CN102134577A - 高产重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法以及新型重组蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供在植物贮藏器官中高产重组蛋白的方法以及GLP-1衍生物。使用一种载体,通过转化得到高产重组蛋白的植物贮藏器官。其中所述载体含有重组蛋白的基因、细胞分裂素相关基因、抗药性基因以及具有脱离能力的DNA因子,且细胞分裂素相关基因和抗药性基因存在于与具有脱离能力的DNA因子的联动的位置,在植物的贮藏器官中表达的重组蛋白存在于与具有脱离能力的DNA因子的不联动的位置。通过上述方法生产GLP-1,并提供对酶的分解作用稳定的衍生物。
Description
本申请为分案申请,原申请的申请日为2004年3月26日,申请号为200480014756.6(PCT/JP2004/004382),发明名称为“高产重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法以及新型重组蛋白”。
技术领域
本发明涉及高产重组蛋白的植物的贮藏器官的生产方法、以及肽酶抗性人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的新型衍生物及其利用。本发明中,“重组蛋白”包含“重组肽和重组蛋白”(以下表示为“重组蛋白”)。
背景技术
利用基因工程技术的药物、临床检查药物、工业原料的生产已经在实际的产业方面成就了很大的贡献,其中,以微生物或哺乳类培养细胞为宿主的物质生产系统得到特别广泛应用。但是,培养这些细胞时,必须有无菌环境完善的培养设备或培养基等,并且,不可避免地要消耗石油能源,因此成本高。另外,使用哺乳类细胞作为宿主,则不可避免会有对人体有害的病毒混入的风险。
因此,作为价廉、安全的物质生产系统,人们开发了使用转基因植物的物质生产系统,以此代替通过微生物或哺乳类细胞的培养进行的物质生产。例如,迄今为止已报道的有:生产生物降解性聚酯等高分子化合物(例如日本特开2002-262886号公报)、疫苗(例如G.Jaeger等.,Eur.J.Biochem.259,426,1999)或乳铁蛋白(D.Chong等.,Transgenic.Res.9,71,2000)等蛋白、脑啡肽(日本特开2000-106890号公报)等肽的转基因植物的制备。
作为转基因植物,如果可以在该植物的可食用部分例如大豆或水稻的种子、蔬菜的叶等生产对人体有益的功能性物质,则无须经过目标物质的提取步骤,即可直接经口摄入人体。并且如果是种子,还无需用冷藏装置完备的设备进行保存或运输,可在室温下稳定地长期保存。另外,提取目标物质时,种子与叶不同,几乎没有酚性物质的混入,因此容易纯化。因此可以认为种子是理想的生产目标基因产物的器官,目前为止,已有例如制备生产大豆球蛋白(T.Katsube等.,Plant.Physiol.120,1063,1999)等蛋白、(1,3-1,4)-β-葡聚糖酶(H.Horvath等.,Proc.Nathl.Acad.Sci.USA.,97,1914,2000)等酶、脑啡肽(D.Chong等.,Transgenic.Res.9,71,2000)等肽的种子的报告。
但是,通过转基因植物的物质生产系统与目前作为主流的微生物 或哺乳类细胞培养系统比较,在具有上述优异特性的另一面,也有产率低、特别是由植物贮藏器官进行的生产效率差的问题。为解决该问题,人们考虑了各种增强转基因植物中物质生产能力的方案。例如,为了改善贮藏其器官之一的种子的物质生产能力,从提高导入的目标基因的表达或基因产物的蓄积的观点考虑,人们将精力集中于以下的研究:利用在种子中强烈表达的种子贮藏蛋白的启动子(例如T.Katsube等.,Plant.Physiol.120,1063,1999)、将该启动子同与之作用并使表达增强的转录因子结合使用(例如D.Yang等.,Proc.Nathl.Acad.Sci.USA.,98,11438,2001)、插入5’非翻译区(例如日本特开2002-58492号公报)、使基因中的C+G含量最佳(H.Horvath等.,Proc.Nathl.Acad.Sci.USA.,97,1914,2000)、向内质网附加核输送信号(例如日本特开2000-504567号公报)等。还有报告指出:使用缺失种子贮藏蛋白的突变体作为导入外源基因的植物体,则外源基因产物在种子中的生产量提高(日本特开2002-58492号公报)。但仅凭这些改良,不足以显示种子中的物质生产能力得到了增强,人们希望开发出新的方法。
另一方面,已知GLP-1(胰高血糖素样肽-1)是因摄取食物而由消化管分泌、在胰脏中发挥功效,刺激糖依赖性胰岛素的分泌的激素。II型糖尿病患者中,虽然可以保持对该GLP-1的应答性,但量不足。GLP-1制剂的开发作为补充GLP-1的不足部分的胰岛素分泌促进剂,有望应用于糖尿病治疗药。但是,GLP-1的活性本体是GLP-1(7-36)的酰胺化物或GLP-1(7-37)的多肽,如果口服摄取GLP-1,则在消化管内被消化酶消化、分解,不能充分吸收。因此,目前临床上尝试通过输液进行静脉内注射或皮下注射。并且有报道指出,GLP-1也可被存在于血液中或组织中的二肽酰肽酶IV(DPP-IV)分解,活性半衰期只有1-2分钟,非常短,容易由肾脏排出,在血液中的半衰期在5分钟以内,这些成为临床应用的瓶颈。
因此人们研究开发难以被分解、半衰期长的GLP-1衍生物。例如有:第8位氨基酸置换衍生物(Diabetologia41,271-278,1998、Biochem40,2860-2869,2001)、N末端和C末端氨基酸的修饰产物(WO9808871等)、将第34位置换为Arg并向第26位Lys导入亲油性基团的衍生物(WO0007617)、以及整个序列都有氨基酸置换的衍生物(WO9943705、WO9111457)等。另外还进行了皮下吸收缓慢的缓释型注射剂,或者具 有类GLP-1激动活性、在血液中的半衰期长、来自蜥蜴的合成Exendin-4的注射剂。但是这些都是注射剂,考虑到患者的负担,人们希望开发由注射以外的途径给药的新型GLP-1衍生物。
本发明的课题在于提供:高产重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法、通过该方法生产的高产重组蛋白的植物贮藏器官、以及肽酶抗性人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的新型衍生物及其利用。
即,为了增强转基因植物的贮藏器官中的物质生产,进行了上述的各种尝试。但是,为了将生产可用作药物等的重组蛋白的植物贮藏器官作为食物摄取,使其在体内发挥充分的功能,有必要开发更高产重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,同时,由植物中提取重组蛋白并加工成药物或功能性食品时,可以在这些贮藏器官中高产重组蛋白,这在成本方面是很重要的。因此,本发明的目的之一在于:提供在转基因植物中高产重组蛋白的贮藏器官的新型生产方法。
如果选择GLP-1作为通过上述方法在植物贮藏器官中高产的重组蛋白,则只是象平常饮食那样摄取果实或米等,就有望获得糖尿病的治疗效果。但是,如上所述,该天然型GLP-1在消化管内被消化酶消化、分解,因此无法以口服的方式稳定给药,因此目前的现状是尚未有除注射以外的有效的给药方式。因此,人们考虑如果通过一些方法使GLP-1不被消化而通过胃,就可以在小肠被吸收了。不过,吸收时,GLP-1必须以单体的形式存在。此时,天然型GLP-1也会被胰蛋白酶等酶分解而失活。
并且,天然型GLP-1即使被吸收了,其后也会被二肽酰肽酶IV分解,作用无法持续。因此,为了通过口服GLP-1来获得药理效果,必须设计一种通过氨基酸置换使其难以被胰蛋白酶或二肽酰肽酶IV分解、具有持续性活性的GLP-1衍生物。
因此,本发明的另一目的在于:提供对胰蛋白酶等消化酶具有抗性的可口服的新型GLP-1衍生物,进一步优选同时对二肽酰肽酶IV具有抗性的新型GLP-1衍生物。由此即可获得在作为食物摄取时可被吸收、显示药理效果的GLP-1衍生物。
发明内容
本发明人对于转基因植物中高产重组蛋白的贮藏器官的生产方法 进行了深入地研究,结果发现:通过构建一种载体,将该载体导入细胞中,由该导入有基因的植物的细胞再分化成转化体,由该再分化的转化体获得贮藏器官,由此可以在转基因植物中生产高产重组蛋白的贮藏器官,从而完成了本发明,其中所述载体含有在植物的贮藏器官中表达的重组蛋白的基因、细胞分裂素相关基因、抗药性基因和具有脱离能力的DNA因子,且细胞分裂素相关基因和抗药性基因存在于可与具有脱离能力的DNA因子联动的位置,在植物的贮藏器官中表达的重组蛋白的基因存在于与具有脱离能力的DNA因子不联动的位置。
