E1は-O-から選択される。

さらなる実施形態において、E2は-O-もしくは-NR⁶-または原子価結合から選択される。通常、E2は-O-から選択される。

さらなる実施形態において、E1およびE2はいずれも-O-である。

さらなる実施形態において、E1およびE2はいずれも-NR⁶-である。

さらなる実施形態において、Fはフェニル、ピロリジン-2,5-ジオンまたは原子価結合である。

さらなる実施形態において、D1は-O-もしくは-NR⁶-または原子価結合から選択される。通常、D1は-NR⁶-から選択される。

さらなる実施形態において、D2は-O-もしくは-NR⁶-または原子価結合から選択される。通常、D1は-NR⁶-から選択される。

さらなる実施形態において、I1は0〜6、例えば、0、1、2、3、4、5または6である。

さらなる実施形態において、I2は0〜6、例えば、0、1、2、3、4、5または6である。

さらなる実施形態において、I3は0〜6、例えば、0、1、2、3、4、5または6である。

さらなる実施形態において、I4は0〜6、例えば、0、1、2、3、4、5または6である。さらなる実施形態において、I5は0〜6、例えば、0、1、2、3、4、5または6である。

さらなる実施形態において、I6は0〜6、例えば、0、1、2、3、4、5または6である。

さらなる実施形態において、m1は0〜6、例えば、0、1、2、3、4、5または6である。

さらなる実施形態において、m2は0〜10、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である。

さらなる実施形態において、m3は0〜6、例えば、0、1、2、3、4、5または6である。

さらなる実施形態において、m4は0〜6、例えば、0、1、2、3、4、5または6である。

さらなる実施形態において、m5は0〜10、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である。

さらなる実施形態において、m6は0〜6、例えば、0、1、2、3、4、5または6である。

さらなる実施形態において、m7は0〜6、例えば、0、1、2、3、4、5または6である。

さらなる実施形態において、n1は0〜10、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である。

さらなる実施形態において、n2は0〜10、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である。

さらなる実施形態において、n3は0〜10、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である。

さらなる実施形態において、n4は0〜10、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10である。

さらなる実施形態において、X₁は-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1O]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-およびX₂は-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3O]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-であり、-{[(CH₂)_n1O]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-および-{[(CH₂)_n3O]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-は、

から選択される。

さらなる実施形態において、前記親水性スペーサーの分子量は、80ダルトン(D)〜1500Dの範囲または500D〜1100Dの範囲である。

さらにさらなる実施形態において、Wは、次式
-W₇-Y-
[式中、
Yは-(CH₂)_I7-C_3〜10シクロアルキル-W₈-または原子価結合であり、
I7は0〜6であり、
W₇は-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH₂)_s3-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-または原子価結合から選択され、s3は0または1であり、
W₈は-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH₂)_s4-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-または原子価結合から選択され、s4は0または1である]
を有する。

Wの実施形態において、Yは、-(CH₂)_I7-シクロヘキシル-W₈-である。

さらなる実施形態において、Yは原子価結合である。

一実施形態において、W₇は、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-または原子価結合から選択される。通常、W₇は、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂から選択される。

さらなる実施形態において、W₈は、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-または原子価結合から選択される。通常、W₈は、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂から選択される。

さらなる実施形態において、I7は0または1である。

さらなる実施形態において、本発明の親水性スペーサーBは、

から選択される。

Pに結合したアルブミン結合残基(上記式(I)の置換基A)は、アルブミンに非共有結合する親油性残基である。通常、アルブミン結合残基は、生理的pHで負に帯電し、ヒト血清アルブミンに結合親和性を有し、それは約10μM未満またはさらに約1μM未満である。

本発明で使用するアルブミン結合剤は、通常、水溶液中での溶解性が低い脂肪酸誘導体である。アルブミン結合剤の溶解性は、そのログP値で示すことができる。分配係数としても知られるログPは、平衡状態で2つの非混和性溶媒の混合物の2相における化合物の濃度比の対数である。通常、溶媒の1つは水であり、二つ目は、オクタン-1-オール、クロロホルム、シクロヘキサンおよびプロピレングリコールジペラルゴネート(PGDP)から選択される。これらの異なる溶媒中で測定されたログP値は、主として水素結合作用により違いを示す。オクタノールは、水素結合を与え、受け入れることができるが、シクロヘキサンは不活性である。クロロホルムは、水素結合を与えることができるが、PGDPは、それらを受け入れることしかできない。

本発明の一実施形態において、アルブミン結合剤は、オクタン-1-オール、クロロホルム、シクロヘキサンおよびプロピレングリコールジペラルゴネート(PGDP)のいずれかにおいて-3を超えるLogPを有する。

さらなる実施形態において、アルブミン結合剤は、オクタン-1-オール、クロロホルム、シクロヘキサンおよびプロピレングリコールジペラルゴネート(PGDP)のいずれかにおいて-4を超えるLogPを有する。さらにさらなる実施形態において、アルブミン結合剤は、オクタン-1-オール、クロロホルム、シクロヘキサンおよびプロピレングリコールジペラルゴネート(PGDP)のいずれかにおいて-5超のログPを有する。

あるいは、アルブミン結合剤部分のcLogPを、公表されているアルゴリズムを用いて計算できる。(J. Am. Chem. Soc.、86(1964)5175〜5180「A New Substituent Constant,Π, Derived from Partition Coefficients」、C. A. Lipinskiら、Advanced Drug Delivery Reviews、23(1997)3〜25、「Experimental and Computational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings」およびI. Moriguchi、S. Hirono、I. Nakagome、H. Hirano、Chem. and Pharm. Bull.、42(1994)976〜978「Comparison of Reliability of logP Values for Drugs Calculated by Several Methods」)。

本発明の一実施形態において、アルブミン結合剤は、オクタン-1-オール、クロロホルム、シクロヘキサンおよびプロピレングリコールジペラルゴネート(PGDP)のいずれかにおいて1を超えるcLogPを有する。本発明のさらなる実施形態において、アルブミン結合剤は、オクタン-1-オール、クロロホルム、シクロヘキサンおよびプロピレングリコールジペラルゴネート(PGDP)のいずれかにおいて2を超えるcLogPを有する。本発明のさらにさらなる実施形態において、アルブミン結合剤は、オクタン-1-オール、クロロホルム、シクロヘキサンおよびプロピレングリコールジペラルゴネート(PGDP)のいずれかにおいて3を超えるcLogPを有する。本発明のさらにさらなる実施形態において、アルブミン結合剤は、オクタン-1-オール、クロロホルム、シクロヘキサンおよびプロピレングリコールジペラルゴネート(PGDP)のいずれかにおいて4を超えるcLogPを有する。本発明のさらにさらなる実施形態において、アルブミン結合剤は、オクタン-1-オール、クロロホルム、シクロヘキサンおよびプロピレングリコールジペラルゴネート(PGDP)のいずれかにおいて5を超えるcLogPを有する。

さらなる実施形態において、アルブミン結合残基は、直鎖アルキル基、分岐アルキル基、ωカルボン酸基またはωカルボン酸イソスターを有する基から選択される。通常、アルブミン結合残基は、6〜40個の炭素原子を有する。さらなる実施形態において、アルブミン結合残基は、8〜26個の炭素原子を有する。さらなる実施形態において、アルブミン結合残基は、8〜20個の炭素原子を有する。

さらなる実施形態において、Aは14〜26個の炭素原子を有し、ωカルボン酸基を含む。さらなる実施形態において、Aは14〜26個の炭素原子を有し、ωカルボン酸イソスター、例えば、テトラゾールを含む。

アルブミン結合特性は、J. Biol.Chem. 277(38)、35035〜35042、2002に記載されているように表面プラズモン共鳴により測定できる。

さらなる実施形態において、Aは、以下のもの

(式中、*はWからBへの結合を示す)
から選択される。

一実施形態において、アルブミン結合残基Aは、親水性スペーサーBを介してタンパク質Pのグルタミン残基に結合する。

別の実施形態において、アルブミン結合残基Aは、親水性スペーサーBを介してタンパク質Pのシステイン残基に結合する。

別の実施形態において、アルブミン結合残基Aは、親水性スペーサーBを介してタンパク質PのN末端残基に結合する。

別の実施形態において、アルブミン結合残基Aは、親水性スペーサーBを介してタンパク質PのC末端残基に結合する。

別の実施形態において、アルブミン結合残基Aは、親水性スペーサーBを介してタンパク質Pのリシン残基に結合する。

さらに別の実施形態において、アルブミン結合残基Aは、親水性スペーサーBを介して糖タンパク質Pの酸化グリカン残基に結合する。

一実施形態において、A-W-B-は

である。

一実施形態において、PはFVIIa-C407であり、A-W-B-Pは

である。

一実施形態において、A-W-B=は

である。

一実施形態において、Pは糖酸化FVIIaであり、A-W-B=Pは

である。

一実施形態において、Pは糖酸化FVIIaであり、y=2であり、(A-W-B=)_yPは

である。

一実施形態において、Pは糖酸化FVIIaであり、y=3であり、(A-W-B=)_yPは

である。

一実施形態において、A-W-B-は

である。

一実施形態において、PはhGHであり、A-W-B-Pは

である。

一実施形態において、PはhGHであり、y=2であり、(A-W-B)_y-Pは

である。

本発明のさらなる態様によれば、治療で使用するための本明細書に記載のタンパク質コンジュゲートが提供される。

さらなる態様によれば、本発明は、薬学的に許容される添加剤と場合により組み合わせて、本明細書に記載のタンパク質コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。

本発明のさらなる態様によれば、親水性スペーサーを介してアルブミン結合残基に連結したタンパク質もしくは糖タンパク質を含むタンパク質コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグが提供される。

本発明のさらなる態様によれば、本明細書に記載の血液凝固因子と本明細書に記載の変性剤群とを反応させるステップを含む、コンジュゲート血液凝固因子を調製する方法が提供される。

本発明の方法により、非変性血液凝固因子と比較して、改善された薬理学的特性を有する変性血液凝固因子が得られる。例えば、改善された薬理学的特性は、バイオアベイラビリティの増加、機能的インビボ半減期の増加、インビボ血漿半減期の増加、免疫原性の低下、プロテアーゼ耐性の増大、アルブミンに対する親和性の増加、レセプターに対する親和性の改善、貯蔵安定性の増加、機能的インビボ半減期の低下およびインビボ血漿半減期の低下からなる群から選択される。

一実施形態において、該方法は可溶化剤を加えることをさらに含む。変性剤群が脂肪酸を含む場合、このような可溶化剤の存在により、水溶液中で脂肪酸の溶解性が増加し、したがってコンジュゲーション反応の有効性が増大する利点が得られる。

一実施形態において、可溶化剤は、場合により置換されているシクロデキストリン分子を含む。

したがって、本発明のさらなる態様によれば、本明細書に記載のタンパク質または糖タンパク質と記載のアルブミン結合剤とを、場合により置換されているシクロデキストリン分子の存在下で反応させるステップを含む、コンジュゲートタンパク質または糖タンパク質を調製する方法が提供される。一実施形態において、アルブミン結合剤は、非水溶性アルブミン結合剤を含み、タンパク質または糖タンパク質は、水溶性のタンパク質または糖タンパク質を含む。

いくつかの凝固因子(例えば、FVIIa、FIXa、FXa、FIIa)は、血液カスケードのプロテアーゼとして作用し、それらは、溶液中に長時間放置したとき自動触媒作用により分解されることが周知である。

したがって、可溶化剤の使用に加えて、変性剤が脂肪酸を含む場合、反応混合物は、プロテアーゼ型凝固因子(例えば、FVIIa、FIXa、FXa、FVIIaなど)の活性部位を阻害する可逆的遮断薬をさらに含有できる。

したがって、一実施形態において、凝固因子と変性剤群との間のコンジュゲーションは、凝固因子の機能部位(すなわち、プロテアーゼ部位)をヘルパー分子、例えば、セリンプロテアーゼ阻害剤により阻害する条件下で行われる。ヘルパー分子は、可逆的方式でプロテアーゼ部位を特異的に認識し、その後の精製ステップ中に容易に除去できるものであることが好ましい。例えば、ベンズアミジンは、FVIIaに適した可逆的活性部位阻害剤である。

本発明のさらなる態様によれば、前記に定義した方法により得ることができるコンジュゲートタンパク質または糖タンパク質が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、前記に定義した方法により得ることができるコンジュゲート血液凝固因子が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、本明細書に定義された変性剤群にコンジュゲートした、本明細書に定義された血液凝固因子を含むコンジュゲート血液凝固因子が提供される。

