JP6385644B2 - 目的遺伝子を発現させるための光学スイッチ用コンストラクト - Google Patents
目的遺伝子を発現させるための光学スイッチ用コンストラクト Download PDFInfo
- Publication number
- JP6385644B2 JP6385644B2 JP2013050728A JP2013050728A JP6385644B2 JP 6385644 B2 JP6385644 B2 JP 6385644B2 JP 2013050728 A JP2013050728 A JP 2013050728A JP 2013050728 A JP2013050728 A JP 2013050728A JP 6385644 B2 JP6385644 B2 JP 6385644B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- promoter
- expression
- polynucleotide
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
[1]以下に記載のポリヌクレオチドを含む、目的遺伝子を発現させるための光学スイッチ用コンストラクト;
(a)光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子プロモーター(PpsaA)、
(b)前記光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの制御下に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列であって、前記目的遺伝子の発現を阻害する転写産物をコードするポリヌクレオチド配列。
[2]前記光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子プロモーターが、配列番号1で示されるヌクレオチド配列を有する、前記[1]に記載のコンストラクト。
[3]前記コンストラクトが一過性遺伝子発現用コンストラクトである、前記[1]または[2]に記載のコンストラクト。
[4]前記DNA組み換えタンパク質の発現を阻害するポリヌクレオチド配列が、
RNAi(RNA interference)、あるいはリプレッサーによって、目的遺伝子の発現を阻害する、前記[1]〜[3]に記載のコンストラクト。
[5]更に、植物由来の変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子(mALS)をコードするポリヌクレオチドを含む、前記[1]〜[4]に記載のコンストラクト。
[6] 前記[1]〜[5]に記載のコンストラクトを含有するベクター。
[7]前記[6]に記載のベクターが導入された植物由来の形質転換体。
[8]近赤外光照射により、目的遺伝子の発現量を変化させる方法であって、前記[6]に記載のコンストラクトを導入した形質転換体に、440nm〜450nm、または690nm〜710nmの波長領域内の波長成分を含む光を照射する方法。
[9]前記波長領域内の波長成分の光量子束密度が、70μmol m−2s−1〜300μmol m−2s−1の範囲内である、前記[8]に記載の方法。
[10]前記近赤外光照射を1日間〜2日間行うことを特徴とする前記[8]または[9]に記載の方法。
[11] 以下に記載のポリヌクレオチドを含むコンストラクトの、目的遺伝子を発現させる光学スイッチとしての使用;
(a)光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子プロモーター(PpsaA)、
(b)前記光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの制御下に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列であって、前記目的遺伝子の発現を阻害する転写産物をコードするポリヌクレオチド配列。
本発明のコンストラクトは、目的遺伝子を葉緑体中で発現させるスイッチとして用いることができる。
本発明は、近赤外光が選択的に光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子(psaA)の発現を抑制するという知見に基づいている(図2A:文献11)。
また、同様の機構により、近赤外光は選択的に、rbcLプロモーターの制御にも関与することが知られている(図2B)。
PS II,光化学系II;PS I,光化学系I;PQ,酸化型プラストキノン;PQH2,還元型プラストキノン;σ1,RNAポリメラーゼσ因子SIG1;PpsaA,PS I反応中心タンパク質遺伝子プロモーター(Kobayashi et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 10760-10764, 2010)
本発明は、上記に記載されるような、PS I反応中心タンパク質遺伝子(psaA)のプロモーター(光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子プロモーター)を光学スイッチとして利用するものである。
光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子プロモーター配列(PpsaA)は、配列番号:1において示される。
配列番号1:
5’-AAGCATTTATTGAAATAGGATAATATTATCTATAAAAAAAATAGGCTACATTTCGGAACTTAATAATTGAAATATGAATACACTCGATTAGGTTATAAAAAAAGCTCTTTGTGTACCAATGTAAAGGCGCTAAAACTTTTTTTAATTATAAAAAAGGGTCCGTTGAGCACCCTATGGATATGTCATAATAGATCCG-3’
ここで、3’側の最後のGが転写開始点である。
