JP2010538049A - 切断型glp−1誘導体及びその治療的使用 - Google Patents
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Abstract
Description
定義と特定の実施態様
本発明において、以下の用語は指定の意味を有する。即ち、「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語は、本明細書において、ペプチド結合で連結した、少なくとも5つの連続したアミノ酸からなる化合物を意味する。連続したアミノ酸は遺伝コードにコードされたアミノ酸の集団でも良く、そして、それらは遺伝子コードにコードされていない天然のアミノ酸及び合成アミノ酸でも良い。遺伝コードにコードされていない天然のアミノ酸には、例えば、γ−カルボキシグルタメート、オルニチン、ホスファセリン、D−アラニン、D−グルタミンがある。合成アミノ酸は化学合成で製造されたアミノ酸、即ち、D−アラニン、D−ロイシンのような、遺伝コードにコードされたアミノ酸のD−異性体、Aib(α−アミノイソブチル酸)、Abu(α−アミノブチル酸)、Tle(tert−ブチルグリシン)、β−アラニン、3−アミノメチル安息香酸、アントラニル酸を含む。
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Xaa18−Tyr−Leu−Glu−Glu−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Phe−Ile−Xaa30−Trp−Leu−Xaa33−Xaa34−Xaa35−R
式(I)(配列番号2)
上記式中、
Xaa7はL−ヒスチジン、D−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニン又は4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8はAla、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa9はGlu又はアルファ、アルファジメチル−GluのようなGlu誘導体であり;
Xaa16はVal又はLeuであり;
Xaa18はSer、Lys、Cys又はArgであり;
Xaa20はLeu、Lys又はCysであり;
Xaa23はGln、Glu、Lys、Cys又はArgであり;
Xaa24はAla又はAsnであり;
Xaa25はAla又はValであり;
Xaa27はGlu、Ala又はLeuであり;
Xaa30はAla、Glu、Lys、Arg又は存在せず;
Xaa31はTrp、Lys、Cys又は存在せず;
Xaa33はVal、Lys、Cys又は存在せず;
Xaa34はLys、Glu、Asn、Arg、Cys又は存在せず;
Xaa35はGly、Aib又は存在せず;
Rはアミド又は存在せず;
Xaa30、Xaa31、Xaa32、Xaa33、又はXaa34が存在しない場合、各々の下流のアミノ酸残基が存在しない、
GLP−1アナログ又はその誘導体に関する。
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Xaa18−Tyr−Leu−Glu−Glu−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Phe−Ile−Xaa30−Trp−Leu−Xaa33−Xaa34−Xaa35−R
式(II)(配列番号3)
上記式中、
Xaa7はL−ヒスチジン、D−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニン又は4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8はAla、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18はSer、Lys又はArgであり;
Xaa30はAla、Glu、Lys、Arg又は存在せず;
Xaa33はVal、Lys又は存在せず;
Xaa34はLys、Glu、Arg又は存在せず;
Xaa35はGly、Aib又は存在せず;
Rはアミド又は存在しない、
GLP−1アナログ又はその誘導体に関する。
−(CH2)lD[(CH2)nE]m(CH2)p−Qq−から選択される親水性リンカーであり、ここで、
l、m及びnは、独立して1から20であり、pは0から10であり、
Qは−Z−(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p−であり、
qは0から5の範囲の整数であり、
それぞれD、E及びGは独立して−O−、−NR3−、−N(COR4)−、−PR5(O)−、及び−P(OR6)(O)−であり、ここで、R3、R4、R5、及びR6は独立して、水素又はC1−6−アルキルを示し、
Zは−C(O)NH−、−C(O)NHCH2−、−OC(O)NH−、C(O)NHCH2CH2−、C(O)CH2−、C(O)CH=CH、(CH2)s−、−C(O)−、C(O)O−又はNHC(O)−から選択され、ここで、sは0又は1である。
ここで、l、m、n、及びpは独立に1から5であり、qは0から5である。
ここで、qは0から5である。
本発明の更に別の態様では、親水性リンカーは、−[CH2CH2O]m+1(CH2)pQq−であり、
ここでm及びpは独立して0から10であり、
Qは、上で定義されたように、−Z−(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p−である。
本発明の更に別の態様では、親水性リンカーは、
−(CH2)l−O−[(CH2)n−O]m−(CH2)p−[C(O)NH−(CH2)l−O−[(CH2)n−O]m−(CH2)p]q−であり、
ここで、l、m、n、及びpは独立して1から5であり、qは0から5である。
ここでA−は、
をからなる群から選択され、
ここで、nは14、15、16、17、18及び19からなる群から選択され、pは10、11、12、13及び14からなる群から選択され、dは0、1、2、3、4及び5からなる群から選択され、
−B−は、
からなる群から選択され、
ここで、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択され、yは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12からなる群から選択され、
−C−は、
,
からなる群から選択され、
ここで、b及びeは0、1及び2からなる群から各々独立に選択され、c及びfは0、1及び2からなる群から各々独立に選択され、但し、cが0の場合、bは1若しくは2であり、又は、cが1若しくは2の場合、bは0であり、及び、fが0の場合、eは1若しくは2であり、又は、fが1若しくは2の場合、eは0であり、
−D−は前記アミノ酸残基に結合し、リンカーである。
本発明の更なる態様では、誘導体化されたアミノ酸残基は1級アミノ基を側鎖に含む。1級アミノ基を含むアミノ酸残基の例は、リジン、オルニチン、O−アミノエチルセリン、O−アミノイソプロピルセリン又は、より長鎖の1級アミノ基を側鎖に含むOアルキル化セリンである。
本発明の更なる態様では、誘導体化されたアミノ酸残基はリジンである。本発明の更なる態様では、本発明に記載の誘導体は、1つの位置が唯一、誘導体化され、例えば、唯一のアミノ酸残基が誘導体化される。本発明の別の態様では、誘導体化されるアミノ酸残基は、システインである。
本発明の幾つかのGLP−1化合物は、実験の部に記載されるように合成され、試験された。
機能レセプターアッセイは、実施例21に記載されたように、インスリン分泌薬を用いた刺激に対する応答としてサイクリックAMP(cAMP)を測定することにより実施され得る。cAMP形成は好ましくはアルファスクリーン(商標)cAMPキット(Perkin Elmer Life Sciences)によって定量される。インキュベーションは96穴マイクロタイタープレートの半領域で、総量50μlのバッファー3中(50mMのTris−HCI、5mMのHEPES、10mMのMgCl2、pH7.4)で、次の添加物と共に実施され得る。:1mMのATP、1μMのGTP、0.5mMの3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX)、0.01%のTween−20、0.1%のBSA、6μgの膜調製、15μg/mLのアクセプタービーズ、6nMビオチニル−cAMPと共に事前インキュベートした20μg/mLのドナービーズ。作動活性の試験に用いられるアナログ又は誘導体は好ましくはバッファー3に溶解し希釈する。GTPは実験毎に新しく調製される。プレートは暗所で、3時間ゆっくり攪拌しながら室温でインキュベーションし、次いで、Fusion instrument(パーキンエルマー・ライフサイエンス)中でカウントした。濃度−応答曲線は、それぞれのアナログ又は誘導体及び予想されたEC50値に対し、Prismバージョン4.0又は5.0(GraphPad、Carlsbad、CA)の4パラメータロジスティックモデルを用いることによりプロットした。
0.1Mのトリエチルアミン-HClバッファー100μL、pH7.4において、ペプチドのアリコート(5nmol)を、5mU酵素活性に相当する1μLの精製されたジペプチジルアミノペプチダーゼIVと共に、37℃で10−180分インキュベートする。10%のトリフルオロ酢酸5μLを添加することにより、酵素反応を終結させ、ペプチド分解産物を分離し、HPLC分析を使用して定量する。この分析を実施するための一方法は次の通りである:Siegelら、「Regul.Pept」、1999年、79巻、p93−103及びMentleinら、「Eur.J.Biochem.」、1993年、214巻、p829−35に従って、混合物をVydac C18ワイドポア(30nm細孔、5μmの粒子)250×4.6mmのカラムに加え、0.1%のトリフルオロ酢酸に線形段階的勾配をつけてアセトニトリルが入ったもの(3分間は0%のアセトニトリル、17分間は0−24%のアセトニトリル、1分間は24−48%のアセトニトリル)を、1ml/分の流量で溶離させる。ペプチドとその分解産物は、220nm(ペプチド結合)又は280nm(芳香族アミノ酸)の吸光度をモニターし得、標準体に対するそれらのピーク領域を積分することにより定量する。ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによるペプチドの加水分解速度はインキュベーション時間で推定され、加水分解されるペプチドの10%未満になる。
その代わりに、ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによる分解に対するペプチドの耐性は、次の分解アッセイにより測定される:
0.085Mのトリス−HClバッファー40μL、pH8.0において、ペプチドのアリコート(4nmol)を、1.6%のヒト血漿アルブミンの存在下又は非存在下、10.9mUの精製されたジペプチジルアミノペプチダーゼIVと共に、37℃で22時間インキュベートする。0、4、及び22時間後に10μlのサンプルを回収し、1%のトリフルオロ酢酸100μLを混合することにより、酵素反応を終結させる。ペプチド分解産物を分離し、HPLC解析を用いて定量する。この解析を実施する一方法は次の通りである:混合物をAgilent Zorbax 300SB−C18(5μm粒子)150×2.1mmのカラムに加え、0.1%のトリフルオロ酢酸から0.07%TFAを含む100%のアセトニトリルへの30分間の線形段階的勾配で、0.5ml/分の流量で溶離させる。ペプチド及びその分解産物は、214nmの吸光度をモニターし、それらのピーク領域を積分することにより定量する。ジペプチジルアミノペプチダーゼIVに対するペプチドの安定性は、無傷ペプチドと、切断後の2つのアミノ末端のアミノ酸を失った分解産物のピーク領域の合計に対する無傷ペプチドのピーク領域として決定される。
アルブミン結合アッセイ:
GLP−1アナログ又はその誘導体のヒト血漿アルブミン(HSA)に対する親和性は、競合シンチレーション近接アッセイ(SPA)により測定した。ストレプトアビジン−SPAビーズ(GE Healthcare RPNQ0009)をビオチン化したHSAと共に5時間インキュベートする。結合していないHSAを除くために、ビーズをバッファーで洗浄する。ビーズを125Iで標識化した、N−イプシロン26−[2−(2−{2−[2−(2−{2−[(S)−4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8、125I−Tyr19、Arg34]GLP−1(7−37)又はN−イプシロン37−[2−(2−[2−((S)−4−((S)−4−(12−[4−(16−(1H−テトラゾール−5−yl)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ)−4−カルボキシブチリルアミノ)−4−カルボキシブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8、125I−Tyr19、Glu22、Arg26、34、Lys37]GLP−1(7−37)−NH2のようなアシル化GLP−1アナログと、100mMのHepes、100mMのNaCl、10mMのMgSO4、0.025%のTween−20、pH7.4を含むバッファー中で混合する。混合物はパーキンエルマー・オプティプレート−96、6005290(100μl/ウェル)のウェルにピペットで入れ、同じバッファー中に100μlの測定するGLP−1アナログ又は誘導体の一連の希釈液を添加する。室温で20時間緩やかに振揺させた後、プレートを遠心しトップカウンターでカウントした。結合cpmはGLP−1アナログ又は誘導体の濃度の関数としてプロットし、競合曲線のEC50値はHSAに対するアナログ又は誘導体の親和性の測定に使用される。
一態様では、修飾GLP−1配列と、一又はそれ以上のアルブミン結合残基の間の親水性リンカーを含むGLP−1アナログ又はその誘導体に関する。
[Glu22、Arg26]GLP−1(7−33)アミド、
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、Glu30、Lys33)GLP−1(7−33)アミド、
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Arg26、Glu30)GLP−1(7−33)アミド、
[Glu22、Val25、Arg26]GLP−1(7−33)アミド、
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Arg26、Glu30)GLP−1(7−33)アミド、
[Glu22、Arg26]GLP−1(7−33)ペプチド、
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−[Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Glu30]GLP−1(7−33)アミド、及び
[Glu22、Val25、Arg26]GLP−1(7−32)アミド
からなる群から選択される。
本発明の他の目的は、0.1mg/mlから25mg/mlの濃度で存在している本発明に記載のアナログ又は誘導体を含有する医薬製剤を提供することであり、該製剤は3.0から9.0のpHを有する。製剤は、緩衝系、保存料(類)、等張化剤(類)、キレート剤(類)、安定剤及び界面活性剤を更に含有しうる。
本発明の更なる実施態様では、製剤は安定剤を更に含有する。医薬組成物に安定剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995が参照される。
本発明の組成物は、本発明に記載のアナログ又は誘導体の安定性を更に高め、生物学的利用能を増加させ、溶解度を高め、副作用を低減させ、当業者によく知られている時間療法を達成し、また患者のコンプライアンスを高め、又はそれらの任意の組合せのために、例えば共有的、疎水的及び静電気的相互作用を介して、医薬担体、医薬デリバリー系及び先端医薬デリバリー系に更に配合され、又は結合され得る。担体、医薬デリバリー系及び先進医薬デリバリー系の例には、限定されるものではないが、ポリマー、例えばセルロース及び誘導体、多糖類、例えばデキストラン及び誘導体、デンプン及び誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリレート及びメタクリレートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸及びそれらのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えばサーモゲル化系、例えば当業者によく知られているブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフィア、ナノ粒子、液晶及びそれらの分散液、脂質-水系における相挙動の当業者によく知られているL2相とそのディスパージョン、ポリマーミセル、多相エマルション、自己乳化、自己-マイクロ乳化、シクロデキストリン及びその誘導体、及びデンドリマーが含まれる。
更なる実施態様では、製剤は、10μm、好ましくは1−5μm、最も好ましくは1−3μm未満のエアゾール粒子のMMADを達成するために、任意の既知のエアゾール化技術、例えばネブライゼーションによりエアゾール化することができる。好ましい粒子径は、肺の奥深くまで医薬を送達せしめるのに最も効果的なサイズに基づいており、タンパク質が最適に吸収されるようになされる(例えば、Edwards DA、Ben−Jebria A、Langer A、Recent advances in pulmonary drug delivery using large、porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379−385を参照)。
配列に依存して、本発明のアナログは、ポリペプチドをコードするDNA配列を含み、ペプチドの発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中でポリペプチドを発現することができる宿主細胞を培養し、その後、得られたペプチドを培地から回収することを含む方法により生産することができる。
本発明のペプチドをコードするDNA配列、プロモータ及び場合によってはターミネーター及び/又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクター中にそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者にはよく知られている(例えば、上掲のSambrookらを参照)。
b)配列番号1の位置26と同じ位置にArg残基とを含む
i)配列番号1の配列7から35と比較して、総数で2、3、4、5、6、7、又は8つのアミノ酸置換を有し、
ii)所望により、配列番号1の位置30、31、32、33、34、又は35と同じ位置のアミノ酸が存在しなくても良く、但し、位置30、31、32、33又は34のアミノ酸が存在しない場合、各々の下流のアミノ酸残基も存在しなくても良く、
iii)所望により、C末端アミド基を有する、
修飾GLP−1配列(配列番号1)を含む、GLP−1アナログ又はその誘導体。
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Xaa18−Tyr−Leu−Glu−Glu−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Phe−Ile−Xaa30−Trp−Leu−Xaa33−Xaa34−Xaa35−R
式(I)(配列番号2)
{上式中、
Xaa7はL−ヒスチジン、D−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニン又は4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8はAla、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa9はGlu又はアルファ、アルファジメチル−GluのようなGlu誘導体であり;
Xaa16はVal又はLeuであり;
Xaa18はSer、Lys、Cys又はArgであり;
Xaa20はLeu、Lys又はCysであり;
Xaa23はGln、Glu、Lys、Cys又はArgであり;
Xaa24はAla又はAsnであり;
Xaa25はAla又はValであり;
Xaa27はGlu、Ala又はLeuであり;
Xaa30はAla、Glu、Lys、Argであるか又は存在せず;
Xaa31はTrp、Lys、Cysであるか又は存在せず;
Xaa33はVal、Lys、Cysであるか又は存在せず;
Xaa34はLys、Glu、Asn、Arg、Cysであるか又は存在せず;
Xaa35はGly、Aibであるか又は存在せず;
Rはアミドであるか又は存在せず;
但し、Xaa30、Xaa31、Xaa32、Xaa33、又はXaa34が存在しない場合、各々の下流のアミノ酸残基が存在しない}
の配列を有する、実施態様1から9の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Xaa18−Tyr−Leu−Glu−Glu−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Phe−Ile−Xaa30−Trp−Leu−Xaa33−Xaa34−Xaa35−R
式(II)(配列番号3)
{上式中、
Xaa7はL−ヒスチジン、D−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニン又は4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8はAla、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18はSer、Lys又はArgであり;
Xaa30はAla、Glu、Lys、Argであるか又は存在せず;
Xaa33はVal、Lysであるか又は存在せず;
Xaa34はLys、Glu、Argであるか又は存在せず;
Xaa35はGly、Aibであるか又は存在せず;
Rはアミドであるか又は存在しない}
の配列を有する、実施態様1から9の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
A−B−C−D−
{A−は、
からなる群から選択され、
ここで、nは14、15、16、17、18及び19からなる群から選択され、pは10、11、12、13及び14からなる群から選択され、dは0、1、2、3、4及び5からからなる群から選択され、
−B−は、
からなる群から選択され、
ここで、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択され、yは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12からなる群から選択され、
−C−は、
からなる群から選択され、
ここで、b及びeは0、1及び2からなる群から各々独立に選択され、c及びfは0、1及び2からなる群から各々独立に選択され、但し、cが0の場合、bは1若しくは2であり、又は、cが1若しくは2の場合、bは0であり、及び、fが0の場合、eは1若しくは2であり、又は、fが1若しくは2の場合、eは0であり、
−D−は前記アミノ酸残基に結合し、リンカーである}
で誘導体化された、実施態様1から11の何れか一に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
なる群から選択され、
ここで、kは0、1、2、3、4、5、11及び27からなる群から選択され、mは0、1、2、3、4、5及び6から選択される、
実施態様12に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
a)GLP−1(7−35)の位置22(配列番号1の位置16)と同じ位置にGlu残基と
b)GLP−1(7−35)の位置26(配列番号1の位置20)と同じ位置にArg残基とを含む
i)配列番号1の配列7から35と比較して、総数で2、3、4、5、6、7又は8つのアミノ酸置換を有し、
ii)所望により、GLP−1(7−35)の位置30、31、32、33、34、又は35(それぞれ配列番号1の位置24、25、26、27、28、又は29)と同じ位置のアミノ酸が存在しなくても良く、但し、GLP−1(7−35)の位置30、31、32、33又は34(それぞれ配列番号1の位置24、25、26、27、又は28)のアミノ酸が存在しない場合、各々の下流のアミノ酸残基も存在しなくても良く、
iv)所望により、C末端アミド基を有する、
修飾GLP−1配列(配列番号1)を含む、GLP−1アナログ又はその誘導体も提供する。
b)配列番号1の位置26と同じ位置にArg残基とを含む
i)配列番号1の配列7から35と比較して、総数で2、3、4、5、6、7、又は8つのアミノ酸置換を有し、
ii)所望により、配列番号1の位置30、31、32、33、34、又は35と同じ位置のアミノ酸が存在しなくても良く、但し、位置30、31、32、33又は34のアミノ酸が存在しない場合、各々の下流のアミノ酸残基も存在しなくても良く、
