JP2001151798A

JP2001151798A - 糖尿病治療に有用なｇｌｐ−１アナログ

Info

Publication number: JP2001151798A
Application number: JP2000311202A
Authority: JP
Inventors: Douglas I Buckley; アイ．バックレイダグラス; Joel F Habener; エフ．ハベナージョエル; Joanne B Mallory; ビー．マロリージョアンヌ; Svetlana Mojsov; モジュゾフスベトラーナ
Original assignee: DOUGLAS I. BUCKLEY; JOANNE B. MALLORY; SVETLANA MOJSOV
Current assignee: DOUGLAS I. BUCKLEY; JOANNE B. MALLORY; SVETLANA MOJSOV
Priority date: 1990-01-24
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2001-06-05
Also published as: ES2113879T3; JP2005132848A; WO1991011457A1; ATE164852T1; CA2073856A1; DK0512042T3; DE69129226T2; EP0512042A1; CA2073856C; DE69129226D1; JP2003192698A; JP2004196825A; EP0512042A4; JP3262329B2; JPH05506427A; EP0512042B1

Abstract

(57)【要約】【課題】従来のＧＬＰ−１ペプチドアナログは、循環
半減期が短く、特性へのどのような効果によって有効性
の向上が得られるかは明らかではなかった。【解決手段】本発明は、ＩＩ型糖尿病の治療に対して
改良された特徴を有する活性ＧＬＰ−１ペプチド、７−
３４、７−３５、７−３６および７−３７の有効なアナ
ログを提供することにより上記の課題を解決する。これ
らのアナログは、７−１０位でアミノ酸が置換され、Ｃ
末端が切断され、および／または基本のペプチド中に様
々な他のアミノ酸置換を含み、そしてグルカゴンと比較
してインシュリン生産を刺激する能力が向上し、ＧＬＰ
−１（７−３７）と比較してプラズマ中での安定性が向
上され得るか、あるいはその両方である。このような特
性は治療薬としてのアナログの能力を向上させる。７お
よび８位にＤ形アミノ酸置換および／または７位にＮア
ルキル化またはＮアシル化アミノ酸を有するアナログ
は、インビボにおいて特に分解耐性である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本出願は、１９９０年１月２
４日出願の米国特許出願第４６８，７３６号の一部継続
出願である。

【０００２】（技術分野）本発明は、改良された薬学的
組成物の分野に関する。詳細には、本発明は、薬理学的
特性が向上した、７〜３６位または７〜３７位のグルカ
ゴン様ペプチドＩフラグメントのアナログに関する。

【０００３】

【従来の技術】（背景技術）グルコースの代謝は、イン
スリン、グルカゴン、およびガストリック・インヒビト
リー・ペプチド（ＧＩＰ）を含む多くのペプチドホルモ
ンによって調節される。これらのペプチドホルモンがこ
の代謝を調節する複雑なメカニズム、および、これらが
相互にどのように影響するかについては、少なくともそ
の一部が解明されている。例えば、グルカゴンは、イン
スリンを産生する膵臓β細胞の表面のレセプターに結合
し、インスリンの分泌を刺激する。グルカゴン様ペプチ
ドＩが、インスリンの分泌を刺激すると示唆されている
が、これについては確認されていない。

【０００４】これらのホルモンの内の数種類は、哺乳類
のグルカゴン前駆体である「プログルカゴン」から生じ
る。「プログルカゴン」は、１８０個のアミノ酸のペプ
チドである。このペプチドのタンパク質分解およびプロ
セシングにより、これらの多くのタンパク質ホルモンが
得られる。プロセシングの結果は、プロセシングが行わ
れる細胞の起源に左右される。例えば、ブタおよびラッ
トの膵臓では、プログルカゴンはプロセシングによって
グルカゴンとグリセンチン関連膵臓ペプチドとを形成す
る。グリセンチン関連膵臓ペプチドは、ＧＬＰ−１およ
びＧＬＰ−２配列の双方を含む大型のペプチドである。
ブタの小腸では、分泌物は、６９個のアミノ酸のグルカ
ゴン含有ペプチドグリセンチン、ならびに別のペプチド
としての２個のグルカゴン様配列、即ちＧＬＰ−１およ
びＧＬＰ−２である。

【０００５】しかし、いずれにしても、プログルカゴン
の全配列は、グルカゴンの２９個のアミノ酸配列、ＧＬ
Ｐ−１の３６個または３７個のアミノ酸配列、およびＧ
ＬＰ−２の３４個のアミノ酸配列を含んでいる。これら
の配列間には、アミノ酸スペーサー配列が介在してい
る。

【０００６】ＧＬＰ−１の活性パターンを解明する初期
の試みでは、曖昧な見解が出されていたが、これに続い
て得られた結論は、このペプチドの切断型が生物学的に
活性であるということである。Ｍｏｊｓｏｖ，Ｓ．らの
ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ（１９８７）７９：６１６
−６１９は、３１個のアミノ酸ペプチドＧＬＰ−１（７
−３７）のみが膵臓からのインスリン放出を強く刺激す
ることを開示している。これより以前に、切断型および
完全長の３７個のアミノ酸形態の膵臓および腸での発見
はされていた。おそらくはカルボキシ末端がアミド化さ
れたＧＬＰ−１（７−３６）もまた、インスリン放出の
強力なメディエイターである。（例えばＨｏｌｓｔ，
Ｊ．Ｊ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ（１９８７）２
１１：１６９−１７４を参照のこと）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】以下に記載する本発明
は、これらのＧＬＰ−１の切断型のアナログに関する。
これらのアナログは、グルコースにより誘導されるイン
スリン分泌、およびグルコースにより誘導されるグルカ
ゴン分泌阻害を促進する際の有効性、並びに循環半減期
に関連しており、所望の組み合わせの特徴を備えてい
る。グルコースにより誘導されるインスリン分泌を促進
する際の切断型の生理学的効果は、Ｈｏｌｓｔ，Ｊ．
Ｊ．らおよびＭｏｊｓｏｖ，Ｓら（前出）によって上記
のように提示されている。グルカゴン放出阻害における
切断型ホルモンの活性については、Ｏｒｓｋｏｖ，Ｃら
のＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８８）１２３：２００９
−２０１３およびＳｕｚｕｋｉ，Ｓ．らのＤｉａｂｅｔ
ｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ：ＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔ
ｉｃｅ（１９８８）５（付録１）：Ｓ３０に提示さ
れている。これらの切断型の循環半減期は短く、Ｋｒｅ
ｙｍａｎｎらのＴｈｅＬａｎｃｅｔ（１９８７年１２
月５日）１３００〜１３０３に示されているように、約
４分である。これらの切断型ＧＬＰ−１ペプチドの改変
型によって、これらの特性が最適となる可能性が得られ
る。

【０００８】肝臓および血漿中のペプチドホルモンの分
解ならびに一般的なインビボでのこのようなホルモンの
半減期の研究に関して幾つかの文献がある。ＭａｃＤｏ
ｎａｌｄ，Ｊ．Ｋ．らによる初期の文献ＪＢｉｏｌ
Ｃｈｅｍ（１９６９）２４４：６１９９−６２０８で
は、ジペプチダーゼがラット肝臓中のグルカゴンの分解
の原因であることが明らかにされた。成長ホルモン放出
因子、即ち一般的なグルカゴンのＧＬＰ−１およびＧＬ
Ｐ−２ファミリーのメンバーの研究により、このメンバ
ーが、インビトロで血漿中において急速に分解されるこ
と、およびインビボでジペプチダーゼによっても急速に
分解されることが明らかにされた（Ｆｒｏｈｍａｎ，
Ｌ．Ａ．ら、ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ（１９８６）
７８：９０６−９１３）。Ｍｕｒｐｈｙ，Ｗ．Ａ．ら
は、ＰｅｐｔｉｄｅＲｅｓｅａｒｃｈ（１９８８）
１：３６−４１において、全てではないが幾つかのアル
キル化された成長ホルモン放出因子ペプチドがインビボ
でさらに高い有効性を示すことを明らかにした。特に、
例えば、トリイソプロピル化されたＧＲＦー２９は、Ｇ
ＲＦ−２９自体より１０６倍高い活性を示すことが発見
された。一方、Ｎ末端がメチル化されたＧＲＦ−２９で
はその有効性は親の僅か４０％であった。このホルモン
の２位のＤ−Ａｌａの置換によってその有効性が向上す
ることもまた明らかにされた。特性へのどのような効果
によって有効性の向上が得られるのかは、当然明らかで
はなかった。

【０００９】他に、ＧＬＰ−１（７−３７）の幾つかの
改変が試みられている。７位のヒスチジン残基を欠失さ
せるとこのホルモンの活性が大幅に低減されることが明
らかにされている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．ら（前出）；Ｈ
ｅｎｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｋ．ら、Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｅＳｏｃｉｅｔｙＭｅｅｔｉｎｇ，Ｎ
ｅｗＯｒｌｅａｎｓ，ＬＡ（１９８８））。１個また
はそれ以上のＣ末端欠失の効果については対立する報告
がなされている（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．ら（前出）；Ｙａ
ｎａｉｈａｒａ，Ｃ．ら、Ａｂｓｔｒａｃｔｆｏｒ
ＡＧｌｕｃａｇｏｎａｎｄＲｅｌａｔｅｄＰｅ
ｐｔｉｄｅｓＳａｔｅｌｌｉｔｅＳｙｍｐｏｓｉｕ
ｍ、８ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｇｒ
ｅｓｓｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９８８年
７月１５〜１６日、Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）。しか
し、このペプチドホルモンファミリーの他のメンバー、
例えば、ＧＩＰ、グルカゴン放出因子（ＧＲＦ）、セク
レチン、およびバソアクティブ・インテスティナル・ポ
リペプチド（ＶＩＰ）の改変に関する文献は多い。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＩＩ型糖尿病
の治療薬として有用なペプチドを提供し、このペプチド
は、島細胞からのインシュリンの放出を刺激するのに、
グルカゴンよりも強力であり、このペプチドは、実質的
に、ＧＬＰ−１（７−３４）、ＧＬＰ−１（７−３
５）、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１（７−
３７）あるいはそのＣ末端アミド形態からなり、以下よ
りなる群から選択される少なくとも１つの改変を有す
る：（ａ）２６位および／または３４位のリシンを、中性ア
ミノ酸、アルギニンまたはＤ形リシンに置換、および／
または３６位のアルギニンを、中性アミノ酸、リシンま
たはＤ形アルギニンに置換；（ｂ）３１位のトリプトファンを、酸化耐性アミノ酸に
置換；（ｃ）以下の少なくとも１つの置換：１６位のＶをＹ
に；１８位のＳをＫに；２１位のＥをＤに；２２位のＧ
をＳに；２３位のＱをＲに；２４位のＡをＲに；および
２６位のＫをＱに；（ｄ）以下の少なくとも１つを含む置換：８位のＡを、
他の小中性アミノ酸に；９位のＥを、他の酸性アミノ酸
または中性アミノ酸に；１０位のＧを、他の中性アミノ
酸に；および１５位のＤを、他の酸性アミノ酸に；なら
びに（ｅ）７位のヒスチジンを、他の中性アミノ酸、あるい
はＤまたはＮアシル化またはアルキル化形のヒスチジン
に置換、ここで、（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）
において、置換するアミノ酸は、必要に応じて、Ｄ形で
あり得、そして７位に置換するアミノ酸は、必要に応じ
て、Ｎアシル化またはＮアルキル化形であり得る。

