JPH05506427A

JPH05506427A - 糖尿病治療に有用なｇｌｐ―１アナログ

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Publication number: JPH05506427A
Application number: JP91503618A
Authority: JP
Inventors: バックレイ，ダグラス　アイ．; ハベナー，ジョエル　エフ．; マロリー，ジョアンヌ　ビー．; モジュゾフ，スベトラーナ
Original assignee: バツクレイ，ダグラス　アイ．; ハベナー，ジヨエル　エフ．; マロリー，ジヨアンヌ　ビー．; モジユゾフ，スベトラーナ
Priority date: 1990-01-24
Filing date: 1991-01-24
Publication date: 1993-09-22
Anticipated expiration: 2017-03-04
Also published as: EP0512042B1; JP2003192698A; CA2073856C; WO1991011457A1; CA2073856A1; EP0512042A4; ATE164852T1; JP2004196825A; JP2005132848A; DE69129226T2; EP0512042A1; DE69129226D1; JP3262329B2; JP2001151798A; ES2113879T3; DK0512042T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】治　に　なＧ　Ｌ　Ｐ−１アナログ本出願は、１９９０年１月２４日出願の米国特許出願第４６８．７３６号の一部継続出願である。

１亙立互本発明は、改良された薬学的組成物の分野に関する。詳細には、本発明は、薬理学的特性が同上した、７〜３６位または７〜３７位のグルカゴン様ペプチド！フラグメントのアナログに関する。

１１１亙グルコースの代謝は、インスリン、グルカゴン、およびガストリック・インヒビトリー・ペプチド（Ｇ　Ｉ　Ｐ）を含む多くのペプチドホルモンによって調節される。これらのペプチドホルモンがこの代謝を調節する複雑なメカニズム、および、これらが相互にどのように影響するかについては、少なくともその一部が解明されている。例えば、グルカゴンは、インスリンを産生ずる膵臓β細胞の表面のレセプターに結合し、インスリンの分泌を刺激する。グルカゴン様ペプチドＩが、インスワンの分泌を刺激すると示唆されているが、これについては確認されていない。

これらのホルモンの内の数種類は、哺乳類のグルカゴン前駆体である「プログルカゴン」から生じる。「プログルカゴンＪは、１８０個のアミノ酸のペプチドである。このペプチドのタンパク質分解およびプロセシングにより、これらの多くのタンパク質ホルモンが得られる。プロセシングの結果は、プロセシングが行われる細胞の起源に左右される。例えば、ブタおよびラットの膵臓では、プログルカゴンはプロセシングによってグルカゴンとグリセンチン関連膵臓ペプチドとを形成する。グリセンチン関連膵臓ベプチトハ、Ｇ　Ｌ　Ｐ−１およびＧＬＰ〜２配列の双方を含む大型のペプチドである。ブタの小腸では、分泌物は、６９個のアミノ酸のグルカゴン含有ペプチドグリセンチン、ならびに別のペプチドとしての２個のグルカゴン様配列、即ちＧ　Ｌ　Ｐ−１およびＧＬＰ−２である。

しかし、いずれにしても、プログルカゴンの全配列は、グルカゴンの２９個のアミノ酸配列、ＧＬＰ−１の３６個または３７個のアミノ酸配列、およびＧＬＰ− ２の３４個のアミノ酸配列を含んでいる。これらの配列間には、アミノ酸スペーサー配列が介在している。

ＧＬＰ−１の活性パターンを解明する初期の試みでは、曖昧な見解が出されていたが、これに続いて得られた結論は、このペプチドの切断型が生物学的に活性であるということである。Ｍｏｊｓｏｖ、Ｓ、らのＪ　Ｃ１ｊｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　（１９８７）　７９：５１８−５１９は、３１個のアミノ酸ペプチドＧＬＰ−１（７−３７）のみが膵臓からのインスリン放出を強く刺激することを開示している。これより以前に、切断型および完全長の３７個のアミノ酸形態の膵臓および腸での発見はされていた。おそらくはカルボキシ末端がアミド化されたＧＬＰ− １（７−３６）もまた、インスリン放出の強力なメゾイエイタ−である。（例えばＨｏ１ｓｔ。

Ｊ、　Ｊ、ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１９ｇ？）　２１１：１６９−１７４を参照のこと）。

以下に記載する本発明は、これらのＧＬＰ−１の切断型のアナログに関する。これらのアナログは、グルコースにより誘導されるインスリン分泌、およびグルコースにより誘導されるグルカゴン分泌阻害を促進する際の有効性、並びに循環半減期に関連しており、所望の組み合わせの特徴を備えている。

グルコースにより誘導されるインスリン分泌を促進する際の切断型の生理学的効果は、Ｈｏ１ｓｔ、　Ｊ、Ｊ、らおよびＭｏｊｓｏｖ、　Ｓら（前出）によって上記のように提示されている。グルカゴン放出阻害における切断型ホルモンの活性については、０ｒｓｋｏｖ、ＣらのＥｎｄｏｃｒ＋ｎｏｌ　（１９１１ｇ）　１２３：２００９−２０１３および５ｕｚｕｋｉ、　Ｓ。

らのＤＩａｂｅｔｅｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ：　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｔｃｅ　（１９８ｇ）　５（付録１）　：Ｓ３０に提示されている。これらの切断型の循環半減期は短く、Ｋｒ６ｙｍａｎｎらのＴｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ　（１９８７年１２月５日）　１３００〜１３０３に示されているように、約４分である。

これらの切断型ＧＬｐ−ｔペプチドの改変型によって、これらの特性が最適となる可能性が得られる。

肝臓および血漿中のペプチドホルモンの分解ならびに一般的なインビボでのこのようなホルモンの半減期の研究に関して幾つかの文献がある。ＭａｃＤｏｎａｌｄ、　Ｊ、に、らによる初期の文献Ｊ　Ｂｊｏ！　Ｃｈｅｌｌ（１９６９）　２４４：６１９９−６２０８では、ジペプチダーゼがラット肝臓中のグルカゴンの分解の原因であることが明らかにされた。成長ホルモン放出因子、即ち一般的なグルカゴンのＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２フアミリーのメンバーの研究により、このメンバーが、インビトロで血漿中において急速に分解されること、およびインビボでジペプチダーゼによっても急速に分解されることが明らかにされた（Ｆｒｏｈｔｘａｎ、　Ｌ、Ａ、ら、Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　（１９８６）　７８：９０５−９１３）。Ｍｕｒｐｈｙ、　Ｖｒ、Ａ、らは、旦ｅ　ｔｉｄｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８８）　Ｌ：３６−４１において、全てではないが幾つかのアルキル化された成長ホルモン放出因子ペプチドがインビボでさらに高い有効性を示すことを明らかにした。特に、例えば、トリインプロピル化されたＧＲＦ−２９は、ＧＲＦ−２９自体より１０６倍高い活性を示すことが発見された。一方、Ｎ末端がメチル化されたＧＲＦ−２９ではその有効性は親の僅か４０％であった。このホルモンの２位のＤ−Ａｌａの置換によってその有効性が同上することもまた明らかにされた。特性へのどのような効果によって有効性の向上が得られるのかは、当然明らかではなかった。

他に、ＧＬＰ−１（７−３７）の幾つかの改変が試みられている。７位のヒスチジン残基を欠失させるとこのホルモンの活性が大幅に低減されることが明らかにされている（Ｓｕｚｕｋｉ。

Ｓ、ら（前出）　；　Ｈｅｎｄｒｉｃｋ、　Ｇ、　Ｋ、ら、Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　５ｏｃｉｅｔ　Ｍｅｅｔｉ　Ｎｅｗ　０ｒｌｅａｎｓ　ＬＡ　（１９８８））。１個またはそれ以上のＣ末端欠失の効果については対立する報告がなされている（Ｓｕｚｕｋｉ、　Ｓ、ら（前出）　；　Ｙａｎａｉｂａｒａ、　Ｃ，ら、Ａｂｓｔｒａｃｔ　ｆｏｒＡ　Ｇｌｕ’ｃａ　ｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｐｅ　ｔｒｄｅｓ　５ａｔｅｌｌｉｔｅ　Ｓ　ｒｓ　ｏｓｉｕｍ、８ｔｈ　にｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９８８年７月１５−１６日、０ｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）。しかし、このペプチドホルモンファミリーの他のメンバー、例えば、Ｇ　Ｉ　Ｐ、グルカゴン放出因子（ＧＲＦ）、セクレチン、およびノくソアクティブ・インテステイナル・ポリペプチド（Ｖ　Ｉ　Ｐ）の改変に関する文献は多い。

茜１ヱ」」玉本発明は、ＧＬＰ−１（７−３４）；　（７−３５）；　（７−３６）もしくは（７−３７）ヒトペプチドの改変型またはこれらのＣ末端がアミド化された形態の改変型を提供する。天のアミノ酸配列を有しており、この配列中の（Ｇ）、（Ｒ）および（Ｇ）が存在するかどうかは、指示された鎖長による。

改変型では、天然の構造に１箇所またはそれ以上の改変が加えられており、治療に宵用な能力が向上して（する。これらの改変型では、グルカゴンよりもインスリン分泌を促進するための有効性が高いか、もしくは血漿中での安定性が同上しているか、またはその両方である。この有効性および向上した安定性は、以下に記載するように分析され得る。

