KR100254063B1

KR100254063B1 - 재조합대장균을이용한재조합단백질의제조방법

Info

Publication number: KR100254063B1
Application number: KR1019970050023A
Authority: KR
Inventors: 이지원; 신남규; 신철수; 홍민선; 신항철
Original assignee: 신동권; 주식회사한일합섬
Priority date: 1997-09-30
Filing date: 1997-09-30
Publication date: 2000-04-15
Also published as: KR19990027555A

Abstract

본 발명은 재조합 대장균을 배지의 조성 및 주입방법 등을 조절하여 고농도로 배양한 다음 단백질 발현에 적합한 생산배지 및 배양조건을 이용하여 재조합 단백질을 고수율로 또한 그 일부를 수용성 형태로 대량생산하는 제조방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 종양괴사인자 (TNF-α)의 아미노 말단을 융합 파트너로 이용하여 외래 단백질을 T7 프로모터 등으로부터 생산할 수 있는 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 성장배지의 조성과 주입방법 등을 최적화시켜 고농도로 배양한 다음 배양된 재조합 대장균을 단백질 발현에 최적인 생산배지를 사용하여 유용한 외래 단백질을 고수율로 생산하는 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 과정에 더하여 재조합 대장균의 배양액의 pH 를 조절하거나 열충격을 가함으로 외래 단백질을 수용성의 형태로 얻는 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 의하면 발효배지 1 리터 당 재조합 단백질을 5∼15 그람 생산할 수 있으며 이중 수용성 단백질의 비율을 최대 80% 이상으로 향상시킬 수 있다.

Description

재조합 대장균을 이용한 재조합 단백질의 제조방법

본 발명은 재조합 대장균을 배지의 조성 및 주입방법 등을 조절하여 고농도로 배양한 다음 단백질 발현에 적합한 배지를 사용하여 재조합 단백질을 고수율로생산하는 방법 및 상기 재조합 단백질의 일부를 수용성 형태로 제조하는 방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 종양괴사인자 (TNF-α)의 아미노 말단을 융합파트너로 이용하여 외래 단백질을 T7 프로모터 등으로부터 생산할 수 있는 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 성장배지의 조성과 주입방법 등을 최적화시켜 고농도로 배양한 다음 배양된 재조합 대장균을 단백질 발현에 최적인 생산배지를 사용하여 유용한 외래 단백질을 고수율로 생산하는 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 재조합 대장균의 배양액의 pH 를 조절하거나 열충격을 가함으로 외래 단백질을 수용성의 형태로 얻는 제조방법에 관한 것이다.

대장균은 다른 생물체에 비하여 그의 유전자와 대사체계에 대한 정보가 가장 많이 알려져 있어 유전자 재조합 기술에 의하여 유용한 외래 단백질을 생산하기 위한 숙주로 많이 이용되고 있다.

재조합 단백질을 고효율로 생산하기 위해서는 재조합 대장균을 고농도로 배양하는 것이 요구되는데 이를 위하여 복합배지(complex medium), 합성배지(synthetic medium), 반합성배지(semi-synthetic medium)등 다양한 조성의 배지와 정속주입(constant feeding), 계단식 증가(stepwise increase), 지수적 증가(exponential), 비 성장속도(specific growth rate control)에 의한 조절, pH 및 용존산소에 의한 조절(pH-stat, DO-stat), 포도당 및 초산농도에 의한 조절(glucose, acetic acid concentration control)등 다양한 배지주입방법들이 개발되어 있으나 실질적 배양방법에서는 각각의 재조합 균주에 대하여 특이적으로 작용하는 배양방법과 최적조건이 존재하여 배지 주입방법의 선택과 배지를 포함한 배양방법의 최적화가 고농도 균체배양의 효율성을 좌우한다 (Lee, 1996,TIBTECH.14, 98-105).

재조합 대장균의 단백질 합성은 성장환경과 관련된 균체 내의 여러 생리/생태학적인 요인들 [플라스미드 안정성 및 카피수, 전사 및 해독 효율, 발현단백질의 용해도, 단백질분해(proteolysis), 막 보전(membrane integrity) 등]과 밀접한 관계가 있으므로 수율 및 생산성을 극대화하는 최적 배양조건을 확립해야 한다. 따라서 재조합 단백질을 고효율로 발현시키기 위해서는 고농도로 배양된 재조합 대장균의 배양액에 IPTG등 적당한 발현유도인자의 투입과 단백질 생산에 적당한 조성의 배지를 적합한 방법에 의하여 주입해야 하며 필요에 따라 그 조성과 방법등을 달리하여 재조합 융합 단백질을 생산해야 한다 (Yee and Blanch, 1992,Bio/Technol. 10, 1550-1556).

재조합 단백질에서 과량의 재조합 단백질을 발현시킬 경우 일부 혹은 대다수의 단백질이 응집체(inclusion body)를 형성한다. 단백질이 과량생산되어 그 단백질이 가지는 용해도의 한계를 넘어 서거나 발현된 펩타이드(peptide)가 폴딩(folding)초기의 중간체 단계에서 상호간에 또는 다른 아미노산등의 불순물과 분자 상호간의 다이설파이드본드(intermolecular disulfide bond) 또는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의하여 결합하게 되면 구조가 왜곡되어 불용성으로 단단하게 굳어진다(Anna Mituraki et al., 1989,Bio/Technol. 7, 690-697).