iii)所望により、C末端アミド基を有する、
修飾GLP−1配列(配列番号1)を含む、GLP−1アナログ又はその誘導体。
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Xaa18−Tyr−Leu−Glu−Glu−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Phe−Ile−Xaa30−Trp−Leu−Xaa33−Xaa34−Xaa35−R
式(I)(配列番号2)
{上式中、
Xaa7はL−ヒスチジン、D−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニン又は4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8はAla、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa9はGlu又はアルファ、アルファジメチル−GluのようなGlu誘導体であり;
Xaa16はVal又はLeuであり;
Xaa18はSer、Lys、Cys又はArgであり;
Xaa20はLeu、Lys又はCysであり;
Xaa23はGln、Glu、Lys、Cys又はArgであり;
Xaa24はAla又はAsnであり;
Xaa25はAla又はValであり;
Xaa27はGlu、Ala又はLeuであり;
Xaa30はAla、Glu、Lys、Argであるか又は存在せず;
Xaa31はTrp、Lys、Cysであるか又は存在せず;
Xaa33はVal、Lys、Cysであるか又は存在せず;
Xaa34はLys、Glu、Asn、Arg、Cysであるか又は存在せず;
Xaa35はGly、Aibであるか又は存在せず;
Rはアミドであるか又は存在せず;
但し、Xaa30、Xaa31、Xaa32、Xaa33、又はXaa34が存在しない場合、各々の下流のアミノ酸残基が存在しない}
の配列を有する、実施態様1から9の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Xaa18−Tyr−Leu−Glu−Glu−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Phe−Ile−Xaa30−Trp−Leu−Xaa33−Xaa34−Xaa35−R
式(II)(配列番号3)
{上式中、
Xaa7はL−ヒスチジン、D−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニン又は4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8はAla、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18はSer、Lys又はArgであり;
Xaa30はAla、Glu、Lys、Argであるか又は存在せず;
Xaa33はVal、Lysであるか又は存在せず;
Xaa34はLys、Glu、Argであるか又は存在せず;
Xaa35はGly、Aibであるか又は存在せず;
Rはアミドであるか又は存在しない}
の配列を有する、実施態様1から9の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
A−B−C−D−
{A−は、
からなる群から選択され、
ここで、nは14、15、16、17、18及び19からなる群から選択され、pは10、11、12、13及び14からなる群から選択され、dは0、1、2、3、4及び5からからなる群から選択され、
−B−は、
からなる群から選択され、
ここで、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択され、yは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12からなる群から選択され、
−C−は、
からなる群から選択され、
ここで、b及びeは0、1及び2からなる群から各々独立に選択され、c及びfは0、1及び2からなる群から各々独立に選択され、但し、cが0の場合、bは1若しくは2であり、又は、cが1若しくは2の場合、bは0であり、及び、fが0の場合、eは1若しくは2であり、又は、fが1若しくは2の場合、eは0であり、
−D−は前記アミノ酸残基に結合し、リンカーである}
で誘導体化された、実施態様1から11の何れか一に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
なる群から選択され、
ここで、kは0、1、2、3、4、5、11及び27からなる群から選択され、mは0、1、2、3、4、5及び6から選択される、
実施態様12に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
b)GLP−1(7−35)の位置26と同じ位置にArg残基とを含む
i)GLP−1(7−35)と比較して、総数で2、3、4、5、6、7、8又は9つのアミノ酸置換を有する、修飾GLP−1(7−35)(配列番号1)であるGLP−1アナログ又はその誘導体。
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Xaa18−Tyr−Leu−Glu−Glu−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Phe−Ile−Xaa30−Trp−Leu−Xaa33−Xaa34−Xaa35−R
式(I)(配列番号2)
{上式中、
Xaa7はL−ヒスチジン、D−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニン又は4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8はAla、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa9はGlu又はアルファ、アルファジメチル−GluのようなGlu誘導体であり;
Xaa16はVal又はLeuであり;
Xaa18はSer、Lys、Cys又はArgであり;
Xaa20はLeu、Lys又はCysであり;
Xaa23はGln、Glu、Lys、Cys又はArgであり;
Xaa24はAla又はAsnであり;
Xaa25はAla又はValであり;
Xaa27はGlu、Ala又はLeuであり;
Xaa30はAla、Glu、Lys、Argであるか又は存在せず;
Xaa31はTrp、Lys、Cysであるか又は存在せず;
Xaa33はVal、Lys、Cysであるか又は存在せず;
Xaa34はLys、Glu、Asn、Arg、Cysであるか又は存在せず;
Xaa35はGly、Aibであるか又は存在せず;
Rはアミドであるか又は存在せず;
但し、Xaa30、Xaa31、Xaa32、Xaa33、又はXaa34が存在しない場合、各々の下流のアミノ酸残基が存在しない}
の配列を有する、実施態様1から10の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Xaa18−Tyr−Leu−Glu−Glu−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Phe−Ile−Xaa30−Trp−Leu−Xaa33−Xaa34−Xaa35−R
式(II)(配列番号3)
{上式中、
Xaa7はL−ヒスチジン、D−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニン又は4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8はAla、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18はSer、Lys又はArgであり;
Xaa30はAla、Glu、Lys、Argであるか又は存在せず;
Xaa33はVal、Lysであるか又は存在せず;
Xaa34はLys、Glu、Argであるか又は存在せず;
Xaa35はGly、Aibであるか又は存在せず;
Rはアミドであるか又は存在しない}
の配列を有する、実施態様1から10の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
A−B−C−D−
{A−は、
からなる群から選択され、
ここで、nは14、15、16、17、18及び19からなる群から選択され、pは10、11、12、13及び14からなる群から選択され、dは0、1、2、3、4及び5からからなる群から選択され、
−B−は、
からなる群から選択され、
ここで、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択され、yは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12からなる群から選択され、
−C−は、
からなる群から選択され、
ここで、b及びeは0、1及び2からなる群から各々独立に選択され、c及びfは0、1及び2からなる群から各々独立に選択され、但し、cが0の場合、bは1若しくは2であり、又は、cが1若しくは2の場合、bは0であり、及び、fが0の場合、eは1若しくは2であり、又は、fが1若しくは2の場合、eは0であり、
−D−は前記アミノ酸残基に結合し、リンカーである}
で誘導体化された、実施態様1から12の何れか一に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
なる群から選択され、
ここで、kは0、1、2、3、4、5、11及び27からなる群から選択され、mは0、1、2、3、4、5及び6から選択される、
実施態様13に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、Glu30、Lys33)GLP−1(7−33)アミド;
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Arg26、Glu30)GLP−1(7−33)アミド;
[Glu22、Val25、Arg26]GLP−1(7−33)アミド;
[Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Glu30]GLP−1(7−33)アミド;
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−[Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Glu30]GLP−1(7−33)アミド;
[Glu22、Arg26]GLP−1(7−33)ペプチド;
[Glu22、Val25、Arg26]GLP−1(7−32)アミド;
N−イプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Arg26)GLP−1(7−33)アミド;
N−イプシロン31{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Glu22、Val25、Arg26、Lys31)GLP−1(7−33)アミド;
N−イプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(デスアミノHis7、Lys20、Glu22、Arg26)GLP−1(7−33)アミド;
N−イプシロン31{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(デスアミノHis7、Glu22、Arg26、Lys31)GLP−1(7−33)アミド;
N−イプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、Glu30、Lys31)GLP−1(7−32)アミド;
N−イプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、Nle30、Lys31)GLP−1(7−32)アミド;
N−イプシロン31−[2−(2−{2−[2−(2−{2−[(S)−4−カルボキシ−4−({トランス−4−[(19−カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]−[Aib8、Glu22、Val25、Arg26、Lys31]GLP−1−(7−33)アミド;
[デスアミノHis7、Glu22、Arg26]−GLP−1(7−34);
[Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、Lys31]GLP−1(7−32)アミド;
