CN105002196A - 一种猪瘟重组疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪瘟重组疫苗，通过构建猪瘟病毒E2基因和Erns基因串联的真菌特异性双T-DNA安全表达载体；利用PEG法、农杆菌介导法或电击法转化食药用真菌原生质体，所述的食药用真菌为金针菇、平菇和蛹虫草、灵芝；经鉴定为阳性的菌丝体，培养获得T1代子实体，利用PCR筛选出只含目的基因而不含选择标记基因的子实体个体，培养至T2代，获得稳定表达猪瘟病毒基因的转基因食药用真菌。通过转基因真菌菌丝的发酵培养，制备猪瘟重组疫苗。利用本发明生产的猪瘟疫苗各批次间质量差异小、产量大、成本低，具有广泛的社会效益和经济效益。

Description

一种猪瘟重组疫苗

技术领域

本发明属于基因工程和生物医药技术领域，具体涉及一种猪瘟重组疫苗。

背景技术

猪瘟又称“烂肠瘟”，是由猪瘟病毒（Classical Swine fever virus，CSFV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，因其给人类造成巨大的经济损失和严重公共卫生问题，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。猪瘟属于我国规定的一类烈性动物传染病，据不完全统计，猪瘟每年给我国造成的经济损失近100亿，对我国养猪业的危害极其严重。国家畜禽重大疫病攻关课题组首席科学家谢庆阁也认为，在生产实践中，有很多猪病的发生与猪瘟病毒感染有关。

 传统疫苗的应用为我国动物疫病的防控做出了巨大贡献，目前依然是我国控制动物传染病的主要手段。传统疫苗主要包括灭活疫苗和弱毒疫苗，使用兔化弱毒疫苗株进行强制免疫控制猪瘟，仍然是我国目前最为流行和有效的防治手段。但是，常规弱毒疫苗免疫的最大缺点是难以用血清学方法与自然感染区分开，使得出口受到限制而蒙受损失。因此，开发能用血清学方法区分免疫猪与感染猪的新型疫苗（DIVA疫苗）成为当务之急。

在过去的十几年中,曾经应用各种新技术针对猪瘟开发新型DIVA疫苗,但是投入了市场的只有E2亚单位疫苗。还有人尝试将E2蛋白抗原域A或者B/C缺失,制成亚单位疫苗。另外，仅含有E2部分肽段的亚单位疫苗也已有报道。目前比较成功的是杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗。因为去掉了跨膜区，表达的重组蛋白高水平地分泌到昆虫细胞培养液中。另外，有研究人员采用同样技术路线，研制出E2亚单位疫苗，这两种亚单位疫苗均已商品化。

基因工程疫苗以其安全性好、质量均一、生产成本低、适合开发多价苗和联苗等诸多优点，成为新型疫苗的研究焦点和开发方向。近年来我国在兽用生物制品研发领域发展迅速，一些兽用基因工程疫苗通过注册，这为我国动物疫苗产业注入了新的生机和活力。目前已上市的兽药基因工程疫苗已经在禽流感、口蹄疫、猪伪狂犬病、猪圆环病毒病、禽法氏囊病等对畜禽养殖业危害大的疫病防控中广泛使用，并发挥了重要作用，成为传统疫苗的有效补充甚至替代品。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用食药用真菌菌丝体生物反应器生产的可饲猪瘟重组疫苗。

一种融合蛋白基因E2-Erns，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

一种融合蛋白E2-Erns，其氨基序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

一种表达载体pCB130NG-E2-Erns，它是：

    1）用HindIII和EcoRI双酶切pCAMBIA1300载体，去除MCS区，经DNA聚合酶Klenow酶补平后，用T4连接酶连接形成中间载体pCB130-1；

    2）在pCB130-1的SphI位点处引入SEQ ID NO.1所示的基因，包含左右边界序列和多克隆位点，构建成中间载体pCB130-2；

    3）pCB130-2分别在PstI酶切位点处引入真菌特异性启动子GPD，在SacI与EcoRI酶切位点之间引入Nos终止子，构建成真菌特异性双T-DNA表达载体，命名为pCB130NG；