本发明还将该高产重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法应用于已知的刺激糖依赖性胰岛素分泌的激素,GLP-1,制备该GLP-1的衍生物,由此提供不会被消化酶等消化、分解,并且在血浆中稳定的GLP-1衍生物。即,本发明人发现:在含有GLP-1(7-36)或者在其氨基酸序列的基础上有1个或多个氨基酸缺失、置换和/或附加的序列、且具有GLP-1活性的肽中、第26位被置换为谷胺酰胺、第34位被置换为天冬酰胺或天冬氨酸的GLP-1衍生物可保持与天然型GLP-1同等程度的活性,对胰蛋白酶等消化酶具有抗性,可由小肠吸收。还发现:再通过将第8位的丙氨酸变更为丝氨酸或甘氨酸,还可获得对二肽酰肽酶IV的抗性,在血浆中稳定,从而完成了本发明。另外,以往讲肽口服给药时,在胃中会被胰蛋白酶分解,因此肽是不可以口服的。但是,本发明由植物贮藏器官生产,因此可获得胰蛋白酶抗性,可以口服给药。
附图简述
图1是表示本发明的实施例中,在制备pGlbGLP130Hm的方案中,由pTL7到pGlbGLP的制备过程的图。
图2是表示本发明的实施例中,在制备pGlbGLP130Hm的方案中,由pUC18和pNPI130到pNPI130PUC的制备过程的图。
图3是表示本发明的实施例中,在制备pGlbGLP130Hm的方案中,由pNPI140和pNPI130PUC到pNPI130Hm的制备过程的图。
图4是本发明的实施例中,表示由pGlbGLP和pNPI130Hm到pGlbGLP130Hm的制备,同时表示pGlbGLP130Hm的限制酶切图谱的图。
图5是表示本发明的实施例中,由实施例1和比较例1得到的水 稻成熟种子中GLP-1衍生物融合蛋白的蓄积水平的图。
图6是表示本发明的实施例中,以往的载体pGlbGLP-Hm的限制酶切图谱的图。
图7是表示本发明的实施例中,根据实施例2所示的方法,测定比较制备例1的GLP-1(7-36酰胺)(天然型GLP-1)、比较制备例2的[Ser8]-GLP-1(7-36酰胺)、比较制备例3的[Gly8]-GLP-1(7-36酰胺)、和制备例1的[Gln26,Asn34]-GLP-1(7-36酰胺)的环AMP产生活性的结果的图。
图8是本发明的实施例中,根据实施例3所示的方法,将[Gln26,Asn34]-GLP-1(7-36酰胺)进行胰蛋白酶处理,对经胰蛋白酶处理的和未经处理的情况下比较环AMP产生活性的浓度依赖性的图。
图9是本发明的实施例中,根据实施例4所示的方法,使用来自由实施例1得到的水稻成熟种子的白米及其粉末的GLP-1衍生物、比较制备例1的GLP-1(7-36酰胺)(天然型GLP-1)、制备例2的[Ser8,Gln26,Asp34]-GLP-1(7-36)、制备例3的[Ser8,Gln26,Asn34]-GLP-1(7-36),进行对胰蛋白酶的稳定性比较的图。
图10是表示本发明的实施例中,根据实施例5所示的方法,由水稻成熟种子提取融合蛋白[Ser8,Gln26,Asp34]-GLP-1(7-36),该提取组分的胰蛋白酶处理时间与环AMP产生活性的关系的图。
图11是本发明的实施例中,根据实施例6所示的方法,使用比较制备例1的GLP-1(7-36酰胺)(天然型GLP-1)、制备例2的[Ser8,Gln26,Asp34]-GLP-1(7-36)、制备例3的[Ser8,Gln26,Asn34]-GLP-1(7-36)进行胰蛋白酶抗性的比较的图。
图12是本发明的实施例中,根据实施例7所示的方法,使用比较制备例1的GLP-1(7-36酰胺)(天然型GLP-1)、制备例2的[Ser8,Gln26,Asp34]-GLP-1(7-36)、制备例3的[Ser8,Gln26,Asn34]-GLP-1(7-36)进行DPP-IV抗性的比较的图。
图13是本发明的实施例中,根据实施例8所示的方法,使用比较制备例1的GLP-1(7-36酰胺)(天然型GLP-1)、制备例2的[Ser8,Gln26,Asp34]-GLP-1(7-36)、制备例3的[Ser8,Gln26,Asn34]-GLP-1(7-36)进行胰岛素分泌促进活性比较的图。
图14是本发明的实施例中,根据实施例9所示的方法,在使用比 较制备例1的GLP-1(7-36酰胺)(天然型GLP-1)、制备例2的[Ser8,Gln26,Asp34]-GLP-1(7-36)、制备例3的[Ser8,Gln26,Asn34]-GLP-1(7-36)进行小鼠经口糖负荷试验中降血糖效果比较的图中,以图15中0至120分钟血糖值变动图表曲线下面积表示血糖值变化量。
图15是本发明的实施例中,根据实施例9所示的方法,在使用比较制备例1的GLP-1(7-36酰胺)(天然型GLP-1)、制备例2的[Ser8,Gln26,Asp34]-GLP-1(7-36)、制备例3的[Ser8,Gln26,Asn34]-GLP-1(7-36)进行小鼠经口糖负荷试验中降血糖效果比较的图中,表示0至120分钟血糖值随时间的变化。天然型:GLP1(7-36酰胺);34N:[Ser8,Gln26,Asn34]-GLP-1(7-36);34D:[Ser8,Gln26,Asp34]-GLP-1(7-36);5∶5μg/kg皮下施用;20∶20μg/kg皮下施用。
实施发明的最佳方式
[高产重组蛋白的植物贮藏器官的生产]
本发明是高产重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,包含以下步骤:(A)构建一种载体,将该载体导入细胞中的步骤,其中所述载体含有在植物的贮藏器官中表达的重组蛋白的基因、细胞分裂素相关基因、抗药性基因和具有脱离能力的DNA因子,且细胞分裂素相关基因和抗药性基因存在于与具有脱离机能的DNA因子联动的位置,在植物贮藏器官中表达的重组蛋白的基因存在于与具有脱离机能的DNA因子不联动的位置;(B)将通过上述(A)导入了载体的植物细胞在添加药物的培养基和不添加药物的培养基上进行培养,由此再分化为转化体的步骤;(C)从通过上述(B)再分化的转化体中获得植物贮藏器官的步骤。以下对本发明进行详细说明。
(对象植物)
本发明中用于植物贮藏器官的生产的对象植物只要可形成贮藏器官即可,并没有特别限定,双子叶植物的代表性例子有:烟草、菜籽、大豆等,单子叶植物的代表性例子有:水稻、玉米、大麦、小麦等谷类或芦笋等。另外,本发明中对高产重组蛋白的植物贮藏器官并没有特别限定,代表性的有果实、块根、块茎、种子等。
(所使用的基因)
本发明所使用的基因可通过cDNA或基因组DNA的克隆获得。另外,如果预先知道该DNA序列,则也可以化学合成。即使不清楚DNA序列,如果知道氨基酸序列,也可以化学合成由氨基酸序列推定的DNA序列。
本发明中,基因可以根据需要将表达所必需的启动子和/或终止子的序列、还有使基因产物高效输送到贮藏器官的信号序列连接使用。这些启动子、终止子和信号序列只要可在植物中发挥功能即可,可以没有特别限制地使用。例如,可以使用花椰菜花叶病毒的35S启动子(J.T.Odell等.,Nature(London),313,810,1985)、胭脂氨酸合成酶的启动子(W.H.R.Langridge等.,Plant Cell Rep.,4,355,1985)等作为所述启动子。并且,如果使用诱导型启动子,还可以控制基因表达。
所述诱导型启动子目前有很多是已知的。例如与化学物质反应而诱导的启动子有:谷胱甘肽-S-转移酶I系基因的启动子(日本特开平5-268965号公报)、谷胱甘肽-S-转移酶II系基因的启动子(国际公开WO93/01294号公报)、Tet阻抑物融合型花椰菜花叶病毒35S启动子(C.Gatz等.,Mol.Gen.Genet.,227,229,1991)、Lac操纵子/阻抑物系启动子(R.J.Wilde等.,The EMBO Journal,11,1251,1992)、alcR/alcA系启动子(国际公开WO94/03619号公报)、糖皮质激素系启动子(青山卓史、蛋白核酸酶、41:2559、1996)、par系启动子(T.Sakai等.,Plant CellPhysiol.,37,906,1996)等,在光条件下反应而诱导的有:二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因(rbcS)的启动子(R.Fluhr等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,2358,1986)、果糖-1,6-二磷酸酶基因的启动子(日本特表平7-501921号公报)、捕光性叶绿素a/b结合蛋白基因的启动子(日本特开平5-89号公报)等,其它在伤害、温度等各种外部环境等下反应而诱导的启动子。