適切な血液凝固因子の例としては、I(フィブリノゲン)、II(プロトロンビン)、組織因子、V(プロアクセレリン)、VI、VII、VIII、IX(クリスマス因子)、X(スチュアートプラウアー因子)、XI(血漿トロンボプラスチン前駆体)、XII(ハーゲマン因子)、XIII(フィブリン安定化因子)、ヴォンヴィレブランド因子、プレカリクレイン、高分子量キニノゲン(HMWK)、フィブロネクチン、アンチトロンビンIII、ヘパリン補因子II、タンパク質C、タンパク質S、タンパク質Z、タンパク質Z関連プロテアーゼ因子阻害剤(ZPI)、プラスミノーゲン、α2抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1(PAI1)、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-2(PAI2)およびガン凝血促進剤である。

本発明は、凝固活性を有する非天然組換えタンパク質、例えば、活性化血小板に対する親和性が増加した、組織因子(TF)類似体、TF融合タンパク質またはTFキメラ、例えば、キメラを含むTFアネキシンV、TF抗体融合タンパク質および他のTF融合タンパク質も包含し、そこで非TF成分により、活性化血小板に発現するエピトープに対する結合親和性が増加する。凝固活性を有するタンパク質の他の例としては、抗TFPI抗体またはそのフラグメントを含む組織因子経路阻害剤アンタゴニスト、ならびにトロンビン活性化因子Xが挙げられる。さらなる例としては、FVIII様二重特異性MABが挙げられる。

一実施形態において、血液凝固因子は、因子VIIa(FVIIa)、因子VIII(FVIII)または因子IX(FIX)である。さらなる実施形態において、血液凝固因子は、因子VIIa(FVIIa)である。

一実施形態において、血液凝固因子は、因子VIIa(FVIIa)、因子VIII(FVIII)または因子IX(FIX)の類似体である。さらなる実施形態において、血液凝固因子は、因子VIIa(FVIIa)類似体である。

一実施形態において、変性剤群は、アルブミンとの結合により伸張効果を示す。血中に大量に存在するアルブミンは、ミクロモルからナノモルの親和性を有する小分子脂肪酸を結合する。脂肪酸を、より大きな分子、例えば、ペプチドに結合させる場合、コンジュゲートは、血中に存在するアルブミンに特異的に結合できる。その場合に、アルブミンは、その大きさによって腎クリアランスまたはタンパク質分解攻撃からペプチドを保護する大きな担体分子として機能し得る。原理は、より小さいペプチド、例えば、GLP-1およびインスリンについてよく文書化されているが、意外にも、この種の変性剤群が、より大きいタンパク質、例えば、アルブミンと同様の大きさの凝固因子、すなわちそれ自体で腎クリアランスを回避するのに十分な大きさでなくてはならないタンパク質を伸ばすことも見出した。

さらに驚くべきことに、同程度の大きさの大きなタンパク質間での複合体は、本明細書に記載の変性剤群、特に式Iの化合物を含むものにより発揮される親油性力により一緒に保持できる。

したがって、上に示されているように、アルブミン結合剤のタンパク質またはペプチドへの結合により、前記タンパク質またはペプチドの血漿半減期が潜在的に増加することが示された。アルブミンは高疎水性分子に結合できるので、通常のアルブミン結合剤の部類は脂肪酸から得られる。

したがって、本発明の文脈では、-(CH₂)₁₂-部分を有する化合物は、可能性のあるアルブミン結合剤である。上記のアルブミン結合剤が、タンパク質またはペプチドに結合し、前記タンパク質またはペプチドの血漿半減期を増加させる場合、アルブミン結合剤は、本発明に記載の血漿半減期を増加させる部分であり、アルブミンへの結合および/または他の伸張機構、例えば、脂質層への非特異的結合などにより血漿半減期の全体的な増加に寄与することが理解される。

いくつかの実施形態において、本発明の調製物は、対応する非変性タンパク質のバイオアベイラビリティに対して、少なくとも約110%、好ましくは少なくとも約120%、より好ましくは少なくとも約130%、最も好ましくは少なくとも約140%の相対的バイオアベイラビリティを示す。バイオアベイラビリティは、任意の哺乳動物種、好ましくはイヌで測定でき、AUCを計算するために使用する所定の時間は、10分〜8時間の種々の増加を包含できる。バイオアベイラビリティは、例えば、以下のようにイヌモデルで測定できる:実験は、4グループに分けられた12匹のビーグル犬において、4足歩行交差試験として行われる。すべての動物には、ナトリウムクロリド(2.92mg/ml)、カルシウムクロリド二水和物(1.47mg/ml)、マンニトール(30mg/ml)およびポリソルベート80を含有するグリシルグリシン緩衝液(pH5.5)などの適切な緩衝液中で約90μg/kgの用量にて、試験調製物Aおよび参照調製物Bが与えられる。血液試料を、最初の投与後10、30および60分および2、3、4、6および8時間で採取する。血漿を試料から得、タンパク質をELISAで定量する。

一実施形態において、変性剤群は脂肪酸誘導体を含む。さらなる実施形態において、変性剤群は、C12、C14、C16、C18およびC20の脂肪酸誘導体を含む。理論に拘束されずに、かつ先に言及したように、血中に大量に存在するアルブミンは、ミクロモルからナノモルの親和性を有する小分子脂肪酸を結合する。それにより、アルブミンは、ペプチドを、腎クリアランス、中和抗体、レセプター介在クリアランスまたはタンパク質分解攻撃から保護する担体分子として機能する。したがって、本発明は、対応する非コンジュゲート因子と比較したとき、インビボ血漿半減期が増加したコンジュゲート血液凝固因子類似体を提供する。

一実施形態において、変性剤群は、式(II)の化合物

[式中、R¹は、水素、-COOH、テトラゾリルまたは-C(=O)-NHS(=O)₂-R²を表し、nは、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25のいずれか1つから選択される整数であり
R²は、C_1〜6アルキル、フェニル、C_1〜6アルキルフェニル、C_1〜20アルキルテトラゾリルまたはC_1〜20アルキルカルボキシルを表す]
を含む。

一実施形態において、R¹は、-COOHを表し、nは、12〜18(例えば、12、14、16または18)から選択される整数を表す。

一実施形態において、変性剤群は、式(III)の化合物

を含む。

一実施形態において、変性剤群および/または血液凝固因子は、コンジュゲーションを促進するように構成されたコンジュゲーション部分をさらに含む。例えば、一実施形態において、変性剤群は、ヒドロキシルアミン部分から選択されるコンジュゲーション部分を含む。このようなヒドロキシルアミン部分は、様々な機能的血液凝固因子(例えば、血液凝固因子の酸化誘導体)へのコンジュゲーションに適していよう。グリカン部分が、(国際公開第2008/0258556号に記載されているように)血液凝固因子上に存在しているか、または(国際公開第2005/014035号に記載されているように)ガラクトースオキシダーゼとの酸化を可能にするために適切に切除されている場合、血液凝固因子のこのような酸化誘導体は、直接酸化(例えば、過ヨウ素酸)により調製できる。露出ガラクトースまたはシアル酸残基が、血液凝固因子上に存在しない場合、それらは、ガラクトシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを用いる酸化の前にガラクトシル化またはシアリル化できる。

代替実施形態において、変性剤群は、マレイミド部分またはハロアセテート部分から選択されるコンジュゲーション部分を含む。このようなマレイミド部分およびハロアセテート部分は、様々な機能的血液凝固因子(例えば、遊離システイン残基または部分遊離システイン残基を有する血液凝固因子)へのコンジュゲーションに適していよう。血液凝固因子は、(国際公開第2006/134174号に記載されているように)遊離システイン残基または部分遊離システイン残基を保持するように操作できることが認識されよう。ある場合において、システイン残基は、例えば、グルタチオン混合ジスルフィドにより部分的に阻害できる。このような場合、グルタレドキシンの存在下で酸化還元電位(GSSG/GSH)を慎重に調節することによりコンジュゲーション前に除去できる。また、表面露出システインは、(米国特許出願公開第2006/0115876号に記載されているように)トリカルボキシエチルホスフィンまたはトリス(3-スルホネートフェニル)ホスフィンなど、例えば、ホスフィン系還元剤の使用により化学的に非ブロック化できる。凝固因子上の遊離チオールは、活性化スルフィド、例えば、チオピリジル活性化スルフィドと反応して、混合ジスルフィドを形成することもできる。

代替実施形態において、血液凝固因子は、N末端セリンの酸化を用いて、次いで例えば(国際公開第2006/122982号に記載されているように)オキシム化、(国際公開第2005/035553号に記載されているように)カルボキシペプチダーゼを用いるC末端トランスペプチド転移および適切に設計された変性剤群誘導体により、(国際公開第2005/070468号に記載されているように)トランスグルタミナーゼの使用により、または例えば、NHSエステルもしくはヒドロジベンゾトリアゾリルエステル活性化変性剤群を使用するリシン側鎖上での直接アシル化により変性剤群にコンジュゲートできる。

本発明のコンジュゲート血液凝固因子およびコンジュゲート血液凝固因子を含む医薬組成物は、血液凝固因子(例えば、FVII(a)、FVIIIまたはFIX)の投与により緩和される疾患、例えば、出血性障害、例えば、血友病、血液疾患、関節血症、血腫、皮膚粘膜出血、遺伝性血液疾患、家族性出血性障害、家族性血液疾患または因子補充療法の治療に使用できる。一実施形態において、血液凝固因子の投与により緩和される疾患は、血友病、例えば、血友病Bまたはクリスマス病である。

したがって、本発明のさらなる態様によれば、患者に、治療有効量の前記に定義したコンジュゲート血液凝固因子を投与することを含む血友病を治療する方法が提供される。

血友病の治療で使用するための前記に定義したコンジュゲート血液凝固因子も提供される。

血友病の治療のための薬剤の製造における前記に定義したコンジュゲート血液凝固因子の使用も提供される。

血友病の治療で使用するための前記に定義したコンジュゲート血液凝固因子を含む医薬組成物も提供される。

治療レジメンおよび予防レジメンは、本発明の別の態様に相当することを理解されたい。特に、本発明は、血友病の予防的治療に望ましいものにする血漿半減期が増加したコンジュゲート血液凝固因子を提供することを理解されるべきである。血友病のこのような予防的治療は、本発明の好ましい実施形態を構成する。

本発明のさらなる態様によれば、前記に定義したコンジュゲート血液凝固因子を含む医薬製剤が提供される。

製剤は、緩衝液系、保存料、等張剤、キレート化剤、安定剤および界面活性剤をさらに含むことができる。本発明の一実施形態において、医薬製剤は、水性製剤、すなわち水を含む製剤である。このような製剤は、通常、溶液または懸濁液である。本発明の一実施形態において、医薬製剤は水溶液である。

一実施形態において、医薬製剤は、医師または患者により使用前に溶媒および/または賦形剤が加えられる凍結乾燥剤である。

一実施形態において、医薬製剤は、任意の事前の溶解なしに使える状態にある乾燥(例えば、凍結乾燥またはスプレー乾燥)製剤である。

一実施形態において、本発明は、本発明のコンジュゲート血液凝固因子水溶液および緩衝液を含む医薬製剤であって、前記コンジュゲート血液凝固因子が、0.1〜100mg/mlの濃度で存在し、前記製剤が、約2.0〜約10.0のpHを有する医薬製剤に関する。

本発明の一実施形態において、製剤のpHは、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9および10.0からなるリストから選択される。

本発明の一実施形態において、緩衝液は、ナトリウムアセテート、ナトリウムカーボネート、シトレート、グリシルグリシン、(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、ナトリウムジヒドロゲンホスフェート、ジナトリウムヒドロゲンホスフェート、ナトリウムホスフェートおよびトリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定の緩衝液の各々1つは、本発明の代替実施形態を構成する。

本発明の一実施形態において、製剤は、活性部位阻害剤をさらに含む。

本発明の一実施形態において、製剤は、薬学的に許容される保存料をさらに含む。本発明の一実施形態において、保存料は、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、メチルp-ヒドロキシベンゾエート、プロピルp-ヒドロキシベンゾエート、2-フェノキシエタノール、ブチルp-ヒドロキシベンゾエート、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノールおよびチオメロザール、ブロノポール、安息香酸、イミドウレア、クロルヘキシジン、ナトリウムデヒドロアセテート、クロロクレゾール、エチルp-ヒドロキシベンゾエート、ベンゼトニウムクロリド、クロルフェネシン(3p-クロロフェノキシプロパン-1,2-ジオール)またはその混合物からなる群から選択される。