【００１１】好ましい実施態様において、本発明は、Ｉ
Ｉ型糖尿病の治療薬として有用なペプチドを提供し、こ
のペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ａ）に
記載されるものであり、２６位および／または３４位の
リシンを置換するアミノ酸が、Ｋ†、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｌ、
Ｉ、Ｑ、Ｍ、ＲおよびＲ†からなる群から選択され、そ
して３６位のアルギニンを置換するアミノ酸が、Ｋ、Ｋ
†、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｑ、ＭおよびＲ†からなる群
から選択され、必要に応じて、上記のもう１つの別のパ
ラグラフに記載の改変と組合わされる。

【００１２】好ましい実施態様において、本発明はＩＩ
型糖尿病の治療薬として有用なペプチドを提供し、この
ペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ｂ）に記
載されるものであり、そして３１位のトリプトファンを
置換するアミノ酸が、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＡおよびＹから
なる群から選択され、必要に応じて、上記のもう１つの
別のパラグラフに記載の改変と組合わされる。

【００１３】好ましい実施態様において、本発明はＩＩ
型糖尿病の治療薬として有用なペプチドを提供し、この
ペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ｃ）に記
載されるものであり、２２位のＧをＳに置換すること、
２３位および２４位のそれぞれＱおよびＡをＲに置換す
ること、ならびに２６位のＫをＱに置換することを組合
せて行ったが、あるいは１６位のＶをＹで置換するこ
と、および１８位のＳをＫで置換することを行ったか、
あるいはこれらの置換と２１位のＥをＤで置換すること
を行っており、必要に応じて、上記のもう１つの別のパ
ラグラフに記載の改変と組合わされる。

【００１４】好ましい実施態様において、本発明はＩＩ
型糖尿病の治療薬として有用なペプチドを提供し、この
ペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ｄ）に記
載されるものであり、８位のアラニンを置換する小さい
中性アミノ酸が、Ｓ、Ｓ†、Ｇ、Ｃ、Ｃ†、Ｓａｒ、Ａ
†、ｂｅｔａ−ａｌａおよびＡｉｂからなる群から選択
され、そして９位のグルタミン酸を置換する酸性または
中性アミノ酸が、Ｅ†、Ｄ、Ｄ†、Ｃｙａ、Ｔ、Ｔ†、
Ｎ、Ｎ†、Ｑ、Ｑ†、Ｃｉｔ、ＭＳＯおよびアセチル−
Ｋからなる群から選択され、そして１０位のグリシンを
置換する代替の中性アミノ酸が、Ｓ、Ｓ†、Ｙ、Ｙ†、
Ｔ、Ｔ†、Ｎ、Ｎ†、Ｑ、Ｑ†、Ｃｉｔ、ＭＳＯ、アセ
チル−Ｋ、ＦおよびＦ†からなる群から選択され、必要
に応じて、上記のもう１つの別のパラグラフに記載の改
変と組合わされる。

【００１５】好ましい実施態様において、本発明はＩＩ
型糖尿病の治療薬として有用なペプチドを提供し、この
ペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ｅ）に記
載されるものであり、７位のヒスチジンを置換するアミ
ノ酸が、Ｈ†、Ｙ、Ｙ†、Ｆ、Ｆ†、Ｒ、Ｒ†、Ｏｒ
ｎ、Ｏｒｎ†、Ｍ、Ｍ†、Ｎ−ホルミル−Ｈ、Ｎ−ホル
ミル−Ｈ†、Ｎ−アセチル−Ｈ、Ｎ−アセチル−Ｈ†、
Ｎ−イソプロピル−Ｈ、Ｎ−イソプロピル−Ｈ†、Ｎ−
アセチル−Ｋ、Ｎ−アセチル−Ｋ†、ＰおよびＰ†から
なる群から選択され、必要に応じて、上記のもう１つの
別のパラグラフに記載の改変と組合わされる。

【００１６】好ましい実施態様において、本発明はＩＩ
型糖尿病の治療薬として有用なペプチドを提供し、この
ペプチドは、以下からなる群から選択される：（Ｈ†）⁷−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｙ）⁷−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｎ−アセチル−Ｈ）⁷−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｎ−イソプロピル−Ｈ）⁷−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ａ†）⁸−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｅ†）⁹−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｄ）⁹−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｄ†）⁹−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｆ†）¹⁰−ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｓ）²²（Ｒ）²³（Ｒ）²⁴（Ｑ）²⁶−ＧＬＰ−１（７−
３７）、および（Ｓ）⁸（Ｑ）⁹（Ｙ）¹⁶（Ｋ）¹⁸（Ｄ）²¹−ＧＬＰ−１
（７−３７）。

【００１７】本発明は、ＩＩ型糖尿病の治療薬として有
用なペプチドを提供し、このペプチドは、ＧＬＰ−１
（７−３７）と比較して、プラズマ中での分解耐性が向
上しており、このペプチドは、実質的に、ＧＬＰ−１
（７−３４）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１
（７−３６）またはＧＬＰ−１（７−３７）、あるいは
そのＣ末端アミド形からなり、以下からなる群から選択
される少なくとも１つの改変を有する：（ａ）７位のヒスチジンを、Ｄ形中性または酸性アミノ
酸、あるいはＤ形ヒスチジンに置換；（ｂ）８位のアラニンを、Ｄ形アミノ酸に置換；および（ｃ）７位のヒスチジンを、Ｎアシル化（１−６Ｃ）ま
たはＮアルキル化（１−６Ｃ）形態の代替アミノ酸また
はヒスチジンに置換。

【００１８】好ましい実施態様において、本発明はＩＩ
型糖尿病の治療薬として有用なペプチドを提供し、この
ペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ａ）に記
載されるものであり、７位のヒスチジンを置換するＤ形
アミノ酸が、Ｐ†、Ｄ†、Ｅ†、Ｎ、Ｑ†、Ｌ†、Ｖ
†、Ｉ†およびＨ†からなる群から選択され、必要に応
じて、上記のもう１つの別のパラグラフに記載の改変と
組合わされる。

【００１９】好ましい実施態様において、本発明はＩＩ
型糖尿病の治療薬として有用なペプチドを提供し、この
ペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ｂ）に記
載されるものであり、８位のＤ形アミノ酸が、Ｐ†、Ｖ
†、Ｌ†、Ｉ†およびＡ†からなる群から選択され、必
要に応じて、上記のもう１つの別のパラグラフに記載の
改変と組合わされる。

【００２０】好ましい実施態様において、本発明はＩＩ
型糖尿病の治療薬として有用なペプチドを提供し、この
ペプチドの唯一の改変は、上記のパラグラフ（ｃ）に記
載されるものであり、アルキル化またはアセチル化アミ
ノ酸が、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＫおよびＨ
からなる群から選択され、必要に応じて、上記のもう１
つの別のパラグラフに記載の改変と組合わされる。

【００２１】さらに好ましい実施態様において、本発明
は、ＩＩ型糖尿病の治療に有用な薬学組成物を提供し、
この組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤と混合された
形の、上記ペプチドの有効量を含む。

【００２２】別の好ましい実施態様において、本発明
は、ＩＩ型糖尿病の治療方法を提供し、この方法は、こ
のような治療を必要とする被検体に、上記のペプチドま
たはその薬学組成物を有効量投与することを包含する。

【００２３】好ましい実施態様において、本発明はＩＩ
型糖尿病の治療薬として有用なペプチドを提供し、この
ペプチドは、以下からなる群から選択される：（Ｈ†）⁷−ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｎ−アセチル−Ｈ）⁷−ＧＬＰ−１（７−３７）、（Ｎ−イソプロピル−Ｈ）⁷−ＧＬＰ−１（７−３
７）、（Ｎ−アセチル−Ｋ）⁷−ＧＬＰ−１（７−３７）、お
よび（Ａ†）⁸−ＧＬＰ−１（７−３７）。

【００２４】（発明の開示）本発明は、ＧＬＰ−１（７
−３４）；（７−３５）；（７−３６）もしくは（７−
３７）ヒトペプチドの改変型またはこれらのＣ末端がア
ミド化された形態の改変型を提供する。天然ペプチド
は、

【００２５】

【化１】のアミノ酸配列を有しており、この配列中の（Ｇ）、
（Ｒ）および（Ｇ）が存在するかどうかは、指示された
鎖長による。

【００２６】改変型では、天然の構造に１箇所またはそ
れ以上の改変が加えられており、治療に有用な能力が向
上している。これらの改変型では、グルカゴンよりもイ
ンスリン分泌を促進するための有効性が高いか、もしく
は血漿中での安定性が向上しているか、またはその両方
である。この有効性および向上した安定性は、以下に記
載するように分析され得る。