단백질이 응집체로 생산될 경우 이로부터 활성을 갖춘 단백질을 순수 분리해내기 위해서는 생체외 변성/리폴딩(in vitrodenaturation/refolding), 설폰화 반응(sulfitolysis), 투석(dialysis), 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reversed-phase HPLC) 등으로 이루어진 복잡한 분리/정제과정을 거쳐야 한다. 각 정제단계에서의 일부 단백질 손실은 불가피하며 특히 리폴딩 단계의 낮은 효율은 경우에 따라 전체 생산공정의 수율 저하를 초래할 정도로 큰 문제인 것으로 알려져 있다. 리폴딩 공정은 유레아(urea)나 구아니딘에이치씨엘(guanidine-HCl)에 환원제(reducing agent)를 함께 처리하여 응집체를 수용성으로 만든 뒤 느린 속도의 산화과정을 거치면서 활성을 가진 단백질을 얻는 공정인데, 단백질 구조에 따라 리폴딩이 불가능한 경우도 있으며 가능하다 하더라도 대부분 이 과정에서 수율이 낮아 생산된 단백질 중 상당량의 손실을 감수해야 한다 (Fiona A. O. Marston, 1986,Biochem. J.240, 1-12).

재조합 단백질의 생산에서 이와같은 응집체형성을 최소화하기 위하여 재조합 단백질 발현 벡타 구성 시 목적 단백질을 수용성이 높은 아미노산과 결합시켜 발현시키거나 시그날 시퀀스(signal sequence)와 연결하여 페리플라즘(periplasm)으로 분비(secretion)시키는 등의 방법과 단백질 폴딩에 관여하는 샤프론(chaperone)들을 동시에 발현시키는 노력들이 있었다.

응집체의 생성을 억제하기 위해서는 발효조건의 영향도 매우 큰데 여기에 작용하는 요소로는 배지조성, 배지주입방법, 비 성장속도, 온도, pH, 발현유도조건 등이 있으며 이에 더하여 각종 이온과 화합물등 외부 첨가물질도 작용하는 것으로 알려져 있다.

응집체의 형성은 분자간 상호작용(intermolecular reaction)에 의한 단백질 응집(protein aggregation)에 의한 것으로, 열역학적으로 에너지 장벽(energy barrier)이 존재하는 흡열반응이므로 단백질의 수용성 발현을 위해서는 낮은 배양온도가 일반적으로 유리한 것으로 알려져 있다. 칼머 등 (Chalmers 등, 1990,Appl. Environ. Microbiol., 56, 104-111)은tac프로모터를 이용하여 β-락타메이즈(β-lactamase), 인간 상피성장인자(human epidermal growth factor) 등을 발현시켰는데 20-25℃의 낮은 온도에서 수용성 단백질의 양이 현저히 증가하였다. 특히 인간 상피성장인자의 경우는 낮은 온도에서 세포 파쇄(cell lysis)를 최소화하며 발현된 재조합단백질의 70%이상이 수용성으로 발현되었다. 그러나 온도 요인은 GroEL (Chaperonin), HtpG (Stress 90) 등의 열 충격(heat shock) 단백질, 온도유도 프로모터 시스템(thermoinducible promoter system), 융합단백질 등과 관련하여 케이스(case) 별로 그 영향이 달리 나타날 수도 있으며, 경우에 따라 열 충격이 수용성 단백질 발현에 유리하게 이용될 때도 있다. 필러 등(Pilon 등, 1996,Biotechnol. Prog., 12, 331-337)은 유비퀴틴(ubiquitin)의 C-말단 17개 아미노산 서열을 융합 파트너로 이용하여 8 내지 53개의 아미노산으로 구성된 15개의 펩타이드(peptide)를 발현시키면서 열 충격을 가하여 모두 수용성으로 발현시킨 바 있다.

pH가 단백질 폴딩에 미치는 영향은 단백질의 등전점 (isoelcetric point, pI)에 따라 다르고 폴딩 효율을 극대화하는 최적 pH가 존재하나, 일반적으로 낮은 pH에서 응집체 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 스트랜버그와 엔포스는 (Strandberg and Enfors, 1991,Appl. Environ. Microbiol., 57, 1669-1674)은 온도유도 시스템을 이용하여 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase)를 융합단백질의 형태로 발현시킨 결과, 샤프론의 영향으로 42℃에서 수용성 단백질 비율이 증가하였으나 pH 5.5 이하에서는 응집체 생성이 급격히 증가하였음을 보고하였다.

프로모터의 유도(induction )정도를 조절하여 단백질 발현량을 감소시킴으로써 응집체 생성을 억제할 수도 있다. 즉,tac, T7, lac프로모터의 경우는 IPTG 또는 락토스(lactose )농도를,λp _L 의 경우는 온도 전이(shift) 정도를 조절함으로써 단백질 발현량을 낮게 조절할 수 있으며, 또한 유기 질소(organic nitrogen)의 섭취(feeding) 속도 등 배양조건의 효율적인 제어를 통해서도 단백질 발현 정도를 조절할 수 있다 (Tsai et al., 1987,J. Ind. Microbiol.2, 181-187).

외래단백질을 수용성으로 생산하는 공정이 성공적으로 개발된다면 재조합 대장균이 다른 고등세포 (yeast, insect, CHO cell 등) 유래의 재조합 균주들에 비해 갖는 일부 단점들이 보완되어 그 이용범위와 공정의 경제성이 크게 증가할 것으로 기대된다.

