JP3417558B2 - 配位子作用薬および拮抗薬の選択 - Google Patents

配位子作用薬および拮抗薬の選択

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明はポリペプチド配位子と受容体の相互作用の分
野に関する。具体的には、本発明はポリペプチド配位子
に関する拮抗薬と作用薬を選別およびスクリーニングす
る分野に関する。
背景技術の説明 配位子（リガンド）が誘発する受容体のオリゴマー化
は、細胞外配位子結合ドメインを含有するチロシンキナ
ーゼ受容体の大きなファミリーにとって信号変換の作用
機序であると提唱されてきた（概略についてはYarden,
Y.ら,Ann.Rev.Biochem 57:443−478（1988）;Ullrich,
A.ら,Cell 61:203−212（1990）を参照のこと）。これ
らのモデルでは１受容体（Ｒ）につき１ホルモン分子
（またはサブユニット）（Ｈ）の結合がH2R2複合体の形
成を誘発すると考えられている。例えば架橋性および非
解離性の電気泳動的研究は、表皮成長因子（EGF）がEGF
受容体の二量化を促進し、受容体の自己リン酸化と細胞
内チロシンキナーゼの活性化がそれに続くことを示唆し
ている（Shector,Y.ら,Nature 278:835−838（1979）;S
chreiber,A.B.ら,J.Biol.Chem.,258:846−853（1983）;
Yarden,Y.ら,Biochemistry,26:1434−1442（1987）;Yar
den,Y.ら,Biochemistry 26:1443−1451（1987））。イ
ンスリン受容体（Kahn,C.R.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
75:4209−4213（1978）;Kubar J.ら,Biochemistry 28:
1086−1093（1989）;Heffetz,D.ら,J.Biol.Chem.261:88
9−894（1986））、血小板由来成長因子（PDGF）受容体
（Heldin,C.H.ら,J.Biol.Chem.264:8905−8912（198
9）;Hammacher,A.ら,EMBO J.8:2489−2495（1989）;Sei
fert,R.A.ら,J.Biol.Chem.264:8771−8778（1989））お
よびインスリン様成長因子（IGF−１）受容体（Ikari,
N.ら,Mol.Endocrinol.2:831−837）を含む他のチロシン
キナーゼ受容体の研究は、受容体のオリゴマー化がその
生物学的効果と強く共役していることを示している。他
のグループは最近、その細胞外結合ドメインと錯化した
ポリペプチドホルモンを結晶化させている（Lambert,G.
ら,J.Biol.Chem.264:12730−12736（1989）;Gunther,N.
ら,J.Biol.Chem.265:22082−22085（1990））。しか
し、これらの受容体または他の受容体において配位子が
誘発する変化に関する構造上の摂動と必要条件のより詳
細な分析は、これらの膜結合系の複雑さと、高度に精製
された天然の受容体または組換え受容体の量が適当でな
いという理由によって妨害されてきた。
精製された受容体が利用可能な場合、その検定法はし
ばしばホルモン−受容体複合体の性質が認識されないほ
どに組織化されていた。米国特許第5057417号では、組
換えhGH受容体の細胞外ドメイン（hGHbp）またはhGH結
合タンパク質への結合に関する非標識hGHと125I−hGHの
競争を用いてhGH結合検定を行い、形成した複合体を沈
殿させるために、得られた複合体をhGHbpに対する抗体
＋ポリエチレングリコールで処理している。これらの免
疫沈殿検定法はhGHがhGHbpと1:1の複合体を形成するこ
とを示唆した。この免疫沈殿検定法は結合した125I−hG
Hの量を正しく検出したが、誤って1:1のモル比を示し
た。
hGHの受容体と結合タンパク質に関する様々な固相検
定法が使用されてきた。そのような検定法は結合したhG
Hの量を検出したが、受容体に対するhGHのモル比を検出
するものではなかった。固相またはhGH受容体を含有す
る膜画分を用いる結合検定法は、活性な受容体の総量お
よび／または結合した内因性hGHの量を検出することが
できなかったので、受容体に対するhGHのモル比を決定
するには適していなかった。EGFに関するものなど、先
の研究に基づいて、hGH−受容体複合体はH2R2四量体で
あろうと推測されていた。
ヒト肝臓からクローニングされたhGH受容体（Leung,
D.W.ら,Nature,330:537（1987））は１つの細胞外ドメ
イン（〜28kD）、貫膜セグメントおよび細胞内ドメイン
（〜30kD）を有し、既知のチロシンキナーゼまたは他の
タンパク質のいずれとも相同でない。それにもかかわら
ずhGH受容体の細胞外部分はプロラクチン受容体（Bouti
n,J.M.ら,Cell 69（1988））の細胞外ドメインに構造的
に関連しており、概していえば少なくとも８つの他のサ
イトカインおよび関連受容体に構造的に関連している。
大腸菌内で発現されるhGHbpは１リットルにつき数十ミ
リグラム分泌されている（Fuh,G.ら,J.Biol.Chem.265:3
111−3115（1990））。高度に精製されたhGHbpは血清中
に認められる天然のhGHbpと比較して、hGHについて同じ
特異性と高い親和性を保持している（KD〜0.4nM）。
hGHは、胎盤性ラクトゲン、プロラクチンおよび成長
ホルモンの他の遺伝的変種および種変種を含む相同なホ
ルモンファミリーの一構成要素である（Nicoll,C.S.ら,
Endocrine Reviews,7:169（1986））。hGHは広範な種特
異性を示し、クローン化された体因性受容体（Leung,D.
W.ら（1987）Nature 330:537）またはプロラクチン受容
体（Boutin,J.M.ら,Cell,53:69）のいずれかに結合する
点で、これらの中では珍しいものである。クローン化さ
れたhGHの遺伝子は大腸菌中で分泌型として発現されて
おり（Chang,C.N.ら,Gene 55:189（1987））、そのDNA
とアミノ酸配列は既に報告されている（Goeddelら,Natu
re,281:544（1979）;Grayら,Gene 39:247（1985））。h
GHの三次元構造はこれまで利用できなかった。しかしブ
タ成長ホルモン（pGH）に関する三次元折り畳みパター
ンが中ぐらいの解像度と精度で報告されている（Abdel
−Meguid,S.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:6434（19
87））。相同体走査（homolog−scanning）突然変異導
入法（Cunninghamら,Science 243:1330,1989）によって
hGH受容体および抗体結合部位が同定されている。Ｎ−
末端アミノ酸が欠失または変化しているGHは知られてい
る。Gertlerら,Endocrinology 118:720（1986）、Ashke
naziら,Endocrinology 121:414（1987）、Binder,Mol.E
ndo.,7:1060−1068（1990）およびWO90/05185を参照の
こと。hGHの拮抗薬変種はChenら,Mol.Endo.,5（10）:18
45（1991）とその参考書目に記載の文献およびWO91/058
53に記述されている。hGH変種はCunninghamら,Science,
244:1081（1989）およびScience 243:1330−1336（198
9）に開示されている。
多くのポリペプチド配位子のそれらの受容体との相互
作用の様式は未だ不明のままであるから、所望の特性を
達成するべくそれらの配位子のアミノ酸配列変種を工作
することは困難であった。基本的には、おそらくある場
合には同様に作用する配位子または動物相同体の相同性
分析や、例えば断片（例：トリプシン消化断片）の分析
からもたらされる指針の下に、無作為に変異を導入して
きた。次いで、所望の活性（例：作用薬または拮抗薬活
性）について候補物質をスクリーニングしてきた。これ
らのスクリーニング法は単調で退屈であり、かつ、費用
のかかるものであった（例：形質転換動物の使用（WO91
/05853））。候補物質の選択の効率の改善する方法が求
められている。具体的には、拮抗薬または作用薬である
と思われる候補物質に集中させる方法が求められてい
る。拮抗薬は天然の配位子の生物学的活性を抑制、阻害
または妨害する物質であり、一方、作用薬は活性自体は
天然の配位子より強い活性を示すが、それ自身は生物学
的活性をもたない。
したがって本発明の目的は作用性または拮抗性ポリペ
プチド配位子を効率よく選別するための改善された方法
を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、その受容体と逐次的に1:
2の複合体を形成する配位子を検出する方法を提供する
ことである。
本発明のもう１つの目的は上述の1:2配位子−受容体
複合体の形成を妨害または促進する能力について候補物
質を検定することである。
さらなる目的は作用薬または拮抗薬として作用するこ
とができるポリペプチド配位子のアミノ酸配列変種を提
供することである。
本発明のその他の目的、特性および特長は下記の説明
と添付の請求の範囲を考慮すればより明白になるであろ
う。
発明の要約 我々は予想外にも、成長ホルモンとそれらが属する立
体配座的な配位子の一群がそれらの受容体と1:2の複合
体を形成することができ、その場合、第１の配位子部位
（部位１）が１つの受容体に結合し、次いで第２の配位
子部位（部位２）がもう１分子の受容体に結合すること
によって1:2の複合体を与えることを発見した。本発明
を適用することができる配位子は、両末端が非螺旋アミ
ノ酸配列で終わっていて、かつ、非螺旋アミノ酸配列に
よって分断されている４つの両親媒性逆平行アルファ螺
旋ドメインを含有する単量体配位子である。以下に詳述
するように、成長ホルモン、プロラクチンおよび胎盤性
ラクトゲンを用いた我々の研究への類比によって、部位
１および／または２にアミノ酸配列変異を導入すること
によって上記配位子の作用性または拮抗性アミノ酸配列
変種を効率よく設計することが可能になった。
配位子作用薬または拮抗薬である物質についてスクリ
ーニングするために、２部位複合体形成検定法を用い
る。このような物質は基本的には制約がなく、配位子の
アミノ酸配列変種および結合タンパク質または受容体変
種と共に、非タンパク質性有機化合物が含まれる。
このようなアルファ螺旋配位子の新しいアミノ酸配列
変種についても記述する。具体的には、部位２における
受容体への配位子の親和性を減少もしくは排除するアミ
ノ酸配列突然変異を部位２に含む、ポリペプチド配位子
に関する拮抗薬を提供する。理想的には、該配位子拮抗
薬類縁体は部位２における受容体への親和性か低いか、
もしくはそのような親和性を有さず、部位１における受
容体への親和性が増大しているであろう。
また、一部位または両部位の配位子親和性を増大させ
る突然変異を部位１および／または部位２に有する作用
薬配位子アミノ酸配列変種をも本明細書に開示する。好
ましい態様として、二量体複合体中の配位子の平均滞在
時間が、所望の細胞応答を達成するためにその複合体が
必要とする時間と同じかそれ以上であるように、両部位
の速度定数を選択する。配位子のポリペプチド作用薬変
種は、（ａ）配位子に突然変異を導入して作用薬候補を
作成し、（ｂ）その候補物質が第１の配位子部位を介し
て受容体に結合する親和性を決定し、（ｃ）その候補物
質が第２の配位子部位を介して受容体に結合する親和性
を決定し、（ｄ）その候補物質が第１および第２部位の
一方または両方で天然の配位子よりも高い親和性で結合
する場合にそれを作用薬として選択することからなる方
法によって同定される。
本発明によれば、ポリペプチド配位子の作用薬または
拮抗薬候補を検出する方法であって、該配位子が通常逐
次的に、まず第１の配位子部位を介して受容体ポリペプ
チドに結合し、次いで第１の部位とは異なる第２の配位
子部位を介してもう１つの受容体ポリペプチドに結合
し、配位子の第２の受容体結合部位における受容体に関
するポリペプチド配位子の親和性に対する該候補の効果
を決定することからなる方法が提供される。部位１の相
互作用は後述するMab5などの部位２遮断抗体を用いる免
疫沈殿によって決定される。あるいは、実質的に受容体
と1:1の複合体のみを形成する野生型配位子の量を決定
し、次いで受容体に関して上記の比率で天然の配位子と
競合するという候補物質の能力を決定する。３要素複合
体を形成するという候補物質の能力を追跡することによ
って部位２の相互作用を検定する。
候補物質が配位子のポリペプチド類縁体である場合に
は、部位２におけるその類縁体の結合の欠如が拮抗薬活
性と正の相関を示す。受容体部位２に天然の配位子より
高い親和性で結合する能力は作用薬活性と相関する。拮
抗薬活性と作用薬活性は共に、部位１において天然の配
位子より高い親和性で結合するという候補物質の能力と
正に相関する。部位１および／または部位２に対する天
然の配位子の結合を促進または抑制するというそれらの
能力について、小分子または他の非類縁体候補物質を検
定する。拮抗薬は、部位２および／または部位１（好ま
しくは部位２）における天然の配位子−受容体結合を妨
害するというそれらの能力についてスクリーニングす
る。これは、例えばその配位子の部位２損傷変種を陽性
対照として用いて、部位１における配位子受容体結合を
抑制しないが、部位２結合を妨害する拮抗薬の同定を可
能にする。
候補物質の効果は、天然のポリペプチド配位子の存在
下で、もしくは天然のポリペプチド配位子の活性と比較
して、測定することができる。第１の選択肢では、野生
型配位子による受容体相互作用に対する候補物質の効果
を測定する。第２の選択肢では、野生型配位子の活性を
陽性対照として使用し、候補物質（通常は配位子のアミ
ノ酸配列変種）の受容体結合特性を野生型配位子の非存
在下で測定する。しかし一般的には、野生型配位子の存
在下における競争型検定法として、作用薬または拮抗薬
候補に関する検定を行うことが最善である。
我々は、GH受容体を結合することができる選択された
抗体がGHの拮抗薬または作用薬として作用することをも
決定した。したがって成長ホルモンの欠損または過剰の
治療におけるGHの拮抗性または作用性のための方法を提
供する。
図面の簡単な説明 図1aおよび図1b.図1a:hGHとhGHbpの間の複合体の結
晶。10mM Tris（pH8.0）および100mM NaClで平衡化した
セファデックスG75−100サイズ排除カラムでhGH/hGHbp
複合体を精製することによって、この複合体を調製し
た。この複合体を含有する高分子量ピークを遊離のhGH
から分離し、貯蔵し、濃縮した。これらの成分を1ml/分
の流速での直線的なアセトニトリル勾配で無勾配的（図
1b）に溶出させた。矢印の時点で勾配を開始し、これを
破線で示す。214nmでの吸光度を実線で表す。
図2.4:1、3:1、2:1、1:1、0.5:1に対応するさまざま
な比率のhGHbpとhGHのゲル濾過クロマトグラフィー。各
混合物中のhGhbpとhGH（hGHをそれぞれ20μＭおよび40
μＭとした1:1および0.5:1の比率を例外として10μＭに
固定した）の濃度は280nmの吸光度に基づく。100μｌの
タンパク質試料をセファロース12FPLCカラム（ファルマ
シア）に適用し、溶出させた。ピークを280nmでの吸光
度について監視した。
図3.様々な抗hGHbpモノクローナル抗体によって複合
体を沈殿させた場合のhGHbpに対するhGHの結合に関する
スキャッチャード分析。
図4.hGHbpと、hGHbpに結合するように工作したヒトプ
ロラクチン（パネルＡ）またはヒト胎盤性ラクトゲン
（パネルＢ）の変種もしくはhGH（パネルＣ）との2:1比
のゲル濾過クロマトグラフィー。ゲル濾過クロマトグラ
フィーによって試料を分析した。
図5.hGHbpによるhGHの滴定熱量測定。hGHbp（10mM Tr
is（pH8.0）中15μＭ濃度）を1.37ml滴定セル（MC2滴定
熱量計,Microcal Incorporated,マサチューセッツ州ノ
ーサンプトン）に入れ、25℃で平衡化した。この溶液に
hGは（10mM Tris（pH8.0）中437μＭ）を４μＬづつの
増加単位で添加した。各注入間の間隔を５分間とし、各
注入を８秒間にわたって行った。
図6.hGHとhGHbpの２つを1:1の比率で混合する前
（−）および後（‥‥）のhGHとhGHbpの個々のスペクト
ルの和の遠UV（パネルＡ）または近UV（パネルＢ）にお
ける円二色スペクトル。遠UVおよび近UVスペクトルをそ
れぞれ0.01cmおよび1.0cmセル中で0.2nmおよび0.5nm間
隔で集めた。
図7.hGHとhGHbpの２つを1:1の比率で混合する前
（−）および後（‥‥）のhGHとhGHbpの個々のスペクト
ルの和の蛍光放射スペクトル。
図8.hGHの連続的添加による10nM S237C−AFのホモク
エンチング。インキュベーションの後、島津RF5000U分
光蛍光光度計を用いて490nmの励起λと512nmの放射λ
（バンド幅はそれぞれ3nmおよび10nmである）で蛍光測
定を行った。
図9.hGHが誘発するS237C−AFの二量化に関するIC50の
決定。結合緩衝液（20mM tris・HCl（pH7.5）、0.1％BS
A、0.02％NaN3）中のS237C−AF（図８に記述のように調
製したもの）の連続的希釈液（３倍）を20nMから0.08nM
の範囲にわたって調製し、1.0mlづつ検定管に分注し
た。同様に１μＭから0.004μＭの範囲にわたってhGHを
連続的に希釈した。hGH希釈液の一部（10μｌ）（S237C
−AFに対して1:2モル比のhGHを与える）と緩衝液のみを
S237C−AF含有検定管に加え、混合し、平衡化するため
に暗所で25℃で５時間インキュベートした。平衡化の
後、上述（図８）のように蛍光を測定したが、ここでは
励起バンド幅を10nMとした。４変数曲線フィットから決
定される半最大△F/F0値を与えるhGHの濃度としてIC50
値を計算した。６回の独立した実験の平均から0.54（＋
／−0.14）nMのIC50を計算した。
図10.過剰のhGHまたはhGH突然変異体による、hGHが誘
発するS237C−AF二量化の反転。S237C−AFとhGHをそれ
ぞれ10nMと5nMの濃度で結合緩衝液中に希釈し、1.0mlづ
つ検定管に分注した。次に、hGH、突然変異体または緩
衝液のみのいずれかの連続的希釈液を加え、平衡化のた
めにその混合物を暗所で25℃で５時間インキュベート
し、図１について記述したように蛍光を測定した。デー
タ点は３つ１組の測定の平均であり、●はhGH、▲はK17
2A/F176A、■はhPLリクルートを表す。誤差線はSEMを与
える。
図11.hGH（hGHbp）２の結晶構造。中央上部の濃い線
はhGH分子を表す。このhGH分子は２つのhGHbp分子に結
合しており、その１つは左側にあり、もう１つは右側に
ある。これらのhGhbp分子のそれぞれは一本鎖によって
連結した２つのドメインを有し、上部ドメインはhGH分
子と同じ高さにあり、他のドメインは垂直に配向し、図
の下に向かって突き出ている。hGHbpのこれら最後の２
つのドメインは最底部で互いに接触している。
図12.成長ホルモン受容体に特異的な抗体に対する応
答としての体重増加。モノクローナル抗体Mab263を８匹
のラットに投与し（1.05mg/kg）、対照群には賦形剤の
みを投与した。体重測定を毎日行った。
図13.hGH−mG−CSFハイブリッド受容体（９）を含有
するFDC−P1細胞の、hGHが誘発する増殖。10U/ml IL−3
m10μＭβ−メルカプトエタノールおよび10％牛胎児血
清（FBS）を補足したRPMI1640培地中で５％CO2、37℃で
細胞を成長させた（８）。IL−３を含まない同じ培地で
細胞を洗浄し、増大する濃度のhGHで18時間処理する前
に、４×105/ml（○）、２×105/ml（●）および１×10
5/ml（□）の密度で100μｌづつ96穴プレートに接種し
た。DNA合成を測定するために、培地20μｌ中１μCi/ウ
ェルの添加によって細胞を［3H］−チミジンでパルス処
理した。４時間後、細胞を収集し、ガラスフィルター上
で洗浄した。シンチレーションカクテル2mlを加え、ベ
ックマンLS1701シンチレーション計数器で計数した。各
データ点は３つ１組の測定の平均値を表し、誤差線はS.
D.である。
図14.hGHが誘発する細胞増殖のhGh変種による拮抗。
細胞を図13と同様に調製し、1nM hGH＋増大する量の部
位１突然変異体（K172A/F176A）（●）、部位２突然変
異体（G120R）（□）、組合わされ増進された部位１突
然変異体／部位２突然変異体（H21A/R64K/E174A/G120
R）（■）および野生型hGH（○）と共にインキュベート
した。
図15a,図15bおよび図15cはIL−６拮抗薬または作用薬
を調製する際の変異に適した推定α螺旋部位のホイール
プロットを表す。これらの図の番号付与はＮ−末端プレ
残基から開始するものであることに注意のこと。
好ましい態様の説明 本発明の方法は作用薬ポリペプチド配位子または拮抗
薬ポリペプチド配位子の同定を容易にする。一般に本発
明は下記の如く実施される。
第１に、受容体との1:2の３要素複合体に関与する配
位子を同定するために、配位子と受容体の会合の化学量
論を決定する。会合の化学量論は下記の方法の１つを用
いて生理学的条件下で受容体に対する配位子の比率を測
定することによって決定される。例えばＸ線結晶学、セ
パロースゲルでのサイズ排除クロマトグラフィー、抗体
結合試験、走査熱量測定、BIA−コア分析、CDスペクト
ル分析または蛍光スペクトル分析。配位子−受容体複合
体のＸ線結晶構造は有用であるが、決して化学量論を決
定するために必要なわけではないことに注意すべきであ
る。好ましくは、本明細書にさらに記述するフルオレセ
イン・ホモクエンチング法を使用する。この方法では、
滴定によって決定されるように２つの受容体分子が配位
子によって結合された時に、フルオレセイン分子が互い
にクエンチ（消光）し、その溶液の蛍光が減少するよう
に位置するフルオレセインで受容体を標識する。本明細
書に記述する分析技術それ自体はよく知られており、当
業者の技術の範囲内である。
好ましくは、受容体の細胞外ドメインを化学量論分析
に使用する。即ち、貫膜ドメインが欠失しているか、さ
もなくば膜挿入または疎水性会合の能力がなくなってい
る受容体変種を用いて、この分析をインビトロで溶液中
で行う。随意に細胞質領域を欠質させてもよい。そのよ
うな受容体は既知であり、組換え細胞培養中で発現させ
て、そこから回収することができる。
受容体が１より多数のポリペプチド鎖を含有する時に
は、その受容体調製物が受容体ポリペプチド鎖のすべて
を含有することが好ましい。また３要素複合体が２つの
異なる受容体鎖からなる時（例えばアルファ鎖とベータ
鎖を含有するIL−２またはIL−３受容体複合体の場合な
ど、例:Teshigawaら,J.Exp.Med.,165:223−238［197
8］）には、両鎖を用いて分析を行う。この例では各受
容体鎖に対する結合が１つの順序のみで逐次的に進行す
る。会合の順序は異なる受容体分子を関与させると容易
に決定される。
いくつかの受容体が1:2複合体を形成し得るが、これ
らの受容体はそれぞれ１より多数の鎖を含有し得る。配
位子がそれらの鎖の１つにのみ結合し、他の鎖が結合鎖
の適性な立体配座の維持に必要でない場合には、多鎖受
容体の使用は必要でなく、配位子結合に必要な鎖が存在
するだけでよい。
1:2の複合体を形成する配位子は２つの分離した結合
部位によってそれらの受容体に結合する。受容体がこれ
ら２つの部位に逐次的に、即ち、まず１つの部位（部位
１）に、それから他の部位（部位２）に結合することを
発見したことは本発明の重要な特徴である。逆の順序で
起こることは観測されていない。この理解は拮抗性配位
子の調製にとってとりわけ重要である。第１部位に関す
る配位子の親和性を増進しないとしても保存することが
重要である。さもなくば、配位子類縁体は受容体に全く
結合しない。他方、第２部位結合の効果的な破壊または
阻害は拮抗薬活性を意味する。
本発明に従って配位子結合部位とそれらの付加順序を
決定する。以下に詳述する方法で成長ホルモンの立体配
座と候補配位子の立体配座を比較することによって、部
位１と部位２が同定される。それらはアラニン走査突然
変異法や他の系統的突然変異法（例：カセット突然変異
法、PCR突然変異法またはala走査）によってより完全に
解析される。立体配座分析は変種を作成してスクリーニ
ングする前に潜在的な部位１残基および部位２残基の範
囲をかなり減縮することを可能にする。
いずれの場合にも、不能にする部位２の突然変異と機
能的な部位１を伴う配位子類縁体を、３要素配位子：受
容体複合体を形成させ得ないことによって同定する。た
だしそのような変種は受容体と1:1の複合体を形成させ
得るであろう。他方、不能にする部位１の突然変異と機
能的な部位２を伴う類縁体は受容体に全く結合できない
であろう。この決定のために使用される検定法はポリペ
プチドの会合を検出する検定法のいずれかであり、後述
するホモクエンチング検定法やゲル濾過などを使用する
ことができる。
立体配座分析は両親媒性アルファ螺旋単量体配位子の
一群から配位子候補を選択することを容易にする。この
ような配位子は成長ホルモン、胎盤性ラクトゲンおよび
プロラクチンと立体配座的に関連するので、成長ホルモ
ンの構造との類推によってこれらの配位子の部位１およ
び部位２を決定することは容易である。皮肉なことに、
EPO、アルファインターフェロン、ベータインターフェ
ロン、GM−CSF、Ｇ−CSFおよびインターロイキン２、
３、４、６および７などの配位子の一次アミノ酸配列は
成長ホルモン、胎盤性ラクトゲンまたはプロラクチンと
の相同性が乏しい。しかし、（一般にサイトカインまた
はホルモンである）これらの配位子を従来の立体配座構
造原理（Bazanら,Immunol.Today,11:350−354（1991）,
Chouら,Biochemistry,13:222［1974］）によって分析す
れば、若干の共通する構造上の特長を示すことが分か
る。最も注目すべきことは、それらがそれぞれの前と後
ろに実質上螺旋でない構造（螺旋間のループおよびその
タンパク質末端のＮ−末端およびＣ−末端配列）を伴う
４つの主たる両親媒性アルファ螺旋によって特長づけら
れることである。主たるアルファ螺旋は典型的には約15
〜30残基長である。これらをＮ−末端から順にＡ〜Ｄと
命名する。短い螺旋セグメントは主たる螺旋を結合する
ループ中に存在し得る。
この種類の配位子のアルファ螺旋は両親媒性性であ
る。即ち、これらは一般に螺旋の一方の側に疎水性残基
を含有し、螺旋の他方の側に親水性残基を含有する。螺
旋の連続する各3.6残基を螺旋状はしごの意味で１回転
（ターン）と呼ぶ。螺旋の末端ではいくらかの微小なほ
つれが予期されるべきである。即ち、各アルファ螺旋末
端は使用するアルゴリズムと当業者の判断に応じて約１
〜３残基変化するであろう。この配位子群間の総合的な
相同性の欠如にもかかわらず、いくつかの保存された残
基が上記螺旋中に認められ、これらを用いて成長ホルモ
ンと配位子を構造的に並列させる際の補助とすることが
できる。
成長ホルモンおよび相同な配位子プロラクチン並びに
胎盤性ラクトゲンに関する我々の分析は、４要素アルフ
ァ螺旋サイトカインおよびホルモンのこの群の部位２が
基本的に（ａ）Ｎ−末端から螺旋Ａの最初の３〜４回転
までに延びる配列と（ｂ）螺旋Ｃのほぼ中央の４〜５回
転とからなることを立証した。したがって部位２は非連
続的であるが、両セグメントはそのタンパク質中で密接
な近位にあり、その様式で受容対と相互作用する。部位
２ドメインのいずれかもしくは両方を突然変異させる。
突然変異のために候補残基を選択する際には一般に螺旋
疎水性残基を無視する。ただし時としてそれらは該候補
の機能的保全に影響を与え得る。さらに部位２内の残基
のすべてが受容体結合に機能的または構造的な関与を示
すわけではなかろう。しかし、本明細書に記載の原理の
適用は、拮抗薬活性または作用薬活性についてスクリー
ニングする必要がある候補物質の数を著しく減少させ
る。
拮抗薬変種は、以下の詳述するように、候補位置にお
ける天然の残基の電荷、疎水性または嵩高さの本質的な
変化によって特長づけられる。これは一般に問題の残基
を置換するか、もしくはそれを削除することによって達
成される。場合によっては、機能的または構造的に活性
な部位２残基に隣接する残基を挿入することによって所
望の効果を達成することができる。拮抗薬の製造におけ
る目標は部位２における受容体結合を排除すること、も
しくは天然の配位子との関連で少なくとも２倍はそれを
減少させることである。これは、受容体との構造的な相
互作用（水素結合、塩橋形成、疎水相互作用など）に重
要である１またはそれ以上の天然の残基の特長を激しく
変化させることによって最も効果的に達成される。その
ような残基を接触残基と呼ぶ。別法として、受容体と直
接接触しない位置にあるが、接触相互作用に関与する残
基の適性な配置にとって重要である残基を選択する。そ
のような残基を機能的残基と呼ぶ。
典型的な場合、約20個を越えない位置（残基）が部位
２変種（疎水的両親媒性性残基を除く）を作成する際に
潜在的に重要であろう。これらのうち各アミノ酸群の代
表的な構成要素のみを使用して候補物質を作成する。即
ち、通常は、部位２内の各残基について残り19種の天然
に存在する残基を表す19変種をスクリーニングする必要
はない。その代わりに残基群の代表的構成要素を選択す
る。一般にこれらの群は、（ａ）正に荷電した残基
（Ｋ、ＲおよびＨ）、（ｂ）負に荷電した残基（Ｄおよ
びＥ）、（ｃ）アミド（ＮおよびＱ）、（ｄ）芳香族
（Ｆ、ＹおよびＷ）、（ｅ）疎水性（Ｐ、Ｇ、Ａ、Ｖ、
Ｌ、ＩおよびＭ）並びに（ｆ）非荷電親水性残基（Ｓお
よびＴ）である。さらに拮抗薬候補を作成する際には５
種類の代表的残基をスクリーニングするよりはむしろ、
典型的には１〜３種類だけを選択することで充分であ
る。なぜなら適当な残基における本質的な変異はいずれ
も部位２を不能にするであろうからである。下記の表1a
を参照のこと。最も極端な置換は特長の相反する組み合
わせを選択することによって作成される。例えば天然の
残基がアラニン（小さい疎水性残基）であるならば、極
端な置換は親水性で嵩高く荷電しているグルタミン酸で
あろう。さらに進化論的な多様性を示すものから残基を
選択する。即ち、ある動物種の配位子がhu受容体部位２
に結合することができない場合には、変異残基を候補と
して選択する。拮抗薬を含有する可能性の高い突然変異
体の充分なプールは典型的な場合、約20から約60までの
部位２変種を含有するであろう。部位２における作用薬
候補を選択するには微小相違法を用いる。部位１に関す
る下記の議論を参照のこと。このようなプールの作成と
スクリーニングは過度の実験を必要とせず、充分に当業
者の技術の範囲内であろう。
置換アミノ酸の選択でもその残基がアルファ螺旋構造
内に位置するか、非螺旋構造内に位置するかを考慮すべ
きである。その残基が螺旋回転の一部である場合には、
その置換がプロリンやグリシンなどの螺旋破壊残基でな
いことが好ましい。他方、プロリンまたはグリシンが野
生型螺旋内に認められる残基である場合には、それらを
自由に置換することができる。なぜならそれらの置換は
螺旋立体配座を不安定化しないだろうからである。
部位１も非連続的な部位である。これは（ａ）螺旋Ａ
の中央40％（おそらく螺旋Ａ中の部位２のＣ−末端と重
複している）内、（ｂ）螺旋Ａと螺旋Ｂを連結している
ループのＣ−末端2/3（好ましくはＣ−末端1/2）および
（ｃ）螺旋ＤのＣ−末端1/2（好ましくは1/3）に位置す
る３つのセグメントからなる。比率はアミノ酸残基の直
線的な配列について述べている。部位２拮抗薬突然変異
で用いた方法とは対照的に、部位１ドメイン内の残基を
改変せずに残しておく（突然変異によって部位２のみを
不能にする拮抗薬の場合）か、改変するとすれば、結合
を破壊しないように部位１の変異を選択する。その理由
は、部位１を不能にすることはほとんどの態様で望まし
くないからである。その代わりに部位１の親和性を約10
％から２倍以上にまで増大させることが目標である。し
たがって一般的にはこれらのドメイン内の残基を（欠失
させたり隣接する挿入に付すのではなくて）置換し、立
体障害決定基（その残基の嵩高い側鎖が、特に荷電して
いる場合に、配位子−受容体結合相互作用を妨害または
阻害するもの）を同定するために、最初のスクリーニン
グをアラニン走査で行う。立体障害残基を同定したら、
作用薬もしくは拮抗薬のための部位１置換を、表1aの
「作用薬」置換という表題のところから選択する。種多
様性分析も作用薬を同定する際に同様に有用であろう。
やはり約20個以下の位置を部位１変異のために選択する
ことが必要であろう。一般に各位置における突然変異
は、元来の残基が属する群の残りの構成要素、並びに、
嵩高さがより少ない側鎖を含有する、かつ／または、非
荷電の、次に最も近い関係にある群（表1a）の残基によ
る置換であろう。
各部位は数個の非連続的なドメインを含有するので、
これらのドメインのいずか１つに変異を導入する。即
ち、与えられた部位の各ドメインを変化させる必要はな
い。部位２の螺旋ドメイン（螺旋ＡまたはＣ）（好まし
くは螺旋Ｃ）は部位２に関する好ましい突然変異導入部
位である。部位１の螺旋ドメイン（螺旋ＡまたはＤ）
（好ましくは螺旋Ｄ）は部位１の変異にとって好ましい
位置である。各部位の各ドメイン（部位２については
２、部位１については３）中の少なくとも１残基を変化
させることが本発明の範囲に包含されるが、典型的な場
合、各部位について１残基のみを変化させる。他の態様
として、２またはそれ以上の残基であって、通常は約５
残基までを各ドメインで変化させる。
突然変異導入または変化のための螺旋残基の選択は図
15a、ｂおよびｃに示すような螺旋ホイール図の構築に
よって容易になる。これらは従来の方法で作成され、部
位１および部位２の螺旋部分の変化について標的位置を
同定する際に有用である。興味深い特定の残基は親水性
残基、嵩高くない残基または螺旋立体配座を不安定化す
る傾向のある残基である。
置換、挿入、欠失またはそれらの組み合わせはスクリ
ーニングの候補物質を作成する際に有用であるが、残基
変化の効果は残基変化そのもの以上に拡大し得る。例え
ば受容体結合を防止するべく部位２を改変するのに適し
た方法は部位２内にＮ−またはＯ−グリコシル化部位を
導入することである。この部位は酵母や高等真核細胞中
で発現された時にグリコシル化され、立体的障害によっ
て部位２の結合を妨害するであろう。この方法の１つの
利点は部位２の構造的残基の正確な位置を決定する必要
がないということである。なぜなら嵩高い隣接基の挿入
が結合の阻害に必要な条件のすべてであり得るからであ
る。他の利点は循環半減期を増大させるなどの変調とそ
の変種の免疫原性を減少させることができるという能力
である。したがって、例えば本明細書に記載の配位子
（例えばIL−２）の螺旋Ａおよび／またはＣ（好ましく
はＣ）内にグリコシル化部位を挿入することは本発明に
包含される。
候補作用薬または候補拮抗薬を、作用薬または拮抗薬
として機能的に作用するというそれら候補物質の能力に
ついてスクリーニングする。そのような検定法は従来か
ら知られおり、例えば野生型配位子の効力と活性を検定
するために典型的に使用される従来の検定法など、広く
利用可能である。別法として、あるいは上記に加えて、
受容体の化学量論を決定するために使用する検定法を、
（とりわけ部位１で結合するが、部位２では結合しない
拮抗薬を同定するために）使用することができる。これ
らの検定法自体は日常的なものであり、はなはだしい実
験を必要としない。
ヒト成長ホルモンに関して部位２の構造的残基にはT
3、I4、L6、L9、N12、L15、R16、R19、Q22、Y103、N10
9、D116、E119、G120およびT123が含まれる。部位２の
機能的残基にはF1、I4、L6、R8、D116およびE119が含ま
れる。これらの位置の１またはそれ以上でいずれかの残
基を置換するか、天然の残基を欠失させるか、もしくは
それらに隣接して別の残基を挿入する。上述のように、
通常は拮抗薬作用を求めるか、作用薬作用を求めるかに
応じて、同じ種類または異なる種類の構成要素を置換す
る。これらの位置の１またはそれ以上に、あるいはそれ
らに隣接して導入される変異は部位２結合に影響を当え
るであろう。一般に突然変異にとってこのましい残基に
は、Ｎ−末端ドメイン／螺旋Ａ内の指定された領域の少
なくとも１つの突然変異と、Ｃ螺旋内のもう１つの突然
変異が含まれる（具体的にはF1、I4、L6、D119およびG1
20）。hGH拮抗薬の例にはI4A/L6A/G120A hGH、I4A/L6A/
G120A/T123A hGH、F1A/I4A/G120I/T123A hGH、F1A/I4A/
G120F hGHおよびF1T/I4F/L6R/G120R/T123D hGHと共に、
受容体に対する部位１の親和性を増大させるE174、H2
1、R64、K172および／またはF176などの残基における追
加の突然変異を伴う上記のいずれかが含まれる。例えば
E174はＳに突然変異させることが好ましいが、他の態様
ではＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、ＷまたはＰから選択される残基に突然
変異させる。F176はＹに突然変異させることが好まし
く、随意にE174S、R168N、D171S/Aおよび／またはI179T
（螺旋Ｄから）および螺旋ＡからのF10A、M14W、H18Dお
よびH21Nと組み合わせて使用してもよい。ファージミド
スクリーニングによって野生型のホルモンよりも約30倍
強いGHbpへの結合を示す２つの部位1hGH変種を同定し
た:F10A/M14W/H18D/H21N/R167N/D171SまたはA/E174S/F1
76Y/I179T。作用薬または拮抗薬を作成するために、こ
れらの部位の突然変異を部位２における上述の突然変異
と組み合わせる。拮抗薬の例にはF1A/I4A/F10A/M14W/H1
8D/H21N/G120R,F,Y,W,D,EまたはI/R167N/D171SまたはA/
E174SまたはA/F176Y/179T hGH、F1A/I4A/H21A/R64K/E17
4A hGH、I4A/G120R/E174A hGHおよびI4A/G120I/F174A h
GHが含まれる。
他の拮抗薬態様ではI4A、L6A、F1および／またはG120
を欠失させ、これらの残基の１またはそれ以上を欠失さ
せる一方で残りの残基を置換し、かつ／または、これら
の残基に隣接して１またはそれ以上の残基を挿入する。
置換、欠失および挿入の組み合わせは有用である。単に
それらを選択することは成長ホルモンの活性を最適化す
る問題であろう。このような組み合わせの例にはF1
（△）/I4A/G120I/E174AおよびI4（△）/G120（Ｋ）/E1
74Aが含まれる。
部位１および部位２中の位置における突然変異の効果
は一般に結合および親和性を抑制することであろう。た
だしこれらの部位において選択された改変が日常的なス
クリーニングによって決定されるように親和性の増大を
もたらすこともある。例えばE174（Ｓ、Ｇ、Ａまたは
Ｔ）および位置21、18および64での変異はGHbpに対する
部位１の親和性を増大させることが明らかになってい
る。
HGH部位１構造的残基はH18、H21、Q22、F25、K41、Y4
2、L45、Q46、P61、S62、N63、R64、E66、R167、K168、
D171、K172、T175、R178およびC189である。部位１の機
能に影響を与える側鎖を有する残基はP5、L6、F10、M1
4、F54、E56、I58、S62、N63、R64、E66、Q68、Y164、D
171、K172、E174、T175、F176、R178、I179、C182およ
びV185である。受容体に対する部位１の親和性を増大さ
せるために好ましい残基はH21、R64およびE174である。
一般に部位１残基には置換のみを施し、削除したり、そ
れらに隣接して残基を挿入したりしない。さらに、表1a
に記したように、部位１置換は一般に天然の残基と同じ
群か、あるいは密接に関連する群から選ばれるであろ
う。作用薬活性と拮抗薬活性は共に部位１が受容体に結
合することを必要とするので、部位１の激しい摂動は通
常望ましくない。それでもなお例外（例えばE174A）が
存在し、したがって最適な置換を決定するために一群の
置換体をスクリーニングすることが望ましい。
他の成長ホルモンにおける類似の残基は容易に同定さ
れ、同じ方法で改変される。例えばhGH中のI4はbGH中の
M4に対応する。他の種から得られる成長ホルモンやhGH
の他のアレルを比較する際に残基番号に多少の変化が存
在し得ることに注意すること。動物のGHが相同な位置に
ヒトGHと同じ残基を含有しない場合には、置換される残
基はその位置における動物残基とは異なるもの、好まし
くはその位置におけるヒト残基とは異なるものである。
さもなくば、突然変異導入のための残基の選択を上述し
た方法と同じ方法で実行する。
構造分析または分子モデリングを用いて他の配位子
（即ち、４つの逆平行両親媒性アルファ螺旋を含有する
単量体ポリペプチド）中の変異のために類似する配列を
同定する。チョウ−ファスマン分析を用いて候補配位子
の構造を決定し、次いで各配位子について部位１と部位
２内に位置する類似の残基を同定する。いくつかの例で
は構造的研究が既に公表されており、必要なことは部位
１と部位２を同定するために様々なドメイン中の残基を
成長ホルモンと比較することだけである。単量体配位子
は正常な生理学的条件下で循環する単量体として発見さ
れるものである。
そのような配位子の現在知られている例にはEPO、GM
−CSF、Ｇ−CSF、インターロイキン２、３、４、６およ
び７、胎盤性ラクトゲンおよびプロラクチン、アルファ
−インターフェロン、ベータ−インターフェロンが含ま
れる。その他の配位子も将来同定されるであろうし、本
発明の教示はそれらにも等しく適用される。
これらの配位子に関する拮抗薬候補を作成するため
に、２つの領域：（ａ）Ｎ−末端からＡ螺旋の最初のＮ
−末端1/3まで、および、（ｂ）Ｃ螺旋のほぼ中央の1/2
（好ましくは1/3）の一方または両方に本質的な突然変
異を導入する。これらのドメインはhGHの部位２ドメイ
ンに対応する。作用薬は部位１および／または部位２に
嵩高さが低く、かつ／または、電荷が少ない置換を導入
することによって作成される（表１を参照のこと）。最
適な拮抗薬は、受容体結合を防止するか、実質上欠失さ
せるために部位２を突然変異させることによって、並び
に、受容体に対する親和性を増大させるために部位１を
突然変異させることによって作成される。理解されるで
あろうが、作用薬態様と拮抗薬態様の両方において、受
容体に対する親和性を増大させるべく部位１を改変す
る。
成長ホルモン以外の配位子の拮抗薬変種および作用薬
変種を作成する方法の例として、下記の表1bを参照す
る。表1bはhPRL、IL−２、IL−３、IL−４、IL−６、GM
−CSF、Ｇ−CSFおよびEPOに関する推定の部位１および
部位２主要部および核決定基を開示するものである。各
配位子の螺旋ドメインを同定し、それらをhGHの類似す
るドメインと比較することによって各部位に関する螺旋
決定基を選択した。hGH以外の配位子の構造または機能
に寄与する非螺旋ドメインを同定する際にも同じ分析を
適用する。表1bは、Ｎ−末端内の部位２ドメインよりも
部位２螺旋残基を標的にすることによって拮抗薬変種が
好ましく作成されるという我々の確信を反映している。
しかし、部位１および部位２に関する非螺旋類似残基を
変化させることもできる。部位１および部位２について
推測した表1bの残基は、表にした配位子の受容体と構造
的または機能的に相互作用する少なくとも１残基を含有
するものと考えられる。これは３螺旋ドメインまたはそ
の一部の１ないし３の遮断アラニン走査または相同体走
査、該ドメインまたはその一部の欠失、Ｏ−またはＮ−
結合型グリコシル化部位を作成するための３ドメインの
１またはそれ以上の中の残基の置換によって容易に確認
される。ドメインの活性を確認すれば、重要な機能的ま
たは構造的残基を同定するために残基毎のアラニン走査
を用いることは容易な問題である。
表1bの螺旋構造情報は、DeVosら,Science,225:306−3
12（1992）（hGHG）、Bazanら,Immunol.Today,11:350−
354（1991）（hPRL、IL−６、IL−２およびEPO）、Lokk
erら,EMBO J.,10:2125−2131（1991）、Bazanら，前掲
（IL−２）およびDiederichsら,Science 254:1779−178
2（GM−CSF）から得た。上述のように、他の配位子に関
するこのような情報は、モデリング、nmrあるい好まし
くはＸ線結晶学的分析によって得られる。
表1bにおける部位指定は、螺旋Ａの長さの0.07ないし
0.5と螺旋Ｃの長さの0.5ないし0.8である部位２に基づ
く接触片を計算することによって到達した。これらの部
位は概略と見なされるべきであり、おそらく適度の改善
を必要とするであろう。各部位は記載の配列から±１〜
５残基に位置し得る。
拮抗薬の製造では、標的螺旋残基に導入する残基また
は構造が一般には同じ種類（上記を参照のこと）のもの
でなく、置換される残基よりも嵩高いことが好ましい。
他の態様では、部位残基を欠失させるか、他の残基（Ｇ
やＰの如き螺旋破壊残基など）を部位残基に隣接して挿
入する。次に一群の候補物質を作成し、最適な候補物質
を同定するために本明細書に記載の方法によってスクリ
ーニングする。しかし、たとえ変種配位子が天然の配位
子との比較で作用薬または拮抗薬として作用し得ないと
しても、その変種はその配位子にとっての従来からの用
途（変種が天然の配位子にほぼ等しい活性を保持してい
る場合）に、あるいはそれが受容体に結合できない場合
には免疫学的な（例えば診断用の）試薬として有用であ
るということは強調されるべき点である。
IL−２拮抗薬候補を調製するための代表的な計画を表
1cに記載する。この計画では、表1bで同定した推定上の
部位２残基を、受容体結合を減じるのに好適なアミノ酸
で置換する。追加の代替的な置換をもこの表に示す。
IL−６螺旋Ａ、ＣおよびＤに関する代表的な螺旋ホイ
ールプロットをそれぞれ図15a、ｂおよびｃに記載す
る。螺旋Ａ中で潜在的興味深い残基はD54、R58、E51、K
55、T48、R52、Q56およびS49であり、螺旋ＣではK157、
A158、Q155、Q152、K156およびV149である。
hPRLに関する同様のプロットは、部位２を改変するた
めの位置が残基H58、D69、H55、D48、N59、V52、D45、Y
56およびR49（螺旋Ａ）と、K143、Q150、G157、E146、Q
164、R153、L160、S142、E149、S163、V145、K152、E14
8、H166、E156およびE159（螺旋Ｃ）であることを示唆
している。
興味深いhPRL部位１（螺旋Ｄ）残基はC202、R220、S1
91、K209、N198、L216、R205、S194、N212、H201、C21
9、E190、H208、Y197、K215、R204、D211、L193、L200
およびK218である。hPRL残基にはプレ配列のＮ−末端Ｍ
＝１として番号を付与している。
当然のことながら本明細書でいう作用薬および拮抗薬
は、部位１および／または２に認められる残基以外の追
加の残基へ変異が導入されている配位子をも包含する。
例えば候補物質を他のポリペプチドに融合させたり
（例：免疫アフィニティー精製を容易にするため）、所
望の活性に関与しない残基および適性な立体配座の維持
に必要でない残基を欠失、置換または挿入したり（例：
配位子の活性な断片を作成するため）、さもなくば従来
の慣用に従って変化させる。
配位子が受容体に結合する際のKaまたは親和性定数
は、問題の部位で配位子が受容体に結合する速度（「結
合」速度）を配位子が受容体から脱離する速度（「脱
離」速度）で割った比である。高親和性相互作用とは
「結合」速度が優勢である相互作用をいう。拮抗薬は一
般に部位１に高親和性変異を有するであろう。たいてい
は、いずれかの部位での高親和性変異が受容体の性質に
応じて作用薬にとって望ましい。配位子が受容体に結合
し、３要素受容体複合体が連続的な信号ではなく単一を
信号を発する場合には、受容体に対して極度に高い親和
性を有する配位子類縁体が実際に充分な時間受容体を占
めるので実質的に拮抗薬としての作用を開始する。例え
ば細胞の特徴の変化（例：タンパク質の放出、有糸分裂
の刺激など）を信号化するのに二量化した受容体が20〜
30分を必要とするならば、時間単位で受容体を占めるよ
うな速度定数を作用薬配位子が保持する必要はないであ
ろう。したがって最適には、受容体の信号化事象が完了
するのに必要な時間とほぼ同じ時間後に受容体から変種
が脱離するように作用薬の親和性を最適化すべきであ
る。高い（＞野生型の倍）部位1Kaは不活性な部位２を
有する拮抗薬にとってまさしく望ましい。なぜならこれ
がその拮抗薬による受容体部位１の占有を増進し、それ
によって、そうでなければ天然の配位子にとって利用可
能になるかもしれない受容体を拘束するであろうからで
ある。したがって最も望ましくは、作用薬突然変異は二
量化した受容体の信号化特性と合致する速度定数を有
し、他方、拮抗薬は部位１において高い親和性を示し、
部位２においてより低い親和性（または親和性の欠如）
を示すであろう。Kaは、例えばPharmaciaから市販され
ているBIA−コア装置の使用などによって、与えられた
配位子変種について容易に決定される。
３要素複合体を形成するという配位子とその受容体の
能力は、該複合体の形成に影響を与えるが配位子アミノ
酸配列変種ではない物質の便利な検定終点としても機能
する。例えば一群の候補非ペプチド分子または短いペプ
チド分子を作用薬効果または拮抗薬効果についてスクリ
ーニングしようとするならば、その候補物質の存在下と
非存在下で３要素複合体の形成を追跡するだけでよい。
複合体形成を抑制する候補は拮抗薬として作用し、複合
体を形成するのに必要な配位子と受容体の量を減少させ
るものは作用薬候補であろう。受容体または配位子に対
する非特異的な効果（例：タンパク質変性）は従来から
の分析法（例:CD研究）によって排除される。
さらにこの検定法は変種受容体とそれらの活性を検出
するためにも有用である。例えば、配位子結合部位に関
して天然の受容体と競争する能力を測定することによっ
て、配位子に正しく結合するという能力について突然変
異受容体を検定する。ホモクエンチングを用いるこのよ
うな検定法では、フルオレセイン標識受容体を天然の配
位子の制限量に加え、標識された受容体と競争するとい
う候補受容体の能力を受容体標識との関連で増大した蛍
光によって測定する。蛍光のクエンチング（消光）や増
進は、受容体集団の半分を１つの発蛍光団で標識し、残
りの半分を増進分子またはクエンチング分子で標識する
ことによって検出することもできる。このような系は広
く知られており、一般に上記の３要素検定に適用するこ
とができる。この検定法を、単に複合体の分子サイズを
追跡するだけで部位１または部位２結合の分析を可能に
するように適合させることもできる。妥当な比率である
にもかかわらず配位子と受容体が全く複合体を形成しな
い場合には、部位１が欠損しているか、あるいは（受容
体が候補物質である場合には）配位子部位１に関する受
容体の結合部位が欠損している。（妥当な量の配位子ま
たは受容体が存在するにもかかわらず）1:1複合体のみ
が形成される場合には、部位２（またはその受容体部
位；使用する候補物質による）が受容体に結合する能力
を欠いている。同じ分析を適用することによって、野生
型タンパク質より強い親和性で部位１または部位２で結
合することができる配位子または受容体を同定する。
複合体形成に関する検定 ３要素複合体を検出するための検定法には、複合体の
分子量を決定すること、蛍光の発光または蛍光のクエン
チングあるいは受容体上の標識間の他のエネルギー移動
を決定すること、Bia−コア分析、ゲル排除クロマトグ
ラフィー、天然ゲル電気泳動、等電フォーカシング、沈
降および透析が含まれる。他の好適な方法には受容体−
配位子部位に結合する抗体の使用、偏光の旋光度、クロ
マトグラフィーおよび核磁気共鳴が含まれる。クロマト
グラフィーの種類にはゲル濾過、イオン交換および高圧
液体クロマトグラフィー（HPLC）が含まれる。いずれの
分析法でも、複合体化していない配位子および／または
受容体のバックグラウンドに対して３要素複合体の形成
を決定することが可能であろう。
配位子とそれらの受容体 構造的に分析を行い、適切であれば本明細書に従って
突然変異させる配位子の中には、成長ホルモン、インス
リン様成長ホルモン、上皮小体ホルモン、インスリン、
リラクシン、卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホ
ルモン（TSH）および黄体形成ホルモン（LH）などの糖
タンパク質ホルモン、造血性成長因子、肝性成長因子、
線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲ
ン、腫瘍壊死因子−アルファ、腫瘍壊死因子−ベータ、
ミュラー阻害物質、マウス・ゴナドトロピン関連ペプチ
ド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、イン
テグリン、トロンボポイエチン、NGF−βなどの神経成
長因子、血小板由来成長因子、TGF−アルファやTGF−ベ
ータなどの形質転換成長因子（TGF）、インスリン様因
子成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子−II、EPO、骨
誘導性因子、インターフェロン−アルファ、インターフ
ェロン−ベータおよびインターフェロン−ガンマなどの
インターフェロン、Ｍ−CSF、GM−CSFおよびＧ−CSFな
どのコロニー刺激因子（CFS）、IL−１、IL−２、IL−
３、IL−４、IL−５、IL−６、IL−７、IL−８などのイ
ンターロイキン（IL）および他のポリペプチド因子が含
まれる。好ましい配位子は、Ｇ−CSF、GM−CSF、IL−
２、IL−３、IL−４、IL−６、IL−７、EPO、成長ホル
モン、胎盤性ラクトゲンおよびプロラクチンなどの螺旋
状単量体サイトカイン／ホルモンである。hGHの場合と
同じ方法でこれらの配位子の受容体を使用し、上述のよ
うに拮抗薬または作用薬を選択する。
上述の議論はアミノ酸配列変種に集中した。しかし、
標的残基をインビトロ法によって共有結合的に修飾する
ことによっても同じ目的が達成される。これは、受容体
に結合するという標的位置の残基の側鎖の能力を破壊も
しくは改変する何らかの種類の化学修飾によって達成す
ることができる。共有結合修飾が標的残基に対して充分
に特異的であれば、最終的な効果は例えば置換突然変異
と同じである。特異性は所望の側鎖と優先的に反応する
試薬を選択することによって達成される。さらなる特異
性は保護されるべき領域に結合する抗体で他の側鎖を遮
断することによって達成される。修飾は、結合に直接参
加するアミノ酸（構造的残基）の１または複数であり得
る。あるいは立体配座の維持に関与している受容体結合
の領域内のアミノ酸またはそれに隣接するアミノ酸をイ
ンビトロで共有結合的に置換する。共有結合的修飾には
酸化、還元、アミド化、縮合など、あるいは多糖やポリ
エチレングリコールなどの嵩高い基の置換が含まれる。
そのような部分（例：ポリエチレングリコール）をタン
パク質に共有結合させる方法はよく知られている（例え
ばDavisら，米国特許第4179337号を参照のこと）。
システイン残基は最も一般的にはクロロ酢酸やクロロ
アセトアミドなどのα−ハロアセテート（および対応す
るアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカル
ボキシアミドメチル誘導体を得る。またシステイン残基
は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−
（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセ
チル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリ
ジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、
ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ
−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベン
ゾ−２−オキサ−1,3−ジアゾールとの反応によっても
誘導体化される。
ヒスチジル残基はpH5.5〜7.0におけるジエチルピロカ
ーボネートとの反応によって誘導体化される。なぜなら
この試薬は比較的ヒスチジル側鎖に特異的だからであ
る。臭化パラ−ブロモフェナシルも有用であり、この反
応は好ましくはpH6.0の0.1Mカコジル酸ナトリウム中で
行われる。
リジニル残基およびアミノ末端残基はコハク酸無水物
または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試
薬による誘導体化はリジニル残基の電荷が反転するとい
う効果を有する。アミノ含有残基を誘導体化するための
他の好適な試薬には、ピコリンイミド酸メチルなどのイ
ミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサー
ル、クロロホウ水素化物、トリニトロベンゼンスルホン
酸、Ｏ−メチルイソ尿素、2,4−ペンタンジオン、トラ
ンスアミナーゼが触媒するグリオキシレートとの反応、
ポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンアミ
ドエステル、または他の嵩高い置換基が含まれる。
アルギニル残基は従来の試薬の１または数種との反応
によって修飾され、それらにはフェニルグリオキサー
ル、2,3−ブタンジオン、1,2−クロロヘキサンジオンお
よびニンヒドリンが含まれる。アルギニン残基の誘導体
化は、グアニジン官能基の高いpKaゆえに、その反応が
アルカリ条件下で行なわれることを必要とする。さらに
これらの試薬はアルギニンのイプシロン−アミノ基と共
にリジンの基とも反応し得る。
チロシル残基の特異的な修飾は、芳香族ジアゾニウム
化合物かテトアラニトロメタンとの反応によってチロシ
ル残基に光学的な標識を導入するという特別な興味をも
って行うことができる。最も一般的にはＮ−アセチルイ
ミジゾールとテトラニトロメタンを用いて、それぞれＯ
−アセチルチロシル種と３−ニトロ誘導体を形成させ
る。放射線免疫検定で使用するべく標識されたタンパク
質を調製するために、125Iまたは131Iを用いてチロシル
残基をヨウ素化する。上述のクロラミンＴ法が好適であ
る。
カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）
は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４
−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４
−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル）カルボジイミド
などのカルボジイミド（R'−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−R'（ここにＲ
とR'は異なるアルキル基を表す）との反応によって選択
的に修飾される。さらにアスパルチル残基とグルタミル
残基はアンモニウムイオンとの反応によってアスパラギ
ニル残基とグルタミニル残基に変換される。
グルタミニル残基とアスパラギニル残基はしばしば脱
アミド化されてそれぞれ対応するグルタミル残基とアス
パルチル残基になる。あるいは温和な酸性条件下でこれ
らの残基を脱アミド化する。これらの残基のどちらの形
態も本発明の範囲に包含される。
他の修飾にはプロリンおよびリジンのヒドロキシル
化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基
のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖
のα−アミノ酸のメチル化（T.E.Creighton「Proteins:
Structure and Molecular Properties」（W.H.Freeman
＆ Co,サンフランシスコ,79〜86頁（1983））、Ｎ−末
端アミンのアセチル化およびＣ−末端カルボキシル基の
アミド化が含まれる。
hGHbp上の２つの結合部位に関する証拠は抗体結合に
よって得られる。hGHbpに対するhGHの親和性は、
［125I］hGHのhGHbpからの置換と、グリコシル化された
ウサギGH受容体から作成された抗受容体モノクローナル
抗体（Mab5）（Barnard,R.ら,Endocrinology 115:1805
−1813（1984）;Barnard,R.ら,Biochem.J.231:459−468
（1985））でその複合体を沈殿させることによって測定
される。この検定法を用いると、スキャッチャード分析
はhGHとhGHbpが1:1の複合体を形成することを示す（Leu
ng,D.W.ら,Nature 330:537（1987）;Fuh,G.ら,J.Biol.C
hem.265:3111−3115（1990）;Barnard,R.ら,Endocrinol
ogy 115:1805−1813（1984）;Barnard,R.ら,Biochem.J.
231:459−468（1985）;Spencer,S.A.ら,J.Biol.Chem.,2
63:7862−7867（1988））。もう１組のMAb（MAb387また
は3D7）を用いた置換曲線のスキャッチャード分析（図
３）は0.5hGH対1hGHbpの化学量論をもたらした。これら
の結果は、hGH上の第２の部位に結合するためのhGHbpの
決定基をMab5が遮断したのだとすれば説明することがで
きる。
各hGHポリペプチド上の２つの結合部位に関する証拠
は、hGH（Cunningham,B.C.ら,Science,244:1081（198
9））とhGHbp（実施例２）の間の結合決定基の走査突然
変異分析においてモノクローナル抗体を用いることによ
って開発された。これらの研究で同定された決定基は1:
1複合体の形成を調節するのに重要である。このデータ
に基づいて、我々はこれらの決定基をhGHの非結合性相
同体に装備し、hGHbpに強固に結合する類縁体を作成し
た（Cunningham,B.C.ら,Science,247:1461−1465（199
0））。hPRL中に８置換を、またhPL中に５置換を組み込
むことによって、我々はhGHbpに結合して1:1複合体を形
成する変種を作成した。
我々はゲル濾過を用いてこれらのhPRLまたはPL変種
（図4AおよびＢ）がhGHbpの１または２分子に結合する
ことができるかどうかを決定した。ホルモンに対するhG
Hbpの比率が2:1である時に、hPRLの両結合変種がhGHbp
との1:1の複合体に対応する２つの対称なピークを示
す。
抗体や複合体を分離するためのクロマトグラフィーを
使用する必要を伴わずに溶液中で自由に結合を調べるこ
とができるので、我々は化学量論と反応の熱量をさらに
評価するために走査熱量測定法を使用した（図５）。こ
の実験によりhGHbpに結合したhGHの当量と反応の熱量を
決定することが可能になった。
表１に野生型hGHとhGHおよびhPRLの変種に関する滴定
終点を要約する。hGHbpのすべてに結合するために必要
なhGHの比率は１に対して約0.5である。要するに、これ
らのデータはhPRLとhPL変種がhGHbpの二量化にとって重
要な決定基を欠いていることを強く示している。これら
の決定基はhGHの単一アラニン突然変異体中ではほとん
ど保存されているが、hPRLまたはhPL変種では保存され
ていない。これはhGH上にhGHbpに関する２つの結合部位
が存在することを示唆している。これらの部位の１つを
hGHのアラニン走査突然変異法（Cunningham,B.C.ら,Sci
ence,244:1081（1989））か、それぞれMab5またはMab26
3免疫沈殿検定法を用いるhGHbpによって機能的に詳細に
特徴づけた。hGHとhGHbp上の第２の部位はまだ解明され
ていなかった。
hGHbpに対するhGHの結合はその成分に光学的な変化を
ほとんど引き起こさない。我々は複合体の形成時の円二
色スペクトル（CD）および蛍光スペクトルの変化を調べ
た。hGHとhGHbpを混合した場合、遠UVCDスペクトルは基
本的にhGHとhGHbpのスペクトルの和と同一である（図6
A）。この結果は複合体の形成時に通常の二次構造に大
きな変化がないことを示している。近UVCDスペクトル
（図6B）は芳香族アミノ酸側鎖の非対称な環境を反映し
ている（Bewley,T.A.,Recent Progress in Hormone Res
earch,35:1555（1979）;Bewley T.A.ら,Archives of Bi
ochemisty and Biophysics,233:219−227（1984））。h
GHとhGHbpのUV吸収スペクトルの間には大きな相違があ
り、これは主としてhGHと比較してhGHbpのトリプトファ
ン含量（それぞれ１対９）が多いことの結果である。し
かしスペクトルの強度の増大を除いて、個々のスペクト
ルの和は混合後に得られたものと基本的に同一であっ
た。
蛍光スペクトルでは、hGHbpに対するhGHの結合時に、
340nmから334nmへの青方偏移と蛍光強度のわずかな減少
がある（図７）。ヨウ素クエンチングとスターン−ボル
マー（Stern−Volmer）分析は、ホルモン受容体複合体
中のトリプトファンの暴露の減少があることを示してい
る。これはhGHを結合した時にhGHbp中の１またはそれ以
上のTrp残基が隠される結果であると思われる。なぜな
ら蛍光クエンチング研究はhGH中のトリプトファンが感
知し得るほどには溶媒にさらされていないことを示して
いるからである（Bewley,T.A.,Recent Progress in Hor
mone Research,35:1555（1979）;Bewley,T.A.ら,Archiv
es of Biochemistry and Biophysics,233:219−227（19
84））。対照的に、hGHbpの突然変異分析はhGHへの結合
にとってTrp104がとりわけ重要であることを示してい
る。
上述のようにhGHの結果は他のポリペプチド配位子
（例えばホルモン−受容体系およびサイトカイン−受容
体系）に関連している。成長ホルモン受容体とプロラク
チン受容体は、インターロイキン２、３、４、５、６、
７、エリスロポエチン、マクロファージコロニー刺激因
子およびその他（概略については８を参照のこと）に関
するサイトカイン受容体の大きいファミリーに構造的に
関連していると思われる。これらの受容体の細胞内ドメ
インが、あったとしてもごくわずかな配列相同性しか共
有せず、既知のチロシンキナーゼのいずれとも相同であ
るとは思われないということが注目される。それにもか
かわらず、GH受容体（Carter−Su,C.ら,J.Biol.Chem.,2
64:18654−18661（1989））、IL−２受容体（Asao,H.
ら,J.Exp.Med.171:637−644（1990））およびIL−３受
容体（Itoh N.ら,Science 247:24−327（1990））はホ
ルモン結合のすぐ後にリン酸化型になる。IL−２受容体
（Sharon,M.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4869−4873
（1990））とIL−６受容体（Taga,T.ら,Cell 58,573−5
81（1989））の場合には、補助タンパク質および／また
は受容体が信号変換に関与することを示す証拠がある。
hGHとその結合タンパク質で得られたこの結果は、hGHの
結合が受容体の細胞外部分の二量化を誘発し、それが細
胞内ドメインを結び合わせることによって、細胞質（ま
たは膜結合）成分と相互作用し得る活性なドメインが生
成するというhGH受容体の活性化のモデルを支持するも
のである。これは複合体化した成分の立体配座の本質的
な変化を伴わずに起こることもあるし、こうした変化を
伴わずには起こらないこともある。
最近２つの他のグループが細胞外結合ドメインと錯化
したポリペプチドホルモンを結晶化させている（Lamber
t,G.ら,J.Biol.Chem.264:12730−12736（1989）;Gunthe
r,N.ら,J.Biol.Chem.265:22082−22085（1990））。し
かしどちらも受容体の二量化に関する決定的な証拠を報
告していない。ヒトIL−２はIL−２受容体のヒトp55成
分の可溶性組換え型と主に1:1の複合体として結晶化し
た。ただしジスルフィドで連結した少量のp55二量体も
観測された。架橋試験は機能的なIL−２受容体複合体が
IL−２、p55およびp70と呼ばれるもう１つの受容体成分
の間で形成されるヘテロ二量体であることを示唆してい
る（Saragori,H.ら,J.Immunol.139:1918−1926（198
7）;Ogura,T.ら,Mol.Biol.Med.5:123−138（1988））。
EGF受容体の細胞外ドメイン（EGFbp）は１分子のEGFと
の錯化状態で結晶化されている（Gunther,N.ら,J.Biol.
Chem.265:22082−22085（1990））。結合研究と沈降分
析は溶液における1:1のEGF・EGFbp複合体の形成を示し
ている。これらのデータはホルモンが誘発する二量化を
経るには細胞外ドメインだけでは充分でないことを示唆
している。しかし、これらの結合研究が複合体を沈殿さ
せるために抗EGF受容体ポリクローナル抗体を用いたこ
とに注意すべきである。さらにこれらの結晶化実験と沈
降実験では受容体に対して大過剰のホルモンが用いられ
た。我々の場合、天然のGH受容体に対して生ぜしめたMa
bが二量化を遮断し（図３）、大過剰のhGHがhGH・（hGH
bp）２複合体を単量体複合体に解離させるであろう（図
２、参考資料34）。
この後者の効果は薬学的に重要な意味を含有し得る。
hGHは天然には血清中で5nMを超えるパルスとして生産さ
れ、1nMよりはるかに低いレベルにまで迅速に低下する
（Taylor,A.L.ら,J.Clin.Invest.48:2349（1969）;Thom
pson,R.G.ら,J.Clin.Invest.51:3193（1972）;Ho,K.Y.
ら,J.Clin.Endocrinol.Metab.64:51−58（1987））。し
かしhGHbpは天然には血清中に約0.5〜1nMの一定レベル
で存在する（Baumann,G.ら,J.Clin.Endocrinol.Metab.6
2:134−141（1986）;Herington,A.C.ら,J.Clin.Invest.
77:1817−1823（1986））。このようにhGHはhGHbpより
過剰に律動するので、細胞受容体と相互作用し得る（さ
らにはhGH・hGHbp・hGH膜受容体型を有するヘテロ二量
化複合体をも生産し得る）遊離のhGHと共に、hGHbpとの
1:1の複合体が生産されると予期するであろう。
我々は、hGHがhGHbpと相互作用してhGH（hGHbp）２型
の複合体を作ることを決定し、その結果としての細胞外
受容体ドメインの二量化がこのホルモンに関する体因性
信号変換を開始すると提唱した。補充されたhPLとhPRL
類縁体（実施例４）はhGHbpの二量化を促進しないの
で、我々はhPLとhPRL骨格が、受容体認識および結合に
必要なものとは異なる必須の二量化決定基を欠いている
と結論することができる。関与するドメインの位置を特
定するために、hPLまたはhPRL相同体置換を伴う一連のh
GH突然変異体と２つの欠失類縁体をホルモンが誘発する
受容体の二量化の減少についてスクリーニングした。次
に、より詳細なアラニン走査法によって重要な側鎖を同
定した。
hGHbp変種（S237C）を構築し、蛍光的に標識した。ホ
ルモンが誘発する二量化を監視するために、図８に記載
の如く蛍光クランチングを測定した。このクエンチング
はhGHとhGHbpのモル比が1:2であることを示した（実施
例４）。hLPおよびhPRLセグメント置換を伴う一連の相
同体走査hGH変種を光検定法で試験した（表２）。これ
らのうちの４つはホルモンが誘発するhGHbp二量化に有
意な減少を引き起こした（実施例４）。他の２つのhGH
欠失類縁体では、hGHbp二量化の欠如が第２部位hGHbp結
合の破壊によるものと思われる（表２）。
突然変異hGHbp（S237C−AF）を蛍光的に標識した。図
８に示すように、ホルモンが誘発する二量化を監視する
ために蛍光信号を用いた。10nM濃度に固定したS237C−A
Fに対してhGHを連続的に希釈し、平衡時に蛍光クエンチ
ングを測定した。フルオレセイン標識のホモクエンチン
グはhGHの添加と共に増大し、hGHが0.5モル等量の時点
で最大になった。しかし極めて注目すべきことに、より
高い濃度のhGHではこのホモクエンチングが反転し、過
剰のhGHの存在下でhGH・（hGHbp）２がhGH・hGHbp単量
体複合体に解離することを示した。
hPLおよびpPRLセグメント置換を伴う一連の相同体走
査hGH突然変異体をS237C−AFに基づく検定法で試験した
（表２）。これらのうちの３つ、即ちhPRL（12−19）、
hPRL（54−74）およびhPRL（111−109）は有意な減少を
引き起こした（18、６および＞100倍）。これらの突然
変異体に関する一次部位（部位１）中の欠損が、観測さ
れたhGHbp二量化の減少のほとんどを説明するものと思
われる。さらに、結合親和性を減少させる一次部位決定
基の突然変異（例:R64AおよびK172A/F176A）が二量化を
減少させることも示され、一次部位に関してhGHbp親和
性を増大させることが明らかになったhGH突然変異体（E
174A）が我々の検定法での測定によれば二量化をも増進
させた。相同体走査突然変異体に加えて、hGH欠失類縁
体（欠失１〜８）はhGHbpの二量化を誘発するという能
力の劇的な減少（＞100倍）を示した（実施例４）。ま
た、hGHbp二量化のこの欠如は二次部位hGHbp結合の破壊
によるものと思われた。
二次部位hGHbp結合に関与する特定のアミノ酸特異的
側鎖をアラニン走査によって詳細に調べた（実施例
６）。26アラニン突然変異体の分析により（表３）、２
つの突然変異体のみ（F1AとI4A）がhGHbp二量化の＞10
倍の破壊をもたらし、他の４つ（L6A、R8A、D116A、E11
9A）が＞２倍の破壊をもたらすことが明らかになった。
これらの決定基は一次部位結合にとって重要なものとは
異なる。固定された濃度のS237C−AF（100nM）に連続的
なhGH添加を行う実験と蛍光ホモクエンチングは、hGHが
誘発する二量化に関する迅速な平衡時間（＜３分）と、
引き続いて起こる過剰のhGHによる二量化の反転に関す
る遅い平衡時間（＞30分）を示した。このことは二量化
の反転が脱離速度律速であることを示唆している（作用
機序については実施例６）。
hGH（hGHbp）２結晶の形成は、BlundellおよびJohnso
nが記述している方法（アカデミック・プレス，ロンド
ン（1976））に従ってＸ線結晶学技術を用いるhGH（hGH
bp）２複合体の三次元構造の決定を可能にした。この構
造を図11に記載し、下記実施例７で議論する。図11の構
造は各hGHが２つのhGH受容体またはhGHbpに結合するこ
とを示している。各hGHbpはhGHの異なる部分と接触して
おり、第１のhGHbpは表４に記載のアミノ酸と接触し、
第２のhGHbpと接触しているhGHアミノ酸を表５に示す。
２つのhGHbp間で接触しているアミノ酸を図６に示す。
これらのアミノ酸接触点でhGHの変種を作成し、本発
明の検定法によってそれを検出することができる。hGH
への結合に関与するアミノ酸内、あるいは２つのhGHbp
自体の間のアミノ酸内で同様にhGHbp変種を作成するこ
とができる。このようなhGHbp変種は、野生型hGHとhGHb
pを用いる本発明の検定法を用いて検出することができ
る。
HRGの医薬組成物と投与 貯蔵のために、所望の純度を有する配位子類縁体タン
パク質を随意の生理学的に許容される担体、賦形剤また
は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Science,前
掲）と混合することによって、凍結乾燥ケーキまたは水
溶液の形態で、配位子類縁体またはGHbp抗体の医薬製剤
を調製する。許容される担体、賦形剤または安定化剤は
使用される投与量と濃度で受容者にとって非毒性であ
り、これらにはリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸
などの緩衝剤、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子
量（約10残基未満）のポリペプチド（メトキシド形成を
防止するため）、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫
グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンな
どの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラ
ギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸、グルコ
ース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖
および他の炭水化物、EDTAなどのキレート剤、マンニト
ールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウ
ムなどの塩形成対イオンおよび／またはツウィーン、プ
ルロニクスまたはポリエチレングリコール（EPG）など
の非イオン性界面活性剤が含まれる。
インビボ投与に使用される配位子類縁体またはGHGp抗
体は滅菌状態でなければならない。これは凍結乾燥およ
び再構成の前または後に滅菌濾過膜を通して濾過するこ
とによって容易に達成される。配位子類縁体または配位
子類縁体に対する抗体は通常は凍結乾燥した形態か、溶
液状態で保存されるであろう。
医薬配位子類縁体または配位子類縁体特異的な抗体組
成物は、一般に滅菌注入口を持つ容器（例えば静脈内溶
液バッグまたは皮下注射針で突き刺すことができる蓋を
持つバイアルなど）に入れられる。
配位子類縁体またはGHbp抗体を投与する経路は既知の
方法（例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼球内、
動脈内または病巣内経路による駐車または注入、あるい
は後述の徐放系によるなど）に従う。配位子類縁体を注
入によっ連続的に投与するか、ボーラス注射によって投
与する。GHbp抗体は同じ方法で投与するか、血流または
リンパ液への投与による。
徐放性調製物の好適な例には、タンパク質を含有する
固体疎水性ポリマーの半透過性基盤であって、該基盤が
成型品（例：フィルムまたはマイクロカプセル）の形態
にあるものが含まれる。徐放性基盤の例にはポリエステ
ル、ヒドロゲル［例:Langerら,J.Biomed.Mater.Res.,1
5:167−277（1981）とLanger,Chem.Tech.,12:98−105
（1982）に記述されているポリ（２−ヒドロキシエチル
−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコー
ル）］、ポリラクチド（米国特許第3773919号、EP5848
1）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸ガンマエチ
ルの共重合体（Sidmanら,Biopolymers,22:547−556（19
83）、非分解性エチレンビニルアセテート（Langerら，
前掲）、Lupron DepotTM（乳酸−グリコール酸共重合体
とロイプロリドアセテートからなる注射可能な微小球）
などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、ポリ−Ｄ−
（−）−３−ヒドロキシラク酸（EP133988）が含まれ
る。エチレンビニルアセテートや乳酸−グリコール酸な
どのポリマーは100日以上にわたって分子を放出するこ
とができるが、ある種のヒドロゲルはより短い期間でタ
ンパク質を放出する。封入したタンパク質を体内に長時
間残しておくと、37℃で湿気にさらされた結果としてそ
れらが変性または凝集して、生物学的活性の喪失や免疫
原性の考え得る変化をもたらすこともあろう。関与する
機構に応じてタンパク質を安定化するために合理的な方
法を工夫することができる。例えば凝集機構がチオ−ジ
スルフィド相互変換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であ
ることが判明したとすれば、スルフヒドリル残基を修飾
し、酸性溶液から凍結乾燥し、湿気含量を調節し、適当
な添加剤を使用し、特殊なポリマー基盤組成物を開発す
ることによって安定化を達成することができる。
徐放性の配位子類縁体または抗体組成物には配位子類
縁体または抗体をリポソームに封入したものも含まれ
る。配位子類縁体または抗体を含有するリポソームはそ
れ自体は既知の方法によって調製される（DE3218121、E
psteinら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:3688−3692（198
5）、Hwangら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77:4030−4034
（1980）、EP52322、EP36676、EP88046、EP143949、EP1
42641、日本国特許出願83−118008、米国特許第4485045
号、米国特許第4544545号およびEP102324）。通常リポ
ソームは小さい（約200〜800オングストローム）単層型
であり、その脂質含量は約30モル％コレステロール以上
であるが、その比率の選択は最適な配位子類縁体治療の
ために調節される。増大した循環時間を持つリポソーム
は米国特許第5013556号に開示されている。
変種の使用 天然に存在する配位子の作用を拮抗薬として遮断する
ように作用させるために、本発明の検定法によって選択
される拮抗薬配位子変種を医薬製剤として使用するか、
もしくは形質転換動物内で発現させる。形質転換動物は
新案物として、あるいは実験モデルとして有用である。
他の選択された配位子変種を作用薬として作用させるた
めの医薬製剤に使用し、これを投与することによって天
然に存在するサイトカインによって刺激される応答と類
似する応答を強化または促進する。例えば医薬的に有効
な剤形中にhGH変種を使用する（例えば1988年４月15日
に出願された米国特許第5096885号）。配位子変種は、
それらが望ましくない副作用を軽減または排除する一方
で天然に存在するサイトカインと類似する活性を有し得
るという点で有利であり、糖尿病誘発活性を示さないhG
H変種はそのような例の１つである。作用薬または拮抗
薬として生物学的活性を有さない配位子変種は少なくと
も１つの配位子免疫エピトープを保持しているであろう
から、それらは野生型配位子またはそれらの抗体に関す
る免疫検定法で有用である。
モノクローナル抗体と受容体の刺激 我々はいくつかの抗体がhGH受容体を刺激できること
を決定した。即ち、これら抗体は、３要素複合体を形成
して受容体を活性化するというhGHの能力を模倣する様
式で受容体を架橋することができる。そのような作用薬
抗体の例は本発明時にはすでに知られていたが、hGHの
作用薬として作用するというそれらの能力は認められて
いなかった。好適な抗体はMAb263である（Barnardら,En
docrinology,115:1805−1813（1984）またはBarnardら,
Biochem.J.,231:459−468（1985））。他の抗体には後
述する方法で作成されるMAb3D9および13E1がある。随意
に、意図する宿主中で親抗体よりも免疫原性の低いキメ
ラ型やCDR移動型を作成するためにこれらの抗体を使用
する。これらの抗体は好ましくはヒト受容体に対するも
のである。hGHの作用薬は少なくとも二価でなければな
らない。しかし、１受容体分子にしか結合しないFAb断
片などの一価抗体は拮抗薬として有用である。
いくつかの態様では上記二価抗体が二特異的である。
即ち、抗体の１つの腕が１つの受容体エピトープを指向
し、もう１つの腕が受容体上の別のエピトープを指向す
る。拮抗薬抗体の態様は受容体（好ましくはその受容体
−受容体接触領域）を指向する１つの腕と、GH受容体以
外の抗原を指向するもう１つの腕とを含有することがで
きる。これらの抗体は従来のハイブリドーマ法によっ
て、あるいは従来のハイブリドーマ法によって、あるい
は各腕をコード化する重鎖および軽鎖で組換え細胞を形
質転換する組換え法によって作成される。組換え法によ
って二特異性抗体を作成し、それをアフィニティー精製
によって細胞培養から回収するか、もしくは従来の方法
で抗体を別個に作成し、それらをインビトロで組み合わ
せる。
これらの結果は獣医学の分野ではとりわけ興味深い。
なぜなら能動的免疫化によってGH作用薬を作成するため
に成長ホルモン受容体またはその断片に対して動物を免
疫化することによって上述の抗体をインビボで生じさせ
ることが現在では可能だからである。したがって、受動
的に（外因性の抗体の投与によって）抗体を投与する
か、もしくは受容体での免疫化によって能動的に抗体を
投与する。
作用薬抗体は成長ホルモンとの比較におけるそれらの
親和性に基づく投与量で投与される。哺乳動物に関する
さらなる投与量は後述のラット成長研究から容易に外挿
される。拮抗薬抗体は、充分量の成長ホルモンと競争し
てその有効活性を正常範囲に減じるか、もしくは矮小動
物が目的物であるならば正常未満に減じるように計算さ
れた投与量で投与される。
抗体は上述の配位子類縁体と基本的の同じ様式で投与
される。作用薬抗体はこれまでに成長ホルモンが使用さ
れてきたのと同じ目的のために使用される。
以下の実施例は本発明を実施するにあたって現在知ら
れている最善の方法の例示を意図するものであるが、本
発明がこれらの実施例に限定されると見なすべきではな
い。
実施例１ hGH−受容体複合体の構造 本発明の検定法はhGH−受容体複合体構造、即ち１つ
のhGHと２つのhGH受容体または結合タンパク質が検出し
得る安定な複合体を形成するという発見に基づいてい
る。hGH（hGHbp）２複合体検定法によってこれらの検定
法を例示する。
hGH・（hGHbp）２複合体の結晶化 hGH（22kDa）とhGHbp（28kDa）の間の複合体の結晶
（図1a）を気相拡散（A.McPherson「Preparation and A
nalysis of Protein Crystals」（John Wiley and Son
s,ニューヨーク（1982））によって成長させた。これら
の結晶は少なくとも2.7Åに回折し、ａ＝145.8Å、ｂ＝
68.6Å、ｃ＝76.0Åの単位格子変数を伴う空間群（P212
12）に属する。これらの結晶の非対称単位の体積はその
複合体がhGH・hGHbpもしくは（hGH・hGHbp）２の形態を
取るとは考え難いものである。具体的には、溶媒含量が
単位格子内で1:1複合体については高すぎ（68％）、2:2
複合体については低すぎる（32％）必要があろう。結晶
の典型的な溶媒含量は約50％であるから（Matthews,B.
W.,J.Mol.Biol.33,491−497（1968））、これらの結晶
が成分の非対称な混合物を含有する可能性が最も高かっ
た。
結晶の正確は組成を評価するために、それらを0.1％
トリフルオロ酢酸中で解離させ、変性条件下でクロマト
グラフィーに付した（図1b）。ペプチド結合の吸光度に
対応する214nmで監視したそれぞれのピークの積分によ
ってhGHとhGHbpの量を定量した。４回の独立した決定に
よると、hGHbpピークに対するhGHピークのA214の比率が
0.42±0.02であった。hGH・（hGHbp）２の形態を有する
複合体については、積分したピーク面積に関して予測さ
れる比率が各成分内の残基の数（hGHは191残基、hGHbp
は238残基）に基づいて0.40である。対照実験として、h
GHとhGHbpの1:2混合物は図1Bのように基本的に同じクロ
マトグラムを作り、他方、2:1混合物と1:1混合物は予期
されるように異なるクロマトグラフを作った。したがっ
て、図１の結晶はhGHとhGHbpを1:2のモル比で含有し
た。溶液中で安定な複合体を作るというhGHとhGHbpの能
力は、複合体形成が信頼できる検定変数であるというこ
とを追認するものである。
溶液におけるhGH（hGHbp）２複合体の形成 サイズ排除クロマトグラフィーによって溶液における
hGH（hGHbp）２の存在を立証した。hGHとhGHbpを1:4、
1:3、1:2、1:1および1:0.5で比率で混合し、各成分をス
ーパーロース12FPLCカラムでのゲル濾過によって分離し
た（図２）。hGHとhGHbpの比率が1:4の時（図2A）、そ
れぞれhGH・（hGHbp）２複合体と遊離のhGHbpに対応す
る見かけ上の分子量70kDと30kDの２つのピークが存在す
る。これらのピークの面積はhGHbpの吸光度によって支
配される。なぜならその▲ε0.1％ 280▼はhGH12より2.9
倍高いからである。hGHに関する▲ε0.1％ 280▼は0.82c
m-1であり、純粋な試料の吸光度と組成分析に基づいてh
GHbpについては2.35cm-1である。hGHとhGHbpの比率が1:
3および1:2である時（図2Bおよび2C）、複合体ピークの
形と位置には変化がないが、遊離のhGHbpに対応するピ
ークは徐々に減少して０に近づく。したがって1:2の比
率では、hGHとhGHbpの基本的にすべてが複合体として結
合している。hGHとhGHbpの比率を1:1に調節し、最終的
に1:0.5に調節すると（図2D、2E）複合体ピークの位置
がより小さいサイズ（〜55kD）に移動し、非対称にな
り、遊離のhGHが蓄積するので、hGH・（hGHbp）２、hGH
・hGHbpおよび単量体hGHに対応する種の混合物の存在が
示唆される。これらのピークの全域で採取したタンパク
質試料のSDS−PAGEによって割り当てた組成を確認し
た。もう１つの対照実験では、遊離の成分が単量体タン
パク質として移動し、二量化がこれらの条件下でhGHとh
GHbpの両方の存在を必要とすることを示すことがわかっ
た。したがって複合体の形成を複数の検定法で検出する
ことができ、hGH・（hGHbp）２複合体の形成は細胞受容
体に対するhGH結合の指標として機能する。さらにサイ
トカイン−サイトカイン受容体複合体を形成するサイト
カイン受容体を介して作用するサイトカインはいずれ
も、hGH−hGH受容体複合体と同様に、このような検定法
で評価できる。
実施例２ hGH受容体結合部位 受容体または結合タンパク質についてhGH結合部位を
遮断する抗体を用いて、hGH受容体またはhGH結合タンパ
ク質に関するhGH結合部位の性質を特徴づけた。hGHbp上
の２つの結合部位に関する証拠は下記の通りである。
hGHbpに対するhGHの親和性は典型的にはhGHbpからの
［125I］hGHの置換と、グリコシル化したウサギGH受容
体から作成された抗受容体モノクローナル抗体（MAb5）
による複合体の沈殿によって測定される（Barnard,R.
ら,Endocrinology 115:1805−1813（1984）;Barnard,R.
ら,Biochem.J.231:459−468（1985））。この検定法を
用いることにより、hGHとhGHbpが1:1の複合体を形成し
得ることがスキャッチャード分析によって立証された
（Leung D.W.ら,Nature 330:537（1987）;Fuh G.ら,J.B
iol.Chem.265:3111−3115（1990）;Barnard,R.ら,Endoc
rinology 115,1805−1813（1984）;Barnard,R.ら,Bioch
em.J.231:459−468（1985）;Spencer,S.A.ら,J.Biol.Ch
em.263:7862−7867（1988）;Spencer,S.A.ら,J.Biol.Ch
em.263:7862−7867（1988））。
最近になって、大腸菌から精製されたグリコシル化さ
れていないhGHbpを用いる免疫化によってさらなるMab
（複数）が作成された（Fuh G.ら,J.Biol.Chem.265:311
1−3115（1990））。複合体を沈殿させるためにこれら
の抗hGHbp Mabのうちの２つ（3B7および3D9）を用いる
置換曲線のスキャッチャード分析（図３）は、より高い
結合親和性（KDはMab5の0.4nMに対して0.1nM）と1hGHbp
に対して0.5hGHの化学量論を与える。これらの結果は、
hGH上の第２の部位に結合するためのhGHbp上の決定基を
MaB5が遮断するとすれば説明することができる。Mab3B7
と3D9を用いる検定法における協同性の欠如は1:1複合体
におけるhGHの親和性（Mab5を用いて測定されるもの）
が1:2複合体に関する値（Mab3B7および3D9を用いて測定
されるもの）より約４倍低いに過ぎないという事実を反
映しているものと思われる。スキャッチャードプロット
における上方の屈曲によって正の協同性を捕らえるに
は、はるかに大きく相違する親和性が必要であろう。さ
らに、Mab3B7と3D9は1:1複合体と1:2複合体の両方を沈
殿させ、これが見かけ上の協同性を低下させるに違いな
い。したがってhGH第２結合部位の遮断は1:1のhGH−hGH
bpモル比をもたらし、一方、第２結合部位を遮断しない
抗体は1:2のモル比をもたらす。
hGH上の２つの結合部位に関する証拠は次の通りであ
る。hGHとhGHbpの間の結合決定基の走査突然変異分析で
Mab5を使用した。したがってこれらの研究で同定される
決定基は1:1複合体の形成を調節する上で重要なものを
反映する。このデータに基づいて我々はhGHの非結合性
相同体内にこれらの決定基を装備し、hGHbpと強固に結
合する類縁体を作成した（Cunningham,B.C.ら,Science
247:1461−1465（1990））。例えば野生型ヒトプロラク
チン（hPRL）またはヒト胎盤性ラクトゲン（hPL）はhGH
より105倍または103倍以上弱くhGHbpに結合する。hPRL
中に８つの置換を組み込むことによって（E62S/D63N/Q6
6E/H17D/E174A/N175F/Y176F/K178R;Cunningham,B.C.ら,
Science 247:1461−1465（1990））、あるいはhPL中に
５つの置換を組み込むことによって（V4I/D56E/M64K/E1
74A/M179I）、我々はそれぞれhGHよりわずかに6.2倍ま
たは1.4倍だけ弱くhGHbpに結合する変種を作成した。
これらの変種が１または２分子のhGHbpを結合するこ
とができるかどうかを決定するために我々はゲル濾過を
用いた（図４）。hGHbpとホルモンの比率が2:1の時、hP
RL（図4A）とhPL（図4B）の両結合性変種はhGHbpとの1:
1複合体に対応する２つの対称なピーク（見かけ上の分
子量約55kDa）と、化学量論的に過剰なhGHbpを表すより
低分子量のピーク（30kDa）を示す。同じ条件下で野生
型hGHはhGH・（hGHbp）２複合体に対応する単一のピー
ク（見かけ上の分子量77kDa）をもたらす（図4C）。図4
Cにおける小さいサテライトピークはわずかに過剰なhGH
bpに由来するものである。ピーク組成をSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）によって確認し
た。
化学量論と反応の熱量をさらに評価するために我々は
走査熱量測定法を使用した。なぜなら複合体を分離する
ために抗体やクロマトグラフィーを使用する必要がな
く、溶液中で自由に結合を研究できるからである。固定
した濃度のhGHbp（15μＭ）を含有する溶液にhGHを一部
づつ加え、さらなるエンタルピー変化がなくなるまで反
応の熱量を測定した（図５）。この実験によって我々は
hGHbpに結合するhGHの当量と反応の熱量を決定すること
ができた。
表1aに野生型hGHとhGHおよびhPRLの変種に関する反応
の熱量と滴定終点を要約する。すべてのhGHbpを結合す
るのに必要なhGHの比率は約0.5対１である。さらに、結
合を減少させる（20倍まで）か、もしくは結合を増強す
る（4.5倍）一連の単一アラニン突然変異体は、反応の
エンタルピーの変化を伴いはするが、hGHbpに対して野
生型hGHと同じ結合の化学量論を与える。対照的にhGHbp
に対するhPRLの結合の化学量論は0.85対１である。
これらのデータは総合的にみてhPRLとhPL変種がhGHbp
の二量化にとって重要な決定基を欠いていたことを強く
示している。これらの決定基はhGHの単一アラニン突然
変異体中ではほとんど保存されているが、hPRLまたはhP
L変種中では保存されていない。このことはhGH上にhGHb
pにとっての結合部位が２つあることを示唆している。
これらの部位のうちの１つはそれぞれMaB5免疫沈殿検定
法を用いるhGHbpまたはhGHのアラニン走査突然変異法
（Cunningham,B.C.ら,Scienct 244:1081（1989））によ
って、機能的に詳細に特徴づけられている。hGHとhGHbp
上の第２の部位は未解明のままであったが、これについ
て後述する。
実施例３ hGH−受容体複合体およびスペクトル変化 受容体に対するhGHの結合は各成分にほとんどスペク
トル変化をもたらさない。hGHbpに対するhGHの結合が各
成分の大きな二次または三次構造の変化をもたらすかど
うかを決定するために、我々は複合体形成時の円二色
（CD）スペクトルと蛍光スペクトルの変化を調べた。0.
01M Tris（pH8.0）および200mM NaCl中で約1.0mg/mlの
タンパク質を透析することによって分光光度測定用のタ
ンパク質を調製した。透析後、その溶液を濾過し（0.22
μ,Millipore）、吸光度スペクトルを得た。そのスペク
トルを光散乱についいて補正し（Shauenstein E.,J.Pol
ymer Sci.16:45（1955））、280nmでの吸光度によって
タンパク質濃度を決定した。純粋な試料の組成分析と吸
光度に基づいて、hGHに関する▲ε0.1％ 280▼は0.82cm
-1であり、hGHbpについては2.35cm-1である。hGHはその
４つの螺旋塊構造（Adbel−Meguid S.S.ら,Proc.Natl.A
cad.Sic.USA 84:6434（1987））に特有の強いα−螺旋C
Dスペクトルを示す（Bewley T.A.ら,Arch.Biochem.Biop
hys.138:338−346（1970））。対照的に、hGHbpのCDス
ペクトルは、ジスルフィド結合で連結された主としてタ
ーンとループ（Cleary,S.ら,Biochemistry 28:1884（19
89）;Hilder,R.C.ら,Biophysical Chemistry 31:45（19
88））からなるタンパク質に特有であり、hGHbpは３つ
の隣接して連結したジスルフィド結合を含有する（Fuh
G.ら,J.Biol.Chem.265:3111−3115（1990））。凍結細
胞ペーストを低浸透圧緩衝液（10mM Tris（pH8.0）、1m
M PMSF（Sigma）、2mM EDTA）中で融解した。その懸濁
液をホモジナイズし、４℃で１時間撹拌した後、10000
×ｇで20分間遠心分離した。その上清に固体硫酸アンモ
ニウムを260g/Lの濃度で加え、溶解するまで撹拌した。
タンパク質沈殿物を10000×ｇで30分間の遠心分離によ
って集めた。そのペレットを10mM Tris（pH8.0）、1mM
PMSFに再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析した。透析液
を10mM Tris（pH8.0）中のＱセファロースカラム（Phar
macia）に添加し、0.0から0.5M NaClへの直線的勾配で
溶出させた。hGHbpを含有するピーク分画をhGHアフィニ
ティーカラムに直接充填した。洗浄の後、4M MgCl2、10
mM Tris（pH7.5）を用いてこのカラムを溶出させた。ピ
ーク分画を合わせ、10mM Tris（pH7.5）で透析し、Mono
Qカラムに添加し、洗浄し、10mM Tris（pH7.5）中0.0
から0.2M NaClへの直線的勾配で溶出させた。
hGHとhGHbpを混合する場合、遠UVCDスペクトルはhGH
とhGHbpに関するスペクトルの和と基本的に同一である
（図6A）。この結果は複合体化した時に通常の二次構造
に大きな変化がないことを示している。近UVCDスペクト
ル（図6B）は芳香族アミノ酸側鎖の非対称な環境を反映
する（Bewley,T.A.,Recent Progress in Hormone Resea
rch 35:1555（1979）;Bewley T.A.ら,Archives of Bioc
hemistry and Biophysics 233:219−227（1984））。hG
HとhGHbpのUV吸収スペクトルの間には大きな相違があ
り、これは主としてhGHと比較してhGHbpのトリプトファ
ン含量が高い（それぞれ１対９）結果である。しかしス
ペクトルの強度の増大を除いて、個々のスペクトルの和
は基本的に混合後に得られるものと同一である。
蛍光スペクトルでは、hGHがhGHbpに結合した時に、34
0ナノメートルから334ナノメートルへの青方偏移と蛍光
強度のわずかな減少がある（図７）。ヨウ素クエンチン
グとシュターン・フォルマー分析はホルモン受容体複合
体中のトリプトファンの暴露に減少があることを示して
いる。蛍光クエンチング研究はhGH中のトリプトファン
が感知し得るほどには溶媒にさらされていないことを示
しているので（Bewley,T.A.,Recent Progress in Hormo
ne Research 35:1555（1979）;Bewley T.A.ら,Archives
of Biochemistry and Biophysics 233:219−227（198
4））、これはおそらくhGHを結合した時にhGHbp中の１
またはそれ以上のTrp残基が隠される結果であると思わ
れる。対照的に、hGHbpの突然変異分析はTrp104がhGHへ
の結合にとりわけ重要であることを示している。これら
の分光学的研究はhGHbpに対するhGHの結合時にほとんど
立体配座変化を示さないが、これらの方法は通常の二次
構造の構造的変化（遠UVCD）および芳香族基の位置の変
化（近UVCDと蛍光クエンチング）に偏している。したが
って複合体化した成分と遊離の成分の高解像構造は立体
配座的変化をさらに明らかにするであろう。
実施例４ 検定法と修飾されたhGH 修飾したポリペプチドホルモンを本検定法で評価し
た。一組のhGH残基（F10、F54、E56、I58、R64、Q68、D
171、K172、E174、F176、R178およびV185を含む）はhGH
bpに対する高親和性化学量論的結合を付与する上で重要
であることが知られている（WO90/04788）。hGHbpに強
固に結合するヒト胎盤性ラクトゲン（hPL）類縁体とヒ
トプロラクチン（hPRL）類縁体（それぞれKd＝1nMおよ
び6nM）を同定するべく、これらの決定基をhGHbp結合非
競争的hGH相同体であるhPLとhPRLに装備した。既に議論
したようにhGHはhGHbpと相互作用してhGH（hGHbp）２型
の複合体を作る。採用したhPLおよびhPRL類縁体はhGHbp
の二量化を促進しないので、我々はhPL骨格とhPRL骨格
が最初の受容体認識と結合に必要なものとは異なる必須
の二量化決定基を欠いていると結論することができる。
hGH（hGHbp）２の形成に関与するドメインの位置を特定
するために、hPLまたはhPRL相同体置換を伴う一連のhGH
突然変異体と２つの欠失類縁体を、ホルモンが誘発する
受容体二量化の減少についてスクリーニングした。次に
重要な側鎖をより詳細なアラニン走査法によって同定し
た。
ホルモンが誘発するhGHbpの二量化を定量するため
に、我々はフルオレセインで標識されたhGHbpのホモク
エンチングを測定する高感度な検定法を使用した。突然
変異hGHbp S237Cを構築し、精製し、５−ヨードアセタ
ミドフルオレセイン（５−IAF）と反応させることによ
って蛍光的に標識されたhGHbp（S237C−AF）を得た。こ
こに得られたS237C−AF試薬は1hGHbp分子につき１つの
標識を保持しており、競争結合検定で完全な結合活性を
保っている。フルレセインは重複する励起スペクトルと
放射スペクトルを有するので、この蛍光プローブはこれ
らの分子が互いに接近した時にホモクエンチングを起こ
す。この信号を用いてホルモンが誘発するS237C−AFの
二量化を図８に示すように監視した。
図８には、hGHの連続的添加による10nM S237C−AFの
ホモクエンチングを示す。S237C−AFを結合緩衝液（20m
M tris・HCl（pH7.5）、0.1％BSA、0.02％NaN3）で10nM
濃度に希釈し、1.0mlづつ12×75mmポリプロピレン検定
チューブに分注した。別個に、120mMから0.002mMまでに
わたるhGHの希釈液を作成した。次にhGH希釈液の一部
（10ml）または緩衝液のみをS237C−AFチューブに加
え、平衡化するために暗所で25℃で５時間その混合物を
インキュベートした。インキュベーション後、Shimadzu
RF5000U分光蛍光計を用いて490nmの励起Ｉと512nmの放
射Ｉ（バンド幅はそれぞれ3nmと10nm）で蛍光測定を行
った。３つの読み取り値からF/F0値を計算し、hGH濃度
に対してプロットした。S237C−AFの調製は次の通りで
ある。既に記述したように突然変異体S237C hGHbpを構
築し、精製した。1mg/ml S237Cの溶液を25mMシステイン
HCl、25mM NaHCO3にし、位置237のシステインを脱遮断
するために４℃で２時間インキュベートした。50mM tri
s・HCl（pH8）で平衡化したPD10（Pharmacia）ミニカラ
ムを用いてこのタンパク質を脱塩し、直ちに500mM 5−I
AF（Molecular Probes）と暗所で４℃で16時間反応させ
た。５−IAF添加前の脱遮断されたS237CのDTNB分析はS2
37C1分子につき１遊離チオール基の平均値を示した（22
μＭ遊離SH対17μM S237C）。20mM tris・HCl（pH7.5）
で平衡化したもう１つのPD10ミニカラムを用いて、遊離
の発蛍光団から５−IAFと反応したS237Cを精製した。精
製したS237C−AFの一部を−80℃で保存し、使用する直
前に融解した。S237C−AFの吸着スペクトル分析は、713
00（494nm）と64800（280nm）のモル吸光係数を用い、2
80nMにおける５−IAF吸光度の妨害について補正するこ
とにより、1.0mM S237Cにつき0.84mMのフルオレセイン
結合を示した。
ここで10nM濃度に固定したS237C−AFに対してhGHを連
続的に希釈し、平衡時に蛍光ホモクエンチングを測定し
た。ホモクエンチングはhGHの添加と共に増大し、hGHが
0.5モル当量（5nM）の時に最大（△F/F0＝11％）にな
る。しかし極めて注目すべきは、このホモクエンチング
がより高いhGH濃度で反転することであり、これは過剰
のhHG（即ちhGH/hGHbp＞0.5）の存在下ではhGH・（hGHb
p）２がhGH・hGHbp単量複合体に解離することを示して
いる。ドナー（S237C−AEDANS、ref.）蛍光クエンチン
グとアクセプター（S237C−AF）蛍光増大の両方を測定
するために同一でないドナー／アクセプター対を用いる
実験で示されるように、測定される蛍光ホモクエンチン
グは純粋なフォルスターエネルギー転移を反映する。大
過剰のhGH（＞70nM）の存在下で起こる蛍光測定値のF/F
0＞１への増大は、結合したhGH・S237C−AF複合体に対
して遊離のS237C−AFのより高い非特異的結合によるも
のと思われる。この現象は我々の検定法で得られるIC50
値をわずかにゆがめるかもしれないが（図９）、我々の
分析の基礎である相対的IC50値は影響を受けないはずで
ある。
図９ではhGHが誘発するS237C−AFの二量化に関するIC
50値を決定した。結合緩衝液（20mM tris・HCl（pH7.
5）、0.1％BSA、0.02％NaN3）中のS237C−AF（図８につ
いて説明したように調製したもの）の連続的希釈液（３
倍）を60nMから0.08nMの範囲にわたって調製し、1.0ml
づつを検定チューブに分注した。同様に、hGHを連続的
に３μＭから0.004μＭの範囲にわたって希釈した。hGH
希釈液の一部（10μｌ）（1:2のhGHとS237C−AFのモル
比を与える）と緩衝液のみをS237C−AFの入った検定チ
ューブに加え（３つ一組）、混合し、インキュベートす
ることによって暗所で25℃で５時間平衡化した。平衡
後、既に記述したように（図８）蛍光を測定したが、た
だし励起バンド幅を10nMとした。半最大△F/F0値を与え
るhGHの濃度としてIC50値を計算した。
表２にhGHの様々な相同体置換体および欠失突然変異
体によって誘発されるS237C−AFの二量化に関するIC50
値を示す。hGH突然変異体の同定は△，欠失体、hPL,ヒ
ト胎盤性ラクトゲンによる置換体、hPRL,ヒトプロラク
チンによる置換体として表す。欠失または置換の領域を
括弧内に指定する。IC50値は図２について記述したよう
に決定した。標準偏差は一般に報告する値の＋／−50％
未満である。
最初に、hPLおよびhPRLセグメント置換を用いて一連
の相同体走査hGH突然変異体をS237C−AFに基づく検定法
で試験した（表２）。これらのうちの３つ、即ちhPRL
（12−19）、hPRL（54−74）およびhPRL（111−129）は
ホルモンが誘発するhGHbpの二量化にわずかな減少（そ
れぞれ18、６および＞100倍）を引き起こした。しかしh
PRL12−19とhPRL54−74は一次部位結合にとって非常に
重要な残基を破壊し、この部位に関するhGHbpの親和性
を本質的に減少させることがわかった。これらの突然変
異体に関する一次部位結合の喪失は観測されたhGHbp二
量化の減少の主たる原因であると思われる。実際に、野
生型hGHによるS237C−AFホモクエンチングについて観測
された500pMというIC50は一次部位hGHbp親和性について
報告された値（Kd＝400pM）とほぼ同一である。さら
に、結合親和性を減じる一次部位決定基の突然変異
（例:R64AおよびK172A/F176A）が二量化をも減じること
が示され、一次部位についてhGHbpの親和性を増進する
ことが示されたhGH突然変異体（E174A）は我々の検定法
で測定したとき二量化をも増進する。他の相同体突然変
異体hPRL（111−129）は一次部位結合には影響を与えな
いが、サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した
場合に、90％はhGH・hGHbp複合体のみを形成するが、残
りの10％はhGH・（hGHbp）２を形成するという不均質性
の証拠を示す。比較的無傷な二次部位結合を伴うこの突
然変異体の副分画の存在は、この突然変異体の効果の原
因をタンパク質折り畳みの失敗または翻訳後修飾に帰す
ることができることを示唆している。
相同体走査突然変異体に加えて、２つのhGH欠失類縁
体（１つはＮ−末端から８残基を除去したもの［△（１
−８）］であり、もう１つのは残基32〜46が欠失した天
然の変種（20K hGH;米国特許第4446235号）である）を
試験した（表２）。△（１−８）突然変異体はhGHbpの
二量化を誘発するという能力の劇的な減少（＞100倍）
を示した。この突然変異体は一次部位結合に対してわず
かな効果しか持たないので（Kdmut/Kdwt＝４）、hGHbp
二量化の喪失は二次部位hGHbp結合の破壊によるものと
思われる。
実施例５ hGH変種のアラニン走査 二次部位hGHbp結合に関与する特定の側鎖を解明する
ために、△（１−８）、hPRL（11−19）およびhPRL（11
1−129）突然変異体で同定されたドメインをアラニン走
査によって詳細に調べた。ブタ成長ホルモンのＸ線結晶
構造によれば相同体置換によって同定された２つのドメ
インは螺旋であり、かつ、高度に両親媒性であるので、
われわれはスクリーニングする突然変異体を、残基が溶
媒にさらされていると思われるこれらの螺旋の親水性表
面に位置するものに集中させた。これらのドメインに加
えて、Ｃ−末端付近の３突然変異体（E186A、S188Aおよ
びF191A）をもスクリーニングした。なぜならこの領域
における適当な相同体置換類縁体がなかったからであ
る。
26種の一組のアラニン突然変異体（表３）から、hGHb
pの二量化に大きな破壊をもたらす２つの突然変異体F1A
とI4A（それぞれ33倍と56倍）と、≧２倍の減少を引き
起こす他の４種（L6A、R8A、D116A、E119A）を見つけ
た。アラニン走査はＮ−末端ドメイン中のF1AとI4Aに隣
接する残基が螺旋ＡとＣのＣ−末端ドメイン中の残基と
共に、二次部位hGHbp結合に有意な寄与をしないことを
示している。Ｎ−末端ドメインからF1とP2を削除したhG
H類縁体［△（1,2）］から得られる追加のデータは、△
（1,2）がF1Aのみの場合以上には二量化を破壊しないこ
とを明らかにし、このことはＮ−末端アミンまたはカル
ボニル基ではなくフェニルアラニン側鎖が重要であるこ
とを示している。アラニン走査分析は、二次部位hGHbp
結合と受容体の二量化に最も寄与するhGH決定基がF1お
よびI4の疎水性側鎖であることを明らかにしている。こ
れらの決定基は、主として親水性を示す（Boutin J.M.
ら,Cell 69:（1988））多くの残基（Matthews,B.W.,J.M
ol.Biol.33:491−497（1968））からなる一次部位結合
にとって必須なものとは著しく異なる。
表３に、アラニン置換したhGH突然変異体によって誘
発されるS237C−AFの二量化に関するIC50値を示す。突
然変異体は野生型残基とアミノ酸配列中での位置及びそ
れに続く突然変異体残基（この場合にはアラニン）で命
名されている。一文字コードによって指定されるアミノ
酸はA,Ala;C,Cys;D,Asp;E,Glu;F,Phe;G,Gly;H,His;I,Il
e;K,Lys;L,Leu;M,Met;N,Asn;P,Pro;Q,Gln;R,Arg;S,Ser;
T,Thr;V,Val;W,Trp;Y,Tyrである。発現されない突然変
異体をNEと指定する。IC50数は図２に記述の如く計算す
る。標準偏差は一般に報告する値の＋／−50％未満また
は表示の通りである。
実施例６ 蛍光のホモクエンチング 固定した濃度のS237C−AF（100nM）に対してhGHの逐
次的な添加を行うと、実時間で監視した蛍光ホモクエン
チング（実施例４）は、hGHが誘発する二量化に関する
速い平衡時間（＜３分）と、引き続いて起こる過剰のhG
H（即ちhGH/hGHbp＞0.5）による二量化の反転に関する
遅い平衡時間（＞30分）を示す。このことは、二量化の
反転が、 （ここでは化学量論的な結合がhGH過剰の条件下で二量
化と競争する） とい機序に従う脱離速度律速であることを示唆している
（Ｈ＝hGH、Ｒ＝遊離のhGHbp、R1＝一次部位hGHbp、R2
＝二次部位hGHbp）。我々は一次部位の化学量論的結合
が起こり、それゆえにこれがhGH（hGHbp）２複合体の形
成と競争するに違いないことを知っている。化学量論的
二次部位結合が起こり得るかどうかを決定するために、
一次部位を除去するように工作した類縁体を、二量化に
関して競争する能力について試験した。hGHbp親和性を5
00倍減少させる一次部位の中央部の突然変異を伴う二重
突然変異体K172A/F176Aは二次部位を保持している。図1
0はhGHbpの二量化が160倍過剰（800nM）の存在下でさえ
過剰のK172A/F176Aによって反転し得ないことを示して
いる。対照的に、工作された一次部位を含有し、二次部
位決定基を欠く既知のhPL変種は20nM（４倍過剰）のIC
50で効率よく二量化を遮断する。このデータは化学量論
的な二次部位結合が起こらないということと、二量化
が、 という逐次的な結合機序によって進行しなければならな
いということを立証している。
二次部位hGHbp結合は化学量論的な一次部位複合体の
形成を必要とするので、この結合事象はhGHのみではな
くhGH・（hGHbp）中に存在する決定基に依存しなければ
ならない。したがってこれらの決定基は一次部位hGHbp
および／または最初のhGHbp結合事象によって引き起こ
される立体配座変化から導入されなければならない。
実施例７ Ｘ線結晶学に基づくhGH−hGHbpアミノ酸相互作用 hGH（hGHbp）２結晶の形成は、BlundellおよびJohnso
n（Academic Press,London,1976）に記述されている方
法に従ってＸ線結晶学的技術を用いてhGH（hGHbp）２複
合体の三次元構造を決定することを可能にする。反復種
晶添加と静置滴における蒸気拡散の組み合わせを用いて
この複合体の結晶を成長させた。わずかに2:1モル過剰
になるようにmet-hGHにhGHbpを添加することによって結
晶貯蔵液を調製し、これを４℃で24時間インキュベート
した。次に複合体を濃縮し、120mM NaCl、20mM酢酸ナト
リウム（pH5.5）、1mM PMSFを用いて平衡化したサイズ
排除カラム（G75−120 Sephadex（Sigma））に充填し
た。次に複合体を含有する分画を貯蔵し、濃縮し、50mM
酢酸ナトリウム（pH5.5）、1mM PMSFに脱塩した。得ら
れた貯蔵溶液中の複合体の濃度は4mg/ml（E280（0.1
％）＝1.67cm-1）であった。0.1M Bis−tris（pH6.5）
を用いて複合体の貯蔵液を1.7mg/mlに希釈し、これに飽
和硫酸アンモニウム（超純粋（Schwarz−Mann））を加
えて10％飽和溶液を調製した。MPD（Aldrich）を加えて
最終濃度１％にした。次にピペットを用いてこの混合物
の50μｌをPyrexガラススポットプレートに移し、150mm
×25mmプラスチック培養皿中で40％飽和硫酸アンモニウ
ムに対して室温で２日間平衡化させた後、種結晶を導入
した。45kV、110mAで作動する回転アノード発生器上で
2.7Åに回折する1mm×0.5mm×0.1mmの大きさの結晶が２
週間以内に得られた。
hGH（hGHbp）２結晶構造の三次元ポリペプチド構造を
図11に示す。太い線で描かれた中央上部の領域はhGH分
子を表し、アルファ螺旋を明確に見ることができる。こ
のhGH分子は２つのhGHbp分子（１つは左側にあり、もう
１つは右側にある）に結合している。これらのhGHbp分
子のそれぞれは単一鎖によって連結された２つのドメイ
ンを有する。上部ドメインはhGH分子と同じ高さにあ
り、もう１つのドメインは垂直方向を向いており、この
図の底部に向かって突き出している。hGHbpの後者の２
つのドメインは図11の最底部で互いに接触している。底
部におけるこの接触は２つのhGHbp分子の間で唯一の接
触領域を構成しており、この接触点について後述する。
この構造に基づいて、相互作用する３つのポリペプチド
のアミノ酸の分析を行った。これらは次の３つのカテゴ
リーに分類される:1）表４に列挙するhGHとhGHbp1（最
初に結合するhGHbp）の間の相互作用;2）表５に列挙す
るhGHとhGHbp2（２番目に結合するhGHbp）の間の相互作
用；および３）表６に列挙する複合体中の２つのhGHbp
間の相互作用。表４と表５は表示する唯一のhGHbpアミ
ノ酸に結合している唯一の個々のhGHアミノ酸を開示し
ている。結合している特定の部分と化学的相互作用の性
質をも列挙してある。命名法は標準的な一文字標記に従
い、アミノ酸の番号は天然のhGHまたはhGHbpのアミノ末
端から番号を付与したものである。表４、５および６中
の残りの用語は次の通りに定義される:MC＝主鎖、SC＝
側鎖、SS＝ジスルフィド、HB＝水素結合、SB＝塩橋、VW
＝ファン・デル・ワールス。これらの表は部位１および
部位２が作用するすべての残基を網羅したものではな
い。
実施例８ hGH受容体を刺激するためのモノクローナル抗体の使用 本発明の検定法を用いて成長ホルモン受容体に対する
モノクローナル抗体をスクリーニングすることができ
る。次いで得られたモノクローナル抗体を、成長を促進
する相対的能力についてインビボで評価することができ
る。グリコシル化されたラットおよびウサギ受容体を免
疫原として用いてモノクローナル抗体MAb263（Agen Bio
chemical,オーストラリア，クイーンズランド）を作成
した。下垂体切除ラットに、ラット中155μg/KgのhGH投
与量に対してモル基準で等価な投与量でMAb263を毎日皮
下注射したところ、図12に示すように有意な体重増加が
あった。
それぞれ８匹のラットからなる２つの群に、MAb263
（1.05mg/kg）と共に、あるいはMAb263なしで、賦形剤
緩衝液（10mM Tris（pH8）、0.1％牛血清アルブミン）
を与えた。要求に応じて水と食物をラットに与えた。毎
日の体重を図12に示す。第６日の終了時にラットの体重
を測定し、その結果を次の表７に示す。
したがって体重増加を得るために成長ホルモン受容体
に対するモノクローナル抗体を投与することができる。
実施例９ 作用薬または拮抗薬活性に関する細胞検定法 細胞に基づく新規な生物活性検定系を本明細書に記載
する。これはホルモンまたはサイトカイン受容体（例え
ばEPO、アルファ−インターフェロン、ベ−タ−インタ
ーフェロン、GM−CSF、Ｃ−CSF、プロラクチン、胎盤性
ラクトゲン、インターロイキン２、３、４、６または７
の受容体など）にそのＣ−末端で解放されたGH受容体の
細胞外GH結合ドメインからなるハイブリッド受容体（米
国特許第4859609号）形質転換細胞系に基づき、該細胞
系は通常はホルモンまたはサイトカインに対して応答性
であり、また通常はホルモンまたはサイトカインの受容
体を含有する。通常、そのＮ−末端でGH受容体断片に融
合されたホルモンまたはサイトカイン受容体の貫膜およ
び内部原形質部分のみを使用する。該細胞の応答特性
は、例えば分析物の放出（例：脱顆粒）、有糸分裂性、
増殖、膜特徴の変化などの測定可能な特徴である。
hGH受容体は血液形成起源の受容体の大きなファミリ
ー（７）に属し、このファミリーにはインターロイキン
−３（IL−３）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−CS
F）受容体が含まれる。Nagataとその共同研究者ら
（８）は、全長ネズミＧ−CSF受容体でトランスフェク
ションされたIL−３依存性骨髄性白血病細胞系（FDC−P
1）がIL−３を伴わないＧ−CSFの添加によって増殖する
ことを明らかにした。あるハイブリッド受容体（米国特
許第4859809号および5030576号）は大阪バイオサイエン
ス研究所のEtsko Ishizaka−IkedaおよびShigekazu Nag
ata博士によって構築されたものであり、これはＧ−CSF
結合ドメインを欠くが３つの細胞外フィブロネクチン反
復、貫膜ドメインおよび細胞内ドメインを含有する型の
mG−CSF受容体に連結したhGHbpを含有する。フィブロネ
クチンドメインはＧ−CSFの結合に関与しないが、mG−C
SF受容体の良好な発現には必要である（８）。
mG−CSF受容体のエクソン７から15（これは３つのフ
ィブロネクチンドメインと貫膜および細胞内ドメインの
全体をコード化する）に連結したhGH受容体のエクソン
１から５まで（これは分泌シグナルと細胞外hGH結合ド
メインをコード化する）を含有するcDNAからハイブリッ
ド受容体を構築した。hGH受容体に由来する配列（Leung
D.ら,Nature 330:537（1987））をPCRによってベクタ
ーpBOS−162（８）中にクローン化し、これによってFDC
−P1細胞における該ハイブリッド受容体の発現を可能に
した。２つの受容体断片の連結部にひとつのシステイン
を作った。安定なFDC−P1細胞系のトランスフェクショ
ンと培養は後述の通りである。
１細胞あたりのおよその受容体数と親和性を立証する
ために、全細胞上のハイブリッド受容体からの［125I］
hGHの競争的置換を用いた。IL−３で成長させた細胞を
検定の前にリン酸緩衝化食塩水（PBS）＋10％FBSで洗浄
した。20pM［125I］hGH（Y103A）の存在下でhGHの連続
的希釈液と共に細胞を４℃で18時間インキュベートした
（1.2×106/ml）。次に過剰の標識を除去するために細
胞をPBSで２回洗浄した。第2hGHbpの結合を部分的に遮
断し得るY103のヨウ素化を防止するためにY103Aを用い
た（９）。
数回の独立した結合実験において、hGHに関する見か
け上のKd値は0.1±0.03nMであり、１細胞につき1000±3
00個の受容体があった。この親和性は可溶性hGHbpに対
するhGH結合より約３倍強く、細胞上の受容体に対するh
GHの結合に関する親和力効果の反映であり得る。トラン
スフェクションされなかった細胞はhGHに関する特異的
結合部位を欠いた（９）。図13は細胞増殖を誘発すると
いうhGHの能力に対する増大するhGH濃度の効果を示して
いる。低濃度においてhGHはこの検定法で強力な作用薬
として作用し、そのEC50は〜20pMで、この値は全細胞上
の見かけ上のKd（〜100pM）よりいくらか低い。これは
最大細胞増殖が100％の受容体占有未満で起こり得るこ
との反映であり得る。
突然変異分析（3,4）と構造研究（５）は各hGH分子が
hGHbpを結合するための２つの別個の部位を含有する点
で二価であることを示している。対照的にhGHbpは、hGH
上の部位１または部位２に結合するために基本的に同じ
決定基を使用するので、実際上一価である。過剰なhGH
はhGH・（hGHbp）２複合体を解離させて、hGHが専ら部
位１を介してhGHbpに結合しているhGH・hGHbp複合体を
形成させるであろう。したがって我々は過剰なhGHが拮
抗信号であるに違いないと推定した（図１）。実際に極
めて高いhGH濃度では増殖活性が失われる（IC50＠２μ
Ｍ）。IL−３が誘発する細胞増殖は高いhGH濃度（８μ
Ｍ）の存在下でも変化せず、hGHが細胞増殖にとって毒
性でないことを示している。作用薬変曲点または拮抗薬
変曲点はいずれも細胞密度に依存せず（図13）、この効
果が細胞間の架橋受容体または他の細胞−細胞相互作用
を伴わないことを示している。さらに全長mG−CSF受容
体を含有するFDC−P1細胞はhGHに応答しないし、ハイブ
リッド受容体を含有する細胞もＧ−CSFに応答しない。
実施例10 ハイブリッド受容体細胞増殖検定を信号化するための
hGHbpの二量化にとっての必要条件をさらに調べるため
に、我々はhGHbpに対する二価モノクローナル抗体（MA
b）とそれらに由来する一価断片（FAb）を使用した。低
濃度の４つの異なる抗受容体MAbのうち３つの増大する
濃度の添加が、細胞増殖の誘発に関してhGHと同じぐら
い強力であった（表８）。
MAb5および263はAgen,Inc.（ニュージャージー）から
得たものであり、Watersとその共同研究者らによって記
述されている（Barnard,R.ら,Endocrinology 115:1805
−1813（1984）;Barnard,R.ら,Biochem.J.231:459−468
（1985））。MAb13E1と3D9はGenentechのハイブリドー
マグループから得たものであり、その性質は他の文献に
記述されている（３）。簡単に述べると、プロテインＡ
−セファロースに対する結合と0.1M酢酸塩（pH3.0）に
よる溶出によってマウスの腹水からMAbを精製した。ジ
チオスレイトールで活性化したPBS中のパパイン＋10mM
システインでMAbを１時間処理（50:1重量MAb/重量パパ
イン）することにより、FAb断片を調製した。0.1Mヨー
ドアセタミドの添加によって消化を停止させた。Fcと残
存MAbをプロテインＡ−セファロースに２回吸着させ、
次いでスーパーロース12（Pharmacia）でのゲル濾過に
よって除去した。
各MAbに関するEC50値（0.3ないし1nM）は通常、ELISA
によって決定したKdよりいくらか低い値であった（表
８）。hGHの場合と同様に、これは全細胞に対する親和
性効果および／または最大信号化が100％受容体占有未
満で達成されることの反映であろう。はるかに高い濃度
（20nMないし＞10μＭ）では３つのMAbのうち２つが活
性を失った。これはおそらく過剰のMAbがhGHbpへの一価
結合ゆえに受容体の架橋を遮断するからであろう。対応
する一価FAb断片は基本的に不活性であり（表８）、信
号化活性にとって二価性が必要であることをさらに示し
ている。
これらのMAbに関する用量応答曲線の相違は、それら
がhGHbpに結合する方法の相違によって説明することが
できる。MAb5は、おそらく両受容体が互いに接触する領
域に結合することによって（11）、hGH・hGHbp複合体に
対する第2hGHbpの結合を防止する。MAb5が最も効率が低
いという事実は最大信号化にとって受容体が互いに密接
に接近する必要があることを示しているのであろう。MA
b13E1はhGH結合（11）を遮断し、hGHの効果を模倣す
る。このMAbは広い平坦部を示し、拮抗性相を示さな
い。これはおそらく我々が観測し得るほどに高いMAb濃
度に達し得なかったためであろう。我々はこの中和MAb
がhGHと同様に結合して極めて安定な受容体二量体を形
成するのであろうと考える。対照的に、MAb263と3D9は
ホルモン−受容体境界から離れたところに結合し、類似
する作用薬相と拮抗薬相を示す。これら２つの相はhGH
ほどには広く離れていない。これはおそらく二量体が最
適な受容体−受容体接触を伴わないからであろう。MAb2
63と3D9が作用薬であるという事実は、活性な二量体を
形成するための構造上の必要条件がかなりルーズである
ことを示唆している。
MAb13E1またはMAb5に由来するFAb断片はhGHが誘発す
る細胞増殖に拮抗するが、MAb263と3D9に由来するもの
は拮抗しない（表９）。これらの研究はMAb13E1とMAb5
に関するエピトープがホルモン−受容体または受容体−
受容体境界を遮断するという事実と合致している。
実施例11 二量化のためのhGH上の構造的な必要条件をさらに決
定するために（図11）、我々は部位１または部位２に対
する受容体の結合を減じるように設計したhGHの突然変
異体を試験した。部位２決定基は保存しているが部位１
中の重要な側鎖（12）が変化している二重突然変異体
（K172A/F176A）は細胞増殖を促進するが、EC50は野生
型hGH（表８）より約103倍高い濃度に移動する。このこ
とはインビトロで測定した部位１結合に関するKdの500
倍の減少と合致する（12）。我々はK172A/F176Aでの滴
定において不活性相を観測し得るほど高い濃度には達し
得なかった。単一hGH突然変異体（G120R）は機能的な部
位１を保持しているが、部位２を立体的に遮断する。こ
の突然変異体は基本的にいずれの濃度でも不活性であ
る。したがって、細胞増殖を促進するには部位１または
部位２のいずれかに対する結合が必要であるが、それだ
けでは十分でない。
逐次的な信号化機序は、部位２結合が遮断されている
（しかし部位１結合は遮断されていない）突然変異体が
hGHの誘発する細胞増殖に拮抗するはずであることを予
測させる。このことを調べるために、我々は最大細胞増
殖の90％を支持するに足るhGH（1nM）＋増大する濃度の
野生型hGHまたは部位１（K172A/F176A）もしくは部位２
（G120R）の突然変異体と共に細胞を培養した。我々の
予期した通り、部位２突然変異体はhGHに拮抗するが、
部位１突然変異体は全く効果がない。実際に、部位２突
然変異体は拮抗薬として野生型hGHより100倍近く強力で
ある（IC50はG120Rについて20nMであり、hGHについて２
μＭである；表９）。これは我々にとっては意外なこと
ではない。なぜならいったんG120Rが結合すれば、受容
体を二量化し、作動させることができないからである。
したがってG120RとhGHの間の競争は部位１を介する遊離
のホルモン分子結合にさらに制限される。対照的に、hG
Hが拮抗性遊離ホルモンであるためには結合したhGH中間
体が反応する前に占有されていない受容体と反応する必
要がある。これは高濃度のhGHを必要とする。
G120RはhGHよりはるかに良好な拮抗薬であるが、50％
の拮抗性に必要な突然変異体の濃度はこの検定法ではhG
Hより約20倍高い（表９）。これは、単量体G120R・受容
体複合体におけるG120RよりもhGHが二量体hGH・（受容
体）２複合体に強固に結合するという事実の反映であろ
う。あるいは最大の信号化が100％の受容体占有を必要
としないのかもしれない。いずれの場合にもG120R突然
変異体における部位１の親和性を改善すれば、より強力
な拮抗薬になるであろう。
部位１を介してhGHbpにより強固に結合するhGH変種が
突然変異法によって作成されている（4,13）。これらの
変異の組み合わせ（H21A/R64K/E174A）はhGHbpに30倍強
固に結合する。この変種はhGHと同等のEC50を持ってい
たが、自己拮抗性に関するIC50はhGHより約30倍低かっ
た。このことは、結合したホルモン−受容体中間体上の
部位２と可溶性ホルモン上の遊離の部位１の間の競争に
よって自己拮抗性がもたらされるという概念と合致す
る。部位１結合の改善がこのホルモンを作用薬として改
善しなかったという事実は、受容体の二量化が律速であ
ること、および、それゆえに部位１と部位２の両方に作
用薬突然変異を導入することが望ましいことの反映であ
り得る。我々はこの変種がG120Rを含有するようにさら
に突然変異させた。この４突然変異体変種はhGH拮抗薬
としてG120Rより10倍強力であった（図14、表９）。こ
れは拮抗性にとって部位１結合親和性が重要であること
のさらなる証拠である。
我々の研究は、hGH、MAbおよびそれらの誘導体によっ
てもたらされる拮抗性または自己拮抗性が受容体二量化
の遮断の結果であって、受容体の下方調節の結果ではな
いことを示している。第１に、hGHの代わりにIL−３で
増殖させた細胞は、より高いhGH応答またはhGH受容体数
を示さない。受容体の下方調節は通常、受容体の活性化
と強固に共役している。この場合、hGHに関する用量応
答曲線の拮抗性部分が（１μＭではなく）生理学的に関
連のあるhGH濃度で始まることを予期することができ
る。さらに、MAbとhGHのそれぞれに関するIC50に対する
EC50の比率は広範に変化し、受容体の活性化が単に結合
特性を変化させるだけで阻害から容易に脱共役し得るこ
とを示している。最後に、G120R突然変異体は不活性で
あるがhGHより強力な拮抗薬であり、G120Rによる細胞の
予備処理はその拮抗性効果を増進させない。したがって
G120Rの拮抗性効果は単純な受容体下方調節とは合致し
ないのである。高濃度で自己拮抗性を発揮する他の配位
子が受容体二量化の遮断に関与し、これが本発明の実施
に有用な配位子を同定するための追加の基礎として働く
ことが考えられる。
引用文献 1.Melmed,S.,New Engl.J.Med.322:966−977（1990）;Fr
ohman,L.A.,J.Clin.Endo.Metab.72:1175−1181（1991） 2.Wells,J.A.ら,Recent Prog.Hormone Res.52（印刷
中）（1992） 3.Cuningham,B.C.ら,Science 254:821−825（1992） 4.Cuningham,B.C.ら,Science 244:1081−1085（1989） 5.de Vos,A.M.ら,Science 255:306−312（1992） 6.Yarden Y.ら,Ann.Rev.Biochem.57:443（1988）;Ullri
ch A.ら,Cell 61:203（1990） 7.Bazen,J.F.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:6934（199
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Patthy,L.Cell 61:13（1990） 8.Fukunaga,R.ら,EMBO J.10:2855−2865（1991） 9.Bass,S.H.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:4498−45
02（1991） 10.Cuningham,B.C.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:34
07−3411（1991） 11.Cuningham,B.C.ら,Science 247:1461−1465（1990） 12.Elbergら,JBC.265:14770（1990） 13.N.Itohら,Science 247:324（1990）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マルケリン，ミッシェル・ジー アメリカ合衆国カリフォルニア94002、 ベルモント、アーバー・アベニュー2028 番 (72)発明者 ウルッチ，マーク アメリカ合衆国カリフォルニア94941、 ミル・バレー、ショーライン403番 (72)発明者 ウェルズ，ジェームス・エー アメリカ合衆国カリフォルニア94010、 バーリンゲーム、コロンバス・アベニュ ー1341番 (56)参考文献 国際公開91／005853（ＷＯ，Ａ１) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．244，Ｐ. 1081−1085（1989) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．247，Ｐ. 1461−1465（1990) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ある候補物質が単量体ポリペプチドホルモ
    ンである成長ホルモン、胎盤性ラクトゲンまたはプロラ
    クチンのうちいずれか１つの配位子拮抗薬または配位子
    作用薬であるかどうかを決定するための方法であって、 （ａ）該候補物質を作用または拮抗されるべき配位子の
    受容体と接触させ、 （ｂ）１つの配位子分子と２つの同じ受容体分子からな
    る３要素複合体の形成について検定する、 ことからなる方法。
  2. 【請求項２】複合体を蛍光エネルギー転移、熱量測定
    法、沈降平衡、ゲル濾過または電気泳動によって検出す
    る請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】候補物質が配位子のアミノ酸配列変種であ
    る請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】段階（ａ）において候補物質を天然の配位
    子の存在下で受容体と接触させる請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】天然の配位子が1:1のホルモン：受容体複
    合体を形成するが、1:2のホルモン：受容体複合体を実
    質上形成することができない場合に、候補物質が拮抗薬
    であることを決定する段階をさらに含む請求項４記載の
    方法。
  6. 【請求項６】候補物質型が天然の配位子を1:2の複合体
    から置換させる場合に、その候補物質が作用薬であるこ
    とを決定する段階をさらに含む請求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】受容体が配位子受容体の細胞外ドメインで
    ある請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】受容体が蛍光標識によって標識されてお
    り、その標識のホモクエンチングによって複合体の形成
    を検出する請求項１記載の方法。
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