CN101914603B - 利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法。本发明主要通过优化发酵培养基的配方、诱导前补料液的配方、诱导后补料液的配方、乳糖诱导液的配方以及发酵参数，成功运用乳糖替代IPTG作为诱导剂来诱导目的蛋白的表达。本发明的目的蛋白表达水平高，目的蛋白占菌体总蛋白的水平可达35～49％，与IPTG诱导水平相当。而且本发明在发酵过程中添加乳糖诱导后再补甘油作为碳源，既可大大提高生物量，又能减少代谢副产物乙酸的生成，还能避免由于发酵液中葡萄糖的存在而影响乳糖的诱导效果。可见，本发明不仅简便，发酵时间短，生产成本低，而且得到的产物中无毒害物质残留。
Description
技术领域
本发明属于基因工程药物制备领域，更具体地，本发明涉及一种利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法。
背景技术
目前工业生产中大多使用大肠杆菌作为工程菌来生产目的蛋白，其中工程菌的高密度培养至关重要，采用高密度培养技术提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内目的蛋白的产量)，不仅可减少培养体积、强化下游分离纯化，还可以缩短发酵周期、减少设备投资从而降低生产成本，能大大地提高其在市场上的竞争力。为了实现这一目的，不仅要考虑重组菌本身的表达性质，而且还必须考虑重组菌生长和产物表达的最适环境条件，包括适宜的培养基组成、合适的培养温度、pH、溶解氧、稳定的比生长速率以及营养物的合理流加(分批补料策略)等。
对于设置有乳糖操纵子的重组载体，人们常用IPTG作为诱导剂。然而，IPTG对于人体具有潜在的毒性，当利用IPTG诱导表达应用于人体的重组药物时，对最终的产品会带来一些不利影响，一些国家明文已规定在生产人用重组蛋白类药物的生产工艺中不得使用IPTG。另外，IPTG的价格也较为昂贵，尤其是在较大体积的发酵罐中进行工业化生产诱导时，IPTG的应用会给发酵成本带来超重的负担(Kapralek et al.1991)。因此，尽管IPTG是Lac操纵子最有效的诱导剂，但它并不适合于大规模制备重组蛋白，特别是药用重组蛋白。与IPTG相比，利用乳糖作为诱导剂其诱导过程较为复杂和麻烦，首先乳糖自身无法进入到菌体细胞的内部，它是一个主动运输的过程，需要借助于乳糖透过酶(Permease)的作用，因此乳糖的转运受多种因素的影响；另外.乳糖进入细胞后仍然不能诱导Lac启动子的启动，它需要经过β-半乳糖苷酶的作用转化为异乳糖(Allolactose)后才起诱导剂的作用(Jobe A，Bourgeois S.J Mol Biol，1972，69：397-408；Muller-Hill B，Rickenberg H V，Wallenfels K.J Mol Biol，1964，10：303-318)。也正因为如此，迄今为止仅有少量的利用乳糖作为诱导剂诱导重组产物表达的研究报道，而在高密度发酵中应用乳糖诱导产物表达的研究则少见报道。尽管如此，乳糖的蛋白诱导效率虽不如IPTG，但乳糖所具备的无毒和价廉的优点，使得其在重组基因工程蛋白类药物的工业化发酵生产中，仍具有优于IPTG的潜在价值和优势。由于乳糖本身会引起细胞在转运以及生理代谢等方面的一系列复杂的变化，从而需要对工程菌生长及诱导表达条件等进行更为精细的优化研究来提高乳糖的诱导效率。
pMFH表达载体(Su ZD and Ni F.Novel fusion protein for efficient productionof recombinant peptides.PCT/WO2004/015111；Su ZD et al，Protein Eng Des Sel.17，647-657，2004；Su ZD and Ni F.Staphylococcal nuclease fusion protein for theproduction of recombinant peptides，US 7390639B2；Su ZD et al，PCT/CA2003/001197)是一个具有Lac操纵子的表达载体，能有效表达100个氨基酸组成的多肽。目前，尚未有关于用乳糖诱导发酵利用pMFH载体构建得到的重组载体的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷和不足之处，提供一种利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法。
本发明的目的是由下述技术方案实现的：一种利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法，包括如下步骤：
(1)将已转化利用pMFH载体和目的基因构建得到的重组载体质粒的宿主菌进行活化，依次制备一级种子和二级种子；
(2)发酵和诱导：将二级种子接种于发酵培养基中，在接种后2.5～4h开始慢速流加乳糖诱导前补料液，乳糖诱导前补料液体积与发酵罐工作体积之比为1/25～1/20，于1～2h流加完，此时发酵液的pH值会一直下降，因为葡萄糖代谢会产酸，当流加进去的葡萄糖耗完后pH值会开始上升，此时进入对数生长期前中期(OD600在25.8～39范围内)，这时开始流加乳糖诱导液进行诱导目的蛋白的表达，乳糖诱导液体积与发酵罐工作体积之比为1/25～1/20，1～2h补加完，加完诱导液后立即补加乳糖诱导后补料液，乳糖诱导后补料液体积与发酵罐工作体积之比为1/25～1/20，于2～3h内流加完，持续诱导6～8h，发酵罐中乳糖诱导终浓度为10～16g/L；
发酵培养基的组成如下：Glucose(葡萄糖)2～8g/L、Yeast extract(酵母提取物)12～30g/L、Tryptone(胰蛋白胨)8～24g/L、NaCl 2～6g/L、(NH4)2SO41～3g/L、Na2HPO4 4～10g/L、KH2PO4 2～8g/L、Citric Acid(柠檬酸)0.5～2.4g/L、MgSO4·7H2O 0.4～1.2g/L，微量元素溶液1ml/L，用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH 6.8～7.5；