N−イプシロン31−[2−(2−{2−[2−(2−{2−[(S)−4−カルボキシ−4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7、Asp11、Glu18、Glu22、Val25、Arg26、Asp27、Glu30、Lys31]GLP−1(7−33)アミド;
[Aib8、Glu22、Val25、Lys31]GLP−1(7−33)−アミド;
N−イプシロン31−{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}
エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−N−ベータ34−(2−(ビス−カルボキシメチルアミノ)アセチル)[Aib8、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、Dap34]GLP−1(7−34)アミド、
から選択される、実施態様1から14の何れか一に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
配列番号1の位置26と同じ位置にArg残基とを含む、
配列番号1の配列7から35と比較して、総数で2、3、4、5、6、7、又は8つのアミノ酸置換を有し、
所望により、配列番号1の位置30、31、32、33、34、又は35と同じ位置のアミノ酸が存在しなくても良く、但し、位置30、31、32、33又は34のアミノ酸が存在しない場合、各々の下流のアミノ酸残基も存在しなくても良く、
所望により、C末端アミド基を有する、
修飾GLP−1配列(配列番号1)を含む、GLP−1アナログ又はその誘導体。
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Xaa18−Tyr−Leu−Glu−Glu−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Phe−Ile−Xaa30−Trp−Leu−Xaa33−Xaa34−Xaa35−R
式(I)(配列番号2)
{上式中、
Xaa7はL−ヒスチジン、D−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニン又は4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8はAla、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa9はGlu又はアルファ、アルファジメチル−GluのようなGlu誘導体であり;
Xaa16はVal又はLeuであり;
Xaa18はSer、Lys、Cys又はArgであり;
Xaa20はLeu、Lys又はCysであり;
Xaa23はGln、Glu、Lys、Cys又はArgであり;
Xaa24はAla又はAsnであり;
Xaa25はAla又はValであり;
Xaa27はGlu、Ala又はLeuであり;
Xaa30はAla、Glu、Lys、Argであるか又は存在せず;
Xaa31はTrp、Lys、Cysであるか又は存在せず;
Xaa33はVal、Lys、Cysであるか又は存在せず;
Xaa34はLys、Glu、Asn、Arg、Cysであるか又は存在せず;
Xaa35はGly、Aibであるか又は存在せず;
Rはアミドであるか又は存在せず;
但し、Xaa30、Xaa31、Xaa32、Xaa33、又はXaa34が存在しない場合、各々の下流のアミノ酸残基が存在しない}
の配列を有する、実施態様1から29の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Xaa18−Tyr−Leu−Glu−Glu−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Phe−Ile−Xaa30−Trp−Leu−Xaa33−Xaa34−Xaa35−R
式(II)(配列番号3)
{上式中、
Xaa7はL−ヒスチジン、D−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニン又は4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8はAla、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18はSer、Lys又はArgであり;
Xaa30はAla、Glu、Lys、Argであるか又は存在せず;
Xaa33はVal、Lysであるか又は存在せず;
Xaa34はLys、Glu、Argであるか又は存在せず;
Xaa35はGly、Aibであるか又は存在せず;
Rはアミドであるか又は存在しない}
の配列を有する、実施態様1から29の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
A−B−C−D−
{A−は、
からなる群から選択され、
ここで、nは14、15、16 17、18及び19からなる群から選択され、pは10、11、12、13及び14からなる群から選択され、dは0、1、2、3、4及び5からからなる群から選択され、
−B−は、
からなる群から選択され、
ここで、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択され、yは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12からなる群から選択され、
−C−は、
からなる群から選択され、
ここで、b及びeは0、1及び2からなる群から各々独立に選択され、c及びfは0、1及び2からなる群から各々独立に選択され、但し、cが0の場合、bは1若しくは2であり、又は、cが1若しくは2の場合、bは0であり、及び、fが0の場合、eは1若しくは2であり、又は、fが1若しくは2の場合、eは0であり、
−D−は前記アミノ酸残基に結合し、リンカーである}
で誘導体化された、実施態様1から62の何れか一に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
なる群から選択され、
ここで、kは0、1、2、3、4、5、11及び27からなる群から選択され、mは0、1、2、3、4、5及び6から選択される、
実施態様63から86の何れか一に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、Glu30、Lys33)GLP−1(7−33)アミド、
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Arg26、Glu30)GLP−1(7−33)アミド、
[Glu22、Val25、Arg26]GLP−1(7−33)アミド、
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Arg26、Glu30)GLP−1(7−33)アミド、
[Glu22、Arg26]GLP−1(7−33)ペプチド、
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−[Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Glu30]GLP−1(7−33)アミド、及び
[Glu22、Val25、Arg26]GLP−1(7−32)アミド、
からなる群から選択される、上記実施態様の何れかに記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
r.t: 室温
DIPEA: ジイソプロピルアミン
H2O: 水
CH3CN: アセトニトリル
DMF: N、Nジメチルホルムアミド
HBTU: 2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル−)−1、1、3、3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
Fmoc: 9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニル
Boc: tertブチルオキシカルボニル
OtBu: tertブチルエステル
tBu: tertブチル
Trt: トリフェニルメチル
Pmc: 2、2、5、7−ペンタメチル−クロマン−6−スルフォニル
Dde: 1−(4、4−ジメチル−2、6−ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
ivDde: 1−(4、4−ジメチル−2、6−ジオキソシクロヘキシリデン)−3−メチルブチル
Mtt: 4−メチルトリチル
Mmt: 4−メトキシトリチル
DCM: ジクロロメタン
TIS: トリイソプロピルシラン
TFA: トリフルオロ酢酸
Et2O: ジエチルエーテル
NMP: 1−メチル−ピロリジン−2−オン
DIPEA: ジイソプロピルエチルアミン
HOAt: 1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール
HOBt: 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIC: ジイソプロピルカルボジイミド
DBU: 1、8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデセン−7
MW: 分子量
SPPS法A
HBTU(2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル−)−1、1、3、3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)又はHATU(O−(7−アザベンゾトリアソール−1−イル)−1、3、3、3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート)を介したNMP(N−メチルピロリジン)中でのカップリング、及びFmoc保護基の除去のUVモニターを用いた製造元提供のFastMocUVプロトコルを用いた、0.25mmol又は1.0mmolスケールのアプライドバイオシステムズ433ペプチド合成機において、Fmoc法に従って保護されたペプチジル樹脂を合成した。ペプチドアミドの合成に用いた開始樹脂はRink−amide樹脂であり、Wang又はクロロトリチル樹脂をカルボキシC末端のペプチドとして用いた。用いた保護されたアミノ酸誘導体は、Fmoc−Aib−OH(Fmoc−アミノイソブチル酸)のような非天然のアミノ酸を除いて、ABI433A合成機に適合するように事前計量されたカートリッジで提供される標準的なFmoc−アミノ酸(例えば、Anaspec、又はNovabiochemから提供される)であった。N末端アミノ酸はアルファアミノ基がBoc保護された(例えば、Boc−His(Boc)OHはN末端をヒスチジンのペプチドに用いた)。位置26のリジンのイプシロンアミノ基は、アルブミン結合部位とスペーサーの連結のための経路に依存して、Mtt、Mmt、Dde、ivDde、又はBoc、の何れかで保護した。ペプチド合成は、幾つかの場合において、限定されるものではないが、2−Fmoc−オキシ−4−メトキシベンジル又は2、4、6−トリメトキシベンジルのような酸性条件下で開裂し得る基で、ジペプチドアミド結合が保護されたジペプチドを使用することにより改善し得る。セリン又はスレオニンがペプチド中に存在する場合、シュードプロリンジペプチドを使用しても良い。(例えば、Novobiochem 2002/2003のカタログ又は新版、又は「J.Pep.Sci.」、5巻、p.403を参照されたい。
ペプチド合成の別の方法は、マイクロ波ベースのLibertyペプチド合成機(CEM Corp.、North Carolina)でのFmoc化学によった。樹脂はTentagel S RAMで0.24mmol/gの負荷であった。カップリング化学はNMP中0.3Mのアミノ酸溶液と8−10倍のモル過剰を用いるNMP中のDIC/HOAtであった。カップリング条件は70℃までで5分であった。脱保護は、70℃まででNMP中の5%ピペリジンを用いた。リジン側鎖の化学修飾が望ましい場合、リジンをLys(mtt)として導入した。Mtt基を、適切なヘキサフルオロイソプロパノール中に20分間樹脂を懸濁させることにより除き、ついでDCM及びNMPで洗浄した。リジンの化学修飾をマニュアル合成によるか又はLibertyでの一又は複数の自動化工程とその後のマニュアルカップリングによって実施した。ペプチド合成の他の方法は、HBTUカップリングを伴うABI433でのFmoc化学を用いるものであった。合成後、樹脂をDCMで洗浄し、乾燥させ、ペプチドをTFA/TIS/水(92.5/5/2.5)での2時間の処理によって樹脂から切断し、ジエチルエーテルで沈殿させた。ペプチドを30%酢酸又は類似の溶媒に再溶解させ、アセトニトリル/TFAを使用してC18カラムでの標準的RP−HPLCによって精製した。ペプチドの同一性はMALDI−MSによって確認した。
