CN102753683B - 具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白、编码该蛋白的多核苷酸以及它们的用途 - Google Patents
具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白、编码该蛋白的多核苷酸以及它们的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的目的在于：提供对几乎所有的患者都发挥优异的柳杉花粉治疗效果、还可作为食品摄取的蛋白。即，本发明提供：具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、或者包含上述序列中具有突变的氨基酸序列；编码上述蛋白的多核苷酸；包含上述多核苷酸的载体；包含上述多核苷酸或上述载体的转化体；以及上述蛋白、上述多核苷酸、上述转化体的用途。
Description
技术领域
本发明涉及具有柳杉花粉的免疫原性的新型蛋白和编码该蛋白的多核苷酸。
背景技术
花粉症是指由进入体内的花粉引起的变态反应症状，其患者不断增加。作为病因的花粉的代表性物质为柳杉花粉。作为柳杉花粉的变应原，已知存在两种蛋白、即Cryj1(参照专利文献1和非专利文献1)和Cryj2(专利文献2、非专利文献2和非专利文献3)。已知大部分柳杉花粉症患者对Cryj1和Cryj2、或它们中的任一种产生变态反应。
作为花粉症的治疗方法之一，有对患者给予变应原中由T细胞表位构成的肽的肽免疫疗法。与对患者给予变应原本身的减敏疗法相比，肽免疫疗法具有不会产生过敏性反应等危险的副作用、短期内可以取得症状缓解效果的优点。
专利文献3和4中记载着：来自柳杉花粉变应原的包含不同的多个人T细胞表位的肽可用于上述免疫疗法。专利文献4中公开了：上述肽对柳杉花粉症患者中57％左右的人有效。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第93/01213号公报
专利文献2：日本特表平8-505284号公报
专利文献3：日本特开平10-259198号公报
专利文献4：日本特开2000-327699号公报
非专利文献
非专利文献1：Yasuda，H.等人，Allergy Clin.Immunol.71，77-86，1983
非专利文献2：Taniai，M.等人，FEBS Letters，239，329-332，1988
非专利文献3：Sakaguchi，H.等人，Allergy，45，309-312，1990
发明内容
发明所要解决的课题
但是，专利文献3和专利文献4中记载的肽并不是对所有的柳杉花粉症患者都有效，在这方面其花粉症治疗效果谈不上充分。
本发明的目的在于：提供对几乎所有的患者都发挥优异的柳杉花粉治疗效果、还可作为食品摄取的蛋白。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果着眼于柳杉花粉变应原Cryj1和Cryj2的氨基酸序列，并尝试着进行各自的修饰。其结果，发现包含对各自加入了特定的修饰而得到的氨基酸序列的蛋白虽然维持柳杉花粉的免疫原性，但具有不同于柳杉花粉抗原的立体结构，因此与IgE的结合性降低，安全性高。进一步进行编码上述蛋白的遗传信息的分析，发现还可以实现上述蛋白和包含上述蛋白的植物体的大量生产。本发明是基于所述认知的发明。
[1]选自以下(A)～(C)的蛋白。
(A)蛋白，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
(B)蛋白，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性；
(C)蛋白，其包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性。
[2]选自以下(a)～(c)的多核苷酸。
(a)多核苷酸，其编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
(b)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白；
(c)多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白。
[3]选自以下(D)～(F)的蛋白。
(D)蛋白，其包含SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列；
(E)蛋白，其包含SEQ ID NO：2～4中任一个所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性；
(F)蛋白，其包含与SEQ ID NO：2～4中任一个所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性。
[4]选自以下(d)～(f)的多核苷酸。
(d)多核苷酸，其编码SEQ ID NO：2～4中任一个所示的氨基酸序列；
(e)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：2～4中任一个所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白；
(f)多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO：2～4中任一个所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白。
[5]上述[4]所述的多核苷酸，其选自以下的(p)～(r)。
(p)多核苷酸，其具有SEQ ID NO：5记载的核苷酸序列；
(q)多核苷酸，其具有SEQ ID NO：6～8中任一个记载的核苷酸序列；
(r)多核苷酸，其具有SEQ ID NO：5记载的核苷酸序列和SEQ ID NO：6～8中任一个记载的核苷酸序列。
[6]载体，包含上述[2]、[4]和[5]中任一项所述的多核苷酸。
[7]转化体，其中导入有上述[2]、[4]和[5]中任一项所述的多核苷酸或[6]所述的载体。
[8]上述[7]所述的转化体，其中，上述转化体为植物。
[9]上述[7]所述的转化体，其中，上述转化体为禾本科植物。
[10]上述[1]或[3]所述的蛋白的生产方法，该方法包括：使上述多核苷酸在上述[7]～[9]中任一项所述的转化体中表达，并采集所产生的蛋白。
[11]通过将上述[2]、[4]和[5]中任一项所述的多核苷酸导入植物中，对植物赋予柳杉花粉的免疫原性的方法。
[12]具有柳杉花粉的免疫原性的植物体的制作方法，该方法包括：制作包含上述[2]、[4]和[5]中任一项所述的多核苷酸的载体；将上述载体导入植物器官、植物组织或植物细胞中得到转化体；以及由上述转化体生育植物体。
[13]柳杉花粉症的治疗或预防药，其中包含选自上述[1]或[3]所述的蛋白和上述[7]～[9]中任一项所述的转化体的一种或两种以上作为有效成分。
[14]柳杉花粉症的治疗或预防方法，该方法是对人给予选自上述[1]或[3]所述的蛋白和上述[7]～[9]中任一项所述的转化体的一种或两种以上。
发明效果
通过本发明提供的具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白，尽管其在几乎所有的柳杉花粉症患者中都发挥柳杉花粉的免疫原性，但与花粉特异性IgE抗体的结合性低，在生物体内不引起过敏性反应的可能性小。由于几乎所有的柳杉花粉症患者对Cryj1和Cryj2都显示出免疫原性，所以可以说本发明的蛋白作为网罗柳杉花粉症患者的柳杉花粉症治 疗或预防药是有效的。因此，具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白以其自身或包含其的植物体等形式对柳杉花粉症的治疗有效。