所说的微量元素溶液的组成为：FeSO4·7H2O 1.8～3.6g/L、MnCl2·4H2O 1.2～2.8g/L、Co(NO3)2·6H2O 2.0～4.0g/L、CaCl2·2H2O 1.0～2.0g/L、CuCl2·2H2O 0.1～0.3g/L、ZnSO4·7H2O 0.2～0.4g/L、H3BO3 0.6～1.8g/L和Na2MoO4·2H2O 1.0～3.0g/L溶于1mol/L HCl中，微量元素溶液过滤除菌；
所述的诱导前补料液的组成为：Glucose 225～450g/L、MgSO4·7H2O 5～10g/L、NH4Cl 15～60g/L，用去离子水配制；
所述的诱导后补料液的组成为：Glycerol(甘油)150～450g/L、Lactose(乳糖)50～150g/L、MgSO4·7H2O 5～10g/L，用去离子水配制；
所述的乳糖诱导液的组成为：Lactose 50～300g/L、Yeast extract 50～300g/L、MgSO4·7H2O 5～10g/L，用去离子水配制；
所述的宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)；
所述的目的基因优选公开号为“CN 101294187A”、发明名称为“一种缓释生物活性多肽的方法与应用”中所涉及的GLP-1衍生物的核苷酸序列；
所述的活化优选通过摇瓶培养进行活化；摇瓶培养的条件为35～40℃、150～250rpm培养12～20h，接种量为0.5～2％(体积百分比)，摇瓶装液量为10～30％(体积百分比)；培养基为含有氨苄青霉素的LB培养基；氨苄青霉素的浓度为100μg/ml；LB培养基的组分组成如下所示：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，用去离子水配制，pH值6.8～7.5；
所述的一级种子优选通过以下方法制备：将活化的菌种接种于发酵基础培养基进行摇瓶培养；摇瓶培养的条件为：摇瓶装液量为10～30％(体积百分比)，于35～40℃、150～250rpm培养8～16h；接种量为0.5～2％(体积百分比)；发酵基础培养基(2YT)的组分组成如下所示：胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH值为6.8～7.5；
所述的二级种子优选通过以下方法制备：将一级种子接种到改进培养基中于35～40℃、150～250rpm继续活化7～10h；接种量为0.5～2％(体积百分比)；摇瓶装液量为10～30％(体积百分比)；所述改进培养基的组分组成如下所示：葡萄糖0.5～2g/L、酵母提取物15～30g/L、胰蛋白胨10～25g/L、NaCl 2～8g/L、(NH4)2SO4 2～8g/L、Na2HPO4 6～24g/L、KH2PO4 2～6g/L、MgSO4·7H2O 0.4～1.6g/L，用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH 6.8～7.5；
步骤(2)所述发酵的培养条件为：接种量为8～12％(体积百分比)，发酵温度为37～40℃，溶氧通过调节通气量与搅拌速度(0～1000rpm)控制在30～50％(体积百分比)、pH值控制在6.8～7.5，发酵过程中通过加盐酸与氢氧化钠溶液来调节pH值，发酵时间为10～20h；
以上所涉及的培养基和补料液都是使用前115～121℃，灭菌15～20min。
本发明的优点在于：
(1)本发明成功运用乳糖替代IPTG作为诱导剂来诱导目的蛋白的表达。
(2)通过本发明所述的技术方案，得到的大肠杆菌BL21(DE3)菌体得率高，OD600值可达到90左右，菌体湿重达48～80g/L。
(3)本发明的目的蛋白表达水平高，目的蛋白占菌体总蛋白的水平可达35～49％，与IPTG诱导水平相当。
(4)本发明利用乳糖诱导蛋白表达外，它还能大幅提高菌的生物量。
(5)本发明在发酵过程中添加乳糖诱导后再补甘油作为碳源，既可大大提高生物量，又能减少代谢副产物乙酸的生成，还能避免由于发酵液中葡萄糖的存在而影响乳糖的诱导效果。
(6)本发明所述的发酵方法简便，发酵时间短，生产成本低，另外，无IPTG存在，后处理简单。
附图说明
图1是实施例1制备的pMFH-GLP-1的质粒图谱。
图2是实施例1中添加乳糖诱导不同时间的蛋白表达情况，其中：
泳道M为蛋白Marker，泳道1～8依次分别为添加乳糖诱导0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h和7h的蛋白表达情况。
图3是实施例3中添加乳糖诱导不同时间的蛋白表达情况，其中：
泳道M为蛋白Marker，泳道1～9依次分别为添加乳糖诱导0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h的蛋白表达情况。
图4是重组工程菌pMFH-GLP-1-PA6.2-BL21(DE3)高密度培养时的生长曲线。
图5是重组工程菌pMFH-GLP-1-PA6.2-BL21(DE3)高密度培养时的蛋白表达情况，其中：
泳道M为蛋白Marker，泳道1～7依次分别为添加乳糖诱导0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h的蛋白表达情况。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)pMFH-GLP-1-DP6.2原核表达载体的构建
①pMFH-GLP-1(7-37)重组质粒的构建
GLP-1(7-37)cDNA序列为：
CAC GCT GAA GGT ACC TTC ACT TCC GAC GTT TCC TCT TAC CTG GAA GGG CAG GCT GCA AAAGAA TTT ATC GCT TGG CTG GTT AAA GGT CGT GGC TAA