DIC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)及びHOBt(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール)を介したNMP(N−メチルピロリジン)中でのカップリングを用いた製造元提供のプロトコルを用いた、0.25mmolスケールのアドバンストケムテック合成機(APEX348)において、保護されたペプチジル樹脂をFmoc法に従って合成した。ペプチドアミドの合成に用いられる開始樹脂はRink−amide樹脂であり、Wang又はクロロトリチル樹脂をカルボキシC末端のペプチドとして用いた。用いた保護されたアミノ酸誘導体は、標準的なFmoc−アミノ酸(例えば、Anaspec、又はNovabiochemから提供される)であった。N末端アミノ酸はアルファアミノ基がBoc保護された(例えば、Boc−His(Boc)OHはN末端がヒスチジンのペプチドに用いられる)。位置26のリジンのイプシロンアミノ基は、アルブミン結合部位とスペーサーの連結のための経路に依存して、Mtt、Mmt、Dde、ivDde、又はBoc、の何れかで保護した。ペプチド合成は、幾つかの場合において、例えば、Novabiochemのシュードプロリン、Fmoc−Ser(tbu)−Ser(Me、Me)−OHのようなジペプチドを使用することにより改善し得る。例えば、Novobiochem 2002/2003のカタログ又は新版、又は「J.Pep.Sci.」、5巻、p.403を参照されたい。
樹脂(0.25mmol)は、手動の浸透/濾過装置に設置され、Dde又はivDde基を除去するために、N−メチルピロリドン(20ml、2×12分)中の2%のヒドラジンで処理し、N−メチルピロリドン(4×20ml)で洗浄した。
樹脂(0.25mmol)は、手動の浸透/濾過装置に設置され、Mtt又はMmt−基を除去するために、2%TFA及びDCM(20ml、5−10分を繰り返し6から12回)中の2から3%のTISで処理し、DCM(2×20ml)、10%MeOH及びDCM(2×20ml)中の5%DIPEA及びN−メチルピロリドン(4×20ml)で洗浄した。
樹脂はシリンジに設置し、Mtt基をだつ保護するために、ヘキサフルオロイソプロパノールで2×10分処理した。その後、樹脂はDCM及びNMPで上記のように洗浄した。
アルブミン結合残基(式IのB−U−側鎖)は、樹脂結合ペプチドへのアシル化又は、限定されるものではないが、DIC、HOBt/DIC、HOAt/DIC又はHBTUのような、標準的なアシル化剤を用いて、溶液中で保護されていないアミノ酸をアシル化することによって、ペプチドに付加し得る。
経路I
オクタデカン二酸モノ−(2、5−ジオキソ−ピロリジン−1−イル)エステルのような活性化(活性エステル又は対称無水物)アルブミン結合残基(A−B)−式Iの側鎖)(EbashiらEP511600、樹脂結合ペプチドに対して4モル等量)をNMP(25mL)に溶解させ、樹脂を添加し、室温で終夜振盪した。反応混合物を濾過し、樹脂はNMP、ジクロロメタン、2−プロパノール、メタノール及びジエチルエーテル十分に洗浄した。
アルブミン結合残基(式IのA−(B)−側鎖)をN−メチルピロリドン/塩化メチレン(1:1、10ml)に溶解させた。ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(樹脂に対し4モル等量)及びジイソプロピルカルボジイミドのような活性化試薬(樹脂に対し4モル等量)を添加し、溶液を15分間振盪した。溶液を樹脂に添加し、ジイソプロピルエチエルアミン(樹脂に対し、4モル等量)を添加した。樹脂は室温で2から24時間振盪した。樹脂はN−メチルピロリドン(2×20ml)、N−メチルピロリドン/塩化メチレン(1:1)(2×20ml)及び塩化メチレン(2×20ml)で十分に洗浄した。
オクタデカン二酸モノ−(2、5−ジオキソ−ピロリジン−1−イル)エステルのような活性化(活性エステル又は対称無水物)アルブミン結合残基(A−B)−式Iの側鎖)(EbashiらEP511600、樹脂結合ペプチドに対して1から1.5モル等量)をアセトニトリル、THF、DMSOのような有機溶媒又は水/有機溶媒(1から2ml)に溶解させ、10等量のDIPEAと共に水中のペプチド溶液(10−20ml)に添加した。tert−ブチルのようなアルブミン結合残基の保護基の場合、反応混合物は終夜凍結乾燥させ、その後単離された粗ペプチドを脱保護した。tert−ブチル基の場合、ペプチドはトリフルオロ酢酸、水、トリイソプロピルシラン(90:5:5)の混合物に溶解させた。30分後混合物を真空蒸発させ、最終ペプチドは分取HPLCで精製した。
樹脂(0.25mmol)を手動振盪装置中の濾過フラスコに設置し、N−メチルピロリドン/塩化メチレン(1:1)(2×20ml)及びN−メチルピロリドン(1×20ml)、N−メチルピロリドン中20%ピペリジン溶液で処理した(3×20ml、各10分)。樹脂はN−メチルピロリドン(2×20ml)、N−メチルピロリドン/塩化メチレン(1:1)(2×20ml)及び塩化メチレン(2×20ml)で洗浄した。
トリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシラン(95:2.5:2.5から92:4:4)の混合物と共に室温で180分間攪拌することによりペプチドを樹脂から切断した。切断混合物を濾過し、濾液は窒素ガスによって油脂に濃縮した。粗ペプチドは45mlのジエチルエーテルを用いて沈殿させ、45mlのジエチルエーテルで1から3回洗浄した。
粗ペプチドは分取HPLCを用いて、5μ又は7μのC−18シリカを封入した20mm×250mmカラムにおいて精製した。ペプチドに依存して、一又は二の精製システムを用いた。
TFA: 乾燥後、粗ペプチドは5ml50%の酢酸水に溶解させ、水で20mlに希釈し、カラムに注入し、40℃で50分間、10ml/分で、40%から60%の0.1%TFA中アセトニトリルの勾配溶出した。画分を含むペプチドを回収した。精製したペプチドは溶出液を水で希釈した後に凍結乾燥した。
得られた最終産物はRP−HPLC(保持時間)及びLCMSによって同定した。
RP−HPLC分析は214nmでのUV検出及び例えば、Vydac、218TP54、4.6mm×250mm、5μ、C−18シリカカラム(The Separations Group、ヘスペリア、USA)によって行われ、42℃で1ml/分で溶出される。最も多くは下の具体的な条件の一つを用いた:
HPLC(方法03−A1−1): RP−分析を、ウォーターズ996ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ2690システムを使用して実施した。UV検出を、42℃で1ml/分で溶出する、218TP54 4.6mm×250mm 5μ C−18シリカカラム(The Seperations Group, Hesperia)において、214、254、276及び301nmにて収集した。カラムを、4Mの硫酸でpH2.5に調整した10%の0.5Mの硫酸アンモニウムで平衡にした。注入後、サンプルを50分間、同様の水系緩衝液中で0%から60%のアセトニトリルの勾配溶出させた。
HPLC(方法03−B1−2): RP−分析を、ウォーターズ996ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ2690システムを使用して実施した。UV検出を、42℃で0.5ml/分で溶出する、Zorbax 300SB C−18(4、5×150mm、5μ)において、214、254、276及び301nmにて収集した。カラムを、水にTFAの入った水溶液(0.1%)で平衡にした。注入後、サンプルを50分間、水にTFAの入った水溶液(0.1%)で0%から60%のアセトニトリル(+0.1%のTFA)の勾配溶出させた。
HPLC(方法02−B1−1): RP−分析を、ウォーターズ2487二重バンド検出器が取り付けられたアライアンスウォーターズ2695システムを使用して実施した。UV検出を、42℃で、Vydac 218TP53、C18、300Å、5um、3.2mm×250mmカラムにおいて、214及び254nmにて収集した。流速0.50ml/分で50分間、0%から60%のアセトニトリル、95から35%の水及び5%の水中トリフルオロ酢酸(1.0%)の線形勾配溶出させた。
HPLC(方法01−B4−2): RP−分析を、ウォーターズ996ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ600Sシステムを使用して実施した。UV検出を、42℃で、Symmetry300 C18、5um、3.9mm×150mmカラムにおいて、214及び254nmにて収集した。流速1.0ml/分で15分間、5%から95%のアセトニトリル、90から0%の水及び5%の水中トリフルオロ酢酸(1.0%)の線形勾配溶出させた。
HPLC(方法02−B4−4): RP−分析を、ウォーターズ2487二重バンド検出器が取り付けられたアライアンスウォーターズ2695システムを使用して実施した。UV検出を、42℃で、Symmetry300 C18、5um、3.9mm×150mmカラムにおいて、214及び254nmにて収集した。流速1.0ml/分で15分間、5%から95%のアセトニトリル、90から0%の水及び5%の水中トリフルオロ酢酸(1.0%)の線形勾配溶出させた。
HPLC(方法02−B6−1): RP−分析を、ウォーターズ2487二重バンド検出器が取り付けられたウォーターズ2695システムを使用して実施した。UV検出を、42℃で、Vydac 218TP53、C18、300Å、5um、3.2mm×250mmカラムにおいて、214及び254nmにて収集した。流速0.50ml/分で50分間、0%から90%のアセトニトリル、95から5%の水及び5%の水中トリフルオロ酢酸(1.0%)の線形勾配溶出させた。
HPLC(方法03−B6−1): RP−分析を、ウォーターズ996ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ2690システムを使用して実施した。UV検出を、42℃で1ml/分で溶出する、218TP54 4.6mm×250mm 5μ C−18シリカカラム(The Seperations Group, Hesperia)において、214、254、276及び301nmにて収集した。カラムを、水にTFAの入った水溶液(0.1%)で平衡にした。注入後、サンプルを50分間、水にTFAの入った水溶液(0.1%)で0%から60%のアセトニトリル(+0.1%のTFA)の勾配溶出させた。カラムを、水にTFAの入った水溶液(0.1%)で平衡にした。注入後、サンプルを50分間、水にTFAの入った水溶液(0.1%)で0%から90%のアセトニトリル(+0.1%のTFA)の勾配溶出させた。
バッファーA: 10mMトリス、4NのH2SO4でpH7.3に調整された15mM(NH4)2SO4、20%v/vのアセトニトリル
バッファーB: 80%v/vのアセトニトリル
流速: 1.0ml/分
勾配: 0−20分は10−50%のB
カラム: Phenomenex、Jupiter 4.6mm×150mm、C4、 5μ、300Å
カラム温度: 40℃。
LCMSはSciex API 100 Single quadropole MS、パーキン・エルマー・シリーズ200 Quardポンプ、パーキン・エルマー・シリーズ200オートサンプラー、アプライドバイオシステムズ785AUV検出器、Sedex75蒸発光散乱式検出器から構成される設定に基づいて実施される。
A: 水中の0.05%トリフルオロ酢酸
B: アセトニトリル中の0.05%トリフルオロ酢酸
を含む2つの溶出リザーバに接続される。
勾配: 1.5ml/分で、7.5分間、5%から90%のアセトニトリル線形
検出器: 210nm(DADからアナログ出力)
ELS(ELSからアナログ出力)、40°C
MSイオン化モードAPI−ES
A: 水中の10mMのNH4OH
B: 90%アセトニトリル中の10mMのNH4OH
を含む2つの溶出容器に接続される。
分析は、A及びBで勾配溶出されるカラム上に適切な容量のサンプル(好ましくは20μl)を、23℃で注入することにより実施される。
HPLC条件、使用される検出器の設定及びMSの設定は下の表に記載される。
カラム Waters Xterra MS C−18 × 3mm id 5μm
勾配 1.5ml/分で、6.5分間、5%から100%のアセトニトリル線形