另外，由于通过本发明提供具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的遗传信息，所以根据该遗传信息还可以进行具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的大量生产、包含该蛋白的转化体的大量生产、该转化体的后代(水稻(イネ)等)的大量生产。
附图说明
图1是显示经口给予Tg水稻种子的实验组和经口给予Non-Tg水稻种子的实验组的T细胞的增殖活性的图。
图2是显示经口给予Tg水稻种子的实验组和经口给予Non-Tg水稻种子的实验组的IL-4的产生量的图。
图3是显示经口给予Tg水稻种子的实验组和经口给予Non-Tg水稻种子的实验组的IL-5的产生量的图。
图4是显示经口给予Tg水稻种子的实验组和经口给予Non-Tg水稻种子的实验组的IL-6的产生量的图。
图5是显示经口给予Tg水稻种子的实验组和经口给予Non-Tg水稻种子的实验组的IL-10的产生量的图。
图6是显示经口给予Tg水稻种子的实验组和经口给予Non-Tg水稻种子的实验组的IL-13的产生量的图。
图7是显示经口给予Tg水稻种子的实验组和经口给予Non-Tg水稻种子的实验组的IFN-γ的产生量的图。
图8是显示经口给予Tg水稻种子的实验组和经口给予Non-Tg水稻种子的实验组的IgE抗体的产生量的图。
图9是显示经口给予Tg水稻种子的实验组和经口给予Non-Tg水稻种子的实验组的IgG抗体的产生量的图。
图10是显示经口给予Tg水稻种子的实验组和经口给予Non-Tg水稻种子的实验组的组胺的产生量的图。
具体实施方式
本发明的蛋白是具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白。柳杉花粉的免疫原性是指被柳杉花粉抗原特异性T细胞识别为抗原，是指柳杉花粉变应原所具备的性质。柳杉花粉变应原包括Cryj1和Cryj2。本发明的蛋白是具有这样的柳杉花粉的免疫原性的蛋白，其活性优选为与Cryj1和Cryj2中的任一个或两者所发挥的免疫原性同等。
作为具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白，例如有(A)包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白。SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列是通过柳杉花粉变应原Cryj2的氨基酸序列的改组来设计的。即，从Cryj2的氨基酸序列的N末端侧数起，第93-388位的部分、第59-92位的部分以及第1-58位的部分依次连接而成的序列。(A)蛋白具有柳杉花粉的免疫原性，优选与Cryj2具有同等的免疫原性。
作为具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白，例如还有(D)包含选自SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列的一个或两个以上的蛋白。SEQ ID NO：2～4各自所示的氨基酸序列是将Cryj1形成三个片段而设计的。即，SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相当于Cryj1的氨基酸序列的从N末端侧数起第1-144位的部分。SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列相当于Cryj1的氨基酸序列的从N末端侧数起第126-257位的部分。SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相当于Cryj1的氨基酸序列的从N末端侧数起第231-353位的部分。(D)蛋白具有柳杉花粉的免疫原性，优选与Cryj1具有同等的免疫原性。
(D)蛋白只要具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中的任一个即可，但也可以组合具有这些序列中的两个以上，优选具有这些序列的全部。对具有两个以上的氨基酸序列时的连接顺序没有特别限定，当具有全部的三个序列时，优选以SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列 的顺序连接。
作为具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白，进一步可以列举如：(G)包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：2～4中的任一个所示的氨基酸序列的蛋白。(G)蛋白具有柳杉花粉的免疫原性，优选与Cryj1和Cryj2具有同等的免疫原性。在(G)蛋白中，除SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列以外，还可以包含选自SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的一个或两个以上的氨基酸序列，优选包含SEQ ID NO：2～4所示的全部氨基酸序列。
在(G)蛋白中，对SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：2～4中任一个所示的氨基酸序列的各自的连接顺序没有限制，但优选从N末端侧起以SEQ ID NO：2～4中任一个所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的顺序连接。另外，在(G)蛋白中，当包含SEQ ID NO：2～4所示的全部氨基酸序列时，对这些序列的连接顺序也没有特别限定，但优选以SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的顺序连接。
对具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的起源和得到该蛋白的方法均没有特别限定。即，作为具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白，例如有天然的蛋白、利用基因工程学方法由重组多核苷酸等表达的蛋白、以及通过化学合成得到的蛋白。而且，例如(A)蛋白可以通过改组柳杉花粉变应原蛋白Cryj2而得到。另外，例如(D)蛋白可以通过分别将柳杉花粉变应原蛋白Cryj1形成三个片段(F1(片段1：1aa-144aa)、F2(126aa-257aa)、F3(231aa-353aa))而得到。而且，例如(I)蛋白可以将通过改组柳杉花粉变应原蛋白Cryj2而得到的蛋白和将柳杉花粉变应原蛋白Cryj1形成三个片段而得到的蛋白连接而得到。
具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白只要具有柳杉花粉的免疫原性即可，不仅可以是象上述(A)蛋白、(D)蛋白和(G)蛋白那样具有SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列本身和SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：4中任一个所示的氨基酸序列本身的蛋白，还可以是与其同源的蛋白、即包含对各自的氨基酸序列加入了修饰而得到的氨基酸序列的蛋白。
作为包含对(A)蛋白的氨基酸序列加入了修饰而得到的氨基酸序列的蛋白，例示下述的(B)和(C)的蛋白。
(B)蛋白，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性；
(C)蛋白，其包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性。
作为包含对(D)蛋白加入了修饰而得到的氨基酸序列的蛋白，例如有(E)和(F)的蛋白。
(E)蛋白，其包含SEQ ID NO：2～4中的任一个所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性；
(F)蛋白，其包含与SEQ ID NO：2～4中的任一个所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性。