根据上面GLP-1(7-37)的序列设计4个寡核苷酸片段，引物1的5’端引入EcoR Ⅰ黏性末端；引物4的5’端包含BamH Ⅰ黏性末端，并使其3’端有同引物1互补的27个碱基，引物序列如下：
EcoR Ⅰ
引物1(P1)：5’
CAC GCT GAA GGT ACC TTC ACT TCC GAC GTT TCC TCT TAC CTGGAA GGG CAG GCT GCA AAA-3’
引物2(P2)：5’-GAA TTT ATC GCT TGG CTG GTT AAA GGT CGT GGC TAA G-3’
引物3(P3)：5’-GGA AAC GTC GGA AGT GAA GGT ACC TTC AGC GTG G-3’
BamH Ⅰ
引物4(P4)：5’
TTA GCC ACG ACC TTT AAC CAG CCA AGC GAT AAA TTC TTT TGCAGC CTG CCC TTC CAG GTA AGA-3’
引物序列由上海英骏生物技术有限公司代为合成。目的基因GLP-1(7-37)获得：分别将合成的四个寡聚核苷酸链P1、P2、P3、P4用TE溶解，接着将等摩尔的P1、P2、P3与P4进行退火复性，并使之终浓度为1pmol/μl，复性总体系为40μl，复性条件：94℃保温5min后，每90秒下降1℃徐冷至25℃；然后用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测并回收待克隆基因片段(108bp)。
用EcoR Ⅰ和BamH I对原核表达载体pMFH进行双酶切，pMFH质粒双酶切反应体系为：pMFH质粒2.0μg，10 X Buffer H 5.0μL，EcoR Ⅰ 2.0μL，BamHI 2.0μL，加MillQ水至50μL。酶切反应条件：30℃水浴2h，然后37℃水浴2h。将目的基因片段与酶切好的pMFH原核表达载体于16℃连接3～4h，连接体系为：pMFH双酶切产物50ng，目的DNA片段60ng，10 X ligation Buffer 2.0μL，T4 DNA Ligase 1.0μL，加MillQ水至20μL。连接产物转化大肠杆菌DH5α(购于大连宝生物公司)，通过氨苄青霉素(Amp)选择培养后，挑取独立、分离的单克隆4～6个，分别置于内含Amp100μg/ml的5ml液体LB培养基中37℃振荡培养过夜。取培养好的菌液用质粒抽提试剂盒(购于OMEGA，按照说明书进行操作)抽提质粒，用EcoR Ⅰ和BamH I进行双酶切(酶切体系与条件同上)，酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测鉴定，将酶切片段长度符合插入片段长度的重组质粒送上海英骏公司测序部测序鉴定，得到pMFH-GLP-1(7-37)重组质粒(如图1所示)。
②GLP-1衍生物肽cDNA序列的重叠延伸PCR扩增
GLP-1衍生物肽cDNA序列为：
GAT CCG CTG CCG CAT AGC CAT CGC GCC CAT AGC CTG CCG CCG TTC AAC CCG CGT GGC CCGCAC GCT GAA GGT ACC TTC ACT TCC GAC GTT TCC TCT TAC CTG GAA GGG CAG GCT GCA AAA GAATTT ATC GCT TGG CTG GTT AAA GGT CGT GGC TAA
采用重叠延伸PCR方法，以pMFH-GLP-1(7-37)重组质粒为模板，扩增GLP-1衍生物肽cDNA序列，具体步骤如下：根据模板pMFH-GLP-1(7-37) DNA序列和人血清白蛋白结合12-mer肽(ABP)：L P H S H R A H S L P P的DNA序列设计重叠延伸PCR的引物，因表达的融合蛋白要通过甲酸的水解释放GLP-1衍生物肽，故在上游引物1(引物F1)的5’端添加甲酸作用位点天冬氨酸-脯氨酸(D-P)的密码子，并在其5’末端添加EcoR I酶切位点和4个保护碱基，上游引物2(引物Fp)5’端是人血清白蛋白结合12-mer肽中H S L P P 5个氨基酸的密码子，紧接着依次是Thrombin酶切位点FNPR、DPP-IV的酶切位点GP、GLP-1(7-37)中HAEGT的密码子；下游引物(引物R)则与蛋白表达载体pMFH的反向引物序列相同。引物序列由上海英骏生物技术有限公司代为完成。
EcoRI甲酸位点
F1：5’-GCGC
CTG CCG CAT AGC CAT CGC GCC CAT AGC CTG CCG CCG-3’
Fp：5’-CAT AGC CTG CCG CCG TTC AAC CCG CGT GGC CCG CAC GCT GAA GGT ACC-3’
R：5’-TCATCCGCCAAAACAGCCAAG-3’
重叠延伸PCR反应体系为：
模板pMFH-GLP-1质粒 100ng
10 X LA GC buffer I 5.0μL
上游引物1(10pmol) 2.0μL
上游引物2(10pmol) 2.0μL
下游引物(10pmol) 4.0μL
dNTP Mixture(各2.5mM) 1.0μL
Takara LA Taq(5U/μL) 0.5μL
Mill Q水 up to 50μL
重叠延伸PCR反应条件：95℃预变性4min后进入循环，循环条件为95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，然后72℃延伸10min，再冷却至4℃。反应结束后取25μL PCR产物于质量体积比为2.0％的琼脂糖凝较电泳分离长度为216bp目的基因片段。
③重叠延伸PCR产物的胶回收
使用Omega胶回收试剂盒，按照试剂盒的说明进行操作。
④酶切与连接
胶回收目的DNA片段用EcoRI和BamHI双酶切
胶回收的目的DNA片段的酶切反应体系为：
胶回收DNA片段 500ng