이에 본 발명자들을 재조합 대장균에서 외래 단백질을 대량 제조하기 위하여, 재조합 대장균을 성장배지의 조성과 주입방법 등을 최적화시켜 고농도로 배양한 다음 종양괴사인자-α의 아미노 말단을 융합파트너로 이용하는 재조합 단백질을 생산배지의 조성, 발현유도 물질의 농도, 배지공급 속도 등을 최적화시켜 고수율로 발현하였고, 이들 과정 중에서 대장균 배양액의 pH, 온도, 유도발현물질 등을 조절하여 수용성 형태의 재조합 단백질의 비율이 증대되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 재조합 대장균을 배지의 조성 및 주입방법 등을 조절하여 고농도로 배양한 다음 단백질 발현에 적합한 배지를 사용하여 재조합 단백질을 대량으로 생산하며 또한 배양조건을 조절하여 상기 재조합 단백질의 수용성 비율을 증가시키는 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.

도 1은 최적화된 반합성 배지를 이용하여 pH에 의한 조절(pH-stat) 방법으로 재조합 대장균을 고농도로 배양한 결과를 나타낸 것이고,

도 2는 최적화된 반합성 배지를 이용하여 지수적 증가에 의한 배지주입 조절 방식으로 재조합 대장균을 고농도로 배양한 결과를 나타낸 것이고,

도 3은 최적화된 합성 배지를 이용하여 지수적 증가에 의한 배지주입 조절방식으로 재조합 대장균을 고농도로 배양한 결과를 나타낸 것이고,

도 4는 반응표면방법 (response surface methodology , 이하 “RSM”이라 약칭함)에 의한 생산배지 최적화의 반응표면도를 나타낸 것이고,

도 5는 재조합 융합단백질 발현율에 대한 이소프로필티오-β-D-갈락토사이드 (isopropylthio-β-D-galactoside , 이하 “IPTG ”이라 약칭함) 첨가 농도의 영향을 나타낸 것이고,

도 6은 재조합 융합단백질의 발현율에 대한 생산배지 주입속도의 영향을 나타낸 것이고,

도 7은 생산공정 말기의 배입주입 방법이 균체농도 및 재조합 융합단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이고,

도 8은 2단계 싸이클릭(cyclic) 유가식 배양에 의한 재조합 융합단백질 생산수율 및 생산성을 나타낸 것이고,

도 9는 최적화된 배양조건에서의 사람성장호르몬 생산을 나타낸 것이고,

도 10은 최적화된 배양조건에서의 글루카곤 생산을 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 종양괴사인자-α(TNF-α)의 아미노말단을 융합파트너로 이용하여 외래 단백질을 T7 프로모터로부터 생산할 수 있는 재조합 대장균을 성장배지의 조성과 주입방법을 조절하여 고농도로 배양한 다음 이에 다시 생산 배지의 조성, 주입속도 및 발현유도물질의 농도 등을 조절하여 재조합 단백질을 고수율로 얻는 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 과정에서 대장균의 배양과 단백질 생산을 동시에 진행시키면서 반복적 조업이 가능한 2단계 싸이클릭 유가식 공정으로 재조합 단백질을 얻는 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 대장균의 배양액의 pH 를 조절하거나 열충격을 가하여 또는 배양액 내의 락토스, 포도당 및 효모 추출물의 농도를 조절함으로 재조합 단백질을 수용성의 형태로 얻는 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 [TNF-α 아미노말단ㆍ절단부위(met 또는 asp₄lys)ㆍ 외래 단백질]로 구성된 융합단백질을 코우딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 대장균을 고농도로 배양한 다음, 이에 다양한 조성의 생산배지를 차례로 주입하고 배양조건을 조절하여 상기 대장균에서 외래 단백질을 발현시킨다.

1) 재조합 대장균의 고농도 배양

본 발명은 재조합 대장균의 고농도 배양을 위하여, 기존의 배양방법들 중 pH-조절 및 지수적 증가에 의한 배지주입 방법을 최적화시켜 이용한다. 본 발명의 방법은 pH-조절 방법에 있어서 아세테이트 축적에는 효율적이지만 균체의 비성장 속도를 세밀하게 조절하는데는 어려운 점을 개선하고, 지수적 증가에 의한 방법에 있어서는 비성장 속도는 효율적으로 조절할 수 있으나 아세테이트가 과량으로 축적될 수 있어 균체의 성장이나 단백질의 합성이 손상되는 문제점을 개선한 것이다.

본 발명은 성장배지로는 반합성 복합배지와 합성배지 등을 사용할 수 있다.구체적으로 본 발명에서는 pH 조절에 의한 유가식 배양을 위하여 포도당과 효모추출물을 주성분으로 하는 반합성 복합배지의 최적 배지조성을 확립하였는데, 바람직하기로는 포도당/효모추출물 (w/w) 비가 0.5∼3.5 범위인 것을 사용한다.

이 때 동일한 단백질 생산조건임을 전제로 할 때 재조합 단백질 생산량은 균체량에 직접 비례하므로, 동일 부피(1 리터)의 배지 주입시 획득된 균체량을 기준으로 최적의 포도당/효모추출물(w/w)비를 결정하였다.

본 발명은 상기 반합성 배지만으로는 높은 비성장속도가 요구되는 고농도 배양을 할 수 없어 (도 2참조), 암모니아를 질소원 및 pH 조절인자로 동시에 이용하고 포도당 농도를 최적화한 합성배지를 지수적으로 주입하는 유가식 배양을 통하여 재조합 대장균을 고농도로 발효 배양하였다.