【００２７】アミノ酸には標準一文字略記コードを使用
する。

【００２８】インスリン刺激特性の向上を呈する本発明
のアナログは、前記の配列またはそのＣ末端アミド化物
に、以下からなる群から選択される少なくともひとつの
改変を加えた配列を有する：（ａ）２６位および／もしくは３４位のリシンを、中性
アミノ酸、アルギニンもしくはＤ型のリシンに、ならび
に／または３６位のアルギニンを中性アミノ酸、リシン
もしくはＤ型のアルギニンに置換；（ｂ）３１位のトリプトファンを耐酸化性アミノ酸に置
換（Ｃ）以下の内の少なくともひとつの置換：１６位のＶ
をＹに；１８位のＳをＫに；２１位のＥをＤに；２２位
のＧをＳに；２３位のＱをＲに；２４位のＡをＲに；お
よび２６位のＫをＱに；（ｄ）以下の内の少なくともひとつの置換：８位のＡを
他の小型中性アミノ酸に；９位のＥを他の酸性アミノ酸
または中性アミノ酸に；１０位のＧを他の中性アミノ酸
に；および１５位のＤを他の酸性アミノ酸に；ならびに（ｅ）７位のヒスチジンを、他の中性アミノ酸、あるい
はＤあるいはＮアシル化またはＤあるいはＮアルキル化
型のヒスチジンに置換。

【００２９】（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）の改
変に関しては、置換するアミノ酸は、Ｄ型であり得る。
これは、例えばＣ†などのように上付き文字†で示され
る。７位において置換するアミノ酸はＮアシル化または
Ｎアルキル化型でもあり得る。

【００３０】したがって、本発明は、そのひとつの局面
において、上記のように、向上したインスリン刺激特性
を有し、上述のＧＬＰ−１（７−３４）からＧＬＰ−１
（７−３７）までの切断型と相同性のあるペプチドに関
する。

【００３１】他の局面においては、本発明は、ＧＬＰ−
１（７−３７）と比較して、血漿中での耐分解性が向上
したペプチドに関する。この向上した耐分解性は、以下
に記載のように定義される。

【００３２】これらのアナログでは、上記の切断型のＧ
ＬＰ−１（７−３４）からＧＬＰ−１（７−３７）また
はこれらのＣ末端アミド化型の内の何れかが、以下のよ
うに改変される。

【００３３】（ａ）７位のＨをＤ中性もしくはＤ酸性ア
ミノ酸に置換、または（ｂ）８位のＡをＤアミノ酸に置
換、または（ｃ）上記の双方の置換、または（ｄ）７位
のＨを任意の自然のアミノ酸のＮアシル化型もしくはＮ
アルキル化型に置換。

【００３４】したがって、耐分解性を有する本発明のア
ナログとしては、（Ｎ−アシル（１−６Ｃ）ＡＡ）７Ｇ
ＬＰ−１（７−３７）および（Ｎ−アルキル（１−６
Ｃ）ＡＡ）７ＧＬＰ−１（７−３７）がある。ここでＡ
Ａは、リシル残基であり、１つまたは両方の窒素がアル
キル化またはアシル化され得る。ＡＡは、インスリン刺
激活性の保持に対応する任意のアミノ酸を示す。

【００３５】７位および８位のＤ型アミノ酸の置換に
は、任意の酸性または中性アミノ酸のＤ残基を７位に、
そして、任意のアミノ酸のＤ残基を８位に使用し得る。
これらもまた、インスリン刺激活性に対応するものであ
る。７位および８位の何れか一方または両方をＤアミノ
酸に置換することができる；７位のＤアミノ酸を上記の
ようにアシル化またはアルキル化することもできる。こ
れらの改変型は、上記のように、ＧＬＰ−１（７−３
７）だけではなく、さらに短い切断型のアナログにも適
用可能である。

【００３６】他の局面では、本発明は、１種類またはそ
れ以上のこれらのペプチドを活性成分として含む薬学的
組成物、およびこれらのペプチドまたはその組成物を用
いてＩＩ型糖尿病を治療する方法に関する。

【００３７】

【発明の実施の形態】（発明を実施するための形態）本
発明のアナログは、ＧＬＰ−１（７−３４）、（７−３
５）、（７−３６）または（７−３７）の改変型であっ
て、その特徴は、培養物中の単離されたラット島細胞か
らのインスリン放出を測定するインビトロでのアッセイ
でグルカゴンよりも高い有効性を呈すること、もしく
は、血漿中での安定性の向上を示すこと、またはこれら
の両方である。

【００３８】（向上したインスリン放出刺激特性を有す
るアナログのアッセイ）本発明のアナログのひとつのグ
ループは、島細胞からのインスリン放出を刺激するに際
してグルカゴンよりも強力である。「島細胞からのイン
スリン放出を刺激するのにグルカゴンよりも強力」であ
るとは、言及するアナログが、以下の記述から選択され
るインビトロでのアッセイにおいて、より高い有効性を
呈することを意味する：これらのアッセイのためのラッ
ト島は、本明細書に援用されるＳｕｔｔｏｎ，Ｒ．らの
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９８６）４２：６
８９−６９１に記載の方法によって単離される。簡潔に
記載すれば、ＳＤ雄ラットに麻酔をかけて、その総胆管
の下端に、適切な位置に固定した２ＦＧカニューレを挿
入する。次に、膵管の胆管ツリー（ｂｉｌｉａｒｙｔ
ｒｅｅ）への入口領域の上方で左右の肝管を各々別個に
結紮する。ラットを放血により殺して、７．５ｍＭのＣ
ａＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液および１〜６ｍ
ｇ／ｍＬのＩ型コラゲナーゼを含有する３ｍＬのハンク
ス液を、カニューレ中に流入させて、膵臓を均一に膨張
させる。次いで、膵臓を摘出し、氷上のビーカーに入れ
た後に、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を含有するハンク
ス液中で３７℃にてインキュベーションを行う。

【００３９】インキュベーションを１３〜２５分間行っ
た後に、膵臓を取り出し、５ｇ／ｌのウシ血清アルブミ
ンおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を含有する４℃の
ハンクス液中に入れる。

【００４０】そして、全ての膵臓組織を１４ＦＧ針を用
いて静かにシリンジにとり、さらに、ＨＥＰＥＳを上記
のように含有するハンクス液中に懸濁させて、１０秒間
５０ｇで遠心分離した後に、上澄みを廃棄する。この組
織ペレットを再度懸濁させて、再度静かに、シリンジに
とり、その後さらに洗浄を行う。その後に、分散した組
織を孔サイズ５００μのナイロンメッシュフィルターを
通過させる。濾過した組織を３５０ｇで５秒間遠心分離
し、上澄みを廃棄した後に、この組織を、ＨＥＰＥＳを
上記のように含有するハンクス液に溶解して得た２５％
のフィコール中に懸濁させる。このフィコール溶液に
は、２３％、２０％および１１％の不連続密度勾配の層
が形成される。この密度勾配層を４℃にて１０分間７５
０ｇで回転させる。そして、上の２つの界面から得られ
る組織をハンクス液中で３回洗浄した後に、切開用の顕
微鏡で見て、島を手操作で採取する。

【００４１】ひとつの方法では、次に、これらの島から
の分泌を促進するＧＬＰ−１アナログの能力を、本明細
書に援用される、Ｓｃｈａｔｚ，Ｈらの“Ｍｅｔｈｏｄ
ｓｉｎＤｉａｂｅｔｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ”（１９
８４）のＶｏｌｕｍｅ１、ＰａｒｔＣ：２９１〜３
０７ページに記載の方法によって決定する。この方法で
は、１本の試験管当り５個〜１０個の島を１ｍＬのクレ
ブス−リンガー−バイカーボネート緩衝液（ＫＲＢ緩衝
液）中でインキュベートする。試験を行うために、グル
カゴンまたは本発明の改変型アナログを５〜１０μｇ／
ｍＬの割合で加える。放出されたインスリンのレベル
は、本明細書に援用されるＪｅｎｓｅｎ，Ｓ．Ｌ．らの
ＭＪＰｈｙｓｉｏｌ（１９７８）２３５：Ｅ３８１
−Ｅ３８６に記載の方法で測定され得る。

【００４２】以下のプロトコールは、インスリン分泌刺
激を測定するのに好ましい方法である。コラゲナーゼ消
化の後に、島を、ＤＭＥＭ（ダルベッコの変法イーグル
培地、１６ｗ／ｏグルコース）、２．８ｍＭグルコース
および１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で、５％のＣ
Ｏ２存在下で、３７℃にて一晩インキュベートすること
により、回収した。

【００４３】翌日、実験に使用する島を、グルコースを
含まず、０．２％のＢＳＡ（Ａｒｍｏｕｒ、臨床グレー
ド、５％ストックで作製）を含有するＤＭＥＭに移し、
血清およびグルコースを含まない培地で６０分間プレイ
ンキュベートした。エッペンドルフピペットを用いて小
島を採取し、８．０ｍＬの培地を含有する６０ｍｍのＴ
Ｃプレートに移して、インキュベーターに戻して６０分
間インキュベートする。この島を移す際に、その数を数
える。（注：各データ点は、５個の島によるものであ
り、通常各４回の実験を行う。したがって、各データ点
に対して２０個の島を使用する。）典型的には、各膵臓
に対して１５０〜２００個の小島を回収する。疑わしい
島（崩れすぎているかまたは崩壊したもの）は使用され
ない。

