NO314309B1 - Veksthormonantagonistpeptid, vektor og vertcelle inneholdende en DNA-sekvens som koder for peptider, fremgangsmåte for fremstilling,farmasöytisk sammensetning inneholdende veksthormonantagonistpeptidet og anvendelse avveksthormonantagonistpept - Google Patents

Description

Vekstinhibltoriske antagonister av bovint veksthormon oppnådd ved mutasjon av den tredje alfaheliksen til det proteinet er det beskrevet. Disse nye hormonene kan bli administrert eksogent til dyr eller også kan transgene dyr bli dannet slik at de uttrykker antagonisten og derved utviser en redusert vekstfenotype.

Foreliggende oppfinnelse vedrører nytt veksthormonantagonistpeptid, spesielt bovint veksthormonantagonlst-peptid, muteiner som inhiberer veksten til dyr eller på annen måte antagoniserer virkningene av det endogene veksthormonet. Disse analogene kan bli uttrykt i transgene dyr som derved oppnår en "redusert vekst" fenotype.

Bovint veksthormon (GH) er et protein med 191 aminosyrer som blir naturlig syntetisert i fremre hypofyse. Molekylvekten til det fullstendige proteinet er på omtrent 22.000 dalton, men blir opprinnelig dannet som et pre-vekst hormon med 26 ekstra aminosyrer aminoter-minalt. Denne lederen (eller signalpeptidet) blir normalt spaltet av i løpet av utskillelsen av hormonet fra bovine hypofyseceller. Flere former av det fullstendige proteinet er blitt funnet i naturen. N-terminalen kan variere (på grunn av variasjonen i spaltningssete i løpet av utskillelsen) slik at det modne proteinet begynner med enten NH2-Ala-Phe-Pro eller NEtø-Phe-Pro. Aminosyren i posisjon 126 kan i tillegg være enten leucin eller valin, sannsynligvis som et resultat av allelisk variasjon i den bovine populasjonen.

Eksogen administrering av bGH til kveg øker melkepro-duksjonen, effektiviteten til f5ret, vekstraten og forholdet mellom ikke-fettvev og fettvev og reduserer fetgjøringstiden.

bGH er blitt produsert ved rekombinante DNA-teknikker, se f.eks. Fraser, U.S. 4.443.539 (gjær); Buell, EP Appl. 103.395 (bakterier); Krivl, EP Appl. 193.515 (bakterier); Kopchick, EP Appl. 161.640 (innkapslede museceller implantert inn i dyr); DeBoer, EP Appl. 75.444 (bakterier, genmodifisert for å eliminere

skadelig sekundær struktur) og dette har lettet produksjonen av bGH-analoger ved setespesifikk mutagenese. Aviv, GB 2.073.245 beskriver dermed produksjonen av Met-Pro (des Ala)-bGH, Met-Arg (des Ala)-bGH, Met-Glu-Gly (des Ala)-bGH, og des (Ala<ip>he<2->Pro3-Ala4 )-bGH i E. coil. Brems, et al., PNAS (USA) 85:3367-71 (1988) rapporterte fremstilling av bGH-mutant K112L, som utvidet den hydrofobe fasen til den tredje alfaheliksen til bGH. 96-133-fragmentet av denne mutanten ble også dannet.

Den biologiske aktiviteten til de proteolytiske fragmentene av bGH er også blitt studert. Brems, et al., Biochemistry, 26:7774 (1987); Swislocki, et al., Endocrinology, 87:900 (1970); Paladini, et al., TIBS, 256 (nov. 1979). bGH-fragmentet inneholdende aminosyrene 96-133 er overlegen i vekstfremmende analyser i forhold til bGH-1-95 og bGH-151-191. Hara, et al., Biochemistry, 17:550 (1978); Sonenberg, U.S. Patent Nos. 3.664.925 og 4.056.520; Chen og Sonenberg, J. Biol. Chem., 250:2510-14 (1977). Et oktapeptid avledet fra aminoterminalen til hGH er blitt vist å ha hypoglycemisk aktivitet, se Ng, et al., Diabetes, 23:943-949 (1974), men har ingen effekt på veksten. Lignende resultater ble observert med fragmentet bGH (96-133). Graf, et al., Eur. J. Biochem., 64:333-340

(1976); Hara, et al., Biochem., 17:550-56 (1978).

Analoger av bGH har forskjellig vekstfremmende aktivitet, og det har også de kjente analogene til andre veksthormoner. En veksthormonanalog med vekstinhibitorisk aktivitet er ikke tidligere blitt rapportert.

Forskjellige transgene dyr er blitt dannet. Hammer, et al., Nature, 315:680-683 (1985) (kaniner, sau og griser). Visse dyr er blitt påvirket for å uttrykke et veksthormon, og øket vekst av slike transgene dyr er blitt rapportert. Palmiter, et al., Nature 300:611

(1982) mikroinjiserte hann-pronucleus til fertiliserte museegg med et DNA-fragment inneholdende promoteren til metallotionein-I-genet fra mus koblet til det struktu-relle genet til veksthormonet fra rotter. Flere av de transgene musene utviklet fra den genetisk modifiserte zygoten viste en vekstrate som var vesentlig høyere enn den i kontrollmusene. (Den genetisk modifiserte musen virker som et testmiljø for å bestemme virkningen av hormonet på veksten av dyret). Senere demonstrerte Palmiter, et al., Science, 222:809 (1983) at en lignende vekstøkning kunne bli oppnådd i transgene mus som bærer et uttrykkbart humant veksthormongen. En lignende effekt blir observert når den humane veksthor-monfrigjørende faktoren blir uttrykt i transgene mus. Hammer, et al., Nature, 315:413 (1985).

Bovint veksthormon er også blitt uttrykt i transgene dyr. McGrane, et al. J. Biol. Chem., 263:1144351

(1988) ; Kopchick, et al., Brazil. J. Genetics, 12:37-54

(1989) . Transgene dyr karakterisert ved et eksogent gen som utviser en redusert vekstfenotype har før vært ukjent.

Foreliggende oppfinnelse vedrører vektshormonantago-nistpeptider eller -proteiner som er vesentlig homologe med virveldyrveksthormon, men som har vekstinhibitorisk aktivitet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører således et veksthor-monantaganistpeptid eller -protein med minst 11 aminosyrer, kjennetegnet ved at det omfatter en mutert alfaheliks som er vesentlig homolog med, men ikke identisk med, den tredje alfaheliks til et referanse-veksthormon (bGH), fig. 1), og humant veksthormon hGH selektert fra gruppen bestående av bovint vektshormon (bGH) og humant veksthormon (hGH) og som dannes av aminosyrene hovedsakelig tilsvarende posisjonene 106-129 i den naturlig forekommende formen, hvor minst en av forskjellene fra den tredje alfaheliks i bGH eller hGH er ved et residie som tilsvarer residiet 119 til villtype bGH eller 120 til villtype hGH, idet nevnte peptid eller protein kan antagonisere minst én biologisk aktivitet til veksthormonet fra virveldyr, og som er et protein forskjellig fra: (a) enkeltsubstitusjonen bGH-mutantene G119P, G119K, G119L og G119R, (b) trippelsubstitusjonen bGH-mutantene E117L,

G119R, A122D, eller

(c) hGH-mutanten Y111V, L113I, D1160, E11SK, E119B,

G120L, Q122E, T123G, G126L, R127I , E129S.

Videre vedrører oppfinnelsen en vektor, kjennetegnet ved at den inneholder en DNA-sekvens som koder for peptidet eller proteinet ifølge oppfinnelsen, og som ytterligere omfatter en promoter operativt koblet til nevnte gen.

