KR20060013369A - 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산방법 및 신규 재조합 단백질 - Google Patents

재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산방법 및 신규 재조합 단백질 Download PDF

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유지 하야시
아끼라 다시따
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Abstract

본 발명은 재조합 단백질을 식물 저장 기관 중에 다량 생산시키는 방법, 및 GLP-1 유도체를 제공한다. 또한, 본 발명은 재조합 단백질의 유전자, 사이토카인 관련 유전자, 약제 내성 유전자 및 이탈능을 갖는 DNA 인자를 포함하고, 사이토카인 관련 유전자와 약제 내성 유전자는 이탈능을 갖는 DNA 인자와 함께 거동하는 위치에 존재하며, 식물의 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질은 이탈능을 갖는 DNA 인자와 함께 거동하지 않는 위치에 존재하는 벡터를 이용하여 형질전환함으로써 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관을 수득한다. 상기 방법에 의해 GLP-1을 생산하고, 추가로 효소의 분해 작용에 대하여 안정화된 유도체를 제공한다.
재조합 단백질, , 사이토카인 관련 유전자, 약제 내성 유전자, 이탈능을 갖는 DNA 인자, 식물 저장 기관, 벡터, 형질전환

Description

재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법 및 신규 재조합 단백질 {Process for Producing Plant Storage Organ with High Production of Recombinant Protein and Novel Recombinant Protein}
본 발명은 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관을 생산하는 방법, 및 펩티다제 내성화된 인간 글루카곤 형태의 펩티드-1 (GLP-1)의 신규 유도체와 그의 이용에 관한 것이다. 또한, 본 발명에서 「재조합 단백질」이란, 「재조합 펩티드 및 재조합 단백질」을 포함하는 것이다 (이하, 「재조합 단백질」이라고 함).
유전자 공학 기술을 이용한 의약품, 임상 검사약이나 공업 원료의 생산은 이미 실산업에서 많은 공헌을 하고 있으며, 그 중에서도 미생물 또는 포유류 배양 세포를 숙주로 하는 물질 생산 시스템은 특히 널리 이용되고 있다. 그러나, 이들 세포를 배양하기 위해서는 무균 환경이 정비된 배양 설비나 배지 등이 필요하며, 석유 에너지의 소비를 피할 수 없기 때문에 비용 상승으로 이어지고 있다. 또한, 포유류 세포를 숙주로서 사용하면, 인체에 유해한 바이러스가 혼입되는 위험을 피할 수 없다.
따라서, 미생물 또는 포유류 세포의 배양에 따른 물질 생산을 대신하는, 저 렴하고 안전한 물질 생산 시스템으로서 형질전환 식물을 이용한 물질 생산 시스템의 개발이 행해지고 있다. 예를 들어, 생분해성 폴리에스테르 등의 고분자 화합물(일본 특허 공개 제2002-262886호 공보), 백신 (예를 들어 문헌 [D. G. Jaeger et al., Eur. J. Biochem. 259, 426, 1999]) 또는 락토페린 [D. Chong et al., Transgenic. Res. 9, 71, 2000] 등의 단백질, 엔케팔린 (일본 특허 공개 제2000-106890호 공보) 등의 펩티드를 생산하는 형질전환 식물의 제조가 현재까지 보고되어 있다.
형질전환 식물의 경우, 그 식물의 가식부, 예를 들어 콩 또는 벼의 종자, 야채의 잎 등에서 인체에 유익한 기능성 물질을 생산시키면, 목적 물질의 추출 공정을 거치지 않고 직접 인체에 경구 섭취시키는 것이 가능하다. 또한, 종자의 경우에는 냉장 장치가 완비된 설비에서 보존 또는 수송을 행할 필요가 없고, 실온에서의 안정적인 장기 보존이 가능하다. 또한, 목적하는 물질을 추출하는 경우에도, 종자는 잎과는 달리 페놀성 물질의 혼입이 거의 없기 때문에 쉽게 정제할 수 있다. 따라서, 종자는 목적하는 유전자 산물을 생산시키는 기관으로서 이상적이라고 여겨지며, 이제까지 예를 들어 글리시닌 [T. Katsube et al., Plant. Physiol. 120, 1063, 1999] 등의 단백질, (1,3-1,4)-β-글루카나제 [H. Horvath et al., Proc. Nathl. Acad. Sci. USA., 97, 1914, 2000] 등의 효소, 엔케팔린 [D. Chong et al., Transgenic. Res., 9, 71, 2000] 등의 펩티드를 생산하는 종자의 제조가 보고되어 있다.
그러나, 형질전환 식물에 의한 물질 생산 시스템은, 상기 우수한 특성을 갖 는 반면, 현재의 주류인 미생물 또는 포유류 세포 배양 시스템에 비하여 생산 효율이 불량하고, 특히 식물 저장 기관에 의한 생산 효율이 불랑하였다. 이 문제를 해결하기 위해, 형질전환 식물에서의 물질 생산 능력의 증강책이 여러가지로 고안되어 있다. 예를 들어, 저장 기관 중 하나인 종자에서의 물질 생산 능력을 개선하기 위해, 도입한 목적 유전자의 발현 또는 유전자 산물의 축적 향상을 도모한다는 관점에서, 종자에서 강력하게 발현되는 종자 저장 단백질의 프로모터의 이용 (예를 들어 문헌 [T. Katsube et al., Plant. Physiol., 120, 1063, 1999]), 이 프로모터와 여기에 작용하여 발현을 향상시키는 전사 인자와의 병용 (예를 들어 문헌 [D. Yang et al., Proc. Nathl. Acad. Sci. USA., 98, 11438, 2001]), 5' 비번역 영역의 삽입 (예를 들어 일본 특허 공개 제2002-58492호 공보), 유전자 중의 C + G 함량의 최적화 [H. Horvath et al., Proc. Nathl. Acad. Sci. USA., 97, 1914, 2000], 소포체로의 이행 신호의 부가 (예를 들어 일본 특허 공개 제2000-504567호 공보) 등에 관한 연구가 적극적으로 행해지고 있다. 또한, 외래 유전자를 도입한 식물체로서 종자 저장 단백질을 결여시킨 돌연변이체를 사용하면 종자에서의 외래 유전자 산물 생산량이 향상된다는 보고도 있다 (일본 특허 공개 제2002-58492호 공보). 그러나, 이러한 개량만으로는 아직 충분히 종자에서의 물질 생산 능력이 증강되었다고는 할 수 없기 때문에 새로운 방법의 개발이 요구되고 있었다.
한편, GLP-1 (글루카곤 형태 펩티드-1)은 음식물 섭취에 의해 소화관으로부터 분비되고, 췌장에서 기능하여 당 의존적인 인슐린 분비를 자극하는 호르몬으로 알려져 있다. 제2형 당뇨병 환자에게는 상기 GLP-1에 대한 응답성은 유지되어 있 지만, 양적인 부족이 문제가 되고 있다. GLP-1제의 개발은 GLP-1의 부족분을 보충하는 인슐린 분비 촉진제로서의 당뇨병 치료약에 대한 응용에 기대가 모아지고 있다. 그러나, GLP-1의 활성 본체는 GLP-1(7-36) 아미드 또는 GLP-1(7-37)의 폴리펩티드이며, GLP-1의 경구 섭취시에는 소화관 내에서 소화 효소에 의해 소화ㆍ분해되어 충분히 흡수되지 않는다. 따라서, 임상에서는 점적에 의한 정맥내 주사나 피하 주사가 시도되고 있는 것이 현실이다. 또한, GLP-1은 혈액 중에 존재하거나 조직에 존재하는 디펩티딜펩티다제 IV (DPP-IV)에 의해 분해되어 활성 반감기가 1 내지 2 분으로 매우 짧고, 신장으로부터 배설되기 쉬우며, 혈중 반감기가 5 분 이내인 것이 보고되어 있어, 이들의 임상적 응용에 문제가 되고 있다.
따라서, 분해되기 어렵고, 반감기가 긴 GLP-1 유도체의 개발이 행해지고 있다. 예를 들어, 위치 8의 아미노산 치환 유도체 [Diabetologia 41, 271-278, 1998, Biochem 40, 2860-2869, 2001], N-말단 및 C-말단 아미노산의 변형체 (WO 9808871 등), 위치 34를 Arg로 치환하여 위치 26의 Lys에 친유성기를 도입한 유도체 (WO 0007617), 및 서열 전반에 걸친 아미노산 치환에 의한 유도체 (WO 9943705, WO 9111457) 등이다. 또한, 피하로부터의 흡수가 느린 서방형 주사제의 개발, 또는 GLP-1 형태의 아고니스트 활성을 가지며 혈중 반감기가 긴 도마뱀 유래의 합성 엑센딘-4(Exendin-4)를 이용한 주사제 개발이 행해지고 있다. 그러나, 이들은 주사제이기 때문에 환자의 부담을 고려하면, 주사 이외의 경로로 투여되는 신규 GLP-1 유도체가 요구된다.
본 발명의 과제는 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관을 생산하 는 방법; 상기 방법에 의해 생산된, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관, 및 펩티다제 내성화된 인간 글루카곤 형태 펩티드-1 (GLP-1)의 신규 유도체와 그 이용을 제공하는 데 있다.
즉, 형질전환 식물의 저장 기관에서의 물질 생산을 증강시키기 위해, 상기와 같은 여러가지 시도가 이루어지고 있다. 그러나, 의약품 등으로서 유용한 재조합 단백질이 생산된 식물 저장 기관을 식사로서 섭취하고, 그 충분한 기능을 체내에서 발휘시키기 위해서는, 재조합 단백질이 더욱 다량으로 생산되는 식물 저장 기관을 생산하는 방법의 개발이 필요하다. 동시에, 식물로부터 재조합 단백질을 추출하여 의약품 또는 기능성 식품으로서 가공하는 경우에도, 이들 저장 기관에 재조합 단백질이 다량 생산되어 있는 것이 비용면에서 중요하다. 따라서, 본 발명의 목적 중 하나는, 형질전환 식물에서 재조합 단백질이 다량 생산되는 저장 기관을 생산하는 신규 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 상기 방법에 있어서 식물 저장 기관 중에서 다량 생산시키는 재조합 단백질로서 GLP-1을 선택하면, 통상적인 식사와 같이 과실 또는 쌀 등을 섭취하는 것만으로도 당뇨병 치료 효과를 기대할 수 있다. 그러나, 상기한 바와 같이, 천연형 GLP-1은 소화관 내에서 소화 효소에 의해 소화ㆍ분해되기 때문에 경구적으로 안정하게 투여할 수 없고, 따라서 현실적으로는 주사 이외의 유효한 투여 방법은 없었다. 따라서, 어떠한 방법에 의해서 소화되지 않은 채로 위를 통과하기만 한다면 소장에서 흡수되지 않을까 여겨진다. 단, 흡수시에는 GLP-1이 단체(單體)로서 존재해야만 한다. 이때, 천연형 GLP-1의 경우에는 트립신 등의 효소에 의해 분해 되어 실활되어 버린다.