    4）经SalI和 KpnI，在pCB130NG中插入SEQ ID NO.4所示的基因。

一种食药用真菌菌丝体，它转染了所述的一种表达载体pCB130NG-E2-Erns；

    所述的食药用真菌为蛹虫草、灵芝、金针菇或平菇。

一种食药用真菌菌丝体在制备猪瘟疫苗中的应用。

本发明提供了一种猪瘟重组疫苗，通过构建猪瘟病毒E2基因和Erns基因串联的真菌特异性双T-DNA安全表达载体；利用PEG法、农杆菌介导法或电击法转化食药用真菌原生质体，主要涉及的食药用真菌为金针菇、平菇和蛹虫草、灵芝；经鉴定为阳性的菌丝体，培养获得T1代子实体，利用PCR筛选出只含目的基因而不含选择标记基因的子实体个体，培养至T2代，获得稳定表达猪瘟病毒基因的转基因食药用真菌。通过转基因真菌菌丝的发酵培养，制备猪瘟重组疫苗。利用本发明生产的猪瘟疫苗各批次间质量差异小、产量大、成本低，具有广泛的社会效益和经济效益。

利用本发明制备的猪瘟可饲基因工程疫苗，具有以下优点：

 1．生产成本低，且易形成规模化产业，生产转基因口服疫苗工艺简单，不需要昂贵的培养基和复杂的纯化过程，也不需要严格的无菌生产和冷藏保存。

2．转基因可饲疫苗生产成品储存简单。不需要冷冻、冷藏，还有利于运输，这不仅降低了成本，还可以随时预防接种。

3．预防接种简单易行，转基因植物疫苗可通过饲喂而进行免疫，在进行大范围预防接种时，大大节省了人力和时间。

4．使用安全。对免疫接种动物来说，表达系统中的非目的成分对动物无害，不存在其他潜在动物病原体污染的可能；免疫接种时，不需要注射器和针头之类的设备，不存在通过注射接种动物感染病原微生物的可能。

5．在E2蛋白基础上开发的亚单位疫苗不仅会赋予猪对抗CSFV野毒株的广泛保护，而且很容易通过检测抗Erns的抗体将免疫猪和感染猪区分开。

附图说明

图1真菌特异性双T-DNA安全表达载体pCB130NG示意图；

图2 pCB130NG-E2-Erns质粒酶切；

图3 转基因蛹虫草菌丝的PCR检测；

图4 转基因蛹虫草子实体的PCR检测。

具体实施方式

实施例1. 真菌特异性双T-DNA安全表达载体的构建

   利用pCAMBIA1300载体作为基础载体，首先通过HindIII和EcoRI双酶切，去除MCS区，经DNA聚合酶Klenow酶补平后，用T4连接酶连接形成中间载体pCB130-1。接下来，通过基因合成技术在中间载体的SphI位点处引入一段序列（SEQ ID NO.1），包含左右边界序列和多克隆位点，构建成中间载体pCB130-2。在此载体基础上，通过PCR技术及酶切与连接方法，分别在PstI酶切位点处引入真菌特异性启动子GPD（SEQ ID NO..2），在SacI与EcoRI酶切位点之间引入Nos终止子（SEQ ID NO..3），构建成真菌特异性双T-DNA表达载体，命名为pCB130NG，该载体示意图见图1。

实施例2. 猪瘟重组疫苗E2-Erns的设计

为了提高猪瘟疫苗的免疫效果和将免疫猪和感染猪区分开，将猪瘟病毒E2基因和Erns基因串联一起进行构建；同时，为使两个病毒蛋白表达后在空间上隔开，在两基因之间添加一个短的核苷酸Linker：CGGTGGATCCGGCGGTGGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCT；为便于表达后的检测，在E2基因的5’末端和Erns基因的3’末端均加上6个His标签。得到的猪瘟重组疫苗E2-Erns氨基酸序列为SEQ ID NO.4,委托生物公司合成。

实施例3. 猪瘟病毒基因E2-Erns表达载体的构建

通过Genebank查找猪瘟病毒 E2 基因（FJ598612.1）和Erns 基因（JQ178244.1）序列，根据真菌对密码子的偏爱性，对目的基因进行密码子优化后，利用人工合成方法将两基因串联，引入到改造后的双T-DNA安全表达载体pCB130NG（图1）中，两侧酶切位点分别为：上游加SalI(GTCGAC)，下游加KpnI(GGTACC)。经过酶切鉴定（图2），获得真菌特异性猪瘟病毒基因E2-Erns表达载体pCB130NG-E2-Erns。