Videre vedrører oppfinnelsen en vertcelle, kjennetegnet ved at den er transformert med og kan uttrykke det rekombinante DNA-molekylet ifølge oppfinnelsen.

Videre vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for å produsere et vektshormonantagonistpeptid eller -protein, kjennetegnet ved at den omfatter å transformere en celle som bærer med en ekspresjonsvektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for et peptid eller protein ifølge oppfinnelsen, og nevnte protein blir produsert i en egnet eller gjenvinnbar form.

Videre vedrører oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter peptidet eller proteinet ifølge hvilket som helst av kravene 1 - 10, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Videre vedrører oppfinnelsen anvendelse av et veksthormonantagonistpeptid eller -protein på minst 11 aminosyrer, som omfatter en mutert alfaheliks som i det vesentlige er homolog med, men ikke identisk til, den tredje alfaheliks av et referanseveksthormon (bGH), fig. 1) og humant veksthormon hGH selektert fra gruppen bestående av bovint veksthormon (bGH) og humant veksthormon (hGH) og som dannes av aminosyrene hovedsaklig tilsvarende posisjonene 106-129 i den naturlig forekommende formen, hvor minst én av forskjellene fra den tredje alfaheliks i bGH eller hGH er ved et residie korresponderende til residie 119 hos villtype-bGH eller 120 hos villtype-hGH, hvor nevnte peptid eller protein er i stand til å antagonisere minst den biologiske aktiviteten til et humant eller animalsk veksthormon, og er et peptid eller protein annet enn: (a) enkeltsubstitusjonen bGH-mutantene G119P,

G119K, G119L og G119E, eller

(b) trippelsubstitusjonen bGH-mutanten E117L,

G119R, A122D,

for fremstilling av en sammensetning for å forebygge eller behandle en tilstand hos nevnte menneske eller dyr som er kjennetegnet ved nivået av nevnte biologiske aktivitet som overskytende.

Videre vedrører oppfinnelsen anvendelse av et rekombinant DNA-molekyl istand til å uttrykke i en egnet vertcelle et veksthormonantagonistpeptid eller -protein på minst 11 aminosyrer, som omfatter en mutert alfaheliks som i det vesentlige er homolog med, men ikke identisk til, den tredje alfaheliksen til et referansevektshor-mon (bGH), fig. 1) selektert fra gruppen bestående av bovint veksthormon (bGH) og humant veksthormon (hGH) og som dannes av aminosyrene hovedsakelig tilsvarende posisjonene 106-129 i den naturlig forekommende formen, hvor minst én av forskjellene fra den tredje alfaheliksen i bGH eller hGH er ved et residie korresponderende til residie 119 hos villtype-bGH eller 120 villtype-hGH, hvor nevnte peptid eller protein er i stand til å antagonisere i det minste den biologiske aktiviteten til et menneske- eller dyreveksthormon, og at peptidet eller proteinet er et annet enn: (a) enkeltsubstitusjon-bGH-mutantene G119P, G119K,

G119L og G119R, eller

(b) trippelsubstitusjon-bGH-mutanten E117L, G119R,

A122D,

for fremstilling av en sammensetning for å forebygge eller behandle en tilstand hos nevnte menneske eller dyr som er kjennetegnet ved at nivået av nevnte biologiske aktivitet er overskytende.

Det har blitt oppdaget at mutasjon av Gly11*' i bGH til Arg ("G119R"), Pro ("G119P"), Lys ("G119K"), Trp ("G119W") eller Leu ("G119L"), eller homolog Gly<120> i hGH til Arg eller Trp, resulterer i et mutein (mutant-proteln eller peptidfragment derav) som har vekstinhibitorisk aktivitet i vertebrater, spesielt pattedyr. Dette nye hormonet kan bli administrert til pattedyr (eller andre virveldyr), spesielt mennesker og kveg, når vekstinhibisjon er ønskelig.

I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir hormonet produsert eksogent og administrert til individet. I lys av størrelsen på hormonet så blir det fortrinnsvis produsert ved ekspresjon av et gen som koder for det i en egnet vert. Et slikt gen blir lettest fremstilt ved setespesifikk mutagenese av et bGH-gen. Hormonet kan derimot også bli produsert ved hjelp av andre teknikker, så som ved kondensasjon av fragmenter av nativt bGH med et syntetisk peptid som bærer den erstattede aminosyren. Dersom et peptidfragment har den ønskede vekstinhibitoriske aktiviteten, kan det bli fremstilt ved en Merrifield-type syntese.

I en annen utførelsesform blir dette genet introdusert inn i en prenatal form av et pattedyr ved hjelp av kjente teknikker og den prenatale formen blir utviklet til et transgent pattedyr som uttrykker en redusert vekstfenotype. Et pattedyr kan bli genetisk modifisert etter fødselen, dvs. "genterapi".

Vekstinhiberte dyr kan derfor bli produsert enten ved administrering av det vekstinhibitoriske hormonet ifølge denne oppfinnelsen i farmasøytisk form eller ved genetisk transformasjon av en prenatal eller postnatal form av dyret.

Det vekstinhibitoriske hormonet, eller genet som koder for det, er nyttig ved produksjon av smådyr for anvendelse i forskningsinstitusjoner hvor plassen er begrenset, ved produksjon av kjæledyr for mennesker som har liten plass og for produksjon av husdyr hos bønder med små gårdsbruk. Hormonet kan også være nyttig ved behandling av humangigantisme og ved forskning på gigan-tisme og dvergisme, ved behandling av diabetes og føl-gene derav, ved kontroll av kolesterol og ved forebyg-gelse og behandling av visse cancerformer.

Pasienter med dårlig kontrollert diabetes er blitt funnet å ha høye nivåer av sirkulerende veksthormon. Se f.eks. Lundbaek, et al., Lancet, 2:13-33 (1970). Det er blitt spekulert at høye nivåer av veksthormon kan bidra til dårlig diabeteskontroll, i motsetning til bare å være en konsekvens derav. Press, et al., New England J. Med., 310:810-14 (1984). Forsøk er blitt gjort for å inhibere frigjøring av veksthormon ved hjelp av somatostatinanaloger. Anvendelse av veksthormonantagonister er derimot ikke blitt tidligere rapportert. Et ytterligere aspekt ifølge foreliggende oppfinnelse er derfor anvendelse av de beskrevne GH-antagonistene for å forbedre kontrollen av diabetes.

Blant komplikasjonene ved diabetes hører retinopati, nefropati og angiopati. Diabetisk retinopati antas å oppstå som et resultat av proliferasjonen av mikrovaskulære endotelceller i netthinnen. Humant veksthormon er kjent for å stimulere proliferasjonen av mikrovaskulære endotelceller. Se Rymaszewski, et al-, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 88:617-21 (1991). Veksthormonantagonistene ifølge foreliggende oppfinnelse kan derfor være nyttige for å motvirke de negative virkningene av forhøyede nivåer av endogent veksthormon på mikrovaskulære vev, så som netthinnen, ved diabetes eller hos andre individer med forhøyede veksthormonnivåer.

Glomerulosklerose oppstår ved forskjellige glomerulære sykdommer, inkludert diabetisk nefropati. Årsaken er ukjent, men mesangial celleproliferasjon kommer forut for eller ledsager mesangial sklerose. Feilregulering av residente glomerulære celler kan være viktig for utvikling av glomerulosklerose (Doi, et al., Am. J. Pathol., 137:541, 1990).

Transgene mus som uttrykker bGH er blitt vist å ha forstørrede glomeruli som utvikles til glomerulosklero-setilstanden. GH har derfor vært implisert i utviklingen av diabetisk glomerulosklerose (Doi, et al., 1990 and Bell, Am. J. Med. Sei., 301:195, 1991). En GH-antagonist kan hindre den GH-avhengige effekten på cellene til diabetiske nyrer og derfor være nyttig ved fo-rebyggelse eller behandling av glomerulosklerose.