如上所述,本发明的重组蛋白基因的启动子可以使用35S启动子等组成型表达的启动子或诱导型启动子,特别优选可保证在生产重组蛋白基因的植物贮藏器官中表达的该植物贮藏器官特异性启动子。这样的在植物的特定组织或器官中促进特异性表达的启动子也是本领域技术人员广泛已知的。例如,本发明中,所述启动子可以使用在水稻种子中使外源基因表达的种子贮藏蛋白基因的启动子——球蛋白基因的启动子(M.Nakase等.,Plant Mol.Biol.,33,513,1997)、谷蛋白基因的启动子(F.Takaiwa等.,Plant Mol.Biol.,17,875,1991)等。还可以使用在菜豆、蚕豆、豌豆等豆科作物,花生、芝麻、菜籽、棉籽、葵花籽、红花籽等粮油种子作物的种子中使外源基因表达的启动子——大豆球蛋白基因的启动子、グルシフエリン基因的启动子(J.Rodin等.,Plant Mol.Biol.,20,559,1992)等各作物的主要种子贮藏蛋白基因的启动子。
另一方面,本发明中,终止子可以以胭脂氨酸合成酶的终止子(A.Depicker等.、J.Mol.Appl.Gen.,1,561,1982)、章鱼氨酸合成酶的终止子(J.Gielen等.,EMBO J.,3,835,1984)为代表,从DNA数据库中登录的植物基因的终止子等中选择使用。
本发明中,可导入植物的重组蛋白基因不仅是编码对人或家畜等动物的健康有作用的功能性肽、药物肽等的基因,也可以是编码功能未知的任意的肽或蛋白的基因。例如,本发明的实施例中就是将编码GLP-1衍生物的基因导入植物中,在植物的种子中生产GLP-1衍生物,可根据本发明的方法在植物的贮藏器官中生产的重组蛋白不仅限于GLP-1或其衍生物,包括已经作为药物使用或开发的各种肽或蛋白(S.Josephson and R.Bishop,TIBTECH,6,218,1988)在内,近年来发现的低胆固醇肽(例如日本特开2001-114800号公报)、螨尘或花粉抗原的T细胞表位肽(例如美国专利6268491号、日本特开平10-7700号公报、日本特开平10-259198号公报、日本特开平10-506877号公报、日本特开平11-92497号公报、日本特开2000-327699号公报)等各种肽或蛋白都可通过本发明的方法在植物贮藏器官生产。
可以根据其性质和目的生产经适当修饰的上述肽。即,以GLP-1为例,除GLP-1之外,本发明还可适用于含有GLP-1(7-36)或在其氨基酸序列的基础上有1或多个氨基酸缺失、置换和/或附加的序列、且具有GLP-1活性的肽,或者具有该肽的第26位被谷氨酰胺、第34位被天冬酰胺或天冬氨酸置换的氨基酸序列的GLP-1衍生物。本发明中,含有GLP-1(7-36)或者在其氨基酸序列的基础上有1或多个氨基酸缺失、置换和/或附加的序列、且具有GLP-1活性的肽也适合为GLP-1(7-36)、GLP-1(7-37)或它们的C末端为酰胺化物的GLP-1衍生物。本发明也适合将这些GLP-衍生物的第8位置换为丝氨酸或甘氨酸的GLP-1衍生物和SEQ ID NO.2的GLP-1衍生物。
(导入的重组蛋白基因的构建)
本发明中,可以使用一种融合基因,该融合基因是通过将编码这些重组蛋白的基因(DNA序列)插入或置换到编码原本在植物贮藏器官中表达的蛋白,例如种子贮藏蛋白,的基因中编码可变区的基因序列内,其中所述植物贮藏器官是要通过本发明的方法高产重组蛋白的贮 藏器官,所述编码区不会对原本在植物贮藏器官中表达的蛋白的蓄积量等不会因此受到不良影响。例如实施例中,将编码上述GLP-1衍生物的基因插入球蛋白基因中编码蛋白可变区的位置,形成融合基因使用。另外,此时,通过在重组蛋白基因和插入或置换了该基因的、原本在植物贮藏器官中表达的贮藏蛋白基因的交界处设置酶切序列,可以在提取所述融合基因的表达产物后,通过酶处理,切取目标重组蛋白并纯化。如果将要用胰蛋白酶等消化酶处理的酶切序列设置于此,则在通过饮食摄取要由本发明的方法高产重组蛋白的种子等植物贮藏器官后,目标肽或蛋白在小肠中被切取,被体内吸收,发挥各种生理机能。
种子贮藏蛋白是主要贮藏在种子中的蛋白,作为发芽所必需的营养元素而发挥着重要的作用(稻学大成第3卷、农山渔村文化协会)。可在本发明中使用的种子贮藏蛋白基因的种类没有特别限定,例如可以使用水稻球蛋白、谷蛋白、谷醇溶蛋白、拟南芥的2S白蛋白(日本特开2000-106890号公报)等基因。重组蛋白基因的插入位置只要是不使原本种子贮藏蛋白基因所编码的蛋白的特性发生变化的可变区即可,并没有特别限定。例如,本发明的实施例中,是将编码GLP-1衍生物的基因插入编码水稻球蛋白第109号氨基酸部位的位置。
(导入载体的构建)
本发明中,通过构建一种载体,对植物进行基因导入。所述载体中细胞分裂素相关基因和抗药基因存在于与具有脱离能力的DNA因子联动的位置,并且上述重组蛋白基因存在于与它们的不联动的位置上。
这里,细胞分裂素相关基因是指具有促进植物中细胞分裂或引起由植物的组织分化定芽或不定芽等的功能、与细胞分裂素的生成等相关的基因。
关于所述细胞分裂素相关基因,本发明中例如可以使用来自根癌农杆菌的ipt基因(A.C.Smigocki、L.D.Owens,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5131,1988)、来自红球菌的ipt基因、来自拟南芥的细胞分裂素合成酶基因、来自假单胞菌的ptz基因等的细胞分裂素合成基因,除此之外,还有使惰性细胞分裂素活化的基因——来自大肠杆菌的β-葡糖醛酸糖苷酶基因(Morten Joersbo and Finn T.Okkels,Plant Cell Reports 16,219-221,1996)、被认为是细胞分裂素受体基因的来自拟南芥的CKI1基因(Kakimoto T.Science 274,982-985,1996)等细胞分裂素相关基因的任意一种。
本发明中,抗药性基因是指使导入该基因的植物细胞具有抗生素抗性和农药抗性的基因。所述抗生素抗性基因例如可以使用潮霉素抗性基因(HPT:潮霉素磷酸化酶基因)、卡那霉素抗性基因(NPTII:新霉素磷酸化酶基因)等,农药抗性基因可以使用磺酰脲系抗性基因(ALS:乙酰乳酸合成酶基因)等。
具有脱离能力的DNA因子是指本身具有可从它们所存在并发挥功能的染色体DNA等中脱离的能力的DNA序列。植物中,这样的因子已知有存在于染色体DNA中的被称为转座子的因子,其结构和功能以及其动态已基本研究清楚。即,原则上转座子发挥功能必须具备两个构成要素,即由位于其内部的基因表达、催化其本身的脱离或转移的酶(转移酶),以及也是存在于其内部的末端区、该转移酶与之结合并作用的DNA序列。通过这些功能,转座子由其所存在的染色体DNA上脱离,然后通常转移至DNA上新的位置,但也有一定的概率是不转移而直接失去功能、消失等,因此,本发明就是利用这样的转座子的转移错误。
转座子有所述自主性转座子、即保持转移酶和DNA结合序列两个要素,由转座子内部表达的转移酶与存在于末端区的DNA序列结合并作用,由此可自主地从其存在的染色体上脱离并转移的转座子,除此之外,也有被称为非自主性转座子的形式。该非自主性转座子是指虽然保持有转移酶与之结合并作用的末端DNA序列,但内部的转移酶基因发生突变,转移酶不表达,因此不能自主地从染色体上脱离的转座子。不过,如果由自主性转座子或者独立存在的转移酶基因提供转移酶,则非自主性转座子与自主性转座子显示同样的动态。
自主性转座子有由玉米分离出的Ac和Spm等(A.Gieri and H.Saedler,Plant Mol.Biol.,19,39,1992)。尤其Ac,可用限制酶Sau3A从玉米染色体中切取wx-m7基因座而获得(U.Behrens等.,Mol.Gen.Genet.194,346,1984),是植物转座子中对其的分析最有进展的自主性转座子,其DNA序列也得到阐明(M.Muller-Neumann等.,Mol.Gen.Genet.,198,19,1984),因此本领域技术人员可容易地获得,适合作为 本发明所使用的DNA因子。另外,非自主性转座子分别是Ac、Spm的内部区域有缺失的因子,以Ds、dSpm为代表(H.-P.Doring and P.Starlinger,Ann.Rev.Genet.20,175,1986),除玉米之外,还已知从金鱼草、牵牛等很多植物中分离得到(例如Y.Inagaki等.,Plant Cell,6,375,1994).