또한, 천연형 GLP-1은 흡수된 후에도 디펩티딜펩티다제 IV에 의해 분해되어 지속적인 작용은 기대할 수 없다. 따라서, GLP-1의 경구 투여에 의해 약리 효과를 얻기 위해서는, 아미노산 치환에 의해 트립신 또는 디펩티딜펩티다제 IV에 의해 분해되지 않고 활성이 지속적인 GLP-1 유도체를 고안할 필요가 있다.
따라서, 본 발명의 다른 목적 중 하나는, 트립신 등의 소화 효소에 대한 내성을 가져서 경구 투여가 가능한 신규 GLP-1 유도체, 더욱 바람직하게는 디펩티딜펩티다제 IV에 대한 내성까지 겸비하는 신규 GLP-1 유도체를 제공하는 데 있다. 따라서, 식사로서 섭취된 경우에 흡수되어 약리 효과를 나타내는 GLP-1 유도체를 얻는 것이다.
본 발명자들은 형질전환 식물에서 재조합 단백질이 다량 생산되는 저장 기관을 생산하는 방법에 대하여 심도있게 연구한 결과, 식물의 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질의 유전자, 사이토카인 관련 유전자, 약제 내성 유전자 및 이탈능을 갖는 DNA 인자를 포함하고, 사이토카인 관련 유전자와 약제 내성 유전자는 이탈능을 갖는 DNA 인자와 함께 거동하는 위치에 존재하며, 식물의 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질의 유전자는 이탈능을 갖는 DNA 인자와 함께 거동하지 않는 위치에 존재하는 벡터를 구축하고, 상기 벡터를 세포 중에 도입하여 상기 유전자가 도입된 식물의 세포로부터 형질전환체를 재분화시키고, 이와 같이 재분화된 형질전환체로부터 저장 기관을 수득함으로써 형질전환 식물에서 재조합 단백질이 다량 생산되는 저장 기관을 생산할 수 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
또한, 본 발명에서는, 상기 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관을 생산하는 방법을 당 의존적인 인슐린 분비를 자극하는 호르몬이라고 알려져 있는 GLP-1에 적용함과 동시에, 상기 GLP-1의 유도체를 제조하여 소화 효소 등에 의해 소화ㆍ분해되지 않는다. 또한, 혈장 중에서도 안정한 GLP-1의 유도체를 제공한다. 즉, 본 발명자들은 GLP-1(7-36) 또는 그의 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 및(또는) 부가된 서열을 포함하고 GLP-1 활성을 갖는 펩티드에서 위치 26을 글루타민으로 치환하고 위치 34를 아스파라긴 또는 아스파라긴산으로 치환한 GLP-1 유도체가, 천연형 GLP-1과 동일한 정도의 활성을 유지하고 트립신과 같은 소화 효소에 대한 내성을 가지며 소장에 의해 흡수될 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 추가로 위치 8의 알라닌을 세린 또는 글리신으로 변경함으로써 디펩티딜펩티다제 IV에 대한 내성도 획득하고, 혈장 중에서도 안정하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 또한, 종래에는 펩티드를 경구 투여하는 경우에 위에서 펩신에 의해 분해되어 버리기 때문에 펩티드의 경구 투여가 불가능하였다. 그러나, 본 발명의 식물 저장 기관에서 생산시키면 펩신에 대한 내성을 획득할 수 있고 경구 투여가 가능하다.
도 1은 본 발명의 실시예의 pGlbGLP130Hm 제조 공정 중 pTL7에서부터 pGlbGLP의 제조까지를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예의 pGlbGLP130Hm 제조 공정 중 pUC18 및 pNPI130에서부터 pNPI130PUC의 제조까지를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예의 pGlbGLP130Hm 제조 공정 중 pNPI140 및 pNPI130PUC에서부터 pNPI130Hm의 제조까지를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예 중 pGlbGLP 및 pNPI130Hm에서부터 pGlbGLP130Hm의 제조까지를 나타냄과 동시에, pGlbGLP130Hm의 제한 효소 지도를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예의 실시예 1 및 비교예 1에서 수득한 벼 완숙 종자에서 GLP-1 유도체 융합 단백질의 축적 수준을 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 사용한 종래형 벡터 pGlbGLP-Hm의 제한 효소 지도를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예의 실시예 2에 나타낸 방법에 따라 비교 제조예 1의 GLP-1(7-36 아미드) (천연형 GLP-1), 비교 제조예 2의 [Ser8]-GLP-1(7-36 아미드), 비교 제조예 3의 [Gly8]-GLP-1(7-36 아미드) 및 제조예 1의 [Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36 아미드)의 시클릭 AMP 생산 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 실시예의 실시예 3에 나타낸 방법에 따라 [Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36 아미드)를 트립신 처리하고, 트립신 처리한 것과 처리하지 않은 것에서 시클릭 AMP 생산 활성의 농도 의존성을 비교한 도면이다.
도 9는 본 발명의 실시예의 실시예 4에 나타낸 방법에 따라 실시예 1에서 수 득한 벼 완숙 종자의 백미 및 그 분말 유래의 GLP-1 유도체, 비교 제조예 1의 GLP-1(7-36 아미드) (천연형 GLP-1), 제조예 2의 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36), 제조예 3의 [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36)을 사용하여 펩신에 대한 안정성을 비교한 도면이다.
도 10은 본 발명의 실시예의 실시예 5에 나타낸 방법에 따라 벼 완숙 종자로부터 융합 단백질로서 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)을 추출하고, 이 추출 분획의 트립신 처리 시간과 시클릭 AMP 생산 활성과의 관계를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 실시예의 실시예 6에 나타낸 방법에 따라 비교 제조예 1의 GLP-1(7-36 아미드) (천연형 GLP-1), 제조예 2의 [Ser8, Gln26, Asp34] -GLP-1(7-36), 제조예 3의 [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36)을 이용하여 트립신 내성을 비교한 도면이다.
도 12는 본 발명의 실시예의 실시예 7에 나타낸 방법에 따라 비교 제조예 1의 GLP-1(7-36 아미드) (천연형 GLP-1), 제조예 2의 [Ser8, Gln26, Asp34] -GLP-1(7-36), 제조예 3의 [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36)을 이용하여 DPP-IV 내성을 비교한 도면이다.
도 13은 본 발명의 실시예의 실시예 8에 나타낸 방법에 따라 비교 제조예 1의 GLP-1(7-36) (천연형 GLP-1 아미드), 제조예 2의 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7- 36), 제조예 3의 [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36)을 이용하여 인슐린 분비 촉진 활성을 비교한 도면이다.
도 14는 본 발명의 실시예의 실시예 9에 나타낸 방법에 따라 비교 제조예 1의 GLP-1(7-36 아미드) (천연형 GLP-1), 제조예 2의 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36), 제조예 3의 [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36)을 이용하여 마우스 경구 당 부하 시험에서의 혈당 저하 효과를 비교한 도면이고, 도 15의 0에서부터 120 분까지의 혈당치 변동을 나타내는 그래프의 곡선하면적을 혈당치 변화량으로서 나타낸다.
도 15는 본 발명의 실시예의 실시예 9에 나타낸 방법에 따라 비교 제조예 1의 GLP-1(7-36 아미드) (천연형 GLP-1), 제조예 2의 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36), 제조예 3의 [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36)을 이용하여 마우스 경구 당 부하 시험에서의 혈당 저하 효과를 비교한 도면이고, 0에서부터 120 분까지 혈당치의 경시적인 변화를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
[재조합 단백질을 다량 생산하는 식물 저장 기관의 생산]
본 발명은 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관을 생산하는 방법으로서, 하기 (A), (B), (C)의 과정을 포함한다:
(A) 식물의 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질 유전자, 사이토카인 관련 유전자, 약제 내성 유전자 및 이탈능을 갖는 DNA 인자를 포함하고, 사이토카 인 관련 유전자와 약제 내성 유전자는 이탈능을 갖는 DNA 인자와 함께 거동하는 위치에 존재하며, 식물의 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질 유전자는 이탈능을 갖는 DNA 인자와 함께 거동하지 않는 위치에 존재하는 벡터를 구축하고, 상기 벡터를 세포 중에 도입하는 과정,
(B) 상기 (A)에 의해 벡터가 도입된 식물 세포를 약제 첨가 배지 및 약제 비첨가 배지에서 배양하여 형질전환체를 재분화시키는 과정, 및
(C) 상기 (B)에서 재분화된 형질전환체로부터 식물 저장 기관을 수득하는 과정.
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
대상 식물
본 발명에서 식물 저장 기관의 생산에 사용하는 대상 식물로는 저장 기관이 형성되는 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 쌍자엽 식물로는 담배, 유채씨, 콩 등을 들 수 있고, 단자엽 식물로는 벼, 옥수수, 보리, 밀 등의 곡류 또는 아스파라거스 등을 대표적인 것으로서 들 수 있다. 또한, 본 발명에서 재조합 단백질을 다량 생산시키는 식물 저장 기관은 특별히 한정되지 않지만, 과실, 괴근(塊根), 괴경(塊莖), 종자 등을 대표적인 것으로서 들 수 있다.
사용하는 유전자
본 발명에서 사용하는 유전자는 cDNA 또는 게놈 DNA의 클로닝으로 얻을 수 있다. 또한, 해당 DNA 서열이 이미 명확하다면, 이것을 화학적 합성하여 얻을 수도 있다. 또한, DNA 서열이 명확하지 않더라도 아미노산 서열이 명확하다면, 아미 노산 서열로부터 DNA 서열을 추정하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에서, 유전자는 필요에 따라 그의 발현에 필요한 프로모터 및(또는) 터미네이터의 서열 및 추가로 유전자 산물을 저장 기관에 효율적으로 이행시키는 신호 서열을 연결하여 사용한다. 이들 프로모터, 터미네이터 및 신호 서열은 식물에서 기능하기만 한다면 별도의 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 프로모터로는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 [J. T. 0dell et al., Nature (London), 313, 810, 1985], 노파린 합성 효소의 프로모터 [W. H. R. Langridge et al., Plant Cell Rep., 4, 355, 1985] 등을 사용할 수 있다. 또한, 유도형 프로모터를 사용하면, 유전자 발현을 제어할 수 있다.