Mens veksthormoner ikke tidligere er blitt implisert i hyperkolesterolemi, er GH-antagonister blitt anvendt i en annen utførelsesform for å redusere nivåene av kolesterol i serum.

Det er blitt foreslått at somatostatinanaloger med langvarig aktivitet kan være nyttig ved kontroll av bryst- og prostatacancerformer. Manni, Biotherapy, 4:31-36 (1992). Manni beskriver at de klarte å inhibere tumorveksten ved flere mekanismer, inkludert inhibering av veksthormonsekresjonen. Veksthormonet er implisert på grunn av at det er laktogent og på grunn av at det forhøyer IGF-l-nivåene. Det foreslås i foreliggende oppfinnelse at veksthormonantagonistene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt for behandling av cancerformer hvor veksten er fremmet ved endogent veksthormon eller IGF-1.

Generelt er disse antagonistene terapeutisk eller profylaktisk nyttige for å motstå de negative virkningene av veksthormoner, både endogene hormoner og hormoner administrert klinisk.

I løpet av dette arbeidet er det blitt oppdaget et samsvar mellom evnen som L-celler fra mus har til å utskille proteinet og proteinets virkning (positiv eller negativ) på vekstraten i et transgent dyr. n L-

Figur 1 Aminosyresekvensen til bGH (G119E) og nukleotidsekvensen til genet som koder for denne analogen. Alfaheliksene er markert og aminosyrene er nummererte, idet nummer 1 er den første aminosyren til det modne proteinet. De uthevede basene og aminosyrene er de som ble mutagenisert i Gl19R-mutanten. Figur 2 Generell strategi for oligonukleotidrettet mutagenese. pBGHIO 6 ble anvendt som parental vektor. Det inneholder metallotionein I transkripsjonene regulatoriske sekvenser (MT-1) fra mus koblet til bGH-genet (BamHI koblet med Bglll) som inneholder fem eksoner (skraverte bokser I-V) og intron A. Dette fusjonsgenet ble inkorporert inn i pBE322 ved EcoRI sete. Replikasjonsorigo (ORI) til pBR322, ampicillin-resistent genet (Amp) samt bGH-translasjonsstart (ATG) og stopp (TAG) kodonene er Indikert. 5<1> og 3<1> ikke-translaterte regioner er vist skravert. Nukleotidsekvensen mellom restriksjonssetene Tthllll og Xmal er vist. Substitusjonsmutas]onene er angitt. En stille mutasjon er også angitt (<*>) og danner et unikt BamHI sete. Posisjonen til de perifere aminosyreresidiene mutert i eksperimentene (115, 117, 119, 122) er angitt. Figur 3 er et idealisert overflatenett (sylindrisk plott) representasjon av det meste av den tredje alfaheliksen til bovint veksthormon. Overflatenettet blir produsert ved projeksjon av heliksen på et koaksialt sylindrisk papir, med kutting av dette papiret parallelt til heliksaksen og flatgjøring av denne. Volumene til aminosyrene er angitt i parenteser. En stiplet linje indikerer kløften eller innhuket som blir dannet av Alal22-Glyll9-Aspll5. Figur 4 er et plott av en antagelse av den sekundære strukturen (alfa-heliks, beta-ark, revers dreining, tilfeldig tvinning) for aminosyrene 108-127 av bovint veksthormon (a) villtype (b) mutant G119R og (c) mutant A122D. Disse plottene ble dannet ved hjelp av "Micro-Genie" programmet. Figur 5 Scatchard-plott av data fra konkurrerende bin-dingseksperimenter for villtype-bGH og bGH-M8 ved anvendelse av muse-lever-membran preparater. Ordinater representerer forholdet mellom bundet til fritt bGH og abscissen konsentrasjonen av total bundet bGH. Hvert punkt representerer gjennomsnittet av fire eksperimen-ter som ble utført tredobbelt. Figur 6 angir en sammenligning av vekstraten blant kontroll (ikke-transgene), G119R-, G119L-, G119K- og G119P-nms som illustrerer den vekstinhibitoriske virkningen til disse mutantene. Figur 7 presenterer aksialt den tredje alfaheliksen (109-126) av bGH, som viser dets amflpatiske tendenser. Hydrofobiske aminosyresektorer er skravert med prikker, hydrofile aminosyrer er indikert ved åpne sektorer, glycinsektoren, en naturlig aminosyre, med skrålinjer. Residieantallene og hydrofilisitetsverdiene (Hopp og Wood skala) er angitt. Figur 8 presenterer sidebilder av den tredje alfaheliksen av villtype (venstre) og G119R-mutant (høyre) bGH projisert på planet hvor sidekjeden til Arginin-119 av den mutante G119R ligger. Glycin 119-residiet som finnes på bunnen av kløften er indikert med en pil.

Bildene ble dannet ved anvendelse av programvare for molekylær modellering (QUANTA og CHARMm, Polygene, Waltham, Massachusetts, USA). Figur 9 sammenligner serumglukose, urea/nitrogen og triglyceridnivåene til kontrollmus, transgene bGH-M8 (E117L, G119R, A122D) -produserende mus og transgene wtbGH-produserende mus av begge kjønn. Figur 10 sammenligner serumkolesterol for transgene wtbGH-produserende mus, kontrollmus og transgene bGH-M8-produserende mus av begge kjønn. Figur 11 plotter GPEH-aktivlteten mot bGH-M8-dosering i en konkurrerende inhiblsjonsanalyse for antagonisme av evnen som GH (her villtype bGH) har til å fremme differensiering av preadipocytter (NIH 3T3-F442A-celler)• Figur 12 sammenligner virkningen av bGH og bGH-M8 på differensiering av 3T3-F442A-celler. Ved konfluens ble celler inkubert med økende konsentrasjoner av bGH eller bGH-M8. Cellene ble høstet på dag 8 for bestemmelse av GPDH-aktiviteten. Eksperimentet ble gjentatt to ganger med lignende resultater. Hver kolonne representerer gjennomsnittsverdien oppnådd fra trippelanalysene. "Feilkolonnen" representerer standarddelingen. Figur 13 viser forholdet mellom serum bGH- analog-konsentrasjonene og vekstforholdet til transgene mus (TG)/ikke-transgene (NTG). Ordinaten representerer bGH-analogkonsentrasjonene i serum. Abscissen representerer vekstforholdet til TG/NTG mus. Figur 14 viser forholdet mellom serum hGH-analog-konsentrasjoner og vekstforholdet mellom transgene mus (TG)/ikke-transgene (NTG). Ordinaten representerer bGH-analogkonsentrasjonene i serum. Abscissen representerer vekstforholdet TG/NTG mus.

Foreliggende oppfinnelse vedrører veksthormonantagonister, spesielt vekstinhibitorer, som er peptider eller proteiner med en lignende sekvens og sekundært struktur som et veksthormon fra virveldyr, inkludert men ikke begrenset til pattedyrveksthormoner, spesielt humane og bovine veksthormoner. Forbindelsen omfatter fortrinnsvis en alfaheliks med en aminosyresekvens-homologi på minst omtrent 50% med den tredje alfaheliksen til et virvelløst veksthormon, spesielt bovint eller humant veksthormon. Andre alfahelikser av det native hormonet kan bli utelatt dersom dette kan bli utført uten tap av vekstinhibitorisk og/eller annen veksthormonantagonistaktivitet. Anvendelse av betegnelsen "antagonist" er rent funksjonelt og skal ikke begrense oppfinnelsen til forbindelser som har en bestemt virkningsmekanisme.