在(E)蛋白中，可以包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中的任一个、或者两种以上被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，除此以外，还可以具有不是取代等的对象的SEQ ID NO：2～4中的任一个所示的氨基酸序列。在(F)蛋白中，也可以包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中的任一个、或者两种以上具有90％以上同源性的氨基酸序列，除此以外，还可以具有不是取代等的对象的SEQ ID NO：2～4中的任一个所示的氨基酸序列。
作为包含(G)蛋白的氨基酸序列中加入了修饰而得到的氨基酸序 列的蛋白，例示(H)～(O)的蛋白。
(H)蛋白，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和在SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性；
(I)蛋白，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和与SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性；
(J)蛋白，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列和SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性；
(K)蛋白，其包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列和SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性；
(L)蛋白，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列和SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性；
(M)蛋白，其包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性；
(N)蛋白，其包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列和SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性；
(O)蛋白，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列和与SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性。
在上述各蛋白中，被取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸残基的个数如上所述为一个或多个。通常为1～15个、例如为1～10个，优选为1～7个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个。通常，向氨基酸序列中导入一个或多个突变以制作与原始氨基酸具有相同性质的蛋白的方法为本领域技术人员所周知。通常，在蛋白中将氨基酸取代成具有相同性质的氨基酸(碱性氨基酸之间的取代、酸性氨基酸之间的取代、极性氨基酸之间的取代、疏水性氨基酸之间的取代、芳族氨基酸之间的取代等)时，若比较取代前后的蛋白，则往往具有相同的性质。
在上述各蛋白中，如上所述，同源性为90％以上。优选为93％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、更进一步优选为98％以上、其中优选为99％以上。关于氨基酸序列的同源性，采用BLAST、FASTA等的算法，通过设定适当的检索条件即可确定。
本发明的多核苷酸是编码具有柳杉花粉变应原蛋白免疫原性的蛋白的多核苷酸。
作为多核苷酸，例如有DNA、RNA、PNA。其中优选DNA。另外，对多核苷酸的起源、制备方法没有特别限定，可以是来自天然的多核苷酸，也可以是重组多核苷酸、通过化学合成得到的多核苷酸。
作为编码具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的多核苷酸，例示编码上述(A)～(C)的任一种蛋白的多核苷酸。具体而言，例示下述的(a)、(b)和(c)。
(a)多核苷酸，其编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
(b)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列， 并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白；
(c)多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白。
另外，作为编码具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的多核苷酸，例示编码上述(D)～(F)中的任一种蛋白的多核苷酸。具体而言，例示下述的(d)、(e)和(f)。
(d)多核苷酸，其编码SEQ ID NO：2～4中的任一个所示的氨基酸序列；
(e)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：2～4中的任一个所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白；
(f)多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO：2～4中的任一个所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白。
并且，编码具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的多核苷酸也例示下述的(g)～(r)。
(g)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：2～4中的任一个所示的氨基酸序列的蛋白；
(h)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白；
(i)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和与SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白；
(j)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中有 一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列和选自SEQ ID NO：2～4的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白；
(k)多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列和SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白；
(l)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列和SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白；
(m)多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列、并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白；