实施例4. 转猪瘟病毒E2-Erns基因蛹虫草子实体的获得

1.  蛹虫草原生质体的提取与转化：

（1）蛹虫草菌丝体的培养：将蛹虫草菌丝体于优化的固体PDA培养基培养9天，然后再接种于150mL液体PDA培养基，26-28℃、100-130r/min，250mL摇瓶振荡暗培养4天，直至长成生长量较多、大小均匀、状态良好的菌丝球。

（2）原生质体的制备：用0.6mol/L的甘露醇配制混合酶液，即溶壁酶和蜗牛酶复合添加，总量为3.0-4.0%，比例为1:1；按照菌丝体重量：酶液=1:6-10的比例酶解菌丝，酶解温度为34℃，酶解时间2.5-4小时；以无菌脱脂棉过滤除去残余蛹虫草菌丝体，5000g离心10min，收集原生质体。

（3）蛹虫草原生质体转化：将原生质体浓度调节到1×10⁷个/ml，载体质粒的添加量为25μg，混合均匀后，置于冰上5min后，加入30μl PEG 缓冲液（25% PEG4000，50mmol/L CaCl₂，10mmol/L Tris-HCl，pH7.5），冰浴20min，再加入250μl PEG 缓冲液，室温放置20min，加入1ml的MYG培养液，1000g，离心5min，弃掉上清液，用1ml MYG培养液回溶原生质体。

2. 蛹虫草阳性转化菌丝的筛选和鉴定：

（1）蛹虫草阳性转化菌丝的筛选：经转化后的原生质体，在MYG培养液中培养5天后，均匀涂布于含有15-25mg/L潮霉素的MYG固体平板上，生长7天后，抗性转化子即可长出。继续培养抗性转化子，菌丝直径长到2cm左右时，将单个菌落接种到新的抗性PDA固体平板上（含有15-25mg/L潮霉素），培养至菌丝长满板。

（2）蛹虫草抗性转化菌丝的DNA提取：收集阳性转化菌丝，按照DNA提取试剂盒(爱思进生产)操作说明，提取抗性菌丝的基因组DNA。

（3）蛹虫草阳性转化子的鉴定：以抗性菌丝基因组DNA为模板，E2-Erns基因5’端序列（TTCAATTGTACGATGGAACAG）和3’端序列（ACGTAAGCTCCGAACCATGTC）为引物，退火温度选择60℃，设计PCR反应。反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出目的基因条带的菌丝，即为转基因阳性转化子（图3）。

3. 转基因蛹虫草子实体的筛选和获得：

    （1）配制瓶料及接种：培养阳性转化菌丝作为菌种，配制蛹虫草培养料（大米45g，营养液45ml，营养液配方/L：蔗糖30g，蛋白胨150 g，硫酸镁0.5g ，磷酸二氢钾1.5g ，维生素B1 0.015 g，2,4-D 0.002 g），灭菌接种后，进行发菌和子实体培养管理。

（2）发菌：发菌温度控制在20-23℃，黑暗培养，持续15d左右，菌丝即可吃透培养料，完成营养生长。

（3）子实体培养：菌丝体成熟后，由白色逐渐转为桔黄色，此时，室内应增加光照，白天利用自然散射光，保持200勒克斯，晚间可利用日光灯作光源，每天应不少于10h光照，以促使菌丝体转色和刺激原基形成。待料面突起，并形成小米粒状原基时，要适当通风，补充新鲜空气，保护室内温度18℃-22℃，并提高空气相对温度至80%-85%。如湿度太大，易使培养基提早失水而影响产量。蛹虫草有较强的趋光性，因此在子实体形成后，应根据情况适当调整培养瓶与光源的相对方向，或调整室内光源方向，以保证子实体的正常生长形态，从而提高产量，形成橘黄色或橘红色的顶部略膨大的呈棒状的子座(子实体)。待子实体不再生长，其顶端出现许多小刺时，表明已成熟。

（4）筛选：采取蛹虫草子实体提取基因组DNA，使用PCR技术筛选出只含有目的基因而无筛选标记的转基因蛹虫草（图4）。继续培养至T2代。

实施例5. 转基因蛹虫草菌丝的发酵培养，制备可饲猪瘟重组疫苗

1. 发酵培养获得猪瘟重组疫苗：以筛选获得的转基因蛹虫草为母种，培养制得转基因蛹虫草菌丝作为发酵菌种，用PDA液体培养基为发酵液，按照菌种：发酵液=1:100的比例接种，发酵温度为22-25℃，大量制备蛹虫草菌丝体。离心收集蛹虫草菌丝体，离心力为1000g，将所获菌丝体低温烘干，即得到猪瘟重组疫苗E2-Erns。