이러한 유도형 프로모터는 현재까지 다수가 알려져 있다. 예를 들어, 화학 물질에 반응하여 유도되는 것으로서는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 I계 유전자의 프로모터 (일본 특허 공개 (평)5-268965호 공보), 글루타티온-S-트랜스퍼라제 II계 유전자의 프로모터 (국제 공개 WO 93/01294호 공보), Tet 레프레서 융합형 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 [C. Gatz et al., Mol. Gen. Genet., 227, 229, 1991], Lac 오퍼레이터/레프레서 시스템의 프로모터 (R. J. Wilde et al., The EMBO Journal, 11, 1251, 1992], alcR/alcA 시스템의 프로모터 (국제 공개 WO 94/03619호 공보), 글루코코르티코이드 시스템의 프로모터 [아오야마 다꾸시, 단백질 핵산 효소, 41: 2559, 1996], par 시스템의 프로모터 [T. Sakai et al., Plant Cell Physiol,, 37, 906, 1996] 등이 알려져 있고, 또한 광에 반응하여 유도되는 것으로서는 리불로스 2 인산 카르복실라제의 작은 서브유닛 유전자 (rbcS)의 프로 모터 [R. Fluhr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2358, 1986], 프럭토스-1,6-비스포스파타제 유전자의 프로모터 (일본 특허 공표 (평)7-501921호 공보), 집광성 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자의 프로모터 (일본 특허 공개 (평)5-89호 공보) 등이 알려져 있으며, 그 밖에도 상해, 온도 등의 여러가지 외부 환경 등에 반응하여 유도되는 프로모터가 알려져 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 재조합 단백질 유전자의 프로모터로는 35S 프로모터 등과 같이 항상적(恒常的) 발현을 나타내는 프로모터 또는 유도형 프로모터를 사용할 수도 있지만, 재조합 단백질 유전자를 생산시키고자 하는 식물 저장 기관 중에서의 발현이 보증되어 있는, 상기 식물 저장 기관에 특이적인 프로모터가 특히 바람직하다. 이와 같이 식물의 특정 조직 또는 기관에서의 특이적 발현을 촉진하는 프로모터 역시 당업자 등에게 널리 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명에 있어서는 이러한 프로모터로서 벼 종자에서 외래 유전자를 발현시키는 종자 저장 단백질 유전자의 프로모터인 글로불린 유전자의 프로모터 [M. Nakase et al., Plant Mol. Biol., 33, 513, 1997], 글루텔린 유전자의 프로모터 [F. Takaiwa et al., Plant Mol., Biol., 17, 875, 1991] 등을 사용할 수 있다. 또한, 강낭콩, 잠두콩, 완두콩 등의 콩과 작물 또는 땅콩, 참깨, 유채씨, 면실, 해바라기, 서플라워 등과 같은 식용 오일용 종자 작물의 종자에서 외래 유전자를 발현시키는 프로모터인, 글리시닌 유전자의 프로모터, 글루시페린 유전자의 프로모터 [J. Rodin et al., Plant Mol. Biol., 20, 559, 1992] 등과 같이 각 작물의 주요한 종자 저장 단백질 유전자의 프로모터도 사용할 수 있다.
한편, 본 발명에서는 터미네이터로서 노파린 합성 효소의 터미네이터 [A. Depicker et al., J. Mol. Appl, Gen., 1, 561, 1982], 옥토핀 합성 효소의 터미네이터 [J. Gielen et al., EMBO J., 3, 835, 1984]를 비롯하여 DNA 데이타베이스에 등록되어 있는 식물 유전자의 터미네이터 등을 여러가지로 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에서, 식물에 도입할 수 있는 재조합 단백질 유전자는 인간 또는 가축 등과 같은 동물의 건강에 기여할 수 있는 기능성 펩티드, 의약용 펩티드 등을 코딩하는 유전자 뿐만 아니라, 기능이 알려져 있지 않은 임의의 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자일 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 GLP-1 유도체를 코딩하는 유전자를 식물에 도입하고 식물의 종자에서 GLP-1 유도체를 생산시켰지만, 본 발명의 방법에 의해 식물의 저장 기관에서 생산시킬 수 있는 재조합 단백질이 GLP-1 또는 그의 유도체로만 한정되는 것이 아니라 이미 의약품으로서 사용 또는 개발되고 있는 여러가지 펩티드 또는 단백질 [S. Josephson and R. Bishop, TIBTECH, 6, 218, 1988] 등을 비롯하여 최근에 발견된 콜레스테롤 저감화 펩티드 (예를 들어, 일본 특허 공개 제2001-114800호 공보), 진드기 또는 화분 항원의 T 세포 에피토프 펩티드 (예를 들어, 미국 특허 제6268491호, 일본 특허 공개 (평)10-7700호 공보, 일본 특허 공개 (평)10-259198호 공보, 일본 특허 공개 (평)10-506877호 공보, 일본 특허 공개 (평)11-92497호 공보, 일본 특허 공개 제2000-327699호 공보) 등과 같은 여러가지 펩티드 또는 단백질을 본 발명의 방법에 의해 식물 저장 기관에서 생산시킬 수 있다.
또한, 이들 펩티드는 그 성질 및 목적에 따라 적절하게 변형시킨 것을 생산시킬 수도 있다. 즉, GLP-1에 대하여 예시하면, 본 발명은 GLP-1 외에도 GLP-1(7-36) 또는 그 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 및(또는) 부가된 서열을 포함하고 GLP-1 활성을 갖는 펩티드, 또는 상기 펩티드의 위치 26을 글루타민으로 치환하고 위치 34를 아스파라긴 또는 아스파라긴산으로 치환한 아미노산 서열을 갖는 GLP-1 유도체에 적용할 수 있다. 또한, 본 발명은 GLP-1(7-36) 또는 그의 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 및(또는) 부가된 서열을 포함하고 GLP-1 활성을 갖는 펩티드를 GLP-1(7-36), GLP-1(7-37), 또는 이들의 C-말단 아미드인 GLP-1 유도체에도 적용할 수 있다. 또한, 본 발명은 이들 GLP-1 유도체의 위치 8을 세린 또는 글리신으로 치환한 GLP-1 유도체 및 서열 2에 기재한 GLP-1 유도체에도 적용할 수 있다.
도입 재조합 단백질 유전자의 구축
본 발명에서는, 이들 재조합 단백질을 코딩하는 유전자 (DNA 서열)를, 예를 들어 종자 저장 단백질 등과 같이 본 발명의 방법에 의해 재조합 단백질을 다량 생산시키고자 하는 식물 저장 기관에서 본래 발현되는 단백질 유전자 중에 그 단백질의 축적량 등에 악영향을 일으키지 않는 가변 영역을 코딩하는 유전자 서열에 삽입하거나 그 서열을 치환한 융합 유전자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 실시예에서는 상기 GLP-1 유도체를 코딩하는 유전자를, 글로불린 유전자 중에 상기 단백질의 가변 영역을 코딩하는 위치에 삽입하여 융합 유전자로서 사용하였다. 또한, 이때 재조합 단백질 유전자 및 식물 저장 기관에서 본래 발현되며 상기 유전자를 삽입 또는 치환한 저장 단백질 유전자와의 경계에 효소 절단 서열을 배치함으로써, 이러한 융합 유전자의 발현 산물을 추출한 후에 효소 처리하여 목적하는 재조합 단백질을 절단하고 정제할 수 있다. 또한, 여기에 트립신 등의 소화 효소에 의한 절단 서열을 배치하면, 본 발명의 방법에 의해 재조합 단백질이 다량 생산된 종자 등의 식물 저장 기관을 식사로서 섭취한 후에 목적하는 펩티드 또는 단백질이 소장에서 절단되어 체내로 흡수되어 여러가지 생리 기능을 발휘하게 된다.
또한, 종자 저장 단백질은 주로 종자에 저장되는 단백질이며 발아에 필요한 영양소로서 중요한 기능을 한다 [이네가꾸 다이세이 제3권, 농산어촌 문화 협회]. 본 발명에서 사용할 수 있는 종자 저장 단백질 유전자의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 벼의 글로불린 또는 글루텔린, 프롤라민, 애기장대의 2S 알부민 (일본 특허 공개 제2000-106890호 공보) 등의 유전자를 사용할 수 있다. 또한, 재조합 단백질 유전자의 삽입 위치는, 종자 저장 단백질 유전자가 본래 코딩하고 있는 단백질의 특성에 변화를 일으키지 않는 가변 영역이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 벼의 글로불린의 109번째 아미노산 부위를 코딩하는 위치에 GLP-1 유도체를 코딩하는 유전자를 삽입하였다.
도입 벡터의 구축
본 발명에서는, 사이토카인 관련 유전자와 약제 내성 유전자가 이탈능을 갖는 DNA 인자와 함께 거동하는 위치에 존재하고, 또한 이것과는 함께 거동하지 않는 위치에 상기 재조합 단백질 유전자가 존재하도록 구축한 벡터를 사용하여 식물에 유전자 도입을 행한다.
여기서, 사이토카인 관련 유전자란, 식물에서의 세포 분열 촉진 또는 식물 조직으로부터의 정아(定芽)나 부정아(不定芽)의 분화 등을 일으키는 기능을 갖는, 사이토카인의 생성 등에 관여하는 유전자를 지칭한다.
이러한 사이토카인 관련 유전자로는 예를 들어 아그로박테리움ㆍ투메파시엔스 (이하, 에이. 투메파시엔스라고 함) 유래의 ipt 유전자 [A. C. Smigocki, L. D. Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5131, 1988], 로도콕쿠스 유래의 ipt 유전자, 애기장대 유래의 사이토카인 합성 효소 유전자, 슈도모나스 유래의 ptz 유전자 등의 사이토카인 합성 유전자 뿐만이 아니라 불활성형 사이토카인을 활성화하는 유전자인 대장균 유래의 β-글루쿠로니다제 유전자 [Morten Joersbo and Finn T. Okkels, Plant Cell Reports 16, 219-221, 1996] 또는 사이토카인 수용체 유전자라고 여겨지고 있는 애기장대 유래의 CKI1 유전자 [Kakimoto T. Science 274, 982-985, 1996] 등의 사이토카인 관련 유전자를 모두 본 발명에서 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 약제 내성 유전자란, 이것이 도입된 식물 세포에 항생 물질 내성 또는 농약 내성을 부여하는 유전자를 지칭한다. 이러한 항생 물질 내성 유전자로는 예를 들어 하이글로마이신 내성 유전자 (HPT: 하이글로마이신 인산화 효소 유전자) 또는 카나마이신 내성 유전자 (NPTII: 네오마이신 인산화 효소 유전자) 등을 사용할 수 있고, 농약 내성 유전자로는 술포닐 우레아계 내성 유전자 (ALS; 아세토락테이트 합성 효소 유전자) 등을 사용할 수 있다.