アミノ酸には標準−文字略記コードを使用する。

インスリン刺激特性の同上を呈する本発明のアナログは、前記の配列またはそのＣ末端アミド化物に、以下からなる群から選択される少なくともひとつの改変を加えた配列を有する：（ａ）２６位および／もしくは３４位のりシンを、中性アミノ酸、アルギニンもしくはＤ型のりシンに、ならびに／または３６位のアルギニンを中性アミノ酸、リシンもしくはＤ型のアルギニンに置換；（ｂ）３１位のトリプトファンを耐酸化性アミノ酸に置換（Ｃ）以下の内の少なくともひとつの置換：１６位のＶをＹに；１８位の５−ｔ−Ｋに；２１位のＥをＤに；２２位のＧをＳに；２３位のＱをＲに：２４位のＡをＲに；および２６位のＫをＱに；（ｄ）以下の内の少なくともひとつの置換：８位のＡを他の小型中性アミノ酸に；９位のＥを他の酸性アミノ酸または中性アミノ酸に；１０位のＧを他の中性アミノ酸に；および１５位のＤを他の酸性アミノ酸に；ならびに（ｅ）７位のヒスチジンを、他の中性アミノ酸、あるいはＤあるいはＮアシル化またはＤあるいはＮアルキル化型のヒスチジンに置換。

（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）の改変に関しては、置換するアミノ酸は、Ｄ型であり得る。これは、例えばＣ′などのように上付き文字“で示される。７位において置換するアミノ酸はＮアシル化またはＮアルキル化型でもあり得る。

したがって、本発明は、そのひとつの局面において、上記のように、同上したインスリン刺激特性を育し、上述のＧＬＰ−１（７−３４）からＧＬＰ−１（７− ３７）までの切断型と相同性のあるペプチドに関する。

他の局面においては、本発明は、ＧＬＰ−１（７−３７）と比較して、血漿中での耐分解性が向上したペプチドに関する。

この同上した耐分解性は、以下に記載のように定義される。

これらのアナログでは、上記の切断型のＧＬＰ−１（７−３４）からＧＬＰ−１（７−３７）またはこれらのＣ末端アミド化型の内の何れかが、以下のように改変される。

（ａ）７位のＨをＤ中性もしくはＤ酸性アミノ酸に置換、または（ｂ）８位のＡをＤアミノ酸に置換、または（Ｃ）上記の双方の置換、または（ｄ）７位のＨを任意の自然のアミノ酸のＮアシル化型もしくはＮアルキル化型に置換。

したがって、耐分解性を冑する本発明のアナログとしては、（Ｎ−アシル（１− ｆ５ｃ）ＡＡ）’ＧＬＰ−１（７−３７）および（Ｎ−アルキル（１−６Ｃ）ＡＡ）　７ＧＬＰ−１（７−３７）がある。ここでＡＡは、リシル残基であり、１つまたは両方の窒素がアルキル化またはアシル化され得る。ＡＡは、インスリン刺激活性の保持に対応する任意のアミノ酸を示す。

７位および８位のＤ型アミノ酸の置換には、任意の酸性または中性アミノ酸のＤ残基を７位に、そして、任意のアミノ酸のＤ残基を８位に使用し得る。これらもまた、インスリン刺激活性に対応するものである。７位および８位の何れか一方または両方をＤアミノ酸に置換することができる；７位のＤアミノ酸を上記のようにアシル化またはアルキル化することもできる。これらの改変型は、上記のように、ＧＬＰ−１（７−３７）だけではなく、さらに短い切断型のアナログにも適用可能である。

他の局面では、本発明は、１種類またはそれ以上のこれらのペプチドを活性成分として含む薬学的組成物、およびこれらのペプチドまたはその組成物を用いてＩＩ型糖尿病を治療する方法に関する。

殴ｉ旦１！ユヱ里図１は、本明細書で使用するアミノ酸の分類の概略を模式％式％図２は、本発明の種々の化合物を表に示したものである。

図３は、血漿中の２種類のアナログの血漿中での分解を調べるためのラジオラベルシーケンシング分析の結果を示す。

図４は、アミノ末端領域に改変を加えたＧＬＰ−１（７−３７）のアナログによる、アミノ末端特異的抗血清からの１２５■−ＧＬＰ−１（７−３９）の置換の結果を示す。

１を　るための≦熊本発明のアナログは、ＧＬＰ−１（７−３４）、（７−３５）、（７−３８）または（７−３７）の改変型であって、その特徴は、培養物中の単離されたラット島細胞からのインスリン放８を測定するインビトＣでのアッセイでグルカゴンよりも高い有効性を呈すること、もしくは、血漿中での安定性の′向上を示すこと、またはこれらの両方である。

ｏ　したインスリン放　ｉＩ＋激、　を　るアナログの７ツ！ヱ本発明のアナログのひとつのグループは、島細胞からのインスリン放出を刺激するに際してグルカゴンよりも強力である。「島細胞からのインスリン放出を刺激するのにグルカゴンよりも強力」であるとは、言及するアナログが、以下の記述から選択されるインビトロでのアッセイにおいて、より高い有効性を呈することを意味する：これらのアッセイのためのう、ト島は、本ａ）￥納置に援用される５ｕｔｔｏｎ、　Ｒ，ラ６Ｄｋ組鉦１ａｎｔａｔｉｏｎ　（１９８６）　４２：６８９−６９１に記載の方法によって単離される。簡潔に記載すれば、ＳＤ雄クラット麻酔をかけて、その総胆管の下端に、適切な位置に固定した２ＦＧカニユーレを挿入する。次に、膵管の胆管ツ！Ｊ　−（ｂｉｌｉａｒｙ　ｔｒｅｅ）への入口領域の上方で左右の膵管を各々別個に結紮する。う、）を放血により殺して、７．５ｍＭのＣａＣｌ２．２０ａ＋ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液およびｌ〜Ｓａｇ１０＋Ｌの■型コラゲナーゼを含有する３ｍＬのハンクス液を、カニユーレ中に流入させて、膵臓を均一に膨張させる。次いで、膵臓を摘出し、氷上のビーカーに入れた後に、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を含有するハンクス液中で３７℃にてインキユベーションを行う。

インキュベーションを１３〜２５分間行った後に、膵臓を取り出し、５ｇ／】のつ／血清アルブミンおよび２０ｍＭの）（ＥＰＥＳ緩衝液を含有する４℃のハンクス液中に入れる。

そして、全ての膵臓組織を１４ＦＧ針を用いて静かにシリンジにとり、さらに、ＨＥＰＥＳを上記のように含有するハンクス液中に懸濁させて、１０秒間ＳＯｇで遠心分離した後に、上澄みを廃棄する。この組織ベレットを再度懸濁させて、再度静かに、シリンジにとり、その後さらに洗浄を行う。その後に、分散した組織を孔サイズ５００μのナイロンメツシュフィルターを通過させる。濾過した組織を３５０ｇで５秒間遠心分離し、上澄みを廃棄した後に、この組織を、ＨＥＰＥＳを上記のように含有するハンクス液に溶解して得た２５％のフィコール中に懸濁させる。このフィコール溶液には、２３％、２０％および１１％の不連続密度勾配の層が形成される。この密度勾配層を４℃にて１０分間７５０ｇで回転させる。そして、上の２つの界面から得られる組織をハンクス液中で３回洗浄した後に、切開用の顕微鏡で見て、島を手操作で採取する。

ひとつの方法では、次に、これらの島からの分泌を促進するＧＬＰ−１アナログの能力を、本明細書に援用される、５ｃｈａｔｚ、Ｈらの“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ″（１９８４）　のＶｏｌｕｍｅ　Ｌ　Ｐａｒｔ　Ｃ：２９１〜３０７ページに記載の方法によって決定する。この方法では、１本の試験管当り５個〜１０個の５をＩＩＩＩＬのクレブス−リンガー −バイカーボネート緩衝液（ＫＲＢｌｉ液）中でインキュベートする。試験を行うために、グルカゴンまたは本発明の改変型アナログを５〜１０μｇ／ｍＬの割合で加える。放出されたインスリンのレベルは、本明細書に援用されるＪｅｎｓｅｎ、　Ｓ、Ｌ、らのＬＬカニ旺虹（１９７８＞　２３５：Ｅ３８１−Ｅ３８６に記載の方法で測定され得る。

以下のプロトコールは、インスリン分泌刺激を測定するのに好ましい方法である。コラゲナーゼ消化の後に、島を、ＤＭＥＭ　（ダルベツコの変法イーグル培地、　１６ｗ１０グルコース）、２．８ｍＭグルコースおよび１０％のウシ胎児血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ）中で、５％のＣＯ２存在下で、３７℃にて一晩インキコベートすることにより、回収した。