由很多例子得知,这些转座子在被导入到与其来源植物不同的种类植物的染色体中时,可以发挥其能力进行脱离、转移(例如B.Baker等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,4844,1986)。本发明中,使用自主性、非自主性转座子均可。使用非自主性转座子时,还需要将由自主性转座子等中获得或合成的转移酶基因导入其中,这种情况下,可以将其与该非自主性转座子一起共同整合导入到本发明的载体中,也可以完全分别地导入。
已知存在于植物以外的具有脱离能力的DNA因子有:来自位点特异性重组体系的因子。该位点特异性重组体系包含以下两个要素:具有特征性DNA序列的重组位点(相当于本发明的具有脱离能力的DNA因子),以及与该DNA序列特异性结合、当存在2个或以上该序列时催化其序列间重组的酶;该DNA序列在同一DNA分子上朝同一方向以一定的间隔存在于两处位置时,夹在它们之间的区从该DNA分子(质粒、染色体)上脱离;该序列朝相对的方向存在于两处位置时,该区域显示反转的动态。本发明是利用该前者的脱离作用。已知编码重组酶的基因无需存在于与重组位点相同的DNA分子上,只要存在于与其相同的细胞中并表达,即可发生该DNA序列间的脱离、反转(N.L.Craig,Annu.Rev.Genet.,22,77,1988)。
目前,位点特异性重组体系已知有从噬菌体、细菌(例如大肠杆菌)、酵母等微生物分离的Cre/lox系、R/RS系、FLP系、eer系、fim系(N.L.Craig,Annu.Rev.Genet.,22,17,1988中有概述),但在高等生物中尚未知其存在。不过正如国际公开WO93/01283号公报中的来自P1噬菌体的Cre/lox系用作导入植物的基因导入载体那样,由上述微生物分离的位点特异性重组体系在导入植物等与其来源生物种类不同的生物种类时,也可获得与其原本的生物体内的举动相同的举动。本发明的一个实施例中,将重组酶插入酵母(接合酵母)的位点特异性重组体系R/RS系(H.Matsuzaki等.,J.Bacteriology,172,610,1990)的重组位点之 间来应用,已有报告指出该R/RS系在高等植物中也可保持其本来的功能(H.Onouchi等.,Nucleic Acid Res.,19,6373,1991)。
本发明中,插入细胞分裂素相关基因和抗药基因的位置只要是与具有脱离能力的DNA因子一起,使其可脱离的位置即可。例如使用自主性转座子作为具有脱离能力的DNA因子时,可以将其插入到转移酶基因的启动子区上游、该转移酶基因所结合的末端区的下游的不影响转座子脱离的位置。使用R/RS系时,任何在被重组位点夹持的区域内,且不阻碍重组酶的表达的位置均可插入。
(构建的载体向植物细胞的导入)
本发明中,将这样构建的载体导入植物细胞。如上述(对象植物)项所述,导入该载体的植物只要是形成贮藏器官的植物即可,没有特别限定,例如如果是单子叶植物,则有以水稻、玉米、大麦、小麦等谷类或芦笋等为代表的植物,如果是双子叶植物,则有以烟草、菜籽、大豆等为代表的植物。构建的载体向植物细胞的导入也可以使用公知的方法进行。例如除经由农杆菌属细菌的方法之外,还可以使用电穿孔法、聚乙二醇法、基因枪法等公知的任意方法,但并不限于此。
例如,使用本发明的方法向水稻中导入重组蛋白基因时,可以优选使用日本特许第3141084号公报所记载的方法。此时,播种水稻种子并使其发芽的播种培养基例如可使用N6C12培养基(N6无机盐类以及维生素类(Chu C.C.,1978,Proc.Symp.,Plant Tissue Culture,SiencePress Peking,pp.43-50)、30g/L蔗糖、2.8g/L脯氨酸、0.3g/L酪蛋白氨基酸、1mg/L 2,4-D、4g/L脱乙酰吉兰糖胶)等。但是,对上述培养基组成并没有特别限定,可以通过改变其组成物的种类、浓度来实施本发明。
(转化体的再分化)
由导入了重组蛋白基因的植物细胞或组织进行转化体的再分化时,可以将基因导入处理后的细胞或组织在添加药物的培养基和不添加药物的培养基中,采用公知的方法进行培养。本发明中,转化体是指定芽、不定芽、不定根等植物组织或小植株。
例如,根据本发明,将重组蛋白基因导入水稻并获得转化体时,如上所述,使用构建的载体,根据日本特许第3141084号公报记载的方法进行基因导入处理,由处理后发芽的种子切取水稻盾片组织,将该 盾片组织例如在添加药物的培养基N6C12TCH25培养基(N6无机盐类和维生素类、30g/L蔗糖、2.8g/L脯氨酸、0.3g/L酪蛋白氨基酸、2mg/L2,4-D、500mg/L羧苄青霉素、25mg/L潮霉素、4g/L脱乙酰吉兰糖胶)培养1周,再在添加药物的培养基N6C14TCH25培养基(N6无机盐类和维生素类、30g/L蔗糖、2.8g/L脯氨酸、0.3g/L酪蛋白氨基酸、4mg/L2,4-D、500mg/L羧苄青霉素、25mg/L潮霉素、4g/L脱乙酰吉兰糖胶)培养1周,再用未添加药物的培养基MSRC培养基(MS无机盐类和维生素类(Murashige,T.and Skoog,F.,1962,Physiol.Plant.,15,473)、30g/L蔗糖、30g/L山梨醇、2g/L酪蛋白氨基酸、500mg/L羧苄青霉素、4g/L脱乙酰吉兰糖胶)中培养,可得到作为芽或小植株的转化体。当然,上述例举的培养条件不是绝对的,可以根据需要改变培养基的组成、浓度,或者添加各种植物激素或药物,改变培养时间。
含药物的培养基使用添加与抗药性基因对应的药物的培养基,其中所述抗药性基因整合到如上构建的用于基因导入的载体中。例如将潮霉素抗性基因整合到该载体中时,可以使用添加有潮霉素的培养基,将磺酰脲系抗性基因整合到该载体中时,可以使用添加有磺酰脲系农药的培养基。
(植物贮藏器官的获得)
本发明中,植物贮藏器官可以如下获得:如上述,由导入了重组蛋白基因的植物细胞或组织再分化为转化体,然后采用公知的方法培育该转化体。例如,该转化体为不定芽时,可通过公知的方法进行生根处理,再生植株,培育该植株,使其结籽,即可收获高产重组蛋白的植物成熟种子等贮藏器官。不定芽的生根可以采用在MS琼脂培养基上插植不定芽等方法进行。另外,转化体以小植株的形式获得时,即使不进行生根处理也可以得到转基因植物。并且利用块根或块茎等作为植物贮藏器官时,可以通过公知的方法,无须经过植株的再生过程,使这些组织分化,即可由所得转化体获得。
(GLP-1类的生产)
本发明中,采用高产重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法提供GLP-1类。已知GLP-1是刺激糖依赖性胰岛素分泌的激素,因此GLP-1(7-36)是具有His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly- Arg所示序列的肽。本发明中,将编码该GLP-1(7-36)氨基酸序列的基因,或者编码含有在GLP-1(7-36)氨基酸序列的基础上有1个或多个氨基酸缺失、置换和/或附加的序列、且具有GLP-1活性的肽的基因作为上述重组蛋白,整合到本发明中所构建的载体中,使该基因表达,生产GLP-1类。
(GLP-1衍生物)
如上所述,本发明提供GLP-1类的生产方法,同时制备该GLP-1的衍生物,提供不被消化酶等消化、分解,并且在血浆中稳定的GLP-1的衍生物。本发明的衍生物是在含有GLP-1(7-36)或者在其氨基酸序列的基础上有1个或多个氨基酸缺失、置换和/或附加的序列、且具有GLP-1活性的肽中,第26位被谷氨酰胺置换,第34位被天冬酰胺或天冬氨酸置换,该GLP-1衍生物可保持与天然型GLP-1同等程度的胰岛素分泌促进活性,且对胰蛋白酶等消化酶具有抗性,由此变为可由小肠吸收。进一步通过将第8位的丙氨酸变更为丝氨酸或甘氨酸,还可获得对二肽酰肽酶IV的抗性,可变为在血浆中也稳定。
即,本发明的GLP-1衍生物是在含有GLP-1(7-36)或者在其氨基酸序列的基础上有1个或多个氨基酸缺失、置换和/或附加的序列、且具有GLP-1活性的肽中、第26位被谷氨酰胺置换,第34位被天冬酰胺或天冬氨酸置换的产物,这里,含有GLP-1(7-36)或者在其氨基酸序列的基础上有1个或多个氨基酸缺失、置换和/或附加的序列、且具有GLP-1活性的肽也包含GLP-1前体、类似物、以及它们的C末端酰胺化物,优选GLP-1(7-36)、GLP-1(7-37)或它们的末端酰胺化物。特别优选本发明的GLP-1衍生物将第8位置换成丝氨酸或甘氨酸。二肽酰肽酶IV是识别多肽链由N末端开始的第2个脯氨酸或丙氨酸,并水解其羧基一侧的酶。这里,优选本发明的GLP-1衍生物将第8位的丙氨酸变更为丝氨酸或甘氨酸。该第8位置换物可保持与天然型GLP-1同等程度的活性,在血浆中也稳定。