psaAプロモーターとしては、上記のシロイヌナズナpsaAプロモーター配列およびそれと相同性の高い配列を用いることができる。
配列番号2:
5’-TTGTTTTTCATTTTCATGGATGAATTCCGCATATTGTCATATCTAGGATTTACATATACAACAGATATTACTGTCAAGAGTGATTTTATTAATATTTTAATTTTAATATTAAATATTTGGATTTATAAAAAGTCAAAGATTCAAAACTTGAAAAAGAAGTATTAGGTTGCGCTATACATATGAAAGAATATACAATAATGA-3’
ここで、3’側の最後のAが転写開始点である。
しかし、用いる配列は、配列番号1や配列番号2に示される配列を有するものに限定されるものではなく、これらの配列と同等な機能(プロモーターの下流に位置する光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子またはRubisco Lサブユニット遺伝子を転写させる機能)を有する他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号1または2の塩基配列と約80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記プロモーター活性を有する配列が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
本発明に係るポリヌクレオチドは、RNA(例えば、mRNA)の形態、またはDNAの形態(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)で存在し得る。DNAは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖DNAまたはRNAは、コード鎖(センス鎖としても知られる)であり得る。
本発明において「一過性遺伝子発現」とは、葉緑体に導入されたDNAが葉緑体内で分解されるまでの間、遺伝子が発現されることを意味する。
本発明のDNA組み換えタンパク質(目的遺伝子)としては、例えば、リツキシマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、エポエチン アルファ、ベバシズマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、ソリリス(Soliris)(登録商標)、エラプラーゼ(Elaprase)(登録商標)、ナグラザイム(Naglazyme)(登録商標)、シンライズ(Cinryze)、ミオザイム(Myozyme)、アーカリスト(Arcalyst)、ファブラザイム(Fabrazyme)、セレザイム(Cerezyme)、アウドラザイム(Aldurazyme)等の医療製剤用タンパク質、および免疫グロブリンA等の抗体タンパク質が挙げられるがこれらに限定されるものではない。これらのタンパク質製剤は、大型医薬品として世界での売り上げが多額であり(図7、図8)、これらの組み換えタンパク質を植物体内で生産する手法は、大幅な生産コストの削減に貢献し、医薬品生産の増大にも貢献するものと考えられる(図9)。また更に、特に、植物体の成長が著しく困難となる目的遺伝子を選択した場合には、本発明のコンストラクトが非常に有用になると考えられる。
配列番号3:
5’-AAAAAATATTCCTAGAGCAATTCTATTTCTATGTATGTGGATTCGCTTCTAATTTATTTCATCGATTACAAAAAATTTTTTATGAATCTAAACTAAAAGGATCTTATCCATTTTACATTGGTTGACATGGCTATATAAGTCATGTTATACTGTTTC-3’
ここで、3’側の最後のCが転写開始点となる。
さらに、本発明の「目的遺伝子の発現を阻害する転写因子をコードするポリヌクレオチド」は、(i)目的遺伝子をコードするポリヌクレオチド(DNA)の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド;(ii)目的遺伝子をコードするポリヌクレオチド(DNA)の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド;(iii)目的遺伝子をコードするポリヌクレオチド(DNA)の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド;及び(iv)目的遺伝子をコードするポリヌクレオチド(DNA)の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、葉緑体発現用コンストラクトと共にベクターに組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記(i)〜(iv)のポリヌクレオチド(DNA)の発現を抑制することができる。したがって、上記ポリヌクレオチド(例えば、DNA)の発現を抑制することが好ましい場合に好適に利用することができる。
本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる(例えば、Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照)。
緑色発光ルシフェラーゼをコードするCBG68luc(Promega)を使った場合、このコード領域を以下のようなsiRNA最適配列予測サイト(例えばhttp://www.idtdna.com/Scitools/Applications/RNAi/RNAi.aspxや、http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/sirnaSequenceDesignInit.do)で配列を予測させると,以下のCBG68lucのタンパク質コード領域の83〜109の27塩基のアンチセンスがベストとして上がる。
配列4:5’−TCCGAGCACTGCGTAAACATAGTCACC−3’