本発明の一実施形態において、保存料は、0.1mg/ml〜20mg/mlの濃度で存在する。本発明の一実施形態において、保存料は、0.1mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在する。本発明の一実施形態において、保存料は、5mg/ml〜10mg/mlの濃度で存在する。本発明の一実施形態において、保存料は、10mg/ml〜20mg/mlの濃度で存在する。これらの特定の保存料の各々1つは、本発明の代替実施形態を構成する。医薬組成物における保存料の使用は、当業者に周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版、2000が参照される。

本発明の一実施形態において、製剤は、等張剤をさらに含む。本発明の一実施形態において、等張剤は、塩(例えば、ナトリウムクロリド)、糖または糖アルコール、アミノ酸(例えば、L-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えば、グリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えば、PEG400)またはそれらの混合物からなる群から選択される。任意の糖、例えば、単糖、二糖もしくは多糖、または例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、水溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロースNaを含む、水溶性グルカンを使用できる。一実施形態において、糖添加物はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも1つの-OH基を有するC4〜C8炭化水素として定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ダルシトール、キシリトールおよびアラビトールが挙げられる。一実施形態において、糖アルコール添加物はマンニトールである。上に言及した糖または糖アルコールは、単独でまたは組み合わせて使用できる。糖または糖アルコールが液状調製物に可溶性であり、本発明の方法を用いて実現される安定化効果に悪影響を与えない限りは、使用量に決まった制限はない。一実施形態において、糖または糖アルコールの濃度は、約1mg/ml〜約150mg/mlの間である。本発明の一実施形態において、等張剤は1mg/ml〜50mg/mlの濃度で存在する。本発明の一実施形態において、等張剤は1mg/ml〜7mg/mlの濃度で存在する。本発明の一実施形態において、等張剤は8mg/ml〜24mg/mlの濃度で存在する。本発明の一実施形態において、等張剤は25mg/ml〜50mg/mlの濃度で存在する。これらの特定の等張剤の各々1つは、本発明の代替実施形態を構成する。医薬組成物での等張剤の使用は、当業者に周知である。便宜上、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第20版、2000が参照される。

本発明の一実施形態において、製剤は、キレート化剤をさらに含む。本発明の一実施形態において、キレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸およびアスパラギン酸、ならびにそれらの混合物から選択される。本発明の一実施形態において、キレート化剤は、0.1mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在する。本発明の一実施形態において、キレート化剤は、0.1mg/ml〜2mg/mlの濃度で存在する。本発明の一実施形態において、キレート化剤は、2mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在する。これらの特定のキレート化剤の各々1つは、本発明の代替的実施形態を構成する。医薬組成物中でのキレート化剤の使用は、当業者に周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版、2000が参照される。

本発明の一実施形態において、製剤は安定剤をさらに含む。医薬組成物における安定剤の使用は、当業者に周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版、2000が参照される。

より特に、本発明の組成物は、治療有効成分が、液体医薬製剤中で貯蔵中に凝集形成を示す可能性のあるポリペプチドを含む、安定化液体医薬組成物である。「凝集形成」とは、可溶性のまま残り得るオリゴマー、または溶液から沈殿する大きな可視的凝集物の形成に至るポリペプチド分子間の物理的相互作用を意味する。「貯蔵中」とは、一度調製した液体医薬組成物または製剤が、対象に直ぐに投与されないことを意味する。正しくは、液体医薬組成物または製剤は、調製後、貯蔵のために、液体形態、凍結状態、または対象に投与するのに適した液体形態または他の形態に後で再構成するための乾燥形態のいずれかで包装される。「乾燥形態」とは、液体医薬組成物または製剤が、凍結乾燥(すなわち、凍結乾燥;WilliamsおよびPolli(1984)、J. Parenteral Sci. Technol.、38:48〜59参照)、噴霧乾燥(Spray-Drying Handbook中のMasters(1991)(第5版;Longman Scientific and Technical、Essez、U.K.)、491〜676頁;Broadheadら(1992)Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169〜1206;Mumenthalerら(1994)Pharm. Res. 11:12〜20参照))、または空気乾燥(CarpenterおよびCrowe(1988)Cryobiology 25:459〜470;Roser(1991)Biopharm. 4:47〜53)のいずれかにより乾燥させることを意味する。

液体医薬組成物の貯蔵中のポリペプチドによる凝集形成は、当該ポリペプチドの生物学的活性に悪影響を及ぼし、医薬組成物の治療効果を低下させる可能性がある。さらに、ポリペプチド含有医薬組成物が、注入システムを用いて投与される場合、凝集形成は、管、膜またはポンプの閉塞などの他の問題を引き起こす可能性がある。

本発明の医薬組成物は、組成物の貯蔵中に、ポリペプチドによる凝集形成を低下させるのに十分な量のアミノ酸塩基をさらに含むことができる。「アミノ酸塩基」とは、任意の所与のアミノ酸がその遊離塩基形態またはその塩形態のいずれかで存在する、アミノ酸、またはアミノ酸の組合せを意味する。アミノ酸の組合せを使用する場合、すべてのアミノ酸が遊離塩基形態で存在してもよく、すべてがそれらの塩形態で存在してもよく、またはいくつかがそれらの遊離塩基形態で存在してもよいの対して他がそれらの塩形態で存在する。一実施形態において、本発明の組成物を調製する際に使用するアミノ酸は、帯電した側鎖を有するもの、例えば、アルギニン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸である。特定アミノ酸(例えば、メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンおよびそれらの混合物)がその遊離塩基形態またはその塩形態で存在している限り、特定アミノ酸の任意の立体異性体(すなわち、L、Dまたはそれらの混合物)またはこれらの立体異性体の組合せが、本発明の医薬組成物中に存在してもよい。一実施形態において、L立体異性体を使用する。本発明の組成物は、これらアミノ酸の類似体を用いて製剤化してもよい。「アミノ酸類似体」とは、本発明の液体医薬組成物の貯蔵中に、ポリペプチドによる凝集形成を低下させる望ましい効果をもたらす天然に存在するアミノ酸の誘導体を意味する。適切なアルギニン類似体としては、例えば、アミノグアニジン、オルニチンおよびN-モノエチル-L-アルギニンが挙げられ、適切なメチオニン類似体としては、エチオニンおよびブチオニンが挙げられ、適切なシステイン類似体としては、S-メチル-L-システインが挙げられる。他のアミノ酸と同様に、アミノ酸類似体は、それらの遊離塩基形態またはそれらの塩形態のいずれかで組成物中に取り込まれる。本発明の一実施形態において、アミノ酸またはアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を防止または遅延させるのに十分な濃度で使用される。

本発明の一実施形態において、治療薬として作用するポリペプチドが、メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を受けやすい少なくとも1つのメチオニン残基を含むポリペプチドである場合、メチオニン(または、他の硫黄含有アミノ酸またはアミノ酸類似体)を、このような酸化を抑制するために加えることができる。「抑制する」とは、経時的にメチオニン酸化種の蓄積を最小限にすることを意味する。メチオニン酸化を抑制することにより、その適正な分子形態でポリペプチドがより多く保持される。メチオニンのいずれかの立体異性体(L、Dまたはそれらの混合物)またはその組合せを使用できる。添加されるべき量は、メチオニンスルホキシドの量が規制当局に許容されるように、メチオニン残基の酸化を抑制するのに十分な量でなければならない。通常、これは、組成物が、約10%〜約30%以下のメチオニンスルホキシドを含有することを意味する。一般に、これは、添加するメチオニンとメチオニン残基との比が約1:1〜約1000:1、例えば、約10:1〜約100:1の範囲となるように、メチオニンを加えることによって実現できる。

本発明の一実施形態において、製剤は、高分子量ポリマーまたは低分子量化合物からなる群から選択される安定剤をさらに含む。本発明の一実施形態において、安定剤は、ポリエチレングリコール(例えば、PEG3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ/ヒドロキシセルロースまたはその誘導体(例えば、HPC、HPC-SL、HPC-LおよびHPMC)、シクロデキストリン、硫黄含有物質、例えば、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノール、ならびに各種の塩(例えば、ナトリウムクロリド)から選択される。これらの特定の安定剤の各々1つは、本発明の代替的実施形態を構成する。

医薬組成物は、治療有効ポリペプチドの安定性をさらに高める追加の安定化剤も含むことができる。本発明で特に関心のある安定化剤としては、それだけに限らないが、ポリペプチドをメチオニン酸化から保護するメチオニンおよびEDTA、ならびにポリペプチドを凍結融解または機械的剪断に関連する凝集から保護する非イオン性界面活性剤が挙げられる。

本発明の一実施形態において、製剤は、界面活性剤をさらに含む。本発明の一実施形態において、界面活性剤は、洗浄剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックポリマー(例えば、Pluronic(登録商標)F68、ポロキサマー188および407、トリトンX-100などのポロキサマー)、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンおよびポリエチレン誘導体、例えば、アルキル化誘導体およびアルコキシル化誘導体(Tween、例えば、Tween-20、Tween-40、Tween-80およびBrij-35)、モノグリセリドもしくはそのエトキシル化誘導体、ジグリセリドもしくはそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチンおよびリン脂質(例えば、ホスファチジルセリン,ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロールおよびスフィンゴミエリン)、リン脂質誘導体(例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸)およびリゾリン脂質誘導体(例えば、パルミトイルリゾホスファチジル-L-セリンおよびエタノールアミン、コリン、セリンもしくはスレオニンの1-アシル-sn-グリセロ-3-ホスフェートエステル)、リゾホスファチジルおよびホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシ(アルキルエステル)、アルコキシ(アルキルエーテル)誘導体、例えば、リゾホスファチジルコリンのラウロイル誘導体およびミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトールである極性頭基の修飾物、正帯電したDODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルスレオニン、グリセロリン脂質(例えば、セファリン)、グリセロ糖脂質(例えば、ガラクトピラノシド)、スフィンゴ糖脂質(例えば、セラミド、ガングリオシド)、ドデシルホスホコリン、ニワトリ卵リソレシチン、フシジン酸誘導体(例えば、ナトリウムタウロ-ジヒドロフシデートなど)、長鎖脂肪酸およびその塩C6〜C12(例えば、オレイン酸およびカプリル酸)、アシルカルニチンお
よび誘導体、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンのN^α-アシル化誘導体、リシンもしくはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンと中性もしくは酸性アミノ酸との任意の組合せを含むジペプチドのN^α-アシル化誘導体、中性アミノ酸と2つの帯電アミノ酸との任意の組合せを含むトリペプチドのN^α-アシル化誘導体、DSS(ドクサートナトリウムCAS登録番号[577-11-7])、ドクサートカルシウムCAS登録番号[128-49-4]、ドクサートカリウムCAS登録番号[7491-09-0])、SDS(ナトリウムドデシルスルフェートもしくはナトリウムラウリルスルフェート)、ナトリウムカプリレート、コール酸もしくはその誘導体、胆汁酸およびその塩、ならびにグリシンもしくはタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、ナトリウムコレート、ナトリウムデオキシコレート、ナトリウムタウロコレート、ナトリウムグリコレート、N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート、アニオン性(アルキル-アリール-スルホネート)一価界面活性剤、双イオン性界面活性剤(例えば、N-アルキル-N,N-ジメルアンモニオ-1-プロパンスルホネート、3-コールアミド-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホネート)、カチオン性界面活性剤(第4級アンモニウム塩基)(例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド)、非イオン性界面活性剤(例えば、ドデシルβ-D-グルコピラノシド)、プロピレンオキシドおよびエチレンオキシドをエチレンジアミンに順次加えることにより誘導される四官能性ブロックコポリマーであるポロキサミン(例えば、Tetronic's)から選択されるか、または界面活性剤は、イミダゾリン誘導体およびその混合物からなる群から選択できる。これらの特定の界面活性剤の各々1つは、本発明の代替的実施形態を構成する。

医薬組成物中での界面活性剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版、2000が参照される。

他の成分が、本発明の医薬製剤に存在し得る可能性がある。このような追加成分としては、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、増量剤、等張性修飾剤、キレート化剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質)および両性イオン種(例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシンおよびヒスチジンなどのアミノ酸)を挙げることができる。当然ながら、このような追加の成分は、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に悪影響を与えてはならない。