【００４４】この６０分のプレインキュベーションの間
に、実験準備を行うため、プレインキュベーション終了
時には、島を５個づつのグループにして実験条件下に移
すだけでよい。実験の準備は、４８個のウェルを有する
ＴＣプレートにおいて各ウェルにつき０．５ｍＬの培地
を用いて行う。０．２％のＢＳＡを含有するＤＭＥＭ
に、グルコースを所望の濃度になるように（通常低血糖
条件で２．８ｍＭ、中血糖で５．６ｍＭのグルコース、
または高血糖で１６．７ｍＭのグルコース）加え、さら
に、試験化合物を種々の用量範囲（典型的には１ｐＭ〜
１００ｎＭ）で加える。試験化合物を、−８０℃で保存
されたストックから、０．２％のＢＳＡを含有する燐酸
緩衝塩水（ＰＢＳ）で〜０．３ｍＭまで系列希釈する。
これは、管の側面上における損失を防止するためであ
る。培地と試験化合物とを混合した後に、各４回の実験
によるデータ点を得るための４個のウェルの各々に０．
５ｍＬを加える。

【００４５】プレインキュベーション期間終了後、各ウ
ェルに５個の島を加える。島を容量２５μｌでエッペン
ドルフピペットを用いて採取する。インキュベーション
をさらに６０分間継続し、その時点で、島を取り出さな
いように注意深く各ウェルから０．３ｍＬを採取する。
そして、ウェルを再度調べて、島の数を確認する。次
に、インスリン含有量を調べるためにインスリンＲＩＡ
を用いて培地をアッセイする。培地を直ちにアッセイし
ない場合には、アッセイ時までー２０℃で保存される。
インスリン分泌に対する用量応答曲線を作成して、これ
らの曲線からＥＤ５０を計算する。

【００４６】グルカゴンより高い有効性の定義は、同じ
濃度のグルカゴンとアナログとを用いた場合にアナログ
からのインスリン放出レベルの方が高いこと、あるい
は、グルカゴンよりも低濃度のアナログを用いた場合に
同じインスリン放出レベルが得られることであるとされ
る。

【００４７】上記のアッセイは、向上した有効性の判断
のために特異的な基準を提供するが、上記のものに代わ
る他のアッセイを使用することもできる。

【００４８】本発明の化合物の有効性を調べる追加の試
験では、ＲＩＮ１０４６−３８細胞中のｃＡＭＰ産生を
刺激するこれらの化合物の能力を測定する。このアッセ
イは、以下のように行われ得る。

【００４９】第１日目に、５×１０５のＲＩＮ１０４６
−３８細胞（Ｄｒｕｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ
ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ（１９８７）８
４：３４３４−３４３８）を、２．５ｍＬのＭ１９９培
地を入れた６個のウェル付きのディッシュの各ウェルに
植え付ける。第４日目に、細胞に新しい培地を与えて、
第５日に、アッセイを行う。

【００５０】この時、各ウェルには〜２．０〜２．５×
１０⁶個の細胞が存在する。アッセイは、継代が２４回
以下の細胞でのみ行われる。

【００５１】開始６０分前に、単分子層を２．５ｍＬの
ＰＢＳで２回洗浄し、培地を、４．５ｇ／ｌのグルコー
スおよび０．１％のＢＳＡを加えたＤＭＥＭ培地（アッ
セイ培地）１．０ｍｌに変える。開始０時の時点で、培
地を吸引して、試験化合物を含有する１．０ｍＬの新し
いアッセイ培地を加える。試験化合物は、０．１％のＢ
ＳＡを加えた５０μｌのＰＢＳ中に加えられ、コントロ
ールは賦形剤のみに加えられる。インキュベーションを
０〜６０分間継続する。

【００５２】終了時に、馴化培地および単分子層を採取
して、細胞内および細胞外のｃＡＭＰ含有量を測定す
る。細胞外測定では、培地を取り出して遠心分離し、細
胞残留物を全て除去する。細胞内測定では、培地を取り
出した後に、１．０ｍＬの氷冷９５％エタノールを単分
子層に加える。細胞をかき取って回収し、液体Ｎ２を用
いて２回の高速凍結／解凍サイクルにより溶解させる。
次いで遠心分離によって細胞残留物を除去する。馴化培
地の等分量部分（ウェルの内容量の１／４０）およびエ
タノールによる細胞抽出物について、ＲＩＡキットを用
いてアセチル化プロトコールにより２回測定を行い、ｃ
ＡＭＰレベルを調べる。

【００５３】上記と同様に、グルカゴンより高い有効性
の定義は、同じ濃度のアナログおよびグルカゴンを用い
た場合に高いｃＡＭＰ刺激が得られること、または、ア
ナログの濃度をより低くした場合に同じｃＡＭＰ刺激が
得られることとされる。

【００５４】インスリン放出を媒介する向上した有効性
を測定するための他のアッセイが、使用され得る。

【００５５】インスリン放出を促進する化合物の能力
は、インビトロおよびインビボの両方で試験され得る。
放出されたインスリンを標準抗体アッセイを用いて検出
できる。このアッセイは、インビボでの研究で血漿を分
析すること、および、インビトロで培地または潅流液を
分析することによって行う。

【００５６】例えば、有用なインビトロでのアッセイ
に、Ｐｅｎｈｏｓ，Ｊ．ＣらのＤｉａｂｅｔｅｓ（１９
６９）１８：７３３−７３８に記載の膵臓温浸アッセイ
法（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｎｆｕｓｉｏｎａｓｓ
ａｙｍｅｔｈｅｄ）が使用される。これは、Ｗｅｉ
ｒ，Ｇ．Ｃ．らのＪＣｌｉｎＩｎｖｅｒｓｔｉｇａ
ｔ（１９７４）５４：１４０３−１４１２に記載の方法
で使用されているように行われる。インスリン分泌は、
Ｈｏｌｓｔ，Ｊ．Ｊ．らのＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ
（１９８７）２１１：１６９−１７４（前出）に記載の
方法によっても測定され得る。インスリン刺激効果を調
べるアッセイとして有用なものとして、ＲＩＮ１０４６
−３８細胞系中のアデニル酸シクラーゼ刺激の測定があ
る。Ｄｒｕｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．らのＰｒｏｃＮａｔｌ
ＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ（１９８７）８４：３４３
４−３４３８（前出）。

【００５７】グルカゴン放出の阻害は、Ｏｒｓｔｏｖ，
ＣらのＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８８）１２３：２０
０９−２０１３；Ｓｕｚｕｋｉ，ＳらのＤｉａｂｅｔｅ
ｓＲｅｓｅａｒｃｈ：ＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉ
ｃｅ（１９８８）５（付録１）：Ｓ３０（双方とも前
出）に記載のように、明らかにされ得る。

【００５８】（分解に対する向上した安定性を調べるア
ッセイ）本発明のＧＬＰ−１アナログの治療効率は、ア
ナログのインビボでの半減期を増加させることによって
も向上させ得る。「増加したインビボでの半減期」と
は、以下に記載のものからなる群から選択されるアッセ
イに従って血漿存在下での分解に耐えると実証された能
力を意味する。全てのアッセイにおいて、血液をヘパリ
ン処理した管に集めて、これらの管を氷上に静置し、約
３，０００ｒｐｍで１０分間、卓上遠心分離機で遠心分
離することによって、血漿を調製する。単離した血漿を
４℃で保存する。

【００５９】（Ａ．ラジオラベルシーケンシング）ＧＬ
Ｐアナログを、標準ラジオラベリング法を用いて、１９
位における放射性ヨウ素化によって標識する。ＲＩＡ緩
衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４のＮａＨＰＯ ₄、０．２５
％のＢＳＡ（ＡｒｍｏｕｒインスリンおよびＦＦＡを含
まない）、０．５％のＢＭＥ、０．００２％のポリリシ
ン（Ｓｉｇｍａ１５．０００ｍｗ）、０．０５％のＴ
ｗｅｅｎ２０、および０．１％のＮａＮ₃）に移した後
に、放射性ヨウ素化ペプチド（約１０⁵ｃｐｍ／５０ｍ
Ｌ）およびコールド（放射性物質を含まない）非ヨウ素
化ペプチド（２０μｌ１００ｎＭ）を、２ｍｌの血漿
に加えて、最終的に濃度を１ｎＭとして、循環水浴中で
所定の時間インキュベートする。血漿に加えたＲＩＡバ
ッファーの総量は、必ず総体積の５％以下である。イン
キュベーション終了時に、水中の１０％のバシトラシン
（ｗ／ｖ）を最終濃度が０．１％になるように加えて反
応を停止させる。

【００６０】次に、Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋを用いてこの
血漿を抽出して、血漿タンパク質のバルクからアナログ
と全てのフラグメントを分離する。Ｓｅｐ−Ｐａｋカー
トリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）を、２ｍＬの１−プロパノー
ルで洗浄し、次いで２ｍＬの水で洗浄して、その後に、
２ｍＬの、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含
有する２０％のＣＨ₃ＣＮ（緩衝液Ａ）で平衡化する。

【００６１】バシトラシンで処理された血漿を、０．１
％のＴＦＡを含有するＣＨ₃ＣＮを用いて２０％のＣＨ₃
ＣＮで得る。そして、これを３ｍＬのプラスチック注射
器を介してカートリッジを通して穏やかに通過させる。
次に、カートリッジを、１ｍＬの緩衝液Ａを各々洗浄液
として用いて２回洗浄し、そして、２ｍＬの、０．１％
ＴＦＡを含有する５０％ＣＨ₃ＣＮ（緩衝液Ｂ）を洗浄
液として用いて溶出し、これを、シリコーン処理をした
１２×７５のガラス管に流入させる。アナログまたはフ
ラグメントの回収率は、９０％を越える。

【００６２】溶出液を、Ｓｐｅｅｄｖａｃ中で１００
μｌまで濃縮して、もとの管の１ｍＬのＲＩＡ緩衝液の
洗浄液を加えた１．５ｍＬのエッペンドルフ管に移す。

【００６３】ＧＬＰ−１（７−３７）のアナログを使用
する場合に任意のアナログまたはそのフラグメントを精
製するために、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１（７−３７）を
認識するがＧＬＰ−１（７−３６）を認識しない、２４
〜３７位の残基に対応する合成ペプチドに対して調製さ
れた、５μｌの抗血清で濃縮物を、処理する。より短い
型のアナログを使用する場合には、他のカルボキシ末端
特異的抗血清（同様にして調製されるが、免疫原として
２４〜３４位、２４〜３５位または２４〜３６位の残基
に対応するペプチドが用いられる）を使用する。これ
に、ＰＢＳ中に１０％（ｗ／ｖ）のタンパク質Ａ−セフ
ァロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を溶解した１００μｌ
の溶液を加え、この混合物を静かに揺り動かしつつ４℃
にて一晩かけてインキュベートした。次いで、セファロ
ースを、エッペンドルフ遠心分離機中で５秒間４℃にて
回転させて、ペレット状にして、その後にこのペレット
を、冷ＲＩＡ緩衝液を用いて２回、冷ＰＢＳを用いて４
回洗浄する。