Total prosentvis homologi til bovint veksthormon med andre pattedyrveksthormoner er høy: gris (92#), sau ( 9956), humant (66*) og rotte ( 87%). Når det gjelder den tredje alfaheliksen (aminosyresekvens homolog med bGH-109-126) er den prosentvise homologien sammenlignbar med det totale: gris (9456), sau (94?6), humant

(6656) og rotte (94SÉ).

Den sekundære strukturen til et polypeptid er et jevnt arrangement av et lineært segment av polypeptidkjeden. De mest vanlige sekundære strukturene er beta-plate-struktur og alfaheliksene. Se Schulz og Schimer, Prin-ci<p>les of Protein Structure 69 (Springer-Verlag: 1979). Alfaheliksen ble stabilisert av hydrogenbindingen mellom peptidamidet og karbonylgruppene til residier separert av en enkelt dreining av hellksen. Antagelser om den sekundære strukturen er basert på observasjonen av forekomstfrekvensen til aminosyren i en beta-plate-struktur, en alfaheliks, osv. i et protein som har en kjent tredimensjonal struktur.

Den tredimensjonale strukturen til griseveksthormonet er blitt bestemt ved røntgendiffraksjon og sammenlignet med andre veksthormoner. Abdel-Meguid, et al.. Proe. Nat. Acad. Sei., 84:6434 (1987). Som de andre veksthormonene som er studert, er det et enkelt domeneprotein oppstilt som et knippe bestående av fire helikser hvor heliksene er i et antiparallelt forhold. De fire heliksene er dannet av residiene 7-34, 75-87, 106-127 og 152-183. For røntgenstudier av bGH og hGH, se Bell, et al., J. Biol. Chem., 260:8520-25 (1985) og DeVos, et al., Science, 255:306-312 (1992). De tredimensjonale strukturene til de andre veksthormonene kan bli avledet ved sammenligning av sekvensene ved å ta hensyn til se-kundærstrukturtendensene til substituerte aminosyrer.

Bovint veksthormon er 93S6 homologt på aminosyrese-kvensnivået med porcinveksthormon og hGH-strukturen er blitt avledet ved studier av de to sekvensene og av strukturen til veksthormonet fra gris. Dets fire alfahelikser er blitt rapportert å bestå av aminosyrene 4-33, 66-80, 108-127 og 150-179. Den tredje alfaheliksen til bGH er definert som aminosyrene 106-129. Det er derimot å bemerke at endene til denne heliksen har en mindre markert sekundær alfaheliksstruktur enn den sentrale regionen som er 109-126. De nøyaktige bindingene til den tredje alfaheliksen kan være forskjellig for andre GH avhengig av tendensen for alfaheliks til "og"-aminosyrene. Konformasjonen er i samsvar med antagelsene gjort av Chen og Sonenberg, Biochemistry, 16:2110 (1977) ved anvendelse av metoden til Chou og Fasman, Biochemistry, 13:222 (1974) (AAs 10-34, 66-87, 111-127, 186-191).

Aminosyresekvensen til veksthormonene isolert fra forskjellige virveldyrarter er sterkt konservert. I en sammenligning av veksthormonet fra flyndre med andre veksthormoner, inkludert bGH, identifiserte Watahiki, et al., J. Biol. Chem., 264:312 (1989) fem konserverte regioner. Watahikis konserverte region GD4 omfatter området LKDLEEGILALMRELED fra bovint veksthormon, dvs. residiene 113 til 129. Watahikis Figur 3 identifiserer residier konservert blant GH og residiene antatt å være viktig for manifestasjonen av vekstfremmende aktivitet .

Ved å studere Watahikis GD4-konsensusregion fremkommer flere familier av veksthormoner. Den første familien (I) omfatter cGH, rGH, pGH, oGH, bGH og hGH. Disse begynner med LKDLEEGI. Dette fortsettes med IQA (cGH, rGH, pGH), ILA (oGH, bGH) eller IOT (hGH). Alle medlemmer av familien I avslutter GD4 med LMRELED (unntatt for rGH, LMQELED, og hGH, LMGRLED). Den andre familien (II) omfatter fGH, yGH, tGH og sGH. Disse har konsensussekvensen LS (E/D) LK (M/T) G (L/I) (L/G/H/N)

(K/L) LI (E/T/R/I) (A/G) (N/S) QD.

Fire aminosyrer i GD4 er konservert blant alle veksthormonene beskrevet av Watahiki: Leu 113, Leu 116, Gly 119, Leu 123 og Asp 12 (nummereringen er Ifølge bGH-sekvensen). Av aminosyrene nærmest Gly 119 på utsiden av den tredje alfaheliksen er Asp 115 sterkt konservert (erstattet med Glu i fiskehormonene), Leu 116 er uforandret, Glu 118 er konservert blant pattedyr og fugler, men erstattet av Met, Thr eller Val i fisk, Ile 120 er nesten uforandret (erstattet av Leu i fGH), og Ala 122 er konservert, spesielt i pattedyr og fugler (erstattet av Thr i hGH og Leu eller Lys i fiske-GH).

(Det er å bemerke at foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til mutanter hvor disse konserveringene er opprettholdt.)

Det er blitt vist at et rekombinant molekyl inneholdende et hGH- (1-134) fragment koblet til et humant placentalaktogen (141-191)-fragment beholdt full hGH-immunologisk aktivitet og bindingsaktivitet til GH-reseptorer isolert fra kaninlever. Russell, et al., J. Biol. Chem., 256: 296-300 (1981). Ved anvendelse av homolog-scannings mutageneseteknikken ble genfragmenter fra homologe hormoner, dvs. humant placentalaktogen eller humant prolaktin, systematisk substituert i hGH-genet, som dermed produserer forskjellige chimeriske hormoner. Cunningham, et al., Science, 243:1330-36

(1989). En sammenligning av blndingsaffinitetene til disse GH-mutantene og villtype-hGH til en klonet lever-hGH-reseptor førte til konklusjonen at det var tre diskontinuerlige polypeptid-determinanter i hGH involvert i reseptorbinding. De var lokalisert ved NH2-terminusen, COOH-terminusen og innenfor en løkke mellom aminosyreresidiene 54 og 74. Disse antatte bindingsdomenene ble ytterligere analysert ved en alanin-scannings mutageneseteknikk hvor alaninresidiene ble systematisk erstattet i disse regionene. Aminosyreresidiene ved posisjonene 10, 58, 64, 68, 172, 174, 175 og 176 til hGH ble vist å være viktige for GH-reseptorbindingen. Ingen av de mutante GH ble derimot rapportert å inhibere veksten. Cunningham, et al., Science, 244:1081-85 (1989).

Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til mutasjonen av den tredje alfaheliksen til bovint eller humant veksthormon. Den omfatter derimot mutasjon av den tredje alfaheliksen til et hvilket som helst veksthormon fra pattedyr eller andre virveldyr, inkludert, men ikke begrenset til, veksthormonene hvor sekvensene er gitt i Watahiki (1989): flyndre, "yellowtail", tunfisk, laks, kylling, rotte, gris, sau, bovine og humane veksthormoner. Ekspresjon av mutantene til andre veksthormoner er gjort lettere ved tilgjenge-ligheten av genene som koder for sistnevnte. Se f.eks. Goeddel, Nature, 281:544-683 (1979) (hGH).