本発明のコンジュゲート血液凝固因子を含有する医薬組成物は、このような治療を必要とする患者に、例えば、皮膚および粘膜部位などの局所部位、動脈内、静脈内、心臓内での投与など吸収をバイパスする部位、および皮内、皮下、筋肉内または腹部内での投与など吸収に関与する部位に投与できる。

本発明の医薬組成物の投与は、このような治療を必要とする患者に、舌、舌下、バッカル、口内、経口、胃および腸内、鼻、例えば、細気管支および肺胞またはその組合せを通して肺、表皮、真皮、経皮、経膣、直腸、例えば、結膜を介して眼、尿管および非経口など、複数の投与経路を介するものであってよい。

本発明の組成物は、いくつかの剤形で、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、複合エマルジョン、フォーム、膏薬、ペースト、硬膏、軟膏、錠剤、被覆錠剤、リンス、カプセル、例えば、硬ゼラチンカプセルおよび軟ゼラチンカプセル、坐薬、直腸カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、粉末、エアロゾル、吸入剤、点眼剤、眼軟膏、眼リンス、膣ペッサリー、膣リング、膣軟膏、注射液、in situ形質転換溶液、例えば、in situゲル化、in situ硬化、in situ沈殿、in situ結晶化、注入溶液およびインプラントとして投与できる。

さらに、本発明の組成物は、本発明のペプチドの安定性をさらに高めるため、バイオアベイラビリティを増加させるため、溶解度を増加させるため、副作用を低減するため、当業者に周知の時間療法を実現するため、患者のコンプライアンスを高めるため、またはそれらの任意の組合せのために、例えば、共有、疎水性および静電的相互作用を介して、薬物担体、薬物送達系および高度薬物送達系に混合してもよく、または結合させてもよい。担体、薬物送達系および高度薬物送達系の例としては、それだけに限らないがポリマー、例えば、セルロースおよび誘導体、多糖、例えば、デキストランおよび誘導体、デンプンおよび誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリレートおよびメタクリレートポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにそれらのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、キャリアタンパク質、例えば、アルブミン、ゲル、例えば、当業者に周知のブロックコポリマー系などの熱ゲル化系、ミセル、リポソーム、ミクロスフェア、ナノ粒子、液晶およびその分散液、脂質-水系における相挙動の当業者に周知のL2相およびその分散液、ポリマーミセル、複合エマルジョン、自己乳化、自己ミクロ乳化、シクロデキストリンおよびその誘導体、ならびにデンドリマーが挙げられる。

本発明の組成物は、すべて当業者に周知のデバイスである、例えば、計量吸入器、乾燥粉末吸入器およびネブライザーを用いて本発明のペプチドを肺投与するために、固体、半固体、粉末および溶液の製剤において有用である。

本発明の組成物は、制御放出、持続放出、延長放出、遅延放出および徐放出の薬物送達系製剤において特に有用である。より特に、それだけに限らないが、組成物は、当業者に周知の非経口制御放出系および非経口持続放出系(いずれの系も、投与回数を何分の1かに低減する)の製剤において有用である。皮下投与のための制御放出系および持続放出系がさらにより好ましい。本発明の範囲を限定するものではないが、有用な制御放出系および組成物の例としては、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマーミセル、ミクロスフェアおよびナノ粒子がある。

本発明の組成物に有用な制御放出系を製造する方法としては、それだけに限らないが結晶化、凝縮、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散、高圧均質化、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフェアを製造するための溶媒蒸発、押出および超臨界流体処理が挙げられる。一般には、Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D.L.編、Marcel Dekker、New York、2000)およびDrug and the Pharmaceutical Sciences99巻:Protein Formulation and Delivery(MacNally, E.J.編、Marcel Dekker、New York、2000)を参照されたい。

非経口投与は、注射器、場合によりペン様注射器を用いて皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与または静脈内投与により実行できる。あるいは、非経口投与は注入ポンプを用いて実行できる。さらなる任意選択は、鼻スプレーまたは肺スプレーの形態で本発明のペプチドを投与するための溶液または懸濁液であってよい組成物である。さらにさらなる任意選択として、本発明のペプチドを含有する医薬組成物は、無針注射によるか、もしくはパッチ、場合によりイオン泳動パッチからなどの経皮投与、またはバッカル投与などの経粘膜投与に適合させてもよい。

「安定化組成物」という用語は、高い物理的安定性、高い化学的安定性または高い物理的および化学的安定性を有する組成物を指す。

本明細書で使用するタンパク質組成物の「物理的安定性」という用語は、タンパク質を、熱-機械的ストレス、ならびに/または不安定化させる界面および表面、例えば、疎水性の表面および界面との相互作用に曝した結果として、タンパク質の生物学的に不活性および/または不溶性の凝集物を形成するタンパク質の傾向を指す。水性タンパク質組成物の物理的安定性は、適当な容器(例えば、カートリッジまたはバイアル)に充填した組成物を、異なる温度で異なる時間で、機械的/物理的ストレス(例えば、撹拌)に曝した後、目視検査および/または濁度の測定により評価される。組成物の目視検査は、暗背景で鋭く集光した光によって行われる。組成物の濁度は、濁度を例えば、0〜3のスケールでランク付ける視覚スコアにより特徴付けられる(濁りを示さない組成物は、視覚スコア0に相当し、昼光で視覚的濁りを示す組成物は、視覚スコア3に相当する)。組成物が昼光で視覚的濁りを示す場合、タンパク質凝集に対して物理的に不安定と分類される。あるいは、組成物の濁度は、当業者に周知の簡単な濁度測定により評価できる。水性タンパク質組成物の物理的安定性は、タンパク質の立体配座状態の分光学的薬剤またはプローブを用いて評価することもできる。プローブは、タンパク質の非天然コンフォーマーに優先的に結合する小分子であることが好ましい。タンパク質構造の小分子分光プローブの一例としては、チオフラビンTがある。チオフラビンTは、アミロイドフィブリルの検出のために広く使用されている蛍光染料である。フィブリル、およびおそらくさらに他のタンパク質構造の存在下において、チオフラビンTは約450nmで新たな最大励起を生じ、フィブリルタンパク質形態に結合すると、約482nmで増大した発光を生ずる。非結合型のチオフラビンTは、波長で本質的に非蛍光性である。

他の小分子を、天然状態から非天然状態へのタンパク質構造における変化のプローブとして使用できる。例えば、「疎水性パッチ」プローブは、タンパク質の露出疎水性パッチに優先的に結合する。疎水性パッチは、その天然状態のタンパク質の3次構造内に通常埋まっているが、タンパク質がアンフォールドまたは変性し始めると露出されるようになる。これらの小分子分光プローブの例としては、芳香族疎水性染料、例えば、アントラセン、アクリジン、フェナントロリンなどがある。他の分光プローブは、金属-アミノ酸錯体、例えば、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンなどの疎水性アミノ酸のコバルト金属錯体がある。

本明細書で使用する場合、タンパク質組成物の「化学的安定性」という用語は、天然のタンパク質構造と比較して潜在的に低い生物学的効力および/または潜在的に高い免疫原性を有する化学的分解生成物の形成に至る、タンパク質構造における化学的共有結合の変化を指す。天然のタンパク質の種類および性質、ならびにタンパク質が曝される環境に応じて、様々な化学的分解生成物が形成され得る。化学的分解の排除は、ほぼ確実に完全には回避できず、化学分解生成物の量の増大は、当業者に周知のように、タンパク質組成物の貯蔵中および使用中にしばしば見られる。大部分のタンパク質は、グルタミン残基またはアスパラギン残基中の側鎖アミド基が加水分解されて遊離カルボン酸を形成するプロセスである、脱アミド化しやすい。他の分解経路は、高分子量の形質転換生成物の形成を伴い、そこで2つ以上のタンパク質分子がアミド基転移および/またはジスルフィド相互作用により互いに共有結合して、共有結合したダイマー、オリゴマーおよびポリマーの分解生成物の形成に至る(Stability of Protein Pharmaceuticals、Ahern. T.J. & Manning M.C.、Plenum Press、New York 1992参照)。化学分解の別の変形形態として、(例えば、メチオニン残基の)酸化を挙げることができる。タンパク質組成物の化学安定性は、異なる環境条件に曝した後の様々な時点での化学分解生成物の量を測定することによって評価できる(分解生成物の形成は、例えば、温度を上昇させることによりしばしば加速できる)。各個々の分解生成物の量は、様々なクロマトグラフィー技術(例えば、SEC-HPLCおよび/またはRP-HPLC)を使用して、分子サイズおよび/または電荷に応じて分解生成物を分離することによりしばしば決定される。

したがって、上に概説したように、「安定化組成物」とは、増大した物理的安定性、増大した化学的安定性、または増大した物理的および化学的安定性を有する組成物を指す。一般に、組成物は有効期限に達するまで、(推奨される使用および貯蔵条件に従って)使用中および貯蔵中安定でなければならない。

本発明の一実施形態において、式(I)のタンパク質コンジュゲートを含む医薬組成物は、6週間超の使用および3年超の貯蔵に対して安定である。

本発明の別の実施形態において、式(I)のタンパク質コンジュゲートを含む医薬組成物は、4週間超の使用および3年超の貯蔵に対して安定である。

本発明のさらなる実施形態において、式(I)のタンパク質コンジュゲートを含む医薬組成物は、4週間超の使用および2年超の貯蔵に対して安定である。

本発明のさらにさらなる実施形態において、式(I)のタンパク質コンジュゲートを含む医薬組成物は、2週間超の使用および2年超の貯蔵に対して安定である。

本発明のさらにさらなる実施形態において、式(I)のタンパク質コンジュゲートを含む医薬組成物は、1週間超の使用および6ヶ月超の貯蔵に対して安定である。

調製の一般的方法
A-W-B-部分は、酵素的にまたは化学反応基を介してタンパク質に結合できる。反応基の選択は、アルブミン結合剤上に存在する官能基、および変性するタンパク質の官能基に依存する。

(a)化学反応基
活性化エステル
活性化エステルは、一般に、アミノ官能基、例えば、リシン残基上のεアミノ基、ペプチド/タンパク質鎖のN末端に存在するアミノ基に対して反応性である。

適切な活性化エステルとしては、N-ヒドロキシスクシニミジルエステルが挙げられるが、他の活性化エステル、例えば、ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン、7-アザベンゾトリアゾール-1-イルエステルなどが当業者に知られている。

一実施形態において、タンパク質は、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在下で、水溶液中で活性化エステルとして誘導体化される非水溶性アルブミン結合剤でアシル化される。

遊離チオール基への結合
タンパク質は、以下に示すマレイミド誘導体化アルブミン結合剤と反応できる遊離チオール基を含有できる。

他のチオール反応基としては、ハロアセトアミド、例えば、ヨードアセトアミドまたはブロモアセトアミドおよびS-チオピリジル基が挙げられる。

一実施形態において、遊離チオール基を含有するタンパク質を、水溶液中で、マレイミド基で官能化した非水溶性アルブミン結合剤と、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在下で反応させる。

アルデヒド基への結合
アルデヒド官能基は、国際公開第2008/025856A2号に記載されているように、N末端セリンまたはスレオニン残基の温和な酸化、または糖タンパク質上のグリカン部分の温和な酸化によりタンパク質上で生成できる。次いで、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドで官能化したアルブミン結合剤は、以下に示すタンパク質に結合できる。

一実施形態において、タンパク質を、アルデヒド官能基を含有するように酸化して、次いで水溶液中で、ヒドロキシルアミン基で官能化した非水溶性アルブミン結合剤と、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在下で反応させる。

(b)酵素結合
アルブミン結合剤は、酵素を用いてタンパク質に結合できる。

ガラクトースオキシダーゼ
ガラクトース端末を含有する糖タンパク質は、国際公開第2005/014035A2号に記載のガラクトースオキシダーゼ(EC.1.1.3.9)を用いて酵素的に酸化できる。糖タンパク質上のガラクトース残基は、シアル酸の存在によりブロックされるため、酵素的酸化にしばしば直接利用できない。このような場合、シアル酸は、酸化が可能になる前にシアリダーゼ/ノイラミニダーゼの使用により、または弱酸加水分解により除去する必要がある。

一実施形態において、糖タンパク質を、アルデヒド官能基を含有するようにガラクトースオキシダーゼを用いて酸化して、次いで水溶液中で、ヒドロキシルアミン基で官能化した非水溶性アルブミン結合剤と、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在下で反応させる。