【００６４】ニュージーランドホワイトラビットの体内
で、ＧＬＰ−１（７−３７）の２４〜３７位の残基に対
応する合成ペプチドフラグメントに対するポリクローナ
ル抗体を誘起させた。この誘起には、Ｍｏｓｊｏｙ，Ｓ
らのＪＢｉｏｌＣｈｅｍ（１９８６）２６１：１１
８８０−１１８８９に記載の方法を用いた。初期免疫感
作を、鼠径部リンパ節中に行い、完全フロイントアジュ
バントを使用した。初期免疫感作の後に、１週間毎に皮
下追加免疫注射（ｂｏｏｓｔｓ）を２回行い、不完全フ
ロイントアジュバントを使用した。１回の免疫感作また
は追加免疫注射のために、１００μｇのペプチドおよび
１００μｇのメチル化されたＢＳＡを０．３ｍＬのリン
酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解し、これを０．９
ｍＬのアジュバントで乳化させた。初期免疫感作から６
週間後に、採血（５０ｍＬ）を開始し、その後、１ヶ月
ごとに行った。力価が前回の採血時に比べて顕著に低下
した場合には、追加免疫注射を再度上記のように行っ
た。

【００６５】血液を４℃で一晩かけて凝結させることに
よって、血清を調製した。血餅を、２０００ｇで１５分
間遠心分離することによってペレット状にして、血清を
取り出した。血清を、各々同じ量になるように分割し、
−２０℃または−８０℃で保存する。

【００６６】次に、各１００μｌの緩衝液Ｂの洗浄液を
用いて、抗体タンパク質−Ａセファロース複合体からの
ペプチドの溶出を３回行う。次に、全体で３００μｌと
なった洗浄液をＡＢＩ型４７７Ａシーケンサーに直接か
ける。シーケンサーは、製造者の指示書に従って使用さ
れる。その後、各サイクルで得られる画分を取って、カ
ウントを行う。カウントは、４ｍＬのシンチレーション
水溶液（ＡＣＳ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で行われ得る。

【００６７】標識が出現するサイクルは、Ｎ末端からの
分解の程度を示す。ＧＬＰ−１（７−３７）アナログに
おいてＮ末端からの分解が生じない場合には、１９位の
チロシンに対応する１３番目のサイクルで全ての標識が
出現する。分解が生じると、標識はこれより前のサイク
ルに出現する。

【００６８】（Ｂ．ＲＰ−ＨＰＬＣによるアッセイ）上
記の方法は、血漿中でのより長い半減期を示すための明
らかな基準となるが、この特性を調べるための他のアッ
セイ形態を使用することもできる。ある好適なアッセイ
では、逆相−ＨＰＬＣを使用してアナログを分析するこ
とによってフラグメントへの分解を調べることができ
る。なぜならば、フラグメントがアナログ自体とは異な
る保持時間を有するからである。このアッセイでは、ア
ナログを血漿中に加え、これを放置する時間を様々に変
えて、ラジオラベルシーケンシング分析に使用される上
記の方法と類似の態様でアナログを回収する。具体的に
は、ＲＩＡ緩衝液中の１００ｎＭの濃度のアナログを１
ｍＬの血漿中に入れて、最終的な濃度を１ｎＭとし、こ
れを３７℃の循環水浴中で設定時間を様々に変えてイン
キュベートする。その後に、血漿をバシトラシン中で濃
度０．１％（ｗ／ｖ）にすることによって、反応を停止
させる。

【００６９】次いで、ペプチドを上記のようにＳｅｐ−
Ｐａｋ抽出によって精製する。溶出液をＳｐｅｅｄ−ｖ
ａｃ上で約１ｍＬまで濃縮し、１ｍＬの蒸留水で希釈
し、８０℃で凍結させて、一晩凍結乾燥させる。この粉
体を、１ｍＬの出発血漿当り０．５ｍＬの緩衝液Ｃ
（０．１％のＴＦＡ水溶液）中で、再度懸濁させた後
に、０．２５ｍＬをＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ
１０９ＯＬ液体クロマトグラフ上に注入する。液体クロ
マトグラフには、Ｂｒｏｗｎｌｅｅの２ｃｍのＣ１８ガ
ードカラムと共にＡｌｌｔｅｃｈＣ１８カラム（０．
４５×２５ｃｍ；粒径１０μｍ）を使用する。実験中ず
っとＯＤ２１４において抽出をモニターする。溶媒の流
速は１ｍＬ／分であった。緩衝液Ｃと緩衝液Ｄ（アセト
ニトリル中の０．１％のＴＦＡ）との間の勾配を４０分
間の実験時間に渡って設定する。勾配は、開始時に３５
％Ｄとし、注入後２分間はこれを維持し、その後の２４
分間で４２％Ｄまで増加させる。勾配を、次の２分間で
６０％Ｄまで増加させて、２分間このレベルを維持し、
その次の２分間で３５％Ｄに戻す。実験の残りの８分間
は３５％Ｄに維持する。各実験の最初の３０分間に、画
分を０．５分毎に回収して、Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ中で乾
燥する。試料を、ＲＩＡ（Ｃ末端特異的抗血清に対する
結合のための、標識されたＧＬＰ−１（７−３７位）と
の競合を測定する）によって、または、従来のもしくは
好適な他の何れかの方法で分析して、アナログまたはフ
ラグメントの存在を調べることができる。

【００７０】ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ末端もし
くはカルボキシル末端を調べるためのラジオイムノアッ
セイでは、シングルの抗体置換フォーマットを使用す
る。抗体への１２５ＩーＧＬＰー１（７−３７）の結合
が、溶液中の非標識ペプチドの濃度を増加させることに
よって、徐々に置換される。抗体と結合したヨウ素化ペ
プチドを、溶液中の遊離ヨウ素化ペプチドから分離す
る。この分離は、ＰａｎｓｏｒｂｉｎＴＭ（Ｂｏｈｅｒ
ｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いて抗体−ペプチ
ド複合体を沈澱させることによって行われる。次いで、
得られたペレットを、γカウンタによってカウントす
る。

【００７１】（Ｃ．Ｎ末端特異的抗体との結合の消失）
血漿中での半減期を評価する第３の方法では、ポリクロ
ーナルもしくはモノクローナル抗体が用いられる。これ
らの抗体は、Ｎ末端に対して特異的に調製され、分解し
たアナログには結合しない。これらの抗血清は、ＧＬＰ
−１（７−２２）に対応する合成ペプチドに対して誘起
された。このＧＬＰ−１（７−２２）は、カルボキシル
末端に付加的なシステイン残基を含有し、しかも、この
システインを介してＫＬＨに特異的に結合する。この結
合は、Ａｌｄｗｉｎ，Ｌ．らのＡｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８７）１６４：４９４−５０１に
記載されているように、ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＳＮＡを用
いて行われる。ポリクローナル抗体は、ニュージーラン
ドホワイトラビットの体内で生成された。この生成のた
めに、完全フロイントアジュバントで乳化させた５００
μｇの複合体を用いて一次免疫感作を鼠径部リンパ節中
に行い、その後に、２週間毎に不完全フロイントアジュ
バント中の各２００μｇの追加免疫注射を２回行った。
その後に、１ヶ月毎に採血（５０ｍＬ）を行い、力価が
低い場合には、追加免疫注射を行う。モノクローナル抗
体の生成では、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０．５ｍｌの完
全フロイントアジュバント中の２００μｇの複合体を腹
膜を介して注入して免疫処置した。０．５ｍｌの不完全
フロイントアジュバント中の１００μｇの複合体を隔週
でマウスに追加免疫注射した。これらのマウスの脾臓か
ら単離した細胞をＦｏｘ−ＮＹ細胞と融合させて、モノ
クローナル細胞系を産生した。モノクローナル分泌細胞
系は、標準ケーラー−ミルシュタイン技術を用いて産生
される。モノクローナル上澄みおよびポリクローナル血
清を、ＥＬＩＳＡ法を用いてふるい分けすることによっ
て、ＧＬＰ−１（７−３７）と結合しているがＧＬＰ−
１（８−３７）と結合していないものを得る。この特異
性は、標準溶液相ＲＩＡによって確認される。

【００７２】ＧＬＰ−１（７−３７）の分解速度の評価
を、ＲＩＡ緩衝液中のヒト血漿にこのアナログを加える
ことによって行う。一般に、１００倍に濃縮された１０
μＬのペプチドを１ｍＬの血漿に加えて所望の濃度とす
る。次いで、この試料を３７℃の湯浴中でインキュベー
トし、様々な時点で各５０μＬの試料部分を３回づつ取
り出す。これらの試料部分を、直ちにエタノールを用い
て沈澱させて、ラジオイムノアッセイを行う。ラジオイ
ムノアッセイでは、Ｎ末端特異的抗体の、放射性ヨウ素
化されたＧＬＰ−１（７−３７）との結合のための競合
を用いる。放射性ヨウ素化されたＧＬＰ−１（７−３
７）ペプチドと競合する能力の消失は、アナログの分離
を示す。

【００７３】これらの何れのアッセイにおいても、試験
されるアナログの分解速度がＧＬＰ−１（７−３７）に
比べて小さい場合には、そのアナログは向上した安定性
を有している。