検出器 210nm(DADからアナログ出力)
ELS(ELSからアナログ出力)
MSイオン化モードAPI−ES。スキャン100−1000amuステップ0.1amu
ペプチドの分子量をマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法(MALDI−MS)を使用して定量し、Microflex(Bruker)で記録した。α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸の基質を使用した。
0.1%TFA/H2Oを用いたカラム(Xterra(商標)MS C18、5um、4.6×150mmカラム、P7N 186 000490)の平衡化及び25分間の0%CH3CN/0.1%TFA/H2Oから60%CH3CN/0.1%TFA/H2O、次いで5分間の60%から100%の勾配溶出。
天然アミノ酸は一文字表記を用い、例えばHはL−ヒスチジンをAはL−アラニン等を示す。アミノ酸の三文字略語を用いても良く、例えば、HisはL−ヒスチジンを、AlaはL−アラニン等を示す。非天然アミノ酸は、アミノイソブチル酸がAibであるように、三文字略語を用いる。アミノ酸の位置は、Lys33のようにアミノ酸表記の後ろに上付き数字を用いるか、又はLys33のように示し得る。N−末端アミノ基はNH2のように又はHのように表記し得る。C−末端カルボキシル基は−OHのように又は−COOHのように表記し得る。C−末端アミド基は−NH2のように表記される。
下の構造
共にHis−Aib−Glu−Gly−Thr−Pheを意味する。
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、Glu30、Lys33)GLP−1(7−33)アミド
調製法: 方法Cはペプチドが8から10倍モル過剰なアミノ酸を用いて、Advanced ChemtechのApex396において調製されることを除き、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)及びMtt基はヘキサフルオロイソプロパノールを用いて脱保護された。最終産物は分析HPLC及びMALDI−MSで同定された。
HPLC(方法02−B6−1):
RT=32分
MALDI−MS = 3901
計算されたMW = 3900.5
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Arg26、Glu30)GLP−1(7−33)アミド
調製法: 方法Cはペプチドが8から10倍モル過剰なアミノ酸を用いて、Advanced ChemtechのApex396において調製されることを除き、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)及びMtt基はヘキサフルオロイソプロパノールを用いて脱保護された。最終産物は分析HPLC及びMALDI−MSで同定された。
HPLC(方法02−B6−1):
RT=32.9分
MALDI−MS=3858.7
計算されたMW=3859.3
[Glu22、Val25、Arg26]GLP−1(7−33)アミド
調製法: A
HPLC(方法03−A1−1)
RT=44.6分
LCMS: m/z=1029、2(M+3H)3+
計算されたMW=3084.4
[Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Glu30]GLP−1(7−33)アミド
調製法: B
ペプチドは60%アセトニトリルで溶出された。
構造はMALDI−MSで確認した。
計算されたMW=3171.5
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−[Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Glu30]GLP−1(7−33)アミド
調製法: B
ペプチドは70%アセトニトリルで溶出された。
構造はMALDI−MSで確認した。
計算されたMW=3887.4
[Glu22、Arg26]GLP−1(7−33)ペプチド
調製法: A
HPLC(方法B6):
RT=28.09分
LCMS: m/z=1020(M+3H)3+
計算されたMW=3057.3
[Glu22、Val25、Arg26]GLP−1(7−32)アミド
調製法: A
HPLC(方法03−A1−1)
RT=41.9分
LCMS: m/z=996、0(M+3H)3+
計算されたMW=2985.3
N−イプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Arg26) GLP−1(7−33)アミド
調製法: 方法Cはペプチドが8から10倍モル過剰なアミノ酸を用いて、Advanced ChemtechのApex396において調製されることを除き、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)及びMtt基はヘキサフルオロイソプロパノールを用いて脱保護される。最終産物は分析HPLC及びLC−MSで同定される。
HPLC(方法02−B6−1):
RT=34.31分
LCMS: m/z=1277(M+3H)3+
計算された MW=3831
N−イプシロン31{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Glu22、Val25、Arg26、Lys31)GLP−1(7−33)アミド
調製法: 方法Cはペプチドが8から10倍モル過剰なアミノ酸を用いて、Advanced ChemtechのApex396において調製されることを除き、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)及びMtt基はヘキサフルオロイソプロパノールを用いて脱保護される。最終産物は分析HPLC及びLC−MSで同定される。
HPLC(方法02−B6−1):
RT=34.02分
LCMS: m/z=1253(M+3H)3+
計算されたMW=3759
N−イプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(デスアミノHis7、Lys20、Glu22、Arg26)GLP−1(7−33)アミド
調製法: 方法Cはペプチドが8から10倍モル過剰なアミノ酸を用いて、Advanced ChemtechのApex396において調製されることを除き、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)及びMtt基はヘキサフルオロイソプロパノールを用いて脱保護される。最終産物は分析HPLC及びLC−MSで同定される。
RT=33.3分
LCMS: m/z=1257.7(M+3H)3+
計算されたMW=3773
N−イプシロン31{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(デスアミノHis7、Glu22、Arg26、Lys31)GLP−1(7−33)アミド
調製法: 方法Cはペプチドが8から10倍モル過剰なアミノ酸を用いて、Advanced ChemtechのApex396において調製されることを除き、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)及びMtt基はヘキサフルオロイソプロパノールを用いて脱保護される。最終産物は分析HPLC及びLC−MSで同定される。
HPLC(方法02−B6−1):
RT=33.2分
LCMS: m/z=1233.9(M+3H)3+
計算されたMW=3699
N−イプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、 Glu30、Lys31)GLP−1(7−32)アミド
調製法: 方法Cはペプチドが8から10倍モル過剰なアミノ酸を用いて、Advanced ChemtechのApex396において調製されることを除き、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)及びMtt基はヘキサフルオロイソプロパノールを用いて脱保護された。最終産物は分析HPLC及びMALDI−MSで同定された。
HPLC(方法02−B6−1):
RT=32.6分
MALDI−MS: 3715.5
計算されたMW=3714.3
N−イプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、 Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、Nle30、Lys31)GLP−1(7−32)アミド
調製法: 方法Cはペプチドが8から10倍モル過剰なアミノ酸を用いて、Advanced ChemtechのApex396において調製されることを除き、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)及びMtt基はヘキサフルオロイソプロパノールを用いて脱保護された。最終産物は分析HPLC及びMALDI−MSで同定された。
HPLC(方法02−B6−1):
RT=33分
MALDI−MS: 3696.9
計算されたMW=3698
N−イプシロン31−[2−(2−{2−[2−(2−{2−[(S)−4−カルボキシ−4−({trans−4−[(19−カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]−[Aib8、Glu22、Val25、Arg26、Lys31]GLP−1−(7−33)アミド
調製法: 方法Cはペプチドが8から10倍モル過剰なアミノ酸を用いて、Advanced ChemtechのApex396において調製されることを除き、DIC及びHOAt/HOBt(1:1)及びMtt基はヘキサフルオロイソプロパノールを用いて脱保護された。最終産物は分析HPLC及びMALDI−MSで同定された。
HPLC(方法02−B6−1):
RT= 39.3分
MALDI−MS: 3696.9
計算されたMW=3698
[デスアミノHis7、Glu22、Arg26]−GLP−1(7−34)
HPLC(方法I−BDSB2)
RT=5.65分
LCMS: m/z=1057.5(M+3H)3+
計算されたMW=3170.5
[Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、Lys31]GLP−1(7−32)アミド
SPPS法Bに類似の調製
HPLC方法02−B6−1:
RT=27.09分
LCMS: m/z=735(M+4H)4+
計算された(M)=2940.3
N−イプシロン31−[2−(2−{2−[2−(2−{2−[(S)−4−カルボキシ−4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7、Asp11、Glu18、Glu22、Val25、Arg26、Asp27、Glu30、Lys31]GLP−1(7−33)−ペプチドアミド
ChemMatrix Rinkアミド樹脂(0.24mmol/g、0.4g)における調製法B。
HPLC(02−B4−4): Rt=10、649分; 99.6% 純度
HPLC(03−A3−1): Rt=8.491分; 94.3% 純度
MALDI−MS: アルファ−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸; m/z: 3824.543(ネガティブモード)
[Aib8、Glu22、Val25、Lys31]GLP−1(7−33)−アミド
調製法: ペプチドはSPPS法Cによって調製され、最終産物は分析HPLC及びMALDI−MSによって同定された。
HPLC(02−B6−1): RT=31.5分
HPLC(04−A3−1): RT=8.6分
MALDI−MS: 3043.6
計算されたMW=3040.4
N−イプシロン31−{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチルアミノ]エトキシ}
エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−N−beta34−(2−(bis−カルボキシメチルアミノ)アセチル)[Aib8、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、Dap34]GLP−1(7−34)アミド
調製法: ペプチドはSPPS法Cによって調製され、最終産物は分析HPLC及びMALDI−MSによって同定された。
HPLC(02−B6−1): RT=36.7分
HPLC(A4−A3−1): RT=8.9分
MALDI−MS: 4015.9
計算されたMW=4015.5
静脈又は皮下投与後のGLP−1P誘導体の突出