Begrepet et polypeptid som er vesentlig homologt med bovint veksthormon skal innbefatte (men er ikke begrenset til) et hvilket som helst polypeptid som er forskjellig fra det bovine eller humane veksthormonet ved (a) en substitusjon ved en aminosyre tilsvarende aminosyrene 115 eller 119 til det bovine veksthormonet, (b) en substitusjon av en aminosyre som tilsvarer en aminosyre fra bovint eller humant veksthormon som ikke er konservert blant veksthormonene fra virveldyr, spesielt erstatning av aminosyren med en som finnes ved et sete i et annet veksthormon og/eller (c) forkortning av aminosyrene 1-95 og/eller 134/191. (Konserverte aminosyrer er identifisert i Watahiki, et al., 1979.) Alle veksthormoner fra ikke-bovine virveldyr er "vesentlig homologe" med bovine og/eller humane veksthormoner. Polypeptidet er fortrinnsvis minst omtrent 50 % homologt, eller fortrinnsvis minst 80 % homologt, med det bovine eller humane veksthormonet i undersekvensen som vesentlig tilsvarer den tredje alfaheliksen (omtrent residiene 106-129) til bGH, og fortrinnsvis over hele lengden til polypeptidet (ignorering av ytre ikke-bGH-relaterte fusjoner til amino- eller karboksyterminalen).

Forbindelsen blir betraktet å være vekstinhibitorisk dersom veksten av forsøksdyrene inkludert minst én vertebratart som blir behandlet med forbindelsen (eller som er blitt genetisk omkonstruert for å uttrykke dem selv) er signifikant (ved et 0,95 sikkerhetsnivå) saktere enn veksten av kontrolldyrene (betegnelsen "signifikant" ble anvendt i statistisk henseende). Den er fortrinnsvis vekstinhibitorisk i flere arter, eller i det minste i mennesker og/eller boviner. Veksthormoner har betraktelig kryssreaktivitet mellom artene. Gill, et al., Biotechnology, 3:643 (1985) rapporterer at rekombinante kylling og bovine veksthormoner aksele-rerer veksten i juvenile pacific laks.

Det er kjent at visse fragmenter av veksthormoner også har vekstfremmende aktivitet og det er ventet at de vekstinhibitoriske peptidene (betegnelsen er anvendt nedenfor for å Innbefatte proteiner) ifølge foreliggende oppfinnelse ikke behøver å være så store som bGH. Peptidene er fortrinnsvis minst 11 aminosyrer lange (tre dreininger i en alfaheliks) og fortrinnsvis minst 50 aminosyrer lange. Disse peptidene kan beholde den vekstinhibitoriske virkningen til f.eks. bGH (G119R), men mangle andre, uønskede biologiske aktiviteter til den native mutanten. De er også mere ønskelige farmako-kinetiske karaktertrekk.

De vekstinhibitoriske peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også være større enn bGH, forutsatt at de ytterligere aminosyrene ikke resulterer i at forbindelsen ikke kan redusere vekstraten til et virveldyr.

Virkningsmekanismen til foreliggende vekstinhibitoriske peptider er ikke kjent, men det antas at de virker som antagonister overfor villtype-veksthormoner som blir produsert endogent av måldyret. Det er vist at f.eks. bGH (G119R) og bGH (G119R, E117L, A122D) begge på en konkurrerende måte inhiberer bindingen av vill-type-bGH til levermembranpreparater. Det antas derfor at forbindelsen har et nettoresultat for inhibering av veksten på grunn av at dets vekstfremmende aktivitet er vesentlig mindre enn for villtype-veksthormoner (og kanskje neglisjerbar) men kan erstatte fra veksthormonreseptor (GHR)-setene det endogene native veksthormonet (hvor vekstsimuleringen kunne ha vært mer uttalt). Foreliggende oppfinnelse er derimot ikke begrenset til denne teorien.

DeVos, et al., Science, 255:306 (1992) undersøkte hGH-komplekset og den ekstracellulære domenen til dets reseptor (hGHR) ved røntgendiffraksjon. Den første reseptorbindende region til hGH er konkav og blir hovedsakelig dannet av residier på synlige overflater av heliks 4, men også av synlige residier til heliks 1 og residier I regionen som kobler heliksene 1 og 2. Den andre reseptorbindende regionen omfatter de synlige sidene av heliksene 1 og 3 og er relativt flat. Rollen til heliks 3 vises best i Fig. 5 til DeVos og det er en betraktelig reduksjon i mulighet for oppløsning rundt hGH-E119 ved kompleksdannelse. Komplekset hadde formen hGH (hGHRjgi dvs. reseptoren dimeriserer for å reagere med hGH. Det er mulig at GH-antagonistene interfererer med denne dlmeriseringen.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse har en ED50 som er mindre enn omtrent 10 ganger ED50 til villtype-bGH i en analyse av evnen som forbindelsen har til å fortrenge radiomerket villtype-bGH fra et levermembranpreparat dannet som beskrevet nedenfor. Forbindelsene har en ED50 som er minst sammenlignbar med den til villtype-bGH. Forbindelsene har fortrinnsvis en høyere affinitet for veksthormonreseptorene enn det veksthormonet som er nativt for dyret som mottar forbindelsen har. For rensing og karakterisering av en human veksthormonreseptor, se Leung, et al., Nature, 330:537-43 (1987).

Et GH-muteln kan bli betraktet som en antagonist selv om det mangler vekstinhibitorisk aktivitet dersom det antagoniserer en annen GH-mediert aktivitet, f.eks. dets diabetogene, glomerulosklerotiske, hyperkole-sterolemlske eller tumorlgene aktiviteter.

Foretrukne vekstinhibitoriske peptider er kjennetegnet ved en modifikasjon av overflatetopograflen til den tredje alfaheliksen. Det fremgår fra Figur 3 at i den tredje alfaheliksen til "villtype" bovint veksthormon er det et overflatehulrom eller nedsenkning som begynner ved Aspartat-115, fordypet ved Glycin-119 og avsluttes med Alanln-122. Alle mutantene som er dannet frem til nå, både de som har beholdt villtype vekst-f remmende aktivitet og de som ikke har det, er 1 samsvar med teorien om at vekstfremmende aktivitet krever tilstedeværelse av denne kløften eller spalten og at dersom midten av denne kløften blir "fylt igjen" ved substitusjon av aminosyrer med mer bulkete side-kjeder, så inhiberer muteinet veksten av individet. Mutasjoner som vesentlig destabiliserer alfaheliksen er uønsket på grunn av at de kan resultere I tap av all vekstrelatert aktivitet. Det er observert et slikt tap ved flere mutasjoner som var forventet å ødelegge alfaheliksen.

For en diskusjon av alfaheliksdannere og -brytere, se Chou og Fasman, su<p>ra. Glu, Ala og Leu er foretrukket alfaheliksdannere, mens Pro og Gly er kjennetegnet som sterke heliksbrytere. Substitusjoner som innfører sterke alfaheliksbrytere er mindre ønskelig, men kan i et bestemt tilfelle bli tolerert, så som ved enden av heliksen. De sekundære strukturer til disse analogene er blitt foreslått ved anvendelse av "Mikro Genie" computer-programmet som anvender algoritmen til Garnier, et al., J. Biol. Chem., 120:97-120 (1978).

Med hensyn til aminosyre 119, er glycin både det minste amlnosyreresidiet og den minst ønskelige for alfahe-liksdannelse. Det antas derfor at en hvilken som helst annen aminosyre kan erstatte denne uten destabilise-ring av alfaheliksen, mens det på samme tid blir fylt inn i ovennevnte kløft. Alle G<11<>'-bGH substitusjoner som er testet resulterte i en "lite dyr" fenotype. Disse substitusjonene var arginin (en stor, positivt ladet AA), prolin (en syklisk alifatisk AA), lysin (en stor, positivt ladet AA), tryptofan (en stor, aromatisk AA) og leucin (en stor, upolar, alifatisk AA). I hGH er det homologe glycinet i posisjon 119. Substitusjon av arginin eller eller tryptofan resulterer i en antagonist, men hGH-G120A beholdt den vekstfremmende aktiviteten. Det antas derfor at dette glycinet som er konservert i alle GH fra virveldyr kan bli erstattet med en hvilken som helst aminosyre som er forskjellig fra alanin (den nest minste aminosyren), og mer foretrukket av en hvilken som helst aminosyre som er minst like stor som prolin (den minste erstatningsaminosyren kjent som resulterer i en "liten" dyrefenotype). Dele-sjonen av G^^ er også kjent for å resultere i en "liten" dyrefenotype.