【００７４】（アナログ）本発明のアナログは、グルカ
ゴンに比べて高い有効性を有するか、あるいは向上した
耐分解性を有しており、ＧＬＰ−１（７−３４）からＧ
ＬＰ−１（７−３７）の改変型である。これらのアナロ
グのいくつかの例では、あるクラスのアミノ酸が天然の
残基の代わりに置換される。

【００７５】アミノ酸残基は、以下のように、および図
１に示すように、一般的に４つの主要なサブクラスに分
類され得る。

【００７６】酸性：この残基は生理学的ｐＨにおいてＨ
イオンが消失しているために負の電荷を有する。この残
基を含むペプチドが生理学的ｐＨで水性溶媒中に存在し
ている時には、この残基はペプチドのコンフォメーショ
ン中の表面位置を求めて水溶液側に引き付けられる。

【００７７】塩基性：この残基は生理学的ｐＨにおいて
Ｈイオンと結合しているために正の電荷を有する。この
残基を含むペプチドが生理学的ｐＨで水性溶媒中に存在
している時には、この残基はペプチドのコンフォメーシ
ョン中の表面位置を求めて水溶液側に引き付けられる。

【００７８】中性／非極性：これらの残基は生理学的ｐ
Ｈにおいて帯電していない。この残基を含むペプチドが
水性溶媒中に存在している時に、この残基はペプチドの
コンフォメーション中の内側の位置を求めて水溶液と反
発する。これらの残基は、本明細書中では「疎水性」と
も称する。

【００７９】中性／極性：これらの残基は生理学的ｐＨ
において帯電していない。しかし、この残基を含むペプ
チドが水性溶媒中に存在している時には、この残基はペ
プチドのコンフォメーション中の外側の位置を求めて水
溶液側に引き付けられる。

【００８０】個々の残基分子の統計的な集合の中には、
帯電しているものも帯電していないものもあり、水性溶
媒に引き付けられるかまたはこれと反発する程度が大き
い場合あるいは小さい場合があることは、当然理解され
るものである。「帯電している」の定義に適合するに
は、かなりの割合（少なくとも約２５％）の個々の分子
が生理学的ｐＨで帯電している。極性または非極性の分
類に必要な引き付けまたは反発の程度は任意のものであ
り、したがって、本発明により特異的に考案されたアミ
ノ酸は、極性または非極性の何れかに特異的に分類され
た。特に挙げられていない殆どのアミノ酸は、既知の性
質に基づいて分類され得る。

【００８１】アミノ酸残基は、さらに、環式または非環
式、芳香族または非芳香族、および小型または大型とし
て分類される。環式または非環式、および芳香族または
非芳香族という分類は、残基の側鎖置換基に関する独特
な分類である。残基が、カルボキシルの炭素を含む合計
４個以下の炭素原子を含有する場合には、小型と考えら
れる。小型の残基は、当然、常に非芳香族である。

【００８２】天然のタンパク質アミノ酸については、上
記の理論大系に従う下位分類は以下の通りである（図１
も参照のこと）。

【００８３】酸性：アスパラギン酸およびグルタミン
酸；塩基性／非環式：アルギニン、リシン；塩基性／環式：ヒスチジン；中性／極性／小型：グリシン、セリンおよびシステイ
ン；中性／極性／大型／非芳香族：トレオニン、アスパラギ
ン、グルタミン；中性／極性／大型／芳香族：チロシン；中性／非極性／小型：アラニン；中性／非極性／大型／非芳香族：バリン、イソロイシ
ン、ロイシン、メチオニン；中性／非極性／大型／芳香族：フェニルアラニンおよび
トリプトファン。

【００８４】遺伝子にコードされたアミノ酸プロリン
は、技術的には中性／非極性／大型／環式および非芳香
族のグループに入る。しかし、ペプチド鎖の２次コンホ
メーションへのこのアミノ酸の既知の効果のために特殊
なケースとなり、したがって、この特定の定義されたグ
ループには入らない。

【００８５】ある種のよく見られるアミノ酸は、遺伝子
コードでコードされない。

【００８６】このようなアミノ酸としては、例えば、β
−アラニン（β−ａｌａ）、または３−アミノプロピオ
ン酸、４−アミノ酪酸などの他のω−アミノ酸、α−ア
ミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、サルコシン（Ｓａｒ）、オル
ニシン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモアルギ
ニン（Ｈａｒ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）、
ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）、Ｎ−メチルイソロ
イシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈ
ｇ）、およびシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノル
ロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）並びにメ
チオニンスルホキシド（ＭＳＯ）がある。これらもま
た、適切に特定のカテゴリーに属する。

【００８７】上記の定義に基づいて、Ｓａｒおよびβ−
ａｌａは中性／非極性／小型であり；ｔ−ＢｕＡ、ｔ−
ＢｕＧ、Ｎ−ＭｅＩｌｅ、ＮｌｅおよびＣｈａは、中性
／非極性／大型／非芳香族であり；ＨａｒおよびＯｒｎ
は塩基性／非環式であり；Ｃｙａは酸性であり；Ｃｉ
ｔ、アセチルＬｙｓ、およびＭＳＯは、中性／極性／大
型／非芳香族であり；そして、Ｐｈｇは、中性／非極性
／大型／芳香族である。

【００８８】図１も参照のこと。

【００８９】種々のω−アミノ酸は、サイズによって、
中性／非極性／小型（β−ａｌａ、即ち、３−アミノプ
ロピオン酸、４−アミノ酪酸）または大型（その他全て
のω−アミノ酸）に分類される。

【００９０】遺伝子にコードされたアミノ酸に代わる他
のアミノ酸置換物もまた、本発明の範囲のペプチド化合
物に含まれ、この一般理論大系の範囲で分類され得る。

【００９１】本発明のＧＬＰ−１アナログ化合物の記載
に使用する命名は、ペプチド中の各アミノ酸の左にアミ
ノ基、右にカルボキシ基があると仮定する従来の命名法
に従う。本発明の選択された特異的な実施態様を表示す
る式において、アミノおよびカルボキシ末端基は、多く
の場合特に示していないが、他に明示していない限り、
生理学的ｐＨ値において呈するであろう形態をとること
は理解される。したがって、生理学的ｐＨにおけるＮ末
端Ｈ⁺ ₂およびＣ末端Ｏ^-は、必ずしも明示および図示さ
れているわけではないが、特定の実施例または一般式中
で存在すると理解される。

【００９２】上記の説明は、中性ｐＨでの末端の状態に
関するものであるが、ペプチドの酸性付加塩または塩基
性塩もまた本発明の範囲に含まれる。高いｐＨでは、Ｃ
末端およびカルボキシルを含有する側鎖の塩基性塩が、
毒性のない薬学的に許容可能な塩基から形成され得る。
適切な逆のイオンとして、例えばＮａ⁺、Ｋ⁺、Ｃａ⁺⁺な
どがある。適切な薬学的に許容可能な毒性のない有機陽
イオンもまた、逆のイオンとして使用できる。さらに、
上記のように、ペプチドが、対応するアミドとして調製
され得る。

【００９３】Ｎ末端またはアミノ基含有側鎖に関する適
切な酸性付加塩としては、塩酸、硫酸、もしくははリン
酸などの無機酸から形成される塩、および、酢酸、クエ
ン酸などの有機酸または他の薬学的に許容可能な毒性の
ない酸から形成される塩がある。

【００９４】提示されるペプチドでは、コードされた各
残基は、適切な位置で、以下の従来の表に従って、アミ
ノ酸の慣用名に対応する一文字表記によって表示され
る。

【００９５】アミノ酸一文字記号アラニンＡアルギニンＲアスパラギンＮアスパラギン酸ＤシステインＣグルタミンＱグルタミン酸ＥグリシンＧヒスチジンＨイソロイシンＩロイシンＬリシンＫメチオニンＭフェニルアラニンＦプロリンＰセリンＳトレオニンＴトリプトファンＷチロシンＹバリンＶ。

【００９６】遺伝子的にコードされていないアミノ酸
は、前述のように略記される。

【００９７】本出願の特異的なペプチドは、上付き文字
のダガー（†）によって他に明示しない限りは、光学異
性体を有するＬ型の何れかのアミノ酸残基を意味するも
のとする。本発明のペプチドのアナログ中の残基は、通
常、天然Ｌ光学異性体型である。ただし、１個または２
個の、好ましくは１個のアミノ酸が、天然のアミノ酸に
代わって置換される特定の「同一アミノ酸のＤ型」の他
に、Ｄ配置となり得る。

【００９８】特異的なアナログの指定に使用する表記法
では、改変された位置を、置換アミノ酸に対する上付き
文字として示す。したがって、（Ｈ†）⁷−ＧＬＰ−１
（７〜３７）は、表示されたＧＬＰ−１（７〜３７）に
おいて、７位がＤ型のヒスチジンに置換された形態であ
る。（Ｓ）²²（Ｒ）²³（Ｒ）²⁴（Ｑ）²⁶−ＧＬＰ−１
（７〜３７）は、７〜３７のＧＬＰにおいて、２２位で
セリンに、２３位および２４位でアルギニンに、さらに
２６位でグルタミンに置換された形態である。

【００９９】（好ましい実施態様）（Ａ．向上した刺激性を有するアナログ）向上したイン
スリン刺激活性を有するアナログに関して、本発明の特
に好ましいアナログ組成物は、ＧＬＰ−１の切断型に比
べて、限られた数の改変または置換が行われているのみ
のものである。したがって、好ましいアナログは、発明
の開示の節で上述した段落（ａ）〜（ｅ）の内の僅か１
つまたは２つの段落に記載の改変が行われているもので
ある。

【０１００】したがって、本発明の好ましいアナログと
しては、（７〜３４）、（７〜３５）、（７〜３６）ま
たは（７〜３７）の形態のＧＬＰ−１において、２６位
および／もしくは３４位のリシンを中性アミノ酸、アル
ギニンもしくはＤ型のリシンに、並びに／または３６位
のアルギニンを中性アミノ酸、リシンもしくはＤ型のア
ルギニンに置換した（段落（ａ））だけのものがある。
特に好ましいものでは、２６位および３４位のリシンに
代わって置換されるアミノ酸が、Ｋ†、Ｇ、Ｓ、Ａ、
Ｌ、Ｉ、Ｑ、Ｒ、Ｒ†およびＭからなる群より選択さ
れ、かつ３６位のアルギニンに代わって置換されるアミ
ノ酸が、Ｋ、Ｋ†、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｑ、Ｍおよび
Ｒ†からなる群より選択される。