10 X Buffer H 5.0μL
EcoRI 2.0μL
BamHI 2.0μL
MillQ水 up to 50μL
酶切反应条件：30℃水浴2h，37℃水浴2h。
⑤pMFH表达载体的扩增及抽提
使用OMEGA质粒抽提试盒，按试剂盒的说明进行操作。
⑥pMFH表达载体的双酶切
pMFH质粒双酶切反应体系为：
pMFH质粒 2.0μg
10 X Buffer H 5.0μL
EcoRI 2.0μL
BamHI 2.0μL
MillQ水 up to 50μL
酶切反应条件：30℃水浴2h，然后37℃水浴2h。
⑦pMFH质粒双酶切产物的清洁
使用V-gene PCR清洁试盒，按试剂盒的说明进行操作。
⑧EcoRI和BamHI双酶切产物的连接：pMFH质粒载体EcoRI和BamHI
双酶切产物与重叠延伸PCR扩增后GLP-1衍生物对应的目的DNA片段的EcoRI和BamHI双酶切产物的连接体系为：
pMFH双酶切产物 50ng
目的DNA片段双酶切产物 60ng
10 X ligation Buffer 2.0μL
T4 DNA Ligase 1.0μL
MillQ水 up to 20μL
连接反应条件：16℃水浴16～20h，接着参照《分子克隆》中的转化方法将连接产物转化大肠细菌BL21(DE3)(购于大连宝生物公司)，接着对在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上生长出来的菌落进行PCR筛选和测序，得到pMFH-GLP-1-DP6.2原核表达载体。
(2)保种：将经过测序鉴定的菌种pMFH-GLP-1-DP6.2-BL21(DE3)4μl接种到4ml LB培养基(Amp浓度为100μg/ml)中，在37℃下摇床(200rpm)培养约12h，之后用体积百分比50％的甘油进行保种，体积百分比50％的甘油∶菌液比例为3∶7，-70℃保存备用；
(3)菌种的活化：将甘油菌pMFH-GLP-1-DP6.2-BL21(DE3)进行摇瓶培养，于150ml三角瓶中装30ml培养基，进行活化，得到活化的菌种；摇瓶培养的条件为37℃、200rpm培养12h，甘油菌的接种量为1％(体积百分比)，培养基为含有氨苄青霉素的LB培养基，氨苄青霉素的浓度为100μg/ml；LB培养基的组分组成如下所示：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，用去离子水配制，pH值为7.0；
(4)一级种子的制备：将步骤(3)制备的活化的菌种接种于发酵基础培养基进行摇瓶培养；摇瓶培养的条件为：装液量为250ml摇瓶中装50ml发酵基础培养基，于37℃、200rpm培养过夜约10h，接种量为1％(体积百分比)；发酵基础培养基的组分组成如下所示：胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH值为7.0；
(5)二级种子的制备：将一级种子接种到600ml改进培养基中于37℃、200rpm继续活化8h，接种量为1％(体积百分比)，装液量为20％(体积百分比)，3个1L摇瓶中各装200ml改进培养基，氨苄青霉素100μg/ml；
改进培养基的组分组成如下所示：葡萄糖1g/L、酵母提取物22g/L、胰蛋白胨18g/L、NaCl 5g/L、(NH4)2SO4 5g/L、Na2HPO4 15g/L、KH2PO4 4g/L、MgSO4·7H2O 1g/L，用去离子水配制，初始pH 7.0，121℃，灭菌15min；
(6)发酵和诱导：将二级种子接种于发酵培养基中，发酵罐培养条件：5L发酵罐(台湾Bio-top公司，型号：BTF-A5L)工作体积为3.5L，二级种子接种量为10％(体积百分比)，发酵温度为37℃，溶氧通过调节通气量与搅拌速度(0～1000rpm)控制在40％、pH值控制在7.0，发酵过程中通过加2mol/L HCl与2mol/LNaOH来调节pH值，发酵时长为12h；在接种后2.5h开始慢速流加乳糖诱导前补料液200ml(1h流加完)，此时发酵液的pH值会一直下降，因为葡萄糖代谢会产酸，当流加进去的葡萄糖耗完后pH值会开始上升，此时进入对数生长期前中期，接种后5h开始流加乳糖诱导液200ml(1.5h补完)进行诱导目的蛋白的表达，诱导起始时的OD600值为38.75，乳糖诱导的终浓度为12.5g/L，加完诱导液后立即补加乳糖诱导后补料液200ml(2h流加完)，持续诱导7h，得到GLP-1类似物包涵体蛋白；
发酵培养基的组成如下：Glucose 4g/L，Yeast extract 20g/L，Tryptone 12g/L，NaCl 4g/L，(NH4)2SO4 2g/L，Na2HPO4 6g/L，KH2PO4 4g/L，Citric Acid 2g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，微量元素溶液1ml/L，用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH 7.25，121℃，灭菌20min；
微量元素溶液的组成(g/L)：FeSO4·7H2O 2.8，MnCl2·4H2O 2.0，Co(NO3)2·6H2O3.0，CaCl2·2H2O 1.5，CuCl2·2H2O 0.2，ZnSO4·7H2O 0.3，H3BO3 1.0，Na2MoO4·2H2O 2.0溶于1mol/L HCl中，微量元素0.45μm膜(购于Millipore公司)过滤除菌；
所述的诱导前补料液的组成为：Glucose 300g/L、MgSO4·7H2O 10g/L、NH4Cl40g/L，用去离子水配制；
所述的诱导后补料液的组成为：Glycerol 300g/L、Lactose 75g/L、MgSO4·H2O 5g/L，用去离子水配制；
所述的乳糖诱导液的组成为：Lactose 150g/L、Yeast extract 150g/L、MgSO4·7H2O 5g/L，用去离子水配制；