翌日、実験に使用する島を、グルコースを含まず、０．２％のＢ　Ｓ　Ａ　（Ａｒｍｏｕｒ、臨床グレード、５％ストックで作製）を含有するＤＭＥＭに移し、血清およびグルコースを含まない培地で６０分間ブレインキュベートした。エッペンドルフピペットを用いて小島を採取し、８．ｈＬの培地を含有する６０＋ａｍのＴＣプレートに移して、インキ１ベーターに戻して６０分間インキュベートする。この島を移す際に、その数を数える。　（注：各データ点は、５ｍの島によるものであり、通常各４＠の実験を行う。したがって、各データ点に対して２０個の島を使用する。）典型的には、各膵臓に対して１５０〜２００個の小島を回収する。疑わしい島（崩れすぎているかまたは崩壊したもの）は使用されない。

この６０分のプレインキュベージコンの間に、実験準備を行うため、プレインキュベージコン終了時には、島を５ＩＩづつのグループにして実験条件下に移すだけでよい。実験の準備は、４８個のウェルを有するＴＣプレートにおいて各ウェルにつき０．５ｍＬの培地を用いて行う。０．２％のＢＳＡを含有するＤＭＥＭに、グルコースを所望の濃度になるように（通常低血糖条件で２．８１Ｍ％中血糖で５．５ｗＭのグルコース、または高血糖で１６．７ｍＭのグルコース）加え、さらに、試験化合物を種々の用量範囲（典型的には１ｐＭ〜１０１００ｎで加える。試験化合物を、−８０℃で保存されたストックから、０．２％のＢＳＡを含有する燐酸緩衝塩水（ＰＢＳ）で〜Ｑ、　３ｍＭまで系列希釈する。これは、管の側面上における損失を防止するためである。培地と試験化合物とを混合した後に、各４回の実験ｌこよるデータ点を得るための４個のウェルの各々に０．５ｍＬを加える。

プレイン牛１ベージ璽ン期間終了後、各ウェルに５１１Ｎの島を加える。島を容量２５μｌでエッペンドルフビベットを用いて採取する。インキユベーシヨンをさらに６０分ｌ５ｆｆｉｌ続し、その時点で、島を取り出さないように注意深く各ウェルから０．３ｍＬを採取する。そして、ウェルを再変調べて、島の数を確認する。次に、インスリン含有量を調べるためにインスリンＲＩＡを用いて培地をアッセイする。培地を直ちにアッセイしない場合には、アッセイ時まで一２０ ℃で保存される。インスリン分泌に対する用量応答曲線を作成して、これらの曲線からＥＤｓ、を計真する。

グルカゴンより高い有効性の定義は、同じ濃度のグルカゴンとアナログとを用いた場合にアナログからのインスリン放出レベルの方が高いこと、あるいは、グルカゴンよりも低濃度のアナログを用いた場合に同じインスリン放出レベルが得られることであるとされる。

上記のアッセイは、向上した有効性の判断のために特異的な基準を提供するが、上記のものに代わる他のアッセイを使用することもできる。

本発明の化合物の有効性を調べる追加の試験では、ＲＩＮ１０４６−３８細胞中のｃＡＭＰ産生を刺激するこれらの化合物の能力を測定する。このアッセイは、以下のように行われ得る。

第１５百に、５　ｘ　１０５のＲＩ　Ｎ　１０４６−３８細胞（Ｄｒｕｃｋｅｒ、　Ｄ。

Ｊ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８７）　８４：３４３４−３４３８）　を、２、５ｉＬ、のＭＩ９９培地を入れた６個のウェル付きのディフシニの各ウェルに植え付ける。第４Ｂａに、細胞に新しい培地を与えて、第５日に、アッセイを行う。

この時、各ウェルには〜２．０〜２．５　ｘ　１０’個の細胞が存在する。アッセイは、継代が２４回以下の細胞でのみ行われる。

開始６０分前に、単分子層を２．５ｉＬのＰＢＳで２回洗浄し、培地を、４．５ｇ／ｌのグルコースおよび０．１％のＢＳＡを加えたＤＭ　Ｅ　Ｍ培地（アッセイ培地）　１．ｏｍｌに変える。開始０時の時点で、培地を吸引して、試験化合物を含有する１、Ｏａ＋Ｌの新しい７ノセイ培地を加える。試験化合物は、Ｏ，ＬＸのＢＳＡを加えた５０μｌのＰＢＳ中に加えられ、コントロールは賦形剤のみに加えられる。インキニベーションを０〜６０分間継続する。

終了時に、馴化培地および単分子層を採取して、細胞内および細胞外のｃＡＭＰ含有量を測定する。細胞外測定では、培地を取り出して遠心分離し、細胞残留物を全て除去する。

細胞内測定では、培地を取り出した後に、１．０ｉＬの水冷９５％エタノールを単分子層に加える。細胞をかき取って回収し、液体Ｎ２を用いて２回の高速凍結／解凍サイクルにより溶解させる。次いで遠心分離によって細胞残留物を除去する。馴化培地の等分量部分（ウェルの内容量の１／４０）およびエタノールによる細胞抽出物について、ＲＩＡキットを用いてアセチル化プロトコールにより２回測定を行い、ｃＡＭＰレベルを調べる。

上記と同様に、グルカゴンより高い有効性の定義は、同じ濃度のアナログおよびグルカゴンを用いた場合に高いｃＡＭＰ刺激が得られること、または、アナログの濃度をより低くした場合に同上ｃＡＭＰ刺激が得られることとされる。

インスリン放出を媒介する向上した有効性を測定するための他のアッセイが、使用され得る。

インスリン放出を促進する化合物の能力は、インビトロおよびインビボの両方で試験され得る。放出されたインスリンを標準抗体アッセイを用いて検出できる。

このアッセイは、インビボでの研究で血漿を分析すること、および、インビトロで培地またはＮ１ｔｉｆｃ液を分析することによって行う。

例えば、有用なインビトロでのアッセイに、Ｐｅｎｈｏｓ、　Ｊ、ＣらのＤｉａｂｅｔｅｓ　（１９６９）　１８＋７３３−７３１に記載の膵臓温浸アッセイ法（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　１ｎｆｕｓｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｍａｔｈｅｄ）が使用される＠　これは、Ｗｅｉｒ、　Ｇ、Ｃ，らのＪ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｒｓｔｉ　ａｔ　（１９７４）　５４：Ｌ４０３−１４１２に記載の方法で使用されているように行われる。インスリン分泌は、Ｈｏ１ｓｔ、　Ｊ、Ｊ、らのＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１９８７）　２１ユニ１６９−１７４（前出）に記載の方法によっても測定され得る。インスリン刺激効果を調べるアッセイとして有用なものとして、ＲＩＮ　１０４６−３８８胞系中のアデニル酸シクラーゼ刺激の測定がある。

Ｄｒｕｃｋｅｒ、　Ｄ、Ｊ、らのＰｒｏｃ　１Ｊａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８７）　８４：３４３４−３４３８　（前出）。

グルカゴン放出の阻害は、０ｒｓｔｏｖ、　ＣらのＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　（１９８８）　１２３：２００９−２０１３；　５ｕｚｕｋｉ、ＳらのＤｉａｂｅｔｅｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ：　Ｃ１１ｎＩｃａＩ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　（１９８ｇ）　ｃＬ（付録１）：Ｓ３０　（双方とも前出）に記載のように、明らかにされ得る。

に・　る口　した　性を−べるアッセイ本発明のＧＬＰ−１アナログの治療効率は、アナログのインビボでの半減期を増加させることによっても同上させ得る。

「増加したインビボでの半減期」とは、以下に記載のものからなる群から選択されるアッセイに従って血漿存在下での分解に耐えると実証された能力を意味する。全てのアッセイにおいて、血液をヘパリン処理した管に果めて、これらの管を氷上に静置し、約３．　ＯＯＯｒｐｍで１０分間、卓上遠心分難機で遠心分離することによって、血漿を調製する。単離した血漿を４°Ｃで保存する。

Ａ、ラジオラベルシーケンシング：ＧＬＰアナログを、標準ラジオラベリング法を用いて、１９位における放射性ヨウ素化によって標識する。ＲＩＡ緩衝液（ＳｈＭ、　ｐＨ７，４のＮａ１ｌＰＯ４、Ｃ１，２５％のＢ　Ｓ　Ａ　（ＡｒｒｉｏｕｒインスリンおよびＦＦＡを含まない）、０．５％のＢＭＥ、　０．００２％のポリリシン（Ｓｉｇｍａ　１５，０００ａ＋ｖ）、０．０５１のＴｖｅｅｎ２０、および０．１１のＮａＮ５）に移した後に、放射性ヨウ素化ペプチド（約１０５ｃｐ＋ｍ１５０ｍＬ）およびコールド（放射性物質を含まない）非ヨウ素化ペプチド（２０μｍ　１ＱＯｎＭ）を、２ｓｔの血漿に加えて、最終的に濃度を１ｎＭとして、循環水浴中で所定の時間インキ１ベートする。

血漿に加えたＲＩＡバフファーの総量は、必ず総体積の５罵以下である。インキ１ベージ１ン終了時に、水中の１０％のバシトラシン（ｗ／ｙ）を最終濃度が０，１％になるように加えて反応を停止させる。

次に、Ｃ１ｇ　５ｅｐ−Ｐｚｋを用いてこの血漿を抽出して、血漿タンパク質のバルクからアナログと全てのフラグメントを分離する。　５ｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（ｖ／ａｔｅｒｓ）を、２ｉＬの１−プロパツールで洗浄し、次いで２ＩＩＬの水で洗浄して、その後に、２ｉＬの、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する２０％のＣＨ３ＣＮ（緩衝液Ａ）で平衡化する。