【０１０１】３１位のトリプトファンに代えて耐酸化性
アミノ酸に置換することのみによって改変したアナログ
もまた好ましい（段落（ｂ））。特に好ましい置換アミ
ノ酸は、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＡおよびＹからなる群より選
択される。

【０１０２】段落（ｃ）に記載の特異的な置換のうちの
少なくとも１種類による改変のみを行ったアナログもま
た好ましい。特に好ましいアナログでは、２２位のＧが
Ｓに、２３位のＱおよび２４位のＡがＲに、かつ２６位
のＫがＱに全て置換されているか、または、１６位のＶ
がＹに、かつ１８位のＳがＫに置換されているか、ある
いは、これらの置換に加えて２１位のＥがＤに置換され
ている。

【０１０３】段落（ｄ）に記載の改変のみを行ったアナ
ログもまた好ましい。これらのアナログの内の特に好ま
しいものにおいては、８位のアラニンに代えて置換され
る小型の中性アミノ酸が、Ｓ、Ｓ†、Ｇ、Ｃ、Ｃ†、Ｓ
ａｒ、Ａ†、β−ａｌａおよびＡｉｂからなる群より選
択され；並びに／または、９位のグラタミン酸に代えて
置換される酸性もしくは中性アミノ酸が、Ｅ†、Ｄ、Ｄ
†、Ｃｙａ、Ｔ、Ｔ†、Ｎ、Ｎ†、Ｑ、Ｑ†、Ｃｉｔ、
ＭＳＯおよびアセチル−Ｋからなる群より選択され；並
びに／または、１０位のグリシンに代えて置換される他
の中性アミノ酸が、Ｓ、Ｓ†、Ｙ、Ｙ†、Ｔ、Ｔ†、
Ｎ、Ｎ†、Ｑ、Ｑ†、Ｃｉｔ、ＭＳＯ、アセチル−Ｋ、
ＦおよびＦからなる群より選択され；並びに／また
は、１５位のＥがＤに置換される。

【０１０４】７位のみが改変された（段落（ｅ））アナ
ログもまた好ましい。好ましい置換では、７位のヒスチ
ジンに代えて置換されるアミノ酸が、Ｈ†、Ｙ、Ｙ†、
Ｆ、Ｆ†、Ｒ、Ｒ†、Ｏｒｎ、Ｏｒｎ†、Ｍ、Ｍ†、Ｎ
−ホルミル−Ｈ、Ｎ−ホルミル−Ｈ†、Ｎ−アセチル−
Ｈ、Ｎ−アセチル−Ｈ†、Ｎ−イソプロピル−Ｈ、Ｎ−
イソプロピル−Ｈ†、Ｎ−アセチル−Ｋ、Ｎ−アセチル
−Ｋ†、ＰおよびＰ†からなる群より選択される。

【０１０５】以下の特異的な実施態様に加えて、上記の
改変型のクラスの僅か２種類の組み合わせを有する実施
態様もまた好ましい。

【０１０６】以下の特異的なアナログが好ましい。

【０１０７】（Ｈ†）⁷−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（Ｙ）⁷−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（Ｎ−アセチル−Ｈ）⁷−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（Ｎ−イソプロピル−Ｈ）⁷−ＧＬＰ−１（７〜３
７）；（Ａ†）⁸−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（Ｅ†）⁹−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（Ｄ）⁹−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（Ｄ†）⁹−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（Ｆ†）¹⁰−ＧＬＰ−１（７〜３７）；（Ｓ）²²（Ｒ）²³（Ｒ）²⁴（Ｑ）²⁶−ＧＬＰ−１（７〜
３７）；および（Ｓ）⁸（Ｑ）⁹（Ｙ）¹⁶（Ｋ）¹⁸（Ｄ）²¹−ＧＬＰ−１
（７〜３７）。

【０１０８】（Ｂ．向上した安定性を有するアナログ）
向上した安定性を有するアナログの好ましい形態におい
てもまた、僅か１種類、または多くとも２種類のアミノ
酸改変が行われている。

【０１０９】７位のヒスチジンに代えて置換される好ま
しいものとしては、Ｄ型の酸性もしくは中性アミノ酸ま
たはＤ型のヒスチジンがある。Ｐ†、Ｄ†、Ｅ†、Ｎ
†、Ｑ†、Ｌ†、Ｖ†、Ｉ†およびＨ†が好ましい。

【０１１０】７位のヒスチジン、またはこれと置換され
たアミノ酸（ＤもしくはＬ）もまた、Ｎアルキル化（１
−６Ｃ）またはＮアシル化（１−６Ｃ）され得る。

【０１１１】アルキル基は、Ｃで示されたメンバーの、
直鎖または枝分かれ鎖（環式を含む）のヒドロカルビル
（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｙｌ）残基である。アシル基は、
式ＲＣＯ−で示され、式中、Ｒは上に定義したように、
アルキルである。好ましいアルキル基は、ι−プロピ
ル、α−プロピルおよびエチルであり、好ましいアシル
は、アセチルおよびプロピオニルである。アルキル化も
しくはアシル化され得る好ましい残基としては、Ｄもし
くはＬ型の、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｋおよ
びＨがある。

【０１１２】８位のアラニンに代えて置換される好まし
いものとしては、Ｄ型のＰ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＡがあ
る。Ｄ型のＤ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｔ、ＳおよびＨもまた
好ましい。

【０１１３】以下に実証されるように、ある特定のアナ
ログの中には向上したインスリン放出刺激活性と向上し
た安定性との両方を呈するものがあることは理解され
る。

【０１１４】（調製）本発明のアナログは、ペプチド合
成のための標準固相技術を用いて調製され得る。一般に
知られているように、必要な長さのペプチドは、市販の
器具および試薬を用いて調製され得る。その際には、製
造業者の指示書に従って、妨害基の阻止、反応するアミ
ノ酸の保護、反応しない残基のカップリング、脱保護、
およびキャッピングが行われる。適切な器具は、例え
ば、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの
ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓまたはＳａｎ
Ｒａｐｈａｅｌ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＢｉｏｓｅａ
ｒｃｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手され得る。

【０１１５】好ましい方法では、標準自動固相合成プロ
トコルを用いてペプチドが合成され、その際には、適切
に側鎖を保護されたｔ−ブトキシカルボニル−α−アミ
ノ酸を使用する。完成したペプチドを、標準フッ化水素
法を用いて、固相支持体から除去し、同時に側鎖の脱保
護を行う。粗ペプチドを、さらに、半予備逆相−ＨＰＬ
Ｃ（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）（Ｖｙｄａｃ
Ｃ１８）によって、０．１％のトリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）中のアセトニトリル勾配を用いて精製する。ペプ
チドを真空乾燥させることによりアセトニトリルを除去
し、そして、０．１％ＴＦＡ水溶液から凍結乾燥させ
る。純度を分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって確認する。ペプ
チドを、凍結乾燥させて、水または０．０１Ｍの酢酸中
に重量１〜２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させ得る。

【０１１６】上記の合成方法の使用は、コードされてい
ないアミノ酸またはＤ型のアミノ酸がペプチド中にある
場合に必要となる。しかし、遺伝子にコードされたペプ
チドに関しては、市販の発現システムで容易に合成され
たＤＮＡ配列を使用する組換え技術を用いることもでき
る。

【０１１７】（処方および投与）本発明のアナログはＩ
Ｉ型糖尿病の治療に有用である。アナログは、当該分野
で一般に知られているように種々の処方で全身に投与さ
れ得る。ペプチド投与の特定の形態に適切な処方は、例
えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓ
ｙｌｖａｎｉａの最新版に記載されている。一般的に、
処方では、効果的な量のアナログまたは複数種類のアナ
ログの混合物、および少なくとも１種類の薬学的に許容
可能な賦形剤が使用される。

【０１１８】種々の投与形態が、全身治療に効果的であ
る。投与形態には、例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下
注射および腹腔内注射などの注射、適切な坐薬またはス
プレーを用いる経膜または経皮投与、並びに、適切に処
方される場合には、経口投与がある。注射のための適切
な賦形剤としては、ハンクス液およびリンガー液などの
種々の生理学的緩衝剤がある。適切な経膜または経皮処
方は、胆汁酸塩（ｂｉｌｅｓａｌｔ）またはフシデー
ト（ｆｕｓｉｄａｔｅｓ）などの浸透剤を含有する。典
型的な経口処方は、活性成分の消化を阻害する保護剤を
含有する。ピロドリンおよびメチルセルロースなどの高
分子マトリックスを用いる種々の遅延性処方もまた利用
可能である。他の薬剤送達システムには、リポソームお
よびマイクロエマルションがある。種々の処方が実施可
能であり、選択されたペプチドのための適切な処方およ
び投与経路の提供は、一般に実施者によって理解され
る。

【０１１９】本発明の化合物の典型的な投与量は、約１
ｐｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ（体重）である。但し、この
投与量は概算であり、アナログの有効性、循環半減期、
被験体の個々の特徴などの多くの要因に左右される。各
個体の糖尿病治療におけるインスリン投与の最適化は、
充分に確立されており、類似の最適化プロトコルがここ
で使用される。

【０１２０】

【実施例】以下の実施例は、本発明を説明するためのも
のであり、限定するものではない。

【０１２１】（実施例１）（本発明のアナログにより向上したインスリン刺激）図
２に示すように、天然の構造を改変する種々の置換基を
有する本発明のアナログが調製された。これらのアナロ
グの内の幾つかを上記のアデニル酸シクラーゼアッセイ
で試験した。その結果を表１に示す。