5L发酵罐实验时以上两种补料液与诱导液各配200ml，115℃，灭菌20min。
实验结果：OD600达到91，菌体湿重为70.7g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-DP6.2占菌体总蛋白的量为45.4％，不同时间蛋白表达情况见图2所示，图2说明乳糖成功替代IPTG实现了目的蛋白的诱导表达。
图中凡涉及到目的蛋白SDS-PAGE电泳图的，其中M表示蛋白Marker(从小到大依次是14.3kDa、20.1kDa、29.0kDa、44.3kDa、66.4kDa、97.2kDa条带)，20.1kDa附近较深的条带就是目的蛋白GLP-1衍生物融合蛋白所在的位置。
图表中DCW表示细胞干重(dry cell weight)。
图表中蛋白表达量(％)是用AlphaEase FC软件对SDS-PAGE电泳图进行灰度扫描后得到的数据。
实施例2
(1)本实施例二级种子的制备与实施例1相同。
(2)发酵和诱导：将二级种子接种于发酵培养基中，发酵罐培养条件：5L发酵罐(台湾Bio-top公司，型号：BTF-A5L)工作体积为3.5L，接种量为12％(体积百分比)，发酵温度为37℃，溶氧通过调节通气量与搅拌速度(0～1000rpm)控制在30％、pH值控制在7.25，发酵过程中通过加2mol/L HCl与2mol/L NaOH来调节pH值，发酵时长为13h；在接种后4h开始慢速流加乳糖诱导前补料液200ml(1h流加完)，此时发酵液的pH值会一直下降，因为葡萄糖代谢会产酸，当流加进去的葡萄糖耗完后pH值会开始上升，此时进入对数生长期前中期，接种后6h开始流加乳糖诱导液200ml(1.5h补完)进行诱导目的蛋白的表达，诱导起始时的OD600值为25.84，乳糖诱导的终浓度为12.5g/L，加完诱导液后立即补加乳糖诱导后补料液200ml(2h流加完)，持续诱导7h，得到GLP-1类似物包涵体蛋白；
发酵培养基、补料液、诱导液组分与实施例1一样。
实验结果：OD600达到86，菌体湿重为67.4g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-DP6.2占菌体总蛋白的量为36.4％。
实施例3
(1)菌种的活化：将甘油菌pMFH-GLP-1-DP6.2-BL21(DE3)进行摇瓶培养，于150ml三角瓶中装15ml培养基，进行活化，得到活化的菌种；摇瓶培养的条件为35℃、250rpm培养20h，甘油菌的接种量为0.5％(体积百分比)，培养基为含有氨苄青霉素的LB培养基，氨苄青霉素的浓度为100μg/ml；LB培养基的组分组成如下所示：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，用去离子水配制，pH值为6.8；
(2)一级种子的制备：将步骤(1)制备的活化的菌种接种于发酵基础培养基进行摇瓶培养；摇瓶培养的条件为：装液量为250ml摇瓶中装25ml发酵基础培养基，于35℃、250rpm培养过夜约16h，接种量为0.5％(体积百分比)；
发酵基础培养基的组分组成如下所示：胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L、NaCl 5g/L、用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH值为6.8；
(3)二级种子的制备：将一级种子接种到600ml改进培养基中于35℃、250rpm继续培养10h，接种量为0.5％(体积百分比)，装液量为10％(体积百分比)，6个1L摇瓶中各装100ml改进培养基，氨苄青霉素100μg/ml；
改进培养基的组分组成如下所示：葡萄糖2g/L、酵母提取物30g/L、胰蛋白胨25g/L、NaCl 8g/L、(NH4)2SO4 8g/L、Na2HPO4 24g/L、KH2PO4 6g/L、MgSO4·7H2O1.6g/L，用去离子水配制，初始pH 6.8，115℃，灭菌20min；
(4)发酵和诱导：将二级种子接种于发酵培养基中，发酵罐培养条件：5L发酵罐(台湾Bio-top公司，型号：BTF-A5L)工作体积为3.5L，接种量为10％(体积百分比)，发酵温度为38℃，溶氧通过调节通气量与搅拌速度(0～1000rpm)控制在30％、pH值控制在7.5，发酵过程中通过加2mol/L HCl与2mol/L NaOH来调节pH值，发酵时长为15h；在接种后4h开始慢速流加乳糖诱导前补料液200ml(1.5h流加完)，此时发酵液的pH值会一直下降，因为葡萄糖代谢会产酸，当流加进去的葡萄糖耗完后pH值会开始上升，此时进入对数生长期前中期，接种后7h开始流加乳糖诱导液200ml(1.5h补完)进行诱导目的蛋白的表达，诱导起始时的OD600值为26，乳糖诱导的终浓度为10g/L，加完诱导液后立即补加乳糖诱导后补料液200ml(2.5h流加完)，持续诱导8h，得到GLP-1类似物包涵体蛋白；
发酵培养基的组成如下：Glucose 2g/L，Yeast extract 30g/L，Tryptone 8g/L，NaCl 6g/L，(NH4)2SO4 3g/L，Na2HPO4 4g/L，KH2PO4 2g/L，Citric Acid 0.5g/LMgSO4·7H2O 0.8g/L，微量元素溶液1ml/L，用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH 7.5，121℃，灭菌20min；
微量元素溶液的组成(g/L)：FeSO4·7H2O 1.8，MnCl2·4H2O 1.2，Co(NO3)2·6H2O4.0，CaCl2·2H2O 2.0，CuCl2·2H2O 0.3，ZnSO4·7H2O 0.4，H3BO3 1.8，Na2MoO4·2H2O 3.0溶于1mol/L HCl中，微量元素0.45μm膜(购于Millipore公司)过滤除菌；
所述的诱导前补料液的组成为：Glucose 450g/L、MgSO4·7H2O 5g/L、NH4Cl60g/L，用去离子水配制；