本発明の幾つかのGLP−1化合物の突出は、下記の方法を用いて、健康な豚に皮下投与後の血漿中の濃度をモニターすることにより決定される。皮下投与後の血漿中のGLP−1(7−37)の濃度の比較も下記の通りである。本発明の他のGLP−1化合物の突出は同様に決定され得る。
試験物質は皮下又は静脈投与に適した運搬対に溶解させる。濃度は投与量が約1mlになるように調整される。
動物は藁を敷いたペン中で飼育され、それぞれのペンには6匹である。
動物は試験中、国産の飲料水に自由に接近するが、投与前の約午後4時から投与の約12時間後まで絶食される。
動物は搬入時と投与の日に計量される。
それぞれの試験物質は3匹の動物になされる。それぞれの動物は2nmol/kg体重の投与量を受ける。
6匹の動物が隔週で投与され、その間残りの6匹は休憩する。
投与前(0)、投与後0.17(10分間)、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、及び120時間。
投与前(0)、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、及び120時間。
各サンプリング時間において、それぞれの動物から2mlの血液が採られる。血液は頸静脈から採られる。
実験の開始から豚(50%のDuroc、25%のYorkshire、25%のDanish Landrace、約40kg)は絶食させる。それぞれの豚に50μMの等張液(5mMのリン酸、pH7.4、0.02%のTween−20(Merck)、45mg/mlのマンニトール(ピロゲンフリー、Novo Nordisk)中の試験化合物が、0.5nmol/kg投与される。血液サンプルは頸静脈からカテーテルで採られる。5mlの血液サンプルが下記の溶液を175μl含む凍結ガラスに注がれる:0.18MのEDTA、15000KIE/mlのアプロチニン(Novo Nordisk)及び0.30mMのバリン−ピロリジン(Novo Nordisk)、pH7.4。 30分以内に、サンプルは5から6000*gで10分間遠心される。温度は4℃に保持される。上清は別のガラスにピペットで取られ、使用まで20℃で保持される。
コーティングバッファー(PBS): リン酸バッファー生理食塩水、pH7.2
洗浄−バッファー(PBS−洗浄): リン酸バッファー生理食塩水、0.05%v/vのTween20、pH7.2
評価−バッファー(BSA−バッファー): リン酸バッファー生理食塩水、10g/lウシ血清アルブミン(フルカ05477)、0.05%v/vのTween20、pH7.2
ストレプトアビジン−バッファー リン酸バッファー生理食塩水、0.5MのNaCl、0.05%v/vのTween20、pH7.2
標準: 血漿基質中の各化合物
A−TNP: ナンセンス抗体
AMDEX: ストレプトアビジン−西洋わさび−ペルオキシダーゼ(Amersham RPN4401V)
TMB−基質: 3、3’、5、5’テトラメチルベンジジン(<0.02%)、過酸化水素
1.)PBS−バッファー中の5μg/mlの補足抗体100μlで被覆する
・終夜インキュベーション、4℃
・5× PBS−洗浄
・最低30分間の最終洗浄でブロックする
・次いでプレートを空にする
2.)10μg/mlのA−TNPを含むBSA−バッファー中、20μlのサンプル+100μlのビオチン化された検出抗体1μg/ml。
・振盪器において、室温で、2時間インキュベーション、5×PBS−洗浄、次いでプレートを空にする
3.)ストレプトアビジン−バッファー中の100μlのAMDEX1:8000
・振盪器において、室温で、45から60分インキュベーション
・5x PBS−洗浄、次いでプレートを空にする
4.)100μlのTMB−基質
・振盪器において、室温で、インキュベーションx分
・4MのH3PO4で反応を停止
DB−バッファー: 80mMのリン酸 バッファー、0.1%ヒト血漿アルブミン、10mMのEDTA、0.6mMのチオメルサール、pH 7.5
FAM−バッファー: 40mMのリン酸バッファー、0.1%ヒト血漿アルブミン、0.6mMのチオメルサール、pH7.5
チャコール: 40mMのリン酸バッファー、0.6mMのチオメルサール、16.7%ウシ血漿、15g/lの活性炭素、pH7.5(使用前に4℃で最小1時間、上清を混合する。)
標準: 血漿基質中のそれぞれの化合物
それぞれの標準曲線からサンプル中の濃度が計算される。
この方法は、LEADseeker造影粒子を用いた放射性リガンド結合アッセイである。該アッセイは、GLP−1レセプター、標識されていないGLP−1アナログ、125Iで標識されたヒトGLP−1及び小麦胚芽凝集素(WGA)で被覆されたPS LEADseeker粒子を含む膜フラグメントから構成される。コールド及び125Iで標識したGLP−1はレセプターへの結合で競合するであろう。LEADseeker粒子が添加された際、それらはWGA−残基を介して膜フラグメント上の炭水化物残基に結合するであろう。125I−分子とLEADseeker粒子が接近し、粒子からの発光が起きる。LEADseekerは発光を造影し、サンプル中に存在するGLP−1アナログ量に逆相関するであろう。
動物血漿の前処理: 動物血漿は56℃で4時間処理し、10分間10000rpmで遠心する。その後、Val−Pyr(10μM)及びアプロテニン(500KIE/mL)を添加し、使用まで−18℃未満で保存する。
GLP−1アナログ校正液: 約1μMから1pMの範囲の希釈線を得るため、GLP−1アナログを加熱した血漿に混合する。
GLP−1 RRAアッセイバッファー: 25mMのNa−HEPES(pH=7.5)、2.5mMのCaCl2、1mMのMgCl2、50mMのNaCl、0.1%の卵白アルブミン、0.003%tween20、0.005%バシトラシン、0.05%NaN3.
GLP−1レセプター上清: GLP−1レセプター膜フラグメントはヒト膵臓GLP−1レセプター恒常発現ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞から精製される。
−80℃未満で保存される。
WGA連結ポリスチレンLEADseeker造影ビーズ(RPNQ0260、アマシャム): ビーズはGLP−1RRAアッセイバッファーで、13.3mg/mLの濃度に再構築される。次いで、GLP−1レセプター膜上清を加え、使用1時間前に回転保冷(2から8℃)する。
[125I]−GLP−1(7−36)アミド(Novo Nordisk A/S)。 使用まで−18℃未満で保存する。
エタノール99.9%体積(De Dansk Spritfabrikker A/S): 使用まで−18℃未満で保存する。
MultiScreen(登録商標)Solvinert 0.45μmの疎水性PTFEプレート(MSRPN0450、ミリポア株式会社)
ポリプロピレンプレート(カタログ番号650201、Greiner Bio−One)
白色ポリスチレン384−穴プレート(カタログ番号781075、Greiner Bio−One)
水平プレートミキサー
標準スイングバケット、マイクロタイタープレートローターアセンブリ付き遠心分離器
UltraVap−ドライダウンサンプル濃縮器(Porvair)
LEADseeker(商標)マルチモーダル造影システム(アマシャム)
サンプル調製:
濾液を回収するために、(例えば、ポリプロピレンプレートのような)化学的に同等な容器上にMultiScreen(登録商標)Solvinertフィルタープレートを付ける。MultiScreen(登録商標)Solvinertフィルターの空きウェルに99.9%の氷冷アルコール150μlを加え、その後、50μlの校正液又は血漿サンプルを加える。フィルタープレートに保存蓋を設置する。
水平プレートミキサー上に18から22℃で15分間インキュベーションする。
蓋付きのフィルターと容器プレートを標準スイングバケット、マイクロタイタープレートアセンブリーに設置する。次いで、濾液を2分間、1500rmpで容器プレートの空きウェルに回収する。
濾液を、窒素で15分間加熱した(40℃)UltraVapを用いてドライダウンした。それぞれのウェルにGLP−1RRAアッセイバッファーを100μl添加することにより、乾燥物質を再構成した。水平ミキサーで5分間インキュベーションした。
下記のピペッティング計画及び白色ポリスチレン384−穴プレート:
・35μLのGLP−1 RRAアッセイバッファー
・5μLの再構成された濾液
・10μLの[125I]−GLP−1(7−36)アミド。ストック溶液は使用前にGLP−1 RRAアッセイバッファーで20.000cpm/ウェルに希釈される。
・15μLのGLP−1レセプター膜フラグメント(約0.5μg/ウェル)をWGA−ポリスチレンLEADseeker造影ビーズ(0.2mg/ウェル)に事前被覆する。
本発明の幾つかのGLP−1アナログ及び誘導体(実施例1から7、9から17、及び19から20の化合物)の効能、即ち、ヒトGLP−1レセプターを含む培地におけるサイクリックAMP(cAMP)の形成の刺激、を下記のように決定した。比較として、切断型された天然のGLP−1(7−33)の効能も決定した。
本発明のGLP−1化合物の幾つかについて(実施例1から17の化合物)、GLP−1Rレセプター(nGLP−1R)の単離されたN末端の細胞外ドメインへの結合親和性が、下記のように測定された。比較のため、切断型天然ヒトGLP−1(7−33)の効能も決定された。
本発明の幾つかのGLP−1化合物(実施例1から7及び9から18の化合物)のヒトGLP−1レセプターへの親和性は、レセプターから125I−GLP−1を置換する能力によって測定された。
種(in vitro): ハムスター
生物学的終了点: レセプター結合
アッセイ方法: SPA
レセプター: GLP−1レセプター
細胞株: BHK tk− ts13
細胞(約80%コンフルエント)はPBS中で2回洗浄し、収穫し(PBS+EDTA又はヴェルセン)、次いで5分間1000rmpで遠心分離した。細胞/細胞ペレットは、次の工程が可能な程度に、氷上で保つ。細胞ペレットは、適切な量(細胞量に依存するが、例えば、10ml)のバッファー1中、Ultrathurraxで20から30秒間ホモジナイズした。ホモジネートは20000rpmで15分間遠心する。ペレットは10mlのバッファー2に再懸濁し、再遠心した。この工程はもう一度繰り返した。得られたペレットはバッファー2に再懸濁し、タンパク質濃度を決定した。膜は−80℃に保存した。
バッファー2: 20mMのNa−HEPES+0.1mMのEDTA、pH 7.4
SPA:
試験化合物/ペプチド、膜、SPA−粒子及び[125I]はアッセイバッファーで希釈する。25ul(マイクロリットル)の試験化合物/ペプチドをオプティプレートに添加する。バッファーを添加する(50ul)。(好ましくはそれぞれの膜調製に最適化された)0.1から0.2mgのタンパク質/mlに相当する5から10ugのタンパク質/サンプル(50ul)を添加する。0.5mg/ウェル(50ul)のSPA−粒子(小麦胚芽凝集素SPAビーズ)RPNQ 0001)を添加する。[125I]−GLP−1(49.880DPM、25ulに相当する最終濃度0.05nM)と共にインキュベーションを開始する。プレートはPlateSealerで密閉する。振盪しながら30℃で120分間インキュベーションする。プレートを遠心し(1500rpm、10分間)、トップカウンターでカウントする。
アッセイバッファー: 50mMのHEPES
5mMのEGTA
5mMのMgCl2
0.005%のTween20
pH7.4
Claims (20)
- a)GLP−1(7−35)の位置22と同じ位置にGlu残基と、
b)GLP−1(7−35)の位置26と同じ位置にArg残基とを含む
i)GLP−1(7−35)と比較して、総数で2、3、4、5、6、7、8又は9つのアミノ酸置換を有する、修飾GLP−1(7−35)(配列番号1)であるGLP−1アナログ又はその誘導体。 - GLP−1(7−35)の位置30、31、32、33、34、又は35と同じ位置のアミノ酸が存在せず、但し、位置30、31、32、33又は34のアミノ酸が存在しない場合、各々の下流のアミノ酸残基も存在しない、請求項1に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
- GLP−1アナログがi)C−末端カルボキシル基又はiii)C−末端アミド基を含む、請求項1又は2の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
- アルブミン結合残基で誘導体化され又はペグ化された、請求項1から3の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