如上所述,本发明所使用的GLP-1(7-36)是具有以下的氨基酸序列的肽:His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg,第8位改变为丝氨酸的[Ser8]表示第2个(相当于第8位)的Ala变换为Ser。本发明的GLP-1衍生物可以通过化学合成或基因重组技术制备。
即,多肽的化学合成原理是本领域所周知的,可将以下的本领域的常规教材作为参考:Dugas H.和Penney C,Bioorganic Chemistry,1981,Springer-Verlag,New York,pp.54-92、Merrifields JM,Chem.Soc,85,2149,1962、Stewart和Young,Solid Phase Peptide Synthesis,pp.24-66,Freeman(San Francisco,1969)。例如可使用430A肽合成仪(PE-Applied Biosystems Inc,850 Lincoln Center Drive,Foster City CA94404)和由PE-Applied Biosystems提供的循环合成仪,通过固相方法合成本发明的肽。Boc氨基酸及其它试剂可由PE-Applied Biosystems以及其它试剂供应商购买。
通过基因重组技术进行的本发明的GLP-1衍生物的生产可以全合成GLP-1衍生物的DNA、或使用编码更大的天然胰高血糖素的DNA经修饰得到的基因进行。合成基因的构建方法是本领域所周知的,可参照Brown等著的Methods in Enzymology,Academic Press,NY,第68卷109-151页。
对于本发明的GLP-1衍生物的生产所使用的DNA,除上述之外,还可以在提高表达量、使产物在宿主内稳定蓄积方面,在生产后容易纯化方面,或者在生产融合蛋白并容易地切取GLP-1衍生物等方面多加考虑。例如,与β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、A蛋白、TrpE等蛋白的基因连接,生产融合蛋白的方法就是其中之一。这些情况下,例如生产后为了以单体的形式获得GLP-1衍生物,可以在各基因之间加入与氨基酸的甲硫氨酸对应的基因,进行溴化氰处理。此时,C末端为Hse(高丝氨酸)。本发明中有的GLP-1衍生物中,只在C末端具有精氨酸,通过精氨酰内肽酶的酶处理,可得到GLP-1衍生物的单体。
编码上述GLP-1衍生物的基因可以通过公知的基因工程技术导入植物以外的细胞中表达,由此可生产GLP-1衍生物。这种情况下,使用适当的限制性内切核酸酶,将编码GLP-1衍生物的基因插入适当的重组DNA表达载体。构建了GLP-1衍生物的表达载体后,使用该载体转化适当的宿主细胞。宿主细胞可以使用真核细胞或原核细胞的任意细胞。载体的构建和转化细胞的技术是本领域所周知的,通常可参照Molecular Cloning;A Laboratory Manual,Cold Springs HarborLaboratory Press,NY,Vol.1-3,1989。此时,为实现目标基因的有效的转录,可以将其与启动子-操纵子区功能性结合。可在原核细胞和真核 细胞的转化中使用的各种表达载体是周知的,可参照The PromegaBiological Research Products Catalogue和The Stratagene CloningSystems Catalogue。本发明的GLP-1衍生物的生产可以利用以广泛采用的微生物和哺乳类培养细胞为宿主的物质生产系统。另外,也可以利用采用上述的转基因植物的物质生产系统作为价廉、安全的物质生产系统。
[本发明的GLP-1衍生物的利用]
本发明所生产的GLP-1衍生物可以以植物种子等贮藏器官的形式,或者纯化、分离制成制剂的形式,或者以添加该成分的饮料食品的形式摄取并利用。以制剂的形式利用时,可以将含有GLP-I衍生物的成分与制剂可接受的载体、稀释剂、赋型剂或吸收促进剂组合,制成制剂,用作药物组合物。本发明的GLP-1衍生物对于与GLP-1有关的各种疾病有效,例如,可用于胰岛素非依赖性慢性糖尿病的处置、胰岛素依赖性慢性糖尿病的处置、肥胖的处置或者抑制食欲。
(实施例)
以下给出实施例具体说明本发明。但本发明并不受下述事实例的限定。以下的实施例中,如无特别说明,更详细的实验操作均根据分子生物学的方法,按照Molecular Cloning(Sambrook等.,1989)或制造商的操作说明书进行。
[实施例1]
I.质粒pGlbGLP130Hm的制备
将用限制酶EcoRI和Sse 8387I切取的水稻球蛋白启动子、SEQ IDNO.1所示的编码[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36酰胺)的基因插入到可变区(第109号氨基酸部位)得到的水稻球蛋白基因、以及胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化信号所连接的基因片段插入到pTL7(H.Ebinuma等.,Molecular Methods of Plant Analysis,22:95,2002)的EcoRI-Sse8387I限制酶切位点之间,得到质粒pGlbGLP。如SEQ ID NO.2所示,[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)是含有GLP-1的7-36号的氨基酸,其中第8位被丝氨酸置换,第26位被谷氨酰胺置换,第34位被天冬酰胺置换的衍生物,插入到水稻球蛋白基因中时,其N末端一侧附加有赖氨酸残基(AAG)。
另一方面,用限制酶KpnI酶切质粒pUC18的KpnI限制酶切位 点,通过T4聚合酶形成平滑末端,然后再结合,得到质粒pUC18ΔkpnI。用限制酶Sse8387I从质粒pNPI130(日本特开平9-154580号公报)酶切酵母的位点特异性重组体系的重组序列Rs所夹持的区域,将其插入上述pUC18ΔkpnI的Sse8387I限制酶切位点,得到质粒pNPI130PUC。
用限制酶KpnI,从质粒pNPI140(日本特开平9-154580号公报)中酶切CaMV35S启动子、Hm(潮霉素抗性)基因和胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化信号所连接的基因片段,插入pNPI130PUC的KpnI限制酶切位点,得到质粒pNPI130Hm。
目标质粒如下获得:用限制酶Sse8387I从该pNPI130Hm中酶切酵母的位点特异性重组体系的重组序列Rs所夹持的区域,将其插入pGlbGLP的Sse8387I限制酶切位点之间。将所得质粒命名为pGlbGLP130Hm,于2003年3月25日保藏在国际专利生物保藏机构,独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Tsukuba Central 6,1-1,Higashi 1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566,Japan),国际保藏号FERM BP-8343。该pGlbGLP130Hm中,作为在植物的贮藏器官中表达的重组蛋白基因,编码[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)的基因以插入到水稻球蛋白基因的可变区(第109号氨基酸部位)的形式存在,还具有细胞分裂素相关基因ipt基因、抗药性基因——潮霉素抗性基因,并使用酵母的位点特异性重组系R/RS系作为具有脱离能力的DNA因子。
pGlbGLP130Hm的制备方案如图1-4所示,该pGlbGLP130Hm中要整合到植物染色体中的区(T-DNA区)的限制酶切图谱如图4所示。图1-4中,Glb-P表示水稻球蛋白基因的启动子,GLP表示编码[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)的基因,球蛋白表示水稻球蛋白基因,T表示胭脂氨酸合成酶基因的聚腺苷酸化信号,la表示lacZ’基因的片段,35S-P表示花椰菜花叶病毒的35S启动子,ipt表示ipt基因,圈T表示ipt基因本身的聚腺苷酸化信号,Hm表示潮霉素抗性基因,R表示重组酶基因,方框圈起的三角形表示重组序列Rs及其序列方向,RB和LB表示T-DNA区的边界序列。