Modifikasjon av posisjon 115 er foreslått i vår "kløft"-teori. Aspartat i posisjon 115 kan bli erstattet av en mer bulket aminosyre som ikke ødelegger alfaheliksen. Erstatnings-aminosyren har en størrelse som er større enn glutamat. Aminosyrene histidln, metionin, isoleucin, leucin, lysin, arginin, fenylala-nin, tyrosin og tryptofan er vesentlig større enn glutamat. Av disse er His, Met, Leu og Trp mer foretrukket på grunn av at de kombinerer fordelene av "bulk" med en sterk alfahelisk tendens. Det er å bemerke at villtype-Glu er den sterkeste dannelsen av alfaheliks av alle aminosyrene. D115A-mutanten til bGH er ikke en GH-antagonist, men alanin er mindre enn asparaginsyre, slik at dette er ikke beviskraftig for verdien av å erstatte Asp 115 med en mer omfangsrik aminosyre.

Det er mulig at G119A kan føre til en "liten" fenotype dersom den blir koblet med andre mutasjoner, f.eks. ved 115 og 122.

Det er mulig å systematisk screene for effekten av alle mulige aminosyresubstitusjoner ved posisjonene 115 og 119. (Det er 20<2->l eller 399 kombinasjonsmuligheter). DNA som koder for bGH og er degenererte ved disse posisjonene slik at de koder for alle mulige aminosyrer, eller bare de med akseptable alfaheliske tendenser, blir f.eks. fremstilt ved en "dirty bottle" syntese. Fag blir preparert som beskrevet av Ladner, et al., PCT/US89/03731, WO90/02809, som viser mutanten bGH som en domene av et chimerisk kappeprotein. Fagen blir inkubert med en kromatografisk bærer som bærer en veksthormonreseptor. (For teknikken for isolering av veksthormonreseptorer, se Leung, et al., Nature 330:537

(1987) og Spencer, et al., J. Biol. Chem., 263:7862

(1988) ). Nativ bGH blir også inkubert med bæreren, før, i løpet av eller etter faginkubasjonen. Bundet fag blir isolert, amplifisert og undersøkt for å bestemme sekvensen til mutanten bGH (vanligvis ved sekvensering av det tilsvarende genet i faggenomet). Disse mutantene har demonstrert evnen til å konkurrere med villtype-bGH om en veksthormonreseptor. Deres evne til å antagonisere GH-aktiviteten ln vivo blir deretter bekreftet ved f.eks. administrering av disse direkte til et dyr eller ved å preparere et egnet transgent dyr, eller ved in vitro analyse beskrevet i Eksempel 7. Denne metoden kan om ønskelig bli utvidet til andre aminosyreposisjo-ner i den tredje alfaheliksen. Aminosyrer som er spesielt foretrukket for screening er de seks aminosyrene som rommessig er nærmest bGH-Gly 119, dvs. Ala 122, Leu 123, Ile 120, Leu 116, Asp 115 og Glu 118. Det er å bemerke at Bass, et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, 8:309-314 (1990), dannet "hormonfag" som uttrykker og fremviser hGH-genlll-fusjonsproteiner og som ble bundet av monoklonale anti-hGH antistoffer. Det var videre mulig å separere fag med Wt-hGH fra fag med lav-affinitet-hGH-mutant-R64A ved hjelp av affinitets-kromatografi (ved anvendelse av den ekstracellulære domenen til hGH-reseptor bundet til uporøse oksiranku-ler).

Bortsett fra mutasjonene i posisjon 119, som antas som nødvendige for å oppnå den ønskede vekstinhibitoriske aktiviteten, er ytterli-gere mutasjoner mulige som vil la den vekstinhibitoriske aktiviteten eller annen an-tagonistaktivitet være intakt. Disse mutasjonene kan ta form av enkelt- eller flersubstitusjoner, delesjoner eller innskudd i uessensielle regioner av polypeptidet. Det er for eksempel mulig å endre en annen aminosyre i alfaheliksen forutsatt at substitusjonen ikke ødelegger alfaheliksen. Slike endringer erstatter fortrinnsvis en aminosyre med en som har lignende størrelse og po-laritet. Det kan være fordelaktig å modifisere aminosyrene som flankerer det primære mutasjonssetet 119 for å øke alfaheliks-tendensen til sekvensen, spesielt dersom mutasjonen ved 119 ventes å destabilisere he-1iksen.

Følgende tabell kan være nyttig for å Identifisere kan-didatmutanter:

Flere av de siterte referansene angir hvor og hvor polypeptidet Ikke vil tolerere mutagenese. V/atahlki et al. (1989) sammenlignet sekvensene til flyndre, "yellowtail", tunfisk, laks, kylling, rotte, gris, sau, bovine og humane veksthormoner. Han identifiserte fem konserverte domener som han merket GD1-GD5. Mutasjoner I disse konserverte domenene vil sannsynligvis påvirke aktiviteten. GD4 tilsvarer den tredje alfaheliksen til bGH. Ved mutasjon av en kjent GH-antagonist med ønske om å beholde den inhibitoriske aktiviteten er mutasjoner utenfor de konserverte domenene bedre. Mutasjoner I disse konserverte regionene kan f.eks. bli tolerert dersom de blir nøye utvalgt. Mutasjonen E117L modifi-serer f.eks. ikke aktiviteten til verken villtype-bGH eller en bGH-G119R-mutant. Ikke bare substitusjoner, men også Innskudd og deles joner er foreslått ved eksempler på beslektede hormoner.

Abdel-Meguid, et al. (1987) bestemte 3D-strukturen til det rekombinante metionyl porcinveksthormonet og fore-slo at det viste den "generelle tre-dimensjonale fol-dingen" til veksthormonene. 3D-strukturen kan bli anvendt for å Identifisere indre residier og overflate-residier, generelt, proteiner mutert ved overflateresi-diene (som er forskjellige fra reseptorbindingsetet) er mer sannsynlige å forbli funksjonelle. Creighton og Chothia, Nature, 339:14 (1989), beskriver tolerering av mutasjoner ved begravde residier. Strukturen kan også bli anvendt for å bestemme "løkker" av fleksible overflater, og proteiner er mer tolerante for delesjoner og innskudd i slike regioner.

Cunningham, et al. (1989) anvendte homolog-scannings mutagenese for å identifisere epitopene til hGH for dets klonede leverreseptor. Bare varianthormoner med mutasjoner i regionene C(54-74), F(164-190) og i mindre grad A(11-33) utviste overflatebindende affinitet. Cunningham og Wells, Science, 244:1081 (1989) anvendte en beslektet teknikk, alanin-scanning mutagenese, for ytterligere å studere disse regionene. Binding til reseptoren anvendt av Cunningham er ikke nødvendigvis kritisk for den vekstfremmende eller vekstinhibitoriske aktiviteten til mutanten.

Det er for eksempel sannsynlig at vesentlige amino- og karboksyterminale forkortelser kan bli utført uten å negativt påvirke den vekstinhibitoriske aktiviteten på grunn av at 96-133-fragmentet til bGH (K112L) antas å beholde bioaktiviteten. Forkortelser kan bli dannet ved genmodifikasjon eller ved eksopeptidasebehandling.