バシトラシンで処理された血漿を、０．１駕のＴＦＡを含有するＣＨ３ＣＮを用いて２０％のＣＨ３ＣＮで得る。そして、これを３ｍＬのプラスチック注射器を介してカートリッジを通して穏やかに通過させる。次に、カートリッジを、１ｍＬの緩衝液Ａを各々洗浄液として用いて２回洗浄し、そして、２＋ｉＬの、０．１％Ｔ　ＦＡを含有する５０％ＣＨｓＣＮ　（緩衝液Ｂ）を洗浄液として用いて溶出し、これを、シリコーン処理をした１２　ｘ　７５のガラス管ｌこ流入させる。アナログまたはフラグメントの回収率は、９０％を越える。

溶出液を、５ｐｅｅｄ　ｖａｃ中でＩＱＱｔｔｌ　までｉｉｌ＊して、もとの管１７）１ｍＬのＲＩＡ緩衝液の洗浄液を加えた１、　５ｍＬのエッペンドルフ管に移す。

ＧＬＰ−１（７−３７）のアナログを使用する場合に任意のアナログまたはそのフラグメントを精製するために、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１（７−３７）を認識するがＧＬＰ−１（７−３６）を認識しない、２４〜３７位の残基に対応する合成ペプチドに対して調製された、５μｌの抗血清で濃縮物を、処理する。より短い型のアナログを使用する場合には、他のカルボキシ末端特異的抗血清（同様にして調製されるが、免疫原として２４〜３４位、２４〜３５位または２４〜３６位の残基に対応するペプチドが用いられる）を使用する。これに、ＰＢＳ中に１０％（Ｗ／Ｖ）のタンパク質Ａ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を溶解した１００μｍの溶液を加え、この混合物を静かに揺り動かしつつ４℃にて一晩かけてインキュベートした。次いで、セファロースを、工１ベンドルフ遠心分離機中で５秒間４℃にて回転させて、ペレット状にして、その後にこのペレットを、冷ＲＩＡ緩衝液を用いて２回、冷ＰＢＳを用いて４回洗浄する。

ニニージーランドホワイトラビットの体内で、ＧＬＰ−１（７−３７）の２４〜３７位の残基に対応する合成ペプチドフラグメントに対するポリクローナル抗体を誘起させた。この誘起には、Ｍｏ５ｊｏｙ、　ＳらのＪ　Ｂｌｏｌ　Ｃｈａｍ　（１９８６）２６１：１１ｇ８Ｇ−１１８８９に記載の方法を用いた。初期免疫感作を、鼠径部リンパ節中に行い、完全フロインドアジユバントを使用した。

初期免疫感作の後に、１週間毎に皮下追加免疫注射（ｂｏｏｓｔｓ）を２回行い、不完全フロインドアジユバントを使用した。１回の免疫感作または追加免疫注射のために、１００μｇのペプチドおよび１００μｇのメチル化されたＢＳＡを０．３ｒａＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解し、これを０．９ｍＬのアジ１バントで乳化させた。初期免疫感作から６週間後に、採血（５０ｍＬ）を開始し、その後、１ケ月ごとに行った。力価が前回の採血時に比べて顕著に低下した場合には、追加免疫注射を再度上記のように行った。

血液を４℃で一晩かけて凝結させることによって、血清を調製した。血餅を、２０００ｇで１５分間遠心分離することによってペレット状にして、血清を取り出した。血清を、各々同じ量になるように分割し、−２０℃または一８０℃で保存する。

次に、各１００μｌの緩衝液Ｂの洗浄液を用いて、抗体タンパク質−Ａセファａ −ス複合体からのペプチドの溶出を３回行う。

次に、全体で３００μＩとなった洗浄液をＡＢＩ型４７７Ａシーケンサ−に直接かける。シーケンサ−は、製造者の指示書に従って使用される。その後、各サイクルで得られる両分を取って、カウントを行う。カウントは、４ｍＬのシンチレーション水溶液（ＡＣＳ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で行われ得る。

標識が出現するサイクルは、Ｎ末端からの分解の程度を示す。ＧＬＰ−１（７− ３７）アナログにおいてＮ末端からの分解が生じない場合には、１９位のチロシンに対応する１３番口のサイクルで全ての標識が出現する。分解が生じると、標識はこれより前のサイクルに出現する。

Ｂ、ＲＰ−ＨＰＬＣによるアッセイ：上記の方法は、血漿中でのより長い半減期を示すための明らかな基準となるが、この特性を調べるための他のアッセイ形態を使用することもできる。ある好適なアッセイでは、逆相−ＨＰＬＣを使用してアナログを分析することによってフラグメントへの分解を調べることができる。なぜならば、フラグメントがアナログ自体とは異なる保持時間を有するからである。このアッセイでは、アナログを血漿中に加え、これを放置する時間を様々に変えて、ラジオラベルシーケンシング分析に使用される上記の方法と類似の態様でアナログを回収する。具体的には、ＲＩＡ緩衝液中の１１００ｎの濃度のアナログを１ｍＬの血漿中に入れて、最終的な濃度を１ｎＭとし、これを３７℃の循環水浴中で設定時間を様々に変えてインキュベートする。その後に、血漿をバシトラシン中で濃度０．１％（Ｗ／Ｖ）にすることによって、反応を停止させる。

次いで、ペプチドを上記のように５ｅｐ−Ｐａｋ抽出によって精製する。溶出液を５ｐｅｅｄ−ｖａｃ上で約１＊Ｌまで濃縮し、１ｍＬの蒸留水で希釈し、８０ ℃で凍結させて、−晩凍結乾燥させる。この粉体を、１ｍＬの出発血漿当りＯ，Ｓｔの緩衝液Ｃ（０，１％のＴＦＡ水溶液）中で、再度懸濁させた後に、０．２５＋＊ＬをＨｅｖｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　１０９０１Ｊ体クロマトグラフ上に注入する。液体クロマトグラフには、Ｂｒｏｖｎｌｅｅの２ｃｍのＣ１８ガードカラムと共にＡ１１ｔｅｃｈ　Ｃ１８カラム（０，４５！　２５　ｃＩｌ；粒径１０μｍ）を使用する。実験中ずつと０Ｄ２１４において抽出をモニターする。溶媒の流速は１ｍＬ／分であった。緩衝液Ｃと緩衝液Ｄ（アセトニトリル中の０．１２のＴＦＡ）との間の勾配を４０分間の実験時間に渡って設定する。勾配は、開始時に３５ＸＤとし、注入後２分間はこれを維持し、その後の２４分間で４２＄Ｄまで増加させる。勾配を、次の２分間で６０ＸＤまで増加させて、２分間このレベルを維持し、その次の２分間で３５ＸＤに戻す。実験の残りの８分間は３５ＸＤに維持する。各実験の最初の３０分間に、画分を０１５分毎に回収して、５ｐｅｅｄ−ｖａｅ中で乾燥する。試料を、ＲｒＡ（Ｃ末端特異的抗血清に対する結合のための、標識されたＧＬＰ−１（７−３７位）との競合を測定する）によって、または、従来のもしくは好適な他の何れかの方法で分析して、アナログまたはフラグメントの存在を調べることができる。

ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ末端もしくはカルボキシル末端を調べるためのラジオイムノアッセイでは、シングルの抗体置換フォーマットを使用する。抗体への１２５Ｉ−ＧＬＰ　−１（７−３７）の結合が、溶液中の非標識ペプチドの濃度を増加させることによって、徐々に置換される。抗体と結合したヨウ素化ペプチドを、溶液中の遊離ヨウ素化ペプチドから分離する０この分離は、ＰａｎｓｏｒｂｉｎＴＭ（Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて抗体−ペプチド複合体を沈澱させることによって行われる。次いで、得られたベレットを、γカウンタによって力血漿中での半減期を評価する第３の方法では、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体が眉いられる。これらの抗体は、Ｎ末端に対して特異的に調製され、分解したアナログには結合しない。これらの抗血清は、ＧＬＰ−１（７−２２ンに対応する合成ペプチドに対して誘起された。このＧＬＰ−１（７−２２）は、カルボ牛シル末端に付加的なシスティン残基を含有し、しかも、このシスティンを介してＫＬＨに特異的に結合する。この結合は、Ａｌｄｖｉｎ、　Ｌ、らのＡｎａｌ　ｔｉｃａｌ　Ｂｉ。

ｃｈｅｗ　（１９８７）　１６４：４９４−５０１に記載されているように、ｍａｌ−ｓａｃ−Ｅ［５ＩＪＡを用いて行われる。ポリクローナル抗体は、二ニーシーラントホワイトラビットの体内で生成された。この生成のために、完全フロイントアジ−パントで乳化させた５００μｇの複合体を用いて一次免疫惑作を翼径部リンパ節中に行い、その後に、２週間毎に不完全フロイントアジ−パント中の各２００μｇの追加免疫注射を２回行った。その後に、１ケ月毎に採血（ＳＯ ■Ｌ）を行い、力価が低い場合には、追加免疫注射を行う。