II.pGlbGLP130Hm向农杆菌的导入
将根癌农杆菌EHA105菌株接种于10mL YEB液体培养基(5g/L牛肉膏、1g/L酵母膏、5g/L蛋白胨、5g/L蔗糖、2mM MgSO4、22℃的pH为7.2(以下如无特别说明,均为22℃下的pH)),在28℃培养,使OD630在0.4-0.6的范围。以6900×g、在4℃下将培养液离心10分 钟,收集菌体,将菌体悬浮于20ml10mM HEPES(pH 8.0)中,再次以6900×g、在4℃离心10分钟,收集菌体,接着将该菌体悬浮于200μl的YEB液体培养基中,将其作为质粒导入菌液。
使用该质粒导入菌液,如下进行pGlbGLP130Hm向农杆菌的导入。即,使用Gene Pulser II系统[BIORAD制造],在0.5ml管中对将50μl上述质粒导入菌液和3μl pGlbGLP130Hm混合的混合液进行电穿孔,向经电穿孔处理后的混合液中加入200μl YEB液体培养基,在25℃振荡1小时进行培养,然后将菌体接种于添加有50mg/L卡那霉素的YEB琼脂培养基(1.5w/v%琼脂,其它组成与上述相同),在28℃培养2天。再将所得菌落转移至YEB液体培养基进行培养,接着,通过碱法从该菌体中提取质粒,可确认这些菌是导入有pGlbGLP130Hm的EHA105菌株,将其称为EHA105(pGlbGLP130Hm)。
III.感染材料的制备
使用水稻品种“日本晴”作为基因导入的对象,按照细胞工学别册植物细胞工学系列4模型植物的试验方案(93-98页)进行该成熟种子的灭菌。将灭菌的成熟种子播种于N6C12培养基(N6无机盐类以及维生素类、30g/L蔗糖、2.8g/L脯氨酸、0.3g/L酪蛋白氨基酸、1mg/L2,4-D、4g/L脱乙酰吉兰糖胶、pH=5.8),用外科胶带封住,在28℃亮处培养,使其发芽,制成通过农杆菌EHA105(pGlbGLP130Hm)进行感染的材料。
IV.通过农杆菌EHA105(pGlbGLP130Hm)进行水稻的转化以及转化水稻的制备
将在YEB琼脂培养基(5g/L牛肉膏、1g/L酵母膏、5g/L蛋白胨、5g/L蔗糖、2mM MgSO4、15g/L Bacto-agar)中培养的农杆菌EHA105(pGlbGLP130Hm)转移到YEB液体培养基中,在25℃以180rpm培养过夜,然后以3000rpm离心20分钟,收集菌体,悬浮于含有乙酰丁香酮(10mg/L)的N6培养基(N6无机盐类以及维生素类、30g/L蔗糖、2mg/L 2,4-D、pH=5.8),使OD630=0.15,制成感染用农杆菌悬浮液。
将III中制备的发芽种子装入50ml管中,向其中注入上述感染用农杆菌悬浮液,浸泡种子。浸泡1.5分钟后,倒去农杆菌悬浮液,将发芽的种子置于无菌滤纸上,吸去多余的水分,然后播种于N6C12培养基(N6无机盐类以及维生素类、30g/L蔗糖、2.8g/L脯氨酸、0.3g/L酪 蛋白氨基酸、1mg/L 2,4-D、4g/L脱乙酰吉兰糖胶、pH=5.2),用外科胶带封住,在28℃暗处共培养3天,再转移到N6C12CH25培养基(N6无机盐类以及维生素类、30g/L蔗糖、2.8g/L脯氨酸、0.3g/L酪蛋白氨基酸、2mg/L 2,4-D、500mg/L羧苄青霉素、25mg/L潮霉素、4g/L脱乙酰吉兰糖胶),培养1周,然后从发芽种子的盾片组织中切取所发的芽。
接着,将该盾片组织在N6C14TCH25培养基(N6无机盐类以及维生素类、30g/L蔗糖、2.8g/L脯氨酸、0.3g/L酪蛋白氨基酸、4mg/L2,4-D、500mg/L羧苄青霉素、25mg/L潮霉素、4g/L脱乙酰吉兰糖胶)上培养1周,再在MSRC培养基(MS无机盐类以及维生素类、30g/L蔗糖、30g/L山梨醇、2g/L酪蛋白氨基酸、500mg/L羧苄青霉素、4g/L脱乙酰吉兰糖胶)上培养,在与EHA105(pGlbGLP130Hm)共培养后,在1个月至2个月之间再分化为芽或小植株。再分化的芽或小植株移植到生根培养基上培养,得到高约20cm的幼苗。使用Dneasy 96 PlantKit(QIAGEN制备),从该幼苗中提取染色体DNA,通过PCR法确认编码[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)的基因的存在。
此时,为了检测插入到球蛋白基因的可变区的、编码[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)的基因,PCR 引物使用3-1:5’-GGATCCATGGCTAGCAAGGTCGTC-3’(SEQ ID NO.3)和3-3:5’-GATCACTATCTCGTTGCATGCAACAC-3’(SEQ ID NO.4)。使用琼脂糖凝胶电泳对所得PCR反应产物(约700bp)进行分析,确认了染色体DNA中编码[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)的基因的存在。
结果表明,约3%的用于农杆菌感染处理的水稻种子中导入了上述编码[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)的基因。
这样得到的、已确认导入了编码[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)的基因的水稻幼苗的转化体在土壤中驯化,在温室中栽培、生长,收获成熟种子。
V.蛋白分析
用250μl含有10%(v/v)甘油、0.25%(w/v)SDS、5%2-巯基乙醇的62.5mM Tris-HCl(pH6.8)提取缓冲液,在100℃,将IV.中得到的10mg成熟种子处理5分钟,提取这些种子的全部蛋白,将该提取液进行SDS-PAGE。SDS-PAGE使用15%(w/v)聚丙烯酰胺(丙烯酰胺:N,N’- 亚甲基双丙烯酰胺=30∶0.8)凝胶进行。
用分析软件Image Gauge(富士写真胶片制造)对所得凝胶图像进行分析,对编码[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)的基因插入到球蛋白的可变区得到的融合蛋白的蓄积水平进行调查。结果如图5所示。
[比较例1]
使用含有水稻球蛋白启动子、SEQ ID NO.1所示的编码[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)的基因插入到可变区的球蛋白基因、以及胭脂氨酸合成酶的聚腺苷酸化信号所连接的基因片段的图6记载的现有载体pGlbGLP-Hm,进行对水稻成熟种子的基因导入,除此之外,与实施例1同样地进行基因导入,再分化芽或小植株,由该芽或小植株再生植株,得到转化水稻,收获成熟种子,对该成熟种子进行蛋白分析。结果如图5所示。
由图5可知,编码[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)的基因插入到球蛋白的可变区形成的融合蛋白在实施例1中所生产的水稻成熟种子中高蓄积,与比较例1相比较,最高显示约6倍的水平(图5)。
[实施例2]
I.GLP-1衍生物的合成
通过430A型肽合成仪(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)进行固相合成,合成以下所示的GLP-1衍生物,通过HPLC纯化,然后通过质谱确认合成品。使用纯度为95%或以上的合成品,用于体外和体内试验。
比较制备例1.GLP-1(7-36酰胺)
(天然型GLP-1)
比较制备例2.[Ser8]-GLP-1(7-36酰胺)
比较制备例3.[Gly8]-GLP-1(7-36酰胺)
制备例1.[Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36酰胺)
(制备例1的非酰胺化物的氨基酸序列如SEQ ID NO.5表示)
制备例2.[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)
制备例3.[Ser8、Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36)
(制备例3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6表示)
II.GLP-1衍生物的环AMP产生活性