(n)多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列和SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白；
(o)多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列和与SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列，并且具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白。
另一方面，关于编码具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的多核苷酸，从核苷酸序列的角度考虑，例示下述的(p)～(r)。
(p)多核苷酸，其具有SEQ ID NO：5记载的核苷酸序列；
(q)多核苷酸，其具有SEQ ID NO：6～8中的任一个记载的核苷酸序列；
(r)多核苷酸，其具有SEQ ID NO：5记载的核苷酸序列和SEQ ID NO：6～8中的任一个记载的核苷酸序列。
SEQ ID NO：5记载的核苷酸序列是对应于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。另外，SEQ ID NO：6～8记载的核苷酸序列是分别对应于SEQ ID NO：2～4所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
编码具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的多核苷酸包含表达即使不包含SEQ ID NO：5记载的核苷酸序列本身和SEQ ID NO：6～8记载的核苷酸序列本身但具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的全部多核苷酸。作为编码具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的多核苷酸，例如有以下的(s)～(z)。
(s)多核苷酸，其在严格条件下与由与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的多核苷酸杂交；
(t)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；
(u)多核苷酸，其包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列中有一个或多个核苷酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的核苷酸序列；
(v)多核苷酸，其在严格条件下与由与SEQ ID NO：6～8中的任一个所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的多核苷酸杂交；
(w)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：6～8中的任一个所示的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；
(x)多核苷酸，其包含SEQ ID NO：6～8中的任一个所示的核苷酸序列中有一个或多个核苷酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的核苷酸序列；
(y)多核苷酸，其具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列中包含上述(s)、(t)和(u)中的任一个突变的核苷酸序列和SEQ ID NO：6～8中的 任一个所示的核苷酸序列；
(z)多核苷酸，其具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：6～8中的任一个所示的核苷酸序列中包含上述(v)、(w)和(x)中的任一个突变的核苷酸序列。
在上述多核苷酸中，严格条件是指，形成特异性的杂化物、而不形成非特异性的杂化物的条件。作为严格条件，例示在杂交后的清洗中，(例1)在42℃、用5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)、0.1％SDS清洗的条件、(例2)在50℃、用5×SSC、0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)清洗的条件、(例3)在65℃、用5×SSC、0.1％SDS清洗的条件，其中优选为(例2)或(例3)，更优选(例3)。
在上述多核苷酸中，被取代、缺失、插入和/或添加的碱基的个数为一个或多个。通常为1～15个，例如为1～10个、1～7个，优选为1～5个、更优选为1～3个。另外，在上述多核苷酸中，同源性为90％以上，优选为93％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、更进一步优选为98％以上、其中优选为99％以上。关于核苷酸序列的同源性，采用BLAST、FASTA等的算法，通过设定适当的检索条件即可确定。
对获得多核苷酸的方法没有特别限定，可以根据具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的一部分氨基酸序列或本发明的多核苷酸的一部分核苷酸序列，利用公知技术从生物等中分离。作为公知技术，例示克隆、基因重组、PCR、杂交、位点特异性诱变法、突变剂处理、限制酶处理等。还可以人工制作本发明的多核苷酸的核苷酸序列。而且，还可以利用后述的转化体来产生多核苷酸。
具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白能够在各种生物中表达。对在生物中表达蛋白的方法没有特别限定，但可以利用控制多肽表达的因子。作为控制多肽表达的因子，例示启动子、终止子、信号序列。
作为启动子，只要是能够在宿主中表达的启动子即可。其中优选能够在植物(例如禾本科植物)中表达的启动子，其中，更优选能够在 种子的贮藏组织中表达的启动子(种子特异性启动子)，进一步优选在稻米(水稻种子)中表达的启动子，更进一步优选在稻米(水稻种子)中特异性表达的启动子。作为种子特异性启动子，例示谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白等种子贮藏蛋白基因的启动子。作为谷蛋白的启动子，例示GluB1启动子(例如具有SEQ ID NO：11记载的核苷酸序列)、GluB4启动子(例如具有SEQ ID NO：12记载的核苷酸序列)。作为谷醇溶蛋白的启动子，例示16kDa谷醇溶蛋白启动子(例如具有SEQ ID NO：13记载的核苷酸序列)、10kDa谷醇溶蛋白启动子(例如具有SEQ ID NO：14记载的核苷酸序列)。不过，本发明中能够使用的启动子并不限于上述种子特异性启动子，还可以是除此以外的启动子、例如来自植物病毒的启动子等。
作为终止子，只要是能够在宿主中表达的终止子即可。其中优选能够在植物(例如禾本科植物等)中表达的终止子，其中，更优选能够在种子的贮藏组织中表达的终止子，进一步优选在稻米(水稻(Oryza sativa))种子)中表达的终止子，更进一步优选在稻米(水稻种子)中特异性表达的终止子。作为终止子，例如在水稻中表达多肽时，可以使用作为植物贮藏蛋白的谷蛋白的0.6kb GluB1终止子(例如具有SEQ ID NO：18记载的核苷酸序列)、GluB4终止子(例如具有SEQ ID NO：19记载的核苷酸序列)、10kDa谷醇溶蛋白终止子(例如具有SEQ ID NO：21记载的核苷酸序列)、16kDa谷醇溶蛋白终止子(例如具有SEQ ID NO：20记载的核苷酸序列)、球蛋白终止子等。此外，可以选择使用以胭脂氨酸合成酶的终止子、章鱼氨酸合成酶的终止子为代表注册在DNA数据库中的各种植物基因的终止子。