モノクローナル抗体の生成では、Ｂａ１ｂ／ｃマウスに、０．５ｍｌの完全フロイントアジコバント中の２００μｇの複合体を腹膜を介して注入して免疫処置した。０．５ｍｌの不完全フロイントアジ１バント中の１００μｇの複合体を隔週でマウスに追加免疫注射した。

これらのマウスの膵臓から単離した細胞をＦｏχ−ＮＹ細胞と融合させて、モノクローナル細胞系を産生じた。モノクローナル分泌細胞系は、標準ケーラー−ミルシニタイン技術を用いて産生される。モノクローナル上澄みおよびポリクローナル血清を、ＥＬ　ＩＳＡ法を眉いてふるい分けすることによって、ＧＬＰ−１（７−３７）と結合しているがＧＬＰ−１（１３−３７’）と結合していないものを得る。この特異性は、標準溶液相ＲＩＡによって確認される。

ＧＬＰ−１（７−３７）の分解速度の評価を、ＲｒＡｐ衝液中のヒト血漿にこのアナログを加えることによって行う。一般に、１００倍に濃縮された１０μＬのペプチドを１ｍＬの血漿に加えて所望の濃度とする。次いで、この試料を３７℃ の湯浴中でインキ、ベートし、様々な時点で各５０μＬの試料部分を３回づつ取り出す。これらの試料部分を、直ちにエタノールを用いて沈澱させて、ラジオイムノアッセイを行う。ラジオイムノアッセイでは、Ｎ末端特異的抗体の、放射性ヨウ素化されたＧＬＰ−１（７−３７）との結合のための競合を用いる。放射性コラ素化されたＧＬＰ−１（７−３７）ペプチドと競合する能力の消失は、アナログの分離を示す。

これらの何れのアプセイにおいても、試験されるアナログの分解速度がＧＬＰ− １（７−３７）に比べて小さい場合には、そのアナログは向上した安定性を有している。

アナログ本発明のアナログは、グルカゴンに比べて高い有効性を有するか、あるいは向上した耐分解性を有しており、ＧＬＰ−１（７−３４）からＧＬＰ−１（７−３７）の改変型である。これらのアナログのい（つかの例では、あるクラスのアミノ酸が天然の残基の代わりに置換される。

アミノ酸残基は、以下のように、および図１に示すように、一般的に４つの主要なサブクラスに分類され得る。

酸性：この残基は生理学的ｐＨにおいてＨイオンが消失しているために負の電荷を有する。この残基を含むペプチドが生理学的ｐＨで水性溶媒中に存在している時には、この残基はペプチドのコンフｔメーシ１ン中の表面位置をめて水溶液側に引き付けられる。

塩基性：この残基は生理学的ｐＨにおいてＨイオンと結合しているために正の電荷を宵する。この残基を含むペプチドが生理学的ｐＨで水性溶媒中に存在している時には、この残基はペプチドのコンフォメーション中の表面位置をメて水溶液側に引き付けられる。

中性／非極性：これらの残基は生理学的ｐＨにおいて帯電していない。この残基を含むペプチドが水性溶媒中に存在している時に、この残基はペプチドのコンフォノ−シコン中の内側の位置をめて水溶液と反発する。これらの残基は、本明細書中では「疎水性」とも称する。

中性／極性：これらの残基は生理学的ｐＨにおいて帯電していない。しかし、この残基を含むペプチドが水性溶媒中に存在している時には、この残基はペプチドのコンフォメーション中の外側の位置をめて水溶液側に引き付けられる。

個々の残基分子の統計的な集合の中には、帯電しているものも帯電していないものもあり、水性溶媒に引き付けられるかまたはこれと反発する程度が大きい場合あるいは小さい場合があることは、当然理解されるものである。「帯電している」の定義に適合するには、かなりの割合（少なくとも約２５％）の個々の分子が生理学的ｐＨで帯電している。極性または非極性の分類に必要な引き付けまたは反発の程度は任意のものであり、したがって、本発明により特異的に考案されたアミノ酸は、極性または非極性の何れかに特異的に分類された。

特に挙げられていない殆どのアミノ酸は、既知の性質に基づいて分類され得る。

アミノ酸残基は、さらに、環式または非環式、芳香族または非芳香族、および小型または大型として分類される。環式または非環式、および芳香族または非芳香族という分類は、残基の側鎖置換基に関する独特な分類である。残基が、カルボ牛シルの炭素を含む合計４個以下の炭素原子を含有する場合には、小型と考えられる。小型の残基は、当然、常に非芳香族である。

天然のタンパク質アミノ酸については、上記の理論大系に従う下位分類は以下の通りである（１！ＩＩも参照のこと）。

１里：アスパラギン酸およびグルタミン酸；饗１１乙生！蓋：アルギニン、リシン；襄（血Ｚ！里：ヒスチジン：７％　ニゲリシン、セリンおよびシスティン；性大型　族：トレオニン、アスパラギン、グルタミン；：チロシン；中　性　ハ型：アラニン；：バリン、インロイシン、ロイシン、メチオニン；中　非　性　大型　族：フェニルアラニンおよびトリプトファン。

遺伝子にコードされたアミノ酸プロリンは、技術的には中性／非極性／大型／環式および非芳香族のグループに入る。

しかし、ペプチド鎖の２次コンホメーシテンへのこのアミノ酸の既知の効果のために特殊なケースとなり、したがって、この特定の定義されたグループには入らない。

ある種のよく見られるアミノ酸は、遺伝子コードでフードされない。

このようなアミノ酸としては、例えば、β−アラニン（β−ａｌａ）　、または３−アミノプロピオン酸、４−７ミノ酪酸などの他のω−アミノ酸、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）　、サルコシン（Ｓａｒ）　、オルニシン（Ｏｒｎ）　、シトルリン（Ｃｉｔ）　、ホモアルギニン（Ｈａｒ）　、ｔ−ブチルアラニン（ｔ −ＢｕＡ）　、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）　、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−Ｍａｉｌｇ）　、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）　、およびシクロへキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システィン酸（Ｃｙａ）並びにメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）がある。これらもまた、適切に特定のカテゴリーに属する。

上記の定義に基づいて、Ｓａｒおよびβ−ａｌａは中性／非極性／小型であり；ｔ−ＢｕＡ、　ｔ−ＢｕＧ、　Ｎ−Ｍｅｌｌｅｓ　ＨｌｅおよびＣｈａは、中性／非極性／大型／非芳香族であり；ＨａｒおよびＯｒｎは塩基性／非環式であり；Ｃｙａは酸性であり；Ｃｉｔ、アセチルＬｙｓ、およびＭＳＯは、中性／極性／大型／非芳香族であり；そして、Ｐｈｇは、中性／非極性／大型／芳香族である。

図１も膠原のこと。

種々のω−アミノ酸は、サイズによって、中性／非極性／小盟（β−ａｌａ、即ち、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸）または大型（その地金てのω− アミノ酸）に分類される。

遺伝子にコードされたアミノ酸に代わる他のアミノ酸置換物もまた、本発明の範囲のペプチド化合物に含まれ、この一般理論大系の範囲で分類され得る。

本発明のＧＬＰ−１アナログ化合物の記載に使用する命名は、ペプチド中の各アミノ酸の左にアミン基、右にカルボキシ基があると仮定する従来の命名法に従う。本発明の選択された特異的な実施態様を表示する式において、アミノおよびカルボキシ末端基は、多くの場合特に示していないが、他に明示していない限り、生理学的ｐＨ値において呈するであろう形態をとることは理解される。したがって、生理学的ｐＨにおけるＮ末端Ｈ中２およびＣ末端０−は、必ずしも明示および図示されているわけではないが、特定の実施例または一般式中で存在すると理解される。

上記の説明は、中性ｐＨでの末端の状態に関するものであるが、ペプチドの酸性付加塩または塩基性塩もまた本発明の範囲に含まれる。高いｐＨでは、Ｃ末端およびカルボキシルを含有する側鎖の塩基性塩が、毒性のない薬学的に許容可能な塩基から形成され得る。適切な逆のイオンとして、例えばＮａ”、Ｋ１、Ｃａ” ＋などがある。適切な薬学的に許容可能な毒性のない有機陽イオンもまた、逆のイオンとして使用できる。さらに、上記のように、ペプチドが、対応するアミドとして調製され得る。

Ｎ末端またはアミノ基含有側鎖に関する適切な酸性付加塩としては、塩酸、硫酸、もしくははリン酸などの無機酸から形成される虐、および、酢酸、クエン酸などの有機酸または他の薬学的に許容可能な毒性のない酸から形成される塩がある。

提示されるペプチドでは、コードされた各残基は、適切な位置で、以下の従来の表に従って、アミノ酸の慣用名に対応する一文字表記によって表示される。

（以下余白）二土ｌ望　ニスＪり１豆アスパラギン　Ｎアスパラギン酸　Ｄグルタミン酸　Ｅバリン　Ｖ遺伝子的にコードされていないアミノ酸は、前述のように略記される。

本出願の特異的なペプチドは、上付き文字のダガー（↑）によって他に明示しない限りは、光学異性体を有するＬ型の何れかのアミノ酸残基を意味するものとする。本発明のペプチドのアナログ中の残基は、通常、天然り光学異性体型である。