根据已公开的人GLP-1受体的DNA序列(Graziano等、Biochem Biophys Res Com,196:141-146,1993)构建表达载体。用该载体转化中国仓鼠卵巢SHO-K1细胞,得到表达人GLP-1受体的重组CHO-K1细胞。将该人GLP-1受体表达细胞以1×104细胞/ml/孔植入24孔板中,3天后用于测定。
测定方法是:在GLP-1衍生物存在下,将上述细胞在缓冲液(PBS、5.6mM葡萄糖、1mM异丁基甲基黄嘌呤、20μM Ro20-1724、0.5%BSA、pH7.4)中、在37℃孵育30分钟。加入10μl 5N盐酸,停止孵育。通过cAMP-ScreenTM系统(Applied Biosystems制造)的酶联免疫测定对通过各种GLP-1衍生物与GLP-1受体的反应在细胞内形成的环化AMP进行测定。图7表示各种GLP-1衍生物的环AMP产生活性。
该结果显示:[Ser8]-GLP-1(7-36酰胺)、[Gly8]-GLP-1(7-36酰胺)、[Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36酰胺)具有与天然型GLP-1同等的环AMP产生活性。
[实施例3]
对制备例1的[Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36酰胺)进行胰蛋白酶处理,然后与实施例2同样地进行环AMP产生活性测定,调查胰蛋白酶抗性。
即,将合成得到的上述GLP-1衍生物溶解于50mM碳酸氢铵溶液(pH 7.8),使浓度为500μg/ml。向100μl该溶液中加入5μl 500μg/ml胰蛋白酶溶液(Promega制备、Cat.No.V5113),在37℃反应1小时。加入1200μl 71.5%的乙醇(终浓度65%),使反应停止,在4℃、以15,000rpm离心5分钟,回收上清,蒸发干燥。将干燥固化物溶解于蒸馏水中,用于测定活性。
图8表示胰蛋白酶处理前和处理后的[Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36酰胺)的活性与浓度的相关性。可知:[Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36酰胺)在胰蛋白酶处理前和处理后活性没有差别,对胰蛋白酶具有抗性。
[实施例4]
研究水稻成熟种子中GLP-1衍生物对胰蛋白酶的稳定性。
使用实施例1中得到的水稻成熟种子制成的白米及其粉末,加入1.9倍量的水,加热15分钟,制成米饭。将米饭颗粒均匀压碎,然后用蒸馏水稀释5倍,制成样品;将粉末直接用蒸馏水稀释5倍,制成样品。另一方面,用2%BSA溶液将合成品GLP-1(7-36酰胺)、[Ser8、 Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)、[Ser8、Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36)制成10μg/ml溶液,制成样品。
以1/10的量向各样品中加入含有7.6mg/ml胰蛋白酶的10倍浓度的人工胃液(pH1.2),在37℃反应1小时,然后用NaOH中和。对于GLP-1(7-36酰胺)、[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)、[Ser8、Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36)、以及对于来自米的样品提取蛋白,通过胰蛋白酶处理得到GLP-1单体,然后测定它们的环AMP产生活性。结果可知,合成的GLP-1衍生物经胰蛋白酶处理后完全失活,但米中则残留有31-65%的GLP-1活性(图9)。
由以上可以断定:水稻成熟种子中含有的GLP-1衍生物不会被胰蛋白酶消化,可通过胃到达小肠。
[实施例5]
通过0.025M氢氧化钠溶液,从实施例1得到的水稻成熟种子中提取[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)和球蛋白融合的蛋白,将其用50mM碳酸氢铵pH7.8稀释15倍。向该稀释液中加入6μl 83μg/ml胰蛋白酶溶液(Promega制备、Cat.No.V5113),在37℃反应1、2、4、6或20小时,然后加入1200μl71.5%的乙醇(终浓度65%),使反应停止,在4℃、以15,000rpm离心5分钟,回收上清,蒸发干燥。将干燥固化物溶解于蒸馏水中,测定活性。
图10表示在水稻成熟种子中表达、作为融合蛋白得到的[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)的胰蛋白酶处理时间与活性的关系。胰蛋白酶处理伊始即显现环AMP产生活性,与胰蛋白酶处理时间没有关系,一直保持了该活性。由以上可知:[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)在水稻成熟种子中以具有活性的形式表达,且为胰蛋白酶抗性。因此,可以推断:通过GLP-1衍生物的表达,水稻成熟种子中含有的[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)可以不被胰蛋白酶分解而在小肠中被吸收。
[实施例6]
对[Ser8、Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36)和[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)实施胰蛋白酶处理后,与实施例2同样地测定环AMP产生活性,由此研究胰蛋白酶抗性。
即,将上述合成GLP-1衍生物用0.2%牛血清白蛋白溶液稀释为10μg/ml,取8μl上述稀释溶液,加入112μl 50mM碳酸氢铵溶液(pH7.8) 和6μl83μg/ml胰蛋白酶溶液(Promega制备、Cat.No.V5113),在37℃反应1小时,然后加入1200μl 71.5%的乙醇(终浓度65%),使反应停止,在4℃、以15,000rpm离心5分钟,回收上清,蒸发干燥。将干燥固化物溶解于蒸馏水中,用于测定活性。
图11表示GLP-1(7-36酰胺)、[Ser8、Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36)和[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)的胰蛋白酶处理时间与活性的变化。与天然型GLP-1(7-36酰胺)比较,可知[Ser8、Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36)和[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)不会因胰蛋白酶处理而显示活性变化,为胰蛋白酶抗性。
[实施例7]
研究本发明的GLP-1衍生物与天然型GLP-1比较,是否显示显著的DPP-IV抗性。使用5000pM GLP-1(7-36酰胺)(天然型GLP-1)、500pM [Ser8、Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36)、5000pM[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36),分别与40μU/μl的DPP-IV(Sigma、D7052)混合,在37℃反应0、15、30、60分钟,然后用2倍量的乙醇提取,用旋转蒸发器干燥固化。将所得干燥固化物溶解于含1%BSA的蒸馏水中,与GLP-1受体表述细胞作用,测定环AMP产生量。图12中,以未经DPP-IV处理时的为100%,进行环AMP产生活性比较。与GLP-1(7-36酰胺)比较,[Ser8、Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36)和[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)可见明显的DPP-IV抗性。
[实施例8]
研究本发明的GLP-1衍生物的胰岛素分泌促进性。
通过胶原酶从ICR小鼠的胰脏中取得朗格汉斯氏岛细胞,在24孔板上每孔装入2-3个朗格汉斯氏岛细胞。培养过夜。然后,加入溶解于含16.7mM葡萄糖、0.2%BSA和10mM Hepes的Krebs-Ringer缓冲液的本发明的GLP-1衍生物,在37℃放置30分钟,通过酶联免疫测定试剂盒(シバヤギ制备)测定。