이탈능을 갖는 DNA 인자란, 이들이 존재하여 기능하는 염색체 DNA 등으로부터 그 자체가 이탈할 수 있는 능력을 갖는 DNA 서열을 지칭한다. 식물에서는 이러 한 인자로서 염색체 DNA에 존재하는 트란스포손(transposon)이라 불리우는 것이 알려져 있으며, 그 구조 및 기능 뿐만이 아니라 그 거동까지도 거의 판명되어 있다. 즉, 트란스포손이 기능하기 위해서는, 원칙적으로 그 내부에 있는 유전자로부터 발현되어 그 자체의 이탈 및 전이를 촉매하는 효소 (전이 효소) 및 역시 그 내부의 말단 영역에 존재하고 상기 전이 효소가 결합하여 작용하는 DNA 서열이라는 2가지 구성 요소가 필요하다. 이들의 작용에 의해 트란스포손은 그것이 존재하는 염색체 DNA로부터 이탈한 후에 통상적으로는 DNA상의 새로운 위치로 전이되지만, 일정한 확률로는 전이되지 않은 채로 그 기능을 잃고 소실되는 등의 경우도 발생하기 때문에, 본 발명에서는 이러한 트란스포손의 전이 미스(miss)를 이용한다.
또한, 트란스포손에는 이러한 자율성 트란스포손, 즉 전이 효소와 DNA 결합 서열이라는 2가지 요소를 유지하고 있어서 트란스포손 내부로부터 발현되는 전이 효소가 말단 영역에 존재하는 DNA 서열에 결합하여 작용함으로써 그 존재하는 염색체 상으로부터 자율적으로 이탈하여 전이할 수 있는 것 뿐만이 아니라, 비자율성 트란스포손이라고 불리우는 형태도 있다. 상기한 비자율성 트란스포손이란, 전이 효소가 결합하여 작용하는 말단의 DNA 서열은 유지하고 있지만 내부의 전이 효소 유전자에 변이가 발생하여 전이 효소가 발현되지 않기 때문에 염색체 상으로부터 자율적으로 이탈할 수 없는 것을 지칭한다. 그러나, 비자율성 트란스포손도 자율성 트란스포손 또는 이와는 독립적으로 존재하는 전이 효소 유전자로부터의 전이 효소가 공급되면 자율성 트란스포손과 동일한 기능을 나타내게 된다.
자율성 트란스포손으로는 옥수수로부터 단리된 Ac 및 Spm 등이 있다 [A. Gieri and H. Saedler, Plant Mol. Biol., 19, 39, 1992]. 특히, Ac는 옥수수의 염색체 중에서 wx-m7 유전자 위치를 제한 효소 Sau3A로 절단하여 얻을 수 있는 것으로서 [U. Behrens et al., Mol. Gen. Genet. 194, 346, 1984] 식물 트란스포손 중에서는 해석이 가장 많이 진행되어 있는 자율성 트란스포손이며, 그의 DNA 서열 역시 이미 해명되어 있어서 [M. Muller-Neumann et al., Mol. Gen. Genet., 198, 19, 1984] 당업자가 쉽게 취득가능하기 때문에 본 발명에 사용하는 DNA 인자로서 적합하다. 또한, 비자율성 트란스포손으로는 Ac, Spm 각각의 내부 영역이 결손된 것인 Ds 또는 dSpm을 비롯하여 [H. -P. Doring and P. Starlinger, Ann. Rev. Genet. 20, 175, 1986], 옥수수 이외에도 금어초, 나팔꽃 등의 많은 식물로부터 단리된 것 (예를 들어 문헌 [Y. Inagaki et al., Plant Cell, 6, 375, 1994])이 알려져 있다.
또한, 이들 트란스포손은 이것이 유래한 식물과는 다른 종류의 식물의 염색체에 도입된 경우라도 그 능력을 발휘하여 이탈하고 전이한다는 것이 많은 예에서 알려져 있다 (예를 들어 문헌 [B. Baker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4844, 1986]). 또한, 본 발명에서는 자율성 트란스포손이든 비자율성 트란스포손이든 어느 것이라도 사용할 수 있다. 비자율성 트란스포손을 사용하는 경우에는, 이것에 추가하여 자율성 트란스포손 등으로부터 취득하거나 합성한 전이 효소 유전자를 도입할 필요가 있는데, 이러한 경우에는 본 발명의 벡터에 상기 비자율성 트란스포손과 함께 삽입하여 도입할 수도 있고 전혀 별도로 도입할 수도 있다.
또한, 식물 이외에 존재하는 이탈능을 갖는 DNA 인자로는 부위 특이적 재조 합 시스템(site-specific recombination system)으로부터 유래하는 것이 알려져 있다. 상기 부위 특이적 재조합 시스템은 특징적인 DNA 서열을 갖는 재조합 부위 (본 발명의 이탈능을 갖는 DNA 인자에 대응함) 및 상기 DNA 서열에 특이적으로 결합하고 그 서열이 2개 이상 존재할 때 이들 서열 사이의 재조합을 촉매하는 효소라는 2가지 요소를 포함하며, 상기 DNA 서열이 동일한 DNA 분자 상에서 동일한 방향을 향해 일정한 간격으로 2군데 존재하는 경우에는 이들 사이에 있는 영역이 상기 DNA 분자 (플라스미드, 염색체 등)로부터 이탈하고, 상기 서열이 대향하는 방향으로 2군데 존재하는 경우에는 상기 영역이 반전하는 거동을 나타낸다. 본 발명에서는 앞서 설명한 이탈 작용을 이용한다. 또한, 재조합 효소를 코딩하는 유전자가 반드시 재조합 부위와 동일한 DNA 분자 상에 존재할 필요는 없으며, 이것과 동일한 세포 내에 존재하여 발현되기만 한다면, 상기 DNA 서열 사이의 이탈ㆍ반전을 일으킬 수 있다는 것이 알려져 있다 [N. L. Craig, Annu. Rev. Genet., 22, 77, 1988].
현재, 부위 특이적 재조합 시스템은 파지, 세균 (예를 들어, 대장균), 효모 등의 미생물로부터 분리된 Cre/lox 시스템, R/RS 시스템, FLP 시스템, cer 시스템, fim 시스템 등이 알려져 있지만 (총설로서, 문헌 [N. L. Craig, Annu. Rev. Genet., 22, 17, 1988]), 고등 생물에서는 아직 그 존재가 알려져 있지 않다. 그러나, 국제 공개 WO 93/01283호 공보에서 P1 파지 유래의 Cre/lox 시스템이 식물로의 유전자 도입용 벡터에 이용되고 있는 바와 같이, 이들 미생물로부터 분리된 부위 특이적 재조합 시스템도 식물 등과 같이 그것이 유래한 생물 종과는 다른 생물 종에 도입된 경우라 할지라도 그 본래의 생물 내에서의 거동과 동일한 거동을 취한 다는 것이 밝혀져 있다. 또한, 본 발명의 한 실시예에서는 효모 (지고사카로마이세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii))의 부위 특이적 재조합 시스템인 R/RS 시스템 [H. Matsuzaki et al., J. Bacteriology, 172, 610, 1990]에서 그의 재조합 부위 사이에 재조합 효소를 삽입하여 이용했지만, 상기 R/RS 시스템 역시 고등 식물에서도 그 본래의 기능을 유지한다는 것이 이미 보고되어 있다 [H. Onouchi et al., Nucleic Acid Res., 19, 6373, 1991].
본 발명에서, 사이토카인 관련 유전자와 약제 내성 유전자를 삽입하는 위치는, 이탈능을 갖는 DNA 인자와 함께 이탈할 수 있는 위치이기만 하면 된다. 예를 들어, 이탈능을 갖는 DNA 인자로서 자율성 트란스포손을 사용한 경우에는, 전이 효소 유전자의 프로모터 영역보다 상류이고 상기 전이 효소가 결합하는 말단 영역보다는 하류인, 트란스포손의 이탈에 영향을 미치지 않는 위치에 이것을 삽입할 수 있다. 또한, R/RS 시스템을 이용하는 경우에는 재조합 부위 사이의 영역 내에서 재조합 효소의 발현을 저해하지 않는 위치이기만 하다면 어디에나 삽입할 수 있다.
구축한 벡터의 식물 세포로의 도입
본 발명에서는, 이와 같이 하여 구축한 벡터를 식물 세포에 도입한다. 상기 '대상 식물'의 항목에 기재한 바와 같이, 상기 벡터를 도입하는 식물로는 저장 기관을 형성하는 식물이라면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 단자엽 식물로는 벼, 옥수수, 보리, 밀 등의 곡류 또는 아스파라거스 등을 들 수 있고, 쌍자엽 식물로는 담배, 유채씨, 콩 등을 대표적인 식물로서 들 수 있다. 또한, 구축한 벡터의 식물 세포로의 도입도 공지된 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 아그로 박테리움속 세균을 통한 방법 뿐만이 아니라 전기천공법, 폴리에틸렌글리콜법, 파티클 건법 등과 같은 공지된 방법을 모두 이용할 수 있으며, 특별히 한정되지 않는다.
예를 들어 본 발명의 방법을 이용하여 벼에 재조합 단백질 유전자를 도입하는 경우에는, 일본 특허 제3141084호에 기재된 방법을 바람직하게 이용할 수 있다. 이때, 벼 종자를 파종하고 발아시키기 위한 파종 배지로는 예를 들어 N6Cl2 배지 (N6 무기 염류 및 비타민류 [Chu C.C., 1978, Proc. Symp., Plant Tissue Culture, Sience Press Peking, pp.43-50], 30 g/L 수크로스, 2.8 g/L 프롤린, 0.3 g/L 카자미노산, 1 mg/L 2,4-D, 4 g/L 겔라이트) 등을 사용할 수 있다. 그러나, 상기 배지 조성은 특별히 한정되지 않으며, 그 조성물의 종류나 농도를 변경하여 본 발명을 실시할 수도 있다.
형질전환체의 재분화
재조합 단백질 유전자를 도입한 식물 세포 또는 조직으로부터의 형질전환체의 재분화에 있어서는, 유전자 도입 처리 후의 세포 또는 조직을 약제 첨가 배지 및 약제 비첨가 배지에서 공지된 방법을 이용하여 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에서 형질전환체는 정아, 부정아, 부정근 등의 식물 조직 또는 유(幼)식물체를 지칭한다.