구체적으로 본 발명은 아세테이트 생성을 억제할 수 있는 합성배지의 포도당 농도를 결정하는데, 암모니아수로 배양액의 pH를 6∼8 의 범위로 조절함과 동시에 포도당 농도는 600 ~ 850 g/L 범위인 것이 바람직하다 (도 3참조). 상기 합성배지는 비성장속도 0.7 hr^-1까지 초산 생성을 억제하면서 재조합 대장균을 성장시킴을 연속 배양을 통하여 확인하였다.

2) 재조합 단백질의 최적 생산조건 확립

본 발명은 재조합 단백질을 대량으로 생산하기 위하여 생산배지의 조성, 발현유도 물질의 농도, 배지공급 속도 등을 최적화시킨다.

구체적으로 반응 표면 방법 (response surface methodology, RSM)이라는 통계적인 방법을 통하여 포도당과 효모추출물을 주성분으로 하는 생산배지 조성을 최적화한 결과, 포도당 210∼340 g/L, 효모추출물 120∼270 g/L 이 최적 생산배지 조성임을 확인하였다(도 4참조).

또한 이 때 발현유도 물질로 IPTG 가 사용되는데 구체적으로 첨가되는 발현 유도물질(IPTG)의 농도는 발현유도시의 재조합 대장균 균체질량 g 당 3∼10 mg 범위인 것이 바람직하다.

발현 유도물질의 첨가후 균체의 배양 및 단백질 발현에 적절하게 생산배지의 공급속도가 조절되어야 하는데 구체적으로 본 발명의 생산 배지를 사용한 유가식 배양에서 0.3∼0.6 mL/g 세포/시간의 배지 공급속도가 바람직하다.

재조합 융합단백질 생산공정의 후반부에 재조합 균체의 활성이 저하된 상태에서 생산배지가 과도하게 투입되면 균체의 희석과 초산축적에 의하여 재조합 융합단백질의 생성억제 및 균체 파괴가 일어나게 되는데, 본 발명에서는 이러한 현상을 막기 위하여 생산공정 말기의 배지주입방법을 pH 에 의한 조절방식으로 전환한다. 실제로 생산공정 말기에도 정속주입방법을 계속하는 것과 초산이 배양액 내에 축적되는 시점에서 생산배지의 주입방법을 pH 조절방식으로 전환한 것을 비교한 결과 후자에 의한 것이 균체의 생존과 단백질 발현에 유리하다(도 7참조).

3) 생산성 향상을 위한 2단계 싸이클릭(cyclic) 유가식 공정 확립

본 발명은 상기 과정에서 재조합 대장균을 고농도로 배양함과 동시에 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 2단계의 싸이클릭 유가식 배양방법을 제공한다.

일반적으로 재조합 단백질이 유도발현되는 유가식 공정은 한 대의 발효기에서 균 성장기와 단백질 생산기로 나뉘어 조업되는 단일단계 공정이다. 단일단계 공정에서는 일단 균을 고농도로 배양한 이후에 단백질 생산이 이루어지므로 정작 고농도 배양액에서의 단백질 생산기간은 전체 공정에서 어느 한정된 부분에 불과하다. 그러나 고농도 배양과 단백질 생산을 동시에 진행시키면서 반복적 조업이 가능한 2단계 싸이클릭 유가식 공정을 이용하면 목적 단백질의 생산성을 크게 향상시킬 수 있으며 동일 생산성을 얻기 위한 발효기의 크기도 크게 줄일 수 있다.

본 발명에서는 재조합 단백질의 생산성 향상을 위하여 상기 1)재조합 대장균의 고농도 배양 단계에서 하기 표 5 에 나타난 바와 같이 2단계 싸이클릭 유가식 공정(Shin et al., 1997Biotechnol. Prog. 13, 249-257)을 적용하여 대장균의 고농도 배양과 단백질 생산을 동시에 진행시킴으로써 단위 부피당 단백질 생산성을 10∼44% 향상시켰다 (도 8참조).

4) 수용성 재조합 단백질 생산하기 위한 발효조건 확립

본 발명은 상기의 발효방법에 의하여 고농도로 배양된 재조합 대장균으로부터 재조합 단백질을 수용성의 형태로 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 재조합 단백질을 수용성의 형태로 제조하기 위하여 재조합 대장균의 배양액의 pH, 온도, 발현유도물질 농도 등을 최적화하였다.

실제로 낮은 pH 에서 응집체 생성이 증가하고 열 충격이 단백질을 수용성 형태로 제조하는데 효과가 있으며, 프로모터의 유도(induction) 정도를 조절하여 단백질 발현량을 감소시킴으로써 응집체 생성을 억제할 수도 있다.

구체적으로 본 발명에서는 상기 단백질 발현을 위해 최적화된 생산배지를 주입하면서 배양액의 pH 를 조절하여 발현된 재조합 융합단백질 중의 일부를 수용성으로 분리하였으며 바람직한 pH 는 7∼8.5 범위이다.

또한 상기 단백질 발현에 최적화된 생산배지를 이용한 재조합 유전자의 유도발현에 앞서 40∼50℃ 온도 범위에서 0.5∼1.5시간 동안 열 충격을 가함으로써 발현된 재조합 단백질 중 수용성 단백질의 비율을 80% 이상 향상시킬 수 있다.

마찬가지로 상기 단백질 발현에 최적화된 생산배지에서 락토스를 발현 유도인자 및 탄소원으로 이용하면 IPTG 를 유도인자로 이용하는 경우에 비해 재조합 융합단백질의 발현속도를 조절하여 수용성 단백질의 비율을 크게 향상시킬 수 있다.