したがって、CBG68lucのタンパク質コード領域の83〜109の27塩基(以下)を含むCBG68lucのDNA塩基配列(GenBank:AY258593.1)のアンチセンスを好適に用いることができる。
本発明において、リプレッサーとは、特異的なオペレーターを認識し、これに結合することによって、そのオペレーターを含むプロモーターに連なる遺伝子群、すなわちオペロンの発現を抑制し、負の調節を行うタンパク質を意味する。また、オペレーターとは、リプレッサーの結合部位を意味する。オペレーターは、プロモーターとオペロンの構造遺伝子との中間、又はプロモーターと一部重なり合ってオペロンの上流に存在する。すなわち、オペレーターは、プロモーターと存在位置が重複する場合がある。本発明において使用できるリプレッサー遺伝子/プロモーター(オペレーターを含む)としては、既知のものを用いることが出来る。
「光化学系スイッチ」として、図3Aに示すような系があげられる。
PS I反応中心タンパク質遺伝子プロモーター(PpsaA)の制御下に目的遺伝子のRNA干渉(RNA interference,RNAi)コンストラクトを置く。また、目的遺伝子は光波長非依存的発現プロモーター[PS II反応中心タンパク質遺伝子プロモーター(PpsbA)]の制御下に置く。昼光色ではRNAiが発現して、目的タンパク質は産生されない。一方、近赤外発光ダイオード(LED)の照射により、プラストキノン(PQ)が酸化型になり、σ因子SIG1(σ1)がリン酸化する。P−σ1により、PpsaAの活性が抑制され、その制御下に置いたRNAiが発現せず、目的タンパク質が産生される。なお、葉緑体の形質転換維持には、植物由来の変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子(mALS)を用いる。
P,リン酸基;σ1,RNAポリメラーゼσ因子SIG1;PpsaA,PS I反応中心タンパク質遺伝子プロモーター(P−σ1で特異的に転写が抑制される);RNAi,目的遺伝子のRNAiコンストラクト;目的遺伝子,光波長非依存的発現プロモーター[PS II反応中心タンパク質遺伝子プロモーター(PpsbA)]の制御下に置かれた目的遺伝子;mALS,変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子(形質転換維持マーカー)
PpsaA−RNAi−TpsbA
PpsbA−目的遺伝子−TpsbA
PpsbA−mALS−TpsbA
図3Bの系において、「近赤外光」(690〜710nm)では、psaAの発現が抑制されるため、大腸菌の「lac レプレッサー」のような遺伝子発現抑制系をpsaAプロモーター(PpsaA)の制御下に置き,「近赤外光」で目的遺伝子の発現抑制が解除される。
ここで、PS I反応中心タンパク質遺伝子プロモーター(PpsaA)の制御下に大腸菌lacリプレッサー遺伝子(I)が置かれる。また、目的遺伝子は光波長非依存的発現プロモーター[PS II反応中心タンパク質遺伝子プロモーター(PpsbA)]と大腸菌lacオペレーター(O)の制御下に置かれる。
P,リン酸基;σ1,RNAポリメラーゼσ因子SIG1;PpsaA,PS I反応中心タンパク質遺伝子プロモーター (P−σ1で特異的に転写が抑制される);I,大腸菌lacリプレッサー遺伝子;O,光波長非依存的発現プロモーターPpsbAと連結された大腸菌lacオペレーター(O1)配列;目的遺伝子,目的遺伝子タンパク質コード領域;mALS,変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子 (形質転換維持マーカー)
大腸菌lacリプレッサー遺伝子 (I):NCBI Reference Sequence NC_007779.1
大腸菌lacオペレーター(O1)配列:5’-TGTTGTGTGGAATTGAGAGCGGATAACAATTTCACACA-3’
PpsaA−I−TpsbA
PpsbA−O−目的遺伝子−TpsbA
PpsbA−mALS−TpsbA
本発明の葉緑体発現用コンストラクトを導入した植物において、目的遺伝子を葉緑体に蓄積させる場合に用いる波長は、光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの活性を抑制できるものであればよく、特に制限はない。例えば、青色帯(435nm〜480nm)および近赤色帯(610nm〜750nm)において効率的である。また、上記光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの活性抑制の観点からは、好ましくは、約440nm〜約450nm、または約690nm〜約710nmの波長領域内の波長成分を含む光が挙げられる。
光量子束密度としては、光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの活性を抑制できるものであればよく、特に制限はない。これら遺伝子の発現促進効率の観点からは、上記波長領域または波長の波長成分の光量子束密度は、好ましくは70μmol m−2s−1〜300μmol m−2s−1の範囲内である。
光照射時間は、照射する光の光量子束密度によっても異なるが、光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの活性を抑制できるものであればよく、特に制限はないが、連続照射であるのが好ましい。これら遺伝子の発現促進効率の観点からは、光量子束密度が70μmol m−2s−1〜300μmol m−2s−1の範囲内である場合には、光照射時間は、好ましくは1日間〜2日間程度である。
本発明で用いられる光源としては、人工光源を用いる場合には、なるべく光化学系(PS)I反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの活性を抑制する効率の高い波長成分の光のみを用いるのが、エネルギー効率の観点からは好ましい。好ましくは、上記に示される特定の波長を発する光源が挙げられる。