作为编码信号序列的多核苷酸，只要是在宿主的细胞内表达的多核苷酸即可，没有特别限定，可以是在想要表达的多核苷酸的5’末端和3’末端的任一端添加信号序列的多核苷酸。其中，可以是能够在植物(例如禾本科植物)中表达的信号序列，其中优选能够在种子的贮藏组织中表达的信号序列，更优选在稻米(水稻种子)中表达的信号序列，更进一步优选在稻米(水稻种子)中特异性表达的信号序列。作为这样的信号序列，可以使用日本特开2004-321079号公报中例示的信号序列。其中，优选贮藏蛋白信号或内质网滞留信号(例如Lys-Asp-Glu-Leu)。贮藏蛋白信号序列具有使本发明的蛋白移行到内质网中的作用。另外，内质网滞留信号序列在种子的贮藏部位具有提高本发明蛋白的累积量的功能。
对表达具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的方法没有特别限定，优选使用包含编码具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的多核苷酸的载体的方法。关于载体，适当考虑想要表达的植物的种类，可以从公知的各种载体中选择，只要是稳定保持本基因构成的载体即可，没有特别限定。可以按照常规方法向载体中插入目标多核苷酸，例如可以通过使用限制酶位点的连接酶反应来进行。载体除了包含目标多核苷酸以外，根据需要，还可以包含启动子、终止子、增强子、剪接信号、polyA添加信号、核糖体结合位点、复制起始点等的表达调节因子；以及选择标志物基因。启动子和终止子的插入位点通常分别为多核苷酸的5’末端侧和3’末端侧。
作为选择标志物基因，例如有：赋予对抗生素潮霉素的耐性的潮霉素磷酸转移酶基因、赋予对卡那霉素或庆大霉素的耐性的新霉素磷酸转移酶基因、赋予对作为除草剂的膦丝菌素的耐性的乙酰转移酶基因、赋予对作为除草剂的嘧草醚的耐性的突变型乙酰乳酸合成酶基因(mALS)等。通过使用导入有选择标志物基因的载体，导入有目标多核苷酸的样品的选择变得容易。
向载体中插入编码具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的多核苷酸时，可以一同插入编码其他蛋白的多核苷酸。由此，使载体转化时，可以以包含目标蛋白的融合蛋白的形式使之表达，根据其他蛋白的选择如何，可以调节表达位点、表达量等。作为其他蛋白，当转化的宿主为水稻时，优选在水稻的种子中稳定地高度表达的蛋白，更优选谷蛋白。对一同插入多核苷酸和编码其他蛋白的多核苷酸的方法没有特 别限定，例示下述方法：事先在其他蛋白的可变区添加可以插入任意的DNA序列的位点(例如当其他蛋白为谷蛋白时，有Cfr9I位点等)，再利用该位点进行插入。
作为表达具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的方法，优选利用导入有载体的转化体，所述载体包含编码具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的多核苷酸。由此，可以高效率地得到表达具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的基因重组体(例如基因重组植物体、优选基因重组水稻)。还关系到高效率地复制并大量生产具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白。而且，载体的保存也变得容易。
对转化体的制作方法没有特别限定，例示将上述载体根据需要与表达调节因子一同导入宿主细胞中以使之转化的方法。对向宿主组织或细胞中导入载体的方法没有特别限定。例如，通过聚乙二醇向原生质体中导入载体的方法、通过电脉冲向原生质体中导入载体的方法、利用基因枪法向细胞中直接导入载体的方法、DEAE葡聚糖法、磷酸钙法、以及经由土壤杆菌(agrobacterium)导入载体的方法等若干技术已经确立，在该技术领域中广泛应用，在本发明中也可以使用上述任一种方法。
对导入载体的宿主没有特别限定，根据需要可以适当选择。
列举一例：作为为了制作具有柳杉花粉的免疫原性的植物体而制作转化体时的宿主，包括可以再生成植物体的所有植物。作为植物，例如可以列举：叶、根、茎、花、种子中的胚盘等植物器官；构成上述各植物器官的植物细胞；维管束等植物组织；愈伤组织、悬浮培养细胞等的植物培养细胞，但并不限于这些。另外，对植物体的植物种也没有特别限定，但更优选食用的植物，进一步优选禾本科植物的细胞。作为禾本科植物，例示水稻(Oryza sativa)。
作为其他例子，当为了载体的保存、复制等而制作转化体时，宿主未必是植物，例如可以是大肠杆菌、酵母、动物细胞等。
使用导入有选择标志物基因的载体进行转化时，对于导入了该载 体的宿主细胞，通过根据与该载体一同导入的标志物基因的种类置床于含有适当的选择用试剂的公知的选择用培养基中进行培养，可以使转化体的选择变得容易。另外，即使未导入选择标志物基因，除导入有多核苷酸的载体之外，准备导入有选择标志物基因的质粒载体，通过将这些载体导入宿主细胞中，可以进行同样的选择。
制作包含编码具有免疫原性的蛋白的多核苷酸的载体，将该载体导入作为宿主细胞的植物器官、植物组织或植物细胞中得到转化体，再由该转化体生育(再分化)植物体，从而可以制作能够表达具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的植物体。关于植物体的生育(再分化)，可以根据植物细胞的种类按照公知的方法进行。
由转化体得到第1代的植物体时，生育该植物体，再使其进行有性生殖或无性生殖，可以依次得到能够表达本发明的蛋白的、作为后代的植物体。另外，还可以由该转化体、其后代以及它们的克隆中的任一个得到繁殖材料(例如种子、果实、剪下的穗、块茎、块根、株、愈伤组织、原生质体等)，根据这些繁殖材料进一步制作能够表达具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的植物体，并实现量产。
具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白、包含编码该蛋白的多核苷酸的转化体、以及导入有具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的植物体均可用作以包括人在内的哺乳类的柳杉花粉症患者或所谓的花粉症预备军为对象的柳杉花粉症的治疗或预防药的有效成分。对柳杉花粉症的治疗或预防药的每日用量、服用方法和剂型没有特别限定，根据对象的健康状态、性别、体格等诸条件可以适当确定。本发明的柳杉花粉症的治疗或预防药可以用作药品、准药品、食品、动物(实验动物、宠物等)用饲料。另外，具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白、包含编码该蛋白的多核苷酸的转化体、以及导入了具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的植物体，可以在针对包括人在内的哺乳类的花粉症患者的所谓肽免疫疗法中适当使用。即，通过对包括人在内的哺乳类给予具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白、包含编码该蛋白的多核苷酸的转化体、以及导入 了具有柳杉花粉的免疫原性的蛋白的植物体，可以治疗或预防花粉症。
实施例
以下，列举实施例以更具体地说明本发明，但本发明并不限于所述的实施例。需要说明的是，在以下的实施例中，关于分子生物学方法的详细的实验操作，除特别阐述的情况外，均按照Molecular Cloning(Sambrook等人，1989)或试剂制造业者的操作说明书进行。另外，关于以小鼠或来自小鼠的试样为对象的免疫学研究方法的详细实验操作，除特别阐述的情况外，均按照“细胞工学分册マウス解剖イラストレイテツド(秀润社)、生物化学实验法50肠管细胞功能实验法(学会出版中心)”或试剂制造业者的操作说明书进行。
[实施例1]
I.质粒pCSPmALS Cryj1Cryj2的制作
