JP3146161B2 - スーパーオキシド・ディスムターゼを発現するプラスミド及びスーパーオキシド・ディスムターゼの製造方法 - Google Patents

スーパーオキシド・ディスムターゼを発現するプラスミド及びスーパーオキシド・ディスムターゼの製造方法

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JP3146161B2 JP18085896A JP18085896A JP3146161B2 JP 3146161 B2 JP3146161 B2 JP 3146161B2 JP 18085896 A JP18085896 A JP 18085896A JP 18085896 A JP18085896 A JP 18085896A JP 3146161 B2 JP3146161 B2 JP 3146161B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、スーパーオキシ
ド・ディスムターゼを発現するプラスミド及びスーパー
オキシド・ディスムターゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学の１つの特徴は、真核生物起
源の外来ＤＮＡ配列を大腸菌(Escherichia coli)又はそ
の他の微生物に挿入することにある。遺伝子工学で得ら
れる別の優れた特徴は、外来ＤＮＡがコードしているポ
リペプチドの産生をこれら微生物中で誘発することにあ
る。ポリペプチドの産生は２段階プロセスで生じ、各段
階が多数のサブステップを含むと考えられている。２つ
の段階は転写段階と翻訳段階である。ポリペプチドを効
率的に量産するためにはプロセスの２つの段階が共に効
率的に行なわれる必要がある。転写によって遺伝子（Ｄ
ＮＡ）から mＲＮＡが生成し、翻訳によって mＲＮＡか
らポリペプチドが生成する。
【０００３】転写プロセスの重要なサブステップは開
始、即ちプロモーター- オペレーター領域へのＲＮＡポ
リメラーゼの結合である。プロモーター領域を構成する
デオキシリボヌクレオチド塩基の配列を変更し、これに
よってプロモーターの相対的効率を加減してもよい。効
率はＲＮＡポリメラーゼのプロモーター親和性に左右さ
れる。
【０００４】翻訳効率は mＲＮＡの安定性の影響を受け
る。 mＲＮＡの安定性が増すと翻訳効率が上がる。 mＲ
ＮＡ安定性の正確な決定因子は正確にはわかっていない
が、塩基配列によって決定される mＲＮＡの二次構造が
安定性に寄与することが判明している。
【０００５】翻訳の最初のサブステップでは、Shine-Da
lgarno配列又はリボソーム結合部位（ＲＢＳ）として知
られる mＲＮＡ上の塩基配列にリボソームが結合する。
リボソームが mＲＮＡに沿ってＡＵＧ翻訳開始コドンま
で移動するとポリペプチド合成が開始される。これらの
コドンは通常、Shine-Dalgarno部位から約10塩基“下流
に”存在する。翻訳効率を高める要因の１つに、Shine-
Dalgarno部位へのリボソームの結合を増強することが含
まれる。Shine-Dalgarno配列及びＡＵＧコドンの領域で
の mＲＮＡの二次構造とShine-Dalgarno配列からＡＵＧ
コドンまでの間隔とは、夫々、翻訳効率の決定に関して
重要な役割を果たすことが判明している。翻訳効率に影
響を与える別の要因は、早期終結及び減衰である。減衰
部位を除去することによって翻訳効率を向上させること
が可能である。
【０００６】細菌細胞中で真核生物ポリペプチドを多量
に産生する計画の障害となるのは、多量の mＲＮＡを産
生する細胞が効率良く増殖できないことである。このよ
うな障害は、抑制というプロセスにより転写を阻害する
ことによって除去され得る。抑制に於いては、オペレー
ター領域に結合して転写を阻害するタンパク阻害剤（リ
プレッサータンパク）の作用によって遺伝子がスイッチ
オフされる。微生物が所望の細胞濃度まで増殖した後
に、リプレッサーを破壊するか又はリプレッサーの効果
を凌駕し得る誘導物質として知られる分子を添加するこ
とによって抑制されている遺伝子を活性化する。
【０００７】λバクテリオファージ由来のＰL プロモー
ターを含むプラスミド中での真核生物遺伝子のクローニ
ングに関しては文献中に多くの報告が見られる(H.V. Be
rnard et al., Gene (1979) 5, 59; C. Derome et a
l., Gene (1982) 17, 45; D. Ghey-sen et al., Gene
(1982) 17, 55; J. Hedgpeth et al., Mol. Gen. Gene
t.(1978) 163, 197; E.Remaut et al., Gene (1981) 1
5, 81; R.Deryncket al.,Nature (1980) 287, 193) 。
更に、1981年12月16日公開の欧州特許出願第041.767 号
は、λバクテリオファージ由来のＰL プロモーターを含
む発現ベクターを記載している。しかしながら、これら
の参考文献はいずれもＣIIリボソーム結合部位の使用に
ついては記載していない。
【０００８】λバクテリオファージ由来のＰL プロモー
ターとＣIIリボソーム結合部位とを含むベクターの使用
については、A.B. Oppenheim et al., J. Mol. Biol.
(1982) 158, 327 並びにH. Shimatake及びM.Rosenber
g, Nature (1981) 292, 128 に記載されている。これら
の刊行物は、高レベルのＣIIタンパクの産生について記
載しているが、真核生物タンパクの産生を包含又は記載
していない。
【０００９】1982年にShatzman及びRosenberg は第14回
Miami Winter Symposiumにポスターを提出した(A. R. S
hatzman 及びM. Rosenberg, 第14回 Miami Winter Symp
osium, 抄録98頁[1982]) 。この抄録には、λバクテリ
オファージ由来のＰL とNutとＣIIリボソーム結合部位
とを含むベクターを使用して“真核生物”ポリペプチド
を細菌宿主中で細胞タンパクの 5％より高い量で合成す
ることが開示されているが、（ＳＶ40小Ｔ(small Ｔ)
抗原は実際には真核生物ポリペプチドでなくウィルスタ
ンパクであるし）、細菌宿主名が示されていない、使用
したオペレーターが定義されていない、複製起点（開始
点）も選択可能な表現型の遺伝子も認識されてない等の
理由によって上記の開示は実施不能である。このような
ベクターを使用するこの系は、このベクターを安定に形
質転換し得るような或る種の宿主溶原菌(host lysogen)
を含むと記載されている。本発明に於ける１つの具体
例、例えば pＭＧ100 は、前記ベクターに対していくつ
かの類似点を有する。しかしながら、ベクター pＭＧ10
0 による形質転換に用いられるのは宿主溶原菌でなく、
非耐熱性リプレッサーＣI とＮ遺伝子とを含有している
が前記溶原ファージ(lysogen）の残部が除去されている
適当なE. coli宿主菌株である。更にベクターpＭＧ100
は総細胞タンパクの20％を上回る量で bＧＨ及び hＧ
Ｈアナログ（類似体）を産生するために使用された。
【００１０】更に、本発明の別の具体例では、ＣIIとは
異なるリボソーム結合部位が使用される。現状で最も好
ましいベクターである pＮＤ5 及びその誘導体に於いて
は、pＭＧ100 で得られるよりも10％以上多い量でポリ
ペプチドを産生し得るベクターを作成するために、必須
でない配列は除去してある。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】出願人は最近、 Nation
al Institutes of Health,Dept. of Health and HumanS
ervices, 米国, によるM. Rosenberg名義で係属中の米
国特許出願第457,352 号の存在を知った。この出願のあ
る部分はNational Technical Information Service, U.
S. Dept. of Commerceから入手できたが、特許請求の範
囲はまだ機密であり入手不能である。出願人は該出願の
入手し得た部分について検討し、この開示も実施不能で
あるとの結論を得た。即ち、この開示によれば宿主が重
要であるのに（８頁17行）いかなる適当な宿主も確認さ
れていない。更に該出願はλ突然変異体の使用を基盤と
するのにこの突然変異体が特定されていない(4頁20行)
。更に該出願では宿主が溶原ファージを含む（８頁18
行）が、本発明では宿主が溶原菌でない。該出願は真核
生物遺伝子、サルメタロチオネイン遺伝子のクローニン
グ及び発現に言及しているが（７頁18行）これらについ
て詳細に説明していない。該出願ではＣIIリボソーム結
合領域のいかなるヌクレオチドの配列も位置も変更して
いないと述べられている(3頁27行) 。しかしながら本発
明では、このような変更が可能である。
【００１２】ウシ又はヒト生長ホルモンのＰL −ＣII含
有ベクター系による発現の成功、生物学的活性を有する
bＧＨ又は hＧＨアナログの産生、このようなアナログ
を含有する組成物及びその使用、又は、宿主によって産
生される総タンパクの20％を上回る量のポリペプチドの
産生を達成する誘導方法に関する開示は当業界にまだ存
在しない。
【００１３】遺伝子工学的に作成したベクターで形質転
換された宿主による bＧＨアナログの産生に関する当業
界の唯一つの開示は、天然 bＧＨのフェニルアラニン型
のＮ−末端にアミノ酸Ｍetを有する bＧＨアナログを産
生するためにＴrpプロモーターを使用する方法である
（P.H. Seeburg等, DNA (1983) 2, 37）。
【００１４】遺伝子工学的に作成したベクターで形質転
換された宿主による hＧＨアナログの産生に関する当業
界の唯一つの開示は、天然 hＧＨのＮ−末端にアミノ酸
Ｍetを有する hＧＨアナログを産生するためにＬac及び
Ｔrpプロモーターを使用する方法である（D.V. Goedell
等, Nature (1979) 281, 544 ）。
【００１５】更にこの発明は、スーパーオキシド・ディ
スムターゼを発現するプラスミド及びスーパーオキシド
・ディスムターゼの製造方法を提供しようとするもので
ある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】プロモーター、リボソー
ム結合部位、ＡＴＧ翻訳開始コドン及びスーパーオキシ
ド・ディムターゼをコードする遺伝子を有し、該プロモ
ーター、リボソーム結合部位及びＡＴＧ翻訳開始コドン
が該スーパーオキシド・ディスムターゼを発現させるよ
うに配置されているスーパーオキシド・ディスムターゼ
を発現させるためのプラスミド、上記プラスミドを有す
る宿主及び上記宿主を増殖せしめることからなるスーパ
ーオキシド・ディスムターゼの製造方法に係る。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明ベクターは、非耐熱性リプ
レッサーＣI を含む適当な細菌宿主細胞、例えばEscher
ichia coliに導入された際、宿主細胞がリプレッサー
破壊温度まで加熱された時この宿主細胞が前記ベクター
に挿入された所望遺伝子を発現せしめ得且つ前記遺伝子
によりコードされたポリペプチドを産生し得るようにす
る。本発明ベクターは、 5′から 3′に向かって、λバ
クテリオファージ由来プロモーター及びオペレーターＰ
L ＯL を含むＤＮＡ配列と、宿主細胞によって産生され
る抗転写終結因子Ｎタンパクを結合するＮ利用部位（Ｎ
utilization site）と、所望遺伝子の mＲＮＡを宿主
細胞内のリボソームに結合せしめ得るリボソーム結合部
位を含むＤＮＡ配列と、ＡＴＧ開始コドン又は所望遺伝
子のベクター内挿入の際にＡＴＧ開始コドンに変換され
るＤＮＡ配列と、ＡＴＧ開始コドンと位相を合わせて所
望遺伝子をベクター内に挿入するための制限酵素部位
と、を順次に含む二本鎖ＤＮＡ分子を含んでおり、更
に、宿主細胞中で自律複製し得る細菌プラスミド由来の
複製起点を含むＤＮＡ配列と、宿主細胞中にベクターが
存在するときに現れる選択可能又は認識可能な表現形質
に関連する遺伝子を含むＤＮＡ配列とを含む。好ましい
ベクターは pＭＧ100及び pＮＤ5 である。
【００１８】生長ホルモン例えばウシ, ブタ, トリ又は
ヒトの生長ホルモン, スーパーオキシドジスムターゼ,
アポタンパクＥ, 口蹄疫ウィルスのウィルス性タンパク
１,S. aureus由来プロテインＡ, インターロイキンIII
，酵素又はそのアナログの如き所望のポリペプチドを
コードする遺伝子即ち cＤＮＡを、ベクターの制限酵素
部位に挿入してプラスミドを作成する。次にこのプラス
ミドは適当な宿主に導入され得、該宿主中で遺伝子が発
現され所望のポリペプチドが産生され得る。 ｂＧＨ用
の好ましいプラスミドは、 ｐＲec2/3 及び pＲＯ11で
あり、 hＧＨ用の好ましいプラスミドは pＴＶ18(1) 及
び pＴＶ104(2)である。適当な宿主としてEscherichia
coli A1637, A1645, A2602及びA1563 があり、現在で
はA1637 が好ましい。
【００１９】得られた宿主ベクター系をポリペプチドの
製造に使用し得る。プラスミドを含む宿主細胞をポリペ
プチド産生可能な適当な条件下で増殖させ、得られたポ
リペプチドを回収する。現行の好ましい条件としては、
約42℃で10乃至30分、特に15分間増殖させ、次に約37乃
至39℃で総増殖期間が約60乃至90分間になるまで、特に
38乃至39℃で約75分間増殖を継続する。現行の好ましい
増殖培地は、ブドウ糖を加えたラクトアルブミン水解物
又はブレーンハートインフュージョン(brain heart in-
fusion) である。
【００２０】宿主ベクター系を使用して bＧＨ及び hＧ
Ｈのアナログを調製した。これらのアナログは、夫々、
獣医用又は医薬組成物に混入することができる。
【００２１】これらのアナログは、夫々、ウシの乳分泌
もしくは肉増加を刺激するため又はヒト生長ホルモンの
欠乏を治療するために、直接に又は前記の如き組成物と
して使用し得る。
【００２２】図面の説明 図１： pＭＧ100 発現ベクターの構築 このプラスミドは、Ｈpa1 とＢamＨ1 とによって開裂し
た pＫＣ30プラスミドＤＮＡ中に、ＨaeIII 制限部位(3
8150) とＳau3a制限部位(38362) との間に含まれるλフ
ァージＤＮＡの断片を挿入することによって構築され
る。ＨaeIII −Ｓau3a断片は、 nutR ， tR1，cy- とＣ
IIタンパクのリボソーム結合部位（ＣII−ＲＢＳ）を担
持している。ＣII−ＲＢＳを含むＤＮＡを pＫＣ30にサ
ブクローニングして、ＣII−ＲＢＳのＡＴＧ開始コドン
の直後に唯一つのＢamＨ1 制限部位を含み且つＡＴＧト
リプレット内にＮde1 制限部位を含む pＭＧ100 を作成
する（図１底部挿入図参照）。かっこ内の数字はλファ
ージＤＮＡ上制限部位の位置を示す。
【００２３】図２： pＲec2/3 プラスミドの構築 bＧＨ cＤＮＡを含むプラスミドＤ4 をＨaeIIで消化し
た。得られた1600 bpの大断片を精製し、5 ユニットの
Ｓ1 エキソヌクレアーゼで37℃で5 分間消化した。配
列：
【００２４】
【表１】
【００２５】の合成ＥcoＲ1 リンカーを連結した。生成
物をＥcoＲ1 で開裂し、ＥcoＲ1 で開裂してある pＢＲ
322 中に挿入した。ＥcoＲ1 で開裂すると 5′端に配
列：
【００２６】
【表２】
【００２７】を有する1200 bp 断片を遊離するクローン
pＡＬＲ1 を単離した。この配列が生成するということ
は、 pＡＬＲ1 が真正 bＧＨの1 番目の残基（フェニル
アラニン）をコードするＴＴＣコドンを含むＥcoＲ1 制
限部位を含有することを示している。 pＡＬＲ1 をＰst
１で部分開裂した。消化物をＨindIIIリンカーで連結
し、ＥcoＲ1 とＨindIIIとで開裂した。 bＧＨ cＤＮＡ
を含む断片を単離し、ＥcoＲ1 及びＨindIIIの制限部位
間で pＢＲ322 にサブクローニングし pＡＬ500 を得
た。サブクローニングした bＧＨ cＤＮＡ断片をＥcoＲ
1 及びＨindIIIで pＡＬ 500から切除し、ＤＮＡポリメ
ラーゼ“Klenow”断片で“充填(fill in) し”、ＢamＨ
1 部位で開き上記と同様に“充填し”た pＭＧ100 発現
ベクター（図１）に挿入した。得られたベクター pＲec
2/2 は、アミノ末端が次式： MetAspGlnPhe1 Pro2 ...... bGH の如く変化している変性 bＧＨを発現する。プラスミド
pＲec2/2 をＰst１で消化し、ＰL プロモーターと bＧ
Ｈ遺伝子の 5′端とを含む断片を単離した（断片Ａ）。
この断片を pＡＬ500 から得たＰst１断片（断片Ｂ）に
連結した。ここで得られたベクター pＲec2/3 はアミノ
末端が次式： MetAspGlnPhe1 Pro2 ...... bGH の如く変化している変性 bＧＨを発現する。
【００２８】図３: 発現ベクター pＮＤ5, pＮＤ55及び
pＲＯ11の構築 プラスミドp ＯＧ7(A. Oppenheim, S. Gottesman及びM.
Gottesman, J. Mol.Biol. (1982) 158, 327)をＮde1
で開裂した。ＰL プロモーター nutL ， tR 及びＣII−
ＲＢＳを担う大断片の末端を連結して pＮＤ5 発現ベク
ターを得た。この pＮＤ5 ベクターＤＮＡをＮde1 で開
いた。 bＧＨ cＤＮＡを含む pＲec2/3(図２) から得た
Ｎde1 断片を挿入しプラスミド pＲＯ11を得た。プラス
ミド pＲＯ11は、図２の変性 bＧＨの発現体(expresso
r) として pＲec2/3 より優れていると考えられる。Ｎd
e1 で開裂した pＯＧ7 に配列：
【００２９】
【表３】
【００３０】を有する合成リンカーを挿入すると、ＡＴ
Ｇの手前に唯一つのＳac1 制限部位を含む発現ベクター
pＮＤ55が得られる。 pＮＤ55をＳac1 で開裂しＤＮＡ
ポリメラーゼ“Klenow”断片で処理すると、ＰL プロモ
ーター及びＣII−ＲＢＳの後に存在するＡＴＧ開始コド
ンが得られる。このベクターは、ＡＴＧ開始コドンが欠
失している種々の真核生物遺伝子の発現に適している。
【００３１】図４: pＴＶ18(1) と pＴＶ104(2)との構
築 hＧＨをコードするc ＤＮＡを pＢＲ322 のＨindIII部
位に標準法でクローニングしてプラスミド pＴＶＨＧＨ
を調製した（Meth. Enzymol. (1979) 68, 75）。このプ
ラスミドをＨindIIIで消化した。得られた800 bp断片を
精製し、ＦnuＤIIで更に消化してＤＮＡポリメラーゼ
“Klenow”断片で“充填した”。この処理によって hＧ
Ｈの最初の16個のアミノ酸のコドンが除去される。得ら
れたＤＮＡ断片を、Ｍet14以降の hＧＨの配列のコドン
を回復し且つＭet14のＡＴＧコドンの手前のＮde1 制限
部位を再生する合成リンカーと連結した。Ｎde1 で処理
後、この半合成ＤＮＡをＮde1 で開いた pＮＤ5 ベクタ
ーに挿入した。得られたプラスミド pＴＶ18(1) は、Ｐ
L プロモーターのコントロール下で hＧＨを発現する。
この hＧＨは、最初の13個のアミノ酸が欠失しておりＮ
−末端にＭet14を有するアナログである。
【００３２】プラスミド pＴＶ18(1) をＮde1 で部分消
化し、 hＧＨのアミノ酸1-13のコドンを含む合成リンカ
ー：
【００３３】
【表４】
【００３４】と結合した。このリンカーは更に、 pＴＶ
18(1) のＮde1 部位と相補的であり、完全 hＧＨ遺伝子
を pＮＤ5 発現ベクター（図３）のＡＴＧ開始コドンと
位相を合わせて配置する。従って、得られたプラスミド
pＴＶ104(2)はＮ−末端に付加メチオニンを有する天然
hＧＨを発現する。
【００３５】図５はＴrpプロモーターとβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子に転写的に融合されたＴrpＥ遺伝子の最初
の7 個のアミノ酸とを含むベクター pＡＬＴrp46を示
す。
【００３６】図６, 図７及び図８は、Ｔrpプロモーター
の一部及びＬacオペレーターとそれに続く所望遺伝子を
挿入してＴacプロモーターのコントロール下で bＧＨを
発現させるための制限部位を含む一連の発現ベクター
（Ｔac）を示す。
【００３７】図９及び図１０は、ヒスチジンプロモータ
ーのコントロール下にある bＧＨ cＤＮＡ含有発現ベク
ターを示す。
【００３８】図１１はＬacプロモーターのコントロール
下の発現ベクターへの bＧＨ遺伝子の挿入を示す。
【００３９】図１２は、ＯmpＦプロモーターのコントロ
ール下での bＧＨ遺伝子の発現を示す。
【００４０】図１３: 変容した制限部位をもつＭet 4 −
bＧＨアナログ pＡＬ401 と発現ベクター pＮＤ6 及び
pＮＤ11との構築 bＧＨのアミノ末端の最初の3 個のアミノ酸が欠失した
修飾形 bＧＨ（Ｍet4bＧＨ）を発現する pＡＬ401 の構
築には以下の3 断片連結(triple ligation)を用いる。
【００４１】(a) pＡＬ500 から切除したＰvuIIとＨin
dIIIとを有する623 bpの bＧＨ ＤＮＡ断片。
【００４２】(b) 2 本のＤＮＡ鎖を合成し、精製後アニ
ールして
【００４３】
【表５】
【００４４】を形成し、ＤＮＡポリメラーゼ“Klenow”
断片を用いて“充填し”、次にＮde1とＰvuIIとで開裂
して58 bp 断片を調製し、回収精製して得たリンカー。
【００４５】(c) 発現ベクター pＯＧ7 のＨindIIIと
（ＡＴＧ開始コドンから遠い)1個のＮde1 部位を除去し
て得た pＮＤ6 のＳal1 部位にＨindIIIリンカーを導入
して得たpＮＤ11。
【００４６】図１４: アミノ末端がメチオニンで修飾さ
れた真正 bＧＨ及び種々の bＧＨアナログの構築 a) プラスミド pＡＬ401 をＮde1 で処理する。ＡＴＧ
開始シグナルと天然 bＧＨのアミノ末端の最初の3 個の
アミノ酸のコドンとを含む合成ＤＮＡリンカーをＮde1
部位に連結する。得られたベクター pＡＬ601 は、アミ
ノ末端に付加メチオニン残基を含む天然 bＧＨを発現せ
しめる。
【００４７】b) オリゴデオキシリボヌクレオチドリン
カーの構造を変形しa)に記載の手順を用いて、一連の修
飾ウシ生長ホルモンをコードする一群のベクターを構築
する。修飾生長ホルモンは、Ｎ末端のメチオニンで始ま
り、続いて１番目と２番目の各々に20個の自然発生アミ
ノ酸のいずれかが存在し、３番目にＧlu, Ｇln, Ｌys,
Ｍet及びＴrp以外の20個のアミノ酸のいずれかが存在す
る。４番目からＣＯＯＨ−末端までの配列は天然 bＧＨ
の配列に等しい。
【００４８】図１５: 脛骨テスト(Tibia test) 下垂体切除ラットの骨板(bone plate)生長に対する pＲ
ec2/3 bＧＨアナログと真正 bＧＨの影響の比較を示
す。
【００４９】本発明により、遺伝子発現とポリペプチド
発現のレベル向上を達成し得るベクターが開発された。
本発明のベクターは二本鎖ＤＮＡ分子である。このベク
ターを非耐熱性リプレッサーＣI を含む適当な細菌宿主
細胞に導入し、宿主細胞の温度をリプレッサー破壊温度
まで上昇すると、このベクターにより、宿主細胞は、こ
のベクターに挿入された所望遺伝子を発現せしめ得且つ
この遺伝子がコードしているポリペプチドを産生し得る
ようになる。
【００５０】前記ベクターは、 5′から 3′に向かっ
て、λバクテリオファージ由来のプロモーター及びオペ
レーターＰL ＯL を含むＤＮＡ配列と、宿主細胞によっ
て産生される抗転写終結因子(antiterminator)Ｎタンパ
クを結合するＮ利用部位と、所望遺伝子の mＲＮＡを宿
主細胞内のリボソームに結合せしめ得るリボソーム結合
部位を含むＤＮＡ配列と、ＡＴＧ開始コドン又は所望遺
伝子のベクター内挿入の際にＡＴＧ開始コドンに変換さ
れるＤＮＡ配列と、ＡＴＧ開始コドンと位相を合わせて
所望遺伝子をベクター内に挿入するための制限酵素部位
と、を順次に含む。
【００５１】本発明のベクターは更に、宿主細胞中で自
律複製し得る細菌プラスミドから得た複製起点を含むＤ
ＮＡ配列と、宿主細胞中にベクターが存在するときに現
れる選択可能又は認識可能な表現形質に対応する遺伝子
を含むＤＮＡ配列とを含む。
【００５２】ベクターと共に使用される宿主は、Escher
ichia coliである。現在好ましいと考えられる菌株は
A1637, A1645, A2602 及びA1563 であり、A1637 が最
も好ましいと考えられている。この菌株は、Ｃ600 のガ
ラクトースオペロンとガラクトースオペロンに近いλ発
現系との内部にテトラサイクリン耐性遺伝子含有のトラ
ンスポゾンを挿入して得られたものである。この菌株
は、詳細に後述する如き種々のプラスミドを含有させて
American Type Culture Collection, Rockville, メリ
ーランド, アメリカに寄託されている。これらの寄託は
全て、International Recognition of the Deposit of
Microorganismsに関するブタペスト条約に基づく。
【００５３】A1645 はＧal+ （ガラクトース発酵能）と
テトラサイクリン耐性の欠失に対する選択によってA163
7 から得られた。A1645 はλ発現系を維持しているが、
トランスポゾンの一部は選択によって除去されている。
その表現型はＣ600 ｒ- ｍ+gal+ thr- leu- lac Ｚ-
（λcI857 △H1△BAM N+ ）である。
【００５４】A2602 とA1563 とはSA500 から誘導され
る。これらの表現型は夫々、 SA500 his- ilu- gal+
△8(λCI857 △H1△BAM N+ ）及び SA500 his- ilu-
gal+△8 lacZxA21 (λCI859 int2 xisl nutL3 △H1）
である。
【００５５】好ましくはベクターが共有結合で閉鎖した
環状二本鎖分子である。しかしながら、ベクターが共有
結合的に閉鎖することは必須条件ではない。
【００５６】宿主細胞がＣI リプレッサー破壊温度まで
加熱されるとベクターが発現レベルの向上を達成する。
このためには約42℃を上回る温度が有効である。不要な
加熱は宿主細胞に損傷を与えるのでできるだけ避けたほ
うがよい。従って、一般的には温度が42℃を 2乃至 3°
しか上回らないようにするのが好ましい。
【００５７】ベクターの１つの重要な成分はリボソーム
結合部位である。適当な部位は、配列：
【００５８】
【表６】
【００５９】を有するλバクテリオファージからの
ＣII；配列：
【００６０】
【表７】
【００６１】を有する合成オリゴヌクレオチド；及び配
列：
【００６２】
【表８】
【００６３】を有するλバクテリオファージの主要頭部
タンパク遺伝子(major head proteingene) である。
【００６４】ベクターの別の成分は、ＡＴＧ開始コドン
と位相を合わせて所望遺伝子をベクターに挿入するため
の制限酵素部位である。このような部位として種々の部
位が使用され得る。現在好ましいと考えられるのはＢam
Ｈ1 ，Ｓac1 及びＮde1 である。 ベクターは更に、宿
主細胞中で自律複製し得る細菌プラスミド由来の複製起
点を含む。適当な複製起点は種々の起源から得られる。
現在好ましいと考えられるのは pＢＲ322 又は pＲ1 由
来の複製起点ある。
【００６５】ベクターが宿主細胞中に存在するときに現
れる選択可能又は認識可能な表現形質に対応する遺伝子
を含むＤＮＡ配列もベクターの成分の１つである。適当
な遺伝子は温度感受性又は薬剤耐性例えばアンピシリ
ン, クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリンへ
の耐性に対応する遺伝子である。
【００６６】従来の科学文献に記載されたベクターに比
較して本発明のベクターは、所望ポリペプチド産物をコ
ードする多くの種類の遺伝子の発現向上のために使用さ
れ得る。適当な遺伝子としては、生長ホルモン、例えば
ウシ, ブタ, トリ（ニワトリ）もしくはヒトの生長ホル
モン, スーパーオキシドジスムターゼ, アポタンパク
Ｅ, 手足口病ウィルスのウィルスタンパク１, S. aure
usのプロテインＡ, インターロイキンIII ，酵素又はこ
れらのアナログをコードする遺伝子を挙げることができ
る。アナログなる用語は、自然発生ポリペプチドと同じ
活性を有するがポリペプチドのＮ末端に１つ以上の別の
アミノ酸を有するポリペプチドを意味する。
【００６７】ベクターは、本発明の分野の当業者に公知
の方法で形成され得る。これらの方法は本明細書中で参
考として示した種々の刊行物に極めて詳細に記載されて
おり、これらの刊行物の内容は、技術状態に関する完全
な情報を与えるために本明細書中に含まれるものとす
る。
【００６８】現在好ましいとされるベクターの１つは、
図１の制限地図を有する pＭＧ100である。このベクタ
ーのＢamＨ1 制限部位にウシ生長ホルモンをコードする
cＤＮＡを挿入した。得られたプラスミドは pＲec2/3
と指称される。このプラスミドの制限地図を図２に示
す。プラスミド pＲec2/3 は従来の形質転換法を用いて
Escherichia coli A1637株に導入された。得られた宿主
ベクター系をATCC受託番号39385 で寄託した。
【００６９】現在好ましいとされる第２のベクターは図
３の制限地図を有する pＮＤ5 である。ウシ生長ホルモ
ン cＤＮＡをＮde1 制限部位に挿入した。得られたプラ
スミドを pＲＯ11と指称する。 pＲＯ11の制限地図も図
３に示されている。プラスミド pＲＯ11を形質転換によ
ってE. coli A1637株に導入した。得られた宿主ベクタ
ー系をATCC受託番号39390 で寄託した。
【００７０】ベクター pＮＤ5 もまたヒト生長ホルモン
のクローニングに使用された。 pＴＶ18(1) なる名称の
１つのプラスミドと pＴＶ104(2)なる名称の別のプラス
ミドとを、 hＧＨ cＤＮＡをＮde1 制限部位に挿入する
ことによって作成した。 pＴＶ18(1) は図４に示されて
いる。このプラスミドを形質転換によってE. coli A16
37株に導入した。得られた宿主ベクター系をATCC受託番
号39386 で寄託した。pＴＶ104(2)は図４に示されてい
る。このプラスミドもまたE. coli A1637株に導入され
た。得られた宿主ベクター系をATCC受託番号39384 で寄
託した。
【００７１】同じ手順を使用し、本発明のベクターの制
限酵素部位に所望ポリペプチドをコードする遺伝子を挿
入することによって別のプラスミドを調製し得る。
【００７２】上記の宿主ベクター系ではE. coli A1637
を使用した。しかしながら、既に示したようにA1645,A2
602 及びA1563 の如き別の菌株の使用も可能である。こ
れらの宿主ベクター系は、ウシ及びヒトの生長ホルモン
の如きポリペプチドの産生に使用され得る。そのために
は、ポリペプチドを産生し得る適当な条件下で宿主ベク
ター系を増殖し、次にポリペプチドを回収する。
【００７３】適当な条件とは、約42℃で適当な時間を要
して宿主ベクター系を増殖させ、次いで約37〜39℃で更
に或る程度の時間増殖を継続することを意味し、この増
殖は適当な培地中で実施する。
【００７４】好ましくは、42℃での初期増殖時間が約10
乃至30分間であり、37〜39℃での増殖時間は総増殖時間
が約60乃至90分間になるように選択される。好ましくは
42℃で約15分間の増殖と38〜39℃で約75分間の増殖とを
順次に行う。適当な培地としては、ブドウ糖を加えたラ
クトアルブミン水解物とブレーンハートインフュージョ
ンとがある。宿主中でベクターを安定に維持するには、
例えば抗生物質を加えて宿主を選択圧(selective press
ure)下に維持することが不可欠である。
【００７５】前記方法によって、多数の bＧＨ及び hＧ
Ｈアナログを調製した。これらは自然発生ホルモンの活
性を有するか又は有し得る。
【００７６】bＧＨアナログは天然 bＧＨの活性を有し
ており、Ｎ−末端で5 個以内のアミノ酸が変化している
以外は天然 bＧＨと等しいアミノ酸配列を有する。アミ
ノ酸変化の例としては、(1) フェニルアラニン形 bＧＨ
のＮ−末端に付加されたアミノ酸メチオニン,(2) アラ
ニン形 bＧＨのＮ−末端に付加されたアミノ酸メチオニ
ン,(3) フェニルアラニン形 bＧＨのＮ−末端に付加さ
れたアミノ酸配列Ｍet- Ａsp- Ｇln,(4) アラニン形 b
ＧＨのＮ−末端に付加されたアミノ酸配列Ａla- Ｇly,
(5) アラニン形 bＧＨのＮ−末端に付加されたアミノ酸
配列Ｍet- Ｇly,(6) アラニン形 bＧＨのＮ−末端に付
加されたアミノ酸配列Ｍet- Ａsp- Ｐro-Ｍet- Ｇly,
(7) フェニルアラニン形 bＧＨのＮ−末端に付加された
アミノ酸配列Ｍet- Ａsp- Ｐro,(8) フェニルアラニン
形 bＧＨのＮ−末端に付加されたアミノ酸配列Ｍet- Ｔ
hr- Ａrg,(9) フェニルアラニン形 bＧＨのＮ−末端か
ら除去されたメチオニン（４番目）までのアミノ酸があ
る。
【００７７】bＧＨアナログは、アミノ酸配列： Met-(X)n-Y-Met... ［式中、ＭetはＮ−末端、Ｘは20個の自然発生アミノ酸
のいずれか、ＹはＧlu,Ｇln, Ｌys, Ｍet又はＴrp以外
の20個のアミノ酸のいずれか、n は0 乃至6 の整数及び
Ｍet... は、4 番目からＣＯＯＨ−末端(191番目) まで
の天然 bＧＨの配列である］を有する。
【００７８】hＧＨアナログは天然 hＧＨの活性を有し
ており、Ｎ−末端の変化以外は天然hＧＨと等しいアミ
ノ酸配列を有する。アミノ酸変化の例としては、(1) 天
然 hＧＨのＮ−末端に付加されたアミノ酸メチオニン,
(2) hＧＨのＮ−末端から除去されたメチオニン（14番
目）までのアミノ酸がある。
【００７９】hＧＨアナログは、アミノ酸配列： Met-(X)n-Y-Met... ［式中、ＭetはＮ−末端、Ｘは20個の自然発生アミノ酸
のいずれか、ＹはＧlu,Ｇln, Ｌys, Ｍet又はＴrp以外
の20個のアミノ酸のいずれか、n は0 乃至13の整数及び
Ｍet... は、14番目からＣＯＯＨ−末端(191番目) まで
の天然 hＧＨの配列である］を有する。
【００８０】有効量の1 種以上の bＧＨアナログと適当
な担体とを含有する獣医用組成物を調製し得る。このよ
うな担体は当業者に公知である。ウシの乳分泌又は肉形
成を促進するためにアナログを直接ウシに投与してもよ
く、又は組成物にして投与してもよい。
【００８１】有効量の1 種以上の hＧＨアナログと適当
な担体とを含有する薬剤組成物を調製し得る。これらの
担体は当業者に公知である。 hＧＨの分泌不足を生じた
患者を治療するために、患者例えば小人症患者にアナロ
グを直接投与してもよく、又は組成物にして投与しても
よい。
【００８２】
【実施例】以下の実施例は本発明の理解を助けるために
提示されたものであり、本発明の範囲を限定する意図は
なく、本発明の範囲を限定すると解釈されてはならな
い。実施例においては、ベクターの構築、該当ポリペプ
チドをコードする遺伝子のベクター内挿入、得られたプ
ラスミドの細菌宿主内導入等のために使用された従来方
法について詳細に説明していないが、これらの方法は当
業者に公知であり、以下の如き多数の刊行物に記載され
ている。
【００８３】Principles of Gene Manipulation, An In
troduction to Genetic Engineering,2nd Edition, edi
ted by R.W. Old and S.B. Primrose, Univ. of Calif.
Press (1981) Met. Enzymol. vol. 68, Recombinant DNA, edited by
Ray Wu Academic Press(1979) Met. Enzymol. vol. 65, Nucleic Acids(Part 1),edite
d by Lawrence Grossmanand Kivie Moldave Academic P
ress (1980) T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecul
ar Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r Laboratory, NY (1982) H.V. Bernard et al., Gene (1979) 5, 59 A.B. Oppenheim et al., J. Mol. Biol. (1982) 158,
327 E. Remaut et al., Gene (1981) 15, 81。
【００８４】実施例１ 発現ベクター 本明細書で使用される発現ベクターなる用語は、細菌特
にE. coli中で所望遺伝子を発現するのに有用な1 群の
プラスミドを意味する。所望遺伝子を発現ベクター内に
挿入してもよく、又は発現ベクターのプロモーターを切
除して所望遺伝子の手前に入れてもよい。
【００８５】Ｉ．Ｐ L 発現ベクター Ａ． pＭＧ100 図１に示し、前記図面の説明中で詳細に説明したように
pＭＧ100 はマルチコピープラスミド pＢＲ322 に挿入
されたλＤＮＡを有する。λＤＮＡの顕著な特徴は、λ
ＰL プロモーターとＮ利用部位Ｌ及びＲ(nutL 及び nut
R ) と終結Ｒ1部位(tR1) とＣIIリボソーム結合部位と
ＡＴＧ開始コドンとを含むことである。別の特徴は、図
１に示される。
【００８６】pＭＧ100 は pＫＣ30から調製された。 p
ＫＣ30はλＰL プロモーターを以下の如くサブクローニ
ングして調製された。
【００８７】λファージＤＮＡをＸho1 及びＳma1 制限
エンドヌクレアーゼで消化し、6393bp から成る唯一つ
の断片を精製し、続いてＨindIIIびＢamＨ1 制限エンド
ヌクレアーゼで消化した。2397 bp から成り、ＰL プロ
モーターを含む断片が得られた。この断片を精製し、Ｈ
indIIIびＢamＨ1 消化物から単離した pＢＲ322 ＤＮＡ
大断片に結合した。サブクローンをコロニーハイブリダ
イゼーションで同定し、回収しプラスミドＤＮＡを単離
した（A. Oppenheim et al., J. Mol. Biol. (1982) 1
58, 327 ）。
【００８８】このプラスミドと真核生物遺伝子を含む誘
導体とは適当なE. coli宿主中に維持し得る。宿主の最
も重要な特徴はこの宿主が熱感受性リプレッサーＣＩ85
7 と抗転写終結因子(antitermination) Ｎタンパクとを
与えることである(M.E. Gottesman et al., J. Mol. Bi
ol. (1978) 140, 197)。
【００８９】このベクターは、従来の発現ベクターに比
較して以下の如き多くの利点を有する。
【００９０】１．発現レベルが極めて高いこと このベクターはE. coli中の外来タンパクの発現を総細
胞タンパクの15〜25％という高レベルで誘発し得る。
【００９１】２．発現を熱感応的に調節し得ること ＰL プロモーターはＣＩリプレッサーが結合していると
きは不活性である。ＣＩ857 リプレッサーは熱感受性で
ある。即ち、30℃ではプロモーターに結合するが、42℃
で失活する。従って、発酵温度を42℃まで上げると宿主
細菌で所望タンパクの産生が誘発される。
【００９２】このような系は以下の利点を含む。
【００９３】(a) E. coliに毒性の外来タンパクを所望
の時に産生し得、これにより発酵プロセスの早期での細
胞死を回避し得る。
【００９４】(b) タンパクの産生亢進が系を安定させ、
タンパク分解を阻止する（Y.E. Chenget al., Gene (19
81) 14, 121 ）。従って、厳密に調整されたプロモー
ター例えばＰL を使用する“瞬間的”産生亢進は連続的
な低レベル産生よりも好ましいであろう。
【００９５】３．コピー数が多いこと E. coli中に少ないコピー数で存在するλ自体と対照的
に、 pＭＧ100 中のＰL プロモーターはプラスミド上で
多いコピー数を示した。これにより発現レベルが上が
る。
【００９６】４．リボソーム結合部位と開始コドンとを
有すること この発現ベクターは強力な原核生物リボソーム結合部位
(ＲＢＳ) と翻訳開始コドン (ＡＴＧ) とを含む。従っ
て、開始コドンの付加を要せずにいかなる真核生物遺伝
子のクローニングも可能である。更に、有効ＲＢＳは発
現レベルを上げる。
【００９７】５．適当な制限部位が存在すること 発現ベクターはＡＴＧ開始コドンの直後にＢamＨＩ部位
を有しており、これにより最適発現を達成するために所
望遺伝子を適正配置し得る。
【００９８】６．Ｎut部位を有すること 宿主によって与えられるＮタンパクは発現ベクターのＮ
ut部位に結合し、これにより tR1部位での転写終了を阻
止する。
【００９９】Ｂ． pＮＤ5 図３に示す如く、 pＮＤ5 はＰL プロモーターと本発明
の発現ベクターの別の重要な成分とを含む。 pＮＤ5 は
リボソーム結合部位の直後に唯一つのＮde1 部位を含
む。リボソーム結合部位は正常なＣII部位とは異なって
おり、配列：
【０１００】
【表９】
【０１０１】を有する。
【０１０２】この配列は、突然変異体から誘導される
か、又は化学的に合成され得る。前記図面の説明で詳細
に記載したように pＮＤ5 は pＯＧ7 から誘導されたも
のである(A. Oppenheim et al., J. Mol. Biol. (1982)
158, 327)。このベクターは翻訳開始コドンを含まな
い。このベクターは、 bＧＨアナログを含む pＭＧ100
に比較して特に向上した収率で修飾 bＧＨ及びh ＧＨを
最高度に発現すると考えられる。
【０１０３】Ｃ． pＮＤ55 pＮＤ55はＣII−ＲＢＳとＡＴＧ開始コドンとの手前に
適当な制限部位Ｓac1を含む pＮＤ5 の誘導体である。
プラスミドをこの部位で開裂し、次にＤＮＡポリメラー
ゼKlenow断片で処理すると、ＡＴＧ開始コドンが与えら
れる。このコドンに所望の任意の遺伝子を結合し得る
（図３及び図３の説明参照）。
【０１０４】II．ＴＲＰ発現ベクター Ａ． pＡＬ Ｔrp46 pＡＬ Ｔrp46は、Ｔrpプロモーターとβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子に融合したＴrpＥ遺伝子の最初の７つのア
ミノ酸とを含む（図５）。所望の遺伝子は、ＴrpＥの7
個のアミノ酸の後のＢamＨＩ部位に挿入され得る。
【０１０５】Ｂ． pＡＬ Ｔrp47; アテニュエーターの
欠失したＴrp46 これはＴrpプロモーターの減衰領域が欠失したＴrp46に
基づいて構築されたものである。
【０１０６】Ｃ．Ｔrp−Ｌac融合物 プラスミドp4754 上でのこのプロモーターの構築が図６
及び図７に示されている。この構築の変形が図８に示さ
れている。
【０１０７】III ．ヒスチジンプロモーター発現ベクタ
ー この発現ベクターの構築は図９及び図１０に示されてい
る。
【０１０８】IV．使用される別のプロモーター Ａ．Ｌac このプロモーターは図１１の如くp ＹＬ301 の構築に使
用された。
【０１０９】Ｂ．ＯmpＦ これは、シグナル配列に結合したタンパクを発現するプ
ロモーターシステムである。タンパクが膜を通って輸送
されるときにこのシグナル配列は除去される（図１
２）。
【０１１０】実施例２ ウシ生長ホルモン bＧＨ cＤＮＡ修飾の出発点は既に知られているプラス
ミドＤ4 である(E. Keshet et al., Nucleic Acids Res
earch (1981) 9, 19) 。Ｄ4 プラスミドはまた、1980年
3 月24日付イスラエル特許出願第59,690号の優先権を主
張した1981年3月20日付の米国特許出願第245,943 号に
も記載されている。このプラスミドは、E. coli宿主中
で American Type Culture Collection にATCC受託番号
31826 で寄託されている。
【０１１１】Ｉ． pＲec2/3 bＧＨ pＲec2/3 の構築は図２に示されており、前記図面の説
明中に記載されている。正しい解読枠を与えるためにＤ
4 から得た bＧＨ cＤＮＡを pＭＧ 100に挿入する前に
処理した。
【０１１２】pＲec2/3 を公知方法の形質転換によってA
1637 をも含む種々のE. coli株に導入する。 pＲec2/3
を含むA1637 はATCC受託番号39385 で寄託されてい
る。この菌株は増殖及び誘発されると、フェニルアラニ
ン形天然 bＧＨのＮ−末端に付加されたアミノ酸配列Ｍ
et- Ａsp- Ｇlnを有する bＧＨアナログを産生する。ク
ーマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの走査によ
って算出すると、 pＲec2/3 によって産生された bＧＨ
アナログの量は細菌によって産生される総タンパクの約
23％であった。
【０１１３】II． pＲＯ11 pＲＯ11の構築は図３に示されており、前記図面の説明
に記載されている。 pＮＤ5 ベクターＤＮＡをＮde1 で
制限する。 bＧＨ cＤＮＡを含む pＲec2/3(図２) から
のＮde1 断片を挿入すると、プラスミド pＲＯ11が得ら
れる。
【０１１４】pＲＯ11を形質転換によってE. coli A16
37 に導入した。得られた宿主ベクター系をATCC受託番
号39390 で寄託した。この菌株は増殖し誘発されると、
pＲec2/3 と同じアナログを産生する。予備的な結果で
は pＲＯ11が pＲec2/3 よりも20％以上の増加量の bＧ
Ｈを産生することが判明した。菌株の増殖、産生された
bＧＨアナログの回収及び精製には実施例４の pＲec2/
3 の場合と同じ方法を使用する。
【０１１５】III ． pＡＬ401 pＡＬ401 の構築は図１３に示されており、前記図面の
説明に記載されている。Ｄ4 から pＡＬ-500（図２）を
経由して得られた bＧＨ cＤＮＡは図１３に示す如く、
pＮＤ11に挿入された。
【０１１６】pＡＬ401 は形質転換によってE. coli A
1637 に導入され得る。得られた菌株は天然 bＧＨのＭe
t4 がＮ−末端にあり、Ｍet4 の手前のアミノ酸が欠失
している bＧＨアナログを産生する。
【０１１７】IV． pＡＬ601 pＡＬ601 の構築は図１４に示されており前記図面の説
明に記載されている。このプラスミドは pＡＬ401(図１
３) の誘導体である。
【０１１８】pＡＬ601 は形質転換によってE. coli A1
637に導入され得る。得られた菌株は、フェニルアラニ
ン形 bＧＨのＮ末端にＭetが付加された bＧＨのアナロ
グを産生する。
【０１１９】実施例３ ヒト生長ホルモン hＧＨ cＤＮＡの出発点は、末端肥大症患者の下垂体腫
瘍から精製した mＲＮＡから得た cＤＮＡを pＢＲ322
のＨindIII部位にクローニングすることであった。
【０１２０】Ｉ． pＴＶ18(1) pＴＶ18(1) の構築は図４に示されており、前記図面の
説明に記載されている。正しい解読枠を与えるために h
ＧＨ cＤＮＡを pＮＤ5 に挿入する前に処理した。
【０１２１】pＴＶ18(1) を形質転換によってE. coli
A1637 に導入した。得られた細菌をATCC受託番号39386
で寄託した。この菌株は、増殖及び誘発されると、Ｍe
t14で始まりアミノ酸1-13が欠失した天然 hＧＨの配列
を有する hＧＨアナログを産生する。 pＴＶ18(1) によ
って産生される hＧＨアナログの量は、細菌によって産
生される総タンパクの約8 ％であった。
【０１２２】II． pＴＶ104(2) pＴＶ104(2)の構築は図４に示されており、前記図面の
説明に記載されている。正しい解読枠を与えるために h
ＧＨ cＤＮＡを pＮＤ5 に挿入する前に処理した。
【０１２３】pＴＶ104(2)を形質転換によってE. coli
A1637 に導入した。得られた細菌をATCC受託番号39384
で寄託した。この菌株は増殖及び誘発されるとＮ−末
端にＭetを有する天然 hＧＨの配列を有する hＧＨアナ
ログを産生する。 pＴＶ104(2)によって産生される hＧ
Ｈアナログの量は、細菌によって産生される総タンパク
の約25％を上回る。
【０１２４】実施例４ pＲec2/3 の増殖 保存培養物 : A1637 中の pＲec2/3 の保存培養物(stock
culture) をＢＨＩ培地で増殖し（接種物参照）、次に
87％グリセロール含有クエン酸リン酸塩バッファで2 倍
に希釈し、−70℃で保存する。
【０１２５】接種物: 接種物をＢＨＩ培地(37g/l) 即ち
ブレーンハートインフュージョン(DIFCO) 中で増殖させ
る。振盪フラスコ中の無菌培地に保存培養物を接種し、
30℃,200r.p.m. のシェーカー上で15時間インキュベー
トする。以後の接種物増殖段階は撹拌通気した発酵槽で
行なう。無菌培地に0.2 ml/lのフラスコ培養物を接種
し、30℃， pH7±0.5 で撹拌通気して溶存酸素レベルを
空気飽和の20％より高く維持しながら15時間インキュベ
ートする。
【０１２６】産生: 産生培地は、 ラクトアルブミン水解物（酵素的） 20 g/l 酵母抽出物 10 g/l Ｋ2 ＨＰＯ4 2.5 g/l Ｎa Ｃl 10 g/l アンピシリン 0.1 g/l ビオチン 0.1mg/l チアミン 1 mg/l 微量元素溶液 3 ml/l 溶液中のアンピシリン，ビオチン及びチアミンは別々に
フィルター滅菌され接種以前に無菌産生培地に加えられ
る。無菌ブドウ糖溶液は最初に10g/l になるように添加
し、誘発及び発現の過程ではブドウ糖を10g/l より多い
量に維持する。
【０１２７】微量元素溶液は以下の物質を含む。
【０１２８】 Ｍg ＳＯ4 ・7 Ｈ2 Ｏ 170 g/l Ｆe Ｃｌ3 16 g/l Ｚn Ｃｌ2 ・4 Ｈ2 Ｏ 2 g/l Ｃo Ｃｌ2 ・6 Ｈ2 Ｏ 2 g/l Ｎａ2 Ｍo Ｏ4 ・2 Ｈ2 Ｏ 2 g/l Ｃa Ｃｌ2 ・2 Ｈ2 Ｏ 1 g/l Ｃu Ｃｌ2 1 g/l Ｈ3 ＢＯ3 0.5 g/l 濃ＨＣｌ 100 ml/l 培地に 5乃至10％の接種培養物を接種し、30℃でインキ
ュベートする。撹拌−通気速度は、空気飽和の20％より
高い溶存酸素レベルが維持されるように設定される。Ｎ
Ｈ3 でpHを 7±0.2 に維持する。細胞濃度が約3g/l（Ｏ
Ｄ660 ＝10）に到達すると誘発が始まる。
【０１２９】温度を42℃に上げる。42℃に15分間維持
し、次に38℃に下げる。38℃で 1乃至1.5 時間インキュ
ベート後、培養物を急冷し、ホルモン精製のために遠心
分離によって細胞を回収する。
【０１３０】bＧＨの回収 Warring 配合装置を用い、 50mＭ Tris-Ｃl (pH 7.4)と
50mＭ EDTA と25％ショ糖とを含む10倍容の溶液に1kg
の細菌細胞を懸濁させる。配合装置の速度は泡立ちを最
小に抑えるように調整する。均質懸濁液をDynomill細胞
破砕装置(WillyA. Bachofen, Basel)に連続的に通し、
破砕細胞の均質懸濁液を先ずSharpless遠心機で遠心
し、次に Sorvall遠心機で20,000r.p.m.で連続遠心して
清澄化する。双方の遠心ステップで得られた沈澱物を回
収し、 50mＭ Tris-Ｃl (pH7.4) で洗い、500 mlの同じ
バッファに再懸濁させる。終濃度2mg/mlまでリゾチーム
を加え、懸濁液を37℃で1 時間インキュベートする。次
に、Triton X-100を終濃度1％まで加え、懸濁液を 4℃
に冷却し、Sorvall SS34ロータ内で20,000r.p.m.で20分
間遠心する。沈澱物を収集し、 50mＭ Tris-Ｃl で2 回
洗い、500 mlの 50mＭTris-Ｃl(pH7.4), 5mＭ Ｍg Ｃ
ｌ2 に再懸濁させ、デオキシリボヌクレアーゼを終濃度
20μg/mlまで加える。室温で30分間インキュベーション
後、沈澱物を前記同様に収集し、500 mlの20m Ｍ Tris-
Ｃl (pH7.4),100mＭ Ｎa Ｃl 及び 10mＭ EDTA で2 回
洗浄し、次に各500 mlの蒸留水を用いて2 回洗浄する。
沈澱物を遠心によって収集し、−20℃で無限に長く保存
し得る。この段階でドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳
動から判断すると bＧＨは80％純粋である。 bＧＨの収
量は約15g である。
【０１３１】bＧＨの精製 100gの沈澱物を40mlの蒸留水に懸濁させ、0.5 ＭのＮa
ＯＨ, pH11.8で滴定して可溶化する。次に溶液を2 分間
超音波処理し、Sorvall SS34ロータで20,000r.p.m.で20
分間遠心して清澄化する。次に溶液を6.5mＭホウ酸塩バ
ッファ, pH11.8で平衡したSepharose CL-6B カラム(5×
100cm)に通す。100 ml／時の速度でカラムを展開し、各
12mlの画分を収集する。カラムを出た第１のピークは捨
てる。第１ピークは低活性の凝集 bＧＨを示し、第２ピ
ークは高活性の bＧＨを示す。
【０１３２】DEAE-Sephacel(25g/100gr 当量ppt)カラム
を6.5mＭホウ酸塩バッファ, pH9.0で平衡する。第２の
bＧＨピークをＨＣｌでpH9.0 にし、DEAE Sephacel カ
ラムに250 ml／時の速度で充填する。カラムを7.5 mlの
6.5mＭホウ酸塩バッファ, pH9.0 で洗い、 75mＭ Ｎa
Ｃｌを加えた6.5mＭホウ酸塩バッファ, pH9.0 で溶出す
る。0.3 より高いＯＤ280 を示す画分をプールし、Mill
ipore Pellicon透析装置でＨ2 Ｏに対して透析し、凍結
乾燥する。
【０１３３】実施例５ pＲec2/3 により産生される
bＧＨアナログの活性 １． bＧＨアナログと天然 bＧＨとのラジオイムノアッ
セイ比較 リン酸塩緩衝生理食塩水(1％BSA)中に100ng/mlの bＧＨ
アナログを含む溶液を調製した。この溶液を濃度50, 2
5, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56及び0.78ng/lまで順次希釈
した。これらの溶液について各0.1 mlのサンプル群を2
組抽出し、二抗体法を用いるＲＩＡにかけた。希釈曲線
は天然 bＧＨで得られる曲線と同等であった。
【０１３４】２．ラジオレセプター結合アッセイ ウサギ肝膜に対するラジオレセプター結合アッセイを、
T. Tushima及びH.G. Freisen(Y. Chin, Endocr. Metab.
(1973) 37, 334)に記載の方法で、 125Ｉ− hＧＨをト
レーサーとし、真正 bＧＨ溶液を校正曲線用に用いて実
施した。3 組のサンプルを0.3 mlのアッセイバッファ(5
0mＭ Tris, 15mＭ Ｃa Ｃｌ2 及び5mg/mlウシ血清アル
ブミン, pH7.6)中、室温で2 時間インキュベートした。
試験管は、 125Ｉ− hＧＨ（30〜60μci／μg の調製物
20,000cpm)と、 150〜250 μg の肝膜タンパクと、天然
bＧＨ(1〜100ng)又は細菌 bＧＨ抽出物のいずれかとを
収容していた。結果は、 bＧＨアナログの bＧＨ活性が
天然 bＧＨと同じ活性に匹敵することを示した。
【０１３５】３．脛骨テスト 実施例４で操作した細菌細胞から回収された pＲec2/3
bＧＨアナログの生物活性を脛骨テストで測定した（A.
F. Parlow et al., Endocrinology(1965) 77,1126）。
【０１３６】生後28〜30日のネズミを下垂体切除し、次
に処置しないで10〜14日維持した。ウシ下垂体又は組換
体E. coliから誘導したウシ生長ホルモンを 0.15 Ｍ
ＮaＣl ＋0.01Ｍホウ酸塩, pH10.0に溶解した。ネズミ
(1群 4〜7 匹ずつ) を正常食（Purina Rat-Chow 及び任
意量の水）で維持し、 bＧＨ溶液の皮下注射(0.2cc中、
5〜125 μg/日) を5 日間続けた。6 日目に動物を殺
し、前肢膝骨を取り出して長手方向に切開し、アセトン
で固定して2 ％Ａg ＮＯ3 で染色した。双眼解剖器(Nik
on) で観察して骨端プレートの幅を測定した。（ラット
当たり40回の読み取りを行なった）平均値を用いて対数
投与量−応答曲線を描いた。結果を図１５に示す。
【０１３７】実施例６ bＧＨアナログ 表１０は、構築された一連のプラスミドとこれらのプラ
スミドから産生されたアナログとを示す。
【０１３８】
【表１０】
【０１３９】実施例７ 乳牛の催乳に対する pＲec2/
3 bＧＨアナログの効果 bＧＨの催乳効果は科学文献でよく知られており、例え
ば、J. Bines et al.,Brit J. Nutri. (1980) 43, 179
及び C. Peel et al., J. Nutri. (1981)111, 1662等
の報告がある。 D. Bauman etal., J. Dairy Sci. Vol.
Supp. 1,Abst 86(1982) は、r ＤＮＡ bＧＨによって
乳分泌が増加することを報告している。天然 bＧＨと比
較した pＲec2/3 bＧＨの催乳効果を測定する実験を実
施した。分娩141 乃至154 日後の18頭のホルスタイン雌
牛を無作為にグループ分けし、以下の如く処理して乳分
泌をテストした。
【０１４０】
【表１１】
【０１４１】毎日の注射の直前に bＧＨを濃度1mg/mlで
0.1 ＭＮa ＨＣＯ3 水性バッファ（pH＝8.2 ）に溶解し
た。雌牛の頚部にプラシーボ又は bＧＨ溶液を10日間毎
日皮下注射した。5 日間の予処理期間は注射しなかっ
た。
【０１４２】午前6 時頃と午後5 時頃との1 日2 回雌牛
から搾乳した。ミルク重量をBoumatic系で記録し、乳デ
ータ系に記録した。
【０１４３】予処理期間と bＧＨ処理期間とにおける乳
分泌の平均値を表１２に示す。コントロール雌牛の産生
レベルは変わらなかったが、双方の bＧＨ処理グループ
では乳量が同程度に増加した。天然 bＧＨでは10日間の
処理で乳が11.9％増加し、 bＧＨアナログ処理では10.2
％増加した。動物数が少ないのでデータを統計的に分析
できなかったが、増加の程度は文献に報告されたものと
同様である。
【０１４４】従って、 pＲec2/3 bＧＨは天然 bＧＨ同
様に雌牛の催乳を刺激するという結論が得られる。
【０１４５】
【表１２】
【０１４６】各雌牛に対し、プラシーボ又は bＧＨ溶液
の皮下注射を1 日1 回ずつ10日間続けた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は発現ベクター pＭＧ100 の構築説明図。
【図２】図２はプラスミド pＲec2/3 の構築説明図。
【図３】図３は発現ベクター pＮＤ5, pＮＤ55及び pＲ
Ｏ11の構築説明図。
【図４】図４は pＴＶ18(1) 及び pＴＶ104(2)の構築説
明図。
【図５】図５はベクター pＡＬ Ｔrp46の構築説明図
（Ｔrpプロモーターとリーダー,アテニュエーター及び
Ｅ遺伝子の25 bp のサブクローニングを示す図）。
【図６】図６はp4754 の構築説明図。
【図７】図７は pＡＬ312 の構築説明図。
【図８】図８は pＡＬ601(Ｒ) の構築説明図。
【図９】図９は pＨis 102の構築説明図。
【図１０】図１０は pＨis-bＧＨの構築説明図。
【図１１】図１１は pＹＬ301 の構築説明図（即ち、Ｈ
aeII断片と合成ＢamＨ1 リンカーから pＹＬ301 を構築
する工程図）。
【図１２】図１２はＯmpＦプロモーターを含む bＧＨ遺
伝子発現用プラスミドの構築説明図。
【図１３】図１３はＭet4 -bＧＨアナログ発現用プラス
ミド pＡＬ401 の構築説明図。
【図１４】図１４はＭet-bＧＨ発現用プラスミド pＡＬ
601 の構築説明図。
【図１５】図１５は脛骨テストの結果（下垂体由来ウシ
成長ホルモンと組換ウシ成長ホルモンの、下垂体切除ラ
ットに皮下注射して5 日後の骨板成長に対する影響）を
示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 アヴイグドル・レヴアノン イスラエル国、ネタニア、ブロデツキ イ・ストリート・３ (72)発明者 アモス・オツペンハイム イスラエル国、エルサレム、ラマト・シ ヤレツト、シユレム・ストリート・５ ／12 (72)発明者 テイクヴア・フオーゲル イスラエル国、レホヴオツト、コソヴエ ル・ストリート・４ (72)発明者 エリシヤ・ゼーロン イスラエル国、ハシヴア、モシヤヴ・ミ シユマール、エリヤフ・シヤミール・ス トリート・７ (72)発明者 メナヘム・ゼエヴイ イスラエル国、ラマト・ガン、ハギルガ ル・ストリート・73 (56)参考文献 特開 昭56−145221（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．79（1982）ｐ. 2808−2811 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/63 - 15/869 C12P 21/00 - 21/02 C12N 9/00 - 9/99 C07K 14/37 - 14/825 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．真核生物ポリペプチドを宿主−プラスミド・システ
    ムを用いて生産する方法であって、 プラスミドを、λバクテリオファージ非耐熱性レプレッ
    サーＣＩを含有する適切な細菌宿主細胞に導入すること
    を含み、 上記プラスミドは、上記宿主細胞の温度が上記レプレッ
    サーが不活性化される温度に上昇されると、上記宿主細
    胞に上記ポリペプチドの発現を可能にさせるものであ
    り、 上記プラスミドは二本鎖ＤＮＡ分子を含み、 上記二本鎖ＤＮＡ分子は、５’から３’方向に、λバク
    テリオファージ由来のプロモーターおよびオペレーター
    ＰＬＯＬを有するＤＮＡ配列、上記宿主細胞により産生
    される抗転写終結因子Ｎタンパク質と結合するＮ利用部
    位、リボソーム結合部位、ＡＴＧ開始コドン、およびＡ
    ＴＧ開始コドンに位相を合わせた上記ポリペプチドをコ
    ードするＤＮＡを含み、ならびに、上記宿主細胞中で自
    律複製し得る細菌プラスミド由来の複製起点を含むＤＮ
    Ａ配列、および上記プラスミドが上記宿主細胞中に存在
    するときに現れる選択可能なまたは同定可能な表現形質
    に関連する遺伝子を有するＤＮＡ配列を含む、上記方
    法。 ２．生産されたポリペプチドを回収することをさらに含
    む、請求項１に記載の方法。 ３．上記ポリペプチドが、成長ホルモンまたはスーパー
    オキシドジスムターゼ、もしくは、これらポリペプチド
    のいずれかの、天然のポリペプチドと実質的に同じアミ
    ノ酸配列と生物活性を有するポリペプチドアナログであ
    る、請求項１または２に記載の方法。
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