ただし、１個または２個の、好ましくは１個のアミノ酸が、天然のアミノ酸に代わって置換される特定の「同一アミノ酸のＤ型」の他に、Ｄ配置となり得る。

特異的なアナログの指定に側層する表記法では、改変された位置を、置換アミノ酸に対する上付き文字として示す。したがって、（Ｈｔ）　７−ＧＬＰ−１（７〜３７）は、表示されたＧＬＰ−１（７〜３７）において、７位がＤ型のヒスチジンに置換された形態テある。Ｃ５’）”（Ｒ）”（Ｒ）”（Ｑ）　２６−ＧＬＰ−１（７〜３７）は、７〜３７のＧＬＰにおいて、２２位でセリンに、２３位および２４位でアルギニンに、さらに２６位でグルタミンに置換された形態である。

圧ｌ旦と爽ｌ豊！Ａ、ロ　した　゛　を　るアナログ向上したインスリン刺激活性を有するアナログに関して、本発明の特に好ましいアナログ組成物は、Ｇ　Ｌ　Ｐ−１の切断型に比べて、限られた数の改変または置換が行われているのみのものである。したがって、好ましいアナログは、発明の開示の節で上述した段落（ａ）〜（ｅ）の内の僅か１つまたは２つの段落に記載の改変が行われているものである。

したがって、本発明の好ましいアナログとしては、（７〜３４）、（７〜３５）、（７〜３６）または（７〜３７）の形態のＧ　Ｌ　Ｐ−１において、２６位および／もしくは３４位のりシンを中性アミノ酸、アルギニンもしくはＤ型のりシンに、並びに／または３６位のアルギニンを中性アミノ酸、リジンもしくはＤ型のアルギニンに置換した（段落（ａ））だけのものがある。特に好ましいものでは、２６位および３４位のりシンに代わって置換されるアミノ酸が、Ｋｔ、Ｇ、ＳＳＡ。

Ｌ、Ｉ、Ｑ、Ｒ，ＲｔおよびＭからなる群より選択され、かつ３６位のアルギニンに代わって置換されるアミノ酸が、ＫｓＫｔ、Ｇ、Ｓ、ＡＳＬ、Ｉ、Ｑ、ＭおよびＲｔからなる群より選択される。

３１位のトリプトファンに代えて耐酸化性アミノ酸に置換することのみによって改変したアナログもまた好ましい（段落（ｂ））。特に好ましい置換アミノ酸は、ＦＳＶ、Ｌ、Ｉ。

ＡおよびＹからなる群より選択される。

段落（ｃ）に記載の特異的な置換のうちの少なくとも１種類による改変のみを行ったアナログもまた好ましい。特に好ましいアナログでは、２２位のＧがＳに、２３位のＱおよび２４位のＡがＲに、かつ２６位のＫがＱに全て置換されているか、または、１６位のＶがＹに、かつ１８位のＳがＫに置換されているか、あるいは、これらの置換に加えて２１位のＥがＤに置換されている。

段落（ｄ）に記載の改変のみを行ったアナログもまた好ましい。これらのアナログの内の特に好ましいものにおいては、８位のアラニンに代えて置換される小型の中性アミノ酸が、５ＳＳｔ、Ｇ、Ｃ，Ｃｔｓ　５ａｒＳＡｔ、β−ａｌａおよびＡｉｂからなる群より選択され；並びに／または、９位のグルタミン酸に代えて置換される酸性もしくは中性アミノ酸が、Ｅｔ、Ｄ％Ｄｔ１Ｃｙａ、　Ｔ、　Ｔｔ、　Ｎ、　Ｎｔ％Ｑ、　Ｑｔ、　Ｃｉｔ、　ＭＳＯおよびアセチル−Ｋからなる群より選択され；並びに／または、１０位のグリシンに代えて置換される他の中性アミノ酸が、ｓ、ｓｔ、ｙ。

ｙｔ、　’ｒ、　７ｔ、　Ｎ％Ｎｔ、Ｑ、Ｑｔ％Ｃ１ｔｓ　ＭＳＯ，アセチル− Ｋ。

ＦおよびＦ　からなる群より選択され；並びに／または、１５位のＥがＤに置換される。

７位のみが改変された（段落（ｅ））アナログもまた好ましい。好ましい置換では、７位のヒスチジンに代えて置換されるアミノ酸が、Ｈｔ、　Ｙｓ　ＹｆＳＦ、　Ｆｔ、　Ｒ，Ｒｔ％　０ｒｎｓ　。

ｒｎｔＳＭＳ　Ｍｔ、Ｎ−ホルミル−Ｈ，Ｎ−ホルミル−Ｈｔ、Ｎ−アセチル− Ｈ，Ｎ−アセチル−Ｈｉ、Ｎ−イソプロピル−Ｈ，Ｎ−イソプロピル−Ｈｔ、Ｎ −アセチル−に、Ｎ−アセチル−Ｋｔ％ＰおよびＰｔからなる群より選択される。

以下の特異的な実施態様に加えて、上記の改変型のクラスの僅か２種類の組み合わせを育する実施態様もまた好ましい。

以下の特異的なアナログが好ましい。

（Ｈｉ）　７−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（Ｙ）　７−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（Ｎ−アセチル−Ｈ）　７−Ｇ　Ｌ　Ｐ−１（７〜３７）；（Ｎ−イソプロピル−Ｈ）　７−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（Ａ↑’）’−ＧＬＰ−１　（７〜３７）；（Ｅｔ）　９−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（Ｄ）’−ＧＬＰ−１　（７〜３７）；（Ｄ↑）　９−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（１丁）”−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（Ｓ）　２２（Ｒ）　２３（Ｒ）”　（Ｑ）　２６−Ｇ　Ｌ　Ｐ−１（７〜３７）（Ｓ）’（Ｑ）　９（Ｙ）　１６（Ｋ）”（Ｄ）”−ＧＬＰ−１（７向上した安定性を宵するアナログの好ましい形態においてもまた、僅か１種類、または多くとも２種類のアミノ酸改変が行われている。

７位のヒスチジンに代えて置換される好ましいものとしては、Ｄ型の酸性もしくは中性アミノ酸またはＤ型のヒスチジンがある。Ｐｆ、Ｄｒ、Ｅｔ、Ｎ↑、Ｑｔ、Ｌ↑、Ｖｔ、ＩすおよびＨ７が好ましい。

７位のヒスチジン、またはこれと置換されたアミノ酸（ＤもしくはＬ）もまた、Ｎアルキル化（１−６Ｃ）またはＮアシル化（１−６Ｃ）され得る。

アルキル基は、Ｃで示されたメンバーの、直鎖または枝分かれ鎖（環式を含む）のヒドロカルビル（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｙｌ）残基である。アシル基は、式ＲＣＯ−で示され、式中、Ｒは上に定義したように、アルキルである。好ましいアルキル基は、ｔ−プロピル、α−プロピルおよびエチルであり、好ましいアシルは、アセチルおよびプロピオニルである。アルキル化もしくはアシル化され得る好ましい残基としては、ＤもしくはＬ型の、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、におよびＨがある。

８位のアラニンに代えて置換される好ましいものとしては、Ｄｆｉ（７）ＰＳＶＳ　Ｌ、ｒおよびＡがある。Ｄｍ（ＤＤ、Ｅ、Ｎ。

Ｑ、に、Ｔ、ＳおよびＨもまた好ましい。

以下に実証されるように、ある特定のアナログの中には向上したインスリン放出刺激活性と向上した安定性との両方を呈するものがあることは理解される。

■ 本発明のアナログは、ペプチド合成のための標準固相技術を用いて調製され得る。一般に知られているように、必要な長さのペプチドは、市販の器具および試薬を用いて調製され得る。その際には、製造業者の指示書に従って、妨害基の阻止、反応するアミノ酸の保護、反応しない残基のカップリング、脱保護、およびキャッピングが行われる。適切な器具は、例えば、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａのＡｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｗｓまたはＳａｎ　Ｒａｐｈａｅｌ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａの旧ｏｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手され得る。

好ましい方法では、ｍ＊自動固相合成プロトコルを眉いてペプチドが合成され、その際には、適切に側鎖を保護されたｔ−ブトキシカルボニル−α−アミノ酸を使用する。完成したペプチドを、標準７）化水素法を用いて、固相支持体から除去し、同時に側鎖の脱保護を行う。粗ペプチドを、さらに、半予備逆相−ＨＰ　Ｌ　Ｃ（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）　（Ｖｙｄａｃ　Ｃ１ａ）によって、０．１ｚのトリフルオロ詐＃（ＴＦＡ）中のアセトニトリル勾配を用いて精製する。ペプチドを真空乾燥させることによりアセトニトリルを除去し、そして、０．１％ＴＦＡ水溶液から凍結乾燥させる。純度を分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって確認する。ペプチドを、凍結乾燥させて、水またはＯ，ＯＩＭの酢酸中に重量１〜２ｍｇ／Ｌの濃度で溶解させ得る。