トランスグルタミナーゼ
トランスグルタミナーゼ(E.C.2.3.2.13)は、タンパク質-グルタミン-γ-グルタミルトランスフェラーゼとしても知られており、一般的な反応を触媒する。

Q-C(O)-NH₂(アミンアクセプター)は、グルタミン残基含有ペプチドまたはタンパク質を表すことができ、Q'-NH₂(アミンドナー)は、アミン含有求核試薬を表す。あるいは、Q-C(O)-NH₂およびQ'-NH₂は各々アミンアクセプターおよびリシン含有ペプチドまたはタンパク質を表すことができる。しかし、本発明において、Q-C(O)-NH₂は、グルタミン残基含有タンパク質を表し、Q'-NH₂は、上に示されているようにアミン含有求核試薬を表す。

有用なトランスグルタミナーゼの例としては、微生物トランスグルタミナーゼ、例えば、ストレプトマイセスモバラエンス(Streptomyces mobaraense)、ストレプトマイセスシナモネウム(Streptomyces cinnamoneum)およびストレプトマイセスグリセオカルネウム(Streptomyces griseocarneum)(すべて、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第5156956号に開示されている)に由来するもの、ならびにストレプトマイセスラベンデュラエ(Streptomyces lavendulae)(参照により本明細書に組み込まれている米国特許第5252469号に開示されている)およびストレプトマイセスラダカヌム(Streptomyces ladakanum)(参照により本明細書に組み込まれている特開2003-199569号)が挙げられる。以前の属ストレプトベルティシリウム(Streptoverticillium)のメンバーは、現在属ストレプトマイセスに含まれることを注意されたい(Kaempfer、J. Gen. Microbiol. 137、1831〜1892(1991))。他の有用な微生物トランスグルタミナーゼは、バチルスサブチルス(Bacillus subtilis)(参照により本明細書に組み込まれている米国特許第5731183号に開示されている)および様々なミコマイセタから単離されている。有用な微生物トランスグルタミナーゼの他の例としては、国際公開第96/06931号(例えば、バチルスリディクス(Bacilus lydicus)由来のトランスグルタミナーゼ)および国際公開第96/22366号に開示されているものがあり、いずれも参照により本明細書に組み込まれている。有用な非微生物トランスグルタミナーゼとしては、モルモット肝臓トランスグルタミナーゼ、ならびに(参照により本明細書に組み込まれている欧州特許第0555649号に開示されている)カレイ(Pagrus major)および(参照により本明細書に組み込まれている米国特許第5736356号に開示されている)日本産真ガキ(Crassostrea gigas)などの様々な海洋源由来のトランスグルタミナーゼが挙げられる。

一実施形態において、タンパク質は、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在下、水溶液中で、トランスグルタミナーゼおよびアミンハンドルで誘導体化された非水溶性アルブミン結合剤で処理される。

カルボキシペプチダーゼY
タンパク質は、カルボキシペプチダーゼY(EC. 3.4.16.5)、および国際公開第2007/093594号に記載の適切に修飾された基質の使用によりそのC端末で変性できる。C端末アラニンが、N^ε-(4-アセチルベンゾイル)リシンと酵素的に交換され、次いでアルブミン結合剤誘導体A-W-B-ONH₂と反応させる、B.Peschkeら「C-Terminally PEGylated hGH derivatives」Bioorg. Med. Chem. 15(2007)4382〜4395に記載の2段階法が例として示されている。

一実施形態において、タンパク質は、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在下、水溶液中で、カルボキシペプチダーゼYおよびN^ε-(4-アセチルベンゾイル)リシン、次いでアミノキシハンドルで誘導体化された非水溶性アルブミン結合剤で処理される。

次に、以下の非限定的実施例を参照しながら本発明をさらに説明する。

(実施例)
使用した略語
amu=原子質量単位
hr(s)=時間
Hz=ヘルツ
L=リットル
M=モル
mbar=ミリバール
mg=ミリグラム
min=分
mL=ミリリットル
mM=ミリモル
mm=ミリメートル
mmol=ミリモル
nmol=ナノモル
mol=モル
MW=分子量
N=正常
nm=ナノメートル
sec=秒
ppm=100万分の一
ESI=エレクトロスプレーイオン化
i.v.=静脈内
m/z=質量対電荷比
MS=質量分析
HPLC=高圧液体クロマトグラフィー
RP=逆相
HPLC-MS=高圧液体クロマトグラフィー-質量分析
NMR=核磁気共鳴分光法
p.o.=経口による
rtまたはRT=室温
s.c.=皮下
tr=保持時間
Boc=tert-ブチルオキシカルボニル
OtBu=tert-ブチルエステル
tBu=tert-ブチル
Boc-4-ABZ-OH=4-tert-ブトキシカルボニルアミノ安息香酸
CH₃CN=アセトニトリル
DCM=ジクロロメタン、CH₂Cl₂、メチレンクロリド
DIC=ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA=N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMF=N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO=ジメチルスルホキシド
DTT=ジチオトレイトール
EDAC=1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド
Et₂0=ジエチルエーテル
EtOAc=エチルアセテート
Fmoc=9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル
Fmoc-Glu-O-t-Bu=N-Fmoc-グルタミン酸-1-t-ブチルエステル
Fmoc-Lys(Mtt)-OH=(S)-6-[(ジフェニル-p-トリル-メチル)-アミノ]-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸
Fmoc-OEG-OH=(2[2-(Fmoc-アミノ)エトキシ]エトキシ)酢酸
H₂O=水
HBTU=2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOAt=1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt=1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
MeCN=アセトニトリル
MeOH=メタノール
NaCl=ナトリウムクロリド
NaOH=ナトリウムヒドロキシド
NMP=N-メチルピロリジン-2-オン
OEG=(2[2-(アミノ)エトキシ]エトキシ)酢酸
OtBu=tert-ブチルエステル
TFA=トリフルオロ酢酸
THF=テトラヒドロフラン
TIS=トリイソプロピルシラン
Trt=トリフェニルメチル
TSTU=O-(N-スクシニミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウラニウムテトラフルオロボレート
CDCl₃=重水素化クロロホルム
CD₃OD=テトラ重水素化メタノール
DMSO-d₆=ヘキサ重水素化ジメチルスルホキシド

実施例で使用するTGaseは、米国特許第5156956号によるストレプトベルチシリウムモバラエンス由来の微生物トランスグルタミナーゼである。

実施例は、以下の一般的方法も含有する。

キャピラリー電気泳動法
キャピラリー電気泳動法を、Agilent Technologies 3DCEシステム(Agilent Technologies)を用いて行った。データ収集および信号処理は、Agilent Technologies 3DCE ChemStationを用いて行った。キャピラリーは、64.5cm(有効な長さ56.0cm)、50μm内径のAgilent製の「Extended Light Path Capillary」であった。UV検出は、200nm(16nmBw、基準380nmおよび50nmBw)で行った。ランニング電解質は、50mMホスフェート緩衝液pH7であった(方法A)。キャピラリーは、0.1M NaOHにて3分間、次いでミリQ水にて2分間、電解質にて3分間調整した。各動作後、キャピラリーを、ミリQ水にて2分間、次いでリン酸にて2分間、ミリQ水にて2分間洗い流した。水力学的注入を、50mbarで4.0秒間行った。電圧は+25kVであった。キャピラリーの温度は30℃であり、動作時間は10.5分であった。

Maldi-Tof質量分析法
分子量を、Autoflex Maldi-Tof装置(Bruker)を用いて決定した。試料を、マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸を用いて調製した。

RP-HPLC
RP-HPLC分析は、Vydac218TP54 4.6mm×250mm 5μm C-18シリカカラム(The Separations Group、Hesperia)を用いてAgilent 1100システム上で行った。検出は、214nm、254nm、280nmおよび301nmでUVにより行った。カラムを、0.1%トリフルオロ酢酸/H₂Oで平衡化し、試料を、0.1%トリフルオロ酢酸/H₂Oに対して0〜90%アセトニトリルの適切な勾配により溶出した。

LC-MS
LC-MS分析は、Perkin Elmer Series 200マイクロポンプ2台、Perkin Elmer Series 200オートサンプラー1台、Applied Biosystems 785A UV検出器1台およびSedex 75蒸発光散乱検出器1台を備えたPE-Sciex API 100または150質量分析計で行った。Waters Xterra 3.0mm×50mm 5μC-18シリカカラムを、1.5ml/分で室温にて溶出した。それを5%MeCH/0.1%TFA/H₂Oで平衡化し、5%MeCH/0.1%TFA/H₂Oで1分間溶出し、次いで、90%MeCH/0.1%TFA/H₂Oまでの直線勾配で7分にわたって溶出した。検出は、214nmでのUV検出および蒸発光散乱により行った。カラム溶出液のフラクションを、PE-Sciex API 100質量分析計のイオンスプレー界面に導入した。300〜2000amuの質量範囲を、動作中2秒ごとに走査した。

タンパク質の定量
タンパク質濃度は、NanoDrop ND-1000 UV-分光光度計を用いて280nmでの吸光度を測定することにより推定した。

誘導体化部位の決定のための酵素ペプチドマッピング
ペプチドマッピングを、還元およびアルキル化タンパク質のAsp-N消化を用いて行った。最初に、タンパク質を、標準的な手順に従ってDTTおよびヨードアセトアミドで処理した。アルキル化した生成物を、HPLCを用いて精製した。次いで、アルキル化し、精製した生成物を、1:100の酵素:基質の比でエンドプロテアーゼAsp-N(Boehringer)で終夜消化させた。消化物を、C-18カラムおよび標準TFA/MeCN緩衝系を用いてHPLC分離した。得られたペプチドマップを、非誘導体化hGHのものと比較し、保持時間の異なるフラクションを収集して、Maldi-tof質量分析を用いてさらに分析した。

SDS page
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を、NuPAGE4%〜12%Bis-Trisゲル(Invitrogen NP0321BOX)を用いて行った。ゲルを、銀染色(Invitrogen LC6100)またはクマシー染色(Invitrogen LC6065)し、適切な場合、M. M. Kurfurst in Anal. Biochem. 200(2)、244〜248(1992)に記載されているように、PEGについてもヨウ化バリウムで染色した。

タンパク質クロマトグラフィー
タンパク質クロマトグラフィーを、Akta ExplorerクロマトグラフィーシステムおよびGE Health Care製カラムで行った。アニオン交換を、Q-Sepharose HP26/10カラムを用いて行った。出発緩衝液は、20mMトリエタノールアミン緩衝液pH8.5であり、溶出緩衝液は、出発緩衝液+0.2M NaClであった。化合物を、15カラム量にわたって0〜75%溶出緩衝液の勾配で通常溶出した。脱塩および緩衝液交換は、HiPrep 26/10カラムを用いて行った。

(実施例A)
コンジュゲート因子VIIaの調製
ステップ(a)-アルブミン結合剤(1)の調製

アルブミン結合剤(1)を、2-クロロトリチルクロリド樹脂を用いて従来の固相合成により組み合わせた。樹脂をDCM中で膨張させて、次いで、10倍過剰量の4,7,10-トリオキサ-1,13-ジアミンを加えた。洗浄後、Fmoc-Glu(OtBu)OH、Fmoc-Glu-OtBuおよびFmoc-Thex-OH(トランサミン酸)を順次結合し、HOBt/DICおよび30%ピペリジン-DMFを用いて脱保護した。最終的に、完全に脱保護したエイコサン二酸を、HOAC、DIC、ルチジンを用いて過剰に結合させた。次いで、アルブミン結合剤を、DCM中の10%TFAを用いて樹脂から切断した。

