JPS6091986A - ポリペプチドの産生を増強する発現用プラスミド及び該プラスミドを含む形質転換宿主細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 介−ｕｌ’ｉ　７と背−母御 遺伝子上挙の１−ノの特徴は、真核生物起ｄ１；（の外
来１）　ＮΔ配列を大腸菌（Ｉｓ、ｃ　ｊ　ｅｒｉ　ｃ
、ｈ、ｊａ−ｃｏ、ｊｉ　）又（」その他の微生物に挿
入４°ろことにあろ１．遺伝１′・Ｉ・Ｖ。

て得られる別の優れノニ特徴は、外来１）　ＮΔかコー
トしているポリペプチドの産生をこれら微生物中て誘発
４゛ろごとにある。ポリペプチドの産生け２段階プロセ
スで生し、各段階が多数のザブステップを含むと考えら
れている。２つの段階（ｊ転写段階と翻訳段階である。

ポリペプチドを効率的に咀産４−るために（Ｊプ「Ｊセ
スの２−〕の段階かノ１に効率的に？Ｊなわれる必要か
ある。転写によ−）゛Ｃ潰伝子（１）Ｎ△）からｍｌ’
ｊＮΔか生成し、翻訳によ１てｍ１ｔＮΔからポリペプ
チドが生成４−ろ。

転′すプ「ノセスの重要なサブステップ（ｊ開始、即１
′）ブ［Ｊモーター−オペレーター領域へのＲＮΔポリ
メラーゼの結合である。プロモーター領域を１１１成４
゛ろデオギノリポヌクレオヂド塩乱の配列を変更し、こ
（１，に、ｊ−ってブ［ノモーターの相対的効率を加減
してもよい３．効率は［えＮΔボリメラーセのプロモー
ター親和性に左右されろ、。

翻訳効率はｍＲＮΔの安定性の影響を受（〕ろ３．ｌ１
１１１　ＮΔの安定性か増４゛と翻訳効率が−Ｌがろ。

ｍＲＮＡ安定性のｉｆ−：　（ｒ（ｉｊな決定因子はｉ
Ｆ、　ｌ？ｉｐにはわか−１−こいないが、塩基配列に
よって決定されろ１Ｉ）ｌ’ｔＮ△の二次構造か安定性
に寄与４〜ることが判１す口２ている。

翻訳の最初のサブステップで（」、Ｓｈｉ＋＋（ＩＩ）
ａ１ｇａｒｎｏ配列又（Ｊリポソーム結合部位（Ｉｔ　
ＩＩ　Ｓ　）として知られろｍ１ｔＮΔ」−の塩基配列
にリポソーノ・か１，１１合する。リポソームがｍ１ｔ
ＮΔに〆１＞ってΔ【ＪＧ翻訳開始＝１トンまて移動ケ
るとポリペプチド゛合成か開始されろ３．これらの二１
トンは連弾、５ｈｉｎ０１）ａ　ｌ　ｇ　ａ　ｒ　ｎ　
ｏ部位から約１０塩基“Ｆ流にγＹ　？Ｅ　４−ろ。翻
訳効率を高めろ要因の１つに、Ｓｈｉｎｅｉ）ａ１ｇａ
ｒｎｏ部位へのりホソーノ・の結合を増強翻ることが含
まれる。Ｓｌ＋ｉｎｏｌ）ａ１ｇａｒｎｏ配列及び八〇
　Ｇ　ｍｌトンの領域でのｍｒｊＮΔの一次構造とＳ旧
ｎｅ−Ｄａｌｙ、ａｒｎｏ配列からΔＬＪ　Ｇコドンま
ての間隔とは、夫々、翻訳効率の決定に関してｌ■要な
役割を果たづ°ことか判明している。翻訳りノ率に影響
を句える別の要因は、早期終結及び減衰である。減衰部
位を除去４′ることによっ−Ｃ翻訳効率を向。」−さＵ
ｏることかｉｉＪ能である。

細菌細胞中て真核生物ポリペプチドを多電に産生４−る
旧画の障害となるのは、多量のｍ１ｔＮＡを産生ずる細
胞が効率良く増殖できないことてある。

このような障害は、抑制というプ〔１セスにより転写を
阻害することによって除去され得る。抑制に於いては、
オペレーター領域に結合（７て転ツ１丁を阻害４゛るタ
ンパク阻害剤（リブレソサータンノくり）の作用によっ
て遺伝子がスイッチオフさ矛する。微生物が所望の細胞
濃度まで増殖した後に、リブレソザーを破壊６−ろが又
はリプレ・ソサーの効果を凌駕し得ろ誘導物質として知
らｈろ分子を！Ｉ’＋　ｌ１ｌｌ　’ｉすることによ−
・て抑制さλ′１．ている遺伝子を活性化°４′ろ。

λバクテリオファージ由来のＩ）　Ｌプ〔１モーターを
含むプラスミド中ての真核生物遺伝子のりｃｌ−二ノク
に関しては文献中に多くの報告が見られる（ＩＩＪ、　
Ｂｅｒｎａｒｄ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　（１９
７９）　５．５９；　ＣＤｅｒｏｍｃ　ｅｔ　ａｌ、、
Ｇｃｎ（！（１９８２）　１７．　４５；　１１．　Ｇ
ｌ＋ｃｙｓｅｎ　ａＬ　ａｌ、、Ｇｃｎ＋＋　（１９）
（２）、１７．５５；　Ｊ、ｌＩ（４ｄｇｐｅＬＩ＋ｅ
ｔ　ａｌ、、　ＭＯｌ、　ＧｔＮ＋＋、　Ｇｔ＞ｎｅＬ
、（１９７８）　ｊ６３．　１９７；　ｌシ。

Ｒｃｍａｕｔ　ｅｔ　ａｔ、、Ｇｔ＞ｎｃ　（１９８１
）　１５．、　８１；　Ｒ，Ｉ）Ｏｒｙｎｃｋｅｔ　ａ
ｌ、、、Ｎａｔｕｒｃ　（１９Ｐ、０）　２ヨ１，７．
　１９３）、リΣに、１９８１年１２月１６１−１公開
の欧州特許出願第０４１．７６７＋シは、λバクテリオ
ファージ（ＩＩ来の１３Ｌブ（Ｉモーターを含む発現ベ
クターを記載している。しかしながら、ごれらの参煮文
献（コい４゛れらＣｒｉリポソーノ、結合部位の使用に
一ノいては記載していない。

λバタテリオフ、・−ソ山米のＰＬプ（ノモーターとＣ
Ｉリポソーノ・４’ｉ合部位とを含むベクターの使ＩＩ
　＋こりいては、八、ｌｉ、　Ｏｐｐｅｎｈｃｉｍ　＋
！Ｌ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１１（ｉｏｌ　、　（１９
ｇ２）　ｊ！Ｊ、　３２７ｉ１ｆびにＩｆ、　Ｓｂｉｍ
ａＬａｋｏ、ｌひＭＲｏｓｅｎｂｅｒ［；、　ＮａＬｕ
ｒｔ！（１９Ｒ１）　２．ｕｚ、１２）ｌに記載されて
いる。これらのＥｌ１行物は、高レベルの０圧タンパク
の産生について記載しているか、真核生物タンパクの産
生を包含又は記載していない。

、１９８２年にＳｈａＬｚｍａｎ及びＲｏｓｅｎｂｅｒ
ｇは第１４回ＭｉａｍｉＷｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉ
ｕｍにポスターを提出した（Δ　Ｒ３ｈａＬＺｍａｎ及
びＭ、　Ｒｏｓｅｎｈｅｒｇ、第１４回Ｍｉａｍｉ　！
ｉｎｌｒ３ｙｍｐｏｓｉｕｍ、抄録９８頁［＋！１８２
］）。この抄録には、λハクテリオファージ由来のＰＬ
とＮｕｔとＣ■リポソーム結合部位とを含むベクターを
使用して゛Ｖ↓核生物”ポリペプチドを細菌宿主中で細
胞タンパクの５％より高い量で合成することか開示され
ているが、（ＳＶ４０小”Ｉ’　（ｓｍａｌｌ　ｉ’　
）抗原は実際に（Ｊ真核生物ポリペプヂドでなくウィル
スタンパつてあろし）、細菌宿主名が示されていない、
（史ＩＴ目、ノニオペレーターか定義されていない、複
製起点（開始点）ら選択１’ｌＪ能な表現型の遺伝子も
認識されてない等の理１＋に、に−・て−１，記の開示
は実施不能である。ごのようなベクターを使用１′るこ
の系は、このベクターを安定に形質転換し得るような成
る種の宿主溶原菌（ｌｌＯｓ、Ｌ　ｌ　ｙｓｏｇｅｎ）
を含むと記載されている。本発明に於（Ｊる１つの、具
体例、例えばｐｌＶｌＧｌｏｏは、前記ベクターに対し
ていくつかの類似点を有する。し、かじながら、ベクタ
ーｐＭ　Ｇ　１００による形質転換に用いられるのは宿
主溶原菌でなく、非耐熱性リブレッザーＣ１とＮ遺伝子
とを含ａしているがｎ［■記溶原ファージ（ｌｙｓｏｇ
ｅｎ）の残部が除去されている適当な１辷呻±１宿主菌
株である。更にベクターＩＴＭに１００は総細胞タンパ
クの２０％を上回る量てｂＧｌｌ及びｌ＋ＧＨアナログ
（ｉｆｆ似休）体産生ずるために使用された。

更に、本発明の別の具体例では、Ｃ４とは異なるリポソ
ーム結合部位か使用されろ。現状て最し好まｌ、いベク
ターてあろｐＮｌ）５及びその誘導体に於いては、Ｉ）
ＭＧｌｏｏで得られる上りら１０％以−１−多い厖でボ
リペプチドを産生し得ろｔ＼クターを作成４′ろノーめ
に、必須でない配列は除去しである。

出願人は最近、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ＬｉｔｕＬｅ
ｓ　ｏｆ　１ｌＣａｌｔｈ。

１）ｅｐＬ、　ｏｆ　１ＩｅａｌＬｌ＋　ａｎｄ　Ｉｌ
ｕｍａｎ　Ｓ（！ｒｖｉｃＯｓ、米国、によるＭ、　Ｒ
ｏｓ＋うｎ　ｂ　ｃ　ｒ　ｇ名義で係属中の米国特許出
願第４５７．３５２号の存在を知−）こ。この出願のあ
る部分はＮａｔｉｏｎａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ｌ＋
＋ｆｏｒｍａＬｉｏｎ　５ｅｒｖｉｃｅ、ＵＳ、　Ｄｅ
ｐＬ、　ｏｆ　Ｃｏｍｍｅｒｃｅから人手てきノこが、
特許請求の範囲はまた機密であり入手不能である。出願
人は該出願の人手し冑た部分について検訓し、この開示
も実施不能であるとの結論を得た。即し、この開示によ
れば宿主が重要であるのに（８頁１７行）いかなる適当
な宿主も確認されていない。更に該出願はλ突然変異体
の使用を基盤と４るのにこの突然変異体が特定されてい
ない（４頁２０行）。更に読出）頓ては宿−１−が溶卵
ファージを含む（８頁１８行）が、本発明では宿主が溶
原菌でない。該出願は真核生物遺伝子、→ノ゛ルメタロ
ヂオネイン遺伝子のクローニング及び発現に言及してい
るが（７頁１８行）これらについて詳細に説明していな
い。該出願ではＣｌリポソーム結合領域のいかなるヌタ
レオヂトの配列ら位置も変更していないと述へられてい
る（３頁２７行）。しかしながら一本発明では、この上
うな変更がｉ、ｉＪ能である。

ウノ又（Ｊヒト牛長ポルモノのｒ）ＬＣ且含何ヘクター
系による発現のｌ成功、生物学的活性を（ｉ４ろｂＧＨ
又はｂＧＩＩアナ【ツタの１争生、このようなアリログ
を金白４”ろ組成物及びその使用、又は、ｒ１８ｒ　−
ｆによ−て産生される総タンパクの２０％を１−１回る
ｔへのボリペブヂ１、の産生を達成４−ろ誘導方法に関
４る開示は当業界にまだ存在１．ない。

遺伝子］−７的に作成しｌソ＼クターて形質転換された
宿主によろｂＧＩ−１アナ［フタの産生に関４′ろ当業
界の唯一つの開示は、天然ｂＧＩＩの）！ニルアラニン
型のＮ　末端にアミノ酸Ｍ（うｔを何４−ろｂ　ＧＨア
アナグを部生４′ろために′Ｉ″ｒｐプロモーターを使
用オる方法てあろ（Ｐ、Ｉｌ、　Ｓｅｅｈｕｒｇ等、　
ｌ）Ｎ八（＋９８３）２、３７）。

遺伝子工学的に作成したベクターで形質転換された宿主
によろｌ＋　Ｇ　Ｌｌアナログの産生に関ケろ当業界の
唯一つの開示は、天然ｈＧＩ−１のＮ−末端にアミノ酸
Ｍｅｔを有ケるｈＧＨアナログ・を産生６°るためにＬ
ａｃ及びｉ’ｒｐプロモーターを使用する方法である（
１）、Ｖ、　Ｇｏｅｄｅｌｌ等、　Ｎａｔｕｒｅ　（１
９７９）　２−Ｐｖ±。

５４４）。

発明の要約 本発明は改良された発現ベクターに係る。

本発明ベクターは、非耐熱性リブレ・ソサーＣ１を含む
適当な細菌宿主細胞、例えばＥ　５ｐｊｐ−ｒ　ｊ−ｃ
　！ｌ　ｊ−、］ｃｏ−１ｊ、に導入された際、宿主細
胞がリブレソザー破壊温度まで加熱された時この宿主細
胞が前記ベクターに挿入された所望遺伝子を発現ｕ１７
め得目、つｉ（ｊ記遺伝子によりコートされたポリペプ
チドを産生じ得るようにする。本発明ベクターは、５′
から３′に向かって、 λバクテリオファージ由来プロモーター及びオペレータ
ーＰ　Ｌ　ＯＬを含むＩ）　Ｎ　Ａ配列と、宿主細胞に
よって産生される抗転写終結因千Ｎタンパクを結合する
Ｎ利用部位（Ｎ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｔｅ）と
、 所望遺伝子のｍ１ｔＮΔを宿主細胞内のリポソームに結
合せしめ得るリボソート結合部位を含むｌ）　ＮＡ配列
と、 Ａ　ｉ’　に開始＝＋トン又は所望遺伝子のベクター内
挿入の際にΔｉ’　Ｇ開始＝１トンに変換されろＩ）　
ＮΔ配列と、 Δ’Ｉ’　Ｇ開始二重・ンと位相を合わせて所望遺伝ｆ
−をベクター内に挿入４−るための制限酵素部位と、を
順次に含む一ユ本領１）　ＮＡ分子を含んでおり、更に
、 宿主細胞中で白律複ツ”ノし得る細菌プラスミドｒｌ−
＋来の複製起点を含むＩ）　ＮΔ配列と、宿主細胞中に
ベクターが存在４”るときに現れる選択６」能又は認識
可能な表現形質に関連する遺伝子を含む１）　ＮΔ配列
とを含む。好ましいベクターはｐＭＧＩｏＯ及びｐＮ　
Ｄ　５である。

生長ホルモン例えばウシ、ブタ、１・り又はヒトの生長
ホルモン、スーパーオキシド゛ジスノ、ターゼ、アポタ
ンパクＩｉＣ、Ｌ：Ｉ蹄疫ウィルスのウィルス性タンパ
クｌ　、　３．　ａｕｒｅｕｓ山来プロテ由来Δ、イン
ターロイギン１１１．酵素又はそのアナロタの４１．１
き所望のポリペプチドをコート七る遺伝子即ちｃｌ）Ｎ
Δを、ベクターの制限酵素部位に挿入してプラスミドを
作成４−ろ。次にこのプラスミドは適当な宿主に導入さ
れ得、該宿−〕゛中で遺伝「・か発現され所望のポリペ
ブチ）・か産生され得る。ｈＧ１１用の好ましいプラス
ミドは、ｐｉえＥＩＣ２／３及びｐｉえＯＩしてあり、
’　ｈ　ＧＩＩ用の好ましいプラスミドはｐｉ’　Ｖ　
１８（＋）及びｌ）　ｉ”Ｖ　１０４（２）である。ノ
凶当な宿−にとしてＥ　ｓ　ｃ　＋！　（！ｒ　ｉ　ｃ
　１１．１−ａｑｏ−１ｉ　八１６３７、八１６４５．
　Δ２６０２及び八１５６３かあり、現在ては八１６３
７がｋｒましい。

得られ）こ宿主へタター系をポリペプチドの製造に使用
し得ろ。プラスミドを含む宿主細胞をポリペプチド産生
可能なＪツ当な条件ドで増殖さ０、得られたポリペプチ
ドを回収ず−る。現行の好ましい条件としては、約４２
”（ンご１０乃至：（０分、特に１５分間増殖さＵ、次
に約３７乃至３９°（ドζ総増殖１０１間が約６０乃至
９０分間になろまて、特に３８乃至３９°（：て約７５
分間増殖を継続４”ろ３、現行の好ましい増シＩＩ“（
培地は、ブドウ糖を加えたラタトアルブミン氷解物又は
ブレーンハートインフ；＋、ノｊｌン（ｂｒａｉｎ　ｈ
（！ａｒｔ　１ｎｆｕｓｉｏｎ）である。

宿主ベクター系を使用してｈＧＩＩ及びｈＧＩＩのアナ
［ｌりを思１製しノニ１．これらの）２ヲ（１り（」、
人〕Ｉ、獣医用又は医薬組成物に混入４′ろごとｈゾζ
きろ、１ごれらの７　Ｊ　［１夕は、人々、ウシの乳分
泌らしくは肉増加を刺激４ろため又（Ｊヒト生長ホルモ
ンの欠乏を治療４る八めに、直接に又は前記の如き組成
物と１５で使用し得ろ、１ １才＜ｊ、１ｆｉｊ−（７）一部へ１−リ１第１図　ｐ
Ｍに１００窪現２ヘクターの（１１７築このプラスミド
は、川Ｐａｌとｊ３　ａ、ｍ、ｔｌ　ＩとにＪニー、て
開裂したｐＫ（１Ｇプラスミドｌ）　Ｎ　Ａ中に、１ｌ
ａｐＨｌ制限部位（３８１５０）とＳａｕ、、３ａ制限
部位（３８３６２）との間に含まれるλファージＩ）　
Ｎ　Ａの断片を挿入することによって構築される。Ｈａ
ｅｌｌｌ−巨紳３ａ断ｊ冒」、１１ｕＬＨ，ＬＲｌ、　
ＣＹ−とＣｌタンパクのリポソーム結合部位（ＣＩ−Ｒ
Ｂ　Ｓ　）を担持している。０１　旧３　Ｓを含むＩ）
　ＮΔをｐＫｃ３０にザプク［）−ニンクして、Ｃ４−
１え１３８のΔ′１゛Ｇ開始コドンの直後に唯・、つの
扶」泗ＩＩＩ制限部位を含み且つΔＴ　Ｇ　＋−リブレ
ッド内にＮｄｅｌ制限部位を含むｐＭＧ　＋００を作成
゛４゛る（第１図底部挿入図参照）。かっこ内の数字は
えファージｌ）　Ｎ△」−制限部位の位置を示ケ。

第２図、ｐｎｅｃ２／３プラスミドの構築ｂＧＩｌｃｌ
）ＮΔを含むプラスミドＤ、をｊｊ−、ａｅ、　Ｉｆて
消化した。得られた１６００　ｌａｐの大所１’ｒを精
製し、５コ二一ツトのＳｌｒ、キソヌタレアーゼで３７
℃で５分間消化しノご。配列 ＧＧＡ八］へＣＣ ＣＣＴＴ八ＡＧへ の合成Ｅ　ｃｏ　Ｒ，１ｊｌンヵーを連結した。生成物
をＩε０９旧で開裂し、１．ｊ〕−ｃ、Ｏ旧で開裂しで
あるｐ１３　Ｒ３２２中に挿入した。Ｅｃｏｌえ１で開
裂４“ると５′端に配列：ＡΔｌ”Ｉ’　ＣＣＣΔ　。

ＧＧＧ’ｌ’、　、　、　。

を有するＩ　２００　ｂ　Ｉ）断片を遊離するクローン
ｐＡＬ　Ｉえ１を単離した。この配列が生成するという
ことは、ｐΔ１川工用か真正ｂＧＩＴの１番目の残基（
）Ｊニルアラニン）をコート４るｉ’　ｉ″ＣＣコドノ
むＥｃｏ旧制限部位を含（１゛４−るこ々を示している
。ｐΔＬ　Ｒ１をハ↓−１て部分開裂した。消化物をｊ
ｌ−ｉ　＋４ｄ　Ｉｌｌリンカ−で連結し、ＥｃｑＲｌ
と則ｉ　ｎｄ　ＩＩＩとで開裂した。

ｂＧ　Ｈｃｌ）　ＮΔを含む断片を単ｎ１トシ、ｊｐ、
−ｃｏ、Ｉｔ　Ｉ及びＩＩ　ｊ−ｎ旧１１の制限部位間
てｐＢＩζ３２２にザブタ［ｌ−ニンクしｐＡＬ５００
を１リニ。ザブ゛クローニンクし）こ１ＩＧＨｃＤＮＡ
断１’Ｉを３視１ｔｌ及び−！Ｌ　ｉ　ｇ、ｄ　ＩＩＩ
でｐΔＬ５００から切除し、ｌ）　ＮΔポリメラーゼＫ
ｉｔうｎｏｗ”断片で°°充填（ｆｉｌｌ　１ｎ）Ｌ”
、Ｂａｍ１−目部位で開き上記と同様に°“充填し”た
Ｉ）Ｍ　Ｇ　１００発現ヘタター（第１図）に挿入した
。得られたベクターｐｌｉ（！ｃ２／２は、アミノ末端
が次式 ％式％ のθＵ　＜変化している変性ｈＧＩ］を発現オろ。プラ
スミドｐＲｅｃ２／２を片旦ｌで消化し、Ｉ）Ｌブ「１
モーターとｂＧ［ｌ遺伝子の５′端とを含む断片を１１
１．離した（断片Ａ）。この断片をｐΔ１，５００から
得ノ、二ＰｓＬＩ断片（断片Ｂ）に連結した。ここで得
られにヘタター　ｐＲｅｃ２／３はアミノ末端が次式％
式％ の如く変化している変性ｂＧＩＩを発現４−ろ、。

第３図　弁渥企久り−ニーＰ−監−レー髪、−−−−ｒ
２ｊ＼セ→−５−及びｌ）Ｉえ０１１の横降 ブラスミ　ｌ；’　ｐ　ＯＧ　？　（八、Ｌｌｐｐｔ！
ｎｈｃｉｍ、Ｓ、ＧｏＬＬｃｓｍａｎ及びＭ、　ＧｏＬ
Ｌ（！ｓｍａｎ、　Ｊ、　ＭＯｌ、　１（ｉｏｌ、　（
１９ｇ２）　ｌ−５８゜３２７）を区傾１て開裂した。

ＰＬプロモーター１１１１１１−。

ＬＲ及びＣ４−Ｉｔ　１３　Ｓを担う大断片の末端を連
結し２てＩＴＮＩ）５発現ベクターを得た３３　ごのＩ
ＩＮ＋）５ベクター　１．）　ＮΔをＮ（１旧ζ開いた
。ｂＧ　ＩＩ　ｃｌ）　ＮΔを含むｐＲｃｃ２／３（第
２図）から得た−［−（１−ｅｌ断片を挿入（、プラス
ミドｐｌえ０１１を得た。プラスミドｐｌＮＯＩｌは、
第２図の変性Ｌ＋ＧＩｌの発現体（ｅＸ　１１　ｒ　ｅ
ｓ　Ｓ　Ｏｒ　）とし、てｐＲｅｃ２／３より優れてい
ると考えられる。Ｎｄ、、ｌ−ζ開裂したｐＯＧ７に配
列 Ｉへ’ｌ’　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｃ’ｌ’　（’、ΔＡＣ’「
ＣＧへＧ１八Ｉ を何４°る合成リッカーを挿入ケろと、Ａ　Ｔ（？の１
前に唯一っのＳ、ＲＣ，Ｉ制限部位を含む発現ヘタター
ｐＮｌ）５５が得られる。ＩＴＮＩ）５５を叫−鼾１て
開裂し１）ＮΔポリメラーゼ゛’Ｋｌ（！ｎｏｖ”断片
で処理４′ると、１狛。

ブし！モーター及びＣＢ　１３ＨＳの後に（ｒ７１４゛
ろΔ’ｌ’　Ｇ開始二ｊトノが得られろ１．ごのヘタタ
ー（Ｊ、Δ′１゛Ｇ開始＝＋１：ンか欠失している種々
の真核１１物］市伝了の発現に適している。

ｈＧｌｌをコードセろｃＤＮΔをｐＴ（Ｒ３２２の一す
−１旧１１１＋部位に標準法てクローニングし５てプラ
スミドｐＴＶ　ＩＩ　（冊Ｉを、凋製した（Ｍｅｓｈ、
　ｌＥｎｚｙｍｏｌ　、　（１９７９）６−８−．７５
）。このプラスミドを一部）県（ｌ　ｌ１ｌ−Ｃ消化し
）こ。

得られた８００　ｂｌｌ断片を精製し、−ｊｓ−ｎ　ｕ
　Ｉ）　Ｉｔて更に消化し−ζＩ）　ＮΔポリメラーゼ
゛’Ｋｌｅｎｏｗ”断Ｆ、で゛充填した′０この処理に
よってｂＧＨの最初の１６個のアミノ酸のコドンか除去
されろ。得られノ月）ＮΔ断片を、Ｍｅｔ”以降のｈＧ
Ｉ−１の配列の：ｌ　Ｉ’　：／を回復し目つＭｅｔ’
″のΔｉ’　Ｇコドンの手０１ｊのべ−５１４＋ｊ制限
部位をｒ１４牛オろ合成リンカ−と連結した３、Ｎ≦」
（ｌｌて処理後、この半合成り　Ｎ　ＡをＮ　ｄｅｌで
開いたＩ）Ｎ１）５ヘクターに挿入１．　）こ。得られ
たプラスＥ　Ｆ’ｐ’ｌ”Ｖ　１８（１）は、■）ジブ
ロモ−ターのコンドロールド″て１＋Ｃｌ−１を発現オ
ろ。このｈＧｌｌは、最初の１３個のアミノ酸か欠失し
ておりＮ−末端にＭｅｔ”を何するアナロタである。

プラスミＦ’　ｐＴｖ　＋８（１）をＮ、ｄｅｌで部分
消化し、１１ＧＩ＋のアミノ酸１１：（の：Ｉトノを含
む合ｉｋ　１１ツカ’ｌ’　Ａ　’ｌ’　Ｇ　Ｔ　ｌ’
　ＣＣＣへΔＣＣＡ　’ｌ”ｌ’　ＣＣΔ′ＩＩ八ｌ’
　へ　Ｉ：　ＣＧ　ｌ’　ＣＩ’　Ｇ　１”ｌ’　ＣＧ
　Ａ　ＣへへＣＧＣへＣへへＧ　Ｇ　Ｇ　’ｌ”ｒ　ｃ
　ｃ　’＋八へへＧｌ゛八へへ゛八Ｇ　Ｇ　Ｇ　ＯΔ〇
ＡＣΔ八Ｇ　Ｃへ’　Ｇ　ｌ”ｌ　Ｇ　ＣＧΔ１と結合
した。このリンカ−（」すｙに、１）′Ｉ″ｖ　＋ｓｍ
の１３、−５ゆ１部位と相補的てＩうり、完／ＩゝＩｔ
Ｇｌｌ遺伝ｊ′をｐＮＩ）５発現ベクター（第３１＊１
）ｏ）八′１゛に開始：トノと位相を合わ已て配置４′
ろ、　ｉｉＥ　−＋−Ｃ１得られへプラスミドｐｉ’　
Ｖ　１０４（２）ｆｊ：　Ｎ　末端に伺加メーｆ・剖−
ンを何４−ろ天然１＋ＧＩ−１を発現する１、第５図は
’Ｉ”　ｒｐブ（！モーターとβ　カラクトノグーゼ遺
伝子に転゛ｌ）的に融合され八ｉ’　ｒ　ｐ　Ｅ遺伝子
の最初の７側のアミノ酸とを含む／＼クターｐΔＬ　ｉ
’　ｒｐ４６を示４＝。

第ｔ）図、第７図及び第８１叉１ｔ、Ｊ、’Ｔ　ｒｐブ
１ノモーターの一部及びｌ、ａｃオペレーターとそれに
続く所望遺伝子を挿入１．゛ζ′、ｌ’ａｃプロモータ
ーのコノｌ−ｒノール下てｂＧＩ（を発現させるための
制限部位を含む一連の発現／＼クター（１’ａｃ）を示
づ′。

第９図及び第１Ｏ図は、ヒスチジンブ（Ｊモーターのコ
ンｌ−ｏ−ルトにあるｂＧ　Ｉ−Ｉ　ＣＩ）　ＮΔ含金
白現ヘクターを示４−６ 第１１１！目まＬａｃプ「１モーターの＝Ｊント「ｌ−
ルドの発現へフタ−へのｂＧＩＩ遺伝子の挿入を、：＋
　１　、、第１２図は、ＯｍｐＦプロモーターのコント
１ノール丁でのｂ　Ｇ　Ｈ遺伝子の発現を示ｌ−０ｂＧ
Ｉｌのアミノ末端の最初の３個のアミノ酸か欠失した修
ｆイ１（形１＋　Ｇ　ＩＩ　（Ｍ　ｅＬ４１＋　Ｇ　ｌ
−１）を発現４〜ろ１）Δｌ、４０１の（１４築には以
下の：３断ｊ″１連結（ｔｒｉｐｌｔ！ｌｉｇａ１．１
ｏｎ）を用いろ１、 （ａ）　１）Ａ　１．、５００から切除した一！１−ｖ
ｕ１１と！ｌ　ｉ　Ｉｌｌｌ　Ｉｌｌとを何４′ろ６２
３　ｂ　ｐのｂＧＩＩｌ）ＮΔ断昌。

（ｂ）２本のｌ）　Ｎ　Ａ鎖を合成し１．精製後アニー
ルしＣＣΔＴＡ’ｒＧ　ＴＣＣ’ｒ　’ｌ’Ｇ　’ｌ’
ｃｃＧＧ　ＣＣ’ｌ’Ｇ　ｌ’ｉ”ｌ’Ｇ　ＣＣΔΔＣ
ＧＣ］’Ｇ１’ＧＣＴＧＣＧＡＣ八（χ；八へＧＣＣＣ
ＧΔＧＴＣＧ’ｌ’ＧＧ八へＧ１’ＧＧＴＣＧ八ＣＧを
形成し、Ｉ）　ＮΔポリメラーゼ“Ｋ１（８旧）Ｗ°゛
断片を用いて゛充填し゛、次にＮ、−ｄ−ｅ、ＩとＰ　
ｖｕ　Ｉｆとて開裂しで５８ｂｐ断片を訳１製し、回収
精製して得たリンカ−３、（ｃ）発現ベクターｐＯに　
１のｌｌ−ｉ　−ＩＩ　（Ｉ　Ｉｌｌと（Δ′Ｉ”　Ｇ
　ｌ’ｉ！ｉ姶コドンから遠い）１個の履−倶８１部位
を除、ｊｓ　Ｌ　′ζ得ノ二１）Ｎｌ）６の５ａｌｔ！
！ｌ（位にｌ均一＋Ｈ，ｄ　Ｉｌｌリンカ−を導入して
（ｑ〕こｐＮ　Ｄ　１１　。

構築 ａ）プラスミド１）△［４０１を＋９．、−ｄ、ｃ　Ｉ
て処理４′ろ。へ′Ｉ゛Ｇ開始ツクナルとノミ然ｂＧｌ
ｌのアミノ末端の最初の３個のアミノ酸のコ１−ンとを
含む合成１）　ＮΔリンカ−をＮｄｃ、１部位に連結４
−ろ１、得られノこベクターｐΔＬ６（１１４よ、アミ
ノ末端に（’ｔ　ｌ＋ｔ＋メチオニノ残Ｊ１１゜を含む
天然ｂＧｌ−１を発現ｕしめろ。

ｂ）オリコデオギンリポヌクレオチドリンカーの構造を
鼓形しａ・）に記載の手順を用いて、　・連の修奮１ｊ
ウノ生長ポルモンをコードする一＋＋’ｌのベクターを
構築４ろ。修飾生長ホルモンは、Ｎ−木端のメチオニン
で始まり、続いて１番目と２番１−１の各々に２０個の
自然発生アミノ酸のいずれかか存在し、３番日にＧ　ｌ
ｕｇ’；　Ｉｎ、１．、Ｙｓ、ＭｅＬ及び’ｒｒｐ以外
の２０（１，Ｉ、ｌのアミノ酸のい４“れかが存（１−
七ろ３，４番目から０００　Ｈ−末端までの配列は天然
ｂＧＩＩの配列に等しい。

第１５図・Ｉｊ’！！、　’ｔｒｉ−オ不’ｐ　（’ｊ
ｉ　ｂ　ｉ町−砂５ｔ）−Ｆ垂体切除ラットの・ｔ’ｔ
　４Ｍ　（Ｊｏｎｔ；　ｐｌａｌ）’ＩＥ艮に対４′ろ
ｐｎ　ｅｃ２／３　ｂＧ　ｌ−Ｉアナロタと置市１＋Ｇ
Ｉｌの彰響の比較を示す。

幻Ｉ３ヱと膠珊−β−説週）一 本発明にＪす、遺伝子発現とポリペプチド発現のレベル
向上を達成し得るべ、フタ−か開発された。

本発明のベクターは一本鎖１）　ＮΔ分子てある。この
ベクターを非１１ｉ４熱性リプレノザ−０１を含む適当
な細菌病１−細胞に導入し、宿主細胞の温度をリプレソ
ザー破」ψコ温度まて上η１４−ると、この／＼タター
により、宿し細胞は、ごのヘタターに挿入された所望遺
伝ｒ−を発現（ｌしめ得１−Ｌつこの遺伝子か＝１−ド
しているポリペプチドを産生じ得るようになる。

前記ベクターＬ１．，５’から１３′に向かって、λバ
クテリオファー）由来のブ（１モーター及びオペレータ
ー１）　シＯＬを含むＩ）　ＮΔ配列と、宿１ぞ細胞に
、ｊ−・ご産生される抗・トム゛Ｉフ終結因ｒ・（ａｎ
ｔｉＬＬ汀ｍ１ｎａｔＯｒ）Ｎタンパクを結合４゛ろＮ
Ｔり田部位と、 所望遺伝子の…Ｒｉ’ＪΔを宿主細胞内のりポソーノ、
に結合ｕしめｉ５７ろリボソート結合部位を含むＩ）　
Ｎへ配列と、 Δ′１′Ｇ開始フトン又は所望遺伝子のヘクター内挿人
の際にΔｉ’　Ｇ開始コドンに変換されろｌ）　ＮΔ配
列と、 Δ′Ｉ″Ｇ開始コドンと位＋’１１を合わ口て所望遺伝
子をベクター内に挿入４−ろ丸めの制限酵素部位と、を
順次に含む。

本発明のベクターは史に、宿主細胞中で自律複製し得る
細菌プラスミドから得た複製起点を含む１）　ＮΔ配列
と、宿主細胞中にヘンターｈ−ａ在するときに現パ１ろ
選択可能又は認識可能な表現形？ｊに対応４る遺伝ｒ−
を含むＩ）　ＮΔ配列とを含む。

ベクターと共に使用される宿主は、ＩＥｓｃｌ＋０ｒｉ
ｃｈｉａｃ９−１−ｊである。現在好ましいと考えられ
ろ菌株はΔ１６３７．Δ１６４５．八２６０２及び八１
５６３であり、八１６３７が最乙好ま１．いと考えられ
ている。この菌株は、Ｃ６００のカラクト−スオぺ［ｌ
）とカラン）・−スオベ（Ｊンに近いλ発現系との１ｙ
：部にテトラザイクリン耐性逍伝ｒ−含有のトランスポ
ゾンを挿入して１−トられたらのである。この菌株は、
詳細に後述Ａる如き種々のプラ不ミー・を含有さ１１て
八ｍ（！目ｃａｎ　’ｌ’ｙｐｃ（ Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ＬＮｒｔｉｏｎ、　ＩＩ（−
１ｃｋｖｉｌｌｅ、メリーシント。

アメリカに寄、ｆされている１、ごれらの寄ＨＬ＋、Ｊ
全゛ζ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒ＋〕ｃＯｇｎ
ｉｔｉｏｎ　（汀　Ｌｈｅｌ）ｃｌｌｏｓｉｌ　（ｌｒ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに関４ろブタベスト条約
にＪｉｌ’づ＜、ｌへ１６４５は（ＪＲビ（カラッ）・
−ス発酵能）とデー・ラザイクリン耐慴の欠失に対重ろ
選択に、［、ってＡ　ｌ　６３７から得られた。Δ１６
４５はλ発現系を！ｆ持しでいろか、トランスポゾンの
一部は選択に、ｊ、って除去されている。その人工置型
はＣ６００ｒ−ｍ’ｇａｌ’Ｌｌ＋ｒ　１ＯｕＩａｃ　
Ｚ’（λｃ１８５７ハ＼１１１　△Ｉ３八Ｍへ’）であ
る。

八２６０２とΔ１５６３とは５Ａ５００から誘導されろ
。ごれらの表現型は大々、５Ａ５００　ｂｉｓ−ｉｌｕ
ｇａｌへ８（λ（：１８５７△Ｉ（１／＼１３八Ｍｌｌ
＋及び５Ａ５００　ｂｉｓ”ｉｌｕ−ｇａｌ／＼８１ａ
ｃＺｘＡ２１　（λＣ１８５９１ｎＬ２　ｘｉｓｌ　１
１ＬＩＬ１．：（△Ｉ（１）である。

好ましく（」ヘタターか共合結合て閉鎖した環状二本鎖
分子である。１．か１．なから、／＼クターが共有結合
的に閉鎖４ろことは必須条件ではない。

宿主細胞がＣＩリプレッ→ノ゛−破壊温度まで加熱され
るとベクターが発現レベルの向上を達成ケる。

このためには約４２℃を上回る温度が有効である。

不要な加熱は宿主細胞に損傷を与え名のてできるた（ｊ
避りたほうがよい。従って、一般的には温度か４２°Ｃ
を２乃至３°しか」二回らな′いように４゛るのが好ま
しい。

ベクターの１つの重要な成分はリポソーノ２、結合部位
である。適当な部位は、配列 ＴΔΔＧＣ，へへへＴΔＣ１’ＴＡＣΔ１′Ａ゛ドｒｃ
ｃ１’Ｔ１Δ１Ｇ八八１’ＧＴ八を有するλバクテーリ
オファージからのＣ且。

配列 ′Ｉ′ΔΔＧＧ八ＡＧＴ八Ｉへ　’ｌへｌ’　Ａ　ＣΔ
゛「Ａ　１’　Ｔ　ＣＣ’ｔ　１’　Ｃ八１’　Ｇ　Ａ
　八Ｔ　Ｇ　ｌ八を有する合成オリゴヌクレオヂド、及
び配列。

ＴＴＴＴＴＴＴＡＣＧＧＧＡＴ１’ＴＴＴＴ１八ＴＧ八
Δ八八八八八１’　Ｇ　ＣＣＣ１’　Ａ八人ΔΔへへ１
゛ΔＣを有するλバクテリオファージの主要頭部タンパ
ク遺伝子（ｍａｊｏｒ’ｈｅａａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇ
ｅｎｅ）である。

ベクターの別の成分は、Ａ　’ｒ　Ｇ開始コドンと位相
を合わＵて所望遺伝子をベクターに挿入するための制限
酵素部位である。このような部位として種々の部位が使
用され得る。現在好ましいと考えられるのは襲−リ、１
１１　、斗−秤１及び■ｅｌである。

ベクター（Ｊ史に、宿主細胞仲で自律複製し得る細菌プ
ラスニｌ’Ｎｌｌ来の複製起点を含む。適当な複製起点
は種々の起鯨から得られる。現在好ましいと考えられる
のＩＪ：　ｐｌ３　Ｉｔ　３２２又はｐＲ１山来０複製
起点ある。

ベクターか宿１°細胞中に存在するときに現れる選択可
能文（Ｊ認識＋ｉＪ能な表現形質に対応側る遺伝子を含
むＤＮＡ配列もベクターの成分の１っである。適当な遺
伝ｊ′−は’／に：ｒ度悪感受性は薬剤耐性例えばアン
ピシリン、クロラムフェニコールらしくはテ１〜ラザイ
クリンへの耐性に対応する遺伝子である。

従来の科学文献に記載されたベクターに比較して本発明
のベクターは、所望ポリペプチド産物をコードする多く
の種類の遺伝子の発現向りのために使用され得ろ。適当
な遺伝子としては、生長ホルモン、例えばウシ２ブタ、
トすにワトリ）もしくはヒトの生長ポルモノ、スーパー
オキシドンスノ、ターゼ、アポタンパクＥ１手足Ｉｊ病
ウィルスのウィルスタンパクｌ　、　Ｓ、−、ｉｕ＋Ｉ
ｅ−ｕ、ｑのブ〔ＪテイノΔ、イノターＬ１イギン１１
１．酵素又はこれらのアナ［１りをコードする遺伝子を
挙げるごとかできろ。アナ［ｌりなる用語は、自然発生
ポリペプチドと同し活性を６４−るがポリペプチドのＮ
末端にｌす以１．の別のアミノ酸を有ケるポリペプチド
を意味４ろ。

ベクターは、本発明の分り！Ｔの当業者に公り、１１の
方法で形成され得る。これらの方法は本明細書中で参弯
として示した種々の刊行物に極めて訂細に記載されてお
り、これらの［１１行、物の内容は、技術状態に関ずろ
完全な情報をノラえるノニめに本明細書中に含まれろも
のと４−ろ。

現在好ま１７いとされるベクターの１−：＋ｆＪ、第１
図の制限地図を（了４るｐＭＧｌｏｏてあろ３．ごのベ
クターの！ｕ−ａ−’ｌ！−”　ｌ制限部位にウシ生長
ポルモノをコート４−ろｃｌ）ＮΔを挿入した。、　ｉ
Ｗらイまたプラスミ譬 ドはｐｉｔ　ｅｃ２／３　ｂＧ　ＩＩと指称さイ１ろ。

ごのプラスミドの制限地図を第２図に示１ｏプラスミド
ｐｌｔｔ！ｃ２／３ｂＧＩＩは従来の形質転換法を用い
て１４ｓｃｌ＋ｅｒｉｃｈｉａｇｏｌ−ｉ−八ｌ　６　
：（７株に導入されノニ、、得らイまた宿１１＼クター
系を八１Ｃに受託６叶：（９３８５’で寄託（、ハ。

現在好ましいとさイ１ろ第２のベクター（Ｊ第３図の制
限地図をイト）′ろＩＩＮＩ）５である。ウシ生長ホル
モンｃｌ）ＮΔをＮｄ−制限部位に挿入した。得られた
ブラストをＩＩＲＱｌｌと指称４−ろ。ｐｌえＯｌｌの
制限地図ら第３図に示されている。プラスミド１）１１
０１１を形質転換によって均一ρｏｊｉ　Ａｌ６３７株
に導入した。得られノニ宿」−ベクター系をΔ゛Ｉ’　
ＣＣ受託番号３９３９０て寄託した。

ベクター１１ＮＩ）５らまたヒト生長ホルモンのクロー
ニングに使用された。ｐｉ−ｖ　＋ｇ（＋）なる名称の
１つのプラスミドとｐＴ■１０４（２）なる名称の別の
プラスミドとを、ｈＧ　ＨｃＤ　Ｎ　Ａを想蛭１制限部
位に挿入することに、Ｌっで作成した。１１　ｉ″Ｖ　
１ｇ（１）は第４図に示されている。このプラスミドを
形質転換によって１３．−、−　ｇ　ｑ月−Ａ　１６３
７株に導入した。得られた宿主ヘクター系をΔＴ　ＣＣ
：受託番号：（９３８６で寄託した。。

ｐＴ　Ｖ　１０４（２）は第４図に示されている。ごの
プラスミドらまたＥ、−ｑｏｌ−ｉへ１６３７株に導入
された。得られた宿主ヘクター系をＡ　’ｌ’　ＣＧ受
託番号：（９３１１４で寄託　し　）こ。

同し手順を使用し、本発明のベクターの制限酵素部位に
所望ポリペプチドをコード４゛る遺伝ｒを挿入ずろこと
によって別のプラスミドを調製し得ろ。

」二記の宿主ベクター系てはＥ、、　ｃｏｌｉ　Ａ１６
３７を使用した。しかり、　／、Ｊ：がら、既に示した
ようにＡｌ６４５゜Ａ２６０６及びＡ　ｌ　５６３の々
１１き別の菌株の使用ら６■能である。これらの宿１゛
ｌ＼クター系は、ウソ及びヒトの生長ホルモンの如１等
ポリペプチドの産生に使用され得る。そのためには、ポ
リペプチドを産生じ得る適当な条（７１ドで宿−１−、
ヘクター系を増殖し、次にポリペプチドを回収４−ろ３
゜ 適当な条４’ｌと（Ｊ、約４２℃で適当な時間を要して
宿主ベクター系を増殖さ■、次いで約３７〜：（９°に
一ζ更に成る好悪の１１℃１間増殖を継続４゛ることを
像味し、この増殖は適当］、了培地中て実施゛４゛ろ。

好ましくは、４２℃−この初期増殖時間が約１０乃至３
０分間であり、：（７〜３９℃での増殖時間は総増殖時
間が約６０乃至９０分間になるように還択される。好よ
し７くは４２°（：゛ζ約１５分間の増殖と３８〜３９
℃で約７５分間の増殖とを順次に行う。適当な培地とし
ては、ブドウ糖を加えたラクトアルブミン氷解物とブレ
ーンハートインフュージョンとがある。宿主中てヘタタ
ーを安定に維持Ａ′るには、例えば抗生物質を加えて宿
、（二を選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｅｓｓｕｌ
（：）　ｌ゛に維持ずろごとか不ｉｉＪ欠である。。

０１ｊ記方法によって、多数のｂＧＩＩ及びｈＧ１１ア
ナログを調製した。ごれらは自然発生ホルモンの活性を
（ｆ４゛るか又は何し得る。

ｂ　Ｇ　Ｉｔ−’）’すｌ’Ｊりは入熱ｂＧＩＩの活Ｉ
ＩＩを（ｊ（２て、じりＮ　末端で５側以内のアミノ酸
が変化ｊ７ている以外は入熱ｂＧＩＩと等しいアミノ酸
配列をｒｒ　ｔろ、。

アミノ酸変化の例としては、 （１）ツーｒ二−ルアラニーン形１＋ＧＩＩのＮ一本９
１１ｉ１　ｆこ（：Ｉ加されたアミノ酸メヂオニン。

（２）アラニン形１＋ＧＨのＮ−末端にイ・］加さイ１
ノ二アミノ酸メヂオニーノ。

（３）フェニルアラニノｊ［ヨＩＩＧＩＩのＮ　末女品
１に１・ＩＩ川された）アミノ酸量列Ｍｔ！Ｌ　Δ８１
１　（＋　Ｉｎ。

（４）アラニン形ｂＧＩｌのＮ　末端にイ・］加された
アミノ酸配列Δ１ａ−Ｇ　ｌｙ。

（５）アラーン形ｂＧＭのＮ　末端にイ・ｊ加されたア
ミノ酸配列ＭｅｌＧＩｙ。

（６）アラニン形ｂ（冊Ｉの−Ｎ−末端にイ・ｊ加され
たアミノ酸配列Ｍ０１ΔＳｌ）　Ｐ　ｒＯ−ＭｅＬｌｒ
　１ｙ。

（７）フェニルアラニン形ｂＧＩｌのＮ　末端にイｔ　
ＪＪＩ＋されノこアミノ酸配列Ｍ（！［Δｓｐｌ〕＋・
０゜（８）フェニルアラニン形ｂＧＩＩのＮ　末端にｆ
：Ｉ加されたアミノ酸量タリＭ　（！ｔ　−′Ｉ’　ｈ
ｒ　Δｒｇ。

（９）フェニルアラニン形ｂＧＩＩのＮ　末端から除去
されノこメチオーツ（４番ＩＸｌ　）までのアミノ酸が
ある。

ｂＧＩＩアサ「ツクは、アミノ酸量クリＭ＋；１（Ｘ）
ｎ　ＹＭ（！Ｌ １式中、Ｍ（うＬはＮ　末端、Ｘ　＋、、Ｊｌ　２０　
個の自然発生アミノ酸のい４イ′１が、ＹはＧ　ｌｕ、
Ｇ　１１＋、Ｌ　Ｙｓ９Ｍｔ！ｌ　’ｙ！−は’Ｉ’　
ｒｐ以外０）　２０１１古ｌ　ノーＪ’　ミ／酸ノＬｌ
　ａ′）１が、ｎ　ｆＪ：　ＯＪ’）至６（７）ｌと数
及びｔｖｌ＋：Ｌ、、、ｉＪ、４番１１がらＣ（ＩＩ　
Ｏ１１末端（１９１番目）よての入熱ｂＧＩＩの配列て
あろｌを何４′ろ。

ｈＧＩｌアジ（Ｊり゛は天然ｈＧＩＩの活ヤＩを何して
おり、Ｎ−末端の変化以外は天然ｈＧｔｌと等し、いア
ミノ酸配列を有する３、アミノ酸変化の例と１）ご（」
、（１）天然ｈＧＩ−１のＮ−末端に付加されたアミノ
酸メチオニン。

（２）　ｈ（’、’　ＩＩ　（Ｊ）　Ｎ−−末端から除
去されたメチオニン（１４番目）よでのアミノ酸がある
。

＋１ＣＩ＋アナロクは、アミノ酸配列・ＭｅＬ−（Ｘ）
ｎ−Ｙ−ＭｅＬ、、。

１式中、ＭｅｔはＮ−末端、Ｘは２０　（１，Ｖ＋の自
然発生アミノ酸のい４れか、ＹはＧ　ｌｕ、Ｇ　Ｉｎ、
Ｌｙｓ、Ｍｔ！Ｌ又はＴｒｐ以外の２０個のアミノ酸の
い４゛れか、ｎは０乃至１３の整数及びＭｅｔ、、、、
ｆ；ｌ、１４番に１からＣ００ＩＩ−末端（１９１番目
）までの天然ｈＧｔｌの配列であろ１を何４る。

ｈ゛効重１種以上のｂＧｌ−１アナ［１グと適当な担体
どを含有４′ろ獣医用組成物を調製し得ろ、１この上う
な担体は当業者に公知てあろ１．ランの乳分泌又は肉形
成を促進４ろ八めに−ノ′す［ノブを面接ウシに投′″
Ｊ（−てらよく、又（」組成物にし−ζ投１ルζらよい
。

有効…の１挿具１′のｌ＋　（Ｊ　１口′す［ツクと適
当な担体とを角４Ｊ４゛ろ薬ｉｊ’ｌ　＃ｌｌｌｌ金物
製し得ろ、、こＡ１らの１１」休は当業者に公）：Ｕ−
ζある。ｌ＋ＧＩＩの分泌不足を生した！お者を治療４
るノニめに、中、者例え（Ｊ小人１．Ｉ−ｔ、　８にア
づｔ）夕を的接投りしてムよく、叉（」組成物にして投
”ｊし’ｊＣらよい１、 火ｊ１１Ｆ。

以下の実施例（」本発明の理解を助（］ろたぬに提ｉ＋
ｔされた乙の“（Ｆ　ｔｊ’Ｉ”）、本発明の範囲を限
定４−ろひ図（Ｊなく、本発明０）範囲を限定４°ると
解ｆＲされて！Ｊならム一′Ｌ）。実施例においては、
ベクターの構築、咳当ボリペプチドを＝１−１〜する遺
伝子のｔ＼ツクー内挿入、得られたプラスミ）・の細菌
宿主内導入等のために使用された従来方法について詳細
に説明していないか、これらの方法は当業者に公知であ
り、以下の如き多数の刊行物に記載されている。

Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎ０　Ｍａｎｉｐｕ
ｌａＬｉｏｎ、　八ｎ　１ｎＬｒｏｄｕ−ｃＬｉｏｎ　
ｔｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　１７１１ｇｉｎｅｅｒｉｌ１ｇ
、　２＋１（Ｉ　ＥｄｉＬｉＯｌｌ。

ｃｄｉＬＯｄ　ｂｙ　ＩｉＷ、（ｌｌｄ　ａｎｄ　Ｓ、
１１．　Ｉ’ｒｉｍｒｏｓｔ：、Ｕｎｉｖｏｆ　Ｃａ１
ｉｆ、　Ｐｒｅｓｓ　（１９８１）ＭｃＬ、ｌｆｚｙｍ
ｏｌ、ｖｏｌ、６８．　ＲｃｃｏｍｂｉｎａｎＬ　］）
Ｎ八、ｅｄｉＬ（！ｄ　ｂｙ　ｌ１ａｙ　Ｗｕ・ Ｍｅｔ、　ｌｎｚｙｍｏｌ、　ｖｏｌ、　６５．　Ｎｕ
ｃｌｅｉｃΔｃｉｄｓ（Ｐａｒｔ　ｌ）。

ｃ＋１ｉｔｔ：ｄ　ｌａｙ　Ｌａｗｒｅｎｃｅ　Ｇｒｏ
ｓｓｍａｎ　ａｎｄ　ＫｉｖｉＯＭｏｌｔｌａｖｔ）Ｔ
、　ｈｌａｎｉａｔｉｓ、　１４．Ｉ’、　ｌ’ｒｉｔ
ｓｃｌ＋　ａ＋１（ｌ　Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｍｏ１ＯｃｕｌａｒＣ，１ｏｎｉ［ｉ；八Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙｈｌａｎｕａ１．ＣＯＩ（ＩＳｐｒｉｎｇｌｌ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮＹ　（１９８
２）１１、Ｖ、　Ｉｔ〕ｒ＋＋ａｒｄ　ｃＬ　ａｌ、、
　Ｇｅｎｅ（１９７９）　５．５９Ａ、ＩＬ　０ｐｐｔ
！ｎｈＯｉｎｔ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｊ、　ＭＯｌ、　１
ｌｉｏ１．　（１９８２）１５８、３２７ １、ＲｅｍａｕＬ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　（１９８
１）　１５．　８１寒施３舛１−　光−桿−へ？−ター
ニ一本明細当て使用される発現へクタームろ用１；ｊ５
は、細菌特にｌ；−ｃ３λＶ１中で所望遺伝子を発現４
−ろのに有用な１■のプラスミドを意味４”ろ。所望遺
伝子を発現ヘタター内に挿入してらよく、又は発現ベク
ターのブ「ノモーターを切除して所望遺伝子の手１１［
ｉに入れても、ｌ−い３゜ １．１つし■現／＼タター Δ、ｐ！’４Ｇ１００ 第１図に小ｌ１．１）ＩＪ記図而面説明中て詳細に説明
１、ノニ、］二うＩコＩＴＭ　Ｇ　Ｉ　００（ま７　）
レヂーｒビーブラスミ１、ｐｒ３Ｒ３２２に挿入さＡ］
たえＩ）　ＮＡを有４−ろ。λＩ）　ＮＡの題名な１・
１１徴（ｊ、λＩ）ＬプロモーターどＮ刊用部位ｌ、及
びｌばＩｆ　１１　Ｌ　Ｌ及びＩＩＬＩＬＲ）と終結旧
部位（ｔＲｌ　）ど０几リホソ一ムＩｊ’ｉ合部位とへ
′Ｉ′Ｇ開始コトノとを含むごとζ％”＋ろ、１別の特
徴は、第１”図に示されろ。

１＋ｔｖｌ　Ｃ；　１００ｆ、Ｊ：　ｐＫ　Ｃ：　３０
か　ら　コ古］　製　さ　イ１刀こ　１、ｐＫ　Ｃ３０
１Ｊλｌ−１Ｌプｖ１モーレーを辺土の如くザック［）
−ニングして調製さＡ＋ソノ−、 λ−）７−ノＩ）　ＮＡをＸｌｌ０＋及びＳｍａｌ制限
ユ“、ントヌクレアーゼで消化し、６３９３　ｂｐから
成ろ唯一・−ノの断片を精製し、続いてｌ−１−リ−ｄ
１（１及びＹ３−リ１．１　＋制限エンドヌクレアーゼ
て消化した。２３９７　ｂ　ｐから成り、Ｉ）Ｌプロモ
ーターを含む断片か得られた。ごの断片を精製し、月」
四ｄｌ１１及び且−、！應Ｈｌ消化物から単離したｐＩ
３　Ｒ３２２Ｄ　ＮΔ大断片に結合しまた。ザブクロー
ノをコロニーハイツリダイゼーノリンで同定し、回収し
プラスミドＤ　ＮＡを単離（７た（ＡＯｐ　ｐ　ｅ　ｎ
　ｈ　（山ｎ　Ｏｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｈｉ
ｏｌ、　（１９ｇ２）　１５８゜３２７　）。

ごのプラスミドと真核生物遺伝ｒ−を含む誘導体とは適
当な３．、ｃ−ｏ上ｉ−宿主中に随樗し得ろ。宿主の最
ら重要な特徴はこの宿主か熱感受性リブレノザ−Ｃｌ　
８５７と抗転写終結因子（ａｎＬｉＬｅｒｍｉｎａＬｉ
ｏｎ）Ｎタンパクとを！ｊえろことである（Ｍ、１７．
　ＧｏＬＬｅｓｍａｎ＼ｅＬ　ａｌ、、Ｊ、　１Ａｏ１
．　Ｂｉｏｌ、（１９７３）　、１４ｔ）、１９７）。

このヘタターは、従来の発現ヘタターに比較して以下の
如き多くの利点を有する。

１　発現レベルが極めて高い、こと このヘタターｉＪ：　１４ｃ４２−ｊｉ中の外来タンパ
クの発現を総細胞タノバタの１５〜２５％という高レベ
ルて誘発し得る。

２　グ鼾摂、十−勢醍・応−０′趣ミ彫蕉−切現一ケ（
−孝ＰＬプロモーターはＣＩリブレソザーかに古合して
いるときは不活性である。Ｃｌ８５７リブレＩザーは熱
感受性である。即ら、３０　’Ｃてはブ［１モーターに
オー、合４るか、４２℃て失２も４′ろ。従−）で、発
酵温度を４２℃まて１．げろと宿主細菌で所望タンパク
の産生か誘発される。。

このｊ゛、うな糸は以１・゛の１す点を含む、。

（ａ）　Ｅ、　ｃ（＋ｌｉに７ｊｔ性の外来タンパクを
所望の時に産生シ、得、ごイ１に、Ｊ−り発酵ブ１Ｊセ
スの１７１期′どの細胞化を回避し得ろ。、 （ｂ）タンパクの産生几進か系を安定さＵ、タンパク分
解を阻＋、１．ｔろ　い１．　Ｃｈｔｔｎｇ　ｔ〕ｔ　
ａｌ、、　Ｇｔ〕ｎ＋；（＋９８１）　Ｑ４．１２１）
。従って、厳密に調整さメ１．へプロモーター例えば１
３Ｌを使用４−る゛瞬間的°゛産生九進は連続的な低レ
ベル産生上りし好よ（、いてあろう。

３、Ｅ−も二畝−４〉−＊　Ｌ）　ｗ−互よ−Ｅ、ｃｏ
ｌｉ中に少ないコピー数て存イ、１ユセろλ自体と対照
的に、ｐＭＧＩ００中の１ツＬプロモーターはプラスミ
ド１−で多い＝Ｊコピー数示した。これに、１、り発現
レベルか上がる。

４　リポソーノー・結合部位と開始コドンとを何ずろこ
と。

この発現ｌ＼ツクーは強力な原核生物リポソーノ・結合
部位（Ｉｔ　１３３　）と翻訳開始コドン（Δｉ’　Ｇ
　）とを含む。従って、開始コドンの付加を侠１」４に
いかなる真核生物遺伝子のクローニングも可能である。

更に、自効Ｉえｒ３　Ｓは発現レベルを−１−げろ、。

５　適−受縁！ｔｉｌｌ　ｌ＋星座位々〉をイ」：　’
ｊ、　４．、ｑ−人−１−発現ヘタターはΔ’Ｉ”　Ｇ
開始＝１トンの直後に１−３　！！−四１．１１部位を
自しており、これにより最適発現を達ｎＢ　−＋　７　
１＝　Ｍｓ　ｌ−ｎ’ｓ　Ｕ　、”ｎ　Ｉニヱ尤：孟：
ｒ　Ｅコ！’ａ　ｌ　；Ｈ７−６、Ｎｕｔｔ’ｌ（位を
（Ｊｎろこと３、宿主に、ｊ−１て？−ｊえられるＮタ
ンパクは発現ヘタターのＮ　ｕ　Ｌ　！ηく位に１，１
１合し、ごイ１に、１−リＥＲ１部位ての転写終ｒを１
ｔｌｌ　１．４ろ。

Ｉ（、ｐ−戸１λ少 第３図に示４−如く、Ｉ）　Ｎ　ｌ）　５　ｉＪ：　Ｉ
”　Ｌブじ１モーターと本発明の発現ｌ＼ツクーの別の
ｉＴｉ　ｅな成分とを含む。ＩＴＮＩ）５はリホノーム
結合部位の直後に１ｌｆｔ）のべ靭−１部（）ｆを含む
１、リポソーノ・結合部（１ソｔ」１１’：　’ｉｉ’
＋なＣ４部位と（Ｊ異／：、：　ｊ＋ており、配列１Δ
ＡＧＧΔΔＧ１八Ｃ’ｌ”ｌ’　Ａ　ＣＡ　１ＡＩ’　
ｌ’　ＣＣ１’　ｌ’　Ｃへｌ’ＧＡΔｌ’　Ｇ　ｌΔ
を有４る。

この配列（」、突然変−■体から誘導さＡ″ｌ、ろが、
又（Ｊ化学的に合成さＡ１．得ろ。１１［ｊ記１ス１面
の説明て詳細に記載した。Ｊ、・′〕にｐＮ　＋）　５
！ｊ：　Ｉ）ＯＧ　７から誘導され八らのである（Ａ、
　（ｌｐ＋＋ｅｎｈｅｉ川ｅＬ　ａｌ、、用Ｊ、　Ｍｏ
１．１ｌｉｏｌ（＋！１２）ＩＦ＋８−　：（２７１、
−ノヘ）ｙ　ｈ　−＋１）Ｐ＋ｔｌｔｌｔ’ＮＪｉｌ＋
７−１トンを含まない。このベクターは、ｂＧｔｌアナ
ロア ナを含むｐＭに１００に比較して特に向上した収率て修
飾ｂＧＩｌ及びｈＧＨを最高度に発現すると考えられる
。

Ｃ，ｐＮＤ５５ ｐＮＩ）５５はＣ１−Ｒ１３ＳとΔ１゛Ｇ開始コドンと
の手前に適当な制限部位ハＣ−１を含むｐＮＩ）５の誘
導体である。プラスミドをこの部位で開裂し、次に１）
　Ｎ　ＡポリメラーゼＫｌｅＨｗ断片で処理４−ると、
Δ′ｒＧ開姶コ開始がＪうえられる。このコドンに所ｑ
４の任意の遺伝子を結合し得る（第３図及び第：３図の
説明参照）。

ＩＩ　、　ｉ’　ＲＰ発現ヘタター Δ　ｐＡ　Ｌ　ｉ”　ｒｐ４６ ｐＡ１．、ｉ”ｒｐ４６は、Ｔｒｐプロモーターとβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子に融合しｔ二’ｌ″ｒ＋）Ｉ’
：ａ伝ｒ−の最初の７−ノのアミノ酸とを含む（第５図
）１．所望の遺伝子は、′ｌ″ｒｐｌうの７個の）′ミ
ノ、酸の後のり！、！町Ｉｔ　１部位に挿入され得る。

ｒ３．、ｐへ四−ど！’　ｒｐ４’ｊ　；−−アー之１
ヨヒー丑、ノミーニスーー例−２９人見へ仕二ｒ−ｒｐ
−４８２ これは’Ｉ゛ｒｐブＶ２モーターの減衰領域が欠失しノ
二Ｔｒｐ４６に浩づしビＣ構築された乙のである。

０　で阜とりじ二１□ａＣ猷−金一征　゛ブラスミｌ；
’ｐ４７５Ｌしてのこのプじ！モーターの構築が第６図
及び第７図に示されている。この構築の変形が第８図に
示されている。

１１１　μ、り一プーノーンブ■汚ニー汁−灸！ＵＬさ
り一し−二。

この発現ベクターの構築（ｊ第９図及び第１０図に示さ
れ°ている３゜ ■　（東す」）−さ−些−ろ別のプーワー舌−ニフニ−
Ａ、１．．ａｃ このプロモーターは第１１図の如＜　ｐＹ　Ｌ　：（０
１の構築に使用され）、二。

＋３．、Ｏ咀！二 これは、ノブナル配列に結合したタンパクを発現するブ
［Ｊモーターシステムである。タンパクか膜を通って輸
送されろときにこのノブナル配列は除去される（第１２
図）。

実−塵（ダＩ−？　ワーンー生−珠−に川−少−汚−イ
−ｂＧ　ｔｌ　ｃｌ）　Ｎ　Ａ修飾の出発点は既に知ら
れているプラスミドｌ〕、である（１３　ＫｅｓｈｅＬ
　（＋ｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１
９８１）　９．１９）。１）４プラスミドはまた、１９
８０年：う月２４１１（リイスラエル特許出願第５９．
６９０号の優先権をモ１居長した１９８１年３月２０　
Ｅ、＋　（【Ｉの米国特許出願第２４５，９４：’１号
にら記載されている。このプラスミドは、Ｉｊ、、　ｑ
ｏｊ、Ｉ−宿−１モ中てＡｍｐ；ｒｉｃａｎ　’Ｉ’ｙ
ｐｃ　Ｃｕ１Ｌ旧＋！　Ｃｏ１１ＯｃＬｉｏｎにＡ　’
ｌ’　ＣＧ受託番号３１８２６て寄託されている。

＋、ｐｌ惠−ｐ＋：　２’Ｑ−リ〕−リ−ｐｌｔｅｃ２
／３の構築は第２図に示されており、１１（１記図而の
説明中に記載されている。市しい解読枠を与えるために
Ｉ）ｈから得たｂＧＨｃｌ）ＮΔをＩＩＭＧｌｏｏに挿
入する００に処理した。

ｐＩ−ｔｃｃ２／３を公知方法の形質転換にＪ−ってＡ
　１６３７をも含む種々の１．　ｃｏ−１−ｉ−株に導
入オろ。１３１えｃｃ２／３を含むＡｌ６３７はΔ゛巨
：Ｃ受託番号３９３　Ｒ５て寄託されている。１この菌
株（Ｊ増殖及び誘発さＡ］ると、フコニルアラニン彩天
然ｂ（、＋ＩＩのＮ　末端に（＝１加さＡ１にアミノ酸
配列Ｍｏｔ　Δ５ｐＧｌｎをｆｉ’　ｔろ１１（Ｊｌト
ノ２ナロタ゛を産生４”る３、クーマノ−染色Ｓ　ｌ）
　Ｓポリアクリル′ノ２ミド）ｆルの走杏によ−）で詐
出４ろど、ｐｌ？ｔ：ｃ２／３によって産生さＡまたｂ
ＧＩＩアナυアナの量（Ｊ細菌によって産生、３；　）
、する総タンパクの約２：（％てあ−）た。

１１１）琢０（１ ｐｉえ０１１の構築は第３図に示されて４うり、１）（
ｊ記図面の説明に記・成されている。、Ｉ）Ｎｌ）５ヘ
クター１〕ＮΔをＮ−５ｊ３．＋、ｌて制限４る。ｌ；
Ｇ　Ｉｆ　ｃｌ）　ＮΔを含むｐＲｔｑｃ２／３（第２
図）からのＮｄｅｌ断片を挿入４ろと、プラスミドｐＨ
）ＩＩか得られる。

ｐＲＯＩ］を形質転換によって１．、−　ｃ−ｏ貝Δ１
６３７に導入した。得られた宿シーベクター系をΔ’Ｉ
’　ＣＣ受託番号３９３９（ｌて寄託した。この菌株は
増殖１．誘発されると、ｐｌｊｃｃ２／：（と同じアナ
「ツタを産生す′ろ。Ｐ備的な結果テハｐｌｔ　ＯＩＩ
がｐＲｅｃ２／３よりら２０％以−１．〕増加串のｂＧ
Ｉｌを産生４°ることか判明した。菌株の増殖、産生さ
れたｂＧ［トノ′すｃｙグの回収及び精製には実施例４
のｐＲｅｃ２／３の場合と同じ方法を使用゛４°ろ。

１１１、ｐΔ１１０１ １）Δ１．．４０１の構築は第１３図に示されており、
１）１」記図面の説明に記載されている。１）４から１
）ΔＬ　−５００（第２図）を経由して得られたｂＧ　
ｔ（ｃＤ　ＮΔ（Ｊ第１３１ス１に示４°如く、１）Ｎ
ＤＩＩに挿入されノニ。

ｐΔ１．．４０１は形質転換によって１シ、　ｃｏｌｉ
八１６八ツ６３７され得る。得られた菌株は天然ｂＧＩ
ｌのＭＯ［″がＮ−末端にあり、Ｍ’ｅｔ”の手前のア
ミ−）酸か欠失しているｂＧ）ｌアナログを産生ずる。

ＩＶ　、店へ−１４０１ ｐΔＬ６０１の構築は第１４図に示されており１１１１
記図而の説明に記載されている。このプラスミドは■）
ΔＬ４０１（第１：（１ス９の誘導体である。。

■）ΔＬ６０１ｉｊ形質転換によってＩｊ、　、　ｃ　
ｏ　ｊ　ｉΔ１６３７に導入され得る。得られた菌株口
、ノー［ニルアラニラ形ｈＧＩＩのＮ末端にＭｅＬか（
：［加さイ１刃こｂＧＩＩのアナログを産生４ろ、１ 采１−）−ヒト生長患−ル−汚−２− ｈＧ　Ｉ−１ｃｌ）　ＮΔの出発点（１，ｌ、末端肥大
症小者の下垂体腫瘍から精製１．たｍ１ｔＮΔから得た
ｃｌ）ＮΔをｐ１３１え３２２θ川ｌ　ｊ　１１（Ｉ　
Ｉ＋１部位にり（〕−二シンク°ろごとであった１、 １　、１）Ｔ　Ｖ　Ｈｌ（１） ｐＴ　Ｖ　１８（１）ノ構築ハ第４図ニ示すレテオリ、
１１１ｊ記図面の説明に、ＩＬ！載されている。正しい
解読枠をＩ′ｊえるためにｈ（、’　ＩＩ　ｃｌ）　Ｎ
ΔをＩＩＮ＋）５に挿入４゛ろ前に処理した。

ｐ′ｒ　ｖ　１８（１）をバヨ質転換によッテ旦、、ｃ
ｑ−ｊ−ｉ　Ａ１６３７に導入した。得られた細菌を八
’Ｉ’　ＣＣ受託番号３９３８６てγ寄託（７だ。この
菌株は、増殖及び誘発されろと、ＭｅＬ”で始まりアミ
ノ酸１１：（か欠失した天然ｈＧ１１の配列を何重るｌ
＋ＧＨアナログを産生４“る。ｐｉ”Ｖ　ｌ）！（１）
によ−・て産生されろｈＧｌｌアナＶアナの量は、細菌
に、１ニー、て産ｚｌ−されろ総タノバタの約８％てあ
一ノこ、。

＋１　ｐ’ｖ　Ｖ　ｌ咀４（−２Σ １）’Ｉ’　Ｖ　１０４（２）の構築は第４図に示ざＡ
１て、１ノリ、前記図面の説明に記載されている。、＋
ＦＬい解読枠を！ノえろノーめにｈＧ　ＩＩ　ｃｌ）　
ＮΔをｐＮＩ）５に挿入４゛ろ前に処理し７ｋ、。

ｐ’ｔ’　Ｖ　１０４（２）を形質転換によ−、テｌシ
ー　ｃｏｌｉ八１６八ツ６３７（刀こ。（−１らＡ１刀
こ細菌を１鴇００受託番吋３９註４′Ｃ寄゛託しノニ。

ごの菌株は増殖及び誘発されるとＮ末端にＭ（］［を何
４ろ天然りにＩＩの配列を（＋４゛ろｈＧＩ−Ｉアナ「
Ｊりを産生４ろ。＋１’ＦＶ　１０４（２）によ−、ζ
産１１されろ１］６１冒ノ２すＶｌ夕の〒ｉは、細菌に
よ−）で産生されろ総タンバタの約２５％を１回ろ１゜
Ｉ−仰１−４　ｐＩえＯＣ２／−：う９ノη−らｔｆ堡
イア−％；　’＄　八＋　６：（７中のｐＲｅｃ２／３
の保存培養物（ｓｈｏｃｋ　ｃｕｌ’Ｌｕｒｔりを１’
３　ＩＩ　＋培地て増殖しく接種物参照）、次に８７％
タリセ１！−ル含角夕」−、ン酸すノ酸塩バッファーご
２倍に希釈し、　７０°（ンζ保（＋４゛ろ４゜樟一種
物−接＋ｌｉ物を１０１１培Ｉｌ！！（３７ｇ／Ｒ）即
Ｌ）ブレーンハートイノフ；ｌ−ノヨン（旧Ｆ　Ｉ：　
０　）中て増グ、、Ｉｔさ１する。振のフラスコ１中の
無菌培地に保（ｆ培養物を接種し、３０°Ｃ、２Ｑ（ｌ
ｒ、１＋、ｎ＋のツユ、−カー１で１５１１！７間イン
ギコへ−１−４“ろ。以後の接種物増殖段階はｔ（１拌
通気した発酵槽（７行な一ノ１、無］１゛Ｉ培地に０　
、２１＋ｒρ／Ｑのプラス：１培養物を接種し、３０“
Ｃ、ｐＨ７−ｌ−、０、５−ζＩｔ’ｔ１″１′−通気
して溶（ｊ酸素レベルを空気飽（１１υ）２０％より品
＜　１４持しノ、ｊから１５時間イ／ギ：Ｊｌ＼−１・
４ろ、１ＱＱ、−生　産ノｌ：、　ｌｒ’５地（」、ラ
タトアルブミノ氷解物（酵素的）　２０　ｇ／ρ酵１り
抽出物　１０ｇ／ρ Ｋ　、ＩＩ　１−’　０　、　２．５　ｇ／９ＮａＣＱ
　１０　ｇＩＱ アンビンリン　０１ｇ／ρ ビオチン　ｏ、１ｍｇ＃！ チアミノ　＋　ｍｇ／ｊ！ 微晴元素溶液　３１ｒ＋ジ／ｌ 溶液中のアノピンリン１ビオヂン及びデアミノは別々に
フィルター滅菌され接種具１）１ｊに；１１［菌ｆｔｊ
生培地に加えられる。無菌ブトつゎ）１溶液は最初に１
０ｇ／ｌ！になるように添加し、誘発及び発現の過程て
はブ）・つ糖をｌＯｇ／Ｉ！より多い撤に賄゛持４ろ３
、微爪元素溶液は以下の物質を含む。

ＭｇＳ　（’）　、　−７１１，０１７０８／ｕＦｅＣ
１！、　１６　ｇ＃２ ２、　ｎＣｌ、・４Ｈ２０２ｇ＃ Ｃ：ｏＣ〕ｌ、・ｂｌ＋　９０　２　ｇ／ＱＮａ７Ｍｏ
Ｏａ２１１，０　２ｇ＃ ＣａＣＵ、・２１１２０　１　ｇＩＱ ＣｕＣ氾、１ｇ／ｉ！ １１３Ｂ　０３０．５　ｇ＃ 濃！（ＣＩ　Ｉｏｏ＋ｒ＋ｕＲ 培地に５乃至１０％の接種培養物を接種し、＋（０℃で
インギョへ−１−４′る。攪拌−通気速度ｉＪ、空気飽
和の２０％、Ｊ−〇高い溶存酸素レベルが２（四りＪさ
れるように設定されろ。Ｎ　Ｈ３てｐｌｌを７：峠０，
２に維持する３、細胞濃度か約３ｇ／ｊ！（０１）　６
ａｏ＝　１０）に到達４ろと誘発か姶まろ。

６−１１度を４２℃に１げろ。４２°（：に１５分間イ
イ１．ｌ’ｉＬ、次に３８℃に１・げろ５，３８℃で１
乃至１５時間イン二〜５，１１−１・後、培養物を争冷
し、ホルモン精製のために遠心分離に、Ｊ、−・〈二細
胞を回収４ろ５゜ＩＨ−９ｊ−１１Ｊ）−回−収 Ｗａｒｒｉｎｇ配合装置を用い、５０ｍＭ　ｉ’ｒｉｓ
　（＋ｐ、（ｐＨ７／ｌ）と５０ｍＭ　ｌ・、ｌ）’ｌ
’　Ａと２５％ノｑ＋糖どを含む１０倍容の溶液に１ｋ
ｇの細菌細胞を懸濁さＵろ。配合装置の速度は泡（′１
′、らを最小に抑えろ、１−’ｒに調整４”ろ、１均貿
懸Ｗａ　？＆をｌ）ｙｎｏｍｉ　ｌ　１細胞破砕装置（
Ｗｉｌｌｙ　八ｔ３ａｃｔ＋ｏｆｅｎ、　１（ａｓｃｌ
）に連続的に通し、破砕細胞の均質賢濁液を先ｒ＋−３
ｈａｒｐｌｅｓｓ遠心機て遠心し、次に５ｏｒｖａ　１
１遠心機て２０．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ−ζ連続遠心して１
１１を冷体４ろ、１双方の遠心ステップ−ζ得られた沈
澱物を回収し、５０ｍＭ　ｌ’ｒｉｓ　Ｃｌ　（ｐＨ７
，４）で洗い、５００７１１Ｑの同しバッファに再懸濁
さＵろ。終濃度２ｍｇ／威まてリゾデームを加え、懸濁
液を３７℃で１時間インキコへ−１・４゛ろ。次に、ｒ
ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を終濃度１％まで加え、）ヒ濁
液を４°（ｊに冷却し、５ｏｒｖａｌｌ　５Ｓ３４［ノ
ータ内て２０．０ＯＯｒ、ｐ、ｍで２０分間遠心４ろ１
．沈澱物を収集し２．５０ｍＭ　’ｌ’ｒｉｓ　−ＣＩ
ｌて２回洗い、５００　＋＋ρの５０ｍＭ　’ｌ’ｒｉ
ｓ　Ｃ：Ｑ　（ｐＨ７、ｏ、　５ｍｔｖｌ　Ｍｇ０Ｌに
１１１懸ＩｆｊさＵ、デオニ）−ノリポヌクレアーゼを
イ冬ｌ、１３度２０１ノｇ／　ｍＲよで加えろ３、室冶
−ど３０分間イノギ：Ｉｌ＼−ノヨＩン後、沈澱物をｒ
ｉｉｉ記同様に収集し、５００　ｍＱの２０　ｍ　Ｍ１
’ｒｉｓ　Ｃ，ｒｌ　（ｐｌｌ７．４）、ＩＱＱ＋＋＋
Ｍ　ＮａＣｕ＆ひ１θｍＭ　Ｅｌ）ｌ八て２回洗浄し２
、次に各５００　＋Ｉｒ１の蒸留水を用いご２回洗浄４
′ろ。沈澱物を遠心によって収集（７、２０℃て）１１
（限に長く保佇し得ろ。この段階でドブノル硫酸すトリ
ウシ、ケル電気泳動から判断９３ろとｂＧｌｌ＋Ｊ：’
８０％純粋である。ＩＩＧＩＩ）収４７１は約１５ｇ’
ＣＪ’）ろ。

ｊｌＧｊｌの精製 １００ｇの沈澱物を４０７Ｉ所の蒸留水に１箭さｌ、０
５ＭのＮ　ａｏ　Ｌｌ　、　ｐＨ１１，８て滴定して可
溶化４〜ろ。次に溶液を２分間超ｉ’ｒ”６Ｍ処理し、
５ｏｒｖａｌｌ　５Ｓ３４１ノ−タで２０．０００ｒ、
ｐ、ｍ　ご２０分間遠心して清澄化４ろ。

次に溶液を６　、　！ｉ　ｍ　Ｍホウ酸塩バッファ、　
ｐＨ１１，８て平衡したＳ（！ｐｈａｒｏｓ＋；　［：
１．６１ｉカラム（５ｘ　ｌｏｏｃｍ）に通４−３゜１
００　ｍＱ　／時の速度てカラノ７、を展開し、各１２
轍の両分を収集４−る、１ツノジノ・を出ノご第１のピ
ークは捨てろ。

第１ピークは低活１’ｌの凝集ｂＧＩＩを示し、第２ビ
ータは高話性θ・ｂ（：ｌｌを示４′。

１）　ＥΔＥ−３ｃｐｌ＋ａｃｔｌ（２５Ｆ！／１００
ｇｒ当　１Ｔｋｐｐｔ）プノ　ラ　ノ、を　６５＋ｌＩ
Ｍホウ＃均、ハノーノア、　ｐＨ９，０で”１１ｍ１４
ろ３、第２０）ｂＧ１１ピークを１１Ｃ！て１１１１９
．０にし、１月ｉＡｌ：　Ｓｌｌ＋ａｃｃｌカラ１＼に
２５０　＋ｒ＋Ｒ、’　”！ｊの速度て充填４ろ３、カ
シ１、を７　、５　＋＋＋ρの６．５ｍＭホウ酸塩バッ
ファ、’　＋１１１９．０て洗い、７５ｍＭ　Ｎ　ａに
　Ｑ’、Ｄ　ｌｌ１ｌえた６　、　５　ｍ　Ｍホウ酸塩
バッファ。

ｐＨ９，０て溶出４ろ。０３より高い０１）　２．、。

を小４両分をプールし、Ｍｉ　Ｉ　ｌ　’＋ｐｏｒｅｌ
’（Ｉｌ　ｌ　１ｃｏｎ透１ｊ〒装置てＨ２Ｏにス・１
して透析し、凍キーｊ乾燥セる、。

４　姫−ｐｌ−ｊ、ｐ　Ｉ−ｊ　ｅ　ｃ、２　／　３　
ｉ＝：　Ｊ−’）　ｔ’−ｉｆ；ｊ　炒Ａ−ｂ　Ｃ；、
、、Ｉｐ　７：−３ワ−タノケー周匂肚 １、ｂＧＩｌアナ１ツタと天然ｂＧｔｌとのラジオイム
ツアー’ｊ−；しく共コ幻 リン酸塩緩衝生理食塩水（１％ＢＳΔ）中にｌ　ＯＯｎ
　ｇ　／　＋ｒ＋Ｑ。

のｂＧＨアナアナを含む溶液を調製した３、この溶液を
濃度５０．２５．１２．５．６．２５．３．１２．１．
５６及び０．７８ｎｇ＃２まて順次希釈した。こ２１ら
の溶液にすいて８０１雁のザンブル１１工を２組抽出し
、　抗体法を用いろ１工１Δにかｊｊｉだ。希釈曲線は
天然ｂＧＩｌて得られる曲線と同等であった。

２　ラノオレセブター結合アッセイ ウサギ１１１刊１負に対４”ろラノオレセブター結合ア
ッセイを、Ｔ、　’Ｉ’ｕｓｌ＋ｉｍａ及びＩＩ　、　
Ｇ　、　Ｆ　ｒ　［！　ｉ　Ｓ　Ｄ　ＩＩ　（Ｙ　、　
ＣＩＩ　ｉ　ｎ　。

１シｎ＋Ｉｏｃｒ、　ＭｅＬａｂ、　（１９７３）　’
ａ１−．３３４）に記載の方法て、”′Ｉ−ｈＧ　ＩＩ
をトレーサーとし、貞ｌｌ＋　Ｇ　ＩＩ溶液を校正曲線
用に用いて実施しノこ。３組のザノブルを０３−のアッ
セイバッフｙ（，５０ｍＭ　］’ｒｉｓ、　１５ｍＭＣ
ａＣＲ７）ＪＺび５　ｍ　ｇ／　ｍＩウウシメｈアルッ
ミ／、　ｐＨ７，６）中、室温て２１１４ｊ、　１ｔｊ
ｌ　ｆンキュへ一トシた。試験管（Ｊ、’　”　Ｉ　−
１＋Ｇ　Ｉｆ　（：（０〜６０　ｌｔ　ｃｉ＃ｚｇｃ７
）調製物２０．０００ＣＩＴｌｌ＋）と、１５０〜２５
０　ｔｌｇの肝膜タンパクと、天然ｂＧＩｌ（］〜１０
１００ｎ又は細菌ｂＧＩＩ抽出物のり４′イ１がどを収
容していた１、結果は、ｔ＋ＧＩＩアナログのｂＧＩｌ
活性が天然１＋Ｇｌｌと同し、活１’ｌにｐ′１敵４”
ろごとを利く（７た、。

３　、ＩＩ！！！　・ｉ’ｉ　ツー　ス　１・実施例４
て（’／：　ｆｒ　ｌ−へ細菌細胞から回収されたｌ）
：Ｉｔ　ｅｃ２／３　ｂＧ　ＩＩ　’ｊ’す【ｌりのｌ
ｌ物活性を脛′晋フ゛ストて測定したく八　Ｆ、ｌ’ａ
ｒｌｏｗ　ｔｉｔ　ａｔ、、１７ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｔ
Ｊｇｙ（１９６５）　７７、１１２６う１、 生後２８〜３０１１のオスミを「ＩＦ体切除（７、次に
処置　し　／−１：　Ｌ’　−Ｑ　１０−１４１目イｆ
Ｉ；’ｉｔ、）ｌｏ　ウ　ノ’ｌ−’　、’１ｒｒ１本
　叉ｆＪｉ　ＩＩＩ換休１体、、　ｃ−ｏ　１−ｉから
透導しノニウシ生長７１；ルモノを０、１５１ＶＩ　Ｎ
　ａＣｌ　ｌ　Ｏ，０１Ｍホウ酸塩、’１ｌｌｌ＋０．
０に溶解した。１　ネズミ（ｌ　ｆｆＦ、　４−７匹七
−））をｉＦ−’ｌ’ｊｆ食（ＰｕｒｉｎａＲａＬ−Ｃ
ｈｏｗ及び（「留屯の水）てイ（持し、ｂＧＩＩ溶液の
皮下ｔ１射（０，２ｃｃ中、５〜１２５１１ｇ／ｌｌ−
１）を５「１間続（ｊノニ。

６１〕１目に動物を殺し、ｎｉｊ肢膝骨を取り出して長
手方向に切開し、アセトンで固定して２％Δｌｉ　Ｎ　
Ｏ。

て染色しノ為双眼解剖器（Ｎｉｋｏｎ）てｆｊＪＪ察（
−７て前端プレー１・の幅を４１１定した１、（ラット
当たり４０回の読め取りを１１なった）甲均値を用い′
ζ対数投Ｊｊ鍛応答曲線を描いた。結果を第１５図に示
４゜害−施−例−β−ｊ＋−−ＧＭ−アヲニＶ−２−表
１は、構築された一連のプラスミドとこれらのプラスミ
ドから産生されたアサロタどをｊｌｋ　４゜表　１ ブラスミＦ’　ｂ　Ｇ　ＩＩアアナ１夕のアミノ末端ｒ
ｊｐｃ　２／３ＭｃｌΔＳＩＴ　Ｇ　Ｉｎ　Ｉ”ｌ＋ｅ
’ｐ１３１　ＭｅｔΔｓｐ　Ｐｒｏ　ＭＯＬ　ＧｌｙΔ
１ａ１１１＋（！２１１Ｍ　４　ＭｅＬΔｓｐ　、Ｐｒ
ｏ　Ｐｈｔ！２ｐＭ　Ｉ　ＭｅｔΔｌａ’　Ｐｂｅ２ ｐＭ　２　Ｍ＋！ＬΔｌａ’　Ｐｌ＋０２１〕ΔＬ　４
０１　ＭｃＬ” ｐＹＬ　３０１　ＭｅＬ　ＧｌｙΔｌａ’　Ｐｈｅ２１
）Ａ１．、３０２　ＩｔΔ△＋Δｌａ’　ＰｌｉｅＮ２
ｐＨｉｓ　１２９　ＭｅＬ　′ｒｈｒ　Ａ＋、ｇＰｌａ
＋！２Ｉ）ΔＬ　：（１２Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｌａ’　
Ｐｈｅ２ｐＡ　Ｌ　３２２　Ｍ＋！Ｌ　Ｇ　ｌｙΔｌａ
’　Ｉ’１１Ｆ！’ｐ　１８　Ｍ（ｑｔ　Ｇ　ｌｙΔｌ
ａ’　Ｐｌｏ）２Ｐ　１１１”　Ｇ　−８００Ｍｔ！ｔ
　Ｇ　ｌ　ｕ　Ｐ　ｈｔゾｐＯＩｊＦ　２１２　ΔＩａ
ＧＩｙΔｌａ’　Ｐｈｔ＋２％−１ｉ１！Ｉ−例７　乳
１　（１）　ｆｌ）ｉ乳Ｈｑ、−’ｚ）ｊ−＝３−るｐ
　ｊｔ、−ｅｃ　、：！／−３，、−ｊ　ｃ；ｌＩアブ
°［ツタの効−米 ｂＧｔｌの催乳効果（ｊ和学文献てよく知られてＪｊす
、例えは、Ｊ、　ｌ！１ｎｃｓ　（！Ｌ　ａｌ、、　１
ｌｒｉＬ　Ｊ、　ＮｕＬｒｉ（＋９８０）　；−，１，
、＋７！Ｊ及びＣ，Ｉ’ｅｅｌ　（！Ｌ　ａｔ、、Ｊ、
　ＮｕＬｒｉ（１９８１）　３−ｊｊ、　１ｔｉ６２等
の報告がある。、、ｌ）　、　Ｂ　ａｕ　ｍ　ａ　ｎ　
ｔ：　Ｌａｌ　、　、１．　ｌフａｉｒｙ　Ｓｃｉ、Ｖ
ｏｌ、５ｕｐｐ、ｌ、　八ｌ＋５Ｌ８６（１９８２）ｉ
、Ｊ、【１）ＮΔｂＧＩＩに、１ニー’ｌて乳分法が増
加４°ろことを報告（２てぃろ。天然ｂＧＨと比較（ｎ
−ｐｒ７　ｅｃ２／３　ｂＧ　Ｉｆの（１１”乳効果を
測定４′ろ実験を実施した。分娩目１乃金：１５４Ｈ後
の１８頭のボルスタｒ］１１１ｆｉ牛を無作７〜にタル
ーブ分（ｊｊ７、以トのηＮ＜処理して乳分法をナスト
＋＝た。

世−−−一−−乃：−−−−１□４基」町　１１−１の
注射量＝１ントＬノール　５日　生理食塩水 天然ｂＧＨ５日　２５ｍｇ／Ｅｌをｌ０１１間ｐＲ＋＋
ｃ２／３ｂＧ　Ｉｔ　５ト１　２５ｍｇ／　Ｆｌを１０
１１間毎Ｅ１の注射の直前にｂＣ；Ｉ−１を濃度１　ｍ
　ｇ　／　＋ｒ＆でＯ，ＩＭＮａｌｌＣＯ，水性バッフ
　ｙ　（ｐＨ＝　８．２）に溶解した１゜ｍｔ牛の頚部
にブラノーボ又はＩＩ（：１１溶液をｌ　０１１　Ｉｔ
ｔｌ毎Ｆ］皮下θ、射した。５日間の予処理期間はｔｌ
、躬（２なかつノー。

午１ｉｉｊ　６時頃と午後５時頃とのｌト１２回雌）１
から搾乳した。ミルク重役をＢｏｕｍａＬｉｃ系で記録
し、乳データ系に記録しノこ。

予処理ＩＣｌ３間とｂＧＩ−１処理期間とにおｊｌる乳
分泌の平均イｌＩｌ］を表１１に示す。＝Ｉントし１−
ル雌牛の産ルベルは変わらなか−）たが、双方の１＋（
１，１１処理クループでは乳量か同程度に増加した。天
然ｈＧＩＩてｉｊ：　ｌ　０１１間の処理で乳が１１９
％増加し、ｂ　Ｇ　ＩＩ　７す［Ｊグ処理では１０２％
増加した。動物数か少ないの−ζデータを統１目的に分
１１てきなかつノーか、増加の程度は文献にｔμ告され
たものと同様である。

従って、１）１えＬＩＣ２／３　ｂＧ　１１は天然ｂＧ
ＩＩ同様に雌牛の（？に乳を刺激４′ろという結論か得
られろ。

表　１１ コントロール　６　５７．２３　５７．２６天然ｂＧ　
ＩＩ　５　５８．５４　６５５０　１１．９（２５ｍｇ
／ｌ」） ＩＴＩＲｃｃ２／３　ｂＧｌｌ　６　５７．４８　６３
．３４　１０．２（２５ｍｇ／　Ｅｌ　） ３則１１に対し、ブシンーホ又員１＋Ｇｌｌ溶液の皮１
ζｔ１．射をｌ　Ｅｌ　ｌ　ｋ＋ｌ　、、１に一ノＩ０
１」１続（）た１、４１ズ１面の１１１１中ム説明 第１１ス１は発現ベクターＩＢＭに＋００の横築説明図
、第２図はブラスミｌ”　１１［ｔ　ｅｃ２／：（＆）
構築説明ｉズ１、第３１強は発現ベクター１）Ｎ　Ｉ）
　５．　ｐＮｌ）　５５及びｐＴえ０１１の構築説明図
、第４図はｐ′ｒＶ　１８（１）及びｐ、’ｌ’　Ｖ　
１０４（２）の構築説明図、第５図１はベクターｐＡＬ
　’Ｉ’ｒｐ４６の構築説明図（′ｌ’ｒｐプロモータ
ーとリーダー、アテニ。

」−一ター及びＩＣ遺伝−ｒ−の２５１印のサブクロー
ニックを示４°図）、第６図乃至第８図（」夫々　一連
の発現ベクター（Ｔａｃ）　、　ｌ！ｉｆ　９　ｐ４７
５４　、　ｐＡ　Ｌ　３１２及びｌ）△Ｌ６０１（Ｉｔ
）の（１η築説明図（第６図は′Ｉ”ａｃブし１モータ
ーの構築説明図、及び第８図は’］”　ｒｐ　−Ｌ　ａ
ｃ融融合プロモーターフススミドのｌ＋ＧＩＩの夕（）
−二−ツタを示４°図）、第９（ス１及び第１０図は夫
）１ヒスチノンブＵＪモーターを含む発現ベクターｐＨ
ｉｓ　１０２及びｐＨｉｓ　ｌ＋Ｇ　ＩＩ　Ｕ’）　Ｒ
ａｇ説明図（第９図（Ｊ：　Ｉｔ　ｉ　ｓ−、／″ｒｒ
ノモーターろｂＧｌｌの発現を示す図）、第１ｊ図はＩ
ＴＹＬ３０１の構築説明ヌＩ（叩ら、１１−人り（断片
と合成１３呼ｌ１１リンカ−からＩ）ＹＩ、３０１を構
築４°ろ１．桿菌）、第１２図はＯｍｐＦブ【ノモータ
ーを含むｂＧｌ−Ｉ遺１２１’発現用プラスミドの構築
説明図、第１３図はＭ（！Ｌ“ｔ＋ＣＩ−］アナログ発
現用プラスミドｐＡ１．．４０１の構築説明図、第１４
図はＭ　（＞Ｌ　（＋　Ｇ　１１発現用ブフスミトｐＡ
Ｌ６０１の構築１説明１ス１、第１５図はＩｌ’ｌｊ眉
アストの結果（下垂体由来ウシ成長ポルモノと組換ウシ
成長ホルモンの、ｌ・ＩＦ体Ｕｊ除ラうＩ・に皮１−１
１：　１＋１　＋−て５１１後の・ｊ″１板成良に灯４
′ろ：１リャノ；１）を小４−タラフ゛Ｃ／１）ろ３゜ １％Ｊ’ｌＡ　ｆｆｊは佇　村　元 ＦＩＧ、５゜ ＦＩＩＲＢ。

Ｆ比又 Ｆ■［Ｉｌ、−８゜ 人ｄな乃槽仮　ｂ４ｓ鋪断襲＃製　６６ＡｐＳ’Ｍ：ｄ
ヶＦＩＧ、ヨ。

ＦＩＥＩＩ。

ＦＩｏ、１乙。

ＦＩ［ｉｌ、ｌＲ− 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ　、’　識別記号　庁内整理番号［相］
発　明　者　マリアンΦゴレツキ　イスラエル国、リー
ト・５ ０発　明　者　アウ゛イグドル・レヴア　イスラエル国
、ノン ＠発明者　アモス・オツペンハイ　イスラエル国、ム　
ム・ストリート ０発　明　者　テイクヴア・フオーゲ　イスラエル国、
ル　４ ０発　明　者　エリシャ書ゼーロン　イスラエル国、ヤ
フ・シャミー ［相］発　明　者　メナヘム・ゼエヴイ　イスラエル国
、レホヴオット、ハナシ・ハリジョン・ストネタニア、
プロデツキイ・ストリート・３エルサレム、ラマトΦシ
ャレット、シュレ５／１２ レホヴオット、コソヴエル・ストリート・／１シヴア、
モシャヴ・ミシュマール、エリル・ストリート・７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （＋）　改良されたベクターてあり、 非耐熱性リブレッザーＣＩを含何する適Ｉ、Ｉｊな細菌
   宿主細胞に導入されると、宿主細胞か、宿１：細胞の温
   度がリブレッザー破壊温度まて」−昇１．）：ｌｆｉ、
   １）１工記ヘクターに挿入されている所望遺伝ｊ−を発
   現ｌ“しめ得月−ノ前記遺伝子かコートしているポリペ
   プチドを産生し得るようになり、 ５′から３′に向かって、 λバクテリオファーン由来のプロモーター及びオペレー
   ター１’　Ｌ　ＯＬを含むｌ）　ＮΔ配列と、宿主細胞
   が産生づ−る抗転写終結因千Ｎタンパクを結合４−ろＮ
   １：ｌＩ用部位と、 所望遺伝ｒｃｌ）　ｍ　ｔｊ　Ｎ八を宿主細胞内のりポ
   ソートに結合部１．め１１Ｊるリポソーム結合部位を含
   む１）　Ｎ　Ａ配列と、 Δ′１゛Ｇ開姶コドン、又は所望遺伝子をべ゛フタ−内
   に挿入４−ろ際にΔ′ｌ′Ｇ開始＝ｊトンに変換される
   Ｉ）　ＮΔ配列と、 Δ′１゛Ｇ開始＝１開始上１トノ合わ且て所望遺伝子を
   ベクター内に挿入り−るたｙ）の制限酵素部位と、を順
   次に含む６末鎖１）　Ｎ　Ａ分子を含んでおり、更に、
   宿主細胞ＩＩじζ自律複製し得る細菌プラスミド由来複
   製起点を含むＤ　Ｎ　Ａ配列と、宿主細胞１−＋にヘタ
   ターか仔在４−るときに現れる選択可能叉（Ｊ認識可能
   な表現形１ε′Ｉに関連４′ろ遺伝ｒを含Ｊ、’　Ｉ）
   　ＮΔ配列とを含む改良ヘタター。 （２）適切な宿１：、細胞か大腸菌（１シＳ　ｃ！１　
   ＋！　ｒ　ｉ　ｃＩＩ　ｉ　ａｃ−ｏｆ−ｉ）であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のベクター
   。 （ｊう）　大腸１］　（１ｑｃ−ｊ＋ｃｒｉｃｂｉａ−
   ｃｏｔ　ｉ）かΔ１６３７．八１６４５゜脣６０２又は
   Ａ　Ｉ　５６３株であることを特徴とする特Ａ′ｌ請求
   の範囲第２項に記載のベクター１、 （／Ｉ）　−６木組１）　ＮＡ分Ｆが環状であることを
   特徴と４るゼ旨′１請求の範囲第１項に記載のヘタター
   、。 （５）温度が約４２℃より高いことを特徴とする特許り
   請求の・範囲第１項に記載のヘタター。 （６）　リポソーム結合部位が、λノくクテリオファー
   ジ１１１来Ｃ互てあり１」−ン配列 ′１゛Δ八ＧＧΔＡ八Ｉ゛ΔＣＴＴ八（：Δ゛「八Ｔ　
   ’Ｉ’　ＣＣＴ　’ｌ”＋へ′ＩＧΔＡ　’ｌ’　Ｇ　
   ｉ’　Ａを何“４−ることを１・１ｆ徴と一４°ろ特許
   請求の範囲第１項に記載のヘタター。 （７）　リポ゛ノーノ、結合部位か配列。 ｌへへＧＧＡＡＧ’ｌΔ（：１１ΔＣ：　Ａ　’１八ｌ
   ”ｌ’　ＣＣ’Ｉ”ｌ’　Ｃへ１Ｇへへｌ’Ｇ’ｌへを
   有４−る合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項に記載のベクター。 （８）　リホソーノ・結合部位か、ハシテリオファージ
   λの主１　ｕｆ１部タンパク遺伝ｒ　Ｉｌｔ来の乙ので
   あり１丁１つ配列 ］ゴＴ　’ｌ”ｆ”ＩゴへＣＧ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｔｌ”ｌ
   ”ｌ”ｌ’　ｉ”＋ΔＦＧΔＡＡＡＡ八Ａ　’ｌ’　Ｇ
   へＣＣＣ’ｌ’　Ａ　ＡへΔＡ　Ａ　Ａ　’ｌ’　Ａ　
   Ｃを０“４°ろことを特徴とする特５′１請求の９・ｈ
   間第１項に記載のベクター、３ （９）制限酵素部位か１３−ａｍ、ＨＩ、　Ｓ、、、、
   、ｑ、、ｃｌ又ｆＪ、ｌ４ｄｅｌであることを特徴とす
   る特約請求の範囲第１項に記載のヘタター、１ （１０）″ｆν製起点かｐ１３　Ｒ：（２２に＋１１来
   ４るごとを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のヘ
   タター。 （１１）複製起点がｐＲＩに由来４′るごとを特徴とす
   る特許′１請求の範囲第１項に記載のヘタター、。 （１２）表現形質が薬剤耐性又は温度感受性であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のベクター。 （１３）薬剤耐性がアンビンリン、りＣ２ラドフェニコ
   ール又はテ１−ラザイクリンに対４′る抵抗性であるご
   とを特徴とする特許請求の範囲第１２項に記載のヘタタ
   ー。 （１４）所望遺伝子が成長ポルモン、スーパーオギント
   ジスムターセ、アポリポタンパクＥ　、　Ｉ−１蹄疫ウ
   イルスのウィルスタンパクｌ、黄色ブトつ球菌（反−ａ
   −リー調ジ）由来プロティンＡ、インターＵ）イキンＩ
   ｌｌ　。 酵素部（Ｊこれらのアナ（ツクをコードしていることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の・ベクター。 （［５）所望遺伝子がウシ成長＝ｌｚルモン又はそのア
   サログを：Ｉ　−Ｆ’　Ｉ、ているごとを動機と１−る
   ４”Ｉ’　ｉ＋’ｌ請求の範囲第１項に記載のヘタター
   。 （１６）所望遺伝子かヒト成長ホルモン又（、Ｊそのア
   ナ【１グをコートしていることを特徴と才る４’ｆ　ｉ
   ′ｌ請求の範囲第１項に記載のヘタター。 （１７）所望遺伝子かブタ成長ホルモン又（Ｊそのアナ
   し７タを＝Ｊ−トしていることを特徴と」ろ１Ｊ１”許
   請求の範囲第１項に記載のヘタター。 （１８）所望遺伝１’かニワ）・り成長ホルモン叉ｉＪ
   ソのアナシノグを−＋−１・１７でいろごとを４′Ｉ徴
   と・（ろ特言′１請求の範囲第１項に記載のｌ＼ベクタ
   ー。 （１９）添イ；ｊの第１図に示４′制限地図を有し２．
   ７Ａ　ｉ・ｊの第２１ス１に小４−々１１き３−．３−
   ａＢｎ　ｌ　Ｉ　ｌ制限部位中にり１７−ン化されたｂ
   Ｇ　ＩＩ　ｃｌ）　ＮΔを（Ｔする形てＡｌ’ＣＣＮＯ
   ３９：（８５として寄託され−Ｃいろ〕＼クターｐｌｖ
   ｌ　Ｇ　＋　００．。 （２０）添ト１の第３図に示４′制限地図をｆ目１、ｌ
   ソト１の第４１閾に示・）シ１１．ぎＮ−ぐＯＩ制限部
   （１゛ｆ中にり１１−ン化されたＩＩＧ　ＩＩ　ｃｌ）
   　ＮΔを白ケる形“ζへｉ’　ＣＣＮ　。 ３０３９４及び３９　：（＋！　６として？了託されて
   ぃろヘタ・ン−ｐＮ＋）５゜ （２１）特８′１請求の範囲第１．ＴＪ′ｌに記載の／
   ＼ベクター制限酵素部位に挿入されポリペプチド又（Ｊ
   そのアナロタをコートし、ている遺伝ｒとから成るボリ
   ペプヂト産生用ブつスミ）・。 （２、特許請求の範囲第１項に記載のヘタターと制限酵
   素部位に挿入されウノ成長ポルモン又はそのアナログを
   コートしている遺伝子とから成るウソ成長ホルモン産生
   用プラスミド。 （２３）　ｐＲｅｃ２／３　ｂＧ　Ｉ−ｉと命名され、
   添イ＝１の第２図にポケ制限地図を有し、ＡＴＣＣＮｏ
   、３９３８５として寄託されていることを特徴とする特
   ５′１請求の範囲第２２頃に記載のプラスミド。 （２４）、ｐ　Ｔ也０１１と命名され、添付の第３図に
   示４゛制限地図を何し、Ａ１’ＣＣＮｏ、３９３９０と
   して寄託されていることを特徴とする特許請求のＱｍ囲
   第２２項に記載のプラスミド１、 （２５）特Ａ′ｌ請求の範囲第１項に記載のベクターと
   制限酵素部（１γに挿入されヒト成長ホルモン又はｅの
   アナログを：Ｊ−ドし−ζいる遺伝子とから成るヒト成
   長ホルモン産生用プラスミド。 （２６）　ｐｉ’　Ｖ　１８（１）と命名され、添イー
   １の第４図に小４゛制限地図を有し、Δ’ｒＣＣＮｏ、
   ３９３８６とし、て寄託されていることを特徴とする特
   許請求の範囲第２５項にδ記載のプラスミド。 （２７）　ｐ’ｒ　Ｖ　１０４（２）と命名され、添１
   ・］の第４図に示す制限地図を８１．、ＡＴＣＣＮｏ３
   ９３８４としで寄ＲＬされ−ζいろことを特徴とする特
   許請求の範囲第２５項に記載のプラスミド。 （２、特許請求の範囲第２１項に記載のプラスミドを適
   切な宿１−中に含何帽るボリペブヂト産生用宿主ヘクタ
   ー系、。 （２９）宿主かＡ１６３７．　Ａｌ６４５．　Ａ２６０
   ２．ＫｉＪΔ１５６　：（であることを特徴とする特８
   ′］請求の範囲第２８項に記載の宿」ユヘクター系、。 （３０）　特許請求の範囲第２２項に記載のプラスミド
   を適切な宿１・中に含ｆ１４−ろウノ成長ポルモノ＋ｆ
   （：生用宿ユ１ニベクター系３゜ （：（＋　）　宿主がＡｌ６３７．　Ａｌ６４５．　Ａ
   ２６０２又（ＪＡ１５６３てあろごとを特徴とする特工
   ′１請求の範囲第３０項に記載の宿主ベクター系。 （３２、特許請求の範囲第２：３項に記載のプラスミド
   を適切な宿主中に含ｈ′４−るウノ成長ホルモン産生用
   宿主ベクター系□ （３３）　特許請求の範囲第２４項に記載のプラスミド
   を適切な宿主中に含’Ｏｒ　ｉ’るラン成長ホルモン血
   相用宿主ベクター系。 （３４）　特ｉ′ｌ請求の範囲第２５項に記載のプラス
   ミドを適切な宿主中に含有４′るヒ１−成長ホルモン産
   生用宿主ベクター系。 （３５）　宿１：かへ１６３７．八１６４５．Δ２６０
   ２叉は八１５６３てあろごとを特徴と！１〜る特許請求
   の範囲第３４項に記載の宿主ベクター系。 （３６）特へ′１請求の範囲第２６項に記載のプラスミ
   ドを適切な宿主中に含有するヒト成長７］；ルモン産生
   用宿主ヘクター系。 （３７）特許請求の範囲第２７項に記載のプラスミドを
   適切な宿主中に含自七るヒト成長ポルモン産生用宿主ヘ
   クター系。 （３８）　ポリペプチドを産生Ｈルめ得ろ適切な条件Ｆ
   て特ル′Ｉ請求の９・Ｕ間第２８項に記載の宿主ベクタ
   ー系を成育ｕ゛シめ、ｉｓ　’；ｒれろポリペプチドを
   回収４ることを含むボリペプチドの製」告ノｊ法。 （３９）適切７５条ｆ’ｌての）成育か約４２°Ｃで適
   当Ａｒ　Ｉｆ！ｊ間宿１−／＼タター系を成ｆｒ　Ｌｉ
   ２．め引き続き約：（７〜３９　”Ｃて更に適当な１１
   ４７間成育ローしめるごとてあり、前記成育を適切な１
   １１地して行なわＵろごとを特徴とする特８′１請求の
   範囲第３８項に記載の方法。 （４０）　、４２°Ｃての成育の適当ｊｊ暗時間約１０
   〜：３０分てあり、３７〜３９　’Ｃての成育の時間か
   全成育ＩＢｉ間を約６０〜９０分に４”ろに１−分な時
   間であるごとを特徴と４〜１１′１請求の１・Ｕ間第３
   ９項に記載の方法、。 （４１）　４２°（：ての成育の適当な時間か約１５分
   てあり、更に３８〜：（９°（：で約７５分成育りしめ
   ろごとを特徴とする特許請求の範囲第４θ項に記載の方
   法。 （４２）　！切な培地がグルコース添加ラクトアルフミ
   ン氷解物又はブレーンハートイノフ、−ジ、−ｃノであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第３９項に記載の方
   法。 （４３）　ｂＧ　Ｈを産生せしめ得る適切な条件下て特
   許請求の範囲第３２項に記載の宿主ベクター系を成育せ
   しめ、得られるｌ＋Ｇｉ（を回収することを含むウノ成
   長ポルモンの製造方法。 （４４）　ｂＧＨを産生ｕしめ得る適切な条（ｉｔ下で
   特許請求の範囲第３３項に記載の宿主ヘクター系を成育
   せしめ、得られるｈ　Ｇ　ｌ−１を回収ｄ−ることを含
   むウノ成長ホルモンの製造方法。 （４５）　ｈＧＨを産生せしめ得る適切な条ｆｌｌ下で
   特許請求の範囲第３６項に記載の宿主ヘクター系を成育
   せしめ、得られるｈＧＨを回収４−ることを含むヒト成
   長ホルモンの製造方法。 （４６）　ｈＧＨを産生什しめ得る適切な条！ｌＦで特
   許請求の範囲第３７項に記載の宿主ヘクター系を成育ｕ
   しめ、得ら１１．ろｈＧＩＩを回収４−るごとを含むヒ
   ト成長ホルモンの製造方法。 （４７）天然に存在するｂＧＩ−１の活性を（Ｔ　Ｉ−
   １天然１＋ＧＩｌの配列と（ＪＮ−末端のアミノ酸５ｇ
   までが変異している類似）′ミノ酸配列を角４°ろｂＧ
   ＩＩアナロク。 （４８）　フェニルアラニン型ｂ　Ｇ　ＨのＮ　末端に
   アミノ酸メヂオ工ノを何することを特徴とする特ｉ’ｌ
   請求の範囲第１１７項に記載のアサログ。 （４９）　アラニンＪ（’Ｉ　ｂ　Ｇ　ＩＩのＮ−末端
   にアミノ酸メヂオニンを（１４′ろことを特徴とする特
   許請求の範囲第４７項に記載の）′す【フグ。 （５０）　フＪニルアラニン型ｂＧＩｌのＮ−末端にア
   ミノ酸配列ＭｃＬ　Δ５ｐＧＩｎを何４°るごとを特徴
   とする特許請求の範囲第４７項にａ記載のアナ［フグ。 （５１）　７−／、：’−ン９ｂＧｌｌのＮ−末端にア
   ミノ酸配列Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｙを（ｊ４“ろことを特徴
   とする特許請求の範囲第４７項に記載のアナ［ツタ。 （５２）　アラニン型ｂＧＩＩのＮ−末端にアミノ酸配
   列Ｍｅｔ−Ｇｌｙを（１４′ることを特徴とする特ｉｉ
   ’ｌ請求の範囲第４７項に記載のアナロタ。 （５；リ　アラニン型ｂＧＩ−１のＮ−末端にアミノ酸
   配列Ｍ（！［−Δ５ｐ−Ｐ　ｒｏ−ＭｅＬ−Ｇ　ｌｙを
   何４ろごとを特徴とする特許請求の範囲第４７項に記載
   のアナ〔フグ、。 （５４）フＪニルアラニン型ｂＧｔ（のＮ−末端にアミ
   ノ酸配列Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐ　ｒｏを何重ることを特徴
   とする特５′１請求の範囲第４７項に記載のアナＶ１グ
   １゜（５５）アミノ酸配列：　ＭＯｌ−（Ｘ　）ｎ　Ｙ
   　Ｍｔ；Ｌ、、、（式中、Ｍ（・ｔｉＪ：Ｎ　末端であ
   り、ＸｉＪ天然に存在４−ろ２０種のアミノ酸のい４“
   れカシごあり、Ｙ　ｔＪ、　＋’＋ｉｉ記２０種のアミ
   ノ酸からに　ｌｕ、　Ｇ　Ｉｎ、　１．、ｙｓ、　Ｍｔ
   〕Ｌ及び′Ｉ’ｒｐを除いたアミノ酸のい４゛れかてあ
   り、ｎｔｊ：０〜６の整数てあり、ＭＬ！Ｌ　は天然ｂ
   　Ｇ　ＩＩ　Ｃ＋）　４番１”１かＣ）０００１１−末
   端（１９１番１月）までの配列である）を何４ろｂＧＩ
   ＩアナＣ１り、。 （５６）　Ｎ−末端のメチオニン（／ＩＩＩ月）よでの
   アミノ酸が除去されたフェニルアラニン型１＋ＧＩｌの
   アミノ酸配列を何することを特徴とする特、ｔｊｌ請求
   の範囲第４７項に記載のアナロタ。 （５７）　フェニルアラニン型ｂＧｆｌのＮ　末端にア
   ミノ酸配列Ｍ　＋：ｔ　ｉ’　ｌｕ−Δｒｇを何するこ
   とを特徴と４−ろ牛冒′１請求Ｕ）範囲第４７項に記載
   の）′すＶｌり、。 （５８）天然に（＋’　（ｌ′４”るｂＧＨの活性を（
   −ｉ’　ｌ−ており、天然１＋　Ｇ　Ｉ（の配列から変
   異し７ているが５、ｎ（ＩＪの）′ミノ酸配列を（Ｊ″
   ４゛ろｂＧＩＩアナ１ツタ、。 （５９）　Ｎ　末ぐ１４；のメチオニン（１４番［１）
   よこのアミノ酸か除ノズさＡ１ζいろｈ（、’Ｉｆのア
   ミノ酸配列をＣ」４′るごとを特６’ｔと４′ろ！ｌ′
   １．Ｘ′Ｉ請求の範囲第５８項に記・１戊　の　′）２
   　ヲ　１ノ　タ　１、（６０）天然ｈＧＩＩのＮ　Ａ、
   、婿１；にアミノ酸メチ−４−ノを何ｄろごとを特徴ど
   ４ろ特ａ′１請求の９・Ｕ間第５）；項に記載の７−ｊ
   １ツタ゛、１ （６１）特５′１請求の範囲第４７項に記載ｏ）１１　
   （冊（アナしツクの（］効ｍ表適切八へ′担体を含ぞ１
   ゛４°ろ獣１シ、用相成物３゜ （６２）特８′１請求の範囲第５０項に記載のｂＧｌＦ
   ノ′号ログの有効槓と適切な担体を含ｒｊ′４ろ獣医用
   組成物。 （６３）特許請求の範囲第５８項に記載のｈＧＩＩアナ
   ロアナの有効量と適切な担体を含有づ゛る医薬組成物。 （６４）特許請求の範囲第４７項に記載のｌ＋　Ｇ　ｔ
   １アナロクの有効量をウソに投句することから成るウソ
   のミルク叉（Ｊ食肉／４＝　ｉｉ“ｒｔ−の刺激方法。 （６５）特許請求の範囲第５０項に記載のｂＧＨアナ［
   ｌグの有効量をウソに投すすることから成るウソのミル
   ク叉は食肉生産の刺激方法。 （６６）特許請求の範囲第５８項に記載のｈＧＩ（アナ
   【Ｊグの有効量をヒト成長ホルモン欠乏症に罹但してい
   る患者に投句４−ることがら成ろヒト成長ホルモン欠乏
   症の治療方法。 （６７）アミノ酸配列：　Ｍｅｔ−（Ｘ　）ｎ−Ｙ　−
   Ｍｅｔ、、、（式中、ＭｅｔはＮ−末端てあり、Ｘは天
   然に（ｊ−Ｙ１４ろ２０種のアミノ酸のいずれかであり
   、Ｙは前記２０種のアミノ酸のうらＧ　ｌｕ、　Ｇ　Ｉ
   ｎ、　Ｌｙｓ、　Ｍ（！Ｌ及び′Ｉ″ｒｐを除くアミノ
   酸のい４′れかであり、ｎは０〜１３の整数てあり、Ｍ
   ｅｔ、、は天然ｈＧＩＩの口番１１がらＣ００ＩＩ−末
   端（１９１番目）よ−ｊ”（７）配列テア口）　ヲ’（
   ｊずろｈＧＨアナ【ツタ５、 （６８）動物成長ホルモン又はそのア→Ｌ’７りをコー
   ドしているＩ）　ＮΔ配列を含むプラスミドの発現によ
   −）て動物成長ポルモノが産生された細菌細胞から精製
   ポルモノ又（Ｊそのアナ１）夕を回収４′ろ方法であっ
   て、 ａ　細菌細胞の細胞壁を破砕（２て溶解物を生成し、１
   １　ホルモン又（」その）２す〔ツクを沈澱上へく溶解
   物のｐｌ＋を中性１）１１に７に１，１整し、ｃ、ｐＨ
   をアルカリ性【）１１に調整４′ろごとに、Ｊ−り沈澱
   物をｉＪ溶化し、 ＋１．ゲル濾過り１ツマトゲラフイーにより、ＩＩＩ溶
   化ポルモン又（Ｊそのアナログ沈鍛物を他の１ｉＪ　Ｍ
   　１／ｌ成分から分離し、 ０　分離した７ｊ；ルモン又はそのアナ［ｌグをイオノ
   交換クロマトり′ラフイーにかけてホルモン又はそのア
   ナログを濃縮し、これにより精製；］：Ｊレモン又はア
   ナログを回収Ｗる ことから成る方法。 （６９）　ホルモン又はそのアナ［１グｈ（−ジノ１戊
   長７１；フレモノ又はそのアナログであることを特徴と
   する特許請求の範囲６８項に記載の方法。 （７０）　ホルモン又はそのアナログかブ゛り成長フ１
   ；ルモン又はそのアナログであることを特徴とする特許
   請求の範囲第６８項に記載の方θ二。 （７１）ポルモノ又はそのアナ〔Ｊグか二−ワＩ−ＩＪ
   成成長ポルノンはその）２すＶｌ夕であることを特徴と
   する特ｓ’ｌ’　請求の範囲第６８項に記載の方法、。 （７２）　ホルモン又はそのアナＣ）グがヒト成ｇ＝＋
   ：ルモン又はその）２ナロクであることを特徴とする特
   許請求の範囲第６８項に記載の方法。 （７３）細胞を１ａ械的に破砕することを特徴と４゛ろ
   １ミ冒′１請求の範囲第６８項に記載の方法。 （７４）　ｐｌ＋調整に先立ってリゾチームを溶解物に
   添加することを特徴とする特許請求の範囲第６８項に記
   載の方法。 （７５）　ｐｉｌ！ｌｌ！ｉｌ整に先）１ってデオギノ
   リポヌクレアーゼを溶解物に添加４ろことを特徴とする
   特ｉｔ’ｌ請求の範囲第６８項に記載の方法。 （７６）中＋−１ｐＨが約７４であることを特徴とする
   特約請求の範囲第６８項に記載の方法。 （７７）アルカリ性１１＋１か約１１８てあることを特
   徴とする特許請求の範囲第６８項に記載の方法。 （７８）透＋１１とその後の凍結乾燥によ−・てホルモ
   ン又はそのアナＶｌゲを史に濃縮４′ろごとを特徴と４
   −るｔ＋＝ａ許請求のｊｌｊｊ囲第６８項に記載の方法
   。