실제로 배양액으로 락토스가 20 - 200 g/L 농도 범위이고 포도당이 50 - 250g/L 농도 범위이며, 효모추출물은 180∼250g/L 농도 범위로 이루어진 생산배지를 사용하는 것이 바람직하다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1＞ 반합성 복합배지 조성 최적화 및 pH-조절에 의한 고농도 배양

가) 균주 및 배지

[TNF-α 아미노말단ㆍ절단부위(met 또는 asp₄lys)ㆍ 외래 단백질]로 구성된 융합단백질을 코우딩하는 유전자 및 T7 프로모터를 포함하는 발현 벡터 pT2M2PI로 형질전환된 대장균 형질전환체 E.coli BL21 (DE3 + pT2M2PI) (한국종균협회에서 입수;수탁번호 KCCM 10060)를 이용하였다.

재조합 대장균의 종균 배지의 조성은 1L당 트립톤 10g, 효모추출물 10g, 염화나트륨(NaCl) 5g의 LB배지이며 동일한 성분의 아가 플레이트에서 37^oC에서 배양한 다음 생성된 콜로니를 15% 글리세롤 용액에 현탁시켜 -70^oC에 보관하였다. 배양시에는 -70^oC에 보관중인 재조합 대장균을 상기와 동일한 아가 플레이트에 도말하여 37^oC에서 밤새 배양한 다음 생성된 콜로니를 종균 배지에 다시 접종하여 37^oC, 200rpm으로 교반하면서 배양하였다.

16시간이 경과한 다음 이 종균 배지를 10%농도가 되도록 회분 배양 배지가 들어있는 5L 발효조에 접종하여 37^oC, pH 6.75 조건에서 배양을 시작하였다. 배지 중의 포도당이 모두 소모되면 유가식 배양의 성장 배지를 발효조의 조절 장치(control module)에 연결된 펌프를 이용하여 pH-조절(pH-stat) 방법으로 주입하였다.

회분 및 유가식 배양을 위해 이용된 배지의 조성은 아래와 같다.

(1) 회분 배양(Batch cultivation)(1L 당)

① KH₂PO₄5g

K₂HPO₄3g

(NH₄)₂SO₄1.67g

FeSO₄ㆍ7H₂O 0.1g

CaCl₂ㆍ2H₂O 0.02g

효모 추출물 20g

② 포도당 20g

③ MgSO₄ㆍ7H₂O 2g

④ 티아민-HCl 0.1g

⑤ 암피실린 0.2g

이때 상기 성분 ①, ②, ③을 분리하여 각각 121^oC에서 15분간 멸균한 후 혼합하였고, 배지를 혼합한 다음 ④, ⑤의 성분을 필터 주사기(syringe filter, 0.22u

μ

m)로 첨가하였다.

(2) 유가식 배양 (Fed-batch cultivation)(1L 당)

① (NH₄)₂SO₄1.5g

효모 추출물 *

② Glucose *

③ MgSO₄ㆍ7H₂O 1g

④ 암피실린 1g

* 다양한 양

이때 상기 성분 ①, ②, ③을 분리하여 각각 121^oC에서 15분간 멸균한 후 혼합하였고, 배지를 혼합한 다음 ④의 성분을 필터 주사기(syringe filter, 0.22u

μ

m)로 첨가하였다.

나) 고농도 균체의 성장을 위한 반합성 복합배지조성의 최적화

고농도 균체의 성장을 위하여 상기 가) (1)의 조성으로 회분배양을 실시하였고, 유가식 배양을 위하여 주입되는 반합성배지중 포도당/효모추출물(w/w)비에 따른 균체 수율 및 획득양을 비교하기 위하여 표 1에서와 같이 포도당/효모추출물(w/w)비를 달리하며 고농도 배양을 실시하였다.

포도당/효모추출물(w/w) 비에 따른 균체 수율 및 획득량.

포도당(g/L)	효모추출물(g/L)	포도당/효모추출물비율	균체수율(g 세포 /g 포도당)	성장배지 1L 주입 시 획득 균체량 (g)
150	262	0.573	1.450	217.5
200	233	0.858	1.162	232.4
250	204	1.225	0.957	239.3
300	175	1.714	0.796	238.8
350	146	2.397	0.663	232.1
400	117	3.419	0.546	218.4
450	87	5.172	0.435	195.8
500	58	8.621	0.329	164.5

그 결과 포도당/효모추출물(w/w)비가 0.5 ~ 3.5일 때 획득균체량이 최고 수준으로 증가함을 발견하였다.

상기의 과정으로 결정된 최적화된 배지조성에서 pH-조절에 의한 유가식 배양을 실시하여 고수율의 고농도 배양법을 확립하였다 (도 1참조).

<실시예 2＞ 반합성배지의 지수적 주입에 의한 재조합 대장균 고농도 배양

높은 비성장속도에 의한 고농도 균체성장을 위하여 실시예 1의 방법중 복합질소원을 포함하는 반합성배지의 주입방법을 달리하여 지수적 주입을 실시하였다. 그러나 포도당과 초산이 과량으로 축적되는 문제가 발생하여 고농도 배양에 어려움이 있었다(도 2참조).

<실시예 3＞ 합성배지의 초산 생산 억제 기능 및 합성배지의 지수적 주입에 의한 고농도 배양.

가) 합성배지의 초산 생성 억제기능

초산 축적 없이 높은 비성장속도를 유지하기 위하여 합성배지를 사용하였다.