- 位置35のアミノ酸が存在せず、GLP−1アナログの全長が28アミノ酸である、請求項1から4の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
- 位置34及び35のアミノ酸が存在せず、GLP−1アナログの全長が27アミノ酸である、請求項1から5の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
- 位置33、34及び35のアミノ酸が存在せず、GLP−1アナログの全長が26アミノ酸である、請求項1から6の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
- 位置32、33、34及び35のアミノ酸が存在せず、GLP−1アナログの全長が25アミノ酸である、請求項1から7の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
- 位置31、32、33、34及び35のアミノ酸が存在せず、GLP−1アナログの全長が24アミノ酸である、請求項1から8の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
- 位置30、31、32、33、34及び35のアミノ酸が存在せず、GLP−1アナログの全長が23アミノ酸である、請求項1から9の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。
- 式(I)
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Xaa18−Tyr−Leu−Glu−Glu−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Phe−Ile−Xaa30−Trp−Leu−Xaa33−Xaa34−Xaa35−R
式(I)(配列番号2)
{上式中、
Xaa7はL−ヒスチジン、D−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニン又は4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8はAla、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa9はGlu又はアルファ、アルファジメチル−GluのようなGlu誘導体であり;
Xaa16はVal又はLeuであり;
Xaa18はSer、Lys、Cys又はArgであり;
Xaa20はLeu、Lys又はCysであり;
Xaa23はGln、Glu、Lys、Cys又はArgであり;
Xaa24はAla又はAsnであり;
Xaa25はAla又はValであり;
Xaa27はGlu、Ala又はLeuであり;
Xaa30はAla、Glu、Lys、Argであるか又は存在せず;
Xaa31はTrp、Lys、Cysであるか又は存在せず;
Xaa33はVal、Lys、Cysであるか又は存在せず;
Xaa34はLys、Glu、Asn、Arg、Cysであるか又は存在せず;
Xaa35はGly、Aibであるか又は存在せず;
Rはアミドであるか又は存在せず;
但し、Xaa30、Xaa31、Xaa32、Xaa33、又はXaa34が存在しない場合、各々の下流のアミノ酸残基が存在しない}
の配列を有する、請求項1から10の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。 - 式(II)
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Xaa18−Tyr−Leu−Glu−Glu−Gln−Ala−Ala−Arg−Glu−Phe−Ile−Xaa30−Trp−Leu−Xaa33−Xaa34−Xaa35−R
式(II)(配列番号3)
{上式中、
Xaa7はL−ヒスチジン、D−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニン又は4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8はAla、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロヘプチル)カルボン酸、又は(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18はSer、Lys又はArgであり;
Xaa30はAla、Glu、Lys、Argであるか又は存在せず;
Xaa33はVal、Lysであるか又は存在せず;
Xaa34はLys、Glu、Argであるか又は存在せず;
Xaa35はGly、Aibであるか又は存在せず;
Rはアミドであるか又は存在しない}
の配列を有する、請求項1から10の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。 - 少なくとも一のアミノ酸残基が、
A−B−C−D−
{A−は、
からなる群から選択され、
ここで、nは14、15、16 17、18及び19からなる群から選択され、pは10、11、12、13及び14からなる群から選択され、dは0、1、2、3、4及び5からからなる群から選択され、
−B−は、
からなる群から選択され、
ここで、xは0、1、2、3及び4からなる群から選択され、yは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12からなる群から選択され、
−C−は、
からなる群から選択され、
ここで、b及びeは0、1及び2からなる群から各々独立に選択され、c及びfは0、1及び2からなる群から各々独立に選択され、但し、cが0の場合、bは1若しくは2であり、又は、cが1若しくは2の場合、bは0であり、及び、fが0の場合、eは1若しくは2であり、又は、fが1若しくは2の場合、eは0であり、
−D−は前記アミノ酸残基に結合し、リンカーである}
で誘導体化された、請求項1から12の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。 - [Glu22、Arg26]GLP−1(7−33)アミド
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、Glu30、Lys33)GLP−1(7−33)アミド;
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Arg26、Glu30)GLP−1(7−33)アミド;
[Glu22、Val25、Arg26]GLP−1(7−33)アミド;
[Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Glu30]GLP−1(7−33)アミド;
Nイプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−[Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Glu30]GLP−1(7−33)アミド;
[Glu22、Arg26]GLP−1(7−33)ペプチド;
[Glu22、Val25、Arg26]GLP−1(7−32)アミド;
N−イプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Arg26)GLP−1(7−33)アミド;
N−イプシロン31{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Glu22、Val25、Arg26、Lys31)GLP−1(7−33)アミド;
N−イプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(デスアミノHis7、Lys20、Glu22、Arg26)GLP−1(7−33)アミド;
N−イプシロン31{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(デスアミノHis7、Glu22、Arg26、Lys31)GLP−1(7−33)アミド;
N−イプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、Glu30、Lys31)GLP−1(7−32)アミド;
N−イプシロン20{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−(Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、Nle30、Lys31)GLP−1(7−32)アミド;
N−イプシロン31−[2−(2−{2−[2−(2−{2−[(S)−4−カルボキシ−4−({トランス−4−[(19−カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル}アミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]−[Aib8、Glu22、Val25、Arg26、Lys31]GLP−1−(7−33)アミド;
[デスアミノHis7、Glu22、Arg26]−GLP−1(7−34);
[Aib8、Lys20、Glu22、Val25、Arg26、Leu27、Lys31]GLP−1(7−32)アミド;
N−イプシロン31−[2−(2−{2−[2−(2−{2−[(S)−4−カルボキシ−4−(17−カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][デスアミノHis7、Asp11、Glu18、Glu22、Val25、Arg26、Asp27、Glu30、Lys31]GLP−1(7−33)アミド;
[Aib8、Glu22、Val25、Lys31]GLP−1(7−33)−アミド;
N−イプシロン31−{2−(2−{2−[2−(2−{2−[4−カルボキシ−4−(17−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}
エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}−N−ベータ34−(2−(ビス−カルボキシメチルアミノ)アセチル)[Aib8、Glu22、Val25、Arg26、Lys31、Dap34]GLP−1(7−34)アミド、
から選択される、請求項1から14の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体。 - 請求項1から15の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体又はその製薬的に許容可能な塩、アミド、アルキル、又はエステル、及び製薬的に許容可能な賦形剤、を含有する医薬組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1から15の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体、又は請求項16に記載の医薬組成物。
- 高血糖症、2型糖尿病、耐糖能異常、1型糖尿病、肥満、高血圧、X症候群、脂質異常症、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠状動脈性心臓病及び他の心臓血管疾患、卒中、炎症性腸症候群、消化不良及び胃潰瘍の治療又は予防に使用するための、請求項1から15の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体、又は請求項16に記載の医薬組成物。
- 高血糖症、2型糖尿病、耐糖能異常、1型糖尿病、肥満、高血圧、X症候群、脂質異常症、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠状動脈性心臓病及び他の心臓血管疾患、卒中、炎症性腸症候群、消化不良及び胃潰瘍の治療又は予防に使用するための医薬の製造における、請求項1から15の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体、又は請求項16に記載の医薬組成物の使用。
- 請求項1から15の何れか一項に記載のGLP−1アナログ又はその誘導体、又は請求項16に記載の医薬組成物の薬学的に活性な量を投与することによる、高血糖症、2型糖尿病、耐糖能異常、1型糖尿病、肥満、高血圧、X症候群、脂質異常症、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠状動脈性心臓病及び他の心臓血管疾患、卒中、炎症性腸症候群、消化不良及び胃潰瘍の治療又は予防の方法。
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