【０１２２】

【表１】従って、本発明の様々なアナログが、インスリンに対す
る挙動を調べるアッセイにおいて、有用な範囲の有効性
を示している。

【０１２３】（実施例２）（ＧＬＰ−１アナログの向上した安定性）（Ａ．不活性化形態の証明）ＧＬＰ−１（７−３７）切
断型のホルモンをラジオヨウ素化し、精製したペプチド
を血漿とともにインキュベートし、上記のように、ラジ
オラベルシーケンシングによってアッセイした。０分
後、１５分後、および６０分後に、サンプルのシーケン
シングを行った。０分時では、サイクル１３で、放射能
の単一ピークが発見され、分解がないことが示された。
１５分後では、サイクル１３で、放射能の量が減少し、
サイクル１１で増加した。インキュベーションの６０分
後、実質的にすべてのカウントが、サイクル１１で現れ
た。

【０１２４】従って、単一のジペプチジルアミノペプチ
ダーゼ開裂が、ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチドの分解
に関与していると思われる。

【０１２５】上記の結果は、Ｎ末端特異的およびＣ末端
特異的抗血清を使用するＲＩＡによって測定されるよう
な分解と一致している。上記のように血漿とともにイン
キュベートし、ＲＩＡでテストしたところ、回収したフ
ラグメントがラジオラベルされたＧＬＰ−１（７−３
７）のカルボキシ末端特異的抗体への結合を阻害する、
の能力は減少していなかった。しかし、１時間後には、
アミノ末端特異的抗体への結合を阻害する能力は、ほと
んど０まで減少した。

【０１２６】（Ｂ．ラジオラベルシーケンシングにより
テストされたＧＬＰ−１（７−３７）アナログ）９位に
Ｄ−Ａｓｐまたは８位にＤ−Ａｌａを含むＧＬＰ−１
（７−３７）アナログを使用して、分解分析のラジオラ
ベルシーケンシングを行った。このアッセイの結果を図
３に示す。図３Ａは、（Ｄ†）⁹−ＧＬＰ−１（７−３
７）の結果を示し、図３Ｂは、（Ａ†）⁸−ＧＬＰ−１
（７−３７）の結果を示す。これらの図に示されるよう
に、（Ｄ†）⁹アナログは、ＧＬＰ−１（７−３７）と
同様に分解する。一方、（Ａ†）⁸アナログは、６０分
後には、ほとんど分解を示さなかった。

【０１２７】（Ｃ．ＲＩＡによりテストされたアナロ
グ）Ｎ末端特異的抗体は、アナログの分解を測定するの
に使用され得る。但し、この抗体が、Ｎ末端に改変を含
むこれらのアナログと交差反応する能力をもつ場合に限
られる。図４は、７位、８位、および９位で改変された
アナログの結果を示す。（Ｙ）⁷、（Ｈ†）⁷、および
（Ａ†）⁸は、高濃度でではあるが、交差反応が可能で
あり、（Ｄ†）⁹は可能でない。交差反応ペプチドを高
濃度（１０−１００ｎＭ）で６０分間、血漿とともに
インキュベートし、Ｎ末端特異的抗体に対するＲＩＡを
使用するＲＩＡでテストした。パラグラフＢの結果に一
致して、（Ａ†）⁸アナログは、６０分後には分解せ
ず、（Ｈ†）⁷アナログも分解しなかった。しかし、
（Ｙ）７アナログは分解した。

【０１２８】（Ｄ．ＨＰＬＣによる、アナログのプロテ
アーゼ耐性）ＧＬＰ−１（７−３７）と比較した場合
の、様々なアナログの分解耐性もまた、上記のように、
ＨＰＬＣによってテストした。血漿中でのインキュベー
ションを６０分間行い、この後、分解は観察されなかっ
た。すなわち分解は完了した。その結果を表２に示す。

【０１２９】

【表２】本発明は、ＩＩ型糖尿病の治療に対して改良された特徴
を有する、活性ＧＬＰ−１ペプチド、７−３４、７−３
５、７−３６および７−３７の有効なアナログを提供す
る。これらのアナログは、７−１０位でアミノ酸が置換
されており、および／またはＣ末端が切断され、および
／または基本のペプチド中に様々な他のアミノ酸置換を
含む。アナログは、グルカゴンと比較して、インシュリ
ン生産を刺激する能力が向上し、ＧＬＰ−１（７−３
７）と比較してプラズマ中での安定性が向上され得る
か、あるいはその両方である。このような特性は、治療
薬としてのアナログの能力を向上させる。７および８位
にＤ形アミノ酸置換、および／または７位にＮアルキル
化またはＮアシル化アミノ酸を有するアナログは、イン
ビボにおいて、特に分解耐性である。

【０１３０】

【発明の効果】本発明は、７−１０位でアミノ酸が置換
されており、および／またはＣ末端が切断され、および
／または基本のペプチド中に様々な他のアミノ酸置換を
含む活性ＧＬＰ−１ペプチド、７−３４、７−３５、７
−３６および７−３７の有効なアナログを提供すること
によって、ＩＩ型糖尿病の治療に対して改良された特徴
を有する活性ＧＬＰ−１ペプチド、７−３４、７−３
５、７−３６および７−３７の有効なアナログを提供す
る。本発明のアナログは、グルカゴンと比較して、イン
シュリン生産を刺激する能力が向上し、ＧＬＰ−１（７
−３７）と比較してプラズマ中での安定性が向上され得
るか、あるいはその両方であり、７および８位にＤ形ア
ミノ酸置換、および／または７位にＮアルキル化または
Ｎアシル化アミノ酸を有するアナログは、インビボにお
いて、特に分解耐性である。このような特性は、治療薬
としてのアナログの能力を向上させる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本明細書で使用するアミノ酸の分類の
概略を模式的に示したものである。

【図２】図２は、本発明の種々の化合物を表に示したも
のである。

【図３Ａ】図３Ａは、血漿中の２種類のアナログの血漿
中での分解を調べるためのラジオラベルシーケンシング
分析の結果を示す。

【図３Ｂ】図３Ｂは、血漿中の２種類のアナログの血漿
中での分解を調べるためのラジオラベルシーケンシング
分析の結果を示す。

【図４】図４は、アミノ末端領域に改変を加えたＧＬＰ
−１（７−３７）のアナログによる、アミノ末端特異的
抗血清からの１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（７−３９）の置換
の結果を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１３年２月１６日（２００１．２．１
６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図２Ａ】図２Ａは、本発明の種々の化合物を表に示し
たものである。

【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の種々の化合物を表に示し
たものである。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】削除

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２Ａ

【補正方法】追加

【補正内容】

【図２Ａ】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２Ｂ

【補正方法】追加

【補正内容】

【図２Ｂ】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 500473852 215 ＢｒｏｏｋｗｏｏｄＲｏａｄ，Ｗｏｏｄｓｉｄｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94062 ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ (71)出願人 500473863 ジョエルエフ．ハベナーＪＯＥＬＦ．ＨＡＢＥＮＥＲアメリカ合衆国マサチューセッツ 02161 ニュートンハイランズ，プリマスロード 217 217 ＰｌｙｍｏｕｔｈＲｏａｄ，ＮｅｗｔｏｎＨｉｇｈｌａｎｄｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ 02161 ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ (71)出願人 500473874 ジョアンヌビー．マロリーＪＯＡＮＮＥＢ．ＭＡＬＬＯＲＹアメリカ合衆国カリフォルニア 94086 サニーベイル，エイピーティー．９アカーレンズ 243 243 Ａｃａｌａｎｅｓ，Ａｐｔ．９, Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94086 ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ (71)出願人 500473885 スベトラーナモジュゾフＳＶＥＴＬＡＮＡＭＯＪＳＯＶアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨーク，イーストシックスティサードストリート 504 504 Ｅａｓｔ 63ｒｄＳｔｒｅｅｔ, ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ 10021 ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ (72)発明者ダグラスアイ．バックレイアメリカ合衆国カリフォルニア 94062, ウッドサイド，ブルックウッドロード 215 (72)発明者ジョエルエフ．ハベナーアメリカ合衆国マサチューセッツ 02161 ニュートンハイランズ，プリマスロード 217 (72)発明者ジョアンヌビー．マロリーアメリカ合衆国カリフォルニア 94086 サニーベイル，エイピーティー．９アカーレンズ 243 (72)発明者スベトラーナモジュゾフアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨーク，イーストシックスティサードストリート 504

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＩＩ型糖尿病の治療薬として有用なペプ
チドであって、該ペプチドが、島細胞からのインシュリ
ンの放出を刺激するのに、グルカゴンよりも強力であ
り、該ペプチドが、実質的に、ＧＬＰ−１（７−３
４）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３
６）またはＧＬＰ−１（７−３７）あるいはそのＣ末端
アミド形態からなり、以下よりなる群から選択される少
なくとも１つの改変を有する、ペプチド：（ａ）２６位および／または３４位のリシンを、中性ア
ミノ酸、アルギニンまたはＤ形リシンに置換、および／
または３６位のアルギニンを、中性アミノ酸、リシンま
たはＤ形アルギニンに置換；（ｂ）３１位のトリプトファンを、酸化耐性アミノ酸に
置換；（ｃ）以下の少なくとも１つの置換：１６位のＶをＹ
に；１８位のＳをＫに；２１位のＥをＤに；２２位のＧ
をＳに；２３位のＱをＲに；２４位のＡをＲに；および
２６位のＫをＱに；（ｄ）以下の少なくとも１つを含む置換：８位のＡを、
他の小中性アミノ酸に；９位のＥを、他の酸性アミノ酸
または中性アミノ酸に；１０位のＧを、他の中性アミノ
酸に；および１５位のＤを、他の酸性アミノ酸に；なら
びに（ｅ）７位のヒスチジンを、他の中性アミノ酸、あるい
はＤまたはＮアシル化またはアルキル化形のヒスチジン
に置換、ここで、（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）におい
て、置換するアミノ酸は、必要に応じて、Ｄ形であり
得、そして７位に置換するアミノ酸は、必要に応じて、
Ｎアシル化またはＮアルキル化形であり得る。