所述的诱导后补料液的组成为：Glycerol 150g/L、Lactose 125g/L、MgSO4·7H2O 5g/L，用去离子水配制；
所述的乳糖诱导液的组成为：Lactose 50g/L、Yeast extract 200g/L、MgSO4·7H2O 8g/L，用去离子水配制；
5L发酵罐实验时以上两种补料液与诱导液各配200ml，115℃，灭菌20min。
实验结果：OD600达到78.57，菌体湿重为54.9g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-DP6.2占菌体总蛋白的量为35％，不同时间蛋白表达情况见图3，图3说明当发酵工艺条件改变后乳糖同样能诱导目的蛋白的表达。
实施例4
(1)菌种的活化：将甘油菌pMFH-GLP-1-DP6.2-BL21(DE3)进行摇瓶培养，于150ml三角瓶中装45ml培养基，进行活化，得到活化的菌种；摇瓶培养的条件为40℃、150rpm培养12h，甘油菌的接种量为2％(体积百分比)，培养基为含有氨苄青霉素的LB培养基，氨苄青霉素的浓度为100μg/ml；LB培养基的组分组成如下所示：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，用去离子水配制，pH值为7.5；
(2)一级种子的制备：将步骤(1)制备的活化的菌种接种于发酵基础培养基进行摇瓶培养；摇瓶培养的条件为：装液量为250ml摇瓶中装75ml发酵基础培养基，于40℃、150rpm培养过夜约8h，接种量为2％(体积百分比)；
发酵基础培养基的组分组成如下所示：胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L、NaCl 5g/L、用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH值为7.5；
(3)二级种子的制备：将一级种子接种到600ml改进培养基中于40℃、150rpm继续活化7h，接种量为2％(体积百分比)，装液量为30％(体积百分比)，2个1L摇瓶中各装300ml改进培养基，氨苄青霉素100μg/ml；
改进培养基的组分组成如下所示：葡萄糖0.5g/L，酵母粉15g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 2g/L，(NH4)2SO4 2g/L，Na2HPO4 6g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，用去离子水配制，初始pH 7.5，121℃，灭菌20min；
(4)发酵和诱导：将二级种子接种于发酵培养基中，发酵罐培养条件：5L发酵罐(台湾Bio-top公司，型号：BTF-A5L)工作体积为3.5L，接种量为8％(体积百分比)，发酵温度为40℃，溶氧通过调节通气量与搅拌速度(0～1000rpm)控制在30％、pH值控制在6.8，发酵过程中通过加2mol/L HCl与2mol/L NaOH来调节pH值，发酵时长为14h；在接种后5h开始慢速流加乳糖诱导前补料液200ml(1h流加完)，此时发酵液的pH值会一直下降，因为葡萄糖代谢会产酸，当流加进去的葡萄糖耗完后pH值会开始上升，此时进入对数生长期前中期，接种后7h开始流加乳糖诱导液200ml(2h补完)进行诱导目的蛋白的表达，诱导起始时的OD600值为32.5，乳糖诱导的终浓度为15g/L，加完诱导液后立即补加乳糖诱导后补料液200ml(2h流加完)，持续诱导7h，得到GLP-1类似物包涵体蛋白；
发酵培养基的组成如下：Glucose 6g/L，Yeast extract 18g/L，Tryptone 18g/L，NaCl 2g/L，(NH4)2SO4 2g/L，Na2HPO4 6g/L，KH2PO4 8g/L，Citric Acid 1g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，微量元素溶液1ml/L，用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH 7.0，121℃，灭菌20min；
微量元素溶液的组成(g/L)：FeSO4·7H2O 3.6，MnCl2·4H2O 2.8，Co(NO3)2·6H2O2.0，CaCl2·2H2O 1.0，CuCl2·2H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.2，H3BO3 0.6，Na2MoO4·2H2O 1.0溶于1mol/L HCl中，微量元素0.45μm膜(购于Millipore公司)过滤除菌；
所述的诱导前补料液的组成为：Glucose 225g/L、MgSO4·7H2O 5g/L、NH4Cl15g/L，用去离子水配制；
所述的诱导后补料液的组成为：Glycerol 300g/L、Lactose 50g/L、MgSO4·7H2O 8g/L，用去离子水配制；
所述的乳糖诱导液的组成为：Lactose 200g/L、Yeast extract 300g/L、MgSO4·7H2O 10g/L，用去离子水配制；
5L发酵罐实验时以上两种补料液与诱导液各配220ml，115℃，灭菌20min。
实验结果：OD600达到79，菌体湿重为61.4g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-DP6.2占菌体总蛋白的量为40.8％。
实施例5
(1)本实施例二级种子的制备与实施例1相同。
