FI90564B - Menetelmä naudan, sian tai ihmisen kasvuhormonin polypeptidianalogin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä naudan, sian tai ihmisen kasvuhormonin polypeptidianalogin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI90564B FI90564B FI842842A FI842842A FI90564B FI 90564 B FI90564 B FI 90564B FI 842842 A FI842842 A FI 842842A FI 842842 A FI842842 A FI 842842A FI 90564 B FI90564 B FI 90564B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- polypeptide
- bgh
- analog
- plasmid
- vector
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
Description
Menetelmä naudan, sian tai ihmisen kasvuhormonin polypepti- dianalogin valmistamiseksi 1 y ·.' -,6 4
Eräs geenitekniikan piirre on eukarioottisista lähteistä peräisin olevien vieraiden DNA-sekvenssien istuttaminen Escherichia coliin tai muihin mikro-organismeihin. Geenitekniikan edelleen kehittyneenä piirteenä on indusoida tuloksena oleva mikro-organismi tuottamaan niitä polypeptidejä, joita vieras DNA koodaa. Polypeptidien tuottamisen voidaan katsoa olevan kaksivaiheinen prosessi, jonka kumpikin vaihe käsittää lukuisia alavaiheita. Nämä kaksi vaihetta ovat transkriptio ja translaatio. Jotta polypeptidiä voitaisiin tuottaa tehokkaasti ja suuria määriä, tulee prosessin molempien vaiheiden olla tehokkaita. Transkripti on mRNA:n tuottamista geenistä (DNA:sta) . Translaatio on polypeptidin tuottamista mRNAsta..
Transkriptioprosessin kriittinen alavaihe on alkuunsaattami-nen eli RNA-polymeraasin sitominen promoottori-operaattorin alueelle. Promoottorialueen muodostavan deoksiribonukleotidi-emäksen sekvenssi saattaa vaihdella, joten se voi vaikuttaa promoottorin suhteelliseen tehokkuuteen. Tehokkuus riippuu RNA-polymeraasin affiniteetista promoottoriin.
mRNA:n stabiilisuus vaikuttaa translaation tehokkuuteen. mRNA:n lisääntynyt stabiilisuus saa parantuneen translaation aikaan. Vaikka mRNArn stabiilisuuteen täsmällisesti vaikuttavia tekijöitä ei tarkkaan tunnetakaan, tiedetään, että mRNA:n sekundaarinen rakenne, jonka sen emästen sekvenssi määrittää, vaikuttaa stabiilisuuteen.
Translaation ensimmäinen alavaihe käsittää ribosomin sitomisen mRNA:ssa olevaan emässekvenssiin, joka tunnetaan Shine-Dalgarno-sekvenssinä tai ribosomaalisena sitoutumiskohtana (RBS). Polypeptidien synteesi alkaa, kun ribosomi kulkeutuu mRNA:n mukana AUG-aloituskodoniin translaatiota varten. Tavallisesti nämä 2 90564 kodonit sijaitsevat Shine-Dalgarno-kohdasta noin 10 emästä "alavirtaan" päin. Translaation tehokkuutta lisäävien tekijöiden joukkoon kuuluvat ribosomien sitoutumista Shine-Dalgarno-kohtaan parantavat tekijät. On osoitettu, että mRNA:n sekundaarinen rakenne Shine-Dalgarno-sekvenssin alueella ja AUG-kodoni sekä Shine-Dalgarno-sekvenssin ja AUG-kodonin välinen etäisyys kukin näyttelevät kriittistä osaa translaation tehokkuuden määräämisessä. Muita translaation tehokkuuteen vaikuttavia tekijöitä ovat ennenaikainen terminaatio ja vaimentuminen. Translaation tehokkuutta voidaan parantaa poistamalla vaimennus-kohdat .
Vaikeuteen, johon törmätään yritettäessä tuottaa eukarioottisten polypeptidien suuria määriä bakteerisoluissa, sisältyy suuria mRNA-määriä tuottavien solujen kyvyttömyys kasvaa tehokkaasti.
Tämä vaikeus voidaan poistaa estämällä transkriptio prosessilla, jota kutsutaan repressioksi. Repressiossa geenien vaikutus kytkeytyy pois proteiini-inhibiittorin (repressoriproteiini) vaikutuksen johdosta, joka proteiini estää transkription sitoutumalla operaattorialueeseen. Sen jälkeen kun mikro-organismit ovat kasvaneet toivottuihin solutiheyksiin saakka, repressoidut geenit aktivoidaan tuhoamalla repressori, tai lisäämällä indusoreina tunnettuja molekyylejä, jotka voittavat repressorin vaikutuksen.
Kirjallisuudesta on löydettävissä lukuisia julkaisuja, jotka käsittelevät eukarioottisten geenien kloonaamista sellaisiin plasmideihin, jotka sisältävät P^-promoottorin λ-bakteriofaagista. (Bernard, H.V. et ai., Gene (1979) 5_, 59; Derom, C. et ai..
Gene (1982) 1_7, 45; Gheysen, D. et ai.. Gene (1982) 1/7, 55; Hedgpeth, J. et ai.. Mol. Gen. Genet. (1978) 163, 197; Remaut, E. et ai., (1981) Gene lj>, 81; ja Derynck, R., et ai., Nature (1980) 287, 193.) Lisäksi eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 041 767, joka on julkaistu joulxikuun 16. päivänä, 1981, esitetään sellaiset ekspressiovektorit, jotka sisältävät λ-bakterio- faagista peräisin olevan P -promoottorin. Kuitenkaan missään
L
näistä viitteistä ei esitetä C ribosomaalisen sitoutumiskohdan käyttöä.
li 3 9 Π 5 6 4 λ-bakteriofaagista peräisin olevan P^-promoottorin sisältämän vektorin ja ribosomaalisen sitoutumiskohdan käyttö on jul kaistu. (Oppenheim, A.B. et ai., J. Mol. Biol. (1982) 159, 327 ja Shimatake, H. ja Rosenberg, M., Nature (1981) 292, 128.) Näissä julkaisuissa esitetään Cjj-proteiinin kohonneen tason tuotanto, mutta niihin ei sisälly tai ne eivät kuvaa eukarioot-tisten proteiinien tuotantoa.
Vuonna 1982 Shatzman ja Rosenberg esittivät posterm 14. Miamin talvisymposiumissa /Shatzman, A.R. ja Rosenberg, M., 14 Miami Winter Symposium, tiivistelmä s. 98, (1982 J_7 - Tässä tiivis telmässä on oikeuttamaton julkaisu λ-bakteriofaagista peräisin olevan PL:n sisältävän vektorin, sekä Nut ja Cjj ribosomaalisen sitoutumiskohdan käytöstä syntetisoitaessa "eukarioottista" polv-peptidiä (SV40 pikku T antigeeni ei itse asiassa ole eukanootti-nen polypeptidi, vaan virusperäinen proteiini) solun proteiinia 5%:a suurempana määränä bakteeri-isännässä, jota ei nimettv. Käytettyä operaattoria ei määritelty. Replikaation alkuperää, eikä valikoitavissa olevan fenotyypin geeniä identifioitu.
. . Tämän järjestelmän, jonka kanssa vektoria käytettiin, kuvataan • _ käsittävän tiettyjä isännän lysogeenejä, joiksi vektori voidaan stabiilisti muuntaa. Tämän keksinnön eräällä toteutusmuodolla, '..· eli pMGlOO:lla, saattaa olla tiettyjä yhtenevyyttä tämän vektorin : ·.· kanssa. Kuitenkaan sitä ei muunneta isännän lysogeeniksi, vaan pikemminkin sopiviksi E.coli-isäntäkannoiksi, jotka sisältävät termolabiilin repressorin C j. ja N-geenin, mutta joista loppu lysogeeni on poistettu. Lisäksi sitä on käytetty tuottamaan bGH- ja hGH-analogeja määriä, jotka ovat yli 20% solun koko proteiinista.
Lisäksi tämän keksinnön muissa toteutusmuodoissa käytetään . : : Crista eroavia ribosomaalisia sitoutumiskohtia. Edelleen tällä V hetkellä parhaimpina pidetyistä vektoreista, pND5 ja sen johdan-naisista, on poistettu epäessentiaaliset sekvenssit, jotta saa-·;*" täisiin luotua sellainen vektori, joka sallii polypeptidin sel-laisten määrien tuotannon, jotka määrät ovat yli 10?i suurempia :**: kuin pMGlOOrlla saadut määrät.
4 90564
Ainuttakaan julkaisua alalla ei ole olemassa, jotka käsittelevät: härän tai ihmisen kasvuhormonin onnistunutta ekspressiota P^-Cjjtn sisältävällä vektorijärjestelmällä; bGH- tai hGH-ana— logien tuottamista, joilla analogeilla on biologista aktiivisuutta; tällaisia analogeja sisältäviä valmisteita, tai niiden käyttöä; tai induktiomenetelmiä sellaisten polypeptidimäärien tuotannon aikaansaamiseksi, jotka määrät ovat 20¾ suuremmat kuin isännän kaiken kaikkiaan tuottama proteiini.
Ainoa alan julkaisu, joka käsittelee bGH-analogien tuottamista geenimanipuloiduilla vektoreilla muunnettujen isäntien avulla, käsittää Trp-promoottorin käytön tuotettaessa bGH-analogia, jolla on Met-aminohappo luonnollisen bGH:n fenyylialaniinimuodon N-päässä. /Seeburg, P.H. et ai., DNA (1983) 2:, 37.7
Ainoa alan julkaisu, joka käsittelee hGH-analogien tuottamista geenimanipuloiduilla vektoreilla muunnettujen isäntien avulla, käsittää Lac- ja Trp-promoottorien käytön tuotettaessa hGH-analogia, jolla on Met-aminohappo luonnollisen hGH:n N-päässä. /Goedell, D.V. et ai., Nature (1979) 281. 5447 Tässä keksinnössä käytetään ekspressiovektoria, joka sopivaan termolabiilin repressorin Cj sisältävään bakteeri-isäntään, nimittäin Escherischia coliriin, istutettaessa muuttaa isäntäsolun kykeneväksi, kohottamalla isäntäsolun lämpötilaa sellaiseksi, että tässä lämpötilassa repressori tuhoutuu, saamaan vektoriin istutetun halutun geenin ekspression aikaan ja saamaan geenin koodaaman polypeptidin tuotannon aikaan, joka geeni koostuu: kaksoiskierteisestä DNA-molekyylistä, joka käsittää järjestyksessä 5':sta 3':een seuraavat: DNA-sekvenssin, joka sisältää lambda-bakteriogaafista peräiSin olevat P^O^-promoottorin ja -operaattorin; N-hyödyntämiskohdan isäntäsolun tuottaman antiterminaattori-N_ proteiinin sitomiseksi;
II
DNA-sekvenssin, joka käsittää ribosomaalisen sitoutumiskohdan, jotta toivotun geenin mRNA kykenisi sitoutumaan ribosomeihin solun sisäpuolella; s sv. 4 ATG-alkuunsaattajakodonin tai DNA-sekvenssin, joka on muutettu ATG-alkuunsaattajakodoniksi istuttamalla toivottu geeni vektoriin; ja restriktioentsyymikohdan toivotun geenin istuttamiseksi vektoriin ATG-alkuunsaattajakodonin kanssa samassa vaiheessa; ja joka tämän lisäksi käsittää DNA-sekvenssin, jossa on baktee-riplasmidista peräisin oleva replikaation alkukohta. 3oka bak-teeriplasmidi kykenee itsenäiseen replikoitumiseen lsäntäsolus-sa, ja DNA-sekvenssin, joka käsittää valikoitavissa tai tunnistettavissa olevaan fenotyypin piirteeseen liittyvän geenin, joka piirre ilmenee, kun vektori on läsnä isäntäsolussa. Parhaimmat vektorit ovat pMG 100 ja pND5.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .
Geenit eli cDNArt, jotka koodaavat toivottuja polypeptidejä, kuten kasvuhormoneja, esim. härän, sian, kananpojan tai ihmisen kasvuhormoneja, superoksidi-dismutaasia, E-apoproteiinia, suu-ja sorkkatautia aiheuttavan viruksen proteiinia 1, S. aureus -bakteerin A-proteiinia, interleukiini III:a, entsyymiä tai sen analogia, voidaan plasmidin luomiseksi istuttaa vektorin re-striktioentsyymin kohtaan. Plasmidit voidaan puolestaan viedä sopiviin isäntiin, joissa geenit kykenevät ekspressoimaan ja joissa toivottuja polypeptidejä voidaan tuottaa. Parhaita plas-mideja bGH:lle ovat pRec 2/3 ja pROll; ja hGHrlle pTV 18(1) ja pTV 104(2). Sopivia isäntiä ovat mm. Escherichia coli A1637, A1645, A2602 ja A1563 A1637:ää pidettäessä tällä hetkellä parhaimpana.
Tuloksena olevia isännän vektorijärjestelmiä voidaan käyttää polypeptidien valmistukseen. Plasmideja sisältävät isäntäsolut kasvatetaan sellaisissa sopivissa olosuhteissa, jotka sallivat polypeptidin tuotannon ja tuloksena oleva polypeptidi otetaan talteen. Tällä hetkellä parhaimpina pidetään olosuhteita, joissa kasvu tapahtuu noin 42°C:ssa 10-30 minuutin ajan, erityisesti 6 9-.. B 6 4 15 minuutin ajan, mitä seuraa jatkuva kasvatus noin 37-39°C:ssa riittävän pitkän ajan, jotta koko kasvuvaiheeksi muodostuisi noin 60-90 minuuttia, erityisesti kasvatus 38-39°C:ssa noin 75 minuutin ajan. Tällä hetkellä parhaimpina pidetyt kasvatusalustat ovat laktoalbumiinin hydrolysaatit, joihin on lisätty glukoosia tai aivo-sydän-infuusionestettä.
bGH- ja hGH-analogeja on valmistettu käyttämällä isäntä-vektori-järjestelmää. Nämä analogit voidaan sisällyttää eläinlääketieteellisiin tai farmaseuttisiin valmisteisiin, vastaavasti. Vastaavia analogeja voidaan käyttää suoraan tai tämänkaltaisissa valmisteissa stimuloimaan maidon tuotantoa tai härän lihan tuotantoa tai hoidettaessa ihmisen kasvuhormonin puutostilaa.
Kuvien selvennys
Kuva 1. pMGlOO-ekspressiovektorin muodostaminen.
Tämä plasmidi muodostettiin istuttamalla restriktiokohtien Haelll (sijainti 38150) ja Sau3a (sijainti 38362) välissä sijaitseva λ-faagi-DNA:n fragmentti pKC30 plasmidi-DNA:hän, joka oli pilkottu Hpal:11a ja BamHl:11a. HaeIII-Sau3a-fragmen-tissa on nut t ,, cy ja C -proteiinin (CT -RBS) ribosomaa-linen sitoutumiskohta. C^-RBSin sisältävän DNA:n alikloonaa-minen pKC30:een saa aikaan pMG100:n, joka sisältää ainoan BamHl-restriktiokohdan välittömästi C^^-RBSm ATG-alkuunsaat-tajakodonin jälkeen, ja Ndel-restriktiokohdan ATG-tripletin sisällä (alhaalla oleva esitys). Suluissa olevat numerot ilmaisevat restriktiokohtien sijaintia λ-faagi-DNA:ssa.
Kuva 2. pRec 2/3-plasmidin muodostaminen. bGH cDNA:n sisältävä plasmidi, D4, pilkottiin Haell:11a. Tuloksena oleva 1600 emäs-parin (bp) suuruinen fragmentti puhdistettiin, jonka jälkeen se altistettiin 5 Sl-eksonukleaasi-yksikön pilkkovalle vaikutukselle 37°C:ssa 5 minuutin ajan. Synteettinen EcoRl-sitoja, jonka sekvenssi oli:
GGAATTCC
CCTTAAGG
kiinnitettiin ligatoimalla. Tuote katkaistiin EcoRl:1lä ja istutettiin pBR322:een, joka oli pilkottu EcoRl:llä. Klooni, n 7 90564 pALRl, eristettiin, joka pilkottaessa EcoRl:11ä tuotti 1200 bp:n fragmentin, jonka sekvenssi 5'-päässä oli: AATTCCCA....
GGGT....
Tämän sekvenssin muodotuminen osoittaa, että pALRl käsittää EcoRl-restriktiokohdan, jossa on TTC-kodoni luonnonmukaisen bGH:n jäännösnumerolle 1 (fenyylialaniini ) . pALRl pilkottiin osittain Pstl:llä. Pilkkoutumistuote ligatoitiin Hindlll-sito-jilla ja pilkottiin EcoRl:11a ja HindIII:lla. bGH cDNA:n sisältävä fragmentti eristettiin ja alikloonattiin pBR322:een EcoRl:n ja Hindlll:n restriktiokohtien väliin, jolloin saatiin pAL500. Tämän jälkeen alikloonattu bGH cDNA-fragmentti irroi-tettiin pAL500:sta EcoRl:11a ja Hindlll:11a, "täytettiin" DNA-polymeraasin "Klenow"-fragmenti1la ja istutettiin pMGl00-ekspres-siovektoriin (kuva 1), joka oli avattu BamHl-kohdastaan ja joka oli myös "täytetty", kuten edellä. Tuloksena oleva vektori pREC 2/2 ekspressoi modifioitua bGH:ta, joka on muutettu amino-päästään seuraavasti: 1 2
MetAspGlnPhe Pro ......bGH
Plasmidi pREC 2/2 pilkottiin Pstl:llä ja P -promoottorin ja 1 1 1" Lj bGH-geenin 5'-pään (joka on merkitty A-fragmentiksi ) sisältävä fragmentti eristettiin. Tämä fragmentti ligatoitiin pAL500:sta (merkitty fragmentiksi B) peräisin olevaan Pstl-fragmenttiin.
Tuloksena oleva vektori, pRec 2/3, ekspressoi modifioitua bGH:ta, joka on muutettu aminopäästään seuraavasti: 1 2
MetAspGlnPhe Pro ......bGH
Kuva 3. Ekspressiovektoreiden pND5, pND55 ja pROll muodostaminen Plasmidi pOG7 /Ä. Oppenheim, S. Gottesman ja M. Gottesman, J. Mol. Biol. (1982) 158, 32^7 pilkottiin Ndel:llä. P -promoottoria — Li nut t ja C -RBS kantavan suuren fragmentin päät ligatoitiin, L K 11 jolloin saatiin pND5-ekspressiovektori. Tämä pND5-vektori-DNA avataan Ndel:1lä. Tämä pRec 2/3:sta (kuva 2) peräisin olevan Ndel-fragmentin, joka sisältää bGH cDNA:n, istuttaminen tuottaa pROll-plasmidin, joka vaikuttaa olevan parempi kuvassa 2 esitetyn muunnetun bGH:n ekspressoija kuin pRec 2/3. Sekvenssiltään
TATGAGCTCA
ACTCGAGTAT
c ' c ' 4
8 " ' 'J J H
olevien synteettisten sitojien istuttaminen pOG7:ään, joka on pilkottu Ndel:llä, johtaa ekspressiovektoriin pND55, joka sisältää ainoan Sacl-restriktiokohdan ATG:n edessä. Kun pND55 pilkotaan Sacl:llä ja käsitellään DNA-polymeraasin "Klenow"-fragmentilla, niin tuloksena on ATG-alkuunsaattajakodoni, joka seuraa P -promoottoria ja CTT-RBS:ää. Tämä vektori soveltuu lukuis-ten sellaisten eukarioottisten geenien ekspressoimiseen, joilta geeneiltä puuttuu ATG-alkuunsaattajakodoni.
Kuva 4. pTV 18(l):n ja pTV 104(2);n muodostaminen. Plasmidi, pTVHGH, valmistettiin kloonaamalla hGH:ta koodaava cDNA pBR 322:n HindiII-kohtaan tavanomaisia menetelmiä käyttäen. Meth. Enzymol. (1979 ) 6_8, 75. Tämä plasmidi pilkottiin Hindlll :11a. Tuloksena oleva 800 emäsparin fragmentti puhdistettiin ja pilkottiin edelleen FnuDII:11a ja "täytettiin" DNA-polymeraasin "Klenow"-fragmen-tilla. Tämä käsittely poistaa hGH:n 16 ensimmäisen aminohapon kodonit. Tuloksena oleva DNA-fragmentti ligatoidaan synteettisellä sitojalla, joka palauttaa hGH:n sekvenssin kodonit 14
Met :sta lähtien, ja regeneroi ATG-kodonin edessä olevan Ndel- 14 restriktiokohdan Met :lle. Ndel-käsittelyn jälkeen tämä puolisynteettinen DNA istutettiin pND5-vektoriin, joka oli avattu Ndel;llä. Tuloksena oleva plasmidi pTV 18(1) ekspressoi hGH:n P^-promoottorin kontrolloimana. Tämä hGH on analogi, jolta puuttuvat 13 ensimmäistä aminohappojäännöstä, ja jonka N-päässä 14 on Met .
Plasmidi pTV 18(1) pilkottiin osittain Ndel:1lä ja ligatoitiin synteettisellä sitojalla, joka sisältää hGH:n aminohappojen 1-13 kodonit: TATGTTCCCAACCATTCCATTATCCCGTCTGTTCGACAACGC ACAAGGGTTGGTAAGGTAATAGGGCAGACAAGCTGTTGCGAT.
Sitoja on myös pTV 18(1):ssä olevaa Ndel-kohtaa täydentävä, ja se asettaa täydellisen hGH-geenin samaan vaiheeseen pND5-eks-pressiovektorin ATG-alkuunsaattajakodonin kanssa (kuva 3).
Täten tuloksena oleva plasmidi, pTV 104(2), ekspressoi luonnon hGH:ta N-päässä olevan ylimääräisen met ioni in in kanssa.
li
O '. r ' A
9 ✓ -. J 4
Kuva 5 esittää pAL Trp 46-vektoria, joka sisältää Trp-promoot-torin ja Trp E-geenin seitsemän ensimmäistä aminohappoa, joka geeni on transkription mukaisesti liitetty β-galaktosidaasigee-ni in.
Kuvat 6, 7 ja 8 esittävät ekspressiovektoreiden (Tae) sarjaa, jotka käsittävät osan Trp-promoottoris ta ja Lac-operaattorista, joita seuraavat restriktiokohdat toivotun geenin istuttamiseksi ja bGH:n ekspressoimiseksi Tac-promoottorin säätelemänä.
Kuvat 9 ja 10 esittävät ekspressiovektoreita, jotka si säl tävät bGH cDNArn histidiinipromoottorin säätelemänä.
Kuva 11 esittää bGH-geenin istuttamista ekspressiovektoriin Lac-promoottorin säätelemänä.
Kuva 12 esittää bGH-geenin ekspressiota Omp F-promoottorin säätelemänä .
4
Kuva 13. Met -bGH-analogin pAL401:n ja ekspressiovektoreiden pND6 ja pNDll, joilla on muutetut restriktiokohdat, muodostaminen : pAL401, joka ekspressoi bGH:n modifioitua muotoa, jolta muodolta 4 puuttuvat kolme ensimmäistä aminohappoa bGH:n (Met bGH:n) aminopäästä, muodostettiin kolminkertaisella ligaatiolla seu-raavia käyttäen: a) 623:n emäsparin bGH DNA-fragmentti, jossa oli PvuII ja Hindlll, ja joka oli erotettu pAL500:sta b) sitoja, joka oli muodostettu syntetoimalla kaksi DNA-ketjua, jotka puhdistamisen jälkeen saatettiin muotoon:
CCATATGTCCTTGTCCGGCCTGITTGCCAACGCTGTGCT
GCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTGGTCGACG
joka "täytettiin" DNA-polymeraasin "Klenow"-fragmenti11 a, jonka jälkeen se leikattiin Ndel:llä ja PvuII:11a 58 emäsparin fragmentin valmistamiseksi, joka fragmentti otettiin talteen ja puhdistettiin .
0' Z ' A 10 ^ . . υ 4 c) pNDll, joka valmistettiin seuraavasti. Ekspressiovektori pOG7 muutettiin Hindlll:n ja erään Ndel-kohdan (joka on etäällä ATG-alkuunsaattajakodonista) eliminaatiolla, jolloin saatiin pND6. Hindlll-sitojat vietiin Sali-kohtaan, jolloin saatiin pNDll.
Kuva 14. Aminopäästään metioniini1la modifioidun, luonnonmukai-sen bGH:n muodostaminen ja lukuisten bGH-analogien muodostaminen .
a) Plasmidi pAL401 käsiteltiin Ndel:1lä. ATG-alkuunsaattamis-signaalin ja luonnonmukaisen bGH:n aminopään kolmen ensimmäisen aminohapon koodin käsittävä synteettinen DNA-sitoja ligatoidaan Ndel-kohtaan. Tuloksena oleva vektori pAL601 johtaa luonnonmukaisen, aminopäässään ylimääräisen metioniinijäännöksen sisältävän bGH:n ekspressioon.
b) Käyttäen kohdassa a) esitettyä menetelmää, mutta oligodeoksiri-bonukleotidi-sitojän rakennetta muuntaen muodostetaan sellaisten vektoreiden joukko, jotka vektorit koodaavat härän muunnettujen kasvuhormonien sarjaa. Muunnetut kasvuhormonit alkavat N-pääs-tään metioniinilla, jota seuraa mikä tahansa 20:sta luonnossa tavattavasta aminohaposta kummassakin asemassa 1 ja 2, ja mikä tahansa 20:sta aminohaposta asemassa 3, lukuunottamatta aminohappoja Glu, Gin, Lys, Met tai Trp. Asemasta 4 eteenpän COOH-päähän saakka sekvenssi on identtinen luonnonmukaisen bGH;n sekvenssiin verrattuna.
Kuva 15. Tibia-koe. Tässä kuvassa verrataan pRec 2/3 bGH-ana-login vaikutusta ja luonnonmukaisen bGH:n vaikutusta sellaisen rotan luulevyn kasvuun, joilta rotilta aivolisäke on poistettu.
Sellainen vektori on kehitetty, jolla vektorilla parantuneiden geeniekspression ja polypeptidiekspression tasojen saavuttaminen tulee mahdolliseksi. Tämä vektori on kaksoisjuosteinen DNA-molekyyli. Kun vektori siirretään sopivaan termolabiilin rep-ressorin C^. sisältävään isäntäsoluun, ja kun isäntäsolun lämpötilaa kohotetaan sellaiseksi, että repressori tässä lämpötilassa h tuhoutuu, niin vektori tekee isäntäsolun kykeneväksi toteutta maan vektoriin istutetun toivotun geenin ekspression ja tämän geenin koodaavan polypeptidin tuottamisen.
il 9-564
Vektorissa on järjestyksessä 5'-3' seuraavat: DNA-sekvenssi, joka käsittää lambda-bakteriofaagista peräisin olevan promoottorin ja operaattorin P O ; N-hyödyntämiskohta isäntäsolun tuottaman antiterminaattori-N-proteiinin sitomiseksi; DNA-sekvenssi, joka käsittää ribosomaalisen sitoutumiskohdan, jotta toivotun geenin mRNA kykenisi sitoutumaan riboscmeihin isäntäsolun sisäpuolella; ATG—aikuunsaattajakodoni tai DNA-sekvenssi, joka on muunnettu ATG-alkuunsaattajakodoniksi istuttamalla toivottu geeni vektoriin; ja restriktioentsyymin kohta toivotun geenin istuttamiseksi vektoriin ATG-alkuunsaattajakodonin kanssa samassa vaiheessa.
Vektorissa on samoin DNA-sekvenssi, joka sisältää bakteeriplas-midista peräisin olevan replikaation alkukohdan, joka bakteeri-plasmidi kykenee itsenäiseen replikoitumiseen isäntäsolussa ja DNA-sekvenssi, joka käsittää valikoitavissa tai tunnistettavissa olevaan fenotyypin piirteeseen liittyvän geenin, joka piirre ilmenee vektorin ollessa läsnä isäntäsolussa.
Vektorin kanssa käytettävä isäntä on Escherichia coli. Tällä hetkellä parhaimpana pidetyt kannat ovat A1637, A1645, A2602 ja A1563. Tällä hetkellä kanta A1637 on kaikkein parhaimpana pidetty. Se saatiin C600:sta istuttamalla tetrasykliiniresistenssin geenin sisältävä transposoni galaktoosioperoniin, kuten ekspression lambda-järjestelmäkin, joka on galaktoosioperonin lähellä. Se on taltioitu kokoelmaan American Type Culture Collection; Rockville, Maryland, U.S.A. ja se sisältää lukuisia plasmideja, kuten jäljempänä on esitetty. Tämänkaltaiset taltioinnit pyrittiin tekemään sopimuksen Budapest Treaty on the International Recog nition of the Deposit of Microorganisms mukaisesti.
12 SK: 5 ό 4 A1645 saatiin A1637:stä selektoimalla Gal+-ominaisuus (galak-toosin fermentointikyky) sekä tetrasykliiniresistenssin puuttuminen. Se sisältää edelleen lambda-ekspressiojärjestelmänkin, mutta selektio poisti osan transposonista. Sen fenotyyppi on C600 r m+ gal+ thr leu lac Z (λοΙ857 ΔηΙ ΔΒΑΜ N+).
A2502 ja A1553 on johdettu SA500:sta. Niiden fenotyypit ovat SA500 his ilu gal+ Δ 8 (λ(Γΐ857ΔΗ1ΔΒΑΜ N+) ja SA500 his ilu gal + Δ8 lac ZxA21 (XCI859 int2 xisl nutL3 ΔΗ1), vastaavasti.
Vektori on mieluiten kovalenttisesti sulkeutunut, pyöreä, kaksois juosteinen molekyyli. Oleellista ei kuitenkaan ole se, että vektori on kovelenttisesti sitoutunut.
Vektori saavuttaa parantuneet ekspressiotasot sen jälkeen kun isäntä on kuumennettu sellaiseen lämpötilaan, jossa C^-repressori tuhoutuu. 42°C:een yläpuolella oleva lämpötila on tehokas tähän tarkoitukseen, ja koska toivottavaa on, että isäntäsolun tarpeetonta vahingoittamista höyryllä vältetään niin suuressa määrin, kuin mahdollista, niin yleisesti toivottavaa on, että lämpötila ei koskaan ylitä 42°C:ta enemmän kuin muutaman asteen.
Eräs vektorin tärkeä komponentti on ribosomaalinen sitoutumiskohta. Sopivia kohtia ovat lambda-bakteeriofaagista peräisin olevat CIi::t, joilla on sekvenssi: TAAGGAAATACTTACAT ATTCCTTTATGAATGTA; synteettinen oiigonukleotidi, jolla on sekvenssi: TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA; ja bakteriofaagi lambdan pääasiallisen pääproteiinin geeni, jolla on sekvenssi: 13 ·: c,04
TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG
AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC.
Toinen vektorin komponentti on restriktioentsyymin kohta toivottujen geenien istuttamiseksi vektoriin ATG-alkuunsaattajakodonin kanssa samassa vaiheessa. Lukuisia tämänkaltaisia kohtia voidaan käyttää. Tällä hetkellä parhaimpana pidetään kohtia BamHl, Sacl ja Ndel.
Vektori käsittää myös isäntäsolussa itsenäiseen repiikaatioon kykenevästä bakteeriplasmidista peräisin olevan replikaation alkamiskohdan. Tämänkaltaisia sopivia replikaation alkamiskohtia voidaan saada lukuisista lähteistä. Tällä hetkellä hyvinä pidetään pBR322:sta tai pRlrstä peräisin olevia replikaation alkamiskohtia.
DNA-sekvenssi, joka käsitää valikoitavissa tai tunnistettavissa olevaan fenotyypin piirteeseen liittyvän geenin, joka piirre ilmenee vektorin ollessa läsnä isäntäsolussa, on myös vektorin komponentti. Sopivia geenejä ovat ne, jotka liittyvät lämpötila-herkkyyteen tai lääkeaineen resistenssiin, kuten ampisilliinin, kloramfenikolin tai tetrasykliinin resistenssiin.
Tieteellisessä kirjallisuudessa aikaisemmin esitettyihin vekto-reihin verrattuna keksinnön mukaisia vektoreita voidaan käyttää lukuisien erilaisten, toivottuja polypeptidituotteita koodaavien geenien parantuneen ekspression saavuttamiseen. Sopiviin geeneihin kuuluvat sellaiset geenit, jotka koodaavat kasvuhormoneja, esim. härän, sian, kananpojan tai ihmisen kasvuhormoneja; super-oksidi dismutaasia; apoproteiini E:tä; suu- ja sorkkatautivi-ruksen virusproteiinia 1, S. aureus-bakteerin A-proteiinia, interleukiini liira, entsyymejä, tai minkä tahansa edellämainitun analogeja. Analogilla tarkoitetaan polypeptidiä, jolla on sama aktiivisuus kuin luonnossa esiintyvällä polypeptidi1lä, mutta jonka N-päässä on yksi tai useampi erilainen aminohappo.
14 9 . 564
Vektori voidaan muodostaa menetelmillä, jotka keksintöön liittyvän alan asiantuntijoille ovat hyvin tunnettuja. Tämänkaltaisia menetelmiä esitetään yksityiskohtaisemmin lukuisissa, tässä julkaisussa tunnistetuissa julkaisuissa, joiden julkaisujen sisältö sisällytetään täten tähän julkaisuun viittauksella, jotta alan tämänhetkisestä tilasta tarjottaisiin täydelliset tiedot.
Eräs tällä hetkellä hyvänä pidetty vektori on pMGlOO, jolla on kuvassa 1 esitetty restriktiokartta. Tässä vektorissa on ollut sen BamHl-restriktiokohtaan istutettu cDNA, joka koodaa härän kasvuhormonia. Tuloksena olevaa plasmidia kutsutaan pRec 2/3:ksi. Sen restriktiokartta on esitetty kuvassa 2. Plasmidi pRec 2/3 istutettiin E.colirn kantaan A1637 tavanomaisia muuntamismenetelmiä käyttäen. Tuloksena oleva isäntä-vektori-järjestelmä on taltioitu numerolla ATCC 39385.
Toinen tällä hetkellä hyvänä pidetty vektori on pND5, jolla on kuvassa 3 esitetty restriktiokartta. Härän kasvuhormonin cDNA on istutettu Ndel-restriktiokohtaan. Tuloksena olevaa plasmidia kutsutaan pROll:ksi. Senkin restriktiokartta on esitetty kuvassa 3. Piasmidi pROll istutettiin E.colirn kantaan A1637 muunnoksella. Tuloksena oleva isäntä-vektori-järjestelmä on taltioitu numerolla ATCC 39390.
Vektoria pND5 on myös käytetty ihmisen kasvuhormonin kloonaamiseen. Eräs pTV 18(1)rksi kutsuttu plasmidi ja eräs muu pTV 104(2)rksi kutsuttu plasmidi on muodostettu istuttamalla hGH cDNA Ndel-restriktiokohtaan. pTV 18(1) on esitetty kuvassa 4.
Se on viety E.colirn kantaan A1637 muunnoksella. Tuloksena oleva isäntä-vektori-järjestelmä on taltioitu numerolla ATCC 39386. pTV 104(2) on esitetty kuvassa 4. Myös se on viety E.colirn kantaan A1637. Tuloksena oleva isäntä-vektori-järjestelmä on taltioitu numerolla ATCC 39384.
Samaa lähestymistapaa käyttäen muitakin plasmideja voidaan valmistaa istuttamalla keksinnön mukaisen vektorin restriktioent-syymin kohtaan toivottua polypeptidiä koodaava geeni.
li 15 9·:Ε64
Edellä esitettyihin spesifisiin isäntä-vektori-järjestelmä in kuuluu E.coli A1637. Kuitenkin, kuten edellä on mainittu, myös muitakin kantoja on käytetty, kuten esim. A1645, A2602 ja A1563. Näitä isäntä-vektori-järjestelmiä voidaan käyttää tuotettaessa polypeptide ja, kuten härän ja ihmisen kasvuhormoneja. Tätä varten isäntä-vektori-järjestelmä kasvatetaan sopivissa olosuhteissa, jotka sallivat polypeptidin tuotannon, jonka jälkeen polypeptidi otetaan talteen.
Sopivat olosuhteet käsittävät isäntä-vektori-järjestelmän kasvattamisen sopivan ajanjakson ajan noin 42°C:ssa, mitä seuraa jatkettu kasvatus noin 37-39°C:ssa lisää jän jakson ajan, kasvun tapahtuessa sopivalla alustalla.
Ensimmäinen kasvujakso on pituudeltaan mieluiten noin 10-30 minuuttia 42°C:ssa, mitä seuraa kasvatus 37-39°C:ssa sellaisen riittävän pitkän ajanjakson ajan, että koko kasvujakson pituus on noin 60-90 minuuttia. Mieluiten kasvatus tapahtuu 15 minuutin ajan 42°C:ssa, mitä seuraa noin 75 minuutin kasvatus 38-39°C:ssa. Sopivia alustoja ovat esim. 1aktalbumiin in hydroly-saatti, johon on lisätty glukoosia tai aivo-sydän-infuusiones-. . tettä. Jotta vektori saataisiin pysymään scabiilisti isännässä, . . niin on tärkeätä, että isäntä pidetään selektiivisen paineen - 1 2 alaisena esim. antibiootin lisäyksen avulla.
Lukuisia bGH- ja hGH-analogeja on valmistettu edellä esitetyn menetelmän avulla. Näillä on tai saattaa olla luonnossa esiintyvien hormonien aktiivisuus.
bGH-analogeilla on luonnon bGH:n aktiivisuus, ja identtinen aminohapposekvenssi lukuunottamatta N-pään vaihtelua aina viiteen (5) aminohappoon saakka. Näistä esimerkkeinä seuraavat: aminohappo metioniini kiinnittyneenä bGH:n fenyylialaniini- ··· muodon N-päähän.
2 aminohappo metioniini kiinnittyneenä bGH:n alaniinimuodon N-päähän.
16 v ^64 3) aminohapposekvenssi Met-Asp-Gln kinnittyneenä bGH:n fenyyli-alaniinimuodon N-päähän.
4) aminohapposekvenssi Ala-Gly kiinnittyneenä bGH:n alaniini-muodon N-päähän.
5) aminohapposekvenssi Met-Gly kiinnittyneenä bGH:n alaniini-muodon N-päähän.
6) aminohapposekvenssi Met-Asp-Pro-Met-Gly kinnittyneenä bGH:n ai aniinimuodon N-päähän.
7) aminohapposekvenssi Met-Asp-Pro kiinnittyneenä bGH:n fenyyli-alaniinimuodon N-päähän.
8) aminohapposekvenssi Met-Thr-Arg kiinnittyneenä bGH:n fenyyli-alaniinimuodon N-päähän.
9) aminohapot metioniiniin saakka (4 asemaa) puuttuvat bGH:n fenyylialaniinimuodon N-päästä.
bGH-analogi, jonka aminohappojärjestys on:
Met-(X ) -Y-Met. . . n missä Met on N-pää, X on mikä tahansa 20:sta luonnossa esiintyvästä aminohaposta, Y on mikä tahansa 20:sta aminohaposta, aminohappoja Glu, Gin, Lys, Met tai Trp lukuunottamatta, n on kokonaisluku 0:sta 6:een ja Met... on luonnollisen bGH:n sekvenssi asemasta 4 lähtien COOH-päähän saakka (asema 19L).
hGH-analogeilla on luonnollisen hGH:n aktiivisuus ja identtinen aminohapposekvenssi, N-pään vaihteluita lukuunottamatta. Esimerkkeinä näistä ovat seuraavat: 1) aminohappo metioniini liittyneenä luonnollisen hGH:n N-päähän.
2) aminohapot metioniiniin saakka (14 asemaa) puuttuvat hGH:n N-päästä.
hGH-analogi, jonka aminohappojärjestys on:
Met - (X ) -Y-Met... n missä Met on N-pää, X on mikä tahansa 20:sta luonnossa esiintyvästä aminohaposta, Y on mikä tahansa 20:sta aminohaposta, lukuunottamatta aminohappoja Glu, Gin, Lys, Met tai Trp, n on kokonaisluku 0:sta 13:een ja Met... on luonnollisen hGH:n sekvenssi asemasta 14 lähtien COOH-päähän asti.
Il 17 91", 5 64
Sellaisia eläinlääketieteellisiä valmisteita, jotka sisältävät yhden tai useamman bGH-analogin tehokkaita määriä sekä sopivaa kantaja-ainetta, voidaan valmistaa. Tällaiset kantaja-aineet ovat hyvin tunnettuja tämän alan asiantuntijoille. Analogeja voidaan antaa suoraan tai valmisteen muodossa nautaeläimille maidon tai lihan tuotannon kohottamiseksi .
Sellaisia farmaseuttisia valmisteita, jotka sisältävät yhden tai useamman hGH-analogin tehokkaita määriä sekä sopivaa kantaja-ainetta, voidaan valmistaa. Tällaiset kantaja-aineet ovat hyvin tunnettuja tämän alan asiantuntijoille. Analogeja voidaan antaa suoraan tai valmisteen muodossa ihmiskohteelle, esim. kääpiötaudin vaivaamalle henkilölle, kohteen gGH:n tuotannon puutteiden hoitamiseksi.
Esimerkit
Seuraavat esimerkin on esitetty auttamaan keksinnön ymmärtämisessä. Esimerkkeihin ei sisälly vektoreiden muodostamisessa, haluttuja polypeptidejä koodaavien geenien tämänkaltaiseen vektoriin istuttamisessa tai tuloksena olevien plasmidien bakteeri-isäntiin viemisessä käytettyjen tavanomaisten menetelmien yksityiskohtaista kuvausta. Nämä menetelmät ovat hyvin tunnettuja alan asiantuntijoille, ja ne on esitetty lukuisissa julkaisuissa, joista esimerkkeinä seuraavat:
Principles of Gene Manipulation, An Introduction to Genetic Engineering, 2nd Edition, toimittaneet R.W. Old ja S.B. Primrose, Univ. of Calif. Press (1981)
Met. Enzymol. vol. 68, Recombinant DNA, toimittaneet Ray Wu, Academic Press (1979),
Met. Enzymol. vol. 65, Nucleic Acids (Osa 1), toimittaneet Lawrence Grossman ja Kivie Moldave, Academic Press (1980) T. Maniatis, E.F. Fritsch ja J. Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982) 18 9' S64 H. V. Bernard et ai., Gene (1979) _5, 59 A.B. Oppenheim et ai., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327 E. Remaut et al·., Gene (1981) 15_, 81
Esimerkki 1 Ekspressiovektorit Tässä käytettynä termillä ekspressiovektori tarkoitetaan sellaista plasmidien ryhmää, joita plasmideja voidaan käyttää toivottujen geenien ekspressiossa bakteereissa, erityisesti E.coli:ssa. Toivottu geeni voi olla istutettu ekspressio-vektoriin tai vaihtoehtoisesti ekspressiovektorissa olevat promoottorit voidaan leikata ja asettaa toivotun geenin eteen.
I. P^-ekspressiovektorit
A. pMGlOO
pMGlOO, kuten kuvassa 1 on esitetty ja kuten yksityiskohtaisesti kohdassa Kuvien selitykset on esitetty, koostuu monikopioplasmi-diin pBR322 istutetusta ÄDNA:sta. ADNA:n huomattavimmat ominaisuudet ovat, että se sisältää>P -promoottorin, N-hyÖdyntämis-
Li kohdat L ja R friut^ ja nut^ terminaatiokohdan Rl (tR^), ribo- somaalisen sitoutumiskohdan ja ATG-alkuunsaattamiskodonin. Muut ominaisuudet on esitetty kuvassa 1.
pMGlOO valmistettiin pKC30:sta. pKC30 valmistettiin puolestaan alikloonaamalla λPL-promoottori seuraavalla tavalla.
λ-faagi DNA pilkottiin Xhol ja Smal restriktioendonukleaasei1la, ja 6393 emäsparista muodostuva ainut fragmentti puhdistettiin, jonka jälkeen se pilkottiin HindiII ja BamHl restriktioendonuk-laaseilla. Muodostuva fragmentti käsitti 2397 emäsparia, ja siihen sisältyvä P^-promoottori puhdistettiin ja ligatoitiin PBR322 DNA suureen fragmenttiin, joka oli eristetty Hindlll- ja BamHl-pilkkoutumistuotteesta. Aliklooni identifioitiin pesäke-hybridisaatiolla, se otettiin talteen ja plasmidi-DNA eristettiin (Oppenheim, A. et ai., J. Mol.Biol. (1982) 158, 327).
II
19 S :.-64 Tämä plasmidi ja sen eukarioottisia geenejä sisältävät johdannaiset voidaan säilyttää sopivissa E.coli-isännissä. Isännän tärkein piirre on se, että siinä on lämpöherkkä repressori CI857 ja antiterminaation N-proteiini. /Gottesman, M.E. et al.(
J. Mol.Biol. (1978) 140, 191 .J
Tällä vektorilla on lukuisia etuja aikaisemmin esitettyihin ekspressiovektoreihin verrattuna, muun muassa: 1. Ekspression erittäin korkeat tasot Tämä vektori kykenee ohjaamaan vieraiden proteiinien ekspressiota E.coli:ssa tasoilla, jotka ovat niinkin korkeat kuin 15-25% solun kokonaisproteiinista.
2. Ekspression lämpöindusoitu säätely P -promoottori on epäaktiivinen, kun CI-repressori on liittyneenä
Li siihen. CI857-repressori on lämpöherkkä, eli se sitoutuu promoottoriin 30°C:ssa, mutta se muuttuu epäaktiiviseksi 42°C:ssa. Täten kohottamalla käymislämpötilaa 42°C:een isäntäbakteerit indusoituvat tuottamaan toivottua proteiinia.
Tämänkaltaisen järjestelmän etuja ovat mm. seuraavat: (a) E.coli:lle toksista vierasta proteiinia voidaan tuottaa haluttaessa, jolloin solujen kuoleminen käymisprosessin alussa vältetään.
(b) proteiinien ylituotanto saattaa stabiloida järjestelmää ja estää proteolyyttistä hajoamista /Cheng, Y.E. et ai., Gene (1981) 14 , 1217. Täten "hetkellinen" ylituotanto tiukasti säädeltyä promoottoria, kuten P :a, käyttäen saattaa olla suositeltavampaa
Lj jatkuvaan alhaisen tason tuotantoon verrattuna.
3. Kopioiden suuri lukumäärä
P -promoottori pMGlOO esiintyy plasmidissa siten, että sen kopioi-E
den lukumäärä on suuri verrattuna A;aan itseensä, joka on läsnä E.coli:ssa alhaisina kopioiden lukumäärinä. Tämä kohottaa ekspressiotasoja.
4. Ribosomin sitoutumiskohta ja alkuunsaattajakodoni Tämä ekspressiovektori käsittää voimakkaan ribosomaalisen sitou- 2 0 ' h o 4 tumiskohdan (RBS) sekä translaation alkuunsaattajakodonin (ATG). Täten mikä tahansa eukarioottinen geeni voidaan kloonata tarvitsematta lisätä alkuunsaattajakodonia. Lisäksi tehokas RBS lisää ekspression tasoja.
5. Sopiva restriktiokohta
Ekspressiovektorissa on BamHl-kohta, joka sijaitsee siten, että se seuraa välittömästi ATG-alkuunsaattajakodonia, mikä tekee toivotun geenin asianmukaisen asettamisen mahdolliseksi optimaalisen ekspression saavuttamiseksi.
6. Nut-kohta
Isännästä peräisin oleva N-proteiini sitoutuu ekspressiovektorin Nut-kohtaan, jolloin se estää transkription päättymisen tRl-kohdassa B. pND5
Kuten kuvassa 3 on esitetty, pND5 käsittää P -promoottorin ja tämän keksinnön mukaisten ekspressiovektoreiden muut tärkeät komponentit. Siihen kuuluu ainut Ndel-kohta, joka on välittömästi ribosomaalisen sitoutumiskohdan jälkeen. Ribosomaalinen sitoutumiskohta eroaa tavallisesta C^-kohdasta. Sen sekvenssi on :
TAAGGAAGTACTTACAT
ATTCCTTCATGAATGTA
Se saattaa olla johdettu mutantista tai olla kemiallisesti syntetisoitu. Kuten yksityiskohtaisesti on esitetty kohdassa Kuvien selitykset, pND5 johdettiin pOG7:stä. /Öppenheim, A., et ai., J.Mol.Biol. (1982) 158, 3277. Tämä vektori ei sisällä translaation alkuunsaattajakodonia. Se vaikuttaa saavan aikaan muunnettujen bGH:n ja hGH:n lisääntynyttä ekspressiota, erityisesti parantunutta saantoa bGH-analogin sisältävään pMGl00:aan verrattuna .
C. pND55 pND55 on pND5:n johdannainen, ja se sisältää sopivan restriktio-kohdan Sacl C^-RBSm edessä ja ATG-alkuunsaatta jakodonin. Plas-midin leikkaamisella tästä kohdasta ja tätä seuraavalla DNA-poly- meraasin Klenow-fragmentilla käsittelyllä voidaan saavuttaa sellainen ATG-alkuunsaattajakodoni, johon mikä tahansa toivottu geeni voidaan ligatoida (kuva 3 ja kuvan 3 selitys).
21 o r, ,.: a
✓ . i J
II. Trp-Ekspressiovektorit A. pAL Trp 46 pAl Trp 46 käsittää Trp-promoottorin ja 3-galaktosidaasigeeniin yhdistyneen Trp E-geenin seitsemän ensimmäistä aminohappoa.
(kuva 5.) Toivottu geeni voidaan istuttaa BamHl-kohtaan, joka seuraa Trp E:n seitsemää aminohappoa.
B. pAl Trp 47; Trp 46, josta valmentaja on poistettu Tämä muodostamistapa perustuu Trp 46:een, ja siinä Trp-promoot-torin vaimentaja-alue on poistettu.
C. Trp-Lac-yhdistämiset Tämän plasmidissa p4754 esiintyvän promottorin muodostaminen on esitetty kuvissa 6 ja 7. Tämän muodostamistavan muunnelma on esitetty karkeasti kuvassa 8.
III. Histidiinipromoottorin ekspressiovektorit Tämän ekspressiovektorin muodostaminen on esitetty kuvissa 9 ja 10.
IV. Muut käytetyt promoottorit A. Lac Tätä promoottoria käytettiin pYL 301:a muodostettaessa, kuten kuvassa 11 on esitetty.
B. Omp F
Tämä on promoottori järjestelmä, joka ekspressoi signaalijärjestelmään kiinnittynyttä proteiinia. Signaalisekvenssi irtoaa, kun proteiinin sijainti muutetaan kalvon toiselle puolelle.(kuva 12 . ) 22 9 ' F, 6 4
Esimerkki 2 Härän kasvuhormoni bGH cDNA:n muunnelmien lähtökohta on plasmidi D4 , joka on kuvattu aikaisemmin. /Keshet, E. et ai, Nucleic Acids Research (1981) 9^, 197 D^-plasmidi on tallennettu aikaisemmin kokoelmaan American Type Culture Collection E.coli-isäntään numerolla ATCC 31826.
I. pRec 2/3 bGH
pRec 2/3:n muodostaminen on esitetty kuvassa 2 ja esitetty kohdassa Kuvien selitykset. D^:stä peräisin olevaa bGH cDNArta on manipuloitu ennenkuin se on istutettu PMG100:aan oikeiden lukeu-tumispuitteiden aikaansaamiseksi.
pRec 2/3 on viety lukuisiin E.coli-kantoihin, muiden muassa kantaan A1637, muunnoksella tunnettuja menetelmiä käyttäen. pRec 2/3:n sisältävä A1637 on tallennettu numerolla ATCC 39385. Kasvatettuna ja indusoituna tämä kanta tuottaa bGH:n analogin, jolla on aminohapposekvenssi Met-Asp-Gln, joka sekvenssi on liittyneenä luonnollisen bGH:n fenyy1ialaniinimuodon N-päähän. pRec 2/3:n tuottaman bGH-analogin määrä oli noin 23% bakteerien tuottamasta kokonaisproteiinin määrästä, Coomasie-värjätty-jen SDS-polyakryyliamidigeelien y1ipyyhkäisyn avulla laskettuna.
II. pROll pR011:n muodostaminen on esitetty kuvassa 3 ja selitetty kohdassa Kuvien selitykset. pND5 vektori-DNA on pilkottu Ndel:1lä. pRec 2/3:sta peräisin olevan bGH cDNA:n käsittävän Ndel-fragmen-tin (kuva 2) istuttaminen johtaa plasmidiin pROll.
pROll on viety muunnoksella E.coli:iin A1637. Tuloksena oleva isäntä-vektori-järjestelmä on taltioitu numerolla ATCC 39390. Kasvatettuna ja indusoituna tämä kanta tuottaa saman analogin kuin pRec 2/3:kin. Alustavat tulokset osoittavat, että pROll tuottaa jopa 20% enemmän bGH-analogia kuin pRec 2/3. Kannan kasvattamiseen, tuotetun bGH-analogin talteenottamiseen ja sen puhdistamiseen käytetyt menetelmät ovat samat kuin pRec 2/3: Ile esimerkissä 4 esitetyt menetelmät.
li 23 Γ.^64 III . PAL401 pAL401:n muodostaminen on esitetty kuvassa 13 ja selitetty kohdassa Kuvien selitykset. D^:stä peräisin oleva bGH cDNA istutettiin pAL-500:n (kuva 2) kautta pNDll:een, kuten kuvassa 13 on esitetty.
pAL401 voidaan viedä E.coli:n kantaan A1637 muunnoksella. Tuloksena oleva kanta tuottaa bGH:n analogin, jossa luonnollisen 4 4 bGH:n Met^ on N-päässa ja josta Met :ää edeltävät aminohapot on poistettu.
IV. pAL601 pAL601:n muodostaminen on esitetty kuvassa 14 ja selitetty kohdassa Kuvien selitykset. Se on pAL401:n (kuva 13) johdannainen.
pAL601 voidaan viedä E.colirn kantaan A1637 muunnoksella. Tuloksena oleva kanta tuottaa bGH:n analogia, jossa Met on liittyneenä bGH:n fenyylialaniinimuodon N-päähän.
Esimerkki 3 Ihmisen kasvuhormoni hGH cDNA:n lähtökohtana oli acromegaliapotilaiden aivolisäkekas-vaimesta puhdistetusta mRNA:sta peräisin olevan cDNA:n kloonaaminen pBR322:n Hindlll-kohtaan.
I. pTV 18(1) PTV 18(1):n muodostaminen on esitetty kuvassa 4 ja selitetty kohdassa Kuvien selitykset. hGH cDNArta manipuloitiin ennenkuin se istutettiin pND5:een oikeiden lukeutumispuitteiden saavuttamiseksi .
pTV 18(1) vietiin E.coli:n kantaan A1637 muunnoksella. Tuloksena olevat bakteerit on tallennettu numerolla ATCC 39386.
Kasvatettuna ja indusoituna tämä kanta tuottaa hGH:n analogin, 14 jolla on luonnollisen hGH:n sekvenssi, joka alkaa Met :llä, ja jolta analogilta puuttuu aminohapot 1-13. pTV 18(1):n tuottaman hGH-analogin määrä oli noin 8% bakteerien tuottamasta kokonais-proteiinista.
24 9:.:5 64 II. pTV 104(2) pTV 104(2):n muodostaminen on esitetty kuvassa 4 ja selitetty kohdassa Kuvien selitykset. hGH cDNArta manipuloitiin ennenkuin se istutettiin pND5:een oikeiden lukeutumispuitteiden saavuttamiseksi .
pTV 104(2) vietiin E.colirn kantaan A1637 muunnoksella. Tuloksena olevat bakteerit on tallennettu numerolla ATCC 39384. Kasvatettuna ja indusoituna tämä kanta tuottaa hGH:n analogin, jolla on luonnollisen hGH:n sekvenssi, jota N-päässä edeltää Met. pTV 104(2):n tuottaman hGH-analogin määrä oli yli 25% bakteerei-den tuottamasta kokonaisproteiinista.
Esimerkki 4 pRec 2/3:n kasvattaminen
Varastoviljelmät: Al637:ssä olevien pRec 2/3:n varastoviljelmät kasvatetaan BHI-alustalla (katso siirroste), jonka jälkeen ne laimennetaan kaksinkertaisiksi fosfaattisitraattipuskuria sisältävällä 87%:lla glyserolilla, ja varastoidaan -70°C:ssa.
Siirroste: Siirroste kasvatetaan BHI-alustalla (37 g/1) aivo- sydän infuusionestettä (Difco). Ravistelupulloissa oleva alusta siirrostetaan varastoviljelmäliä ja inkuboidaan 15 tuntia ravis-telijassa 30°C:ssa, 200 kierrosta minuutissa. Siirrosteen seu-raavat kasvatusvaiheet suoritetaan sekoittajalla varustetuissa ilmastetuissa fermenttoreissa. Steriili alusta siirrostetaan 0,2 ml:lla ravisteluviljelmää litraa kohden, ja inkuboidaan 15 tuntia 30°C:ssa, pH:ssa 7+0,5 sekoittaen ja ilmastaen, jotta liuenneen hapen taso säilytettäisiin 20% ilman kyllästymisasteen yläpuolella.
Tuotanto: Tuotantoalusta sisältää:
Laktalbumiinin hydrolysaattia (entsymaattista) 20 g/1
Hiivauutetta 10 g/1 K2HP04 2,5 g/1
NaCl 10 g/1
Ampisilliinia 0,1 g/1
II
25 9-:.504
Biotiinia 0,1 mg/1
Tiamiinia 1 mg/1
Hivenaineliuosta 3 ml/1
Liuoksessa olevat ampisilliini, biotiini ja tiamiini steriloidaan erikseen suodattamalla ja lisätään steriiliin tuotantoalustaan ennen siirrostamista. Alussa lisätään steriiliä glukoosiliuosta siten, että pitoisuus on 10 g/1, ja sitä lisätään induktio- ja ekspressiotoimenpiteiden aikana glukoosipitoisuuden säilyttämiseksi yli 10 g/1 .
Hivenliuos sisältää:
MgS04.7H20 170 g/1
FeCl3 16 g/1
ZnCl2.4Η2<3 2 g/1
CoC12.6H20 2 g/1
Na2Mo04.2H20 2 g/1
CaCl2.2H20 1 g/1
CuCl2 1 g/1 H3B03 0,5 g/1 Väkevää HCl:a 100 ml/1
Alustaan siirrostetaan 5-10% siirrostevi1jelmää ja sitä inkuboi-daan 30°C:ssa. Sekoitus-ilmastusnopeudet asetetaan siten, että liukoisen hapen taso säilytetään 20% ilman kyllästymisasteen yläpuolella. pH pidetään arvossa 7+0,2 NH3: n avulla. Heti kun solupitoisuus saavuttaa suurin piirtein arvon 3 g/1 (OD56Q = 10), niin induktio aloitetaan.
Lämpötila kohotetaan 42°C:een. Se säilytetään tässä arvossa 15 minuuttia, jonka jälkeen se lasketaan 38°C:een. Sen jälkeen kun 38°C:ssa suoritettu inkubointi on kestänyt 1-1 1/2 tuntia, viljelmä jäähdytetään ja solut otetaan talteen sentrifugoimalla hormonin puhdistamista varten.
•U— 26 ;· ' ~ ή 4 bGH:n talteenotto
Yksi kilogramma bakteerisoluja suspendoidaan 10 tilavuuteen nestettä, joka sisältää 50 mM Tris-Cl:a (pH 7,4), 50 mM EDTA:a ja 25% sakkaroosia Warring-sekoittajassa, jolloin sekoittajan nopeutta säädetään siten, että vaahtoaminen on niin vähäistä kuin mahdollista. Homogeenista suspensiota johdetaan jatkuvasti Dynomill-solusärkijän (Willy A. Bachofen, Basel) läpi, ja hajotettujen solujen homogeeninen suspensio kirkastetaan ensin sentrifugoimalla Sharpless-sentrifugissa, mitä seuraa jatkuva sentrifugointi 20 000 rpmrssä Sorvall-sentrifugilla. Molempien sentrifugointi-vaiheiden sakka otetaan talteen, pestään 50 mM Tris-Cl:lla (pH 7,4) ja lietetään uudelleen 500 ml:aan samaa puskuria. Lysotsyymiä lisätään siten, että loppupitoisuudeksi tulee 2 mg/ml, ja suspensioita inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. Tämän jälkeen lisätään Triton X-100:a siten, että loppupitoisuudeksi tulee 1%, suspensio jäähdytetään 4°C:een ja sentrifugoidaan 20 000 rpm:ssä 20 minuutin ajan Sorvali:in roottorissa SS34. Sakka otetaan talteen, pestään kahdesti 50 mM Tris-Cl:lla, lietetään uudelleen 500 mlraan 50 mM Tris-Cl:a (pH 7,4), 5 mM MgC^rta ja deoksiribonukleaasia lisätään siten, että loppupitoisuus on 20^,ug/ml. Sen jälkeen kun seosta on inkuboitu 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, sakka otetaan talteen, kuten edellä on esitetty, pestään kahdesti 500 mlrlla 20 mM Tris-Cl:a (pH 7,4), 100 mM NaCl:lla ja 10 mM EDTA:a, mitä seuraa pesu kahdesti 500 ml:lla tislattua vettä. Sakka otetaan talteen sentrifugoimalla ja se voidaan varastoida -20°C:ssa rajoittamattoman pituisen ajan. Tässä vaiheessa bGH on 80%rsen puhdasta natrium-dodekyylisulfaatti-geelielektroforeesin avulla pääteltynä. Saanto on noin 15 g bGH:ta.
bGH:n puhdistaminen 100 grammaa sakkaa lietetään 40 ml:aan tislattua vettä ja tehdään liukoiseksi titraamalla 0,5 m NaOH:lla, pH 11,8. Tämän jälkeen liuosta sonikoidaan 2 minuuttia ja se kirkastetaan sentrifugoimalla 20 000 rpmrssä Sorvallrin roottorissa SS34 20 minuutin ajan. Sitten liuos viedään Sepharose CL-6B-kolonniin (5 x 100 cm), joka on tasapainotettu 6,5 mM boraattipuskurilla, pH 11,8. Kolonnia eluoidaan nopeudella 100 ml/tunti ja 12 mlrn fraktioita kerätään. Ensimmäinen kolonnista tuleva piikki jätetään huomiotta. Seuraa-vat kaksi piikkiä erotetaan ja otetaan talteen. Ensimmäinen edustaa aktiivisuudeltaan alhaista kasautunutta bGHrta; toinen edustaa aktiivisuudeltaan korkeata bGHrta.
27 ;· ' R64 DEAE-Sephacel (25 g/100 g ekvivalentti-ppt) koloani tasapainotetaan 6,5 mM boraattipuskurilia, pH 9,0. Toisen bGH-piikin pH asetetaan arvoon 9,0 HCl:llä, jota ohjataan DEAE-Sephacel-kolonniin nopeudella 250 ml/h. Kolonni pestään 7,5 ml :11a 6,5 mM boraattipuskuria, pH 9,0, eluoidaan 6,5 mM:lla boraatti-puskurilla, pH 9,0, joka sisältää 75 mM NaCl. Fraktiot, joilla °E>280 on yli 0,3, otetaan talteen ja dialysoidaan H20:ta vastaan Milliporen Pellicon-dialyysilaitteessa, jonka jälkeen fraktiot lyofilisoidaan.
Esimerkki 5 pRec 2/3:n tuottaman bGH-analogin aktiivisuus 1. bGH-analogin ja luonnollisen bGH:n radioimmunologinen vertailu 100 ng/ml bGH-analogia sisältävä liuos valmistettiin fosfaatti-puskuroituun suolaliuokseen (l%:nen BSA). Tämä liuos laimennettiin sarjassa pitoisuuksiin 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 ja 0,78 ng/1. Näistä liuoksista kulloinkin kaksi 0,1 ml:n näytettä alistettiin RIA:aan kaksinkertaista vasta-ainemenetelmää käyttäen. Laimennoskäyrä oli verrattavissa luonnollisella bGHrlla saatuun laimennoskäyrään.
2. Radioreseptorin sitoutumiskoe
Radioreseptorin sitoutumiskoe suoritettiin jäniksen maksa kalvoilla, kuten tutkijat T. Tushima ja H.G. Freisen ovat esittäneet /T. Chin., Endocr. Metab. ( 1973) 3_7, 3347, käyttäen ^^I-hGH:ta merkkiaineena ja luonnomukaisia bGH-liuoksia kalibrointi-käyrien muodostamiseen. Kolmea rinnakkaisnäytettä inkuboitiin kaksi tuntia huoneen lämpötilassa 0,3 ml:ssa koepuskurissa (50 mM Tris, 15 mM CaCl^ ja 5 mg/ml härän seerumin albumiinia, pH 7,6). Putket sisälsivät ^^T-hGHita (20 000 sysäystä minuutissa valmistettaessa 30-60 ^uCi/^ug), 150-250 ^,ug maksakalvon proteiinia ja joko luonnollista bGH:ta (1-100 ng) tai bakteeriperäisen bGH:n uutteita). Tulos osoittaa, että bGH-analogin bGH-aktiivisuus on verrattavissa luonnollisen bGH:n aktiivisuuteen .
28 9 ' 9 :)4 3. Tibiakoe
Esimerkin 4 mukaisesti yhdistelmätekniikan avulla saaduista bakteerisoluista talteenotetun pRec 2/3-analogin bioaktiivisuus arvioitiin tibiakokeen avulla /Parlow, A.F., et ai., Endocrinology (1965 ) 1Ί_, 1126 ) .
Rotilta poistettiin aivolisäke 28-30 päivän ikäisinä, jonka jälkeen niitä pidettiin 10-14 vuorokautta ilman käsittelyä.
Härän aivolisäkkeestä tai yhdistelmä E.coliista peräisin olevaa härän kasvuhormonia liuotettiin 0,15 M NaCl + 0,01 M boraatti-liuokseen, pH 10,0. Rotat (4-7 kappaletta ryhmässä) saivat päivittäin ihonalaisesti injektoituna bGH-liuoksia (5-125 ,ug/vrk 3 ' 0,2 cm :ssa) 5 vuorokauden ajan ruokavalion ollessa tavanomainen (Purina Rat-Chow ja vettä vapaasti). Eläimet tapettiin 6. päivänä niiden eturaajojen polviluut otettiin ulos, leikattiin pituussuuntaan, kiinnitettiin asetonilla ja värjättiin 2%:lla AgNO^:11 a. Luulevyjen leveys mitattiin jaottelevaa linssi järjestelmää käyttäen (Nikon). Logaritmisten annos-reaktio-käyrien muodostamiseen käytettiin keskiarvoja (40 lukemaa rottaa kohden). Tulokset on esitetty kuvassa 15.
Esimerkki 6 bGH-analogit
Taulukossa I on esitetty muodostettujen plasmidien joukko, sekä näistä plasmideista valmistetut analogit.
Taulukko I
PLASMIDI_bGH-ANALOGIEN AMINOPÄÄ_
Rec 2/3 Met Asp Gin Phe2 ? pB 1 Met Asp Pro Met Gly Ala Phe o pM 4 Met Asp Pro Phe pM 1 Met Ala·*- Phe2 1 2 pM 2 Met Ala Phe pAL 401 Met^ pYL 301 Met Gly Ala1 Phe2 pAL 302 11 A.A + Ala1 Phe2 pHis 129 Met Thr Arg Phe2 29 9' 904
Taulukko I jatkuu PLASMIDI bGH-ANALOGIEN AMINOPÄÄ pAL 312 Met Gly Ala1 Phe2 pAL 322 Met Gly Ala1 Phe2 pAL 601R Met Gly Ala1 Phe2 p 18 Met Gly Ala1 Phe2 2 PBTG-800 Met Glu Phe pORF 2-12 Ala Gly Ala1 Phe2
Esimerkki 7 pRec 2/3 bGH-analogin vaikutus meijerilehmien maidonmuodostumi- seen_ bGH:n laktogeeninen vaikutus on esitetty laajasti tieteellisen kirjallisuuden raporteissa Bines, J. et ai, Brit J. Nutri. (1980) 43, 179 ja Peel, C. et ai, J. Nutr. (1981) 111, 1662. Bauman, D. et ai, J. Dairy Sei. Voi. Supp. 1, Abst 86 (1982). Viimeksimai-nitussa julkaisussa on esitetty, että rDNA bGH lisäsi maidon tuotantoa. pRec 2/3 bGH:n maidontuotantoon kohdistuvien vaikutuksien toteamiseksi ja luonnollisen bGH:n vaikutuksiin vertaamiseksi suoritettiin koe. Iältään 141-154 vuorokautta synnytyksestä olevat 18 Holstein-lehmää alistettiin satunnaisesti käsittelylle ja ehkäistiin maidontuotannon mukaisesti seuraavan suunnitelman mukaisesti.
Esikäsittely Käsittely Päivittäinen GH-injektie
Vertailu 5 vrk Suolaliuosta
Luonnollista bGHrta 5 vrk 25 mg/vrk 10 vrk:n ajan pRec 2/3 bGH 5 vrk 25 mg/vrk 10 vrkrn ajan bGH:t laitettiin liuokseen, jossa oli 0,1 M NaHCO^n veteen tehtyä puskuria (pH = 8,2), pitoisuuksina 1 mg/ml välittömästi ennen kunkin päivän injektioita. Lehmiin injektoitiin korviketta tai bGH-liuoksia päivittäin 10 vrk:n ajan ihonalaisesti niskan alueella olevaan kohtaan. 5 vrk kestävän esikäsittelyjakson aikana oi injektioita annettu.
Lehmät lypsettiin kahdesti päivässä noin klo 6:00 ja 17:00.
Maidon painot tallennettin Boumatic-järjestelmällä ja ne tallennettiin meijerin tietojärjestelmään.
30 S' : S 64
Keskimääräiset maidontuotantoarvot esikäsittelyjakson ja bGH-käsittelyjakson aikana on esitetty taulukossa II. Vertailu-lehmien tuotannon taso pysyi muuttumattomana, kun taas molemmissa bGH-ryhmissä maidon tuotanto kasvoi saman verran. Luonnollinen bGH aiheutti 11,9% kasvun maidontuotannon 10 vrk:n jakson aikana ja bGH-analogilla käsittely johti 10,2% kasvuun. Tietojen tilastollista merkittävyyttä ei analysoitu eläinten pienestä lukumäärästä johtuen, kuitenkin kasvamisen suuruusluokka on kirjallisuudessa esitettyjen arvojen kanssa samankaltainen.
Loppupäätelmänä oli,että pRec 2/3 bGH stimuloi maidontuotantoa meijerilehmissä luonnollisen bGH:n tavoin.
Taulukko II
Härän kasvuhormonin vaikutus maidontuotantoon Luonnollinen bGH verrattuna pRec 2/3 bGH:on.
Keskimääräinen maidontuotanto päivittäin , kg/vrk Käsittely Esikäsittely GH:n aikana %:nen kasvu es ikäsit- ryhmä No. 5 vrk 10 vrk telyyn verrattuna
Vertailu 6 26,98 26,00
Luonnollinen
bGH
25 mg/vrk 5 26,58 29,73 11,9
pRec 2/3 bGH
25 mg/vrk 6 25,29 28,76 10,2
Kuhunkin lehmään injektoitiin kerran päivässä 10 vrk:n ajan ihonalaisesti joko korviketta tai bGH-liuosta.
Il
Claims (10)
1. Menetelmä naudan kasvuhormonin, ihmisen kasvuhormonin tai sian kasvuhormonin polypeptidianalogin valmistamiseksi, jolla on oleellisesti samanlainen aminohappojärjestys ja biologinen aktiivisuus kuin luonnossa esiintyvällä polypep-tidillä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: (a) kasvatetaan sopivaa Escherichia coli -isäntäsolua, joka sisältää lämpölabiilin repressorin Cj käsittävän plasmidin, joka plasmidi muuttaa Escherichia coli -isännän kykeneväksi, isäntäsolun lämpötilaa nostettaessa lämpötilaan, jossa repressori inaktivoituu, saamaan aikaan polypeptidiä tai polypeptidianalogia koodaavan DNA:n ilmentymisen ja poly-peptidin tai polypeptidianalogin tuottamisen, plasmidin käsittäessä kaksisäikeisen DNA-molekyylin, joka käsittää järjestyksessä 5' ->3' : promoottorin ja operaattorin PjjOjj lambda-bakteriofagista; N-käyttökohdan Escherichia coli -isännän tuottaman antiter-minaattori N -proteiinin sitomiseksi; ribosomaalisen sitoutumiskohdan, joka kykenee muuttamaan polypeptidiä tai polypeptidianalogia koodaavan DNA:n mRNA-transkriptin kykeneväksi sitoutumaan ribosomeihin Escherichia coli -isäntäsolussa; ATG-aloituskodonin; ja polypeptidiä tai polypeptidianalogia koodaavan DNA:n samassa faasissa ATG-aloituskodonin kanssa; ja joka lisäksi sisältää DNA-jakson, jonka replikaatiokyky on peräisin bakteerin plasmidista pBR322, joka kykenee autonomisesti replikoitumaan Escherichia coli -isäntäsolussa ja geenin, johon liittyy lääkeresistenssi, joka tulee esiin plasmidin ollessa Escherichia coli -isäntäsolussa; ja 32 ; :: ,,: 4 (b) saatujen tuotettujen polypeptidien tai polypeptidianalo-gien talteenottamisen.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sopiva Escherichia coli -isäntä on kanta A1637, A1645, A2602 tai A1563.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että plasmidi on rengasmainen.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lääkeaine on ampisilliini, kloramfenikoli tai tetrasykliini .
5. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidianalogi on naudan kasvuhormonin analogi ja plasmidia merkitään pRec 2/3 ja se on talletettu ATCC-talle-tusnumerolla 39385.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidianalogi on naudan kasvuhormonin analogi ja plasmidia merkitään pROll ja se on talletettu ATCC-talletusnu-merolla 39390.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidianalogi on ihmisen kasvuhormonin analogi ja plasmidia merkitään pTV104(2) ja se on talletettu ATCC-talle-tusnumerolla 39384.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Escherichia coli -isäntäsolun kasvatus tapahtuu sopivassa väliaineessa 42°C:ssa noin 15 min ja sen jälkeen 38-39°C:ssa noin 75 min.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sopiva väliaine on lakta-albumiinihydrolysaatti, johon on lisätty glukoosia tai aivo-sydän-nestettä. 33 1 ·...' - 6 4
10. Menetelmä naudan maidon- tai lihantuoton stimuloimiseksi, joka menetelmä käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tuotetun naudan kasvuhormonianalogin tehokkaan määrän annostelemisen naudalle.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51418883A | 1983-07-15 | 1983-07-15 | |
| US51418883 | 1983-07-15 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI842842A0 FI842842A0 (fi) | 1984-07-13 |
| FI842842A FI842842A (fi) | 1985-01-16 |
| FI90564B true FI90564B (fi) | 1993-11-15 |
| FI90564C FI90564C (fi) | 1994-02-25 |
Family
ID=24046152
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI842842A FI90564C (fi) | 1983-07-15 | 1984-07-13 | Menetelmä naudan, sian tai ihmisen kasvuhormonin polypeptidianalogin valmistamiseksi |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US4871835A (fi) |
| EP (3) | EP0319049B1 (fi) |
| JP (3) | JPH0687780B2 (fi) |
| AT (2) | ATE66959T1 (fi) |
| AU (2) | AU577298B2 (fi) |
| BG (2) | BG49718A3 (fi) |
| BR (1) | BR8403523A (fi) |
| CA (1) | CA1254527A (fi) |
| CZ (1) | CZ282867B6 (fi) |
| DD (2) | DD240217A5 (fi) |
| DE (2) | DE3486425T2 (fi) |
| DK (1) | DK347184A (fi) |
| ES (2) | ES8602947A1 (fi) |
| FI (1) | FI90564C (fi) |
| HK (1) | HK128095A (fi) |
| HU (1) | HU209878B (fi) |
| IE (2) | IE64174B1 (fi) |
| IL (8) | IL72396A (fi) |
| NZ (2) | NZ227962A (fi) |
| RO (1) | RO91332B (fi) |
| SK (1) | SK278576B6 (fi) |
| ZA (1) | ZA845345B (fi) |
Families Citing this family (67)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5340926A (en) * | 1983-03-25 | 1994-08-23 | Celltech, Limited | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate |
| US5236828A (en) * | 1983-07-06 | 1993-08-17 | Papas Takis S | Plasmid pJL6 |
| US5670371A (en) * | 1983-07-15 | 1997-09-23 | Bio-Technology General Corp. | Bacterial expression of superoxide dismutase |
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| US5332805A (en) * | 1984-02-03 | 1994-07-26 | Celltech Limited | Process for the recovery of recombinantly produced chymosin from insoluble aggregate |
| EP0159123B1 (en) * | 1984-03-06 | 1992-01-15 | Eli Lilly And Company | Vectors for expressing bovine growth hormone derivatives |
| US6030611A (en) * | 1984-08-27 | 2000-02-29 | Bio-Technology General Corp. | Therapeutic SOD compositions and uses thereof |
| US5162217A (en) * | 1984-08-27 | 1992-11-10 | Bio-Technology General Corp. | Plasmids for expression of human superoxide dismutase (SOD) analogs containing lambda PL promoter with engineered restriction site for substituting ribosomal binding sites and methods of use thereof |
| CA1340597C (en) * | 1984-08-27 | 1999-06-22 | Haim Aviv | Expression vectors containing pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods |
| US5143836A (en) * | 1984-08-27 | 1992-09-01 | Bio-Technology General Corp. | Plasmids for expression of human superoxide dismutase (SOD) analogs containing lambda pl promoter with engineered restriction site for substituting ribosomal binding sites and methods of use thereof |
| US5759816A (en) * | 1984-08-27 | 1998-06-02 | Bio-Technology General Corp. | Expression vectors containing λPL promoter and T1 T2 rRNA termination sequence plasmids containing the vectors hosts containing the plasmids and related methods |
| US5112744A (en) * | 1984-08-27 | 1992-05-12 | Bio-Technology General Corp. | Plasmids for the production of human Cu-Zn superoxide dismutase, bacterial hosts containing the plasmids and methods for production and recovery of such superoxide dismutase |
| CA1267615A (en) * | 1984-08-27 | 1990-04-10 | Dan Hadary | Method for recovering purified growth hormones from genetically engineered microorganisms |
| US4743546A (en) * | 1985-02-13 | 1988-05-10 | Biotechnica International, Inc. | Controlled gene excision |
| US4861868A (en) * | 1985-02-22 | 1989-08-29 | Monsanto Company | Production of proteins in procaryotes |
| FR2579223B1 (fr) * | 1985-03-25 | 1988-12-09 | Genetica | Procede de preparation microbiologique de la serum-albumine humaine |
| EP0229110B1 (en) | 1985-06-26 | 1992-05-20 | The Upjohn Company | Solubilization and oxidation of somatotropin from transformed microorganisms |
| US4788144A (en) * | 1985-06-28 | 1988-11-29 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermentation process for the high level production of swine growth |
| US4762784A (en) * | 1985-07-15 | 1988-08-09 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermemtation process for the high level production of bovine growth hormone |
| US4874703A (en) * | 1985-08-26 | 1989-10-17 | Eli Lilly And Company | Expression vectors for use in E. coli |
| US5631227A (en) * | 1985-09-18 | 1997-05-20 | The Upjohn Company | Somatotropin analogs |
| JPS63500941A (ja) * | 1985-09-18 | 1988-04-07 | ジ・アップジョン・カンパニ− | 選択的脱アミノ化による哺乳動物ソマトトロピンの生物学的活性の増強 |
| JPH07110232B2 (ja) * | 1985-10-14 | 1995-11-29 | 株式会社日立製作所 | 遺伝子組換え大腸菌の遺伝子生産物を採取する方法および装置 |
| IE59498B1 (en) * | 1985-11-22 | 1994-03-09 | Bio Technology General Corp | Human manganese superoxide dismutase analog, plasmid for its expression and method of recovering it in enzymatically active form |
| US6610520B1 (en) * | 1985-11-22 | 2003-08-26 | Bio-Technology General Corp. | Gene encoding human manganese superoxide dismutase and recombinant polypeptide encoded thereby |
| ES2019874B3 (es) * | 1986-10-08 | 1991-07-16 | Upjohn Co | Bioactividad mejorada de somatotropina de mamiferos mediante desamidacion selectiva. |
| US5089406A (en) * | 1987-01-07 | 1992-02-18 | Allied-Signal Inc. | Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences |
| GB8701848D0 (en) * | 1987-01-28 | 1987-03-04 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US5240837A (en) * | 1987-02-19 | 1993-08-31 | The Upjohn Company | CDNAS encoding somatotropin, expression vectors and hosts |
| JP2580303B2 (ja) * | 1987-02-19 | 1997-02-12 | ジ・アップジョン・カンパニー | 異種蛋白をコ−ド付けするｃＤＮＡ類、発現ベクタ−類および宿主類 |
| US5104796A (en) * | 1987-04-06 | 1992-04-14 | International Minerals & Chemical Corp. | High titer production of human somatomedin c |
| US5047504A (en) * | 1987-04-28 | 1991-09-10 | Amgen, Inc. | Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| US4966841A (en) * | 1987-05-22 | 1990-10-30 | The Board Of Regents Of The University Of Washington | Enhanced vector production and expression of recombinant DNA products |
| US5030563A (en) * | 1987-07-07 | 1991-07-09 | Genetics Institute, Inc. | Bacterial hypersecretion using mutant repressor sequence |
| US5079345A (en) * | 1988-08-19 | 1992-01-07 | Eli Lilly And Company | Proteins having growth hormone anabolic properties with reduced effect on carbohydrate metabolism |
| EP0365858B1 (en) * | 1988-10-26 | 1994-11-30 | American Cyanamid Company | Process for reducing the aggregate content of growth hormone-like materials |
| US6780613B1 (en) * | 1988-10-28 | 2004-08-24 | Genentech, Inc. | Growth hormone variants |
| WO1990004788A1 (en) | 1988-10-28 | 1990-05-03 | Genentech, Inc. | Method for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides and hormone variants |
| JPH04503154A (ja) * | 1988-11-07 | 1992-06-11 | ルニベルシー・ド・ルタ・ア・リージュ | 変型ヒト成長ホルモン |
| US4975529A (en) * | 1989-08-18 | 1990-12-04 | Monsanto Company | Method of folding somatotropins |
| US5958879A (en) * | 1989-10-12 | 1999-09-28 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Growth hormone receptor antagonists and methods of reducing growth hormone activity in a mammal |
| US6583115B1 (en) | 1989-10-12 | 2003-06-24 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Methods for treating acromegaly and giantism with growth hormone antagonists |
| IE912345A1 (en) * | 1990-08-03 | 1992-02-12 | Pharmacia Ab | Treatment of human lactation failure |
| US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| US5844097A (en) * | 1990-11-30 | 1998-12-01 | Monoclonetics International, Inc. | Methods for the diagnosis of peripheral nerve damage |
| DK0559795T3 (da) * | 1990-11-30 | 1996-01-29 | Monoclonetics Int | Fremgangsmåder til diagnosticering af kroniske smerter i lænderegionen og halshvrivelsøjlen |
| US5231178A (en) * | 1991-01-16 | 1993-07-27 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Method for the purification of intact, correctly-folded insulin-like growth factor-1 |
| JP3417558B2 (ja) * | 1991-05-10 | 2003-06-16 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | 配位子作用薬および拮抗薬の選択 |
| US5395761A (en) * | 1991-11-27 | 1995-03-07 | Eli Lilly And Company | Plasmid pHKY334, an expression vector for EK-BGH and host cells transformed therewith |
| ZA94169B (en) * | 1993-01-26 | 1994-09-07 | Lilly Co Eli | Non-denaturing potency assay for bovine somatotropin |
| AU693478B2 (en) * | 1994-11-10 | 1998-07-02 | Metabolic Pharmaceuticals Limited | Treatment of obesity |
| US20020142965A1 (en) * | 1994-11-15 | 2002-10-03 | Metabolic Pharmaceuticals, Ltd. | Treatment of obesity |
| US6335319B1 (en) | 1994-11-15 | 2002-01-01 | Metabolic Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of obesity |
| WO1996040203A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Ohio University/Edison Biotechnology Institute | Methods of treatment using growth hormone antagonists |
| KR970006498A (ko) * | 1995-07-31 | 1997-02-21 | 유충식 | 활성형 인성장호르몬의 정제 방법 |
| PT1568772E (pt) * | 1995-09-21 | 2010-04-14 | Genentech Inc | Variantes da hormona do crescimento humana |
| US5849293A (en) * | 1996-01-11 | 1998-12-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Use of human transferrin in controlling insulin levels |
| AU723494B2 (en) * | 1996-02-13 | 2000-08-31 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Mutant human growth hormones and their uses |
| EP1012189B1 (en) | 1997-09-08 | 2007-10-31 | Metabolic Pharmaceuticals Ltd. | Treatment of obesity |
| DE19951765A1 (de) * | 1999-10-27 | 2001-05-03 | Thomas Schweder | Wirts-Vektor-Systeme zur Überproduktion von thermolabilen Enzymen psychrophiler Organismen |
| KR100400638B1 (ko) * | 2000-12-06 | 2003-10-08 | 주식회사 엘지생명과학 | 재조합 인간 성장호르몬 유사체의 분리방법 |
| IL157378A0 (en) | 2001-03-09 | 2004-02-19 | Genentech Inc | Process for production of polypeptides |
| AU2003263552A1 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-29 | Nautilus Biotech | Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules |
| US7998930B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-08-16 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Modified growth hormones |
| EP2386571B1 (en) | 2005-04-08 | 2016-06-01 | ratiopharm GmbH | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
| US20080260820A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Gilles Borrelly | Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides |
| EP2446898A1 (en) | 2010-09-30 | 2012-05-02 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients |
Family Cites Families (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR68404B (fi) * | 1979-06-01 | 1981-12-29 | Univ California | |
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| US4426323A (en) * | 1980-01-10 | 1984-01-17 | Ionics, Incorporated | Selected recovery of proteins from fermentation broths |
| US4443539A (en) * | 1980-02-05 | 1984-04-17 | The Upjohn Company | Process for preparing bovine growth hormone |
| IL59690A (en) * | 1980-03-24 | 1983-11-30 | Yeda Res & Dev | Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it |
| BR8101972A (pt) * | 1980-06-06 | 1982-08-17 | Biogen Nv | Vetor, processo para sua producao, processo para produzir uma molecula recombinante de dna, e processo para produzir um polipeptideo |
| US4352443A (en) * | 1980-06-24 | 1982-10-05 | U.S. Cap & Closure, Inc. | Dispenser having a trigger-bulb pump |
| JPS6045848B2 (ja) * | 1980-07-31 | 1985-10-12 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒト成長ホルモンの製造方法 |
| IE52755B1 (en) * | 1980-08-26 | 1988-02-17 | Univ California | Bovine pre-growth and growth hormone |
| DE3231658A1 (fi) | 1981-01-21 | 1983-11-17 | ||
| EP0061250A3 (en) * | 1981-03-23 | 1983-09-28 | Biogen N.V. | Improved process for recovering products produced by host organisms |
| NZ201918A (en) * | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
| US4436815A (en) * | 1981-11-27 | 1984-03-13 | Eli Lilly And Company | Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cells |
| US4665160A (en) * | 1982-03-22 | 1987-05-12 | Genentech, Inc. | Novel human growth hormone like protein HGH-V encoded in the human genome |
| GB2129810B (en) * | 1982-06-07 | 1985-09-18 | Celltech Ltd | A process for the preparation of chymosin |
| EP0103395A3 (en) * | 1982-08-17 | 1985-05-22 | Biogen N.V. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
| EP0111814A3 (en) * | 1982-12-16 | 1985-08-14 | Mgi Pharma, Inc. | The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone |
| US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| CA1224168A (en) * | 1982-12-23 | 1987-07-14 | Dean H. Hamer | Human growth hormone produced by recombinant dna in mouse cells |
| US4728609A (en) * | 1983-01-10 | 1988-03-01 | Hoffmann-La-Roche Inc. | Recombinant growth hormone releasing factor |
| JPS59145876A (ja) * | 1983-02-09 | 1984-08-21 | 株式会社リコー | 開閉体用のヒンジ |
| ATE53220T1 (de) * | 1983-03-07 | 1990-06-15 | Hoffmann La Roche | Polypeptide. |
| JPH06102034B2 (ja) * | 1983-03-25 | 1994-12-14 | セルテク リミテツド | タンパク質の生産方法 |
| US4755465A (en) * | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| AU587176B2 (en) * | 1984-02-14 | 1989-08-10 | Mycogen Plant Science, Inc. | Transfer vector |
| US4767709A (en) * | 1984-06-28 | 1988-08-30 | The Johns Hopkins University | Growth-related hormones |
| DE3426532A1 (de) * | 1984-07-18 | 1986-01-30 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig | Verwendung einer dna-sequenz zur expression sowie dna-struktur und expressionsvektor mit der dna-sequenz |
| CA1340597C (en) * | 1984-08-27 | 1999-06-22 | Haim Aviv | Expression vectors containing pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods |
| US4612367A (en) * | 1985-04-08 | 1986-09-16 | Eli Lilly And Company | Process for purifying growth hormone-like materials |
| US4677196A (en) * | 1985-09-06 | 1987-06-30 | International Minerals & Chemical Corp. | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies |
| US4656255A (en) * | 1985-09-09 | 1987-04-07 | International Minerals & Chemical Corp. | Protein recovery |
-
1984
- 1984-07-02 BG BG80683/87A patent/BG49718A3/xx unknown
- 1984-07-03 EP EP88121246A patent/EP0319049B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-03 DE DE3486425T patent/DE3486425T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-03 AT AT84107717T patent/ATE66959T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-03 AT AT88121246T patent/ATE136934T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-03 DE DE8484107717T patent/DE3485003D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-03 EP EP95114069A patent/EP0691406A1/en not_active Withdrawn
- 1984-07-03 EP EP84107717A patent/EP0131843B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-05 SK SK5246-84A patent/SK278576B6/sk unknown
- 1984-07-05 CZ CS845246A patent/CZ282867B6/cs unknown
- 1984-07-06 AU AU30345/84A patent/AU577298B2/en not_active Expired
- 1984-07-11 ZA ZA845345A patent/ZA845345B/xx unknown
- 1984-07-12 IL IL72396A patent/IL72396A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-07-12 BG BG66214A patent/BG49721A3/xx unknown
- 1984-07-12 IL IL91826A patent/IL91826A/xx unknown
- 1984-07-12 IL IL91828A patent/IL91828A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-07-13 JP JP59145876A patent/JPH0687780B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-13 CA CA000458833A patent/CA1254527A/en not_active Expired
- 1984-07-13 DK DK347184A patent/DK347184A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-07-13 RO RO115224A patent/RO91332B/ro unknown
- 1984-07-13 HU HU842749A patent/HU209878B/hu unknown
- 1984-07-13 NZ NZ227962A patent/NZ227962A/xx unknown
- 1984-07-13 FI FI842842A patent/FI90564C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-07-13 BR BR8403523A patent/BR8403523A/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-07-13 ES ES534321A patent/ES8602947A1/es not_active Expired
- 1984-07-13 NZ NZ208897A patent/NZ208897A/xx unknown
- 1984-07-13 IE IE181884A patent/IE64174B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-07-16 DD DD84283853A patent/DD240217A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-16 DD DD84265320A patent/DD229427A5/de not_active IP Right Cessation
-
1985
- 1985-01-14 US US06/691,230 patent/US4871835A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-07-03 US US06/752,441 patent/US4831120A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-07-08 ES ES544976A patent/ES8604252A1/es not_active Expired
-
1988
- 1988-07-22 AU AU19777/88A patent/AU615663B2/en not_active Expired
-
1989
- 1989-03-07 US US07/320,320 patent/US4997916A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-28 IL IL91826A patent/IL91826A0/xx unknown
- 1989-09-28 IL IL91828A patent/IL91828A0/xx unknown
-
1992
- 1992-04-17 IL IL101629A patent/IL101629A0/xx unknown
- 1992-07-29 IE IE922469A patent/IE922469A1/en not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-12-01 JP JP5301898A patent/JP2568376B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-21 IL IL10810893A patent/IL108108A0/xx unknown
-
1994
- 1994-12-29 IL IL11217894A patent/IL112178A0/xx unknown
-
1995
- 1995-08-10 HK HK128095A patent/HK128095A/xx not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-07-10 JP JP18085896A patent/JP3146161B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI90564B (fi) | Menetelmä naudan, sian tai ihmisen kasvuhormonin polypeptidianalogin valmistamiseksi | |
| EP0518587B1 (en) | A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production | |
| ES2375330T3 (es) | Expresión directa de péptidos en medios de cultivo. | |
| JPS63251095A (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
| EP0434605B1 (en) | Novel process for the production of unfused protein in E. coli | |
| CA1340464C (en) | Method of producing superoxide dismutase in a bacterial cell | |
| EP0510018A1 (en) | Lipoprotein signal peptide fused to antigenic polypeptides | |
| US5637495A (en) | Plasmids for production of human growth hormone or polypeptide analog thereof, hosts containing the plasmids, products manufactured thereby, and related methods | |
| US5256546A (en) | Bacterial expression of porcine growth hormone | |
| US5527691A (en) | Expression vectors containing lambdapl promoter and T1 T2 rRNA termination sequence, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods | |
| US5198361A (en) | Plasmids for production of met-asp-gln bovine growth hormone, hosts containing the plasmids, products manufactured thereby and related methods | |
| US5670371A (en) | Bacterial expression of superoxide dismutase | |
| US5112744A (en) | Plasmids for the production of human Cu-Zn superoxide dismutase, bacterial hosts containing the plasmids and methods for production and recovery of such superoxide dismutase | |
| US5151364A (en) | Expression vectors containing lambdapl promoter, T1 T2 RRNA termination sequence, and origin of replication derived from a constitutive high copy number plasmid, and hosts containing the plasmids | |
| US5081020A (en) | Expression vectors containing λPL promoter, T1 T2 rRNA termination sequence and origin of replication derived from a constitutive high copy number plasmid hosts and related methods | |
| US5059529A (en) | Stabilized expression vectors containing λPL promoter and the gene for the cI434 repressor, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods | |
| US5759816A (en) | Expression vectors containing λPL promoter and T1 T2 rRNA termination sequence plasmids containing the vectors hosts containing the plasmids and related methods | |
| EP0443790A1 (en) | Growth hormone-like glycoproteins | |
| Glover et al. | Expression of cloned DNAs in E. coli plasmids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MA | Patent expired |
Owner name: BIO-TECHNOLOGY GENERAL CORPORATION |