상기 재조합 발현 벡터 pT2M2PI로 형질전환된 재조합 대장균의 종균보관 및 배양은 상기실시예 1의 가)의 방법에 의하였고 회분 배양을 위한 합성배지에 접종하여 37^oC, pH 6.75 조건에서 배양을 시작하였다.

질소원 및 pH조절 인자로 수산화암모늄(NH₄OH)이 조절장치(control module)에 의하여 배지 중으로 주입되었다. 배양 전과정에서 배양액의 용존산소농도는 60% 이상을 유지시켰다. 회분 배양을 위해 이용된 합성배지의 조성은 아래와 같다.

① KH₂PO₄13.3g

(NH₄)₂HPO₄4g

② 포도당 20g

구연산 1.7g

③ MgSO₄ㆍ7H₂O 1.2g

④ 티아민-HCl 0.1g

암피실린 0.2g

⑤ 소량 금속 용액 20mL

μ

m)로 첨가하였다. 상기 소량 금속 용액(trace metal solution)은 1L 중에 EDTA 0.42g, CoCl₂ㆍ6H₂O 0.125g, MnCl₂ㆍ4H₂O 0.75g, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.11g, H₃BO₃0.15g, Na₂MoO₄ㆍ2H₂O 0.125g, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.85g, FeCl₃ㆍ6H₂O 5g을 포함한다.

상기 합성배지로 연속배양한 결과 표 2에 나타난 바와 같이 높은 비성장속도에서 초산의 축적없이 균체가 성장하였다.

합성배지를 이용한 연속배양 결과(투입 포도당농도 10 g/L)

희석속도(D, h-1)	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7	0.8^*
균체농도(X, g/L)	3.39	3.33	3.70	3.98	3.94	3.95	4.14	0
배양액중 포도 당농도 (g/L	0.065	0.59	0.064	0.067	0.061	0.063	0.075	0
배양액중 초산 농도 (g/L)	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.1	0.0
* 균 세척(wash out) 조건

나)합성배지를 이용한 고농도 배양

초산 축적을 억제하며 배양액의 부피 증가를 최소화하기 위하여 하기 표 3의 합성배지를 사용한 지수적 주입에 의한 유가식 배양을 실시하였다.

합성배지 조성.

화합물	농도 (g/L)
포도당	600∼850
MgSO_4·7H₂O	20
소량 금속 용액*	20 (mL)
암피실린	1
*소량 금속 용액(g/L) ; EDTA (0.75), CoCl₂6H₂O (0.2), MnCl₂4H₂O (1.2), CuSO₄5H₂O (0.185), H₃Bo₃(0.25), Na₂MoO₄2H₂O (0.2), ZnSO₄7H₂O (1.05), FeCl₃6H₂O (2.205)

회분식 배양에서 포도당이 모두 소모된 후, 유가식 배양을 위한 상기 합성배지(표 3)를 하기식에 의하여 지수적 방법으로 주입하였다. 질소원 및 pH조절 인자로 수산화암모늄이 조절 장치에 의하여 배지 중으로 주입되었다.

X_i+1V_i+1=X_iV_iExp(μΔt)

V_i+1=V_i+F_iΔt

상기 식에서, 하첨자

i

와

i+1

은

t = t^′와 t =t^′+Δt

시간에서의 설계 변수들을 나타내고,

Δt

는 조절 소프트웨어에서의 계산 간격을 의미한다(

Δt = 30s

).

F

는 의사 정상상태(quasi-steady state)에서 탄소원의 질량수지식으로부터 구할 수 있는 지수적으로 증가하는 배지 공급속도(L/hr)(exponentially-increasing volumetric feed rate) 이다. 또한

μ

는 균체의 비성장속도(hr^-1),

Y_x/s

는 균체 질량 수율(g/g),

s_o

는 공급 배지내 포도당의 농도(g/L),

x

는 발효기내 균체 농도(g/L),

v

는 발효액의 부피(L)를 의미한다.

그 결과 상기 합성배지를 지수적으로 주입하는 유가식 배양방법에 의하면 재조합 대장균을 고농도로 배양할 수 있음을 확인하였다(도 3참조).

<실시예 4＞ 재조합 단백질 생산을 위한 발효조건 최적화

가) RSM에 의한 생산배지 조성 최적화

상기 실시예 1, 3의 방법을 사용하여 고농도 배양한 후 재조합 단백질 생산을 위하여 생산배지 조성을 최적화 하였다. 최적화에 사용된 방법은 RSM였으며, IPTG의 첨가에 의한 유도발현 이후에는 각각의 생산배지를 정속주입하였다 (도 4참조).

RSM을 통한 생산배지 조성의 최적 결과

배지중 성분의 농도(g/L)	RSM에 의한 코드값	재조합 융합단백질 발현율(%)
포도당	효모추출물	재조합 융합단백질 발현율(%)	포도당	효모추출물
300	250	1	1	13.7
300	150	1	-1	12.2
200	250	-1	1	7.7
200	150	-1	-1	8.0
250	200	0	0	14.6
350	200	2	0	8.8
150	200	-2	0	13.3
250	300	0	2	10.0
250	100	0	-2	4.9

그 결과 포도당 210∼340 g/L, 효모추출물 120∼270 g/L 이 최적 생산배지 조성임을 확인하였다.

나) 최적 IPTG 첨가량 결정

상기 가)의 방법을 사용하여 최적화된 생산배지에서 투입해야 할 최적의 IPTG 첨가량을 결정하였다(도 5참조).