(1) 発熱がほとんど無い
(2) 発光ダイオード単体が小さいため、光源としての発光機器はその形状を自由に変化させることできる
(3) 発光ダイオードはそれぞれの種類によって光の波長域が狭く(スペクトル幅が小さく)、その組み合わせによって自由に目的の波長域を得ることができるので、植物の栽培に適した波長域を容易に設定して照射を行なうことができる、
などの特徴および効果を有している。すなわち、LEDは、スペクトル幅の小さな単色光/低電圧で駆動可能/コンパクト/発熱が少ないという特性を有しており、植物に必要な波長の光を組み合わせて照射を行なうことにより、小さなエネルギーで効率よく特定の植物生理機能や形態形成を促すことが可能になるとともに、植物の要部に対する近接照射を容易に行なうことが可能である。さらに、高輝度LEDを利用することによって、より強い光量子束密度を提供することが可能であり、このことによって、より強い生合成を植物に誘導させることが可能である。
本発明の組換えベクターは、本発明の上記DNAを適当なベクターに挿入することによって作成することができる。ベクターとしては、pBluescript系のベクター、pBI系のベクター、pUC系のベクターなどが使用できる。
pBluescript系のベクター、pBI系のベクターなどのバイナリーベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的のDNAを導入できるという点で好ましい。pBluescript系のベクターとしては、例えば、pBluescript SK(+)、pBluescript SK(−)、pBluescript II KS(+)、pBluescript II KS(−)、pBluescript II SK(+)、pBluescript II SK(−)などがあげられる。pBI系のベクターとしては、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3、pBI221などがあげられる。
pUC系のベクターは、植物にDNAを直接導入することができるという点で好ましい。
ベクターは、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター)を有するベクターや、外的な刺激(例えば、乾燥、紫外線の照射、塩ストレス)により誘導的に活性化されるプロモーターを有していてもよい。このようなプロモーターとしては、例えば、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのrab16遺伝子のプロモーター(Nundy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1406 (1990))、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター(Schulze-Lefert et al., EMBO J. 8, 651 (1989))、塩ストレスによって誘導されるプロモーターなどがあげられる(Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., Curr. Opin. Plant Biol. 3, 217-223 (2000))。
プロモーターとしては、植物細胞において機能することができれば植物由来のものでなくてもよい。具体的には、CaMV35Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター(Pnos)、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来のPRタンパク質プロモーターなどがあげられる。さらに、前述の外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターもあげられる。
エンハンサーとしては、CaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域があげられる。
ターミネーターとしては、前述のプロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター(Tnos)、CaMVポリAターミネーターなどがあげられる。
本発明の形質転換植物細胞は、本発明の組換えベクターを植物細胞に導入することによって得ることができる。組換えベクターの植物細胞への導入は、従来公知の方法、例えば、植物に感染するウイルスや細菌を介して導入する方法(I. Potrylkus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 205 (1991))、外来DNAを直接導入する方法などがあげられる。具体的には、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法、エレクトロポレーション法などを用いることができる。これらの方法は、例えば、形質転換する宿主植物の種類などに応じて適宜決定できる。
本発明のベクターまたはポリヌクレオチドが導入されることで形質転換される植物としては、特に制限はなく、下等植物から高等植物まで全て含む。本発明で形質転換される植物としては、例えば、種子植物、シダ植物、コケ植物、地衣植物、多細胞の植物、作物植物、蔬菜植物、花卉植物、木本植物、観賞用植物、樹木植物(例えば、針葉樹、落葉樹など)などを挙げることができる。本発明の形質転換された植物は、単子葉または双子葉植物であってよい。農作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ダイズ、(インゲン)マメ、エンドウ、チコリー、トマト、ミカン、イチゴ、ワタ、タバコ、コーヒーノキ、チャ、ナタネ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、ゴムノキ、カンショ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ペッパー、セルリー、カボチャ、ペポカボチャ、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ソルガム、クローバー、ニンジン、アルファルファ、ナス、キュウリ、アラビドプシスなどが挙げられる。観賞用植物としては、例えば、キク、カーネーション、バラ、キンギョソウ、ラン、トルコギキョウ、フリージア、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、シクラメン、カトレア、ペチュニア、トレニア、チューリップ、ガーベラ、アヤメ、ヤシ、スゲなどが挙げられる。樹木植物としては、例えば、例えば、マツ、トウヒ、モミ、ツガ、イチイ、イチョウが挙げられる。コケ植物としては、例えば、ヒメツリガネゴケが挙げられる。