Når det gjelder typer substitusjoner som kan bli utført, må man først se på analyser av frekvensen til aminosyreforandringene mellom homologe proteiner fra forskjellige organismer, slik som de som er presentert i Tabell 1-2 ifølge Schulz og Schimer, ovenfor, og Figur 3-9 til Creighton, ovenfor. Basert på slike analyser har vi definert konservative substitusjoner som forandringer innenfor gruppen angitt nedenfor: I Små alifatiske, upolare eller svakt polare

residier - Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)

II Negativt ladede residier og deres amider Asn

Asp Glu Gin

III Positivt ladede residier - His Arg Lys

IV Store alifatiske upolare residier - Met Leu Ile

Val (Cys)

V Store aromatiske residier - Phe Tyr Trp

Tre residier er I parentes på grunn av deres spesielle rolle i proteinarkitekturen. Gly er det eneste residiet uten en sidekjede og den gir derfor fleksibilitet til kjeden. Pro har en uvanlig geometri som sterkt begren-ser kjeden. Cys kan delta i disulfidbindinger som hol-der proteinene inn i en bestemt folding, og de fire cysteinene til bGH er sterkt konservert. Schulz og Schimer forener I og II ovenfor. Det er å bemerke at Tyr på grunn av sitt hydrogenbindlngspotensial har lik-hetstrekk med Ser, Thr, osv.

Innenfor selve veksthormonfamilien sees forskjellige substitusjoner av andre aminosyrer for residiene til bGH. Blant for eksempel virveldyr-GH angitt i Watahiki, et al., (1989), fremkommer Pro 6 ganger i bGH. Første Pro er Ikke substituert, men er fraværende fra sGH. Den andre er erstattet med Leu i fGH, Thr i yGH og tGH. Den tredje er erstattet med Leu i fGH, Ile i yGH og tGH, Val i sGH. Fjerde Pro er konservert. Femte Pro er erstattet med Phe i fGH, Ser i yGH. Sjette Pro er erstattet med Phe i fGH, yGH og tGH, og Leu i sGH. Pro er erstattet 4 ganger med Phe, 3 ganger med Leu, 2 ganger hver med Thr og Ile, og 1 gang hver med Val og Ser. Når denne analysen utvides til alle aminosyrene av bGH, oppnås følgende rekker: Ovennevnte oppstillinger er ikke normalisert for å jus-tere for de relative frekvensene for forekomst av forskjellige aminosyrer. I egne mutageneseeksperimenter førte forandring av Lys 112 til Leu eller Lys 114 til Trp (Ml), Glu til Gly (E126G) eller Leu (M4), eller Ala til Thr (A122T) ikke til endret aktivitet, mens forandring av Lys, Glu eller Leu til Pro opphevet aktiviteten .

Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til noen bestemt fremgangsmåte for fremstilling av de ønskede

GH-antagonistene. Disse antagonistene blir fortrinnsvis produsert ved først å endre et gen kodende for et virveldyr-GH (f. eks. bGH eller hGH) som har den "native" tredje alfaheliksen ved setespesifikk mutagenese og deretter kloning og ekspresjon av det endrede genet i en egnet vert. Molekulaerbiologiske teknikker er f. eks. beskrevet i Sambrook, et al., Molecular Clonlng: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab Press, 2nd ed., 1989). Genet kan være av genomisk opprinnelse og kan bli cDNA-preparert fra bGH-messenger-RNA, kan være syntetisk eller være en kombinasjon derav. For aminosyresekvensen til bGH og for cDNA-sekvensen til bGH-genet, se Miller, et al., J. Biol. Chem., 255:7521-24 (1980). For den genomiske bGH-sekvensen, se Woychick, et al., Nucleic Acids Res., 10:7197-7210 (1982). cDNA-sekvensen for hGH er angitt av Chang, et al., Gene, 55:189 (1987) og DeNoto, et al., Nucleic Acid Res. 9:3719 (1981), og den genomiske hGH-sekvensen er i Robbins, et al., Cell, 29:623

(1982).

Verten kan være en hvilken som helst hensiktsmessig or-ganisme, inkludert en bakteriecelle, gjær- eller patte-dyrcelle. Genet er operasjonelt koblet til en promoter som er funksjonell i verten. En konstitutiv promoter vil aktivere genekspresjonen på en generell måte, dvs. i mange vev og ved alle tidspunkter i løpet av utviklingen. En regulerbar promoter kan bli aktivert på en vev- eller cellespesifikk måte ved nøyaktige tidspunkter i løpet av utviklingen eller i respons til forandringer 1 miljøet. En konstitutiv promoter blir vanligvis anvendt når større mengder av genproduktet (vanligvis protein) er nødvendig eller når genproduktet er nødvendig i mange celler til mange vev. En regulerbar promoter blir anvendt når et genprodukt er nødvendig i et lite antall celler fra et bestemt vev eller ved et gitt tidspunkt i løpet av utviklingen. Ekspresjonssystemet kan bli konstruert slik at antagonisten blir skilt ut i dyrkningsmediet, eller så kan vertcellene bli dyrket til en høy celletetthet og deretter lysert for å frigi forbindelsen.

En fremgangsmåte egnet for rensing av bGH (G119R) og lignende er beskrevet i Leung, et al., Endocrinology, 119:1489-1496 (1986). Denne prosedyren omfatter rensing ved (a) ammoniumsulfatpresipitering, (b) fraksjonering på DEAE-cellulose (eller en hvilken som helst tilsvarende lonebytte-kolonne) og (c) gelfiltrering (f.eks. på en Sephadex G-25 og/eller Sephacryl S-200 kolonne). Andre prosedyrer som kan anvendes for rensing av veksthormon-relaterte forbindelser er angitt i Reichert, Jr., "Purification of Anterior Pituitary Hormones: Bovine, Rat and Rabbit", Meth. Enzymol., 37:360 et seq.

(Academic Press, N.Y.:1975). Polyklonale eller monoklonale antistoffer som spesifikt gjenkjenner proteinet av interesse kan også bli anvendt i rensningsprosessen.

Den rensede antagonisten kan deretter bli kombinert med kompatible, ikke-toksiske farmasøytiske eksipienser og administrert til et dyr, f.eks. for å behandle en tilstand kjennetegnet ved en omfattende vekstrate. (Betegnelsen "dyr" skal Innbefatte mennesker.) Når det gjelder administrering til ikke-humane dyr, kan det være foretrukket å inkorporere medikamentet i fSret til dyret, fortrinnsvis i en fordannet kombinasjon av medikament og næringsmateriale klar for anvendelse for gårdbrukeren. Antagonisten kan bli administrert oralt eller parenteralt (inkludert intravenøst, subkutant og intramuskulært) til mennesker i en hvilken som helst egnet farmasøytisk doseringsform. Ved behandling av retinopati kan den bli administrert direkte til øyet ved hjelp av en konvensjonell okulær farmasøytisk form. En effektiv dosering og behandlingsprotokoll kan bli bestemt ved hjelp av konvensjonelle metoder, begynnende med en lav dose i forsøksdyr og deretter økning av do-seringen mens virkningene blir registrert og samtidig systematisk varierlng av doseringsregime, Forsøksdose-ringene bør bli valgt etter betraktning av den kliniske litteraturen med hensyn på administrering av veksthormoner og somatostatin (en veksthormonfrigjørende Inhi-bitor ).