在GLP-1(7-36酰胺)、[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)、[Ser8、Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36)的任意肽中,都可见用量相关性的胰岛素分泌促进活性。特别是在[Ser8、Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36)中可以高浓度显示胰岛素分泌促进活性(图13)。
[实施例9]
研究口服糖负荷试验(OGTT)中通过皮下施用GLP-1衍生物产生的血糖降低效果。
对一夜未进食的小鼠口服施用1g/kg葡萄糖,立即背部皮下施用(5、20μg/kg)GLP-1(7-36酰胺)、[Ser8、Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36)或[Ser8、Gln26、Asp34]-GLP-1(7-36)。对对照组施用生理盐水。葡萄糖负荷前以及20、60、120分钟后由眼下静脉丛采血,测定血糖值。GLP-1衍生物中,可见血糖上升的峰值有降低的趋势,[Ser8、Gln26、Asn34]-GLP-1(7-36)中则可见强烈的作用(图14)。另外,该作用持续到施用后120分钟(图15)。由此明确:通过GLP-1肽的改变,在生物体内血液中的稳定性飞跃提高,可确保持续性。
产业实用性
作为采用基因工程的价廉、安全且高效的物质生产系统,本发明可提供通过高产重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法而得到的物质生产系统。根据本发明的方法,可以提供显著蓄积对增进健康有作用的成分的食品。本发明的方法还可以作为生产可用作药物、工业原料的物质的高附加值植物制备的基础技术。
本发明还包含通过本发明的方法制备GLP-1。其中所述GLP-1已知为通过食物摄取、由消化管分泌、在胰脏中发挥作用的刺激糖依赖性胰岛素分泌的激素。
本发明中所提供的新型GLP-1衍生物具有以下优异特性:在利用并摄取时,针对胰蛋白酶等消化酶的分解问题,其具有对该酶的抗性;并且在摄取、吸收后,关于在血浆中的稳定性,针对二肽酰肽酶IV的分解问题,其具有对该酶的抗性,有望作为药物应用。即,本发明的GLP-1衍生物在经口摄取时可以表达药效,例如根据本发明的方法,在植物的贮藏器官中表达并经口摄取时,不会被分解,可从小肠吸收,表达药效。因此,本发明所提供的GLP-1衍生物进一步提高了GLP-1的临床应用的可能性,对糖尿病患者和肥胖患者的QOL改善发挥作用。
Claims (20)
1.高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中编码含有GLP-1(7-36)或者在其氨基酸序列的基础上有1或多个氨基酸缺失、置换和/或附加的序列、且具有GLP-1活性的肽中、第26位置换为谷胺酰胺、第34位置换为天冬酰胺或天冬氨酸的GLP-1衍生物的基因,用作在植物贮藏器官中表达的重组蛋白基因,该方法包含以下步骤(A)、(B)和(C):
(A)构建一种载体,将该载体导入细胞中的步骤,其中所述载体含有在植物的贮藏器官中表达的重组蛋白的基因、细胞分裂素相关基因、抗药性基因和具有脱离能力的DNA因子,且细胞分裂素相关基因和抗药性基因存在于与具有脱离能力的DNA因子联动的位置,在植物贮藏器官中表达的重组蛋白的基因存在于与具有脱离能力的DNA因子不联动的位置;
(B)将通过上述步骤(A)导入了载体的植物细胞在添加药物的培养基和不添加药物的培养基上进行培养,由此再分化为转化体的步骤;和
(C)从通过上述步骤(B)再分化的转化体中获得植物贮藏器官的步骤。
2.权利要求1的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中编码GLP-1衍生物的基因是编码氨基酸序列的第8位进一步置换为丝氨酸或甘氨酸的GLP-1衍生物的基因。
3.权利要求2的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中编码GLP-1衍生物的基因是序列表SEQ ID NO.1所示的基因。
4.权利要求1的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中GLP-1衍生物由序列表SEQ ID NO:2、5或6中所示的氨基酸序列组成。
5.权利要求1的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其包括:在由导入了载体的植物细胞再分化转化体的过程中,将导入了载体的植物细胞在添加植物激素的培养基和添加药物的培养基上培养,然后在不添加植物激素的培养基和不添加药物的培养基上培养。
6.权利要求1的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中编码GLP-1衍生物的基因处于该植物贮藏器官特异性启动子的控制下。
7.权利要求1的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中编码GLP-1衍生物的基因插入或置换到原本在该植物贮藏器官中表达的蛋白编码基因中编码蛋白可变区的位置。
8.权利要求7的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中在编码GLP-1衍生物的基因和原本在植物贮藏器官中表达的蛋白编码基因的交界处配置有编码酶切氨基酸序列的碱基序列,其中所述酶切氨基酸序列用于将该GLP-1衍生物从原本在植物贮藏器官中表达的蛋白上切取分离。
9.权利要求1的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中植物贮藏器官为种子。
10.权利要求9的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中其蛋白的可变区待插入或待置换的原本在植物贮藏器官中表达的蛋白编码基因是种子贮藏蛋白基因。
11.权利要求1的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中细胞分裂素相关基因是细胞分裂素合成基因。
12.权利要求11的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中细胞分裂素合成基因是异戊烯转移酶基因。
13.权利要求1的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中抗药性基因是潮霉素抗性基因。
14.权利要求1的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中具有脱离能力的DNA因子来自位点特异性重组系统或转座子。
15.权利要求1的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中所述植物为单子叶植物。
16.权利要求15的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法,其中所述单子叶植物为水稻。
17.通过权利要求1的生产方法生产的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官、或生产该植物贮藏器官的转基因植物。
18.权利要求1的高产GLP-1衍生物重组蛋白的植物贮藏器官的生产方法中使用的用于将基因导入植物的重组载体,其中编码含有GLP-1(7-36)或者在其氨基酸序列的基础上有1或多个氨基酸缺失、置换和/或附加的序列、且具有GLP-1活性的肽中、第26位置换为谷胺酰胺、第34位置换为天冬酰胺或天冬氨酸的GLP-1衍生物的基因,用作在植物贮藏器官中表达的重组蛋白基因;该重组载体含有编码GLP-1衍生物的基因、细胞分裂素相关基因、抗药性基因和具有脱离能力的DNA因子,该基因已被导入载体中,其中细胞分裂素相关基因和抗药性基因存在于与具有脱离能力的DNA因子联动的位置、而在植物贮藏器官中表达的重组蛋白的基因存在于与具有脱离能力的DNA因子不联动的位置。
19.权利要求18的用于将基因导入植物的载体,其中编码GLP-1衍生物的基因是编码氨基酸序列的第8位进一步置换为丝氨酸或甘氨酸的肽的基因。
20.权利要求19的用于将基因导入植物的载体,其中编码GLP-1衍生物的基因是序列表SEQ ID NO.1所示的基因。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110727 |