本発明のコンストラクトを導入した形質転換体を用いて目的物質を生産する方法は、例えば以下の手順が示されるが、本発明の範囲はこの手順に限定されるものではない。
1. 種子の滅菌、播種
1.5mLチューブにシロイヌナズナ種子(ecotype: Columbia)を分注し、70%エタノール1mLを加え、1分間振とう後、遠心し上清を捨てた。滅菌溶液を1mL加えて、10分間振とうした。以後の操作は、無菌的に行うため、クリーンベンチを使用した。軽く遠心し、上清を捨て、1mL滅菌水で洗浄した。洗浄を5回繰り返し、0.1%アガロース溶液1mLを加え、アルミホイルに包み、4℃で2〜3日春化処理を行った。その後、ムラシゲ・スクーグ(MS)培地に播種した。
人工気象機(RIOTRON NC220, 日本医化器械製作所)を用い、温度20℃、湿度40−60%、照度2,000−3,000luxの白色蛍光灯下、16時間−明、8時間−暗で育成させた。
3−1. 近赤外光の照射
3週間育成させたシロイヌナズナを3日間アルミホイルにて遮光し、各波長の光を2日間から2週間照射した。
約100mgシロイヌナズナ葉を採取し(近赤外光照射のものは遮光条件下で行った)、液体窒素にて氷結粉砕した。その後、RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用い、操作はその取扱説明書に従った。
抽出したRNAからDNAを取り除くためDNase処理を行った。10 X DNase Buffer 5μL、7μg分のRNAが含まれた抽出液、DNase 3μL加え、Milli−Q水で50μLにメスアップした後、37℃で30分反応させた。反応後、Milli−Q水で100μLにメスアップした。そこに等量のクロロホルムを加えて5分間ボルテックスし、室温で15,000rpm、10分間遠心し、上層を回収した。1/10倍量の3M酢酸ナトリウム、2.5倍量の100%エタノールを加え、1分間ボルテックスし、−80℃で1時間放置した。その後、4℃、15,000rpm、10分間遠心し上清を取り除いた。70%エタノールを150μL加え、4℃、15,000rpm、3分間遠心し、上清を完全に取り除いた。得られたペレットを風乾させ、10μLのMilli−Q水に溶かした。
逆転写反応は、Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit(Roche)を用いて行った。
忠実性の高いPCRを行う際は、KOD−Plus DNA polymerase(TOYOBO)を使用した。10 X KOD−Plus Buffer 5 μL、2 mM dNTPs 5μL、25mM MgSO4 2μL、プライマー(各10μM) 1.5μL、KOD−Plus DNA polymerase 1μL、鋳型 DNA 50ngを混合し、Milli−Q水で50 μLに調製した。基本反応条件は、94℃ 2分間→(94℃ 30秒、58℃ 30秒、68℃ 1分/kb)X 30cycle→68℃ 5分間とした。
リアルタイム PCRはLightCycler (Roche) を使用した。SYBER Premix ExTaq (TaKaRa) 10μL、プライマー(各10 pmol)0.4μL、鋳型cDNA 2μLを混合、Milli−Q水で20μLにメスアップしたものをキャピラリーに入れ、LightCyclerに供した。プライマーは20〜25−merの長さで、測定する遺伝子に対して特異性が高く、かつゲノムDNAの混入を確認するために、イントロンを挟むように設計し、産物が150〜250bp程度のサイズになるように作製した。発現量を内部標準遺伝子ACT2によって補正し、3日間暗処理したものとの相対値で表した。
4−1. 使用培地組成
抗生物質 (アンピシリン50μg/mL)を含む2mLの液体LB培地中で、大腸菌を37℃で12−16時間振とう培養した。2mLチューブに移し入れ、12,000rpm、10分間遠心し菌体を集め、Plasmid Miniprep Kit(ORIGENE)により調製した。
回収したプラスミドは目的に応じた制限酵素で消化した。処理後、アガロース電気泳動を行い、目的のものとして正しいか確認、ゲルからのDNA回収を行った。
Nucleo Spin Extract II (MACHEREY−NAGEL) を使用した。アガロース電気泳動後、目的のDNA断片をメスで切り出して回収した。切り出したゲルにNT Bufferを200μL加え、50℃、15分間インキュベートし、ゲルを溶かす。溶かした溶液を付属カラムに移し入れ、10,000rpm、1分間遠心した。NT3 Wash Buffer 600μL加えて10,000rpm、1分間遠心し、液は捨てた。10,000rpm、5分間遠心し、カラムを乾燥させた。新しいチューブにカラムを移し、NT Elusion Buffer 30μLを加えて、室温で1分間放置後、10,000rpm、1分間遠心した。
a. DNA末端の平滑化