ステップ(a)-代替法
2-クロロトリチル樹脂(2.0g、2.6mmol)をDCM中で30分間膨張させた。DCM(30ml)中の4,7,10-トリオキサ-1,13-ジアミン溶液を加えた。樹脂を室温で1時間撹拌した。樹脂を、ジクロロメタンで1回洗浄し、次いで、DIPEA:MeOH:DCM(15m1:15ml:20ml)溶液を加えた。樹脂を30分間振とうし、次いでDCMで3回洗浄した。次いで、FmocGlu(OtBu)OH、FmocGluOtBuおよびFmocThexOHを、以下のように標準ペプチド化学により順次結合した。NMP(11.7ml)中のFmoc-AA-OH/DIC/HOBt各々の0.5M溶液を混合し、2分後樹脂に加えた。樹脂を室温で45分間振とうし、次いで5×NMPおよび5×DCMで洗浄した。Ac2O/DIPEA/NMP(1:1:5)溶液を加え、樹脂を室温で10分間撹拌した。樹脂を洗浄した(5×NMPおよび5×DCM)。次いで樹脂を、30%ピペリジン-NMPで2×10分間処理し、最終的に5×NMPおよび5×DCMで洗浄した。次いで、ペプチドに、0.125M HOAt(3等量)、0.125M DIC(3等量)および0.125Mルチジン(3等量)を含有するエイコサン二酸(6等量)の0.25M溶液を加えた。樹脂を室温で2時間振とうした。樹脂を5×NMPおよび8×DCMで洗浄した。生成物(1)を、20分間10%TFA-DCMを用いて樹脂から切断した。樹脂を濾過し、樹脂を、さらにもう一度10%TFA-DCMでさらに20分間処理した。合わせた濾過液を収集し、乾燥させた。

ステップ(b)-マレイミド官能化アルブミン結合剤(2)の調製

アルブミン結合剤を、DMF中のTSTU活性化3-マレイミドプロピオン酸を加えることにより、マレイミドハンドルを有する遊離アミノ基でさらに官能化した。95%TFA-ミリQ中での最後の脱保護およびアセトニトリル中での再結晶化後、式(2)の化合物を、微細な白色粉末として得た。

ステップ(b)-代替法
上記のステップ(a)からの生成物を、DMF(6ml)に溶解させ、TSTU活性化3マレイミドプロピオン酸(TSTUと、DMF(2ml)中の3マレイミドプロピオン酸とを45分間反応させることにより予め製造)およびDIPEA(200μl)を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。次いで、反応混合物を乾燥させた。残基を、95%TFA-MilliQ水に溶解させ、室温で20分間撹拌した。混合物を乾燥させた。残基を、最小量の水に加え、固体を沈殿させた。固体を濾過し、アセトニトリル中で再結晶化させた。結晶を収集し、ジエチルエーテルで広範に洗浄した。

ステップ(c)-マレイミド官能化アルブミン結合剤(2)のFVIIaへのコンジュゲーション
C407因子VIIaをコンジュゲーションに使用した。50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0中のscFVIIaC407に、50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0中の(2)の溶液+5%2-ヒドロキシエチル-β-シクロデキストリンを加え、25℃で1時間反応させた。試料を十分に濃縮し、緩衝液を、新鮮な50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0と交換し、アポ酵素を、25℃で終夜自動活性化させた。自動活性化および選択的重鎖コンジュゲーションを、SDS-PAGE(還元条件)で確認した。

(実施例1)
1.アルブミン結合剤(II)の調製
テトラゾールOEGリンカー(IIa)

テトラゾールOEGリンカー(IIa)を、スキーム1に従って合成した。

リンクアミド樹脂(2g、0.6mMol/g)2gをフラスコに秤量した。樹脂を、NMP(3×30ml)で2時間膨張させた。

Fmoc基の除去:樹脂をNMP(30ml)中の25%ピペリジンと共に10分間振とうした。樹脂をドレインし、NMP(30ml)中の25%ピペリジンで1時間処理し、次いでドレインし、NMP(6×30ml)で洗浄した。Fmoc-Lys(Mtt)-OHおよびHOBTをフラスコに秤量し、NMP(30ml、0.5mM)中のブロモフェノールブルーに溶解させた。この溶液を、上記のドレインした樹脂に加え、次いでDICを加えた。反応物を、大気温度で21時間振とうした。樹脂をドレインし、NMP(6×30 ml)で洗浄し、次いでDCM(3×30ml)で洗浄した。

樹脂を、ヘキサフルオロイソプロパノール(20ml)で10分間処理した。10分間振とうした。樹脂をドレインし、DCM(3×30ml)で洗浄した。再び、樹脂をヘキサフルオロイソプロパノール(20ml)で10分間処理した。10分間振とうした。樹脂をドレインし、DCM(3×30ml)で洗浄し、次いでドレインし、NMP(3×30ml)で洗浄した。

Boc-4-ABZ-OHおよびHOBTをフラスコに秤量し、NMP(30ml、0.5mM)中のブロモフェノールブルーに溶解させた。この溶液を、上記のドレインした樹脂に加え、次いでDICを加えた。反応物を、大気温度で振とうした。樹脂をドレインし、NMP(6×30ml)で洗浄した。

Fmoc基の除去:樹脂をNMP(10ml)中25%ピペリジンと共に10分間振とうした。樹脂をドレインし、NMP(10ml)中の25%ピペリジンで1時間処理し、次いでドレインし、NMP(6×15ml)で洗浄した。

Fmoc-OEG-OHおよびHOBTをフラスコに秤量し、NMP(15ml、0.5mM)中のブロモフェノールブルーに溶解させた。この溶液を、ドレインした樹脂に加え、次いでDICを加えた。反応物を、大気温度で23時間振とうした。樹脂をドレインし、NMP(6×15ml)で洗浄した。

Fmoc基の除去:樹脂をNMP(10ml)中の25%ピペリジンと共に10分間振とうした。樹脂をドレインし、NMP(10ml)中の25%ピペリジンで1時間処理し、次いでドレインし、NMP(6×15ml)で洗浄した。

Fmoc-Glu-O-t-BuおよびHOBTをフラスコに秤量し、NMP(15ml、0.5mM)中のブロモフェノールブルーに溶解させた。この溶液を、ドレインした樹脂に加え、次いでDICを加えた。反応物を、大気温度で18時間振とうした。樹脂をドレインし、NMP(6×15ml)で洗浄した。

Fmoc-Glu-O-t-BuおよびHOBTをフラスコに秤量し、NMP中の0.5mMブロモフェノールブルー15mlに溶解させた。この溶液を、ドレインした樹脂に加え、次いでDICを加えた。反応物を、大気温度で18時間振とうした。樹脂をドレインし、NMP(6×15ml)で洗浄した。

Fmoc-OEG-OHおよびHOBTをフラスコに秤量し、NMP(15ml、0.5mM)中のブロモフェノールブルーに溶解させた。この溶液を、ドレインした樹脂に加え、次いでDICを加えた。反応物を、大気温度で振とうした。樹脂をドレインし、NMP(6×15ml)で洗浄した。

4-(16-1H-テトラゾール-5-イル-ヘキサデカノイルスルファモイル)酪酸およびHOBTをフラスコに秤量し、NMP(15ml、0.5mM)中のブロモフェノールブルーに溶解させた。この溶液を、ドレインした樹脂に加え、次いでDICを加えた。反応物を、大気温度で21時間振とうした。樹脂をドレインし、NMP(6×15ml NMP)で洗浄し、次いでドレインし、DCM(6×15ml)で洗浄した。

樹脂を水(10ml)+DCM(0.25ml)およびTIPS(0.25ml)中の95%TFAの混合物で切断した。樹脂を大気温度で2時間浸透した。冷ジエチルエーテル(75ml)に濾過浸透させた。得られた沈殿物を、遠心分離により単離し、次いでジエチルエーテルで洗浄し(3×)、48時間真空乾燥させ、表題化合物の粗製物300mgを得た。
TOF-MS:反応時間=4.7分、質量1268.71

粗製表題化合物をprep-HPLC(GILSON)で精製した。T2145-10;30→80%MeCN。プールしたフラクションを、ロータリーエバポレーターで蒸発乾燥させ、残基を、H₂O/MeCN1:1に溶解させ、終夜凍結乾燥させ、表題化合物170mgを得た。

(実施例2)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびWang樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量1124.33

(実施例3)
上記の実施例1に記載されており、かつ以下に示されているのと同様の方法で、以下の化合物を、出発物質としてBoc-Gly-PAM樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量1128.38

(実施例4)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量1333.64

(実施例5)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量1320.67

(実施例6)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量2114.64

(実施例7)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量1534.82

(実施例8)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量823.05

(実施例9)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびWang樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量980.22

(実施例10)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量851.10

(実施例11)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量1258.51

(実施例12)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびWang樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量1269.49

(実施例13)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量841.04

(実施例14)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量863.07

(実施例15)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量855.07

(実施例16)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量883.12

(実施例17)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量1123.35

(実施例18)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:反応時間=4.7分、質量1267.45

(実施例19)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量1310.67

(実施例20)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量1308.58

(実施例21)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Glu(ODmab)-OHおよび2-クロロトリチルクロリド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量1235.56

(実施例22)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Glu(ODmab)-OHおよび2-クロロトリチルクロリド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量1173.40

(実施例23)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量703.93

(実施例24)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Lys(Mtt)-OHおよびリンクアミド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量689.90

(実施例25)
上記の実施例1に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物をFMOC-Glu(ODmab)-OHおよび2-クロロトリチルクロリド樹脂を用いて調製した。

TOF-MS:質量1182.34

GHアルブミン結合剤化合物の調製:
(実施例26)
1.アミノ基転移および酸化GH化合物(I)とアルブミン結合剤(II)との結合
以下の溶液を調製した。
緩衝液A:トリエタノールアミン(119mg、0.8mmol)を水(40ml)に溶解させ、pHを8.5に調製した。
緩衝液B:20mMトリエタノールアミン;0.2M NaCl。

(A)1,3-ジアミノ-2-プロパノールによるhGH(III)のアミノ基転移

以下の溶液を調製した。
粉末としてhGH(8.64g)を撹拌しながら緩衝液A(500ml)に溶解させた。この溶液に、緩衝液A(50ml)中のDAP(8.1g)の混合物を徐々に加えた。得られた混合物のpHを、水性HClを加えることにより8.5に調製した。TGase(2.8ml、1.3mg/ml)を、混合しながら加えた。最終混合物を室温で終夜撹拌した。

反応混合物を緩衝液A(1.2L)で希釈し、生成物(IV)を、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。100ml/分〜200ml/フラクション。ステップ緩衝液B40%-40〜100%勾配の緩衝液B、15CV超=225分

(B)アミノ基転移hGH(IV)の酸化

以下の溶液を調製した。
緩衝液A:トリエタノールアミン(119mg、0.8mmol)を水(40ml)に溶解させ、pHを8.5に調整した。
緩衝液B:3-メチルチオ-1-プロパノール(725mg、7.1mmol)を緩衝液A(10ml)に溶解させた。
緩衝液C:HEPES(5.96g)を水(1.0L)に溶解させ、pHを7.0に調整した。
ペリオデート:NaIO₄(48.1mg、0.225mmol)を水(1.0ml)に溶解させた。IV(10mg、0.5μmol)の溶液に緩衝液B(0.2ml)、次いでペリオデート溶液(0.03ml)を加えた。20分の冷インキュベーション後、混合物を緩衝液Cで4回透析した。残渣を1mlまで濃縮した。

(C)アルブミン結合剤(II)による(I)の還元的アミノ化

アルブミン結合剤(II)を、実施例1〜26に記載されているように得た。(B)からの最終溶液(1ml、10mg、0.45μmol(I))を、25mM HEPES緩衝液pH7.0中のアルブミン結合剤(II)溶液(2ml、10mg、0.3μmol)と混合し、得られた混合物を、室温で1時間ゆっくり回転させた。1時間後、NaCNBH₃(水(0.5ml)中のNaCNBH₃ (20mg)溶液100μL)を少量ずつ加えた。混合物を、室温で暗所に18〜24時間保存した。

混合物を、50mM、pH7.5の最終濃度まで1Mトリス溶液で希釈し、イオン交換カラムに施した。生成物(VI)を、NaCl勾配によるカラムの溶出により得た。

(実施例27)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例2からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.473,81

(実施例28)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例4からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.428

(実施例29)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例5からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.472,40

(実施例30)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例6からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量24.265,71

(実施例31)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例7からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.686,83

(実施例32)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例8からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量22.974,75

(実施例33)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例9からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.131,31

(実施例34)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例10からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.002

(実施例35)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例11からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.419,59

(実施例36)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例12からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.420,58

(実施例37)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例13からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量22.992,13

(実施例38)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例14からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.015,15

(実施例39)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例15からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.006,15

(実施例40)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例16からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.034,18

(実施例41)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例17からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.273,97

(実施例42)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例18からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.333

(実施例43)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例19からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.461,75

(実施例44)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例20からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.459,67

(実施例45)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例21からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.386,65

(実施例46)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例22からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量23.324,48

(実施例47)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例23からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量22.841

(実施例48)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例24からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:質量22.826.97