上記の合成方法の使用は、コードされていないアミノ酸またはＤ型のアミノ酸がペプチド中にある場合に必要となる。

しかし、遺伝子にコードされたペプチドに関しては、市販の発現システムで容易に合成されたＤＮＡ配列を使用する組換え技術を眉いることもできる。

区立亙主乏盪亙本発明のアナログはＩＩ型糖尿病の治療に有用である。アナログは、当該分野で一般に知られているように種々の処方で全身に投与され得る。ペプチド投与の特定の形態に適切な処方は、例えば、！？ｅ＋＊ｆｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｆｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｙａｎｉａの最新版に記載されている。一般的に、処方では、効果的な量のアナログまたは複数種類のアナログの混合物、および少なくとも１種類の薬学的に許容可能な賦形剤が使用される。

種々の投与形態が、全身治療に効果的である。投与形態には、例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下注射および腹腔的注射などの注射、適切な坐薬またはスプレーを用いる経膜または経皮投与、並びに、適切に処方される場合には、経口投与がある。注射のだめの適切な賦形剤としては、ハンクス液およびリンガ−液などの種々の生理学的緩衝剤がある。適切な経膜または経皮処方は、胆汁酸塩（ｂｅｅ　５ａｌｔ）またはフシデー　ト（ｆｕｓｉｄａｔｅｓ）などの浸透剤を含有する。典型的な経口処方は、活性成分の消化を阻害する保護剤を含有する。ピａドリンおよびメチルセルロースなどの高分子マトリツクスを用いる種々の遅延性処方もまた利用可能である。他の薬剤送達システムには、リポソームおよびマイクロエマルシ璽ンがある。種々の処方が実施可能であり、選択されたペプチドのための適切な処方および投与経路の提供は、一般に実施者によって理解される。

本発明の化合物の典型的な投与量は、約１ｐｇ／ｋｇ〜ｌｌ１ｇ／ｋｇ（体重）である。但し、この投与量は概算であり、アナログの有効性、循環半減期、被験体の個々の特徴などの多くの要因に左右される。各偲体の糖尿病治療におけるインスリン投与の最適化は、充分に確立されており、類似の最適化プロトコルがここで使用される。

Ｋ亘五以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、限定するものではない。

友１五上本発１のアナログにより口上したインスリン１！激図２に示すように、天然の構造を改変する種々の置換基を有する本発明のアナログが調製された。これらのアナログの内の幾つかを上記のアデニル酸シクラーゼアブセイで試験した。その結果を表１に示す。

（以下余白）表　１」覧」−立コ止ニー社とユニ１ニヒヒど（Ｈ’）’−ＧＬＰ−１（７−３７）１．１　２．２（Ｙ）　−ＧＬＰ−１（７−３７）　５．０　５．０（トアグヶル、Ｈ）７−ＧＬＰ−４（７−３７）１５．５　− （Ｎ−付７１ＩＱｄ＋１．、−Ｈ）−ＧＬＰ−１（７−３７）　１５．５　−（Ｋ）　−ＧＬＰ−１（７−３７）　コＳＯ，Ｏ−（入↑）”−ＧＬＰ−１（７− ３７）　０．４０　０．５５（！：↑）’−Ｇ！Ｊ−１（７−３７）　５５．０　７４．０（Ｄ）’−ＧＩＪ’−４（７−３７）０−１７　０．２８（Ｄｉ）’−ＧＬＰ−１（７−３７３０，９００，９０（Ｆ↑）”−ＧＬＰ−１（７−３７）　１２，０　２３．０２２　２３　２４　２ｇ（Ｓ）　（Ｒ）　（Ｒ）　（Ｑ）　−ＧＩｊ’−１（７−３７）　０．９４　１．ｌ１ｌ（Ｓ）　８（Ｑ）　９（Ｙ）”　（Ｋ）”　（Ｄ）”−ＧＬＰ（（７− コ７）　０．３１従って、本発明の様々なアナログが、インスリンに対する挙動を調べるアッセイにおいて、宵月な範囲の有効性を示している。

皇ｍＧＬＰ−１アナログの口上した　性Ａ、°　ヅ、の「Ｇ［、Ｐ−１（７−Ｂ）切断型のホルモンをラジオ！つ素化し、精製したペプチドを血漿とともにインキュベートし、上記のように、ラジオラベルシーケンシングによってアッセイした。０分後、１５分後、および６０分後に、サンプルのシーケンシングを行った。０分時では、サイクル１３で、放射能の単一ピークが発見され、分解がないことが示された。１５分後では、サイクル１３で、放射能の童が減少し、サイクル１１で増加した。インキュベーシｇンの６０分後、実質的にすべてのカウントが、サイクル１１で現れた。

従って、単一のジペプチジルアミノペプチダーゼ開裂が、ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチドの分解に関与していると思われる。

上記の結果は、Ｎ末端特異的およびＣ末端特異的抗血清を使用するＲＩＡによって測定されるような分解と一致している。

上記のように血漿とともにインキュベートし、ＩＩＩＡでテストしたところ、回収したフラグメントがラジオラベルされたＧＬＰ−１（７−３７）のカルボ牛シ末端特異的抗体への結合を阻害する、の能力は減少していなかった。しかし、１時間後には、アミン末端特異的抗体への結合を阻害する能力は、はとんど０まで減少した。

９位にＤ−Ａｓｐまたは８位にＤ−Ａｌａを含むＧＬＰ−１（７−３７＞アナログを使用して、分解分析のラジオラベルシーケンシングを行った。

このアッセイの結果を図３に示す。図３Ａは、（Ｄわ’−ＧＬＰ−１（７−３７＞の結果を示し、図３Ｂは、（Ａｔ）’−ＧＬＰ−１（７−３７）の結果を示す。これらの図に示されるように、（Ｄｉ）９アナログは、ＧＬＰ−１（７−３７）と同様に分解する。一方、（Ａｔ）６アナログは、６０分後には、はとんど分解を示さなかった。

Ｃ，Ｉ？ＩＡによ　テストされたアナログＮ末端特異的抗体は、アナログの分解を測定するのに使用され得る。但し、この抗体が、Ｎ末端に改変を含むこれらのアナログと交差反応する能力をもつ場合に限られる。図４は、７位、８位、および９位で改変されたアナログの結果を示す。

（Ｙ）’、（Ｈ↑）７、および（Ａｔ）６は、高濃度でではあるが、交差反応が可能であり、（Ｄｉ）　９は可能でない。交差反応ペプチドを高温Ｒ（１Ｇ−１００ｎＭ）で６０分間、血漿とともにインキュベートし、Ｎ末端特異的抗体に対するＲＩＡを使用するＲＩＡでテストした。

パラグラフＢの結果に一致して、（Ａｔ）’アナログは、　６（１分後には分解せず、（［）　７アナログも分解しなかった。しかし、（Ｙ）７アナログは分解した。

Ｄ、　ＨＰＬＣによる　アナログのプロテアーゼＧＬＰ−１（７−３７）と比較した場合の、様々なアナログの分解耐性もまた、上記のように、ＨＰＬＣによってテストした。血漿中でのインキユベーシヨンを６Ｑ分間行い、この後、分解は観察されなかった。すなわち分解は完了した。その結果を表２に示す。

（以下余白）表２アナログ　立見菫稟（Ｈ↑）’ＧＬＰ（（７−３７）　＋（Ｎ−アセチル−Ｈ）７０ＬＰ−１（７−３７）　十（Ｎ−イソプロピル−■）７０ＬＰ−１（７−３７＞　＋（Ｙ）’ＧＬＰ−１（７−３７）　＋（Ｋ）’ＧＬＰ−１（７−３７）　＋（Ｎ−７セｆ　／レーＫ）７ＧＬＰ−１（７−３７）　＋（Ｓ）’　（Ｑ）　９（Ｙ）”（Ｋ）　１８（Ｄ）　２１ＧＬＰ−１（７−３７）　−（Ａｔ）　’ＧＬＰ−１（７−３７＞　÷（Ｄ↑）９ＧＬＰ−１（７−３７＞　−（Ｅ↑）’ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｑ）９ＧＬＰ−１（７−３７）　＋Ｆｉｇｕｒｅ　１由啄ｔｌ−：　Ｇｌｕ　（Ｅ）、Ａｓｐ　（Ｄ）；　シｘｖｉ−Ｊｔ（Ｃ３／ａ）多Ｌｉ：　Ｈｉｓ　（Ｈ）５匹１＆Ｌ２ｐＸ千＋Ｆ、１．７ｕ５よう＋；、＋６Ｌｐ−Ｉ　Ｃｌ−３’ｌ）ｑ？、χｔ２ｂ７−ｉ＞７！、ｒ、ｓｂ匡泗Ｅ２ハエｌｌＱＱ−Σ（３＞）Ｑ−Σ　（偽金）（ｉＱｌ：！−Σ ｆ、参８／イｏｏ’ｌ。