예를 들어, 본 발명에 의해 벼에 재조합 단백질 유전자를 도입하여 형질전환체를 얻는 경우라면, 상기한 바와 같이 하여 구축한 벡터를 이용하여 일본 특허 제3141084호에 기재된 방법에 따라 유전자 도입 처리를 행한 발아 종자로부터 벼의 배반 조직을 절단하고, 상기 배반 조직을 예를 들어 약제 첨가 배지 N6Cl2TCH25 배지 (N6 무기 염류 및 비타민류, 30 g/L 수크로스, 2.8 g/L 프롤린, 0.3 g/L 카자미노산, 2 mg/L 2,4-D, 500 mg/L 카르베니실린, 25 mg/L 하이글로마이신, 4 g/L 겔라이트)에서 1 주일 동안 배양한 후에 추가로 약제 첨가 배지 N6Cl4TCH25 배지 (N6 무기 염류 및 비타민류, 30 g/L 수크로스, 2.8 g/L 프롤린, 0.3 g/L 카자미노산, 4 mg/L 2,4-D, 500 mg/L 카르베니실린, 25 mg/L 하이글로마이신, 4 g/L 겔라이트)에서 1 주일 동안 배양하고, 이어서 약제 비첨가 배지 MSRC 배지 (MS 무기 염류 및 비타민류 [Murashige, T. and Skoog, F., 1962, Physiol. Plant., 15, 473], 30 g/L 수크로스, 30 g/L 소르비톨, 2 g/L 카자미노산, 500 mg/L 카르베니실린, 4 g/L 겔라이트)에서 배양함으로써 싹 또는 유식물체로서의 형질전환체를 얻을 수 있다. 물론, 상기에 예시한 배양 조건이 절대적인 것은 아니며, 필요에 따라서는 배지 조성의 종류나 농도를 변경하거나 여러가지 식물 호르몬 또는 약제를 첨가하거나 배양 기간을 변경할 수 있다.
또한, 약제 첨가 배지로는 상기한 바와 같이 하여 구축하고 유전자 도입에 이용한 벡터에 삽입된 약제 내성 유전자에 대응하는 약제를 첨가한 배지를 이용한다. 예를 들어, 상기 벡터에 하이글로마이신 내성 유전자를 삽입한 경우에는 하이글로마이신을 첨가한 배지를 사용하고, 카나마이신 내성 유전자를 삽입한 경우에는 카나마이신을 첨가한 배지를 사용하며, 술포닐 우레아계 내성 유전자를 삽입한 경우에는 술포닐 우레아계 농약을 첨가한 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
식물 저장 기관의 취득
본 발명에서의 식물 저장 기관은, 재조합 단백질 유전자를 도입한 식물 세포 또는 조직으로부터 상기한 바와 같이 하여 형질전환체를 재분화한 후에 공지된 방법을 이용하여 상기 형질전환체를 생육시켜서 취득하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 형질전환체가 부정아인 경우에는 공지된 방법에 따라 발근 처리 등을 행하여 식물 개체를 재생하고, 이 식물 개체를 육성하고 결실시켜 재조합 단백질이 다량 생산된 식물 성숙 종자 등의 저장 기관을 수확하는 것이 바람직하다. 또한, 부정아의 발근은 MS 한천 배지에 부정아를 꽂아 넣는 등의 방법을 이용하여 행할 수 있다. 또한, 형질전환체가 유식물체로서 수득된 경우에는 발근 처리 등을 행하지 않아도 형질전환 식물을 얻을 수 있다. 또한, 식물 저장 기관으로서 괴근 또는 괴경 등을 이용하는 경우에는, 수득된 형질전환체로부터 식물 개체를 재생시키는 과정을 거치지 않고, 공지된 수단에 따라 이들 조직을 분화시켜 취득할 수도 있다.
GLP-1류의 생산
본 발명에서는 본 발명의 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관을 생산하는 방법을 이용하여 GLP-1류를 제공한다. GLP-1은 당 의존적인 인슐린 분비를 자극하는 호르몬이라고 알려져 있으며, GLP-1(7-36)은 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala -Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg로 표시되는 서열을 갖는 펩티드이다. 본 발명에 있어서는, 상기 GLP-1(7-36)의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 또는 GLP-1(7-36)의 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 및(또는) 부가된 서열을 포함하고 GLP-1 활성을 갖는 펩티드를 코딩하는 유전자를 본 발명에서 구축한 벡터 에 재조합 단백질로서 삽입하고, 상기 유전자를 발현시켜서 GLP-1류를 생산한다.
GLP-1 유도체
본 발명은 상기한 바와 같은 GLP-1류의 생산 방법을 제공하며, 또한 상기 GLP-1의 유도체를 제조하여 소화 효소 등에 의해 소화ㆍ분해되지 않으며, 혈장 중에서도 안정한 GLP-1의 유도체를 제공한다. 본 발명의 유도체는 GLP-1(7-36) 또는 그의 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 및(또는) 부가된 서열을 포함하고 GLP-1 활성을 갖는 펩티드에서 위치 26을 글루타민으로 치환하고 위치 34를 아스파라긴 또는 아스파라긴산으로 치환하여 상기 GLP-1 유도체가 천연형 GLP-1과 동일한 정도의 인슐린 분비 촉진 활성을 유지하고 트립신과 같은 소화 효소에 대한 내성을 갖게 함으로써 소장에 의해 흡수될 수 있도록 변형시킨 것이다. 또한, 추가로 위치 8의 알라닌을 세린 또는 글리신으로 변경함으로써, 디펩티딜펩티다제 IV에 대한 내성도 획득하고 혈장 중에서도 안정하도록 변형시킨 것이다.
즉, 본 발명의 GLP-1 유도체는 GLP-1(7-36) 또는 그 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 및(또는) 부가된 서열을 포함하고 GLP-1 활성을 갖는 펩티드의 위치 26을 글루타민으로 치환하고 위치 34를 아스파라긴 또는 아스파라긴산으로 치환한 것이지만, 여기서 GLP-1(7-36) 또는 그의 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 및(또는) 부가된 서열을 포함하고 GLP-1 활성을 갖는 펩티드는 GLP-1의 전구체, 유사체, 및 이들의 C-말단 아미드체도 포함하는 것이며, 바람직하게는 GLP-1(7-36), GLP-1(7-37) 또는 이들의 C-말단 아미드 이다. 또한, 본 발명의 GLP-1 유도체는 위치 8을 세린 또는 글리신으로 치환하는 것이 특히 바람직하다. 디펩티딜펩티다제 IV는 폴리펩티드쇄의 N-말단으로부터 2번째 프롤린 또는 알라닌을 인식하여 그의 카르복실기 측을 가수분해하는 효소이다. 따라서, 본 발명의 GLP-1 유도체는 위치 8의 알라닌을 세린 또는 글리신으로 변경하는 것이 바람직하다. 상기한 위치 8에서의 치환체는 천연형 GLP-1과 동일한 정도의 활성을 유지하며 혈장 중에서도 안정하다.
상기한 바와 같이, 본 발명에서 사용하는 GLP-1(7-36)은 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이지만, 위치 8을 세린으로 개변한 [Ser8]은 2번째 (위치 8에 상당)의 Ala가 Ser로 변환되어 있는 것을 나타낸다. 본 발명의 GLP-1 유도체는 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술로 제조할 수 있다.
즉, 폴리펩티드의 화학적 합성의 원리는 당업계에 주지된 것이며, 이하와 같은 당업계의 일반적인 문헌들을 참조할 수 있다: [Dugas H. and Penney C, Bioorganic Chemistry, 1981, Springer-Verlag, New York, pp.54-92, Merrifields JM, Chem. Soc, 85, 2149, 1962], [Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp.24-66, Freeman (San Francisco, 1969)]. 예를 들어, 430A 펩티드 합성기 (미국 94404 캘리포니아주 포스터 시티 링컨 센터 드라이브 850에 소재하는 PE-어플라이드 바이오시스템즈 인크.(PE-Applied Biosystems Inc.) 제품) 및 PE-어 플라이드 바이오시스템즈에 의해 공급된 합성 사이클을 이용하여 본 발명의 펩티드를 고상 방법으로 합성할 수 있다. Boc 아미노산 및 기타 시약은 PE-어플라이드 바이오시스템즈 및 다른 약품 공급업체로부터 구입가능하다.
본 발명의 GLP-1 유도체의 유전자 재조합 기술에 의한 생산은, GLP-1 유도체의 DNA를 전체적으로 합성할 수도 있고 또는 보다 큰 천연 글루카곤이 코딩되어 있는 DNA를 변형시켜 수득한 유전자를 이용하여 행할 수도 있다. 합성 유전자의 구축 방법은 당업계에 주지된 것이며, 문헌 [Brown et al., Methods in Enzymology, Academic Press, NY, vol. 68, pp. 109-151]을 참조할 수 있다.
또한, 본 발명의 GLP-1 유도체의 생산에 사용하는 DNA에 대하여, 상기한 것 이외에도 발현량을 증가시켜서 산물을 숙주 내에 안정적으로 축적시키는 연구, 생산 후의 정제를 쉽게 하는 연구, 또는 융합 단백질로서 생산시켜 쉽게 GLP-1 유도체를 절단하는 연구 등을 실시할 수 있다. 예를 들어, β-갈락토시다제, β-락타마제, 프로테인 A, TrpE 등의 단백질의 유전자에 연결되어 융합 단백질로서 생산시키는 수법이 그것이다. 이들의 경우, 예를 들어 생산 후에 GLP-1 유도체를 단체로서 얻기 위해서는, 각 유전자 사이에 아미노산의 메티오닌에 대응하는 유전자를 넣어 브롬화시안 처리를 행할 수 있다. 이 경우에는 C-말단이 Hse (호모세린)가 된다. 또한, 본 발명의 GLP-1 유도체 중에는 C-말단에만 아르기닌을 갖는 것이 있으며, 아르기닐 엔도펩티다제로 효소 처리하면 GLP-1 유도체의 단체를 얻을 수 있다.
또한, 상기 GLP-1 유도체를 코딩하는 유전자는, 공지된 유전자 공학 기술에 의해 식물 이외의 세포에 도입하여 발현시킴으로써 GLP-1 유도체를 생산할 수도 있 다. 이 경우에는 GLP-1 유도체를 코딩하는 유전자를 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 적절한 재조합 DNA 발현 벡터에 삽입한다. GLP-1 유도체를 위한 발현 벡터를 구축한 후에 그 벡터를 이용하여 적절한 숙주 세포를 형질전환시킨다. 숙주 세포로는 진핵 세포 또는 원핵 세포 어느 것이라도 사용할 수 있다. 벡터의 구축 및 세포를 형질전환하기 위한 기술은 당업계에 주지된 것이며, 일반적으로는 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, NY, Vol.1-3, 1989]를 참조할 수 있다. 이때, 목적하는 유전자의 효율적 전사를 달성하기 위해서는 상기 유전자를 프로모터-오퍼레이터 영역과 기능적으로 결합시킨다. 원핵 세포 및 진핵 세포의 형질전환에 사용할 수 있는 여러가지 발현 벡터는 주지된 것이며, 문헌 [The Promega Biological Research Products Catalogue] 및 문헌 [The Stratagene Cloning Systems Catalogue]를 참조할 수 있다. 본 발명의 GLP-1 유도체의 생산에는, 널리 이용되고 있는 미생물 및 포유류 배양 세포를 숙주로 하는 물질 생산 시스템을 이용할 수 있다. 또한, 저렴하고 안전한 물질 생산 시스템으로서, 상기와 같은 형질전환 식물을 이용하는 물질 생산 시스템도 이용할 수 있다.