为了制作目标双运载体(binary vector)，制作在愈伤组织特异性启动子(CSP、クミアイ化学株式会社)上连接有突变型乙酰乳酸合成酶基因(mALS、クミアイ化学株式会社)、下游连接有10kDa谷醇溶蛋白终止子的选择标志物基因盒、以及在转化DNA(T-DNA)区包含attR4-attR3的来自pPZP200的目标双运载体(pCSPmALS 43GW)。
为了在pCSPmALS 43GW中插入基因盒，制作专用的入门克隆(entry clone)。即，向位于pBluescript KS+质粒(SEQ ID NO：10)的多克隆位点两端的BssHII中依次插入由以下(1)～(3)这3种组合的附着区和原始多克隆位点(SEQ ID NO：9)构成的DNA片段，分别命名为pKS4-1MCS II、pKS221MCS II、pKS2-3MCS II。
附着区(1)attL4-AscI-HindIII-XbaI-BamHI-EcoRV-SmaI-KpnI-SacI-EcoRI-MluI-attR1
附着区(2)attL1-AscI-HindIII-XbaI-BamHI-EcoRV-SmaI-KpnI-SacI-EcoRI-MluI-attL2
附着区(3)attR2-AscI-HindIII-XbaI-BamHI-EcoRV-SmaI-KpnI-SacI-EcoRI-MluI-attL3)
需要说明的是，上述attL1、attL2、attL3、attL4、attR1、attR2使用Invitrogen社的制品。
将3种胚乳特异性启动子(10kDa谷醇溶蛋白启动子(SEQ ID NO：14)、GluB4启动子(SEQ ID NO：12)、16kDa谷醇溶蛋白启动子(SEQ ID NO：13))、内部添加有Cfr9I位点以可以预先在可变区中插入任意的DNA序列的种子贮藏蛋白谷蛋白(GluA2(SEQ ID NO：15)、GluB1(SEQ ID NO：16)、GluC(SEQ ID NO：17))的编码区和终止子(10kDa谷醇溶蛋白终止子(SEQ ID NO：21)、GluB4终止子(SEQ ID NO：19)、16kDa谷醇溶蛋白终止子(SEQ ID NO：20))分别组合构成的基因盒插入pKS4-1MCS II、pKS221MCS II、pKS2-3MCS II中。即，得到插入有由10kDa谷醇溶蛋白启动子：GluB 1编码区：10kDa谷醇溶蛋白终止子构成的基因盒的质粒pKS4-1。另外，得到插入有由GluB4启动子：GluA2编码区：GluB4终止子构成的基因盒的质粒pKS221。还得到插入有由16kDa谷醇溶蛋白启动子：GluC编码区：16kDa谷醇溶蛋白终止子构成的基因盒的质粒pKS2-3。
在pKS221的GluA2编码区中的Cfr9I位点插入由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列(对应于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列)构成的多核苷酸。将结果是包含在pKS221中的由GluB4启动子：GluA2编码区(包含由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列构成的多核苷酸)：GluB4终止子构成的基因盒命名为Cryj1 F1表达型基因盒。
在pKS4-1的GluB1编码区中的Cfr9I位点插入由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列(对应于SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列)构成的多核苷酸。将结果是包含在pKS4-1中的由10kDa谷醇溶蛋白启动子：GluB1编码区(包含由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列构成的多核苷酸)：10kDa谷醇溶蛋白终止子构成的基因盒命名为Cryj1 F2表达型基因盒。
在pKS2-3的GluC编码区中的Cfr9I位点插入由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列(对应于SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列)构成的多核苷酸。将结果是包含在pKS2-3中的由16kDa谷醇溶蛋白启动子：GluC编码区：16kDa谷醇溶蛋白终止子构成的基因盒命名为Cryj 1F3表达型基因盒。汇总Cryj1 F1表达型基因盒、Cryj1 F2表达型基因盒和Cryj1 F3表达型基因盒，命名为Cryj1全长表达型基因盒组。
另一方面，在编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸(SEQ ID NO：5)的C末端添加编码内质网滞留信号Lys-Asp-Glu-Leu的多核苷酸，得到多核苷酸。在该多核苷酸的5’侧连接GluB1启动子(SEQ ID NO：11)、在3’侧连接KDEL序列和GluB1终止子(SEQ ID NO：18)，将所得的基因盒命名为Cryj2全长表达基因盒。之后，将Cryj2全长表达型基因盒插入具有Cryj1 F3表达型基因盒的pKS2-3的MluI位点。
按照Gateway(注册商标)系统(Invitrogen社)的操作说明书进行LR反应。首先，将包含Cryj1 F2表达型基因盒的pKS4-1、包含Cryj1 F1表达型基因盒的pKS221、包含Cryj1 F3表达型基因盒和Cryj2全长表达型基因盒的pKS2-3这3种入门克隆的浓度调整为10ng/μL。对于这些入门克隆，使用Invitrogen社的LR clonase plus enzyme Mix II，在25℃下进行16小时的LR反应。反应液组成如下：各10ng的入门克隆、100ng的目标双运载体(在SEQ ID NO：22记载的核苷酸序列中，插入CSP：mALS：10kDaTer基因盒(クミアイ化学株式会社)以代替碱基编号8794～10327的部分而得到的载体)、2μL的LR clonase plus enzyme mix II，用TE缓冲液调整总液量使达到10μL。反应结束后，加入2μg的蛋白酶K，在37℃下静置10分钟。
LR反应结束后，将所得的表达克隆转化至大肠杆菌DH5α(TOYOBO、competent high)中。从得到的大肠杆菌菌落群中选择目标克隆、即导入有上述4种基因盒的双运载体。LR反应的效率极高，在通过菌落PCR进行的一次筛选中，显示出大部分菌落为阳性的可能 性。对于候选克隆，使用ABI DNA序列分析仪Genetic Analyzer 3130，进行核苷酸序列的最终确认，将其作为pCSPmALS Cryj1Cryj2。
II.向土壤杆菌中导入pCSPmALS Cryj1Cryj2
将根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)EHA105株接种在10mL的YEB液体培养基(5g/L的牛肉浸膏、1g/L的酵母提取物、5g/L的蛋白胨、5g/L的蔗糖、2mM的MgSO4、22℃下的pH7.2(以下，没有特别显示时，记作22℃下的pH。))中，在28℃下培养，直至OD630达到0.4～0.6的范围。将培养液以6900×g的离心力在4℃下离心10分钟以进行集菌，之后将菌体悬浮在20mL的10mM HEPES(pH8.0)中，再次以6900×g的离心力在4℃下离心10分钟以进行集菌。然后，将集菌的菌体悬浮在200μL的YEB液体培养基中，将其作为质粒导入用菌液。
将50μL质粒导入用菌液和3μL质粒pCSPmALS Cryj1Cryj2在0.5mL的管内混合，利用电穿孔法(Gene Pulser II系统[BIORAD社])向其中导入质粒，然后加入200μL YEB液体培养基，在25℃下振荡1小时进行培养。将该菌体接种在添加有100mg/L的壮观霉素的YEB琼脂培养基(琼脂为1.5w/v％、其他组成同上。)中，在28℃下培养两天，得到菌落。再将该菌落移植到YEB液体培养基中进一步培养，之后利用碱性法从该菌落中的菌中提取质粒，确认质粒pCSPmALS Cryj1Cryj2被导入到根瘤土壤杆菌EHA105株中。将该菌命名为土壤杆菌EHA105(pCSPmALS Cryj1Cryj2)。