3∼10 mg IPTG/g 세포 일 때 가장 높은 수준의 발현을 보였다

다) 생산배지의 최적 주입속도 결정

상기 가), 나)의 방법으로 확인된 최적 생산조건에 더하여, 최적화된 생산배지의 최적주입속도를 결정하였다(도 6참조).

0.3∼0.6 mL/g 세포/hr 의 속도에서 가장 높은 수준의 재조합 융합단백질의 발현을 보였다.

라) 생산공정 말기의 배지 주입방법이 균체농도 및 재조합 융합단백질 발현에 미치는 영향

상기 가), 나), 다)의 방법을 통하여 최적화된 생산조건으로 사람인슐린 융합단백질이 유도발현된 이후, 배양 말기에 배지주입법을 pH-조절에 의한 방법으로 전환하였다. 그리하여 균체의 요구량을 초과하는 배지주입에 의한 초산축적과 배양액이 희석되는 것을 방지한 결과 정속주입을 계속한 경우에 비해 재조합 융합 단백질의 발현을 높게 유지할 수 있었다(도 7참조).

<실시예 5＞ 최적 발효조건에서의 사람 인슐린 생산

외래 단백질 유전자로 사람 인슐린 유전자가 삽입된 발현벡터 pT2M2PI로 형질전환된 재조합 대장균 형질전환체 E.coli BL21 (DE3 + pT2M2PI) (한국종균협회에서 입수;수탁번호 KCCM 10060)에 실시예 1, 3, 4에서 최적화된 고농도 배양 및 재조합 단백질 제조방법을 적용하여 5g/L 이상의 재조합 사람 인슐린을 생산하였다(도 7참조).

<실시예 6＞ 최적 발효조건에서의 사람성장호르몬 생산

외래 단백질 유전자로 사람 성장호르몬 유전자가 삽입된 발현벡터 pT2GH로 형질전환된 재조합 대장균 형질전환체 E.coli BL21 (DE3 + pT2GH) (한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에서 입수;수탁번호 KCTC 8786P)에 실시예 1, 3, 4에서 최적화된 고농도 배양 및 재조합 단백질 제조방법을 적용하여 15g/L 이상의 재조합 사람 성장호르몬을 생산하였다(도 9참조).

<실시예 7＞ 최적 발효조건에서의 글루카곤 생산

외래 단백질 유전자로 글루카곤을 암호하는 유전자가 삽입된 발현벡터 pT1D4KG로 형질전환된 재조합 대장균 형질전환체 E.coli BL21 (DE3 + pT1D4KG) (한국종균협회에서 입수;수탁번호 KCCM 10074)에 실시예 1, 3, 4에서 최적화된 고농도 배양 및 재조합 단백질 제조방법을 적용하여 6g/L 이상의 재조합 글루카곤을 생산하였다(도 10참조).

<실시예 8＞ 2단계 싸이클릭(cyclic) 유가식 배양에 의한 재조합 사람인슐린 생산

재조합 사람인슐린 제조 공정중 실시예 1, 3, 4의 방법과 더불어 고효율의 생산성을 획득하기 위하여 2단계 싸이클릭 유가식 배양을 실시하였다 (도 8참조).

성장단계 발효기 (발효기 1)에서는 적정 농도(S_F)의 성장제한 기질을 포함하는 성장배지의 주입속도(F)를 조절함으로써 하기 표 5와 같이 일정 고농도에서 일정 비성장속도를 유지하며 재조합 대장균을 배양하고, 배양액 부피가 특정 수준 (V_g,max)에 이르렀을 때 일정량(V_0i)을 생산단계 발효기(발효기 2)로 이송한다. 발효기 2에서는 프로모터 유도발현과 동시에 생산배지가 주입되며 단백질 생산이 진행되는데, 동시에 발효기 1에서는 전과 동일한 성장배지가 주입되며 균 배양이 다시 계속된다. 발효기 1의 배양액 부피가 V_g,max에 이르는 순간 발효기 2내의 배양액이 모두 수확(harvest)되고 (한 싸이클 종료), 발효기 1로부터 배양액 (V_0i)이 다시 이송된 후 앞의 과정이 반복된다 (다음 싸이클 시작).

주요한 공정 변수들인 F, S_F, V_0i, V_0g등은 하기 식들에 의해 결정된다.

F = dV/dt = V_0gμexp(μt)

S_F= X_g/(Y_X/S)

V_0i= V_0g[exp(μt_ind) -1]

V_0g= V_g,max/exp(μt_ind)

μ, X_g, t_ind은 차례로 발효기 1에서의 비성장속도, 균체농도, 발효기 2에서의 단백질 생산기간을 의미한다.

그 결과도 8에서 나타난 바와 같이 단위부피당 단백질 생산성을 10-44% 향상 시켰다.

2단계 싸이클릭(cyclic) 유가식 공정에 의한 반복적 균체 성장 공정.