[본 발명 GLP-1 유도체의 이용]
본 발명에서 생산된 GLP-1 유도체는 식물 종자 등의 저장 기관의 형태, 또는 정제, 분리한 제제의 형태, 또는 상기 성분을 첨가한 음식품과 같은 형태로 섭취하여 이용할 수 있다. 제제의 형태로 이용하는 경우에는 GLP-1 유도체를 포함하는 성분을 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 흡수 촉진제와 조합하여 제제 화하여 의약 조성물로서 이용할 수도 있다. 본 발명의 GLP-1 유도체는 GLP-1이 관여하는 각종 질환에 유효하며, 예를 들어 인슐린 비의존성 만성 당뇨병의 처치, 인슐린 의존성 만성 당뇨병의 처치, 비만의 처치 또는 식욕 억제를 위해 사용할 수 있다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은 하기 실시예로 한정되는 것이 아니다. 또한, 이하의 실시예에서 더욱 상세한 실험 조작은 특별히 진술하는 경우를 제외하고는 분자 생물학적 수법에 대한 문헌 [Molecular Cloning (Sambrook et. al., 1989)] 또는 제조업체의 취급 설명서에 따라 행하였다.
< 실시예 1>
I. 플라스미드 pGlbGLP130Hm 의 제조
pTL7 [H. Ebinuma et al., Molecular Methods of Plant Analysis, 22: 95, 2002]의 EcoRI-Sse8387I 제한 효소 부위 사이에, 제한 효소 EcoRI와 Sse8387I을 이용하여 절단한 벼 글로불린 프로모터, 서열 1에 나타낸 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36 아미드)을 코딩하는 유전자가 가변 영역 (109번째의 아미노산 부위)에 삽입된 벼 글로불린 유전자 및 노파린 합성 효소의 폴리아데닐화 신호가 연결된 유전자 단편을 삽입하여 플라스미드 pGlbGLP를 수득하였다. 또한, [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)은 서열 2에 나타낸 바와 같이 GLP-1의 7 내지 36번째 아미노산을 포함 하고 이것의 위치 8을 세린으로 치환하고 위치 26을 글루타민으로 치환하고 위치 34를 아스파라긴으로 치환한 유도체이지만, 벼 글로불린 유전자로 삽입시에는 그 N-말단측에 리신 잔기 (AAG)를 부가하였다.
한편, 제한 효소 KpnI로 플라스미드 pUC18의 KpnI 제한 효소 부위를 절단하고, T4 폴리머라제에 의해 그 절단 말단을 평활화한 후에 재결합시켜서 플라스미드 pUC18ΔKpnI을 수득하였다. 플라스미드 pNPI130 (일본 특허 공개 (평)9-154580호 공보)에서 효모의 부위 특이적 재조합 시스템의 재조합 서열 Rs에 삽입된 영역을 제한 효소 Sse8387I로 절단하고, 이것을 상기 pUC18ΔKpnI의 Sse8387I 제한 효소 부위에 삽입함으로써 플라스미드 pNPI130PUC를 수득하였다.
또한, 플라스미드 pNPI140 (일본 특허 공개 (평)9-154580호 공보)에서 CaMV35S 프로모터, Hm (하이글로마이신 내성) 유전자 및 노파린 합성 효소의 폴리아데닐화 신호가 연결된 유전자 단편을 제한 효소 KpnI로 절단하고, 이것을 pNPI130PUC의 KpnI 제한 효소 부위에 삽입하여 플라스미드 pNPI130Hm을 수득하였다.
목적으로 하는 플라스미드는, 상기 pNPI130Hm에서 효모의 부위 특이적 재조합 시스템의 재조합 서열 Rs에 삽입된 영역을 제한 효소 Sse8387I로 절단하여, pGlbGLP의 Sse8387I 제한 효소 부위 사이에 삽입하여 수득되며, 이것을 플라스미드 pGlbGLP130Hm (국제 기탁 번호 FERM BP-8343)이라고 명명하였다. 상기 pG1bGLP130Hm은 식물의 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질 유전자로서, [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)을 코딩하는 유전자가 벼 글로불린 유전자의 가변 영역 (109번째 아미노산 부위)에 삽입된 형태로 존재하고 있고, 사이토카인 관련 유전자로서 ipt 유전자를 가지며 약제 내성 유전자로서는 하이글로마이신 내성 유전자를 가지며, 효모의 부위 특이적 재조합 시스템 R/RS 시스템 이탈능을 갖는 DNA 인자로서 사용하였다.
pGlbGLP130Hm의 제조 공정을 도 1 내지 4에 나타내었고, 또한 상기 pGlbGLP130Hm에서 식물 염색체 중에 삽입되는 영역 (T-DNA 영역)의 제한 효소 지도를 도 4에 나타내었다. 도 1 내지 4 중에서 Glb-P은 벼 글로불린 유전자의 프로모터를 나타내고, GLP는 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)을 코딩하는 유전자를 나타내고, 글로불린은 벼 글로불린 유전자를 나타내고, T는 노파린 신타제 유전자의 폴리아데닐화 신호를 나타내고, la는 lacZ' 유전자의 단편을 나타내고, 35S-P는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터를 나타내고, ipt는 ipt 유전자를 나타내고, 원으로 둘러싸인 T는 ipt 유전자 자체의 폴리아데닐화 신호를 나타내고, Hm은 하이글로마이신 내성 유전자를 나타내고, R은 재조합 효소 유전자를 나타내고, 직사각형으로 둘러싸인 삼각형은 재조합 서열 Rs와 그의 서열 방향을 나타내며, 또한 RB와 LB는 T-DNA 영역의 경계 서열을 나타낸다.
II. 아그로박테리움으로의 pGlbGLP130Hm 의 도입
에이. 투메파시엔스 EHA105주를 10 mL의 YEB 액체 배지 (비프 엑기스 5 g/L, 효모 엑기스 1 g/L, 펩톤 5 g/L, 수크로스 5 g/L, 2 mM MgSO4, 22℃에서의 pH 7.2 (이하, 특별히 기재하는 않는 경우, 22℃에서의 pH로 함))에 접종하고, OD630이 0.4 내지 0.6의 범위에 이를 때까지 28℃에서 배양하였다. 상기 배양액을 6900×g, 4℃, 10 분의 조건으로 원심분리하여 집균한 후에, 균체를 20 mL의 10 mM HEPES (pH 8.0)에 현탁하여 다시 6900×g, 4℃, 10 분의 조건으로 원심분리하여 집균하고, 이어서 상기 균체를 200 ㎕의 YEB 액체 배지에 현탁하고 이것을 플라스미드 도입용 균액으로 하였다.
상기 플라스미드 도입용 균액을 이용하여, pG1bGLP130Hm을 다음과 같이 하여 아그로박테리움으로 도입하였다. 즉, 0.5 mL의 튜브 내에서 상기 플라스미드 도입용 균액 50 ㎕ 및 pGlbGLP130Hm 3 ㎕를 혼합한 혼합액에 진 펄서 II 시스템 (바이오래드(BIORAD) 제품]을 이용하여 전기천공을 행하고, 전기천공 처리 후의 혼합액에 200 ㎕의 YEB 액체 배지를 첨가하여 25℃에서 1 시간 동안 진탕 배양한 후에 균체를 50 mg/L 카나마이신 첨가 YEB 한천 배지 (한천 1.5 w/v％, 다른 조성은 상기와 동일함)에 파종하여 28℃에서 2 일 동안 배양하였다. 또한, 수득된 균 콜로니를 YEB 액체 배지에 이식하여 배양한 후에 알칼리법을 이용하여 상기 균체로부터 플라스미드를 추출하여 이들 균이 EHA105주에 pGlbGLP130Hm이 도입된 것임을 확인하였고, 이들을 EHA105 (pGlbGLP130Hm)라고 하였다.
III. 감염 재료의 제조
유전자 도입의 대상으로서 벼 품종「닛본세이」를 사용하고, 그 완숙 종자의 살균을 문헌 [세포 공학 별책, 식물 세포 공학 시리즈 4, 모델 식물의 실험 프로토 콜 (p93-98)]의 방법에 따라 행하였다. 살균된 완숙 종자를 N6Cl2 배지 (N6 무기 염류 및 비타민류, 30 g/L 수크로스, 2.8 g/L 프롤린, 0.3 g/L 카자미노산, 1 mg/L 2,4-D, 4 g/L 겔라이트, pH = 5.8)에 넣고 수술용 테이프로 밀봉하여 28℃의 밝은 곳에서 배양하고 발아시켜, 아그로박테리움 EHA105 (pGlbGLP130Hm)로 감염시키기 위한 재료로 사용하였다.
IV. EHA105 ( pGlbGLP130Hm )에 의한 벼의 형질전환 및 형질전환 벼의 제조
YEB 한천 배지 (비프 엑기스 5 g/L, 효모 엑기스 1 g/L, 펩톤 5 g/L, 수크로스 5 g/L, 2 mM MgSO4, 15 g/L 박토아가)에서 배양한 아그로박테리움 EHA105 (pGlbGLP130Hm)을 YEB 액체 배지에 이식하여 25℃, 180 rpm으로 밤새 배양한 후에 3000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하여 집균하고, 아세토실리콘 (10 mg/L)을 포함하는 N6 액체 배지 (N6 무기 염류 및 비타민류, 30 g/L 수크로스, 2 mg/L 2,4-D, pH = 5.8)에 OD630= 0.15가 되도록 현탁하여, 감염용 아그로박테리움 현탁액으로 하였다.
상기 III에서 조정한 발아 종자를 50 mL의 튜브에 넣고, 여기에 상기 감염용 아그로박테리움 현탁액을 부어 침지시켰다. 1.5 분 동안의 침지 후에는 아그로박테리움 현탁액을 버리고, 발아 종자를 멸균한 여과지 상에 놓아 여분의 수분을 제거하고 나서, N6Cl2 배지 (N6 무기 염류 및 비타민류, 30 g/L 수크로스, 2.8 g/L 프롤린, 0.3 g/L 카자미노산, 1 mg/L 2,4-D, 4 g/L 겔라이트, pH = 5.2)에 넣고 수술용 테이프로 밀봉하여 28℃의 어두운 곳에서 3 일 동안 공존 배양하고, 추가로 N6Cl2TCH25 배지 (N6 무기 염류 및 비타민류, 30 g/L 수크로스, 2.8 g/L 프롤린, 0.3 g/L 카자미노산, 2 mg/L 2,4-D, 500 mg/L 카르베니실린, 25 mg/L 하이글로마이신, 4 g/L 겔라이트)에 이식하여 1 주일 동안 배양한 후에, 발아된 싹을 상기 발아 종자의 배반 조직으로부터 절단하였다.