III.感染材料的制备
使用水稻品种“コシヒカリ系统a123”作为基因导入的对象，按照细胞工学分册植物细胞工学系列4模型植物的实验规程(第93-98页)的方法对其完熟种子进行杀菌。将杀菌后的完熟种子种植在N6Cl2培养基(N6无机盐类和维生素类、30g/L的蔗糖、2.8g/L的脯氨酸、0.3g/L的酪蛋白氨基酸、2mg/L的2，4-D、4g/L的脱乙酰吉兰糖胶(Gelrite)、pH＝5.8)中，用医用胶带(surgical tape)密封，在28℃的亮处进行培养以使其发芽，得到发芽种子。在下述IV中，将该发芽种子 作为土壤杆菌EHA105(pCSPmALS Cryj1Cryj2)的感染材料。
IV.利用EHA105(pCSPmALS Cryj1Cryj2)进行的水稻的转化和转化水稻的制作
将用YEB琼脂培养基(5g/L的牛肉浸膏、1g/L的酵母提取物、5g/L的蛋白胨、5g/L的蔗糖、2mM的MgSO4、15g/L的琼脂)培养的土壤杆菌EHA105(pCSPmALS Cryj1Cryj2)在YEB培养基中、在25℃、180rpm的转速下培养一夜。之后，以3000rpm的转速离心20分钟以进行集菌，将菌体悬浮在包含10mg/L的乙酰丁香酮的N6液体培养基(N6无机盐类和维生素类(Chu C.C.，1978，Proc.Symp.Plant Tissue Culture，Science Press Peking，第43-50页)，30g/L的蔗糖、2mg/L的2，4-D、pH＝5.8)中使OD630＝0.15，作为感染用土壤杆菌悬浮液。
将50mL上述III中制备的发芽种子装入管中，向其中注入感染用土壤杆菌悬浮液，浸泡发芽种子。浸泡1.5分钟后，舍弃土壤杆菌悬浮液，将发芽种子放在已灭菌的滤纸上，除去多余的水分。之后，将该发芽种子种植在共存培养培养基N6Cl2培养基(N6无机盐类和维生素类、30g/L的蔗糖、2.8g/L的脯氨酸、0.3g/L的酪蛋白氨基酸、2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、4g/L的脱乙酰吉兰糖胶、pH＝5.2)中，用医用胶带密封，在28℃的暗处培养3天。然后，将进行了共存培养的发芽种子用N6Cl2TCH25培养基(N6无机盐类和维生素类、30g/L的蔗糖、2.8g/L的脯氨酸、0.3g/L的酪蛋白氨基酸、2mg/L的2，4-D、4400mg/L的羧苄青霉素、1μM的嘧草醚、4g/L的脱乙酰吉兰糖胶)培养1周，之后从胚盘组织中切出已发出的芽。
然后，将该芽用N6Cl4TCH25培养基(N6无机盐类和维生素类、30g/L的蔗糖、2.8g/L的脯氨酸、0.3g/L的酪蛋白氨基酸、4mg/L的2，4-D、400mg/L的羧苄青霉素、1μM的嘧草醚、4g/L的脱乙酰吉兰糖胶)培养1周。再用MSRC培养基(MS无机盐类和维生素类(Murashige，T.和Skoog，F.，1962 Physiol.Plant.，15，473)、30g/L的蔗糖、30g/L的山梨醇、2g/L的酪蛋白氨基酸、1μg/mL的萘乙酸 (NAA)、2μg/mL的苄基氨基嘌呤(BAP)、400mg/L的羧苄青霉素、4g/L的脱乙酰吉兰糖胶)培养。
如此操作，在感染种子和土壤杆菌EHA105(pCSPmALS Cryj1Cryj2)的共存培养开始后一个月～两个月间，由感染种子再分化出芽或幼植物体。将再分化的芽或幼植物体移植到发根培养基中使其生育，得到高20cm左右的幼苗。从该幼苗中提取染色体DNA，通过DNA杂交确认幼苗中Cryj1Cryj2基因的存在。
V.重组水稻的大量生产
将上述IV中得到的、作为转化体的水稻(Tg水稻)的发芽种子播种在氨基甲酸酯中，之后在特定网室内的育苗室(人工太阳光室)中育苗，得到苗。即，将苗以49根/组(panel)定植在整个床区，之后以约12,000根/栋进行植栽。
在特定网室内的栽培栋中，每一栋设置5台水耕床(M式水耕研究所制、H：73cm×W：120cm×D：2,900cm)。各水耕床的营养液配管连成一根，水耕营养液通过循环泵在水耕床间循环，所以各水耕床内的营养液组成相同。水耕床内有各种传感器(pH计、导电率(EC)计、水温计)，其数据每隔10分钟自动保存在环境控制个人计算机(PC)中。另外，通过营养液控制器控制施肥和pH添加剂的添加。利用上述传感器、环境控制个人计算机和溶液控制器，可以实现水耕床内的各种条件(pH、EC和水温)的自动控制。
关于肥料，根据水耕营养液中的硝酸性氮和氨性氮的浓度测定结果，使用以下的市售水耕专用肥料(M式水耕研究所制)(M1：硝酸性氮7％、氨性氮3％、水溶性磷酸8％、水溶性钾23％、水溶性镁4％、水溶性锰0.1％、水溶性硼0.1％；M2：硝酸性氮11％；M5：氨性氮6％、水溶性钾9％、水溶性锰1％、水溶性硼1％)。水耕营养液的液温设定在29℃。
利用补光灯和100％遮光帘调整日长(长日环境：亮12小时、暗12小时；短日环境：亮11小时、暗13小时)。内温通过利用环境控 制系统进行天窗侧窗的开闭来自动控制。其中，关于开花期，为了防止花粉飞散，在空调运行后不再开窗。本栽培法中，从播种到收获栽培水稻150天。
其结果，关于由Tg水稻的发芽种子发芽的个体，在所有个体中均确认到Cryj1基因和Cryj2基因的存在。并且，分析由该个体收获的水稻种子(米)时，确认了含有0.1g/米g的总蛋白量、以及包含形成了三个片段的柳杉花粉变态反应抗原Cryj1(SEQ ID NO：2～4各自所示的氨基酸序列)和改组的Cryj2(SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列)。VI.通过使小鼠经口摄取水稻种子来进行免疫耐受性的诱导
从日本チヤ一ルス·リバ一株式会社购入5周龄的雄性BALB/c小鼠，使其开始经口摄取上述V中由Tg水稻的发芽种子收获的水稻种子(以下称作Tg水稻种子(Tg-稻米、Tg-种子)。)。首先，使用フリツチユ·ジヤパン株式会社制P-14高速旋转粉碎机(rotor speed mill)，以约10,000rpm的转速将未进行转化处理的水稻种子(以下称作Non-Tg水稻种子(Non-Tg稻米、Non-Tg种子)。)和Tg水稻种子分别(均为完熟种子糙米(玄米))粉碎成微粉状，得到各自的水稻种子粉末。接下来，将小鼠分成两组，将各水稻种子粉末装入喂料瓶中，让各组的小鼠自由摄取20天。经口给予水稻种子粉末的期间结束后，算出各组的水稻种子粉末的总摄取量时，推测每只小鼠摄取约6克。
VII.利用柳杉花粉变应原进行的攻击
对于经口摄取上述的Non-Tg水稻粉末或Tg水稻种子粉末的所有小鼠，在经口摄取水稻种子粉末的最后一天的次日，每只小鼠腹腔给予0.1mg株式会社LSL制柳杉花粉提取蛋白(产品编号LG-5280)、5mg株式会社LSL制明矾(氢氧化铝凝胶、产品编号LG-6000)和0.1μgR&D Systems Inc.制小鼠IL-4(产品编号404-ML)的混合液。一周后，每只小鼠腹腔给予0.1mg柳杉花粉提取蛋白和5mg明矾的混合液。
VIII.T细胞增殖活性和细胞因子产生量的测定
自上述VII中所述的第2次腹腔给予柳杉花粉提取蛋白和明矾的 混合液起两周后，使用Miltenyi Biotec K.K.制CD4(L3T4)MicroBeads(产品编号130-049-201)和Miltenyi Biotec K.K.制autoMACSTM自动磁细胞分离装置(产品编号130-020-101)，从小鼠的脾脏分离CD4+T细胞。将1×105个该CD4+T细胞、5×105个由幼稚BALB/c雄性小鼠的脾脏制备的抗原提呈细胞和作为抗原的20μg/mL的柳杉花粉提取蛋白在细胞培养用96孔板中混合，之后在37℃下培养5天。
细胞培养结束后，利用使用プロメガ制CellTiter 96(R)AQueous单溶液细胞增殖检测试剂(产品编号G3580)的比色定量法测定活细胞数。图1中以柳杉花粉变应原特异性刺激指数(S.I.)的形式显示经口给予Tg水稻种子粉末的实验组和经口给予Non-Tg水稻种子粉末的实验组的CD4+T细胞的增殖活性。需要说明的是，以柳杉花粉变应原特异性刺激指数(S.I.)的形式表记添加作为抗原的柳杉花粉提取蛋白时的增殖细胞数相对于在未添加柳杉花粉提取蛋白的情况下进行培养时的增殖细胞数的比例(图1)。