(2)发酵和诱导：将二级种子接种于发酵培养基中，发酵罐培养条件：5L发酵罐(台湾Bio-top公司，型号：BTF-A5L)工作体积为3.5L，接种量为10％(体积百分比)，发酵温度为37℃，溶氧通过调节通气量与搅拌速度(0～1000rpm)控制在50％、pH值控制在7.0，发酵过程中通过加2mol/L HCl与2mol/L NaOH来调节pH值，发酵时长为13h；在接种后3h开始慢速流加乳糖诱导前补料液200ml(2h流加完)，此时发酵液的pH值会一直下降，因为葡萄糖代谢会产酸，当流加进去的葡萄糖耗完后pH值会开始上升，此时进入对数生长期前中期，接种后6h开始流加乳糖诱导液200ml(1h补完)进行诱导目的蛋白的表达，诱导起始时的OD600值为39.0，乳糖诱导的终浓度为16g/L，加完诱导液后立即补加乳糖诱导后补料液200ml(3h流加完)，持续诱导7h，得到GLP-1类似物包涵体蛋白；
发酵培养基的组成如下：Glucose 8g/L，Yeast extract 12g/L，Tryptone 24g/L，NaCl 4g/L，(NH4)2SO4 1g/L，Na2HPO4 10g/L，KH2PO4 6g/L，Citric Acid 2.4g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，微量元素溶液1ml/L，用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH 7.25，121℃，灭菌20min；
微量元素溶液的组成(g/L)：FeSO4·7H2O 2.8，MnCl2·4H2O 2.0，Co(NO3)2·6H2O3.0，CaCl2·2H2O 1.5，CuCl2·2H2O 0.2，ZnSO4·7H2O 0.3，H3BO3 1.0，Na2MoO4·2H2O 2.0溶于1mol/L HCl中，微量元素0.45μm膜(购于Millipore公司)过滤除菌；
所述的诱导前补料液的组成为：Glucose 300g/L、MgSO4·7H2O 8g/L、NH4Cl40g/L，用去离子水配制；
所述的诱导后补料液的组成为：Glycerol 450g/L、Lactose 150g/L、MgSO4·7H2O 10g/L，用去离子水配制；
所述的乳糖诱导液的组成为：Lactose 75g/L、Yeast extract 100g/L、MgSO4·7H2O 5g/L，用去离子水配制；
5L发酵罐实验时以上两种补料液与诱导液各配250ml，115℃，灭菌20min。
实验结果：OD600达到75.6，菌体湿重为80g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-DP6.2占菌体总蛋白的量为46.5％。
实施例6
(1)pMFH-GLP-1-PA 6.2原核表达载体的构建
②GLP-1’衍生物肽cDNA序列的重叠延伸PCR扩增
要得到GLP-1’衍生物肽cDNA序列为(此序列与实施例1中序列有两个密码子不同)：
GAT CCG CTG CCG CAT AGC CAT CGC GCC CAT AGC CTG CCG CCG TTC AAC CCG CGT CCG CCGCAC GCT GAA GGT ACC TTC ACT TCC GAC GTT TCC TCT TAC CTG GAA GGG CAG GCT GCA AAA GAATTT ATC GCT TGG CTG GTT AAA GGT CGT GGC TAA
pMFH-GLP-1-PA 6.2原核表达载体的构建同实施例步骤(1)，与实施例1的不同在于上游引物2(引物FP)，本实施例用的上游引物2(引物FP’)如下所示：
Fp’：5’-CAT AGC CTG CCG CCG TTC AAC CCG CGT CCG GCT CAC GCT GAA GGT ACC-3’。
(2)本实施例二级种子的制备与实施例1相同。
(3)发酵和诱导：将二级种子接种于发酵培养基中，发酵罐培养条件：5L发酵罐(台湾Bio-top公司，型号：BTF-A5L)工作体积为3.5L，接种量为10％(体积百分比)，发酵温度为37℃，溶氧通过调节通气量与搅拌速度(0～1000rpm)控制在40％、pH值控制在7.0，发酵过程中通过加2mol/L HCl与2mol/L NaOH来调节pH值，发酵时长为11h；在接种后3h开始慢速流加乳糖诱导前补料液200ml(1h流加完)，此时发酵液的pH值会一直下降，因为葡萄糖代谢会产酸，当流加进去的葡萄糖耗完后pH值会开始上升，此时进入对数生长期前中期，接种后5h开始流加乳糖诱导液200ml(1.5h补完)进行诱导目的蛋白的表达，诱导起始时的OD600值为30.52，乳糖诱导的终浓度为12.5g/L，加完诱导液后立即补加乳糖诱导后补料液200ml(2h流加完)，持续诱导6h，得到GLP-1类似物包涵体蛋白；
发酵培养基、补料液、诱导液组分与实施例1一样。
实验结果：OD600达到93，菌体湿重为82.8g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-PA6.2占菌体总蛋白的量为49.2％，重组工程菌BL21(DE3)/pMFH-GLP-1-PA6.2高密度培养时的生长情况如图4所示，不同时间蛋白表达情况见图5，图4和图5说明本发明所述的发酵方法同样适合于其它GLP-1类似物包涵体蛋白的发酵生产。
对比实施例
(1)本实施例二级种子的制备与实施例1相同。
(2)发酵和诱导：同实施例1，区别在于使用IPTG诱导液，具体步骤如下：将二级种子接种于发酵培养基中，发酵罐培养条件：5L发酵罐(台湾Bio-top公司，型号：BTF-A5L)工作体积为3.5L，接种量为10％(体积百分比)，发酵温度为37℃，溶氧通过调节通气量与搅拌速度(0～1000rpm)控制在40％、pH值控制在7.0，发酵过程中通过加2mol/L HCl与2mol/L NaOH来调节pH值，发酵时长为12h；在接种后2.5h开始慢速流加诱导前补料液200ml(1h流加完)，此时发酵液的pH值会一直下降，因为葡萄糖代谢会产酸，当流加进去的葡萄糖耗完后pH值会开始上升，此时进入对数生长期前中期，接种后5h开始流加IPTG诱导液200ml(1.5h补完)进行诱导目的蛋白的表达，诱导起始时的OD600值为34.86，IPTG诱导的终浓度为1mmol/L，加完诱导液后立即补加诱导后补料液200ml(2h流加完)，持续诱导7h，得到GLP-1类似物包涵体蛋白；