DNA依存性DNAポリメラーゼで、鋳型DNAおよびdNTPs存在下で3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を持ち、5→3’にはエキソヌクレアーゼ活性は持たずポリメラーゼ活性を有するT4 DNA polymerase (TaKaRa) から構成されるDNA Blunting Kit (TaKaRa) を用いた。反応液は10 μL [鋳型DNA 0.1−10 pmol、10 X Buffer (dNTP含む)] 1 μLをMilli−Q水で9 μLにメスアップし70℃、5分間処理後、T4 DNA polymerase 1 μLを加え、37℃で5分間反応させた。ボルテックスにて激しく撹拌し、氷中に置き反応を停止させた。
ベクター:インサート=1:5〜1:10 (モル比)、平滑末端の場合は1:10〜1:20となるようにそれぞれのDNA溶液を調製し、2 X Ligation Mix (NIPPON GENE) もしくはEnzyme Solution (TaKaRa) をDNA溶液と等量加え、16℃、30分間反応させた。平滑末端のライゲーションの場合、14℃、一晩反応させた。
Competent High JM109およびDH5α (TOYOBO) を使用した。コンピテントセルを氷上で融解して、ライゲーションした溶液を加え穏やかに混ぜ (ライゲーション溶液は、コンピテントセル溶液の1/10量より少なくする)、氷上で30分放置した。42℃のヒートショックを30秒間行い、氷上で2分間冷却した。SOC培地を加えて、37℃で1時間振とう培養した後、LBプレート上に適量播いた。
鋳型となるDNAを大腸菌のコロニーのまま爪楊枝を用いて、PCR反応液に入れ、94℃で10分間の熱処理により大腸菌を破壊し、鋳型DNAを溶出させ、ExTaq DNA Polymerase (TaKaRa) を用い増幅させた。反応液の組成は、10 X ExTaq Buffer 250μL、2.5mM dNTP mixture 180μL、プライマー(各5 pmol)100μL、Milli−Q水1,440μLを調製し、21μLずつ分注した。そこに鋳型DNAを加え、ExTaq DNA Polymeraseを4μL(0.125 U)づつ分注し、穏やかにピペッティングした。PCR反応条件は、通常のものと同様に行った。
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing Kit(Applied Biosystems)を用いた。反応液の組成は、鋳型DNA 200−1,000ng、5 X Sequence Buffer 1μL、プライマー (3.2 pmol) 0.5μLを滅菌Milli−Q水で8μLにメスアップした。最後に2 μLのSequence Taqを加え全体で10μLとした。反応条件を96℃ 1分間→ (96℃ 10秒→50℃ 5秒→60℃ 4分間 X 25 サイクル→4℃) とし、T gradient(Biometra)を用いて反応を行った。反応の終わったサンプルをエタノール沈殿により精製し、PRISM3100/3100−Avant Genetic Analyzer(Applied Biosystems)によりDNA塩基配列を決定した。
1.各種波長光照射によるpsaAおよびpsbA発現量の変化
PSIとPSIIの吸収スペクトルの差が大きく見られる波長は450nmと700nm付近である(文献12)。したがって、これら波長のうちpsaAとpsbAの発現量の差が最も大きく見られる、つまりpsaAの発現が最も抑制される波長とその照射時間の特定を目的とした。各種波長の光を照射し、psaAおよびpsbAの発現量をリアルタイムRT−PCRにて測定した。RT−PCRにおいては転写産物量が測定されるが、内在性のpsaAおよびpsbA転写産物量が高いと各種波長照射による増大が評価しにくいことが想定される。したがって、3週間育成させたシロイヌナズナを3日間暗処理することにより、psaAおよびpsbAの転写産物量を一旦減少させた。その後、白昼光、450nm、690nm、700nm、705nm、710nm、730nmの各波長光を一定期間照射し、シロイヌナズナからRNA抽出を行った。また、3日間暗処理直後のものをコントロールとして使用した。転写産物量は、DNaseI処理、cDNA合成を経て、リアルタイムRT−PCRにて測定した(図4)。
遺伝子発現をモニターするには、レポーター遺伝子が有効である。本実験においては、葉緑体形質転換(葉緑体ゲノムへの遺伝子導入)に先立ち、一過性遺伝子発現(パーティクルガンにより葉緑体に打ち込まれたDNAが葉緑体内で分解されるまでの間の遺伝子発現)により評価する。一過性遺伝子発現は感度が要求され、また目的の遺伝子発現の評価には打ち込み効率の補正が必要となる。したがって、同時に測定可能な複数の高感度レポーター遺伝子が不可欠となる。Chroma−GloLuciferase Assey System(Promega)が本目的を満たすと考えた。Chroma−GloLuciferaseのうち、赤に発光するCBRlucと緑に発光するCBG68lucを実験供した。これらのコドン使用(codonusage)は、葉緑体のそれから大きく外れていなかったため、利用可能と判断した。しかしながら、CBRlucおよびCBG68lucの葉緑体での発現について報告がないため、まずは、これらをpsbAプロモーターの制御下で発現させることとした。
配列番号2 : Rubisco L Subunit Promoter
配列番号3 : PsbA Promoter
配列番号4 : CBG68luc antisense
配列番号5 : lac operator sequence
Claims (5)
- 近赤外光照射により、目的遺伝子の発現量を変化させる方法であって、
光化学系スイッチ用コンストラクトを導入した形質転換植物細胞を提供すること、および
前記形質転換植物細胞に、白色光の照射による生育の後、690nm〜710nmの波長領域内の波長成分を含む光を1〜2日間照射して前記目的遺伝子を発現させること
を含み、
前記光化学系スイッチ用コンストラクトが、以下:
(a)光化学系I反応中心タンパク質遺伝子のプロモーターであって、配列番号1で示されるポリヌクレオチド配列を有するプロモーター、または配列番号1で示されるポリヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有し、前記形質転換植物細胞において近赤外光(690〜710nm)によりプロモーター活性が低下するプロモーター
(b)前記プロモーター(a)の制御下に作動可能に連結されたポリヌクレオチドであって、前記目的遺伝子の発現を阻害する転写産物をコードするポリヌクレオチド、
(c)光化学系II反応中心タンパク質遺伝子のプロモーターであって、配列番号3で示されるポリヌクレオチド配列を有するプロモーター、または配列番号3で示されるポリヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有し、前記形質転換植物細胞において光波長非依存的なプロモーター活性を有するプロモーター、および
(d)前記プロモーター(c)の制御下に作動可能に連結された前記目的遺伝子のポリヌクレオチド
を含む、方法。 - 前記コンストラクトが一過性遺伝子発現用コンストラクトである、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド(b)が、
RNAiによって目的遺伝子のポリヌクレオチド配列(d)の発現を抑制するためのポリヌクレオチド、あるいは
前記プロモーター(c)と作用するように連結されたlacオペレーターに対する、lacリプレッサータンパク質をコードするポリヌクレオチド
によって、前記目的遺伝子のポリヌクレオチド(d)の発現を阻害する、請求項1または2に記載の方法。 - 前記目的遺伝子のポリヌクレオチド(d)が、植物由来の変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記波長領域内の波長成分の光量子束密度が、70μmol m−2s−1〜300μmol m−2s−1の範囲内である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013050728A JP6385644B2 (ja) | 2013-03-13 | 2013-03-13 | 目的遺伝子を発現させるための光学スイッチ用コンストラクト |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013050728A JP6385644B2 (ja) | 2013-03-13 | 2013-03-13 | 目的遺伝子を発現させるための光学スイッチ用コンストラクト |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014176309A JP2014176309A (ja) | 2014-09-25 |
JP6385644B2 true JP6385644B2 (ja) | 2018-09-05 |
Family
ID=51697021
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013050728A Active JP6385644B2 (ja) | 2013-03-13 | 2013-03-13 | 目的遺伝子を発現させるための光学スイッチ用コンストラクト |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6385644B2 (ja) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HUP0100787A3 (en) * | 1998-02-20 | 2003-04-28 | Syngenta Ltd | Pollen specific promoter |
CA2419790A1 (en) * | 2000-08-18 | 2002-02-21 | Gencell S.A. | System for regulating in vivo the expression of a transgene by conditional inhibition |
GB0123401D0 (en) * | 2001-09-28 | 2001-11-21 | Novartis Forschungsstiftung | Methods of inducing gene expression |
WO2011052697A1 (ja) * | 2009-10-30 | 2011-05-05 | 日本製紙株式会社 | スギ花粉の免疫原性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びこれらの用途 |
-
2013
- 2013-03-13 JP JP2013050728A patent/JP6385644B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2014176309A (ja) | 2014-09-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2674256T3 (es) | Polinucleótidos y polipéptidos aislados y métodos de uso de los mismos para aumentar el rendimiento de la planta | |
US9902956B2 (en) | Nucleic acid agents for overexpressing or downregulating RNA interference targets and uses of same in improving nitrogen use efficiency, abiotic stress tolerance, biomass, vigor or yield of a plant | |
US11111497B2 (en) | Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same | |