其结果，由图1可知：与经口给予Non-Tg水稻种子粉末的实验组相比，在经口给予Tg水稻种子粉末的实验组中，由柳杉花粉变应原的刺激引起的T细胞的增殖活性被显著抑制(P＜0.01)。
另外，在培养结束时，回收培养T细胞的一部分上清组分，使用R&D Systems Inc.制Quantikine ELISA试剂盒，测定各种细胞因子的产生量。经口给予Tg水稻种子粉末的实验组和经口给予Non-Tg水稻种子粉末的实验组的IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和IFNγ的产生量分别见图2～图7。
其结果，与经口给予Non-Tg水稻种子粉末的实验组相比，在经口给予Tg水稻种子粉末的实验组中，诱导柳杉花粉变态反应等的Th2型免疫应答的各细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)的产生被显著抑制。并且，其他各细胞因子(IL-10、IFN-γ)的产生也可见抑制的倾向(图2～图7)。关于IL-5(图3)、IL-10(图5)和IFN-γ(图7)的产生量，p＜0.05，确认各实验组间存在显著差别。关于IL-4(图2)和IL-13(图6)的产生 量，p＜0.01，确认各实验组间存在显著差别。
IX.柳杉花粉变应原特异性抗体和组胺产生量的测定
在上述的第2次腹腔给予柳杉花粉提取蛋白和明矾的混合液的两周后，采集小鼠的血清，研究柳杉花粉变应原特异性抗体的产生量和组胺的产生量。首先，为了测定柳杉花粉变应原特异性抗体的产生量，在96孔板的各孔中分别加入用50mM的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释至2μg/mL的Southern Biotech社制的抗小鼠IgE抗体和同样稀释的抗小鼠IgG，在4℃下静置一夜。用PBS清洗后，添加DSフア一マバイオメデイカル株式会社制ブロツクエ一ス(产品编号UK-B80)，在25℃下封闭2小时。
接下来，向各孔中添加从小鼠体内采集的血清，使之在25℃下反应2小时后，向各孔中添加生物素化的柳杉花粉提取蛋白，在25℃下反应2小时。接着，向各孔中添加稀释至1/5000的Endogen社制辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(产品编号N100)，在25℃下反应1小时，之后向各孔中加入作为HRP酶底物的BD Biosciences社制BD OptEIA溶液(产品编号550536)进行显色，用酶标仪测定显色强度。另外，使用NEOGEN CORPORATION社制组胺ELISA试剂盒(产品编号409010)测定组胺的产生量。经口给予Tg水稻种子粉末的实验组和经口给予Non-Tg水稻种子粉末的实验组的IgE抗体、IgG抗体和组胺的产生量见图8～图10。
其结果，与经口给予Non-Tg水稻种子粉末的实验组相比，在经口给予Tg水稻种子粉末的实验组中，柳杉花粉变应原特异性IgE抗体的产生、柳杉花粉变应原特异性IgG抗体的产生和组胺的产生被显著抑制(图8～图10)。
序列表自由文本
SEQ ID NO 1：具有柳杉花粉变应原(Cryj2)的免疫原性的蛋白的氨基酸序列(93aa-388aa、59aa-92aa、1aa-58aa)
SEQ ID NO 2：具有柳杉花粉变应原(Cryj1)的免疫原性的蛋白的氨基酸序列(1aa-144aa)
SEQ ID NO 3：具有柳杉花粉变应原(Cryj1)的免疫原性的蛋白的氨基酸序列(126aa-257aa)
SEQ ID NO 4：具有柳杉花粉变应原(Cryj1)的免疫原性的蛋白的氨基酸序列(231aa-353aa)
SEQ ID NO 5：编码具有柳杉花粉变应原(Cryj2)的免疫原性的蛋白的多核苷酸的核苷酸序列
SEQ ID NO 6：编码具有柳杉花粉变应原(Cryj1)的免疫原性的蛋白的多核苷酸的核苷酸序列
SEQ ID NO 7：编码具有柳杉花粉变应原(Cryj1)的免疫原性的蛋白的多核苷酸的核苷酸序列
SEQ ID NO 8：编码具有柳杉花粉变应原(Cryj1)的免疫原性的蛋白的多核苷酸的核苷酸序列
SEQ ID NO 9：入门克隆中所含的原始多克隆位点的核苷酸序列
SEQ ID NO 10：pBluescript KS+的核苷酸序列
SEQ ID NO 11：GluB1启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO 12：GluB4启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO 13：16kDa谷醇溶蛋白启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO 14：10kDa谷醇溶蛋白启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO 15：内部添加了Cfr9I位点的GluA2的核苷酸序列
SEQ ID NO 16：内部添加了Cfr9I位点的GluB1的核苷酸序列
SEQ ID NO 17：内部添加了Cfr9I位点的GluC的核苷酸序列
SEQ ID NO 18：GluB1终止子的核苷酸序列
SEQ ID NO 19：GluB4终止子的核苷酸序列
SEQ ID NO 20：16kD谷醇溶蛋白终止子的核苷酸序列
SEQ ID NO 21：10kD谷醇溶蛋白终止子的核苷酸序列
SEQ ID NO 22：目标双运载体的核苷酸序列
序列表
Claims (8)
1.选自以下(A)、(G)的蛋白：
(A) 蛋白，其由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列构成；
(G) 蛋白，其由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列和选自SEQ ID NO: 2～4所示氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列构成。
2.选自以下(a)、(g)的多核苷酸：
(a) 多核苷酸，其编码SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
(g) 多核苷酸，其编码由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列和选自SEQ ID NO: 2～4所示氨基酸序列中的一个或两个以上的氨基酸序列构成的蛋白。
3.权利要求2所述的多核苷酸，该多核苷酸选自以下的(p)、(r)：
(p) 多核苷酸，其具有SEQ ID NO: 5记载的核苷酸序列；
(r) 多核苷酸，其具有SEQ ID NO: 5记载的核苷酸序列和SEQ ID NO: 6～8中任一个记载的核苷酸序列。
4.载体，其中包含权利要求2所述的多核苷酸。
5.权利要求1所述的蛋白的生产方法，该方法包括：在导入有权利要求2所述的多核苷酸或权利要求4所述的载体的转化体中使上述多核苷酸表达，并采集所产生的蛋白。
6.通过向植物中导入权利要求2所述的多核苷酸，对植物赋予柳杉花粉的免疫原性的方法。
7.具有柳杉花粉的免疫原性的植物体的制作方法，该方法包括：制作包含权利要求2所述的多核苷酸的载体；将上述载体导入植物器官、植物组织或植物细胞中，得到转化体；以及由上述转化体生育植物体。
8.柳杉花粉症的治疗或预防药，其中包含选自权利要求1所述的蛋白和导入有权利要求2所述的多核苷酸或权利要求4所述的载体的转化体的一种或两种以上作为有效成分。
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Granted publication date: 20150408 Termination date: 20171028 |
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