发酵培养基与微量元素溶液的组成同实施例1；
所述的诱导前补料液的组成为：Glucose 300g/L、MgSO4·7H2O 10g/L、NH4Cl40g/L，用去离子水配制；
所述的诱导后补料液的组成为：Glycerol 300g/L、MgSO4·7H2O 5g/L，用去离子水配制；
所述的IPTG诱导液的组成为：Yeast extract 150g/L、MgSO4·7H2O 5g/L，用去离子水配制，诱导前(灭菌后)添加IPTG至终浓度为1mmol/L；
5L发酵罐实验时以上两种补料液与诱导液各配200ml，115℃，灭菌20min。
实验结果：OD600达到74.7，菌体湿重为54.7g/L菌液，融合蛋白MFH-GLP-1-DP6.2占菌体总蛋白的量为49.3％。此结果说明1mM IPTG诱导目的蛋白表达的水平稍高于乳糖，但使用IPTG诱导后的终OD600与菌体湿重均小于使用乳糖诱导后的值，从而进一步说明乳糖不仅能诱导目的蛋白表达还能作为C源被利用促进菌的生长。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将已转化利用pMFH载体和目的基因构建得到的重组载体质粒的宿主菌进行活化，依次制备一级种子和二级种子；
（2）发酵和诱导：将二级种子接种于发酵培养基中，在接种后2.5～4h开始慢速流加乳糖诱导前补料液，乳糖诱导前补料液体积与发酵罐工作体积之比为1/25～1/20，于1～2h流加完；当发酵罐内的pH值开始上升时流加乳糖诱导液进行诱导目的蛋白的表达，乳糖诱导液体积与发酵罐工作体积之比为1/25～1/20，1～2h补加完，加完诱导液后立即补加乳糖诱导后补料液，乳糖诱导后补料液体积与发酵罐工作体积之比为1/25～1/20，于2～3h内流加完，持续诱导6～8h，发酵罐中乳糖诱导终浓度为10～16g/L；
发酵培养基的组成如下：葡萄糖 2～8g/L、酵母提取物 12～30g/L、胰蛋白胨 8～24g/L、氯化钠 2～6g/L、硫酸铵 1～3g/L、磷酸氢二钠4～10g/L、磷酸二氢钾2～8g/L、柠檬酸 0.5～2.4g/L、七水硫酸镁 0.4～1.2g/L，微量元素溶液 1ml/L，用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH 6.8～7.5；
所说的微量元素溶液的组成为：FeSO4·7H2O 1.8～3.6 g/L、MnCl2·4H2O 1.2～2.8 g/L、Co(NO3)2·6H2O 2.0～4.0 g/L、CaCl2·2H2O 1.0～2.0 g/L、CuCl2·2H2O 0.1～0.3 g/L、ZnSO4·7H2O 0.2～0.4 g/L、H3BO3 0.6～1.8 g/L和Na2MoO4·2H2O 1.0～3.0 g/L溶于1mol/L HCl中，微量元素溶液过滤除菌；
所述的诱导前补料液的组成为：葡萄糖 225～450 g/L、七水硫酸镁5～10 g/L、氯化铵 15～60 g/L，用去离子水配制；
所述的诱导后补料液的组成为：甘油 150～450 g/L、乳糖50～150 g/L、七水硫酸镁 5～10 g/L，用去离子水配制；
所述的乳糖诱导液的组成为：乳糖 50～300 g/L、酵母提取物 50～300 g/L、七水硫酸镁 5～10 g/L，用去离子水配制；
步骤（2）所述发酵的培养条件为：接种量为体积百分比8～12％，发酵温度为37～40℃，溶氧通过调节通气量与搅拌速度控制在体积百分比30～50%、 pH值控制在6.8～7.5，发酵过程中通过加盐酸与氢氧化钠溶液来调节pH值，发酵时间为11～15h；所述搅拌的速度为0～1000rpm。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述的宿主菌为大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述的活化为通过摇瓶培养进行活化；摇瓶培养的条件为35～40℃、150～250rpm培养12～20h，接种量为体积百分比0.5～2％，摇瓶装液量为体积百分比10～30%；培养基为含有氨苄青霉素的LB培养基；氨苄青霉素的浓度为100μg/ml；LB培养基的组分组成如下所示：胰蛋白胨 10g/L、酵母提取物 5g/L、氯化钠 10g/L，用去离子水配制，pH值6.8～7.5。
4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述的一级种子通过以下方法制备：将活化的菌种接种于发酵基础培养基进行摇瓶培养；摇瓶培养的条件为：摇瓶装液量为体积百分比10～30%，于35～40℃、150～250rpm培养8～16h；接种量为体积百分比0.5～2％；发酵基础培养基的组分组成如下所示：胰蛋白胨 16g/L、酵母提取物 10g/L、 氯化钠 5g/L、用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH 值为6.8～7.5。
5.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述的二级种子通过以下方法制备：将一级种子接种到改进培养基中于35～40℃、150～250rpm继续活化7～10h；接种量为体积百分比0.5～2％；摇瓶装液量为体积百分比10～30％；所述改进培养基的组分组成如下所示：葡萄糖 0.5～2g/L、酵母粉 15～30g/L、胰蛋白胨 10～25g/L、氯化钠2～8g/L、硫酸铵 2～8g/L、磷酸氢二钠 6～24g/L、磷酸二氢钾2～6g/L、七水硫酸镁 0.4～1.6g/L，用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH 6.8～7.5。
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