2. 动物实验：选用健康家兔8只，其中4只为空白对照，4只饲喂猪瘟重组疫苗E2-Erns，每只给服100g/天，连服3天。15天后，进行第二次饲喂疫苗，每只给服100g/天，连服3天。7天后，采血，离心、分离血清，用猪瘟C-株细胞毒绵羊红细胞诊断试剂测其抗体水平。

检测结果：血液抗体效价为1:125-1:254，说明本疫苗有良好的免疫原性。

实施例6转基因灵芝、金针菇和平菇菌丝制备及发酵培养，制备可饲猪瘟重组疫苗

    转基因灵芝、金针菇和平菇菌丝的制备及发酵培养与蛹虫草基本相同，制备的可饲猪瘟重组疫苗均获得了良好的免疫原性。

<110>   吉林农业大学

<120>  一种猪瘟重组疫苗

 <160>   4

<210>   1

<211>   103

<212>   DNA

<213>   人工

<400>    1

 

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<210>   2

<211>   913

<212>   DNA

<213>   人工

<400>   2

 

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<210>    3

<211>   256

<212>   DNA

<213>   人工

<400>    3

 

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<210>    4

<211>   1770

<212>   DNA

<213>   人工

<400>   4

 

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<210>   1

<211>   588

<212>   PRT

<213>   人工

 

<400>   1

 

Met His His His His His His Leu Gln Leu Tyr Asp Gly Thr Val Lys

                 5                   10                  15

Ala Ile Cys Val Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser

              20                 25                  30

Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Gly Ala Leu Leu Thr Ser Val

         35                  40                  45

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     50                 55                   60

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                 85                 90                   95

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            100                 105                 110

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        115                 120                 125

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    130                 135                 140

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145                 150                 155                 160

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                165                 170                 175

Cys Gly Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile

            180                 185                 190

Gly Lys Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val Asp Ser

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    210                 215                 220

Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser Asp Glu

225                 230                 235                 240

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                245                 250                 255

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            260                 265                 270

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        275                 280                 285

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    290                 295                 300

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305                 310                 315                 320

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                325                 330                 335

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            340                 345                 350

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        355                 360                 365

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    370                 375                 380

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385                 390                 395                 400

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                405                 410                 415

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        435                 440                 445

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    450                 455                 460

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465                 470                 475                 480

Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn

                485                 490                 495

Phe Ser Phe Ala Gly Thr Val Ile Asp Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val

            500                 505                 510

Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Phe

        515                 520                 525

Gln Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Ile Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu

    530                 535                 540

Lys Ala Arg Gln Gly Ala Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gln

545                 550                 555                 560

Leu Ser Thr Thr Gly Lys Lys Leu Glu Arg Gly Ser Lys Thr Trp Phe

                565                 570                 575

Gly Ala Tyr Val Glu Phe His His His His His His

            580                 585         588

Claims (6)

1.一种融合蛋白基因E2-Erns，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

2.一种融合蛋白E2-Erns，其氨基序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

3.一种表达载体pCB130NG-E2-Erns，它是：

    1）用HindIII和EcoRI双酶切pCAMBIA1300载体，去除MCS区，经DNA聚合酶Klenow酶补平后，用T4连接酶连接形成中间载体pCB130-1；

    2）在pCB130-1的SphI位点处引入SEQ ID NO.1所示的基因，包含左右边界序列和多克隆位点，构建成中间载体pCB130-2；

    3）pCB130-2分别在PstI酶切位点处引入真菌特异性启动子GPD，在SacI与EcoRI酶切位点之间引入Nos终止子，构建成真菌特异性双T-DNA表达载体，命名为pCB130NG；

    4）经SalI和 KpnI，在pCB130NG中插入SEQ ID NO.4所示的基因。

4.一种食药用真菌菌丝体，它转染了权利要求3所述的一种表达载体pCB130NG-E2-Erns。

5.权利要求4所述的一种食药用真菌菌丝体，所述的食药用真菌为蛹虫草、灵芝、金针菇或平菇。

6.权利要求4所述的一种食药用真菌菌丝体在制备猪瘟疫苗中的应用。