WO2009061216A1 (en) | Compositions and methods for altering the production of pigment in plants | |
ES2327657T3 (es) | Metodo para intensificacion de la expresion de genes en las plantas. | |
US11155827B2 (en) | Methods for generating transgenic plants | |
US20150089688A1 (en) | Compositions and methods of gene silencing in plants | |
WO2009061215A1 (en) | Compositions and methods for altering pigment production in plants | |
WO2009061214A1 (en) | Compositions and methods for modulating pigment production in plants | |
US10907171B2 (en) | Methods and compositions for enhanced biomass production and increased abiotic stress tolerance | |
US20160108416A1 (en) | Atsp1, an e3 ubiquitin ligase, and its use | |
JP6385644B2 (ja) | 目的遺伝子を発現させるための光学スイッチ用コンストラクト | |
WO2015103417A1 (en) | Tissue-specific expression and hybrid plant production | |
US20160010105A1 (en) | Stress tolerant plants | |
WO2019232277A1 (en) | Methods of altering seed weight and seed oil content by manipulating alpha-carboxyltransferase (a-ct) activity via carboxyltransferase interactor (cti) protein expression | |
KR101368224B1 (ko) | 상처 스트레스 유도 프로모터 및 이의 용도 | |
Zhang et al. | Phosphorylated transcription factor PuHB40 mediates ROS-dependent anthocyanin biosynthesis in pear exposed to high light | |
Bai et al. | Phosphorylated transcription factor PuHB40 is involved in ROS-dependent anthocyanin biosynthesis in pear exposed to high-light stress | |
AU2015202781A1 (en) | Isolated Polynucleotides and Polypeptides and Methods of Using Same for Increasing Plant Utility | |
Suka et al. | Transformation of PRT6 RNAi construct into tomato (Solanum lycopersicum) cv. Micro-Tom | |
KR101297355B1 (ko) | 파라쿼트, 염, 및 가뭄에 대한 내성 증가를 위한 재조합 벡터, 이의 용도 및 이에 의한 형질전환 식물체 | |
Thomas | Establishment of pale yellow'Golden Pothos' plant-based transgenic system for studying nuclear genes involved in chloroplast biogenesis | |
WO2012174139A2 (en) | Compositions and methods for making and b ioc ont aining auxotrophic transgenic plants |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20151209 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170110 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170307 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170511 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171024 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171220 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180223 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180731 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180808 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6385644 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |