JPH06507632A - 成長ホルモンアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 成長ホルモンアンタゴニスト 本出願は、１９８９年ｌＯ月１２日付けのＵＳＳＮＯ７／４１９．５６１の一部 継続出願である、１９９０年ＩＯ月１２日付けのＰＣＴ／ＵＳ　９０１０５８７ ４の一部継続出願である、現在係属中の、１９９１年５月１日付けのＵＳＳＮＯ Ｖ／６９３．３０５の一部継続出願であり、これらをすべて参照によりここに組 み込まれるものとする。

本発明は、新規な成長ホルモン、特に動物の成長を抑制するか、さもなくば内因 性成長ホルモンの作用と拮抗する突然変異タンパク質のウシ成長ホルモンに関す るものである。これらの類縁体はトランスジェニック動物において発現させるこ とができ、それにより該動物は“低下した成長”の表現型を獲得する。

情報の開示 ウシ成長ホルモン（ＧＨ）は下垂体前葉で天然において合成される１９１個のア ミノ酸からなるタンパク質である。成熟タンパク質の分子量は約２２．０００ダ ルトンであるが、初めはアミノ末端に２６個の追加のアミノ酸を有するプレ成長 ホルモンとして作られる。このリーダー（またはシグナルペプチド）は、通常、 ウシ下垂体細胞からの該ホルモンの分泌中に開裂される。自然界には数種類の形 態の成熟タンパク質が存在している。Ｎ末端は（分泌中の開裂部位の変動のため に）変化することがあり、その結果成熟タンパク質はＮ１（ｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ −ＰｒｏまたはＮＯｘ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏのいずれかで始まる。さらに、１２６位 のアミノ酸は、明らかにウシ個体群の対立遺伝子変異の結果として、ロイシンま たはバリンのいずれかであり得る。

ウシへのｂＧＨの外因的投与はミルク生産、飼料効率、成長速度、および赤身対 脂肪比を増加し、肥育期間を短縮する。

ｂＧＨは組換えＤＮＡ法により生産された。例えば、Ｆｒａｓｅｒ。

米国特許第４．４４３．５３９号（酵母）　；　Ｂｕｅｌｌ、　ヨＯツバ特許出 願第１０３、３９５号（細菌）　；　Ｋｒ１ｖｌ、ヨーロッパ特許出願筒１９３ ．５１５号（細菌）　；　［０ｐｃｈｉｃｋ、　ヨーロッパ特許出願筒１６１． ６４０号（カプセル化マウス細胞を動物に移植した）　；　ＤｅＢｏｅｒ、ヨー ロッパ特許出願筒７５．４４４号（細菌；有害な二次構造を排除するように修飾 した遺伝子）を参照されたい。これは部位特異的突然変異誘発によるｂＧＨの類 縁体の生産を容易にした。かくして、Ａｖｉｖの英国特許第２．０７３．２４５ 号は、Ｅ、　ｃｏｌｉによるＭｅｔ　Ｐｒｏ　（ｄｅｓ　Ａｌａ）　ｂＧＨ。

Ｍｅｔ　Ａｒｇ　（ｄｅｓ　Ａｌａ）　ｂＧＨ、Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ　（ｄ ｅｓ　Ａｌａ）　ｂＧＨ、およびｄｅｓ　（ＡＩａ’Ｐｈｅ”−Ｐｒｏ’−Ａｌ ａ’）　ｂＧＨの生産を開示している。Ｂｒｅｍｓ＋ｅｔ　ａｔ、、　ＰＮＡＳ 　（ＵＳＡ）　８５：３３６７−７１　（１９８８）は、ｂＧＨの第３αヘワツ クスの疎水面を延長したｂＧＨ突然変異体に１１２Ｌの作製を報告した。この突 然変異体の９６−１３３フラグメントも作製された。

ｂＧＨのタンパク質分解フラグメントの生物学的活性も研究されている。Ｂｒｅ ｍｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２６：７７７４　（１ ９８７）；５ｗ１ｓｌｏｃｋｉ、ｅｔ　ａｌ、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、 ８７：９００　（１９７０）；　Ｐａ１ａｄｌｎｉ。

ｅｔ　ａｔ、、　ＴｌＢ５．２５６　（Ｎｏｖ、　１９７９）　、アミノ酸９６ −１３３を含むｂＧＨのフラグメントは、成長促進検定において、ｂＧＨ１−９ ５およびｂＧＨ１５１−１９１よりも優れている。Ｈａｒａ、　ｅｔａｌ、、　 ＢｉｏｃｈｅＩＩｌｉｓｔｒｙ、　１７：５５０　（１９７８）；　Ｓｏｎｅｎ ｂｅｒｇ、米国特許第３゜６６４、９２５号および同第４．０５６．５２０号； 　Ｃｈｅｎ　ａｎｄ　Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ、、　２５０：２５１０−１４　（１９７７）。ｈＧＨ のアミノ末端がら誘導されたオクタペプチドは低血糖活性をもっことが見いださ れた。

Ｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　２３：９４３−９４９　（１９ ７４）を参照されたい。しかし、これは成長に何の影響も与えない。同様の結果 がフラグメントｂＧＨ（９６−１３３）の場合にも観察された。Ｇｒａｆ、　ｅ ｔａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　６４：３３３−３４０　（ １９７６）；　Ｈａｒａ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１７：５５０−５６　（１９７８）。

ｂＧＨの類縁体は、他の成長ホルモンの既知の類縁体と同様に、成長促進活性が いろいろに変化した。しがしながら、成長抑制活性を有する成長ホルモン類縁体 はこれまでに報告されたことがない。

種々のトランスジェニック動物が作られている。Ｈａ＋ｕ＋ｅｒ＋　ｅｔａｌ、 、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１５：６８０−６８３　（１９８５）　（ウサギ、ヒツ ジおよびブタ）。これらの動物のいくつかに成長ホルモンを発現させ、そしてト ランスジェニック動物の成長促進が報告された。Ｐａ１ｎｔ　ｔｅｒ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３００：６１１　（１９８２）は、ラット成長 ホルモンの構造遺伝子に融合させたマウス・メタロチオネイン■遺伝子のプロモ ーターを含むＤＮＡフラグメントを、マウス受精卵の雄性前核に、顕微注入した 。遺伝的に改変された接合体から発生したトランスジェニックマウスのいくつか は、対照マウスよりも実質的に高い成長速度を示した（要するに、遺伝的に改変 されたマウスは動物の成長に対するホルモンの効果を調べるための試験環境とし て役立つ）。その後、Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、　ｅＬ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、 　２２２：８０９　（１９８３）は、発現可能なヒト成長ホルモン遺伝子を有す るトランスジェニックマウスにおいても同様の成長促進が得られることを実証し た。

トランスジェニックマウスにヒト成長ホルモン放出因子を発現させる場合にも同 様の効果が得られる。Ｈａｍｍｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ。

３］５：４１３　（１９８５）。

ラン成長ホルモンは、また、トランスジェニック動物において発現されたｏ　Ｍ ｃＧｒａｎｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　［１ｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、、　２６３ ：Ｈ４４３５１（１９８８）　、にｏｐｃｈｉｃｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｒａ ｚｉｌ、　Ｊ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２：３７−５４（１９８９）。しかしな がら、低下した成長の表現型を付与する外因性遺伝子により特徴づけられるトラ ンスジェニック動物はこれまで知られていなかった。

発明の要約 本発明は、を推動物の成長ホルモンと実質的に相同であるが、成長抑制活性を有 するタンパク質に関するものである。

我々は、ｂＧＨ中のＧｌ　ｙＩＩＩをＡｒｇ　（”Ｇｌ　］　９Ｒ”　）、Ｐｒ ｏ（０１１９Ｐ″）、Ｌｙｓ（“０１１９Ｋ”）、Ｔｒｐ（Ｇ１１９Ｗ”）また はＬｅｕ　（“Ｇ１１９Ｌ″）に、あるいはｈ　Ｇ　Ｈ中の相同性Ｇｌｙ１ｔａ をＡｒｇまたはＴｒｐに突然変異させると、を推動物特に哺乳動物において成長 抑制活性を有するムティン（突然変異タンパク質またはそのペプチドフラグメン ト）が得られることを見いだした。この新規なホルモンは、成長の抑制を望む場 合に、哺乳動物（または他のを推動物）、特にヒトやウシに投与することができ る。

本発明の一態様において、このホルモンは外因的に生産され、そして対象者に投 与される。該ホルモンの大きさを考えると、これは該ホルモンをコードする遺伝 子の適当な宿主内での発現により生産することが好ましい。この種の遺伝子はｂ ＧＨ遺伝子の部位特異的突然変異誘発により作製することが最も簡単である。し かし、このホルモンは、他の技法により、例えば天然ｂＧＨのフラグメントと置 換アミノ酸を有する合成ペプチドとの縮合により作製することもできる。ペプチ ドフラグメントが希望する成長抑制活性をもつ場合には、それをメリーフィール ド型合成によって全合成することができる。

本発明の第二の態様では、この遺伝子を公知方法により哺乳動物の出生前形態に 導入し、該出生前形態を、低下した成長の表現型を発現するトランスジェニック 哺乳動物へと発生させる。また、哺乳動物を誕生後に遺伝的に改変すること、す なわち“遺伝子治療”も考えられるだろう。

かくして、成長を抑制した動物は、本発明の成長抑制ホルモンを医薬形態で投与 するか、あるいは動物の出生前または出生後形態を遺伝的に形質転換することに より作ることができる。

成長抑制ホルモン、またはそれをコードする遺伝子は、スペースが限られている 実験施設用の小動物、部屋が狭いペット愛好家用のベット、そして土地が狭い農 場経営者用の家畜の生産に有用である。このホルモンは、また、ヒト巨人症の治 療、巨人症や小人症の研究、糖尿病やその後遺症の治療、コレステロールのコン トロール、そしである種のがんの予防および治療に有効であろう。

糖尿病の管理が十分でない患者は、特徴的に、循環性成長ホルモンを高１ノベル で含むことが見いだされた。例えば、Ｌｕｎｄｂａｅｋ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ、　２：１３−３３　（１９７０）を参照された い。高レベルの成長ホルモンは不十分な糖尿病管理の一因になり得るものであり 、単なるその結果ではないと推測されている。ｐｒｅｓｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｎｅｗ［！ｎｇｌａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３１０：８１０−１４　（１９８ ４）　、ソマトスタチン類縁体を用いて成長ホルモンの放出を抑制しようとする 試みが以前になされている。しかし、成長ホルモンアンタゴニストの使用はこれ までに報告されていない。かくして、本発明の別の側面は、糖尿病の管理を改善 するための開示されたＧＨアンタゴニストの使用にある。

糖尿病の合倒症には、網膜症、腎症（ネフロバシー）および血管障害がある。糖 尿病性網膜症は網膜における微小血管内皮細胞の増殖の結果として起こると考え られている。ヒト成長ホルモンは微小血管内皮細胞の増殖を刺激することが知ら れている。

Ｒｙｍａｓｚｅｗｓｋｉ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＩＳＡ　８８＋６１７−２１（＋９９１）を参照されたい。従っ て、本発明の成長ホルモンアンタゴニストは、糖尿病患者または過剰の成長ホル モンレベルを体験している他の個体において、網膜のような微小血管組織に対す る高レベルの内因性成長ホルモンの有害作用と拮抗させるのに有用であろう。

糸球体硬化症は糖尿病性腎症を含む種々の糸球体疾患において発生する。その病 因はわかっていないが、糸球体間質細胞の増殖が糸球体間質硬化症に先行してい るか、またはそれに伴って起こる。かくして、内在する糸球体細胞の調節障害は 糸球体硬化症の発生において重要な問題となろう（Ｄｏｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ。

、　１３７：５４１．１９９０）。

ｂＧＨを発現するトランスジェニックマウスは、糸球体硬化症の状態へ進行する 拡大した糸球体をもつことが見いだされた。従って、ＧＨは糖尿病性糸球体硬化 症の発生に関係していることがわかった（Ｄｏｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０ およびＢｅ１１．　Ａｍ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ、。

３０１：１９５．１９９１）。ＧＨアンタゴニストは、糖尿病性腎臓の細胞に対 するＧＨ依存性作用を緩和し、それによって糸球体硬化症の予防または治療に有 用であろう。

成長ホルモンは高コレステロール血症に関係していることがこれまで知られてい なかったが、他の態様において、ＧＨアンタゴニストは血清コレステロールレベ ルを下げるのに用いられる。

活性が持続するソマトスタチン類縁体は乳癌および前立腺癌の防御に有用である ことが提唱されている。Ｍａｎｎｉ、　Ｂ１０ｔｈｅｒａｐ）’。

４：３１−３６　（１９９２）　、　Ｍａｎｎｉは、それらが成長ホルモン分泌 を抑制することを含む多くの作用機序により腫瘍増殖を抑制するのだろうという 仮説を立てた。成長ホルモンは、それが乳汁生産性で、さらにＩＧＦ−ルベルを 上昇させるので関係があるとされた。

我々は、本発明の成長ホルモンアンタゴニストが内因性成長ホルモンまたはＩＧ Ｆ−１によって成長を促進される癌の治療に使用しうろことを提案する。

一般に、これらのアンタゴニストは、成長ホルモン（内因性ホルモンと臨床的に 投与されたホルモンの両方）の有害作用に対抗させるのに治療上または予防上有 効である。

我々の研究の過程で、我々は、該タンパク質を分泌するマウスＬ細胞の能力と、 トランスジェニック動物において成長速度に（正または負の）作用を及ぼす該タ ンパク質と、の相関関係を見いだした。成長調節タンパク質を同定するためのし 細胞分泌検定の使用も本発明の一部を構成する。

添付の請求の範囲は好ましい態様の更なる列挙として参照によりここに組み込ま れる。本明細書中に引用したすべての特許および刊行物は参照により組み込まれ る。

をコードする遺伝子のヌクレオチド配列。αヘリックスにはマークが、そしてア ミノ酸には番号が付けてあり、番号１は成熟タンパク質の最初のアミノ酸である 。肉太の文字で示した塩基およびアミノ酸はＧｌ　１９Ｒ変異体において突然変 異を起こしたものである。

図２　オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発の一般的戦略。ｐＢＧＨＩＯΔ６を 親ベクターとして用いた。これは５つのエクソン（ボックスＩ−Ｖ）とイントロ ンＡを含むｂＧＨ遺伝子に融合された（ＢａｍＨＩがＢｇＩＩＩと接合された） マウス・メタロチオネイン１転写調節配列（ＭＴ−１）を含んでいる。この融合 遺伝子をｐＢＲ３２２中にＥｃｏＲ１部位で組み込んだ。ｐＢＲ３２２の複製起 点（ＯＲＩ）、アンビンリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）、並びにｂ　Ｇ　Ｈ翻訳開始 （ＡＴＧ）および終結（ＴＡＧ）コドンを示しである。５′および３′非翻訳領 域には陰影が付けである。制限部位Ｔｔｈｌ　１１　ＩおよびＸｍａ１間のヌク レオチド配列を示す。置換突然変異を示しである。唯一のＢａｍＨ１部位をもた らした１つのサイレント変異も示しである（＊）。我々の実験で突然変異を起こ させた主なアミノ酸残基の位置（１１５，１１７，１１９，１２２）を示す。

困ノー　ウシ成長ホルモンの第３αヘリツクスの大部分の理想化された表面ネッ ト（円筒状プロット）を表す。表面ネットは、紙の同軸円筒状シート上へヘリッ クスを投影すること、この紙をヘリックス軸に平行に切断すること、およびそれ を平らにすることにより作られる。アミノ酸の容積を括弧内に示す。点線はＡｌ ａｌ　２２−Ｇｌｙｌ　１９−Ａ５ｐｌ　ｌ　５により形成された裂は目または くぼみを示す。

客」−ウシ成長ホルモン（ａ）野生型、（ｂ）変異型Ｇ１１９Ｒおよび（ｃ）変 異型Ａ１２２Ｄのアミノ酸１０８−１２７についての、二次構造予測（αヘリッ クス、βシート、逆ターン、ランダムコイル）のプロットである。これらのプロ ットは″Ｍｉｃｒｏ−Ｇｅｎｉｅ″プログラムにより作成された。

図５　マウス肝臓膜間製物を用いた野生型ｂＧＨおよびｂＧＨ−Ｍ８についての 競合結合実験からのデータのスカッチャードプロット。縦座標は結合ｂＧＨ対遊 離ｂＧＨの比を表し、横座標は結合した全ｂＧＨの濃度を表す。各ポイントは３ 通りずつ行った４つの実験の平均を表す。

図６　対照（非トランスジェニック）、Ｇ１１９Ｒ，Ｇ１１９Ｌ、Ｇ１１９にお よびＧ１１９Ｐマウス間の成長速度の比較であり、これらの変異体の成長抑制作 用を示す。

図７　両親媒性の傾向を示すｂＧＨの第３αヘリツクス（１０９−１２６）の軸 方向の描写を示す。疎水性アミノ酸のセクターは点て陰影を付けてあり、親水性 アミノ酸は無地のセクターで示してあり、中性アミノ酸であるグリシンのセクタ ーは斜線で示しである。残基の番号および親水値（Ｈｏｐｐ　ａｎｄ　Ｗｏｏｄ スケール）を示す。

」　変異型Ｇ１１９Ｒのアルギニン−１１９の側鎖が存在する平面上に投影され た野生型（左）およびＧ１１９Ｒ変異型（右）ｂＧＨの第３αヘリツクスの側面 図を示す。裂は目の底に存在するグリシン−１１９残基を矢印で示しである。

この図面は分子モデリングソフトウェア（ＱＵＡＮＴＡ　ａｎｄ　ＣＨＡＲＭ＋ ｎ。

Ｐｏｌｙｇｅｎｅ、　Ｗａｌｔｈａｍ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、　ＵＳ Ａ）を使って作成された。

図９　両性の対照マウス、トランスジェニックｂＧＨ−Ｍ８（Ｅｌ　１７Ｌ、Ｇ ｌ　１９Ｒ，Ａ１２２Ｄ）産生マウス、およびトランスジェニックｗｔｂＧＨ産 生マウスの血清グルコース、尿素／窒素およびトリグリセリドレベルの比較。

図１０　両性のトランスジェニックｗｔｂＧＨ産生マウス、対照マウス、および トランスジェニックｂＧＨ−Ｍ８産生マウスの血清コレステロールの比較。

図１１　前脂肪細胞（ＮＩＨ３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞）の分化を促進するＧＨに こでは野生型ｂＧＨ）の能力の拮抗についての競合抑制検定においてｂＧＨ−Ｍ ８の用量に対するＧＰＤＨ活性をプロットする。

図１２　３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞の分化に及ぼすｂＧＨおよびｂＧＨ−Ｍ８の作 用を比較する。集密的増殖時に、細胞を次第に増加する濃度のｂＧＨまたはｂ　 Ｇ　Ｈ−Ｍ　８とインキュベートした。

ＧＰＤＨ活性の測定のために細胞を８日目に回収した。実験を２回繰り返し、同 様の結果を得た。各バーは３通りの検定から得られた平均値を表す。誤差バーは 標準偏差を表す。

１１ｆｆｌ１３　血清ｂＧＨ類縁体の濃度とトランスジェニックマウス（ＴＧ） ／非トランスジェニックマウス（ＮＴＧ）の成長率との関係を示す。縦座標は血 清中のｂＧＨ類縁体の濃度を表す。横座標はＴＧ／ＮＴＧマウスの成長率を表す 。

堕　血清ｈＧ）（類縁体の濃度とトランスジェニックマウス（ＴＧ）／非トラン スジェニックマウス（ＮＴＧ）の成長率との関係を示す。縦座標は血清中のｈＧ Ｈ類縁体の濃度を表す。横座標はＴＧ／ＮＴＧマウスの成長率を表す。

（本頁以下余白） 好ましい態様の詳細な説明 本発明は、哺乳動物成長ホルモンを含むがそれに限定されるものではないを椎動 物成長ホルモン、特にヒト及びウシ成長ホルモンと配列及び第二構造において類 似性を有するペプチド又はタンパク質である、成長ホルモンアンタゴニスト、特 に成長阻害剤に関する。好ましくは、該化合物は、を椎動物成長ホルモン、特に ウシ又はヒト成長ホルモンの第３αヘリツクスと少なくとも約５０％のアミノ酸 配列相同性を有するαヘリックスを含む。天然型ホルモンの他のαヘリックスは 、もしその省略が成長阻害及び／又は他の成長ホルモンアンタゴニスト活性の損 失なしになされ得るなら、省略してもよい。“アンタゴニスト７という用語は機 能的意味において使用するものであり、本発明を、特定の作用メカニズムを存す る化合物に限定することを意図したものではない。

ウシ成長ホルモンの他の哺乳動物成長ホルモンとの総パーセント相同性は高い・ ブタ（９２％）、ヒツジ（９９％）、ヒト（６６％）及びラット（８７％）。第 ３αヘリツクス（ｂＧＨ１０９〜１２６に相同なアミノ酸配列）に関する限り、 パーセント相同性はその総合値に匹敵する：ブタ（９４％）、ヒツジ（９４％） 、ヒト（６６％）及びラット（９４％）。

ポリペプチドの第二構造は、ポリペプチド鎖の線状セグメントの通常の配置であ る。最も普通に見られる第二構造はβシート及びαヘリックスである。シュルツ （Ｓｃｈｕｌｚ）及びシマー（Ｓｃｈｉｍｅｒ）。

タンパク質構造の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｔｒ ｕｃｔｕｒｅ）　６９（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：　１９７９）を参照 のこと。αヘリックスは、ヘリックスの１回転分だけ離れた残基のペプチドのア ミド基とカルボニル基の間の水素結合によって安定化している。第二構造の予測 は、既知の三次元構造を有するタンパク質におけるβシート、αヘリックス等の 中のアミノ酸の出現度数の観察に基づく。

ブタ成長ホルモンの三次元構造はＸ線回折によって決定され、他の成長ホルモン のものと比較されてきた〔アブデル−メグイド（Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕｉｄ）ら 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８４：６４３４　（１９８７）） 。

このように検討された他の成長ホルモンのように、これは、単一ドメインタンパ ク質であって、互いが逆平行関係にある４つのヘリックス同士の束として配置さ れている。その４つのへリックスは、残基７〜３４．７５〜８７．１０６〜１２ ７及び１５２〜１８３から構成されている。ｂＧＨ及びｈＧＨのＸ線による検討 については、ベル（Ｂｅｌｌ）ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６０ ：８５２０−２５　（１９８５）及びデポス（ＤｅＶｏｓ）ら、　５ｃｉｅｎｃ ｅ、　２５５：３０６−３１２　（１９９２）を参照のこと。他の成長ホルモン の三次元構造は、置換されたアミノ酸の第二構造の傾向に相当の注意を払って、 配列を比較することによって推定することができる。

ウシ成長ホルモンは、アミノ酸配列レベルでブタ成長ホルモンと９３％相同性で あり、ｂＧＨの構造は該２つの配列及びブタ成長ホルモンの構造の検討によって 推定された。その４つのαヘリックスは、アミノ酸４〜３３．．６６〜８０．１ ０８〜１２７及び１５０〜１７９により推定されると報告された。ｂＧＨの第３ αヘリツクスは、アミノ酸１０６〜１２９と定義されている。しかしながら、こ のヘリックスの末端は、１０９〜１２６である中央領域よりも目立たないαヘリ ックス的第二構造を有しているであろう。第３αヘリツクスの正確な境界は“ア ンド（ａｎｄ）”アミノ酸のαヘリックス的傾向に依存して、他のＧＨとは異な っているといえる。そのコンホメーションは、チョウ（Ｃｈｏｕ）及びファスマ ン（Ｆａｓｖａｎ）、　ＢｉｏｃｈｅＩＩｌｉｓｔｒｙ、　１３：２２２　（１ ９７４）の方法を使用して、チェノ（Ｃｈｅｎ）及びゾーネンベルグ（Ｓｏｎｅ ｎｂｅｒｇ）、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

＋６：２１１０　（１９７７）によって予測されたものとかなり一致している（ アミノ酸ｔｏ−３４，６６−８７，１１１−１２７，１８６−１９１）。

種々のを推動物の種から単離された成長ホルモンのアミノ酸配列は高度に保存さ れている。カレイ目の魚の成長ホルモンの、ｂＧＨを含む他の成長ホルモンとの 比較において、ワタヒキ（Ｗａｔａｈｉｋｉ）ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、、　煕３１２　（１９８９）は、５つの保存された領域を同定した。ワタヒ キの保存領域ＧＤ４は、ウシ成長ホルモンの伸長ＬＫＤＬＥＥＧＩＬＡＬＭＲＥ ＬＥＤ、即ち、残基１１３〜＋２９を含む。ワタヒキの図３は、ＧＨの中に保存 された残基及び成長促進活性が表れるのに重要であると予測される残基を同定し ている。

ワタヒキのＧＤ４コンセンサス領域を検討すると、多くのファミリーの成長ホル モンを認めることができる。第１のファミリー（Ｉ）はｃＧＨ，ｒＧＨｌｐＧＨ ｌｏＧＨ，ｂＧＨ及びｈＧＨを含む。これらは、ＬＫＤＬＥＥＧ　Ｉで始まる。

次いで、それらはＩＱＡ　（ｃＧＨ，ｒＧＨｌｐＧＨ）　、Ｉ　ＬＡ　（ｏＧＨ ，ｂＧＨ）又はＩＱＴ（ｈＧＨ）と続く。次いで、ファミリーＩの全メンバーは 、ＧＤ４をＬＭＲＥＬＥＤで終わる（ｒＧＨがＬＭＱ　Ｅ　Ｌ　ＥＤて、ｈ　Ｇ 　ＨがＬＭＧＲＬＥＤであることを除く）。第２のファミリー（ＩＩ）は、ｆＧ Ｈ，ｙＧＨｌｔＧＨ及びｓＧＨを含む。これらは、コンセンサス配列ＬＳ　（Ｅ ／Ｄ）ＬＫ　（Ｍ／Ｔ）Ｇ　（Ｌ／Ｉ）　（Ｌ／Ｇ／Ｈ／Ｎ）　（Ｋ／Ｌ）ＬＩ 　（Ｅ／Ｔ／Ｒ／Ｉ）（Ａ／Ｇ）（Ｎ／５）ＱＤを有する。

ＧＤ４における４つのアミノ酸は、ワタヒキにより示された全成長ホルモン中に 保存されている：Ｌｅｕｌ１３、Ｌｅｕｌ１６、Ｇｌｙｌ　ｌ　９、Ｌｅｕ１２ ３及びＡｓｐ１２（ｂＧＨの配列に従って番号を付した）。第３αヘリツクスを 検討したところ、Ｇｌｙ１１９に最も近いアミノ酸のうち、ＡｓｐＨ５が高度に 保存されている（魚類のホルモンにおいてはＧｌｕで置換されている）：Ｌｅｕ ｌ１６は不変であり、Ｇｌｕｌ１８は哺乳類及び鳥類において保存されているが 、魚類ではＭｅｔ、Ｔｈｒ又はＶａｌで置換されており；ｌ１ｅ１２０は殆ど不 変であり（ｆＧＨではＬｅｕで置換されている）、そして、Ａ１ａ１２２は特に 哺乳類及び鳥類では良好に保存されており（ｂＧＨではＴｈｒで置換されており 、魚類のＧＨではＬｅｕ又はＬ　ｙ　ｓで置換されいる）。

（本発明はこれら保存が維持されている突然変異体に限定されないと理解される べきである。） ヒト胎盤性ラクトゲン−（１４１〜１９１）断片に結合したｈＧＨ−（１〜１３ ４）断片を含有する組み換え分子が、ウサギの肝臓から単離されたＧＨレセプタ ーに対する完全なｈＧＨ免疫学的活性と結合親和性を保持したことが示されてい る〔ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｎ、、　２ ５６：　２９６−３００　（１９８１）　：ｌ　、相同性走査突然変異誘発法（ ｈｏＩＩｌｏｌｏｇ−ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅ）を使用することによって、相同性ホルモン、即ち、ヒト胎盤性ラクト ゲン又はヒトプロラクチンの遺伝子断片を、ｈＧＨ遺伝子全体にわたって系統的 に置換し、かくして、種々のキメラホルモンを作成した〔タンニングハム（Ｃｕ ｎｎｉｎｇｈａｍ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ。

２４３：１３３０−３６　（１９８９））。クローン化された肝臓ｈＧＨレセプ ターへのこれら突然変異ＧＨと野生型ｈＧＨの結合親和性を比較して、レセプタ ー結合に関連するｈＧＨ中に３つの不連続ポリペプチド決定基があるという結論 に達した。それらは、ＮＨ２末端、Ｃ０ＯＨ末端、及びアミノ酸残基５４と７４ の間のループ内に位置していた。これら推定上の結合ドメインを、アラニン残基 がそれら領域全体にわたって系統的に置換されるアラニン走査突然変異誘発法（ ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｔｅｃｈｎｉｑ ｕｅ）によって更に分析した。ｈＧＨの位置１Ｏ１５８，６４，６８，１７２， １７４，１７５及び１７６におけるアミノ酸残基は、ＧＨレセプター結合に重要 であることが示された。しかしながら、いずれの突然変異本発明は、ウシ又はヒ ト成長ホルモンの第３αヘリツクスの突然変異に限定されない。むしろ、あらゆ る哺乳動物又は他のを推動物成長ホルモンの第３αヘリツクスの突然変異を包含 し、ワタヒキ（１９８９）において配列が示された成長ホルモン：カレイ目の魚 類、黄色の尾びれの魚類、マグロ、サケ、ニワトリ、ラット、ブタ、ヒツジ、ウ シ及びヒト成長ホルモンが挙げれるがこれらに限定されない。他の成長ホルモン の突然変異体の発現は、それをコードする遺伝子の入手可能性によって容易とな る。例えば、ジョーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８１：５４ ４−６８３　（１９７９）　（ｈＧＨ）を参照のこと。

ウソ成長ホルモンと実質的に相同であるポリペプチドの概念は、（ａ）ウシ成長 ホルモンのアミノ酸１１５又は１１９に対応するアミノ酸の置換、（ｂ）を推動 物成長ホルモンの中には保存されていない、ウシ又はヒト成長ホルモンのアミノ 酸に対応するアミノ酸の置換、特に、そのアミノ酸の置換であって異なる成長ホ ルモン中のその部位で見出されるものによる置換、及び／又は（Ｃ）アミノ酸１ 〜９５及び／又は１３４〜１９１の末端の切断によりウシ又はヒト成長ホルモン と異なる、あらゆるポリペプチドを含むものと考えられる（これらに限定されな い）（保存されているアミノ酸は、ワタヒキら、　１９７９で同定されている） 。かくして、ウシ以外の全てのを推動物成長ホルモンは、ウシ及び／又はヒト成 長ホルモンと“実質的に相同”である。好ましくは、該ポリペプチドは、ｂＧＨ の第３αヘソツクス（おおよそ、残基１０６〜１２９）に実質的に対応するサブ 配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）において、ウシ又はヒト成長ホルモンと少なく とも約５０％相同性、より好ましくは少なくとも８０％相同性であり、そしてさ らに好ましくは、該ポリペプチドの全長（アミノ又はカルボキシ末端への外部か らの非ｂＧＨ関連融合物は無視する）が相同であることである。

該化合物で処理された（又は自身でそれを発現するように遺伝子操作された）少 なくともｌのを椎動物種である試験動物の成長が（０，９５の信頼レベルで）コ ントロール動物の成長よりも相当に遅いなら、該化合物は成長阻害性であると考 えられる（“相当”という用語はその統計的意味で使用されている）。好ましく は、該化合物が、複数の種において又は少なくともヒト及び／又はウシにおいて 成長阻害性である場合である。成長ホルモンはかなりの種間交差反応性を有する 。ギル（Ｇｉｌｌ）ら、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

３：　６４３　（１９８５）は、組み換えニワトリ及びウシの成長ホルモンが若 年太平洋サケの成長を加速することを報告した。

成長ホルモンのある断片が成長促進活性を有することは既知であり、本発明の成 長阻害性ペプチド（以下、この用語はタンパク質を含むものとして使用される） はｂＧＨはどに大きい必要はないと考えられる。好ましくは、該ペプチドは少な くとも１１アミノ酸長（αヘリックスの３回転分）であり、より好ましくは、少 なくとも５０アミノ酸長である。これらペプチドは、例えば、ｂＧＨ（Ｇｌ　］ 　９Ｒ）の成長阻害作用を保持してもよく、更に、他の、天然の大きさの突然変 異体の望ましくない生物学的活性を欠いていてもよい。それらは、また、より望 ましい薬物動態学的特徴を有していてもよい。

また、本発明の成長阻害性ペプチドは、追加のアミノ酸が存在することで該化合 物がを推動物の成長速度を低下できないようにしてしまわないことを条件として 、ｂＧＨより大きくてもよい。

本出願人の成長阻害性ペプチドの作用メカニズムは知られていないが、それらは 標的動物によって内生的につくられた野生型成長ホルモンに対するアンタゴニス トとして機能していると考えられる。我々は、例えば、ｂＧＨ（Ｇｌ　ｌ　９Ｒ ）及びｂＧＨ（Ｇ１１９Ｒ，Ｅｌ　１７Ｌ、Ａ１２２Ｄ）の両方が、肝臓膜試料 への野生型ｂ　Ｇ　Ｈの結合を競合的に阻害することを示した。かくして、該化 合物は他のどこにも分類されない成長阻害結果を有していると考えられる。とい うのは、その成長促進活性は野生型成長ホルモンのものよりも実質的に低い（そ して多分無視できる）にもかかわらず、それは内因生の天然成長ホルモン（その 成長の刺激はより顕著であったろう）を成長ホルモンレセプター（ＧＨＲ）部位 から追い出すことができるからである。しがしながら、本出願人はこの理論に拘 束されるものでなない。

デボスら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２５５：３０６　（１９９２）は、ｈＧＨとそ のレセプター（ｈＧＨＲ）の細胞外ドメインの複合体をＸ線回折で試験した。ｈ ＧＦ（の第２レセプター結合領域はくぼんでおり、主としてヘリックス４の露出 した面上の残基により形成されているが、ヘリックスｌの露出した残基及びヘリ ックスｌと２に連結している領域内の残基によっても形成されている。第２レセ プター結合領域は、ヘリックス１と３の露出した側から成り比較的平坦である。

ヘリックス３の役割はデボスの図５に最も良く示されており；複合体形成に際し てのｈＧＨＥｌ１９周辺への溶媒接近容易性の有意な減少がある。該複合体は、 型ｈＧＨ（ＧＨＲ）＊を有した；即ち、該レセプターはｈＧＨと相互作用するた めに二重化している。我々のＧＨアンタゴニストがこの二重化を妨害するかも知 れない。

好ましくは、本発明の化合物は、以下に記載したようにして作った肝臓膜試料か ら放射性ラベル化された野生型ｂＧＨを除去する化合物の能力の分析において、 野生型ｂＧＨのＥＤ５０の約１０倍よりも低いＥＤ５０を有する。より好ましく は、該化合物は、少なくとも野生型ｂＧＨのＥＤ５０に匹敵するＥＤ５０を有す る。

最も好ましくは、該化合物は、該化合物が投与される動物に生まれつき備わって いる成長ホルモンが有するよりも高い、成長ホルモンレセプターについての親和 性を有する。ヒト成長ホルモンレセプターの精製及び特徴付けについては、ロイ ング（Ｌｅｕｎｇ）ら。

Ｎａｔｕｒｅ、３３０：　５３７−４３　（１９８７）を参照のこと。

ＧＨムティンは、たとえそれが成長阻害活性を欠いているとしても、それが他の ＧＨによって媒介される活性、例えば、その糖尿病誘発、糸球体硬化症、高コレ ステロール血症、又は腫瘍発生活性に拮抗するなら、アンタゴニストと考えるこ とができる。

好ましい成長阻害性ペプチドは、第３αヘリツクスの表面トポロジーの一時変異 によって特徴付けられる。′野生型”ウシ成長ホルモンの第３αヘリツクスにお いて、アスパルテート−１１５で始まり、グリシン−１１９で深くなり、そして アラニン−１２２で終わっている表面の割れ目又は陥凹があるのが図３から分か るであろう。これまで調製された全ての突然変異体は、野生型成長促進活性を保 持するもの及びそうでないものの両方ともに、成長促進活性にはこの割れ目又は 陥凹の存在が必要である、及び、この割れ目の中心がより嵩高い側鎖を有するア ミノ酸の置換によって“塞がれている”なら、該ムティンは被検物の成長を阻害 する、という理論と一致している。

αヘリックスを実質的に不安定化する突然変異は、全ての成長関連活性の損失を 来すので望ましくない。我々は、αヘリックスを崩壊させると考えられる多くの 突然変異の場合においてががる損失を認めた。

αヘリックス形成剤及び破壊剤の議論については、先のチョウ及びファスマンを 参照のこと。Ｇｌｕ、Ａｌａ及びＬｅｕは好ましいαヘリックス形成剤であるが 、Ｐｒｏ及びＧｌｙは強いヘリックス破壊剤として特徴付けされている。強いα ヘリックス破壊剤を導入する置換はあまり望ましくないが、該ヘリックスの末端 の如き特定の場合においては許容される。我々の類縁体の第二構造は、ガーニア ー（Ｇａｒｎｉｅｒ）ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓｓ、、　１２０：　９ ７−１２０（１９７８）ノア　／ｌ、　コリズムを使用する“マイクロ・ジェニ ー（Ｍｉ　ｃｒ。

Ｇｅｎ１ｅ）”　コンピュータープログラムを使用して予測された。

アミノ酸１１９に関し、グリシンは最小のアミノ酸残基であると同時にαヘリッ クスの形成に最も不都合なアミノ酸残基である。

かくして、あらゆる他のアミノ酸がαヘリックスを不安定化することなしにそれ と置換できると同時に、前記の割れ目を塞ぐことができると確信される。試験し た全てのＧＨ”ｂＧＨ置換は“小動物（ｓｆｆｉａｌｌ　ａｎｉｍａｌ）”表現 型をもたらした。これら置換は、アルギニン（大きな、正に荷電したアミノ酸） 、プロリン（環状脂肪族アミノ酸）、リシン（大きな、正に荷電したアミノ酸） 、トリプトファン（大きな芳香族アミノ酸）及びロイシン（大きな、非極性芳香 族アミノ酸）であった。ｈＧＨにおいて、相同性グリシンは位置１１９にある。

アルギニン又はトリプトファンの置換はアンタゴニストをもたらしたが、ｈＧＨ Ｇ１２０Ａは成長促進活性を保持した。従って、現在では、全てのを推動物ＧＨ で保存されているこのグリシンは、アラニン（２番目に小さいアミノ酸）以外の あらゆるアミノ酸、より好ましくは少なくともプロリン（“小”動物表現型をも たらすことが知られている最小の置換アミノ酸）と同じ大きさであるあらゆるア ミノ酸で置換されてもよいと考えられる。Ｇｌ目の欠失が“小”動物表現型をも たらすことも知られている。

位置１１５の一時変異が我々の“割れ目”理論によって示唆される。位置１１５ におけるアスパルテートは、αヘリックスを破壊することのないより嵩高いアミ ノ酸によって置換されてもよい。

好ましくは、置換アミノ酸はグルタミン酸よりも大きい大きさを有する。アミノ 酸の、ヒスチジン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、リシン、アルギニン 、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンがグルタミン酸より実質的に 大きい。これらのうち、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ及びＴｒｐがより好ましい。と いうのは、それらは嵩高さという利点と適度に強いαヘリックス的傾向（ａｌｐ ｈａｈｅｌｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ）を兼備するからである。しかしな がら、野生型Ｇｌｕは、全ての該アミノ酸のうちで最も強いαヘリックス形成剤 であることに留意されよ。ｂＧＨのＤ１１５Ａ突然変異体はＧＨアンタゴニスト ではないが、アラニンがアスノ（ラギン酸より小さいので、これは、ＡｓｐＨ５ をより嵩高いアミノ酸と置換する価値があることの証明にはならない。

Ｇｌ　１９Ａが、他の突然変異体と例えば１１５及び＋２２で結び付いたら、“ 小”表現型を導くかも知れないという可能性がある。

位置１１５及び１１９において全ての可能なアミノ酸置換の効果を系統的にスク リーニングすることは可能である（２０２−１又は３９９通りの組み合わせ可能 性がある）。ｂＧＨをコードし、かつ、これら位置で縮退しているＤＮＡを、全 ての可能なアミノ酸又は許容できるαヘリックス的傾向を有するものだけをそこ でコードするように、例えば“ダーティ・ボトル（ｄｉｒｔｙ　ｂｏｔｔｌｅ） ″′合成法によって調製する。キメラ外皮タンノくり質のドメインとして突然変 異ｂＧＨを示すファージを、ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）ら、ＰＣＴ／ＵＳ８９１ ０３７３　Ｌ　ＷＯ９０１０２８０９によって教示されたようにして調製する。

該ファージを成長ホルモンレセプターを保持するクロマトグラフィー支持体と共 にインキュベートする。（成長ホルモンレセプターを単離する方法については、 ロイングら、　Ｎａｔｕｒｅ　３３０：　５３７　（１９８７）及びスペンサー （Ｓｐｅｎｃｅｒ）ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６３ニア８６２ 　（１９８８）を参照のこと。）天然ｂＧＨも、該ファージのインキュベーショ ンの前、最中及び後に、該支持体と共にインキュベートする。結合したファージ を回収し、増幅し、そして、突然変異ｂＧＨの配列を決定するために試験する（ 通常、ファージゲノム中の対応する遺伝子を配列決定することによる）。これら 突然変異体は、成長ホルモンレセプターについて野生型ｂＧＨと競合する能力を 示した。次いで、ｉｎ　ｖｉｖｏでＧＨ活性を拮抗するそれらの能力を、例えば 、それらを動物に直接に投与するか、又は好適なトランスジェニック動物を調製 するか、又は実施例７に記載したｉｎ　ｖｉｔｒｏ分析法によって確認する。

これらのアプローチは、所望により、第３αヘリツクスの他のアミノ酸位置にま で拡大できる。スクリーニングのために特に好ましいアミノ酸は、ｂＧＨのＧＩ ｙｌ１９に空間的に最も近い６つのアミノ酸、即ち、Ａｌａ１２２、Ｌｅｕ１２ ３、ＩＩｅ１２０゜Ｌｅｕ　１１６、ＡｓｐＨ５及びＧ１ｕｌ１８である。パー ス（Ｂａｓｓ）ら、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｆｕｎｃｔ ｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　８：３０９−３１４　（１９９０）が、 ｈＧＨ−遺伝子■融合タンパク質を発現しかつ示し並びに抗ｈＧＨモノクローナ ル抗体と結合した“ホルモン・ファージ”を調製したことに留意すべきである。

更に、ｗｔ−ｈＧＨを保持するファージを、低親和性ｈＧＨ突然変異体Ｒ６４Ａ を保持するファージから、（無孔オキシランビーズに結合したｈＧＨレセプター の細胞外ドメインを使用する）アフィニティクトマトグラフィーによって分離す ることが可能であった。

望まれる成長阻害活性を付与するのに必要と思われる位置１１９での突然変異の ほかに、成長阻害活性又は他のアンタゴニスト活性をそのまま残すであろう追加 の突然変異が可能である。これら突然変異は、該ペプチドの必須でない領域にお ける単−又は複数の置換、欠失又は挿入の形態をとってもよい。例えば、αヘリ ックス内の他のアミノ酸を変更することは、該置換がαヘリックスを破壊しない ことを条件として可能である。好ましくは、かかる変更は、あるアミノ酸を類似 の大きさ及び極性のものと置き換えるものである。該配列のαヘリックス的傾向 を増加するために、特に１１９での突然変異が該ヘリックスを不安定化させると 考えられるものであるなら、−次突然変異部位１１９の側面に位置するアミノ酸 を一次変異させることが有利かも知れない。

次の表は、候補の突然変異体を同定するのに役に立ち得る：挙げた参考事項の多 くは、該ペプチドが突然変異誘発をどこで許容するか及びしないかについての手 引きとなる。ワタヒキら（１９８９）は、カレイ目の魚類、黄色の尾びれの魚類 、マグロ、サケ、ニワトリ、ラット、ブタ、ヒツジ、ウシ及びヒト成長ホルモン の配列を比較した。彼は、５つの保存されたドメインを同定しＧＤＩ−ＧＤ５と 呼んだ。これら保存されたドメインにおける突然変異は多分活性に影響を与える であろう、ＧＤ４はｂＧＨの第３αヘリツクスに対応する。阻害活性を保持した いという望みをもって既知のＧＨアンタゴニストを突然変異する場合、保存され たドメインの外側の突然変異はより許容され難い。しかしながら、これら保存さ れた領域内での突然変異は、注意深く選ばれるならば許容され得る；例えば、突 然変異Ｅｌ１７Ｌは、野生型ｂＧＨ及びｂＧＨＧ１１９Ｒ突然変異体のいずれの 活性も変えない。

置換のみならず挿入及び欠失も同族ホルモンの例により示唆されていることに留 意されたい。

アブデル−メグイドら（１９８７）は組み換えメチオニルブタ成長ホルモンの３ Ｄ−構造を決定し、それが該成長ホルモンの“一般的三次元折りたたみ（ｇｅｎ ｅｒａｌ　ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｆｏｌｄ）”を明らかにする ことを示唆した。３Ｄ−構造は、内部及び表面の残基を同定するのに使用するこ とができる；一般的に言えば、（レセブター結合部位以外の）表面残基において 突然変異されたタンパク質は、多分機能的なままであろう。しかしながら、クレ イトン（Ｃｒｅｉｇｈｌｏｎ）及びコシア（Ｃｈｏｔｈｉａ）、　Ｎａｔｕｒｅ 、　３３９：１４　（１９８９）は、隠れた残基における突然変異の許容性を議 論している。該構造は、また、柔軟な表面“ループを決定するのにも使用できる ；タンパク質はかかる領域において欠失及び挿入により大きな許容度がある。

タンニングハムら（１９８９）は、ｈＧＨのクローン化された肝臓レセプターの ためのｈＧＨのエピトープを同定するのに相同性走査突然変異誘発法を使用した 。領域Ｃ（５４〜７４）、Ｆ（１６４〜１９０）、及び、より程度は低いが、Ａ （１１〜３３）において突然変異を有する変異型ホルモンだけが、減少した結合 親和性を示した。タンニングハム及びウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）、　５ｃｉｅｎｃ ｅ、　２４４：１０８１　（１９８９）は、関連する方法であるアラニン走査突 然変異誘発法を使用して、更にこれら領域を検討した。しかしながら、タンニン グハムによって利用されたレセプターへの結合は、該突然変異体の成長促進又は 成長阻害活性に必ずしも重要ではないということに留意されたい。

例えば、主要なアミノ及びカルボキシ末端の切断は、ｂＧＨ（Ｋ１１２Ｌ）の９ ６〜１３３断片が生物活性を保持すると理解されるので、成長阻害活性に悪影響 を及ぼすことなく行うことができそうに思われる。末端の切断は、遺伝子修飾に よって又はエキソペプチダーゼ処理によって起こすことができる。

行える置換の種類に関しては、前記のシュルツ及びシマーの表１〜２及び前記の クレイトンの図３〜９に示されたものの如き異なる生物の相同性タンパク質問の アミノ酸変化の頻度の分析結果にまず目を向けることができる。かかる分析結果 に基づいて、我々は以下に示したグループ頁工の交換として保存性置換を定義し た： ■　小さな脂肪族の、非極性又は僅かに極性の残基−Ａｌａ、Ｓｅｔ、Ｔｈｒ　 （Ｐｒｏ、Ｇｌｙ） ■　負に荷電した残基及びそれらのアミド　Ａｓｎ　ＡｓｐＧｌｕ　Ｇｌｎ ■　正に荷電した残基−Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ■　大きな脂肪族の非極性残基 −Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　ｌ１ｅＶａｌ　（Ｃｙｓ） ■　大きな芳香族残基−Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ３つの残基はタンパク質構築に おけるそれらの格別な役割の故に括弧で括られている。Ｇｌｙは側鎖を持たない 唯一の残基で、それ故、鎖に柔軟性を付与する。Ｐｒｏは鎖を強く締めっける異 例のジオメトリ−を有する。Ｃｙｓはタンパク質を特定の折り畳みの中に保持す るジスルフィド結合に関与しうる。ｂＧＨの４つのシスティンは高度に保存され ている。シュルツ及びシマーは上記のＩ及び■を合体させていたことに留意され たい。また、ＴＹｒは、その水素結合能力の故に、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ等とある密接 な関係を有していることにも留意されたい。

成長ホルモンファミリーそれ自体の中で、我々はｂＧＨの残基との他のアミノ酸 の幅広い多様な置換を認める。例えば、ワタヒキら（１９８９）に示されたを推 動物のＧＨの中で、ＰｒｏはｂＧＨ中に６回出てくる。第１番目のＰｒｏは置換 されていないが、ＳＧＨには存在していない。第２番目のものはｆＧＨにおいて ＬｅＵで；　ＹＧＨ及びｔＧＨにおいてＴｈｒで置換されている。第３番目のも のはｆＧＨにおいてＬｅｕで、ｙＧＨ及びｔＧＨにおいてＩｌｅで、ｓＧＨにお いてＶａｌで置換されている。第４番目のＰｒｏは保存されている。第５番目の ＰｒｏはｆＧＨにおいてＰｈｅで；ｙＧＨにおいてＳｅｔで置換されている。第 ６番目のＰｒｏはｆＧＨ，ＹＧＨ及びｔＧＨにおいてＰｈｅで、及びｓＧＨにお いてＬｅｕで置換されている。全体では、ＰｒｏはＰｈｅで４回、Ｌｅｕで３回 、ＴｈｒとＩｌｅので各２回、及びＶａｌとＳｅｒで各１回置換されている。こ の分析をｂＧＨの全アミノ酸に拡大した場合、次の対応が得られる；Ａｌａ（１ ４；２つ保存されている）→Ａｓｐ（１０；２つ保存されている）−＋Ｇｌｕ（ １３；２つ保存されている）→Ｐｈｅ（１３；３つ保存されている）→ユＬニム Ｌｅｕ　＋６１．　Ａｓ＋ｎ　＋６１．　Ｓｅｒ　（５１，Ｇｉｎ　Ｄｉ、　工 １＝（２１，Ｇａｙ　（２１，Ｈｉｓ　（１）、　Ｔｈｒ　（１）、　Ｖａｌ　 ｔＬ）Ｇｌｙ（１０；１つ保存されている）→ＡＩＣｊ　（９）　、　Ｇｌｕ　 （８１、ＬＩｐｆ７１　、　Ｖａｌ　＋４１　、　肱しシ檻二Ａｓｎ　＋３）、 　Ｐｈｉ　（３）、　Ａｓｐ　＋２１．　Ｈｉｓ　ｆｌ）、　≧ｆｉｌ、　Ｔｙ ｒ　（１１，ＡＱＩユ註Ｈｉｓ（３；１つ保存されている）→ とユニＬＡｓｎ　（１１，Ｔｙｒ　（１１，ＡＩＩＰ　（１１１１ｅ（７）→ Ｇｉｎ　（７１，Ａｓｎ　（５１，−ＬムＬＰｈａ　（４＋、　凰しムムＪｕａ 　（２１，Ｓｅｒ　（１１，Ａｒｇ　（１１Ｌｙｓ（１２；２つ保存されている ）→Ｓｓｒ　（１１）、ｕ＃　Ｇｌｙ　（４）、ＧユＨ（２）、Ｌｓｕ　（２） 。

Ａｓｎ　（１） Ｌ　ｅ　ｕ　（２７；　１１つ保存されている）→Ｓｓｒ　ｌユｉ）、Ｔｈニー ＪｊＬｌ＝　Ａｓｎ　＋７）、と息ニーエアＪ＝　にｉｎ　＋７）。

Ａｒｇ　（４１，Ｇｌｕ　（４１，Ｐｈｅ　（３１，Ｔｙｒ　（３）、　Ｇｌｙ 　ｆｌ）、　Ｐｒ。

ｆｌ）、　Ｈｌｓ　（１１ Ｍｅｔ（４）→ ユＬ二ＬＡｌａ　（４１、Ｔｈｒ　（３１、Ｓｅｒ　（３１、−ユニムＡｓｎ（ １）、ムＬユ註 Ａｓｎ（６）→ 工１ｅ（Ｕ、阻ｆｉｒ　（４１，、凪！」ｌ−。

Ｐｒｏ（６；１つ保存されている）→ Ｐｈａ　（４１，ｒ、、ｅｕ　（３１，ｎＬユＬ　工ｌｅ　（２）、　Ｖａｌ　 （１１゜−二二註 Ｇｌｎ（１１；１つ保存されている）→Ｌｅｕ　（１３）、　Ａｒｇ　（６）、 　Ｉ、Ｆ　＋５）、　５ｅｒ　［４）、ムＬ」二Ｈｉｓ　（１）、　Ｇｌｙ　（ １１、Ａ！Ｉ！ＬｕＬ＆Ｐｒｏ　＋１１Ａｒｇ（１３；１つ保存されている）→ 込Ｌ」Ｈ，Ｓｉｒ　（９１、Ｔｈｒ　（７１ｒ工１ｅ　＋３１．　Ｇｌｕ　（２ ）。

Ｇｌｙ　（２）　、　Ａｓｎ　＋２１　、　ＬＬユＬＶａｌ　（１）　、　Ｇｉ ｎ　（１１、Ａｓｐ（１１，Ａｌａ　（１１ Ｓｅｒ（１３；３つ保存されている）→Ｔｈ　ｒ　（１２；　１つ保存されてい る）→Ｖａｌ　（７＋、　ＴＹｒ　（５１，Ｐｈｅ　（４１゜工１ｅ　ｆ４＋、 Ｍｅと　（３ン　、Ｌｅｕ　（３）　、、】；こ】；二５＝１１１１．」；≦’ ｌＪ＝　ＡＪｎ　＋２１　、　Ｃ」ｄど」ユ Ｖａｔ（６）→ ｕａ　（４１、！９ｅｒ　（４）　、　ｕＬｕ二Ｔｈｒ　（２１、Ｇｉｎ　（６ １、Ｇｌｙ（２１，ＭＩＬユ社、ＬｄｉＪｌユ１．　Ｌｙｓ　（１）上記の数値 は種々のアミノ酸の相対的出現度数について調整するために標準化されていない ことに留意されたい。我々は、更（こ、我々自身の突然変異誘発実験において、 Ｌｙｓ　１１２をＬｅｕｌこ又はＬＹｓｌ１４をＴｒｐ（Ｍｌ）に、ＧｌｕをＧ ＩＹ（Ｅ１２６Ｇ）又はＬｅｕ（Ｍ４）に、又はＡｌａをＴｈｒ（Ａ１２２Ｔ） に換えても活性に変化がないが、Ｌｙｓ、ｃｌｕ又はＬｅｕをＰｒｏに換えると 活性がなくなることを認めている。

本発明は、望まれるＧＨアンタゴニストを製造する如何なる特定の方法にも限定 されない。好ましくは、これらアンタゴニストは、まず、“天然の”第３αヘソ ツクスを有するを推動物のＧＨ（例えば、ｂＧＨ又はｈＧＨ）をコードする遺伝 子を部位特異的突然変異誘発により変更し、次いで、適当な宿主内で該変更した 遺伝子をクローニング及び発現することによって製造される。分子生物学的技術 は、サムブルーフ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ　Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ　ｅｄ、、　１９８９）に記載さ れている。該遺伝子はゲノム起源のものであってもよく、それはｂＧＨメツセン ジャーＲＮＡから調製されたｃＤＮＡであってもよく、それは合成されたもので あってもよく、又は、それはそれらの組み合わせであってもよい。ｂＧＨのアミ ノ酸配列及びｂＧＨ遺伝子のｃＤＮＡ配列については、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ） ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５５ニア５２１−２４　（１９８０ ）を参照のこと。ゲノムｂＧＨ配列については、ヴオイチック（Ｗｏｙｃｈ　ｉ 　ｃｋ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１０ニア１９７−７ ２１０　（１９８２）を参照のこと。

ｈＧＨのｃＤＮＡ配列は、チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、　Ｇｅｎｅ、　５５：１８ ９　（１９８７）及びプツト（ＤｅＮｏｔｏ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、、　９：３７１９　（１９８１）により与えられており、ゲノムｈ ＧＨ配列は、ロビンス（Ｒ。

ｂｂｉｎｓ）ら、　Ｃｅ１１．２９：６２３　（１９８２）にある。

宿主は使いやすければ如何なる生物であってもよく、細菌、酵母又は哺乳動物の 細胞が挙げられる。該遺伝子は、宿主内でプロモーター機能に、作用できるよう に連結している。構成プロモーターは一般的方法で、即ち、多くの組織において 及び発育中いつでも遺伝子発現を活性化するであろう。調節可能なプロモーター は組織又は細胞特異的方法で、発育中の正確な時期に、又は環境の変化に応答し て、活性化され得る。構成プロモーターは、通常、より大量の遺伝子産物（通常 はタンノクク質）が要求される場合又は遺伝子産物が多くの組織の多くの細胞に おいて要求される場合に用いられる。調節可能なプロモーターは、１つの遺伝子 産物が特定組織の僅かな細胞において又は発育中の所定の時期に要求される場合 に利用される。

発現系は、アンタゴニストが培養培地中に分泌されるように、又は宿主細胞が高 い細胞密度で成育し、次いで、溶解されて該化合物が放出されることができるよ うに組み立てられる。

ｂＧＨ（Ｇｌ　ｌ　９Ｒ）などの精製に適した１つの方法は、ロイングら、　Ｉ Ｉ！ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１１９：１４８９−１４９６　（１９８６） に記載されて（する。本質的に、この手法は、（ａ）硫酸アンモニウム沈澱、（ ｂ）ＤＥＡＥ−セルロース（又はあらゆる等価のイオン交換カラム）上での分別 、及び（Ｃ）ゲル濾過（例えば、セフアゾ・ソクスＧ−２５及び／又はセファク リル８２００カラム上での）による精製を含む。成長ホルモン関連化合物の精製 に応用できる他の手法は、レイカート（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ、　Ｊｒ、）、　“Ｐ ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｅｒｉｏｒ　Ｐｉｔｕ山ｒｙ　Ｈｏｒｍ ｏｎｅｓ：　Ｂｏｖｉｎｅ、　Ｒａｔ　ａｎｄ　Ｒａｂｂｉｔ、”　Ｍｅｔｈ、 　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　３７：３６０及びそれ以下（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、　Ｎ、Ｙ、　：１９７５）に記載されている。興味のあるタンパク質を特 異的に認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体も精製工程で使用するこ とができる。

次いで、精製したアンタゴニストを、適合性で無毒な薬学的賦形剤と混合して、 動物に、例えば、過剰な成長速度によって特徴付けられる症状を治療するめに投 与する（″動物という用語はヒトを含むことを意図している）。ヒト以外の動物 に投与する場合には、出来るだけ、家畜業者が使用し易いように調製された薬剤 と栄養物質の組み合わせで、該動物のえさの中に薬剤を取り込むのが好ましいと 言える。該アンタゴニストは、あらゆる適した薬学的投与形態で、経口で又は非 経口（静脈内、皮下及び筋肉内を含む）でヒトに投与してもよい。網膜症の治療 の場合には、通常の眼科の薬学的形態によって目に直接投与してもよい。有効投 与量及び治療プロトコールは、実験動物で少ない投与量で始め、次いで、その効 果をモニターしながら投与量を増加し、更に投与量規制を系統的に変化させると いった、通常の手段で決定することができる。試行投与量は、成長ホルモン及び ソマトスタチン（成長ホルモン放出阻害剤）の投与に関する臨床文献を考慮して 選ばれるだろう。

他の態様においては、遺伝子を宿主細胞に導入し、遺伝子的に形質転換された細 胞のトランスジェニック動物へと発育させる。

成長ホルモンアンタゴニスト遺伝子を保持する線状ＤＮＡを生殖体の中に導入し ても、又は受精卵の前核の中に、細胞質の中に、二細胞胚の核中に、個々の芽細 胞の中に、又は卵割腔の中に顕微注射してもよい（顕微注射の代わりにエレクト ロポレーションによってこれら標的の幾つかに到達してもよい）。一方、該遺伝 子を保持するレトロウィルスを構築及び使用して、着床前の胚又はかかる胚と凝 集しつる組織培養細胞（例えば、胎児性幹細胞）を感染してもよい。いずれの場 合にも、遺伝子的に修飾された接合子を、簡単なｉｎ　ｖｔｔｒｏ培養の後に里 親に移植し、出産予定日まで養う。分娩後の“遺伝子治療”については、クライ ン（Ｃ１ｉｎｅ）ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８４：４２２−４２５　（１９８０ ）　：ウィリアムソン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ）。

Ｎａｔｕｒｅ、　２９８：４１６−１８　（１９８２）を参照のこと。再度述べ るが、該遺伝子は、宿主内でプロモーター機能に、作用できるように連結してお り、該プロモーターは構成的であっても調節的であっもよい。

異常な胚又は胎児の発生が避けられるように、好ましくは、発現を調節する。

以下の実施例により、本発明を限定することなく更に説明する。

（本頁以下余白） これらのオリゴヌクレオチドは以下のようにハイブリダイズする：実施例１：低 い成長の表現型を与える突然変異の作製材料および方法 プラスミドｐＢＧＨ−１０デルタ６はｐＢＧＨ−１０に由来し、ｂＧＨの完全コ ーディング領域とイントロン八とを含む。ウシ成長ホルモンのイントロンＢ、Ｃ およびＤは含まない（図１）。このプラスミドは“野生型”ｂＧＨをコードし、 その発現はマウスメタロチオネイン１転写制御配列の１７００塩基対の領域によ って支配されている。

プラスミドｐＢＧＨ−１０デルタ６−Ｇ”’Ｒおよびｐ　ＢＧＨ−１０デルタ６ −Ｅ”’Ｌ、Ｇ”’Ｒ，Ａ”２ＤはｐＢＧＨ−１０デルタ６に由来し、Ｔｔｈｌ 　１１　Ｉ部位（エクソン■の３′末端近くに見られる）とＸｍａ１部位（エク ソン■の５°末端近くに位置する）との間のＤＮＡを置き換えるための相補的オ リゴヌクレオチドを用いて領域特異的突然変異誘発を行うことによって作製され た。本明細書に記載するその他の突然変異も同様に作製した。

ｐＢＧＨ１０デルタ６−Ｇ”’Ｒに用いた相補的オリゴヌクレオチドは以下のも のであった： ｐＢＧＨ１０デルタ６−Ｅ　１１′Ｌ　、　Ｇｌ　ｌ　＠　Ｒ、Ａ　ｌ　２　ｔ 　Ｄに用いた相補的オリゴヌクレオチドは以下のものであった：を有するため［ Ｋａｉｓｅｒ　ａｎｄ　Ｋｅｚｄｙ、　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｃｉｄ、　２２３： ２４９−５５ＣＴＧ　ＡＴＧ　ＣＧＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＭ　ＧＡＴ　ＧＧＣ ＡＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＣＴＣＧＡＣＣＴＴ　ＣＴＡ　ＣＣＧ　ＴＧＧ　 ＧＧＧ　ＧＣＣＬｅｕ　Ｍｅｃ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　ＬａｕＥ　Ｉ　Ｉ　７　Ｌ、 ＧＩＩ９Ｒ５４〜１２２ＤＧＴ　ＧＴＣＴＡＴ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＡＡ Ｇ　ＧＡＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＡＧＧ　ＡＴＣＣＴＧ　ＧＡＣＡＣＡ　Ｃ ＡＧ　ＡＴＡ　ＣＴＣＴｒＣＧＡＣＴｒＣＣＴＧ　ＧＡＣＧＴＣＣ’ＩＴ　ＴＣ ＣＴＡＧ　ＧＡＣＣＧＧＡｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌ ｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　工１ｅ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＣＴ Ｇ　ＡＴＧ　ＣＧＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＧＣＡＣＣＣＣＧＡ ＣＴＡＣＧＣＣＣＴＣＧＡＣＣＴＴ　ＣＴＡ　ＣＣＧ　ＴＧＧ　ＧＧＧ　ＧＣＣ Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕこれらのオリゴヌクレオチドは、ｐＢ ＧＨ−１０デルタ６−Ｇｌ１９Ｒにおいては１１９に位置するエクソンをアルギ ニンに置換するＤ　Ｎ　Ａ変化をもたらし、ｐＢＧＨ−１，０デルタ６　Ｅ　ｌ 　ｌ　Ｉ　ｔ、、Ｇ”’ＲおよびＡ１２２Ｄにおいては１１７に位置するグルタ ミン酸をロイシンに、１１９に位置するグリシンをアルギニンに、そして１２２ に位置するアラニンをアスパラギン酸に置換するＤＮＡ変化をもたらす。これら のアミノ酸は親水性（アルギニンおよびアスパラギン酸）または疎水性（Ｏイシ ン）を有するため［Ｈｏｐｐａｎｄ　Ｗｏｏｄｓ、　ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、　７ ８：３８２４−２８　（１９８１）参照］、あるいは陽性（アルギニン）または 陰性（アスパラギン酸）に荷電した側鎖（１９８４）参照コ、そして理想的な両 親媒性αヘリックスの作製を増進する［Ｍａｒｇａｌｉｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３８：２２１３−２９　（１９８７）；　Ｂｒｅｍ ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　８ｒａｃｈｅｍｒｓｔｒｙ　２６：７７７４−７８　（ １９８７）；　Ｋａｒｓｅｒ　ａｎｄ　Ｋｅｚｄｙ、前出；　Ｃｈｅｎ、　ｅｔ 　ａｌ、、　ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）　８７：５０６１−６５　（Ｊｕｌｙ　１９９ ０）参照コ高いαヘリックス形成能を有するため［Ｃｈｏｕ　ａｎｄ　Ｆａｓｍ ａｎ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４７：２５１−７６　（１ ９７８）参照］に選択された。

さらに、これらのオリゴヌクレオチド二本鎖は唯一のＢａｍＨＩ制限酵素部位を 作り出すようにデザインされたサイレントな塩基対変化をコードし、これによっ てスクリーニングが簡単になる。

このオリゴヌクレオチドを標準法［Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ：　（ １９８２）］を用いてＴｔｈｌ　ｌ　ＩＩとＸｍａＩ部位との間にアニーリング してサブクローニングした。スクリーニング法を簡単にするＢａｍＨＩ制限酵素 部位で消化することにより突然変異プラスミドＤＮＡを同定した。このオリゴヌ クレオチドを標準法［ＭａｎｉａＬｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂｏｒ：　（１９８２ ）コを用いてＴｔｈｌ　１１　ＩとＸｍａ１部位との間にアニーリングしてサブ クローニングした。ＢａｍＨＩで消化することにより突然変異プラスミドＤＮＡ を同定した。

突然変異を起こしたウシ成長ホルモン標的領域のヌクレオチド配列を、修飾Ｔ７ 　ＤＮＡポリメラーゼ［５ｅｑｕｅｎａｓｅ、　ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ；　Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ（ＵＳＡ ）　７４：５４６３−６７　（１９７７）］を用いるジデオキシ・チェイン・タ ーミネーション法によって決定した。手動式ＤＮＡ配列決定のためのオリゴヌク レオチドブライマーはＤｕｐｏｎｔ　Ｃｏｄｅｒ　＃３００　ＤＮＡ合成機を用 いて合成し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、受動溶出およびエタノール 沈殿による濃縮によって精製した。２つの突然変異体の配列を直接分析するため に用いたオリゴヌクレオチドブライマーは以下のもの：　ｌ　８ｍｅ　ｒ　（５ ’　ＡＡＡＴＴＴＧＴＣＡＴＡＧＧＴＣＴＧ３’　）であった。簡単に説明する と、二本鎖プラスミドＤＮＡ　ｌ−３μｇを０．２Ｎ　ＮａＯＨの存在下に変性 し、オリゴヌクレオチドプライマー１０−２１０−２０ｐを変性した鋳型にアニ ーリングした（６５℃、２分、次いで３０分、徐々に冷却）。ｄＮＴＰとデオキ シアデノシントリオ三リン酸（＞１ｏ００ｃｉ／ｍｍｏｌｅＳＡｍｅｒｓｈａｍ ）の存在下にオリゴヌクレオチドブライマーをつけた鎖を伸長する修飾Ｔ７ＤＮ Ａポリメラーゼを用い、次いで４種の特定のジデオキシヌクレオチド混合物のそ れぞれに等量のアリコートを移すことにより鎖の伸長を無作為に停止することに よる２段階の重合を行った。

各反応にホルムアミド終結バッファーを加えた後、サンプルを８０℃で２分イン キュベートし、ｌＯ％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素の電気泳動およびオートラ ジオグラフィーによって４セツトの断片をサイズ分画した後、ＤＮＡ配列を決定 した。

実施例２・培ｌＩ＠乳動物細胞における発現上記したｉｎ　ＶｉｔｒＯの突然変 異誘発法を用いて、まず２つの突然変異ｂＧＨ遺伝子を作製した：１つはグリシ ン１１ｇをアルギニンに変更しく“Ｇｌ　１９Ｒ″）、また２番目のものはグル タミン酸１７をロイシンに、グリシン１１ｇをアルギニンに、そしてアラニン１ ２２をアスパラギン酸に変更する（Ｅ１１７Ｌ、Ｇ１１９Ｒ，Ａ１２２Ｄ）。

野生型ｂＧＨＤＮＡ　（ｐＢＧＨｌ　０デルタ）並びＬ　Ｌ＋れらの突然変異を コードするプラスミドを培養マウスＬ細胞中に一時的に導入し、次いでｂＧＨの 発現を分析した。“ウェスタン”分析によって、約２２，０００ダルトンのタン パク質バンドを、野生型ｂＧＨおよび２つの突然変異遺伝子から誘導されるｂＧ Ｈに観察した。

マウスＬ細胞を１０％ウシ血清と２５μ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を 含むＤＭＥＭ　（Ｇ　ｉ　ｂｃｏ）中で維持した。この研究では、既に述べたト ランスフェクション法［Ｌｏｐａｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２：５７０７−５７１７　（１９８４）］を修飾した方 法を用いた。簡単に述べると、プラスミドＤＮＡ２μｇを０．２ｍｇＤＥＡＥ− デキストランを含むＤＭＥＭｌ、Ｏｍｌに加えた。

この溶液を、あらかじめＤＭＥＭ２．Ｏｍｌで洗浄しておいた３５ｍｍの組織培 養プレート中の約１０’個の細胞に加えた。細胞を３７℃で１時間インキュベー トした後、ＤＮＡ−ＤＥＡＥ−デキストラン溶液を除去して、細胞に室温でＨｅ ｐｅｓ緩衝塩中の１０％　ＤＭＳＯ２，Ｏｍｌで９０秒間“ショック”を与えた 。

次いで、′ショック”溶液を除去して、細胞をＤＭＥＭ２．０ｍ１で洗浄した。

ＩＯ％Ｎｕ−血清（Ｃｏｌ　Ｉａｂｏｒａｔ　１ｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ）と５０ Ｒｇ／ｍｌゲンタマイシンを含む培地を毎日交換した。培養液は一２０℃で貯蔵 した。ｂＧＨ結合アッセイを行うには、トランスフェクションした細胞を血清不 含ＤＭＥＭ中でインキュベートし、その後培養液を除去して一２０℃で凍結した 。

分泌されたｂ　Ｇ　Ｈのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ＰＡＧＥ分析につい ては既に文献に記載されている［Ｋｏｐｃｈｊｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　ＤＮＡ、 　４：２３−３１　（１９８５）；　Ｋｅｌｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ 、　７６：７５−８０　（１９８９）］。この研究では、“ウェスタン”分析に はポリクローナル抗−ｂＧＨ血清を用いた。

実施例３．成長ホルモンレセプター結合試験ｐＢＧＨ−１０デルタ６（野生型ｂ ＧＨ）および突然変異ｂＧＨ遺伝子によってトランスフェクションされた細胞か ら血清を含まない培養液を回収した。培地を凍結乾燥してｂＧＨの濃度を決定し た後、文献記載の方法で競合膜結合試験を実施した［Ｓｉｍｔｈ＆　Ｔａｌａｍ ａｎｔｓ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ＋、、　２６２：２２１３−１９　（ １９８７）］　。いずれかの性のＣ５７ＢＬ／６ＪｘＳＪＬハイブリツドマウス （６０−１２０日齢）から得た肝臓膜調製物を、４容量（ｗ／ｖ）の０゜３Ｍス クロース、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ。

０．１ｍＭ　ＴＰＣＫおよび１ｍＭ　ＰＭＳＦ　（ｐＨ８，０）中で、Ｂｒｉｎ ｋｍａｎ　Ｐｏ１ｙｔｒｏｎでホモジエナイズした。

上記の工程および以下のすべての方法は４℃で実施した。ホモジェネートを２０ ．ＯＯＯｘｇで３０分間遠心し、上清を１００゜０００ｘｇで１時間遠心した。

ベレットを］ＯｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８，０）で１回洗浄し、再遠心した。こ のペレットを１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ８，Ｏ）中に、約５０ｍｇ／ｍｌの タンパク質濃度となるように再懸濁した。膜を少量とり、ドライアイス上で冷凍 し、−２０℃で貯蔵した。ローリ−のタンパク質アッセイ法［Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ＋、、　１９３：２６５−２７５　（ １９５１）］によって膜タンパク質濃度を測定した。

以下の方法を用いて競合結合アッセイを行った。タンパク質３ｍｇに対応するミ クロソーム膜を３０，０００ｃｐｍ／チューブの”’ＩｂＧＨ（Ｃａｍｂｒｉｄ ｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と、アッセイバッフｙ−（２ ０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ　ＣａＣＬ、０，１％　ＢＳＡＸ　Ｏ，０５％Ｎ ａＮ＋、ｐＨ８，０）０．３ｍｌから変化する非標識ｂＧＨとともにインキュベ ートした。すべてのアッセイを３回行った。室温で一晩インキユベートした後、 水冷アッセイバッファー１ｍｌを添加し、次いで１０．０００ｘｇで２０分間遠 心することによって遊離のホルモンから膜結合ホルモンを分離した。次いで膜ペ レットの放射能活性をアッセイした。膜と非標識ｂＧＨ５μｇとのインキュベー ションで得られた値から引くことによって特異的に結合した放射能活性を決定し た（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｔａｌａｍａｎｔｓ、　１９８７）。

膜調製物からの”５Ｉ−ｂＧＨの５０％置換で得られた有効量（ＥＤ５０）を決 定した。ｐＢＧＨ−１０デルタ６　ＧＩＩＲおよびｐＢＧＨ−１０デルタ６−Ｅ ”’ＬＳＧ”’Ｒ５Ａｌ２”Ｄによってコードされる突然変異ｂＧＨは野生型ｂ ＧＨと同様なＥＤ５０値であることことが明らかとなった。

実施例４ニドランスジ工ニツクマウス作製のパイロット研究野生型と突然変異ｂ ＧＨ遺伝子を含む一連のトランスジェニックマウス系を標準的マイクロインジェ クション法（ＭｃＧｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）によって作製した。

マウス尾からのＤＮＡ抽出、ドツトプロットおよび血清測定は文献記載の方法（ ＭｃＧｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８８）によって行った。

この遺伝子はトランスジェニックマウスのその他の組織と同様に肝臓組織におい て活性であることが既に示されているマウスメタロチオネイン■プロモーターの 転写制御配列を含む［Ｐａ１ｍ１　ｔｅｒｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３ ００：６１１−６１５　（１９８２）］　、　ｖイクロインジエクション法で生 産した子孫は、スロットプロットハイブリダイゼーション分析によってｂＧＨＤ ＮＡを検定した。ｐＢＧＨ−１０デルタ６（野生型）、ｐＢＧＨ−１０デルタ６ 　ＧＩＩＩＲｌおよびｐＢＧＨ−１０デルタ６Ｅ　ｌｌ７Ｌ、　Ｇ　１＋９Ｒ， Ａ　１ｌｔＤから由来する組換えｂＧＨＤＮＡ配列の約１コピーを含むマウス系 を作製した。トランスジェニック動物からの血清のｂＧＨレベルをウェスタン法 を用いてアッセイした。血清中に野生型ｂＧＨ外来遺伝子を発現するマウスはす べて、それに対応して成長率が上昇していた。血清中に突然変異体ｂＧＨ（Ｇ” ”ＲまたはＥ　ｌ　１７Ｌ、Ｇ”’Ｒ，Ａ””Ｄ）を発現したマウスは劇的かつ 有意に小さかった。８週間生育した後、対照の同腹の子と比較した野生型ｂＧＨ トランスジェニックマウスの成長率は１．５であり、対照の同腹の子と比較した ２匹のｂＧＨ突然変異体マウスの成長率は約０゜６であった。三重突然変異体の 場合には、突然変異ｂＧＨ遺伝子を発現する１０匹の創始者マウスを作製した。

トランスジェニックマウスと非トランスジェニックの同腹の子の間の成長率は０ ゜５８から１．００であった。成長抑制の程度は突然変異す、ＧＨの血清レベル と直接相関していた。３匹の創始者マウスを交配して子孫に形質を受け継がせた 。その結果、これらの子孫の約５０％が該遺伝子に陽性であり、これに対応する 小さい表現型を有していた。

ＧＨの多くの作用はインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）とじて知られるペプチド ファミリー、特に主として肝臓で産生され、次いでそのレセプターとＧＨ結合す ると考えられているＩ　ＧＦ−１によって仲介されることが示されてきた［Ｔｒ ｕｅｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　４７：４４３６７　（１９８５）；　Ｚａｐｔ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈａｒｍ、　Ｒｅｓ、。

２４：１２１−１３０　（１９８６）］。ＩＧＦ−１は古典的な負のフィードバ ック機構によって下垂体におけるＧＨの産生を低下させることが示されている［ Ｌｅｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１１９：１４８ ９−９６　（１９８６）］。］ｐＢＧＨ１ＯΔ６−Ｍ８ランスジェニックマウス における成長抑制を説明する１つの仮説は、ｂＧＨ−Ｍ８はマウスＧＨ（ｍＧＨ ）に対するｉｎ　ｖｉｖｏでのアンタゴニストとして作用し、これによってマウ スＩＧＦ−１の産生を抑制する、というものである。もしもこの仮説が真実なら ば、ｂＧＨ−Ｍ８　トランスジェニックマウスにおいて血清マウスＩＧＦ−ルベ ルの低下だけではなく、下垂体におけるｍＧＨ産生の上昇も予期できるであろう 。本発明者は、“小さい”　トランスジェニックマウスの血清中のＩＧＦ−ルベ ルは正常な非トランスジェニックマウスの約５０％であるのに、野生型ｂＧＨを もつマウス（大きいマウス）は非トランスジェニックマウスのＩＧＦ−ルベルの 約２倍であることを発見した。ｂＧＨ−Ｍ８１−ランスジェニックマウス、ｂＧ Ｈトランスジェニックマウスおよびその非トランスジェニックな同腹の子から採 取した全下垂体の免疫プロット分析の結果は、これらの成長抑制されたマウスの 下垂体はその非トランスジェニックな同腹の子と比較して、より高いレベルのｍ ＧＨを含むことを示唆した。これとは対照的に、ｂＧＨトランスジェニックマウ スのｍＧＨレベルはおおいに抑制されていた。なぜなら、マウスの血清ＩＧＦ− ルベルはその非トランスジェニックな同腹の子の血清中のレベルの２倍にまで上 昇していたからである［Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、 　２２２：８０９−１４　（１９８３）］　ｏこれらの結果は、合わせて考える と、変更したｂＧＨ分子が内在性マウスＧＨに対するアンタゴニストとして作用 することを示唆している。したがって、我々の知見によれば、これはｉｎ　ｖｉ ｖｏにおける成長ホルモンアンタゴニストの最初の例であり、またＧＨ類の成長 促進およびレセプター結合活性を連結させない最初の例である。

実施例５：ｂＧＨおよびｈＧＨのその他のムティンのスクリー二Ｚグ 同様な方法によって、第３αヘリツクスにおける変更をもつｂＧＨおよびｈＧＨ のムティンを作製し、Ｌ細胞での分泌を試験し、いくつかの場合には、トランス ジェニックマウスの成長に及ぼす影響を試験して以下の結果を得た。

ムティンは、国際的に受け入れられている１文字記号を用いることにより、元の アミノ酸、ｂＧＨのアミノ酸配列中のその位置、および置換アミノ酸を特定して 記載する［Ｇｅｏｒｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑ、　Ｄａｔ ａ　Ａｎａｌ、、　１：２７−３９　（１９８７）］。

突然変異ｂＧＨ遺伝子の第１の組をトランスジェニックマウスで発現させたとこ ろ、野生型ｂＧＨを発現するマウスの成長率と同様の成長率を有する動物が得ら れた（すなわち、］、５９−１．７２）。我々はこの類縁体を“完全機能性アゴ ニスト”と呼名（（表１）。

突然変異ｂＧＨ遺伝子の第２の組をトランスジェニックマウスで発現させたとこ ろ、野生型ｂＧＨを発現する動物よりも小さい成長率を有するマウスが得られた （すなわち、１．２９−１．３５）。我々はこのｂＧＨ類縁体を“部分的機能性 アゴニスト”と呼び、これを表■に記載する。

突然変異ｂＧＨ遺伝子の第３の組をトランスジェニックマウスで発現させたとこ ろ、非トランスジェニックマウスよりも小さい成長率を有する動物が得られた（ すなわち、約１．０）。我々はこの類縁体を“非機能性アゴニスト”と呼ぶ（表 ■）。

突然変異ｂＧＨ遺伝子の第４の組をトランスジェニックマウスで発現させたとこ ろ、０．５７から１．０の間の成長率を有するマウスが得られた（表■）。マウ スの成長率はｂＧＨ類縁体の血清レベルと逆相関していた。すなわち、ｂＧＨ類 縁体の血清レベルが上昇するほど、動物の成長率は低下した。この相関関係を図 １３にグラフとして示す。

さらに、これらの類縁体をＮＩＨ−３Ｔ３−前脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙ ｔｅｓ）で発現させたところ、前脂肪細胞の分化を刺激しなかったが、天然型Ｇ Ｈはこの分化を促進するであろう（図１２）。事実、これらの類縁体は前脂肪細 胞の分化を促進する野生型ＧＨの能力に拮抗するであろう（図１１）。我々はこ れら類縁体を“機能性アンタゴニスト”と呼ぶ（表■）。

我々はまた、野生型ｈＧＨ，ｈＧＨＧ１２０ＡＳｈＧＨＧ１２０ＲおよびｈＧＨ Ｇ１２０Ｗのいずれかを発現するトランスジェニックマウスを作製した（表Ｖ） 。ｈＧＨＧ１２０Ａを発現するマウスは野生型ｈＧＨを発現するマウスと同様の 成長増強された表現型を示す（表Ｖ）。我々はこのｈＧＨ類縁体を“機能性アゴ ニスト”と呼ぶ。これとは対照的に、ｈＧＨの１２０の位置をＧの代わりにＲま たはＷで置換し、次いでトランスジェニックマウスで発現させると、０．７３か ら０．９６の成長率を有する動物が得られ（表■）、その血清ｈＧＨ類縁体のレ ベルは成長表現型と逆相関していた；すなわち、これらのｈＧＨ１２０類縁体の 血清レベルが上昇するほど、成長率が低下する。この相関関係を図１４に示す。

したがって、“機能性アンタゴニスト”として作用するｂＧＨ類縁体と同様に、 我々はこれらのｈＧＨ１２０類縁体を“機能性アンタゴニスト”と呼ぶ。ｂＧＨ の１１９の位置にあるグリシン残基は、ｈＧＨの１２０の位置にあるグリシン残 基と相同であることに注意することは重要である。これらはいずれも第３αヘリ ツクスの中心部に位置する。

ｂＧＨ類縁体のサブセットを表■に示すが、この表中では突然変異ＤＮＡをマウ スＬ細胞にトランスフェクションした後、分泌される能力を評価した。これらの 突然変異ＤＮＡを含むトランスジェニックマウスは作製しなかった。

突然変異体ＫＩ　Ｉ　２Ｌ、ＫＩ　Ｊ　４Ｗはへワックスの疎水性表面・を広げ る効果を示す。この突然変異体は野生型成長ホルモンと同様に動物の成長に大き な影響を及ぼす。

突然変異体Ｋｌ　１４Ｐ、Ｅｌ　ｌ　８ＰおよびＬ１２１Ｐ（ならびにその各種 紐み合わせ）は明らかにαヘリックスを破壊する（プロリンは強力なヘリックス 破壊者である）。成長関連の生物活性が廃棄される。突然変異体Ｅ１２６Ｇは特 異なケースである；すなわち、グリシンはへワックス破壊者であるが、１２６の 位置はヘリックスの末端であり、正常な生物活性は維持される。しかしながら、 Ｇ１１９Ｐの場合は、強力なヘリックス破壊者をより一層強力な破壊者の代わり に用いると、明らかにαヘリックスは保持された。

野生型成長ホルモンの第３αヘリツクスは、３つの位置で完全な両親媒性αヘリ ックスとは異なる。第１に、１１７の位置で、Ｇｌｕは疎水性表面における親水 性アミノ酸である。第２に、ｌ１９の位置で、Ｇｌｙは親水性表面における中性 アミノ酸である。

最後に、１２２の位置で、Ａｌａは親水性表面における疎水性アミノ酸である。

突然変異体Ｅｌ　１７ＬＳＧｌ　１９ＲおよびＡ１２２Ｄは個別に、または組み 合わせによって、ヘリックスの両親媒性を増強する。さらにＧ１１９Ｒは配列の αヘリックス傾向を増強する。

突然変異体ＧＩＩ９ＲおよびＥｌ　ｌ　７Ｌ／Ｇｌ　１９Ｒ／Ａｌ　２２Ｄの成 長阻害活性は、第３αヘリツクスの両親媒性の増強と関連する、というのが我々 の最初の仮説であった。そこで、第３αヘリツクスの両親媒性は上記活性と大部 分無関係であるという証拠を探した。

（１）ｗｔ　ｂＧＨのような単−Ｅ１１７Ｌは大きい動物を産生じた。

（２）プロリンはグリシンと同じくらい親水性であるが、突然変異体Ｇ１１９Ｐ は小さい表現型の動物を産生じた。

（３）ロイシンは疎水性であり、したがってヘリックスの親水性表面を破壊する が、突然変異体Ｇ１１９Ｌは小さい表現型の動物を産生じた。

（４）ＥＩ　Ｉ　ＩＬ／Ｇｌ　１９Ｗ／Ｒ１２５Ｌの突然変異体はすべてへワッ クスの親水性表面を破壊するが、これら３つの変異は小さい表現型の動物を産生 じた。

（５）単−Ａ１２２Ｄは成長に何ら影響を及ぼさない突然変異体を産生ずる。

したがって本発明は、ある態様においては、成長阻害活性をもたらすが、ヘリッ クスの両親媒性を低下させるか、あるいはこれを変化させないような第３αヘリ ツクスの突然変異に関する。

ｂＧＨ中のＧＬ１９に対応するコドンを体系的に変更することにより、さらに別 の成長ホルモンアンタゴニストを同定し、このをコードするように、実施例１で 記載するものとは異なるオリゴヌクレオチドを合成することによって容易に実施 できる。同様に、ｈＧ）（のＧ１２０のような、その他のＧＨ類の第３αヘリツ クスの相同性グリシン残基を変更することもできる。同様にして、ＧＨの第３α ヘリツクスのその他のアミノ酸に対応するコドンの変更マウス尾部から血液試料 を得た。試料を室温で５分間凝固させ、次いで遠心して血清を回収し、分析時ま で一２０℃に凍結した。

のスライドにピペットで取り、反射式分光光度計で比色定量で分析し、品質対照 （Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）の基準サンプルと比較した。

結果： ｂＧＨ−Ｍ８　）ランスジェニックマウスとその非トランスジェニックな同腹の 子との間には、血中グルコース、血清尿素／窒素および血清トリグリセリドレベ ルにおいて有意な差が見られない。

しかしながら、ｂＧＨ−Ｍ８　）ランスジェニックマウスにおける全血清コレス テロールのレベルは、その非トランスジェニックな同腹の子およびｂＧＨトラン スジェニックマウスと比較して低下した（Ｐ＜０．０５）。

実施例７二成長ホルモンアンタゴニスト活性のためのｉｎ　ｖｉｔｒｏバイオア ッセイ 成長ホルモンの研究は、成長ホルモンが前脂肪３Ｔ３細胞からの脂肪の形成を促 進することを示した［Ｍｕｒｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１１２９ニア８ ９　（１９８２）］。］グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）を 、このＧＨ誘導の脂肪転換のための分化のマーカーとして用いてきた［Ｗｌｓｅ 　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｙａ、、　２５４：２７３ −７５（１９７９）；　Ｎ１ｘｏｎ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｊｎ ｏｌｏｇｙ、　１１４：５２７　（１９８４）；　Ｐａ１ｒａｕｌｔ　ａｎｄ　 Ｇｒｅｅｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　７６ ：５１３８　（１９７９）コ　。

ｂＧＨ突然変異体がＧＨアンタゴニストとして作用するか否かを決定するために 我々はこのアッセイ法を用いた。ｂＧＨもｂＧＨ−Ｍ８もｌｏｍＭのＫｄ値でこ れらの前脂肪細胞上のレセプターと結合する。天然型配列のウシ成長ホルモン（ ３０ｐＭ）に暴露して７日間培養すると、前脂肪細胞が分化してＧＰＤＨ活性が 刺激される。もしもｂＧＨ突然変異体を野生型ｂＧＨを含む培地に添加すると、 ＧＰＤＨ活性が用量依存的に減少し、したがって、おそらくは脂肪の転換が減少 する（図１１）。

このアッセイは可能性のあるＧＨアンタゴニストを同定する簡便なスクリーニン グ法である。

実施例８： 野生型ｂ　Ｇ　Ｈ遺伝子についてトランスジェニックなマウスは進行性の重症な 糸球体硬化症を発症し、糸球体の大きさが増大することが知られている［Ｄｏｉ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈ、、　１３７：５４１−５２（１９ ９）；　Ｒｅ５ｃｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　６５：６ ０１−５　（１９９１）；　Ｄｏｉ　ｅｔ　ａｔ、、　［！ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ｏｇｙ、　１３０：４０５−４１４　（１９９２）コ。突然変異体ｂＧＨが成長 を増強しないｂＧＨ−Ｍｌ　ｌマウス（すなわち、Ｌ１２１Ｐ、Ｅ１２６Ｇ突然 変異体）がやはり糸球体硬化症を示すように、これは単に体の大きさの関数では ない。しかしながら、ｂＧＨ−Ｍ８　（ＧＩ　Ｉ　９Ｒ）マウスでは、非トラン スジェニックマウスと比較して血清ＩＧＦ−１、体の大きさ、および糸球体の大 きさが減少したが、糸球体硬化症は見られなかった。

ｂＧＨ類縁体を発現するトランスジェニックマウスとその非トランスジェニック な同腹の子との間の６−８週齢における成長率の比較をまとめる。

表１．以下のｂＧＨ類縁体を発現するトランスジェニックマウスは、野生型ｂＧ Ｈを発現するトランスジェニックマウスと同様の表現型を示した（我々はこの類 縁体を“完全機能性アゴニスビと呼ぶ）。＊ ｂＧＨ類縁体　個体数　平均成長率　標準偏差ＷＴ−ｂＧＨ７１，６１０，１４ ＊これらのｂＧＨ類縁体の血清レベルと成長の表現型には何ら相関関係がない。

これらの突然変異ｂＧＨ遺伝子をマウスＬ細胞で発現させたところ、分泌パター ンは野生型ｂＧＨと同様であった。

（本頁以下余白） 表■、以下のｂＧＨ類縁体を発現するトランスジェニックマウスは、野生型ｂＧ Ｈを発現するトランスジェニックマウスよりも小さい表現型を示すが、非トラン スジェニックマウスよりも大きい表現型を示した（我々はこの類縁体を“部分的 機能性アゴニスト”と呼ぶ）。＊ ｂＧＨ個体数　平均成長率　標準偏差 ＷＴ−ｂＧＨ７１６１０，１４ ＊これらのｂＧＨ類縁体の血清レベルと成長表現型の間には何ら相関関係がない 。突然変異ｂＧＨ遺伝子は、野生型ｂＧＨと同様のパターンでマウスＬ細胞によ って発現され、かつ分泌される。

表１から表■においては、“機能性”または“非機能性”としての変異体の特性 決定が成長に対するその作用に関連して用いられることに注意されたい。

（本頁以下余白） 表■、以下のｂＧ）（類縁体を発現するトランスジェニックマウスは、非トラン スジェニックな同腹の子と同様な表現型を示した（我々はこの類縁体を“非機能 性アゴニスト”と呼ぶ）＊＊血清中のｂＧＨ類縁体のレベルと成長の表現型との 間には何ら相関関係がない。これらの突然変異ｂＧＨ遺伝子は、マウスＬ細胞で 分泌されないｂＧＨ−Ｋｌ　ｌ　４Ｐ、Ｅｌ　ｌ　８ＰおよびｂＧＨ−Ｌ１２１ Ｐ、Ｅ１２６Ｇを除いて、マウスＬ細胞中で発現され、また分泌される。

（本頁以下余白） 表■、以下のｂＧＨ類縁体を発現するトランスジェニックマウスは、非トランス ジェニックな同腹の子よりも小さい表現型を示した（我々はこの類縁体を“機能 性アンタゴニスト”と呼ぶ）。＊ｂＧＨ血清ｂＧＨ成長率 類縁体　動物個体数　性別　（μｇ／ｍｌ）　（２力月）Ｅ１１７Ｌ、Ｇ１１９ Ｒ。

Ａ１２２Ｄ　６　Ｆ　３・４０・５８ １５　Ｍ　３．３　０．６９ ５５　Ｍ　２．Ｌ　Ｏ，８５ ６５Ｆ　Ｏ，６１，０ ６７Ｆ　Ｏ，６０，８７ ７０Ｆ　３．３　０．７０ ７１Ｆ　２．６　０．７０ ８９　Ｆ　Ｃ８０，８５ （ｙｌ：Ｌ９Ｒ２５Ｍ　Ｏ，５０，９３２８”　Ｍ　Ｏ，９０，８８ ４９°　Ｍ　６．０　０．６０ ５３　Ｍ　１．ｓ　Ｏ，８５ ９４Ｆ　Ｏ，２０，９８ Ｄ　８　Ｆ　３　、　Ｏ０、７４ Ｇ１９Ｐ　９　Ｆ　２．０　０．８１ Ｇ１９Ｋ　１０　Ｍ　Ｏ，５０，８４ １２Ｍ　Ｏ，４０，９５ １８Ｆ　４．０　０．７８ ２６　Ｆ　５．０　０．５９ Ｇ１１９Ｌ　２３　Ｆ　６．５　０．８１２７　Ｍ　Ｏ，５１，０ Ｇ１１９Ｗ　１６　Ｍ　８．０　０．６４Ｇ１１９Δ　１４　Ｍ　Ｏ，５０，９ ６１５Ｍ　Ｏ，５０，９０ ２２Ｍ　８．０　０．７５ ２３　Ｍ　Ｏ，５０，９０ ＊マウスの成長抑制レベルは類縁体の血清レベルと相関する（図１３参照）。こ れらの突然変異ｂＧＨ遺伝子はマウスＬ細胞で発現され、かつ分泌される。分泌 パターンは野生型ｂＧＨと同様である。

（本頁以下余白） 表Ｖ、１２０の位置での単一アミノ酸置換をコードするｈＧＨ遺伝子を発現する トランスジェニックマウスのまとめ＊　（ｈＧＨ−Ｇ１２０Ａは“完全機能性ア ゴニスビである。ｈＧＨ−Ｇ１２０ＲおよびｈＧＨ−Ｇ　ｌ　２０Ｗは“機能性 アンタゴニスト”として作用する）。

ｈＧＨ血清ｈＧＨ成長率 類縁体　動物個体数　性別　（μｇ／ｍｌ）　（２力月）ＷＴ−ｈＧＨｎ−７１ ，６２±０．１５＊ｂＧＨＧｌｙ　１１９はｈＧＨｃｔｙ　１２０と均等の位置 にある。したがって、我々は文献と同様にｈＧＨＧｌｙ　１２０について言及す る。

＊＊成長抑制のレベルはｈＧＨ類縁体の血清レベルと相関する（図１４参照）。

表Ｖ１．　トランスジェニックマウスではなくマウスＬ細胞で発現させた突然変 異ｂＧＨ遺伝子のまとめ ｂＧＨ類縁体　Ｌ細胞分泌 野生型　ｂＧＨ 表■、”Ｍ”マウス突然変異体 Ｆ／に、　／ 裕 Ｆ／６３ ｂＧＨ雌の１１９位での継続実験 Ｆ／に、６ Ｆ／θ〃 ｂＧＨＭ８　（ｐＭ） Ｆ／６　／２゜ ｂＧＨまたはｂＧＨ−Ｍ８　（ｐＭ） Ｆ／６．　／、３ Ｆ／６　／４ 国際調査報告　。ｒＴ／ＩＩ、Ｑ１７／ｎ１ｓｉｊｏｒＴｔｕ！Ｉ　Ｑ２／ｎ３ ｓ３２ フロントページの続き

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の第３αヘ リックスと実質的に相同であるが同一ではないαヘリックスを含む、少なくとも １１個のアミノ酸の成長ホルモンアンタゴニストペプチドまたはタンパク質であ って、ｂＧＨまたはｈＧＨの第３αヘリックスとの差異の少なくとも１つが野生 型ｂＧＨの残基１１９または野生型ｈＧＨの残基１２０に対応する残基にあり、 該ペプチドまたはタンパク質が脊椎動物成長ホルモンの少なくとも１つの生物学 的活性に拮抗することができ、かつ単一置換ｂＧＨ変異体Ｇ１１９Ｐ、Ｇ１１９ Ｋ、Ｇ１１９しおよびＧ１１９Ｒまたは三重置換ｂＧＨ変異体Ｅ１１７Ｌ、Ｇ１ １９Ｒ、Ａ１２２Ｄ以外のタンパク質である、上記の成長ホルモンアンタゴニス トペプチドまたはタンパク質。
2. ２．前記ペプチドまたはタンパク質がウシまたはヒト成長ホルモンと実質的に相 同である、請求項１記載のペプチドまたはタンパク質。
3. ３．野生型ｂＧＨのアミノ酸１１９または野生型ｈＧＨのアミノ酸１２０に対応 するアミノ酸が、グリシンとアラニンを除いた天然に存在するすべてのアミノ酸 より成る群から選ばれる、請求項２記載のペプチドまたはタンパク質。
4. ４．差異がｂＧＨＧ１１９またはｈＧＨＧ１２０に対応するアミノ酸の欠失であ る、請求項２記載のペプチドまたはタンパク質。
5. ５．請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドまたはタンパク質をコードする配 列を有する遺伝子を含み、さらに該遺伝子に機能しうる状態で連結されたプロモ ーターを含む組換えＤＮＡ分子。
6. ６．請求項５の組換えＤＮＡ分子により形質転換された宿主細胞。
7. ７．多数の請求項６記載の形質転換細胞を含むヒト以外のトランスジェニック動 物。
8. ８．前記動物が対照動物と比べて低下した成長速度を示す、請求項７記載の動物 。
9. ９．請求項１記載のペプチドまたはタンパク質をコードする配列を有する遺伝子 を含む細胞に、該遺伝子の発現を導きうる条件を与え、それにより該タンパク質 を使用可能なまたは回収可能な形態で生産させることから成る、成長ホルモンア ンタゴニストペプチドまたはタンパク質の生産方法。
10. １０．請求項１のペプチドまたはタンパク質および製剤上許容される担体を含有 する医薬組成物。
11. １１．ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の第３α ヘリックスと実質的に相同であるが同一ではないαヘリックスを含み、ｂＧＨま たはｈＧＨの第３αヘリックスとの差異の少なくとも１つがｂＧＨＧ１１０また はｈＧＨＧ１２０に対応する残差にあり、ヒトまたは動物成長ホルモンの少なく とも生物学的活性に拮抗することができる、少なくとも１１個のアミノ酸の成長 ホルモンアンタゴニストペプチドまたはタンパク質の、該生物学的活性のレベル が過剰である点に特徴があるヒトまたは動物の症状を予防もしくは治療するため の組成物の製造における使用。
12. １２．適当な宿主細胞において、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）またはヒト成長ホ ルモン（ｈＧＨ）の第３αヘリックスと実質的に相同であるが同一ではないαヘ リックスを含み、ｂＧＨまたはｈＧＨの第３αヘリックスとの差異の少なくとも １つがｂＧＨＧ１１９またはｈＧＨＧ１２０に対応する残基にあり、ヒトまたは 動物成長ホルモンの少なくとも生物学的活性に拮抗することができる、少なくと も１１個のアミノ酸の成長ホルモンアンタゴニストペプチドまたはタンパク質を 発現することができる組換えＤＮＡ分子の、該生物学的活性のレベルが過剰であ る点に特徴があるヒトまたは動物の症状を予防もしくは治療するための組成物の 製造における使用。
13. １３．前記生物学的活性が成長の促進であり、前記ペプチドまたはタンパク質が 成長抑制作用を有する、請求項１１または１２記載の使用。
14. １４．前記症状が糖尿病である、請求項１１または１２記載の使用。
15. １５．前記生物学的活性が網膜内皮細胞のような微小血管組織に損傷を与える、 請求項１４記載の使用。
16. １６．前記生物学的活性が糸球体硬化症の発症の一因となる、請求項１４記載の 使用。
17. １７．前記症状が過剰レベルの血清コレステロールであり、前記ペプチドまたは タンパク質が低コレステロール血作用を有する、請求項１１または１２記載の使 用。
18. １８．前記生物学的活性が腫瘍形成性である、請求項１１または１２記載の使用 。