이어서, 상기 배반 조직을 N6Cl4TCH25 배지 (N6 무기 염류 및 비타민류, 30 g/L 수크로스, 2.8 g/L 프롤린, 0.3 g/L 카자미노산, 4 mg/L 2,4-D, 500 mg/L 카르베니실린, 25 mg/L 하이글로마이신, 4 g/L 겔라이트)에서 1 주일 동안 배양하고, 추가로 MSRC 배지 (MS 무기 염류 및 비타민류, 30 g/L 수크로스, 30 g/L 소르비톨, 2 g/L 카자미노산, 500 mg/L 카르베니실린, 4 g/L 겔라이트)에서 배양했더니, EHA105 (pGlbGLP130Hm)과의 공존 배양 후 1 개월 내지 2 개월 사이에 싹 또는 유식물체가 재분화되었다. 재분화된 싹 또는 유식물체를 발근 배지에 이식하고 생육시켜 높이 20 cm 정도의 유묘(幼苗)를 수득하였다. 상기 유묘로부터 DNeasy 96 플랜트 키트(Plant Kit) (퀴아겐(QIAGEN) 제품)를 이용하여 염색체 DNA를 추출하고, PCR법으로 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)을 코딩하는 유전자의 존재를 확인하였다.
이때의 PCR 프라이머로는, 글로불린 유전자의 가변 영역에 삽입된 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)을 코딩하는 유전자를 검출하기 위해 프라이머 3-1: 5'-GGATCCATGGCTAGCAAGGTCGTC-3' (서열 3) 및 프라이머 3-3: 5'-GATCACTATCTCGTTGCATGCAACAC-3' (서열 4)를 이용하였다. 수득된 PCR 반응물 (약 700 bp)을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여, 염색체 DNA에서 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)을 코딩하는 유전자의 존재를 확인하였다.
그 결과, 아그로박테리움 감염 처리에 사용한 벼 종자의 약 3％에 상기 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것으로 판명되었다.
이와 같이 하여 수득된, [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)을 코딩하는 유전자의 도입이 확인된 벼 유묘의 형질전환체를 토양에 순화시키고 태양 광실에서 재배하고 생육시켜 완숙 종자를 수확하였다.
V. 단백질 해석
상기 IV에서 수득한 완숙 종자 10 mg에 10％ (v/v) 글리세롤, 0.25％ (w/v) SDS, 5％ 2-머캅토에탄올을 포함하는 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8) 추출 완충액 250 ㎕를 100℃에서 5 분 동안 처리함으로써 이들 종자 중의 전체 단백질을 추출하였고, 그 추출액을 SDS-PAGE에 사용하였다. SDS-PAGE는 15％ (w/v) 폴리아크릴아미드 (아크릴아미드: N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 = 30 : 0.8) 겔을 이용하여 행하였다.
얻어진 겔 화상을 해석 소프트 이미지 가우지(Image Gauge) (후지 샤신 필름 제품)로 해석하여, [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)을 코딩하는 유전자가 글로불린의 가변 영역에 삽입된 융합 단백질의 축적 수준을 조사하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
< 비교예 1>
벼 글로불린 프로모터, 서열 1에 나타낸 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)을 코딩하는 유전자가 가변 영역에 삽입된 글로불린 유전자 및 노파린 합성 효소의 폴리아데닐화 신호가 연결된 유전자 단편을 포함하는, 도 6에 기재된 종래형 벡터 pGlbGLP-Hm을 이용하여 벼의 완숙 종자에 유전자 도입을 행한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방식으로 유전자를 도입하여 싹 또는 유식물체를 재분화시키고, 상기 싹 또는 유식물체로부터 식물 개체를 재생하여 형질전환 벼를 얻고 완숙 종자를 수확하여 상기 완숙 종자에 대한 단백질 해석을 행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5로부터 명확한 바와 같이, [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)을 코딩하는 유전자가 글로불린의 가변 영역에 삽입된 융합 단백질은, 실시예 1에서 생산된 벼 완숙 종자 중에 다량 축적되며, 비교예 1에 비하여 최고 약 6배의 수준을 나타내었다 (도 5).
< 실시예 2>
I. GLP-1 유도체의 합성
이하에 나타낸 GLP-1 유도체를 모델 430A 펩티드 합성기 (미국 캘리포니아주 포스터 시티에 소재하는 PE-어플라이드 바이오시스템즈 제품)를 사용한 고상 합성으로 합성하여 HPLC로 정제한 후에 질량 분광분석으로 합성품을 확인하였다. 순도 는 95％ 이상인 것을 사용하고, 시험관내 및 생체내 시험에 사용하였다.
비교 제조예 1. GLP-1(7-36 아미드)
(천연형 GLP-1)
비교 제조예 2. [Ser8]-GLP-1(7-36 아미드)
비교 제조예 3. [Gly8]-GLP-1(7-36 아미드)
제조예 1. [Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36 아미드)
(제조예 1의 비아미드체의 아미노산 서열을 서열 5에 나타내었음)
제조예 2. [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)
제조예 3. [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36)
(제조예 3의 아미노산 서열을 서열 6에 나타내었음)
II. GLP-1 유도체의 시클릭 AMP 생산 활성
인간 GLP-1 수용체의 공표된 DNA 서열 (문헌 [Graziano et al., Biochem Biophys Res Com, 196: 141-146, 1993])에 기초하여 발현 벡터를 구축하였다. 차이니즈 햄스터 난소 CHO-K1 세포를 해당 벡터로 형질전환시키고, 인간 GLP-1 수용체를 발현하는 재조합 CHO-K1 세포를 수득하였다. 상기 인간 GLP-1 수용체 발현 세포를 1×104개 세포/ml/웰로 24 웰 플레이트에 접종하고, 3 일 후에 분석에 사용하였다.
분석 방법은 상기 세포를 GLP-1 유도체의 존재하에 완충액 (PBS, 5.6 mM 글루코스, 1 mM 이소부틸메틸크산틴, 20 μM Ro20-1724, 0.5％ BSA, pH 7.4) 중에서 37℃로 30 분 동안 배양하였다. 5 N 염산을 10 ㎕ 첨가하여 배양을 정지시켰다. 각종 GLP-1 유도체와 GLP-1 수용체와의 반응에 의해 세포 내에 형성된 시클릭 AMP를 cAMP-스크린(cAMP-Screen) (상표명) 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈)에 의한 효소 면역 분석으로 측정하였다. 도 7에 각종 GLP-1 유도체의 시클릭 AMP 생산 활성을 나타내었다.
그 결과, [Ser8]-GLP-1(7-36 아미드), [Gly8]-GLP-1(7-36 아미드) 및 [Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36 아미드)는 천연형 GLP-1과 동등한 시클릭 AMP 생산 활성을 갖고 있었다.
< 실시예 3>
제조예 1의 [Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36 아미드)에 트립신을 처리한 후에 실시예 2와 동일한 방식으로 이의 시클릭 AMP 생산 활성을 측정함으로써 트립신 내성을 조사하였다.
즉, 합성하여 수득한 상기 GLP-1 유도체를 50 mM 탄산수소암모늄 용액 (pH 7.8)에 500 ㎍/mL의 농도가 되도록 용해하였다. 상기 용액 100 ㎕에 500 ㎍/mL 트립신 용액 (프로메가(Promega) 제품: 카탈로그 번호 V5113) 5 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 정지는 71.5％ 에탄올 1200 ㎕ (최종 65％)를 첨가하여 행하였고, 4℃에서 5 분 동안 15,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 회 수하여 증발시켰다. 건고물을 증류수에 용해하여 활성 측정에 사용하였다.
도 8은 트립신 처리 전과 트립신 처리 후에 [Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36 아미드) 활성의 농도 의존성을 나타낸 것이다. [Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36 아미드)은 트립신 처리 전과 트립신 처리 후의 활성에 차이가 없어서 트립신에 대하여 내성이 있다는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
벼 완숙 종자 중 GLP-1 유도체의 펩신에 대한 안정성을 조사하였다.
실시예 1에서 수득한 벼 완숙 종자의 백미 및 그 분말을 사용하고, 1.9배량의 물을 첨가하고 100℃에서 15 분 동안 가열하여 밥을 지었다. 입상인 것은 눌러 으깨 균일하게 한 후에 증류수로 5배 희석하여 샘플로 하였고, 분말인 것은 그대로 증류수로 5배 희석하여 샘플로 하였다. 한편, 합성품인 GLP-1(7-36 아미드), [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36), [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36)에 대해서는 0.2％ BSA 용액으로 10 ㎍/mL 용액을 제조하여 샘플로 하였다.
각 샘플에 7.6 mg/mL 펩신을 포함하는 10배 농도의 인공 위액 (pH 1.2)을 1/10의 양으로 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후에 NaOH로 중화시켰다. GLP-1(7-36 아미드), [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36), [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36)에 대하여는 이 이후에, 쌀 유래의 것인 경우에는 단백질을 추출하고 트립신 처리하여 GLP-1 단체를 얻은 후에, 시클릭 AMP 생산에 의거한 활성 측정을 행하 였다. 그 결과, 합성 유래의 GLP-1 유도체는 펩신에 의해 완전히 실활되었지만, 쌀에서는 31 내지 65％의 GLP-1 활성이 잔존하는 것으로 밝혀졌다 (도 9).
이로부터, 벼 완숙 종자에 함유된 GLP-1 유도체는 펩신 소화를 받기 어렵고, 위를 통과하여 소장에 도달한다고 추측되었다.
< 실시예 5>
실시예 1에서 수득한 벼 완숙 종자로부터 0.025 M 수산화나트륨 용액에 의해 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)과 글로불린이 융합된 단백질을 추출하고, 이것을 50 mM 탄산수소암모늄 pH 7.8로 15배 희석하였다. 상기 희석액에 83 ㎍/mL 트립신 용액 (프로메가 제품: 카탈로그 번호 V5113) 6 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1, 2, 4, 6 또는 20 시간 동안 반응시킨 후에 71.5％ 에탄올 1200 ㎕ (최종 65％)를 첨가하여 반응을 정지시키고, 4℃에서 5 분 동안 15,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 회수하여 증발시키고, 그 건고물을 증류수에 용해하여 활성 측정을 행하였다.
도 10은, 벼 완숙 종자에서 발현시켜 융합 단백질로서 얻은 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)의 트립신 처리 시간과 활성의 관계를 나타낸 것이다. 트립신을 처리했을 때에야 비로소 시클릭 AMP 생산 활성이 발휘되었고, 트립신 처리 시간과는 관계없이 상기 활성이 유지되었다. 이로부터, [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)은 벼 완숙 종자 중에서 활성을 갖는 형태로 발현되고 트립신에 대한 내성이 있다는 것을 알 수 있었다. 따라서, GLP-1 유도체의 발현에 의해 벼 완숙 종자에 함 유된 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)은, 소장에서 트립신에 의해 분해되지 않고 흡수될 수 있다고 추측되었다.
< 실시예 6>
[Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36) 및 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)에 트립신을 처리한 후에 실시예 2와 동일한 방식으로 이들의 시클릭 AMP 생산 활성을 측정함으로써 트립신 내성을 조사하였다.
즉, 0.2％ 소 혈청 알부민 용액을 사용하여 10 ㎍/mL로 희석한 상기 합성 GLP-1 유도체 8 ㎕에 50 mM 탄산수소암모늄 용액 (pH 7.8) 112 ㎕ 및 83 ㎍/mL 트립신 용액 (프로메가 제품: 카탈로그 번호 V5113) 6 ㎕를 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 정지는 71.5％ 에탄올 1200 ㎕ (최종 65％)를 첨가하여 행하였고, 4℃에서 5 분 동안 15,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 회수하여 증발시켰다. 건고물을 증류수에 용해하고 활성 측정에 사용하였다.
도 11은 GLP-1(7-36 아미드), [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36) 및 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)의 트립신 처리 시간에 대하여 활성의 변동을 나타낸 것이다. 천연형 GLP-1(7-36 아미드)와는 달리, [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36) 및 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)은 트립신 처리에 의한 활성 변동이 없었으므로 이들이 트립신에 대한 내성을 갖는다는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 7>
본 발명의 GLP-1 유도체가 천연형 GLP-1에 비하여 유의한 DPP-IV 내성을 나타내는지 여부를 조사하였다. GLP-1(7-36 아미드) (천연형 GLP-1)는 5000 pM로 사용하고 [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36)은 500 pM로 사용하고 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)은 5000 pM로 사용하였고, 이들을 각각 40 μU/㎕의 DPP-IV (시그마, D7052)와 혼화하여 37℃에서 0, 15, 30, 60 분 동안 반응시킨 후에 2배량의 에탄올로 추출하고 원심 증발기로 건고시켰다. 수득된 건고물을 1％ BSA 함유 증류수에 용해하고, GLP-1 수용체 발현 세포에 작용시켜 시클릭 AMP 생산량을 측정하였다. 도 12에서는 DPP-IV 처리가 없는 경우를 100％로 하여 시클릭 AMP 생산 활성을 비교하였다. GLP-1(7-36 아미드)과는 달리, [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36) 및 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)은 명확한 DPP-IV 내성이 있다는 것이 확인되었다.
< 실시예 8>
본 발명의 GLP-1 유도체의 인슐린 분비 촉진 활성을 조사하였다.
ICR 마우스의 췌장으로부터 콜라게나제에 의해 랑게르한스섬을 취출하여 24웰 플레이트에 웰 당 2 내지 3개씩의 랑게르한스섬을 넣어 밤새 배양하였다. 그 후, 16.7 mM 글루코스, 0.2％ BSA 및 10 mM Hepes를 포함하는 크레브스-링겔 완충액에 용해한 본 발명의 GLP-1 유도체를 첨가하여 37℃에서 30 분 동안 방치하고, 상기 상등액 중의 인슐린 농도를 효소 면역 분석 키트 (시바야기 제품)로 측정하였다.
GLP-1(7-36 아미드), [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36) 및 [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36) 중 어느 펩티드에서도 용량 의존적인 인슐린 분비 촉진 활성이 확인되었다. 특히 [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36)의 경우에는 고농도에서 강력한 인슐린 분비 촉진 활성이 확인되었다 (도 13).
< 실시예 9>
경구 당 부하 시험 (OGTT)을 통해 GLP-1 유도체 피하 투여에 의한 혈당 저하 효과를 조사하였다.
밤새 절식시킨 마우스에게 글루코스 1 g/kg을 경구 투여한 직후에 GLP-1(7-36 아미드), [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36) 또는 [Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1(7-36)을 등에 피하 투여 (5, 20 ㎍/kg)하였다. 대조군에게는 생리 식염수를 투여하였다. 글루코스 부하 전 및 20, 60, 120 분 후에 눈 아래쪽의 정맥총으로부터 경시적으로 채혈하여 혈당치를 측정하였다. GLP-1 유도체인 경우에는 혈당 상승의 피크치가 저하되는 경향이 나타났고, [Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1(7-36)의 경우에는 강력한 작용이 있는 것으로 확인되었다 (도 14). 또한, 그 작용은 투여 후 12O 분까지 지속되었다 (도 15). GLP-1 펩티드의 변형에 의해 생체내 혈중 안정성이 비약적으로 상승하고 지속성을 확보할 수 있다는 것이 명확해졌다.
본 발명에 의해, 유전자 공학을 이용하고 저렴하고 안전하고 효율적이며, 재 조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법에 의한 물질 생산 시스템이 제공된다. 본 발명의 방법에 따라, 건강 증진에 도움이 되는 성분을 유의하게 축적한 식품 제공이 가능하다. 또한, 본 발명의 방법은 의약품 또는 공업 원료로서 유용한 물질을 생산하는 고 부가가치의 식물을 제조하는 기초 기술이 될 수 있다.
또한, 본 발명은 음식물 섭취에 의해 소화관으로부터 분비되고 췌장에 기능하여 당 의존적인 인슐린 분비를 자극하는 호르몬으로 알려져 있는 GLP-1을 본 발명의 방법에 의해 제조하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명에서 제공되는 신규 GLP-1 유도체는 이것을 이용하여 섭취할 때 문제가 되었던 트립신 등의 소화 효소에 의한 분해에 대하여 상기 효소에 대한 내성을 갖고, 섭취, 흡수 후에 혈장 중에서의 안정성에 대하여 문제가 되었던 디펩티딜펩티다제 IV에 의한 분해에 대하여도 상기 효소에 대한 내성을 갖는다는 우수한 특성을 갖는 것이며, 의약으로서의 이용을 기대할 수 있는 것이다. 즉, 본 발명의 GLP-1 유도체는 경구 섭취된 경우에도 약효 발현이 가능하고, 예를 들어 본 발명의 방법에 의해 식물의 저장 기관에 발현시켜 경구 섭취한 경우라도 분해되지 않고 소장에서 흡수되어 약효를 발휘하는 것이 가능해진다. 따라서, 본 발명에서 제공되는 GLP-1 유도체는 GLP-1의 임상 응용의 가능성을 각별히 높이는 것이며, 당뇨병 환자 및 비만 환자의 QOL의 개선에 도움이 된다고 여겨진다.
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Claims (22)

  1. 하기의 (A), (B), (C) 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
    (A) 식물의 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질 유전자, 사이토카인 관련 유전자, 약제 내성 유전자 및 이탈능을 갖는 DNA 인자를 포함하고, 사이토카인 관련 유전자와 약제 내성 유전자는 이탈능을 갖는 DNA 인자와 함께 거동하는 위치에 존재하며, 식물의 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질 유전자는 이탈능을 갖는 DNA 인자와 함께 거동하지 않는 위치에 존재하는 벡터를 구축하고, 상기 벡터를 세포 중에 도입하는 과정,
    (B) 상기 (A)에 의해 벡터가 도입된 식물 세포를 약제 첨가 배지 및 약제 비첨가 배지에서 배양하여 형질전환체를 재분화시키는 과정, 및
    (C) 상기 (B)에서 재분화된 형질전환체로부터 식물 저장 기관을 수득하는 과정.
  2. 제1항에 있어서, 벡터가 도입된 식물 세포로부터 형질전환체를 재분화시키는 과정에서, 벡터가 도입된 식물 세포를 식물 호르몬 및 약제 첨가 배지에서 배양한 후에 식물 호르몬 및 약제 비첨가 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 식물 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질 유전자가 상기 식물 저장 기관에 특이적인 프로모터의 제어하에 있는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질 유전자가 상기 식물 저장 기관에서 본래 발현되는 단백질 유전자 중에 그 단백질의 가변 영역을 코딩하는 위치에서 삽입 또는 치환되어 있는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  5. 제4항에 있어서, 재조합 단백질 유전자와 식물 저장 기관에서 본래 발현되는 단백질 유전자와의 경계에 상기 재조합 단백질을 식물 저장 기관에서 본래 발현되는 단백질로부터 절단 분리하기 위한 효소 절단 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 배치하는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 저장 기관이 종자인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  7. 제6항에 있어서, 식물 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질 유전자를 단백질 가변 영역에 삽입 또는 치환시킨 상기 식물 저장 기관에서 본래 발현되는 유전자가 종자 저장 단백질 유전자인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 관련 유전자가 사이토카인 합성계의 유전자인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, 사이토카인 합성계 유전자가 이소펜테닐 트랜스퍼라제 유전자인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약제 내성 유전자가 하이글로마이신 내성 유전자인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 이탈능을 갖는 DNA 인자가 부위 특이적 재조합 시스템 또는 트란스포손(transposon)에서 유래한 것임을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 식물의 저장 기관 중에서 발현 되는 재조합 단백질 유전자가, GLP-1(7-36) 유전자 또는 GLP-1(7-36)의 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 및(또는) 부가된 서열을 포함하고 GLP-1 활성을 갖는 펩티드를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 식물의 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질 유전자가, GLP-1(7-36) 또는 그의 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 및(또는) 부가된 서열을 포함하고 GLP-1 활성을 갖는 펩티드에서 위치 26을 글루타민으로 치환하고 위치 34를 아스파라긴 또는 아스파라긴산으로 치환한 GLP-1 유도체를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 식물의 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질 유전자가 아미노산 서열의 위치 8을 세린 또는 글리신으로 치환한 GLP-1 유도체를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  15. 제14항에 있어서, 식물의 저장 기관 중에서 발현되는 재조합 단백질 유전자가 서열목록의 서열 1에 기재된 유전자인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 식물이 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  17. 제16항에 있어서, 단자엽 식물이 벼인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관의 생산 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 생산 방법에 의해 생산된, 재조합 단백질이 다량 생산되는 식물 저장 기관 또는 이를 생산하는 형질전환 식물.
  19. GLP-1(7-36) 또는 그 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 및(또는) 부가된 서열을 포함하고 GLP-1 활성을 갖는 펩티드에서 위치 26을 글루타민으로 치환하고 위치 34를 아스파라긴 또는 아스파라긴산으로 치환한 아미노산 서열을 갖는 GLP-1 유도체.
  20. 제19항에 있어서, GLP-1(7-36) 또는 그 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 및(또는) 부가된 서열을 포함하고 GLP-1 활성을 갖는 펩티드가 GLP-1(7-36), GLP-1(7-37) 또는 이들의 C-말단 아미드인 GLP-1 유도체.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 아미노산 서열의 위치 8을 세린 또는 글리신 으로 치환한 것을 특징으로 하는 GLP-1 유도체.
  22. 서열목록의 서열 2, 서열 5 또는 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 GLP-1 유도체.
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