운전방법	시간(hr)	건조균체량(g/L)(배양액부피, L)	비 성장속도(hr^-1)
회분배양	0.00	0.40
	2.00	0.96	0.441
	4.00	5.09	0.835
	6.00	10.85	0.379
	6.50	11.79	0.165
유가식 배양(pH-stat)	10.00	20.95	0.192
	13.00	31.80	0.173
	16.00	43.46	0.151
	18.75	52.15	0.126
	25.50	73.61	0.140
배양세포 수확
유가식 배양(지수적 주입: μ=0.12 hr^-1)	25.50	73.61(2.00)	0.140
	26.50	74.62(2.25)	0.134
	28.00	75.30(2.70)	0.126
	30.00	74.62(3.43)	0.116
	32.50	73.95(4.63)	0.116
배양세포 수확
유가식 배양(지수적 주입: μ=0.10 hr^-1)	32.50	73.95(2.00)	0.116
	34.50	73.27(2.44)	0.095
	37.00	72.25(3.14)	0.094
	39.50	71.23(4.03)	0.094
	41.00	71.57(4.68)	0.103
배양세포 수확
유가식 배양(지수적 주입: μ=0.08 hr^-1)	41.00	71.57(2.00)	0.103
	43.50	72.93(2.44)	0.088
	46.00	72.59(2.98)	0.078
	49.00	71.91(3.79)	0.077
	51.00	71.23(4.45)	0.075
	51.50	71.23(4.63)	0.080

<실시예 9＞ 발효조건 조절에 의한 수용성 재조합 단백질 생산

가) 배양액의 pH 조절을 통한 재조합 사람인슐린의 수용성 발현

실시예 5의 재조합 사람인슐린의 생산공정에서 유도발현 이후 배양액의 pH를 조절하여 발현된 재조합 사람인슐린중 수용성의 비율을 높일수 있었다.

pH의 조절에 따른 재조합 융합단백질 발현 추이.

pH	6.75	7.5	8.0	8.5
총 단백질의 최고 발현율(%)	20.4	10.1	10.3	0
(수용성/총단백질)의 최고 비율	0	0.51	0.35	0

상기 표 6에 나타난 바와 같이 pH를 7.0 ~ 8.5 범위로 조절하면 재조합 단백질의 수용성 비율을 높일 수 있다.

나) 열충격(Heat Shock)에 의한 재조합 사람 성장호르몬의 수용성 발현

실시예 6에서 상기 가)의 방법에 더하여 재조합 사람 성장호르몬의 생산공정에서 유도발현 직전 배양액에 열 충격(45℃, 1시간)을 가하면 하기 표 7에서 보이는 바와 같이 재조합 사람 성장호르몬의 수용성의 비율을 크게 높일 수 있다.

재조합 융합단백질 발현에 대한 열 충격의 영향.

열 충격 조건	45℃, 1시간
총 단백질의 최고 발현율(%)	12.57
(수용성/총단백질)의 최고 비율	0.86
(수용성/총단백질)의 최종 비율	0.86

다) 락토스 포함 생산배지에 의한 재조합 사람 성장호르몬의 수용성 발현

실시예 6의 방법을 사용한 재조합 사람 성장호르몬의 생산공정에서 락토스를 유도발현물질과 탄소원으로 사용하면 하기 표 8에서 보이는 바와 같이 IPTG를 유도인자로 이용하는 경우에 비해 재조합 사람 성장호르몬 중 수용성의 비율을 높일 수 있다.

락토스 포함 생산배지에 의한 재조합 융합단백질 발현.

발현유도 인자	총 단백질의 최고 발현율	(수용성/총단백질)의 최종 비율
IPTG	26.2	0.16
Lactose	17.3	0.43

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법을 이용하여 대장균을 고농도로 배양시켜 재조합 단백질을 발현시키면 발효배지 1 리터 당 재조합 단백질을 5∼15 그람 생산할 수 있으며 이중 수용성 재조합단백질의 비율을 최대 80% 이상으로 향상시킬 수 있다.

Claims

종양괴사인자-α의 아미노 말단을 융합파트너로 이용하여 외래 단백질을 생산할 수 있는 재조합 대장균을 포도당과 효모추출물의 비율이 0.5 - 3.5인 복합배지 또는 암모니아를 질소원 및 pH 조절인자로 이용하고 배양액의 pH 는 6 - 8임 포도당 농도가 600 - 850 g/L인 합성배지인 성장배지에서 유가식으로 고농도로 배양한 후;

포도당 210 - 340 g/L, 효모추출물 120 - 270 g/L를 포함하는 생산배지를 재조합 대장균 균체 g당 0.3~0.6 ml/시간 속도로 연속적으로 주입하여 유가식으로 배양함과 동시에 발현유도물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 제조방법.
제 1항에 있어서, 재조합 대장균은 종양괴사인자-α의 아미노 말단을 융합 파트너로 이용하여 T7 프로모터로부터 외래 단백질을 생산할 수 있는 발현벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 발현유도물질은 IPTG 를 대장균 균체 g당 3 - 10mg 범위로 투입하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 제조방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단백질 생산공정 말기의 일정한 시기에 생산배지 주입 방법을 pH 조절에 의한 방법으로 전환하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 재조합 대장균을 고농도로 배양함과 동시에 재조합 단백질을 고수율로 생산하기 위해 2단계의 싸이클릭(cyclic) 유가식 배양방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 과정에 더하여 재조합 대장균 배양액에서 pH 를 7 - 8.5 범위로 조절하여 재조합 단백질의 일부를 수용성의 형태로 얻는 제조방법.
제 6항에 있어서, 재조합 대장균의 배양액에 열 충격을 가하는 과정을 더하고, 열 충격은 바람직하게 온도 40 - 50℃ 범위에서 0.5 - 1.5 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6항에 있어서, 락토스가 20 - 200 g/L 농도 범위이고 포도당이 50 - 250g/L 농도 범위이며, 효모추출물은 180~250g/L 농도 범위로 이루어진 생산배지를 사용하여 수용성 단백질의 발현비율을 높이는 것을 특징으로 하는 제조방법.