(実施例49)
上記の実施例26に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例25からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:反応時間=4.7時間、質量1268.7051

(実施例50)
1.アミノ基転移および酸化GH化合物(I)とアルブミン結合剤(II)との結合
以下の溶液を調製した。
緩衝液A:トリエタノールアミン(119mg、0.8mmol)を水(40ml)に溶解させ、pHを8.5に調整した。

(A)1,3-ジアミノ-2-プロパノールによるhGH(III)のアミノ基転移

アミノ基転移hGH GIn⁴⁰(IV)を、CIEクロマトグラフィー精製からの副生成物として、実施例26から得た。

(B)アミノ転位hGH GIn⁴⁰(IV)の酸化および還元アミノ化を、実施例26に記載されているように行った。

以下の溶液を調製した。

上記の実施例50に記載されているのと同様の方法で、以下の化合物を実施例6からのアルブミン結合剤を用いて調製した。

TOF-MS:反応時間=4.7時間、質量23.473,81

(実施例51)
1.N端末でのGH化合物(I)とアルブミン結合剤(II)との結合

(A)(I)とアルブミン結合剤アルデヒド(II)との還元アルキル化

アルブミン結合剤(II)を実施例3に記載されているように得た。

2-(C₂₀二酸-Trx-γGlu-Glu-OEG-OEG-Gly-グリシンアミド)-エチル-N^α1-hGH hGH(23mg)をHepes緩衝液(2.3ml、0.25mM、pH7.0)に溶解させた。C₂₀二酸-Trx-γGlu-Glu-OEG-OEG-Gly-Gly-ジメチルアセタール(2mg、上記実施例3参照)を、TFA(50μL)で6分間処理し、真空で蒸発乾燥させた。残基を、EtOH(200μL)でストリップし、真空で蒸発乾燥させた。残渣を、DMF(100μL)に溶解させ、hGH溶液を加えた。沈殿物を形成し、DMF(1ml)を加えることにより再溶解させた。1時間後、NaCNBH₃(20mg、0.5mlMeCN(230μL)中)溶液を少量ずつ加え、20時間放置した。反応物を、AcOH(2ml)を加えることにより失活させ、全量20mlまで水で希釈し、水中の0.1%TFAに対して、40〜80%のMeCN/0.1%TFAの勾配によるC18カラム上の調製HPLCで精製した。最終溶出ピークを集め、70%MeCNから10%まで水で希釈し、凍結乾燥させて、表題化合物4.51mgを得た。
TOF-MS:質量23.237,6

薬理学的方法
アッセイ(I)成長ホルモン活性を決定するためのBAF-3GHRアッセイ
BAF-3細胞(骨髄由来のマウスpro-Bリンパ細胞株)は、成長および生存のため元々はIL-3依存性であった。IL-3は、GHが刺激時に活性化する同じメディエーターであるJAK-2およびSTATを活性化させる。ヒト成長ホルモンレセプターの形質移入後、細胞株は、成長ホルモン依存性細胞株に変化した。このクローンを使用して、BAF-3GHRの生存に対する各種成長ホルモン試料の効果を評価することができる。

BAF-3GHR細胞を、飢餓培地(成長ホルモンを含まない培養培地)中で5%CO₂、37℃で24時間増殖させる。

細胞を洗浄し、飢餓培地に再懸濁し、プレートに播種する。10μlの成長ホルモン化合物もしくは異なる濃度のヒト成長ホルモンまたは対照を細胞に加え、プレートを、5%CO₂、37℃で68時間インキュベートする。

AlamarBlue(登録商標)を、各ウェルに加え、次いで細胞をさらに4時間インキュベートする。AlamarBlue(登録商標)は、酸化還元指示薬であり、細胞代謝固有の反応により還元され、したがって、生存細胞数の間接的測定値が得られる。

最終的に、細胞の代謝活性は、蛍光プレートリーダーで測定される。試料の吸光度は、成長ホルモン化合物または対照で刺激されない細胞の%で表され、濃度反応曲線から活性(細胞を50%刺激する化合物の量)を計算できる。

実施形態のリスト
実施形態1 タンパク質または糖タンパク質と非水溶性アルブミン結合剤とを、場合により置換されているシクロデキストリン分子の存在下で反応させるステップを含む、コンジュゲートタンパク質または糖タンパク質を調製する方法。

実施形態2 シクロデキストリン分子が、場合により置換されているβシクロデキストリンを含む、実施形態1に記載の方法。

実施形態3 場合により置換されているシクロデキストリンが、各々が、1つまたは複数のヒドロキシル基(例えば、ヒドロキシエチル-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-シクロデキストリン)で場合により置換されていてもよい、1つまたは複数のC_1〜6アルキル(例えば、メチル、エチルまたはプロピル)で場合により置換されているシクロデキストリンを含む、実施形態1または実施形態2に記載の方法。

実施形態4 場合により置換されているシクロデキストリンが、2-ヒドロキシエチル-β-シクロデキストリンを含む、実施形態3に記載の方法。

実施形態5 場合により置換されているシクロデキストリン分子が、1%〜10%(例えば、5%)の間の濃度で加えられる、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

実施形態6 水性緩衝液、例えば、Hepes緩衝液(例えば、50mM Hepes、100mM NaClおよび10mM CaCl₂)中での反応を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

実施形態7 一定のpH(例えば、pH7.0)および一定の温度(例えば、25℃)での反応を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

実施形態8 前記タンパク質コンジュゲートが、式(I)のタンパク質コンジュゲート
(A-W-B)_y-P (I)
(式中、
Pはタンパク質または糖タンパク質を表し、
Bは親水性スペーサーを表し、
WはAとBとを連結する化学基であり、
Aはアルブミン結合残基を表し、
yは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10から選択される整数を表す)
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ（ただし、前記A-W-B-部分は非水溶性部分を含む）である、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

実施形態9 前記タンパク質が20000Da超の分子量を有する、実施形態8に記載の方法。

実施形態10 前記タンパク質が、血液凝固因子、例えば、FVII、FX、FII、FV、タンパク質C、タンパク質S、tPA、PAI-1、組織因子、FXI、FXIIおよびFXIIIならびにそれらの連続するFVIII、FIX変異体を表す、実施形態8または実施形態9に記載の方法。

実施形態11 血液凝固因子が、FVII、例えば、FVIIaである、実施形態10に記載の方法。

実施形態12 前記タンパク質が、成長ホルモン(GH)を表す、実施形態8または実施形態9に記載の方法。

実施形態13 yが、1、2または3から選択される整数を表す、実施形態8〜12のいずれかに記載の方法。

実施形態14 yが、2、3、4、5または6から選択される整数を表す、実施形態8〜13のいずれかに記載の方法。

実施形態15 yが2を表す、実施形態14に記載の方法。

実施形態16 yが1を表す、実施形態8〜12のいずれかに記載の方法。

実施形態17 親水性スペーサーが、cLogP<0を有する、実施形態8〜16のいずれかに記載の方法。

実施形態18 親水性スペーサーが、次式
-X₁-X₂-X₃-X₄-
[式中、
X₁は-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-であり、
X₂は-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-であり、
X₃は-[(CHR⁵)_I5-W₆]_m7-であり、
X₄はF-D1-(CH₂)_I6-D2-であり、
I1、I2、I3、I4、I5およびI6は独立に0〜16から選択され、
m1、m3、m4、m6およびm7は独立に0〜10から選択され、
m2およびm5は独立に0〜25から選択され、
n1、n2、n3およびn4は独立に0〜16から選択され、
Fはアリール、ヘテロアリール、ピロリジン-2,5-ジオンcであり、アリール基およびヘテロアリール基はハロゲン、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHまたはC_1〜6アルキルで場合により置換されており、
R¹、R²、R³、R⁴およびR⁵は独立に水素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(=NH)-NH₂、C_1〜6アルキル、アリールまたはヘテロアリールから選択され、アルキル基、アリール基およびヘテロアリール基はハロゲン、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CNまたは-OHで場合により置換されており、
D1、D2、E1およびE2は独立に-O-、-NR⁶-、-N(COR⁷)-または原子価結合から選択され、R⁶およびR⁷は独立に水素またはC_1〜6アルキルを表し、
W₁〜W₆は独立に-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、OC(O)-または原子価結合から選択され、s2は0または1である]
を有する、実施形態8〜17のいずれかに記載の方法。

実施形態19 Wが、次式
-W₇-Y-
[式中、
Yは-(CH₂)_I7-C_3〜10-シクロアルキル-W₈-または原子価結合であり、
I7は0〜6であり、
W₇は-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH₂)_s3-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-または原子価結合から選択され、s3は0または1であり、
W₈は-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH₂)_s4-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-または原子価結合から選択され、s4は0または1である]
を有する、実施形態8〜18のいずれかに記載の方法。

実施形態20 I1、I2、I3、I4、I5およびI6が独立に0〜6を表す、実施形態18または19に記載の方法。

実施形態21 m1、m3、m4、m6およびm7が独立に0〜6を表す、実施形態18〜20のいずれかに記載の方法。

実施形態22 m2およびm5が独立に0〜10を表す、実施形態18〜21のいずれかに記載の方法。

実施形態23 n1、n2、n3およびn4が独立に0〜10、例えば、0〜6を表す、実施形態18〜22のいずれかに記載の方法。

実施形態24 D1およびD2が独立に-O-もしくは-NR⁶-または原子価結合から選択される、実施形態18〜23のいずれかに記載の方法。

実施形態25 D1およびD2がいずれも-O-である、実施形態18〜24のいずれかに記載の方法。

実施形態26 D1およびD2がいずれも-NR⁶-である、実施形態18〜25のいずれかに記載の方法。

実施形態27 E1およびE2が独立に-O-もしくは-NR⁶-または原子価結合から選択される、実施形態18〜26のいずれかに記載の方法。

実施形態28 E1およびE2がいずれも-O-である、実施形態18〜27のいずれかに記載の方法。

実施形態29 E1およびE2がいずれも-NR⁶-である、実施形態18〜27のいずれかに記載の方法。

実施形態30 W₁〜W₈は独立に-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-または原子価結合からなる群から選択される、実施形態18〜29のいずれかに記載の方法。

実施形態31 R¹、R²、R³、R⁴およびR⁵が独立に水素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH、またはC_1〜6アルキルから選択され、アルキル基が、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH、で場合により置換されている、実施形態18〜30のいずれかに記載の方法。

実施形態32 X₁が-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1O]_m2-[(CHR²)₁₂-W₃]_m3}_n2-であり、
X₂が-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3O]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-であり、-{[(CH₂)_n1O]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-および-{[(CH₂)_n3O]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-が、

から選択される、実施形態18〜31のいずれかに記載の方法。

実施形態33 親水性スペーサーが、

から選択される、実施形態8〜32のいずれかに記載の方法。

実施形態34 前記親水性スペーサーの分子量が、80D〜1500Dの範囲または500D〜1100Dの範囲である、実施形態8〜33のいずれかに記載の方法。

実施形態35 前記アルブミン結合残基が親油性残基である、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

実施形態36 前記アルブミン結合残基がアルブミンに非共有結合する、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

実施形態37 前記アルブミン結合残基が生理的pHで負に帯電する、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

実施形態38 前記アルブミン結合残基が、ヒト血清アルブミンに結合親和性を有し、それが約10μM未満または約1μM未満である、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

実施形態39 前記アルブミン結合残基が、直鎖アルキル基、分岐アルキル基、ωカルボン酸基またはωカルボン酸イソスターを有する基から選択される、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

実施形態40 前記アルブミン結合残基が、6〜40個の炭素原子、8〜26個の炭素原子または8〜20個の炭素原子を有する、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

実施形態41 前記アルブミン結合残基が、40個未満のアミノ酸残基を含むペプチドなどのペプチドである、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