！粒！本発明は、！■盟糖尿病の治療に対して改良された特徴を有する、活性ＧＬＰ− １ペプチド、７−３４．７−３５．７−３６および７−３７の手動なアナログを提供する。これらのアナログは、７−１０位でアミノ酸が置換されており、および／またはＣ末端が切断されおよび／または基本のペプチド中に様々な池のアミノ酸置換を含む。アナログは、グルカゴンと比較して、インシュリン生産を刺激する能力が同上し、ＧＬＰ−１（７−３７＞と比較してブラヌマ中での安定性が向上され得るか、あるいはその両方である１このような特性は、治療薬としてのアナログの能力を同上させる。７および８位にＤ形アミノ酸置換、および／または７位にＮアルキル化またはＮアシル化アミノ酸を有するアナログは。

インビボにおいて、特に分解耐性である。

国際調査報告有ズ：こＩ＋−■＋１１４ｎｅｔ、＋、ｎ　ＵＰ　１１６　Ｖ↑／ＩＫＯ＋　／ｆ’ｌｎ ’＋ｎＱ−ｒ〒／ＩＩｇＱ１　／（ｌｌｌｊｎｎ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプチドであって、該ペプチドが、島細胞からのインシュリンの放出を刺激するのに、グルカゴンよりも強力であり、該ペプチドが、実質的に、ＧＬＰ−１（７−３４）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１（７−３７）あるいはそのＣ末端アミド形態からなり、以下よりなる群から選択される少なくとも１つの改変を有する、ペプチド。（ａ）２６位および／または３４位のリシンを、中性アミノ酸、アルギニンまたはＤ形リシンに置換、および／または３６位のアルギニンを、中性アミノ酸、リシンまたはＤ形アルギニンに置換；（ｂ）３１位のトリプトファンを、酸化耐性アミノ酸に置換（ｃ）以下の少なくとも１つの置換：１６位のＶをＹに；１８位のＳをＫに；２１位のＥをＤに；２２位のＧをＳに；２３位のＱをＲに；２４位のＡをＲに；および２６位のＫをＱに；（ｄ）以下の少なくとも１つを含む置換：８位のＡを、他の小中性アミノ酸に；９位のＥを、他の酸性アミノ酸または中性アミノ酸に１０位のＧを、他の中性アミノ酸に；および１５位のＤを、他の酸性アミノ酸に；ならびに（ｅ）７位のヒスチジンを、他の中性アミノ酸、あるいはＤまたはＮアシル化またはアルキル化形のヒスチジンに置換、ここで、（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）において、置換するアミノ酸は、必要に応じて、Ｄ形であり得、そして７位に置換するアミノ酸は、必要に応じて、Ｎアシル化またはＮアルキル化形であり得る。
２．唯一の改変が、請求項１のパラグラフ（ａ）に記載されるものであり、２６位および／または３４位のリシンを置換するアミノ酸が、Ｋ＋、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｑ、Ｍ、ＲおよびＲ＋からなる群から選択され、そして３６位のアルギニンを置換するアミノ酸が、Ｋ、Ｋ＋、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｑ、ＭおよびＲ＋からなる群から選択され、必要に応じて、請求項１のもう１つの別のパラグラフに記載の改変と組合わされる、請求項１に記載のペプチド。
３．唯一の改変が、請求項１のパラグラフ（ｂ）に記載されるものであり、そして３１位のトリプトファンを置換するアミノ酸が、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＡおよびＹからなる群から選択され、必要に応じて、請求項１のもう１つの別のパラグラフに記載の改変と組合わさる、請求項１に記載のペプチド。
４．唯一の改変が、請求項１のパラグラフ（ｃ）に記載されるものであり、２２位のＧをＳに置換すること、２３位および２４位のそれぞれＱおよびＡをＲに置換すること、ならびに２６位のＫをＱに置換することを組合せて行ったが、あるいは１６位のＶをＹで置換すること、および１８位のＳをＫで置換することを行ったが、あるいはこれらの置換と２１位のＥをＤで置換することを行っており、必要に応じて、請求項１のもう１つの別のパラグラフに記載の改変と組合わされる、請求項１に記載のペプチド。
５．唯一の改変が、請求項１のパラグラフ（ｄ）に記載されるものであり、８位のアラニンを置換する小さい中性アミノ酸が、Ｓ、Ｓ＋、Ｇ、Ｃ、Ｃ＋、Ｓａｒ、Ａ＋、ｂｅｔａ−ａｌａおよびＡｉｂからなる群から選択され、そして９位のグルタミン酸を置換する酸性または中性アミノ酸１が、Ｅ＋、Ｄ、Ｄ＋、Ｃｙａ、Ｔ、Ｔ＋、Ｎ、Ｎ＋、Ｑ、Ｑ＋、Ｃｉｔ、ＭＳＯおよびアセチル−Ｋからなる群から選択され、そして１０位のグリシンを置換する代替の中性アミノ酸が、Ｓ、Ｓ＋、Ｙ、Ｙ＋、Ｔ、Ｔ＋、Ｎ、Ｎ＋、Ｑ、Ｑ＋、Ｃｉｔ、ＭＳＯ、アセチル −Ｋ、ＦおよびＦ＋からなる群から選択され、必要に応じて、請求項１のもう１つの別のパラグラフに記載の改変と組合わされる、請求項１に記載のペプチド。
６．唯一の改変が、請求項１のパラグラフ（ｅ）に記載されるものであり、７位のヒスチジンを置換するアミノ酸が、Ｈ＋、Ｙ、Ｙｔ、Ｆ、Ｆ＋、Ｒ、Ｒｔ、Ｏｒｎ、Ｏｒｎ＋、Ｍ、Ｍ＋、Ｎ−ホルミル−Ｈ、Ｎ−ホルミル−Ｈ＋、Ｎ−アセチル−Ｈ、Ｎ−アセチル−Ｈ＋、Ｎ−イソプロビル−Ｈ、Ｎ−イソプロピル−Ｈ＋、Ｎ−アセチル−Ｋ、Ｈ−アセチル−Ｋ＋、ＰおよびＰ＋からなる群から選択され、必要に応じて、請求項１のもう１つの別のパラグラフに記載の改変と組合わされる、請求項１に記載のペプチド。
７．以下からなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド：（Ｈ＋）７−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｙ）７−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｎ−アセチル−Ｈ）７−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｎ−イソプロピル−Ｈ）７ −ＧＬＰ−１（７−３７）（Ａ＋）６−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｅ＋）９−ＧＬＰ−（７−３７）（Ｄ）９−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｄ＋）９−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｆ＋）１０−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｓ）２２（Ｒ）２３（Ｒ）２４（Ｑ）２６−ＧＬＰ−１（７−３７）、および（Ｓ）８（Ｑ）９（Ｙ）１６（Ｋ）１８（Ｄ）２１−ＧＬＰ−１（７−３７）。
８．ＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプチドであって、該ペプチドが、ＧＬＰ−１（７−３７）と比較して、プラズマ中での分解耐性が向上しており、該ペプテドが、実質的に、ＧＬＰ−（７−３４）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ −１（７−３６）またはＧＬＰ−１（７−３７）、あるいはそのＣ末端アミド形からなり、以下からなる群から選択される少なくとも１つの改変を存する、ペプチド：（ａ）７位のヒスチジンを、Ｄ形中性または酸性アミノ酸、あるいはＤ形ヒスチジンに置換；（ｂ）８位のアラニンを、Ｄ形アミノ酸に置換；および（ｃ）７位のヒスチジンを、Ｎアシル化（１−６Ｃ）またはＮアルキル化（１−６Ｃ）形態の代替アミノ酸またはヒスチジンに置換。
９．唯一の改変が、請求項８のパラグラフ（ａ）に記載されるものであり、７位のヒスチジンを置換するＤ形アミノ酸が、Ｐ＋、Ｄ＋、Ｅ＋、Ｎ、Ｑ＋、Ｌ＋、Ｖ＋、Ｉ＋およびＨ＋からなる群から選択され、必要に応じて、請求項８のもう１つの別のパラグラフに記載の改変と組合わされる、請求項８に記載のペプチド。
１０．唯一の改変が、請求項８のパラグラフ（ｂ）に記載されるものであり、８位のＤ形アミノ酸が、Ｐ＋、Ｖ＋、Ｌ＋、Ｉ＋およびＡ＋からなる群から選択され、必要に応じて、請求項８のもう１つの別のパラグラフに記載の改変と組合わされる、請求項８に記載のペプチド。
１１．唯一の改変が、請求項８のパラグラフ（ｃ）に記載されるものであり、アルキル化またはアセチル化アミノ酸が、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＫおよびＨからなる群から選択され、必要に応じて、請求項８のもう１つの別のパラグラフに記載の改変と組合わされる、請求項８に記載のペプチド。
１２．ＩＩ型糖尿病の治療に有用な薬学組成物であって、薬学的に許容可能な賦形剤と混合された形の、請求項１または８に記載の有効量のペプチドを含む、組成物。
１３．ＩＩ型糖尿病の治療方法であって、このような治療を必要とする被検体に、請求項１または８に記載のペプチドまたはその薬学組成物を有効量投与することを包含する、方法。
１４．以下からなる群から選択される、請求項８に記載のペプチド：（Ｈ＋）７−ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｎ−アセチル−Ｈ）７−ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｎ−イソプロピル−Ｈ）７−ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｎ−アセチル−Ｋ）７−ＧＬＰ−１（７−３７）、および（Ａ＋）８−ＧＬＰ−１（７ −３７）。