実施形態42 アルブミン結合剤が、

(式中、*はWからBへの結合を示す)
から選択される、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

実施形態43 アルブミン結合残基Aが、親水性スペーサーBを介してタンパク質Pのグルタミン残基に結合する、実施形態8〜42のいずれかに記載の方法。

実施形態44 アルブミン結合残基Aが、親水性スペーサーBを介してタンパク質Pのシステイン残基に結合する、実施形態8〜42のいずれかに記載の方法。

実施形態45 アルブミン結合残基Aが、親水性スペーサーBを介してタンパク質PのN末端残基に結合する、実施形態8〜42のいずれかに記載の方法。

実施形態46 アルブミン結合残基Aが、親水性スペーサーBを介してタンパク質PのC末端残基に結合する、実施形態8〜42のいずれかに記載の方法。

実施形態47 アルブミン結合残基Aが、親水性スペーサーBを介してタンパク質Pのリシン残基に結合する、実施形態8〜42のいずれかに記載の方法。

実施形態48 アルブミン結合残基Aが、親水性スペーサーBを介して糖タンパク質Pの酸化グリカン残基に結合する、実施形態8〜42のいずれかに記載の方法。

実施形態49 前記コンジュゲートが、

から選択される、前記実施形態のいずれかに記載の方法。

実施形態50 前記実施形態のいずれかに記載の方法により得ることができるコンジュゲートタンパク質。

実施形態51 親水性スペーサーを介してアルブミン結合残基に連結したタンパク質もしくは糖タンパク質を含むタンパク質コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ。

実施形態52 式(I)のタンパク質コンジュゲート:
(A-W-B)_y-P (I)
(式中、
Pはタンパク質または糖タンパク質を表し、
Bは親水性スペーサーを表し、
WはAとBとを連結する化学基であり、
Aはアルブミン結合残基を表し、
yは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10から選択される整数を表す)
またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ。

実施形態53 前記タンパク質が、20000Da超の分子量を有する、実施形態51または実施形態52に記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態54 前記タンパク質が、血液凝固因子、例えば、FVII、FX、FII、FV、タンパク質C、タンパク質S、tPA、PAI-1、組織因子、FXI、FXIIおよびFXIIIならびにそれらの連続するFVIII、FIX変異体を表す、実施形態51〜53に記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態55 血液凝固因子が、FVII、例えば、FVIIaである、実施形態54に記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態56 前記タンパク質が成長ホルモン(GH)を表す、実施形態52または実施形態53に記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態57 yが、1、2または3から選択される整数を表す、実施形態52〜56のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態58 yが、2、3、4、5または6から選択される整数を表す、実施形態52〜57のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態59 yが2を表す、実施形態58に記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態60 yが1を表す、実施形態52〜57のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態61 親水性スペーサーがcLogP<0を有する、実施形態52〜60のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態62 親水性スペーサーが、次式
-X₁-X₂-X₃-X₄-
[式中、
X₁は-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-であり、
X₂は-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-であり、
X₃は-[(CHR⁵)_I5-W₆]_m7-であり、
X₄はF-D1-(CH₂)_I6-D2-であり、
I1、I2、I3、I4、I5およびI6は独立に0〜16から選択され、
m1、m3、m4、m6およびm7は独立に0〜10から選択され、
m2およびm5は独立に0〜25から選択され、
n1、n2、n3およびn4は独立に0〜16から選択され、
Fはアリール、ヘテロアリール、ピロリジン-2,5-ジオンcであり、アリール基およびヘテロアリール基はハロゲン、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHまたはC_1〜6アルキルで場合により置換されており、
R¹、R²、R³、R⁴およびR⁵は独立に水素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(=NH)-NH₂、C_1〜6-アルキル、アリールまたはヘテロアリールから選択され、アルキル基、アリール基およびヘテロアリール基はハロゲン、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CNまたは-OHで場合により置換されており、
D1、D2、E1およびE2は独立に-O-、-NR⁶-、-N(COR⁷)-または原子価結合から選択され、R⁶およびR⁷は独立に水素またはC_1〜6アルキルを表し、
W₁〜W₆は独立に-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、OC(O)-または原子価結合から選択され、s2は0または1である]
を有する、実施形態52〜61のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態63 Wが、次式
-W₇-Y-
[式中、
Yは-(CH₂)_I7-C_3〜10-シクロアルキル-W₈-または原子価結合であり、
I7は0〜6であり、
W₇は-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH₂)_s3-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-または原子価結合から選択され、s3は0または1であり、
W₈は-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH₂)_s4-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-または原子価結合から選択され、s4は0または1である]
を有する、実施形態52〜62のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態64 I1、I2、I3、I4、I5およびI6が独立に0〜6を表す、実施形態62または実施形態63に記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態65 m1、m3、m4、m6およびm7が独立に0〜6を表す、実施形態62〜64のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態66 m2およびm5が独立に0〜10を表す、実施形態62〜65のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態67 n1、n2、n3およびn4が独立に0〜10、例えば、0〜6を表す、実施形態62〜66のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態68 D1およびD2が独立に-O-もしくは-NR⁶-または原子価結合から選択される、実施形態62〜67のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態69 D1およびD2がいずれも-O-である、実施形態62〜68のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態70 D1およびD2がいずれも-NR⁶-である、実施形態62〜68のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態71 E1およびE2が独立に-O-もしくは-NR⁶-または原子価結合から選択される、実施形態62〜70のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態72 E1およびE2がいずれも-O-である、実施形態62〜71のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態73 E1およびE2がいずれも-NR⁶-である、実施形態62〜71のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態74 W₁〜W₈は独立に-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-または原子価結合からなる群から選択される、実施形態62〜73のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態75 R¹、R²、R³、R⁴およびR⁵が独立に水素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH、またはC_1〜6アルキルから選択され、アルキル基が、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH、で場合により置換されている、実施形態62〜74のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態76 X₁が-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1O]_m2-[(CHR²)₁₂-W₃]_m3}_n2-であり、
X₂が-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3O]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-であり、-{[(CH₂)_n1O]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-および-{[(CH₂)_n3O]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-が、

から選択される、実施形態62〜75のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態77 親水性スペーサーが、

から選択される、実施形態51〜76のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態78 前記親水性スペーサーの分子量が、80D〜1500Dの範囲または500D〜1100Dの範囲である、実施形態51〜77のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態79 前記アルブミン結合残基が親油性残基である、実施形態51〜78のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態80 前記アルブミン結合残基が、アルブミンに非共有結合する、実施形態51〜79のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態81 前記アルブミン結合残基が、生理的pHで負に帯電する、実施形態51〜80のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態82 前記アルブミン結合残基が、ヒト血清アルブミンに結合親和性を有し、それが約10μM未満または約1μM未満である、実施形態51〜81のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態83 前記アルブミン結合残基が、直鎖アルキル基、分岐アルキル基、ωカルボン酸基またはωカルボン酸イソスターを有する基から選択される、実施形態51〜82のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態84 前記アルブミン結合残基が、6〜40個の炭素原子、8〜26個の炭素原子または8〜20個の炭素原子を有する、実施形態51〜83のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態85 前記アルブミン結合残基が、40個未満のアミノ酸残基を含むペプチドなどのペプチドである、実施形態51〜84のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態86 アルブミン結合剤が、

(式中、*はWからBへの結合を示す)
から選択される、実施形態51〜85のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態87 アルブミン結合残基Aが、親水性スペーサーBを介してタンパク質Pのグルタミン残基に結合する、実施形態51〜86のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態88 アルブミン結合残基Aが、親水性スペーサーBを介してタンパク質Pのシステイン残基に結合する、実施形態51〜86のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態89 アルブミン結合残基Aが、親水性スペーサーBを介してタンパク質PのN末端残基に結合する、実施形態51〜86のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態90 アルブミン結合残基Aが、親水性スペーサーBを介してタンパク質PのC末端残基に結合する、実施形態51〜86のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態91 アルブミン結合残基Aが、親水性スペーサーBを介してタンパク質Pのリシン残基に結合する、実施形態51〜86のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態92 アルブミン結合残基Aが、親水性スペーサーBを介して糖タンパク質Pの酸化グリカン残基に結合する、実施形態51〜86のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態93 前記コンジュゲートが、

から選択される、実施形態51〜92のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態94 治療で使用するための実施形態50〜93のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲート。

実施形態95 薬学的に許容される添加剤と場合により組み合わせて、実施形態50〜93のいずれかに記載のタンパク質コンジュゲートを含む医薬組成物。

実施形態96 治療有効量の実施形態11に記載のコンジュゲート血液凝固因子を患者に投与することを含む、血友病の予防的治療方法。

実施形態97 血友病の予防的治療で使用するための実施形態11に記載のコンジュゲート血液凝固因子。

実施形態98 血友病の予防的治療のための薬剤の製造における実施形態11に記載のコンジュゲート血液凝固因子の使用。

実施形態99 血友病の予防的治療で使用するための実施形態11に記載のコンジュゲート血液凝固因子を含む医薬組成物。

実施形態100 実施形態11に記載のコンジュゲート血液凝固因子を含む医薬製剤。

本明細書で引用した刊行物、特許文献および特許出願を含むすべての参考文献は、特定の文献が本明細書に別途組み込まれているかどうかに関わらず、各参考文献が個別かつ具体的に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されるように、その全体および同程度(法律が許す最大の範囲)が参照により本明細書に組み込まれている。

本明細書において別段の指示がないか、または文脈により明らかに矛盾することがない限り、「1つ(aおよびan)」および「その(the)」の用語および本発明を示すという文脈において同様の指示対象の使用は、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。例えば、別段の指示がない限り、「化合物(the compound)」は、発明または詳細に記載されている態様の様々な「化合物(compounds)」を指すとして理解されるべきである。

別段の指示がない限り、本明細書に示されたすべての正確な値は、対応するおおよその値の代表値である(例えば、特定の因子または測定について提供されるすべての正確な例示的値は、適切な場合、「約」により修飾される対応するおおよその測定値も提供するとみなすことができる)。

要素に関連して「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」または「含有する(containing)」などの用語を使用する本発明の任意の態様または態様の本明細書における説明は、別段の指示がない限りまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、その特定の要素「からなる(consists of)」、「から本質的になる(consists essentially of)」または「実質的に含む(substantially comprises)」本発明の同様の態様または態様への支持を提供することが意図される(例えば、特定の要素を含むとして本明細書に記載されている組成物は、別段の指示がない限りまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、該要素からなる組成物も示すとして理解されるべきである)。

Claims

血液凝固因子と非水溶性アルブミン結合剤とを、置換されているもしくは置換されていないシクロデキストリン分子の存在下で反応させるステップを含む、コンジュゲート血液凝固因子を調製する方法であって、
前記反応させるステップが、水性緩衝液中で行われ、
前記コンジュゲート血液凝固因子が、式(I):
(A-W-B) _y -P (I)
(式中、
Pは血液凝固因子を表し、
Bは親水性スペーサーを表し、
WはAとBとを連結する化学基であり、
Aはアルブミン結合残基を表し、
yは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10から選択される整数を表す)
により表される、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ（ただし、前記A-W-B-部分は非水溶性部分を含む）である、
方法。
前記シクロデキストリン分子が2-ヒドロキシエチル-β-シクロデキストリンである、請求項1に記載の方法。
前記シクロデキストリン分子が、1%〜10%の間の濃度で加えられる、請求項1または2に記載の方法。
前記アルブミン結合剤が、オクタン-1-オール、クロロホルム、シクロヘキサンまたはプロピレングリコールジペラルゴネート(PGDP)のいずれかにおいて1を超えるclogPを有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
前記親水性スペーサーが、次式
-X₁-X₂-X₃-X₄-
[式中、
X₁は-W₁-[(CHR¹)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR²)_I2-W₃]_m3}_n2-であり、
X₂は-[(CHR³)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁴)_I4-W₅]_m6}_n4-であり、
X₃は-[(CHR⁵)_I5-W₆]_m7-であり、
X₄はF-D1-(CH₂)_I6-D2-であり、
I1、I2、I3、I4、I5およびI6は独立に0〜16から選択され、
m1、m3、m4、m6およびm7は独立に0〜10から選択され、
m2およびm5は独立に0〜25から選択され、
n1、n2、n3およびn4は独立に0〜16から選択され、
Fはアリールもしくはヘテロアリール基、ピロリジン-2,5-ジオン、あるいはハロゲン、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OHまたはC_1〜6アルキルで置換されているアリールもしくはヘテロアリール基であり、
R¹、R²、R³、R⁴およびR⁵は独立に水素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(=NH)-NH₂、C_1〜6アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基、ならびにハロゲン、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CNまたは-OHで置換されているC_1〜6アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基から選択され
D1、D2、E1およびE2は独立に-O-、-NR⁶-、-N(COR⁷)-または原子価結合から選択され、R⁶およびR⁷は独立に水素またはC_1〜6アルキルを表し、
W₁〜W₆は独立に-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-または原子価結合から選択され、s2は0または1である]
を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
前記親水性スペーサーが

から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
前記アルブミン結合残基が

(式中、*はWからBへの結合を示す)
から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。