I en annen utførelsesform blir genet ført inn i en vertcelle som blir utviklet til genetisk transformerte celler fra et transgent dyr. Linearisert DNA-bærende veksthormonantagonistgenet kan bli ført Inn i en gamet, eller mikroinjisert inn i pronukleus til befruktede egg, inn i cytoplasma, inn i kjernen til to-celle-embryoer, inn i individuelle celler til en blastocyst, eller inn i blastocoel-hulrommet. (Noen av disse målene kan bli nådd ved elektroporasjon istedenfor mikroin-jeksjon. ) Alternativt kan et retrovirus som bærer genet bli konstruert og anvendt for å infisere prelm-plantasjons-embryoer eller vevskulturceller (f.eks. embryonlske stamceller) som kan bli aggregert med slike embryoer. I ethvert tilfelle blir den genetisk modifiserte zygoten etter en kort in vitro dyrkning implantert inn I en fostermor og båret frem til fødselen. For "genterapi" post partum, se Cl ine, et al., Nature, 284:422-425 (1980), Williamson, Nature, 298:416-18

(1982). Igjen er genet operasjonelt koblet til en promoter som er funksjonell i verten og promoteren kan være konstitutiv eller regulerbar. Ekspresjonen blir fortrinnsvis regulert slik at unormal embryonisk eller føtal utvikling blir unngått.

Foreliggende oppfinnelse blir ytterligere Illustrert i følgende eksempler.

Eksempel 1: Dannelse av mutasjoner som utviser den

reduserte vekstfenotvpen

MATERIALER OG METODER

Plasmidet, pBGH-10delta6, var avledet fra pBGH-10 og inneholder den fullstendige kodende region til bGH og intron A. De bovine veksthormonintronene B, C og D er fraværende (Figur 1). Dette plasmidet koder for "vill-type"-bGH, og ekspresjonen er kontrollert av et 1700 baseparsegment av muse-metallotionein I-transkripsjo-nell regulatorisk sekvens.

Plasmidene pBGH-10delta6-G<119>R og pBGH-10delta6-E117L, G<1>1<9>R, A<122>D var avledet fra pBGH-10delta6 og ble dannet ved segmentrettet mutagenese ved anvendelse av komplementære oligonukleotider for å erstatte DNA mellom Tthllll-setet (funnet nære ved 3'-enden av Exon IV) og Xma-1-setet (beliggende nære 5'-enden av Exon V) . De andre mutasjonene beskrevet heri ble likeledes dannet.

Komplementære oligonukleotider anvendt for pBGHIO delta 6-G:119R var:

De komplementære oligonukleotidene anvendt for pBGHIO delta6-E117L, G119R, A122D var:

Disse oligonukleotidene hybridiserer som følger:

Disse oligomikleotidene koder for DNA forandringer som resulterer i substitusjoner av arginin for glycin i posisjon 119 i pBGH-10delta6-G119R, og leucin med glutamat i posisjon 117, arginin med glycin i posisjon 119 og aspartat med alanin i posisjon 122 i pBGH-10delta6-E11<7>L, G11<9>R og A<122>D. Disse aminosyrene ble valgt på grunn av at de har hydrofil (arginin og asparaginsyre) eller hydrofob (leucin) karakter [se Hopp og Woods, PNAS (USA), 78:3824-28 (1981)], positivt (arginin) eller negativt (asparaginsyre) ladede side-kjeder [se Kaiser og Kezdy, Science acid, 223:249-55

(1984)], og høyt ot-helisk-dannende potensiale [se Chou og Fasman, Ann. Rev. Biochem., 47:251-76 (1978)] som fremmer dannelsen av en idealisert amfifil a-heliks [se Margalit, et al., J. Immunol., 138:2213-29 (1987); Brems, et al., Biochemistry 26:7774-78 (1987); Kaiser og Kezdy, supra; Chen, et al., PNAS (USA), 87:5061-65 (juli 1990)]. I tillegg koder disse oligonukleotide dupleksene for en stille basepar forandring konstruert for å danne et unikt BamHI-restriksjonssete som forenklet screenings-prosedyrene. 01igonukleotIdene ble sammensmeltet og subklonet mellom Tthllll- og Xmal-setene ved anvendelse av standard prosedyrer (Maniatis et al., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor: (1982)). Mutante plasmid-DNA ble identifisert ved spaltning med BamHI-restriksjonssete som forenklet screenings-prosedyrene. 01igonukleotidene ble sammensmeltet og subklonet mellom Tthllll- og Xmal-setene ved anvendelse av standard prosedyrer (Maniatis et al., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor: 1982). Mutante plasmid DNA ble identifisert ved spaltning med BamHI.

Nukleotidsekvensen til muterte bovine veksthormonmål-regioner ble bestemt ved anvendelse av dideoksykjede-termineringsmetoden med modifisert T7 DNA-polymerase (Sequenase, United States Biochemical; Sanger et al., PNAS (USA), 74:5463-67 (1977)). 01igonukleotid primere for manuell DNA-sekvensering ble syntetisert ved anvendelse av DuPont Coder #300 DNA synthesizer og ren-set ved denaturerende polyakrylamidgelelektroforese, passiv eluering og konsentrering ved etanolpresipi-tering. 01igonukleotidprlmerne anvendt for direkte sekvenseringsanalyser av de to mutantene var følgende: 18mer (5<*> AAATTTGTCATAGGTCTG 3'). l-3>jg av dobbelttrå-det plasmid-DNA ble denaturert i nærvær av 0,2N NaOH, og 10-20 pmol av oligonukleotidprimer ble latt sammen-smelte (65"C, 2 min. etterfulgt av 30 min. sakte av-kjøling) til det denaturerte templatet. En to-trinns polymerisering ble utført ved anvendelse av den modifiserte T7 DNA-polymerasen som utvider den oligo-nukleotid-primede kjeden i nærvær av dNTP og deoksyade-nosin-triotrifosfat (>1000 Ci/mmol, Amersham) etterfulgt av overføring av like aliquoter inn i hver av de fire spesifikke dideoksynukleotldblandingene som tilfeldig terminerer kjedeforlengningen. Etter addisjon av en formamidtermlneringsbuffer til hver reaksjon, ble prøvene inkubert ved 80°C i 2 min. og DNA-sekvensen ble bestemt etter størrelsesseparering av de fire settene av fragmentene ved 10* polyakrylamid/8M urea elektrofo-rese og autoradiografi.

Eksempel 2: Ekspresjon i <p>attedyrceller i kultur

Ved anvendelse av in vitro mutageneseprotokollene beskrevet ovenfor, ble to mutante bGH-gener dannet initielt: en omdanner glycin<119> til arginin ("G119R") og den andre omdanner glutamat117 til leucin, glycin<119 >til arginin og alanin<122> til aspartat (E117L, G119R, A122D).

Plasmidene som koder for disse mutasjonene samt vill-type-bGH-DNA (pBGHlOdelta) ble transient ført inn i dyrkede muse L-celler som deretter ble analysert for bGH ekspresjon. Ifølge "western analyse" ble protein-bånd på omtrent 22.000 dalton observert for villtype-bGH og bGH avledet fra de to mutante gener.

L-celler fra mus ble opprettholdt i DMEM (Gibco) pluss 10* kalveserum og 25 p/ml gentamycin (Gibco). I denne studien ble en modifikasjon av en tidligere beskrevet transfeksjonsprosedyre anvendt (Lopata et al., Nucleic Aclds Res., 12:5707-5717 (1984)). 2 pg plasmid-DNA ble tilsatt til 1,0 ml DMEM inneholdende 0,2 mg DEAE-dekstran. Denne oppløsningen ble tilsatt til omtrent 10^ celler I en 35-mm vevskulturskål som tidligere var blitt vasket med 2,0 ml DMEM. Etter inkubasjon av cellene i en time ved 37° C ble DNA-DEAE-dekstranopp-løsnlngen fjernet og cellene "sjokkbehandlet" i 90 sekunder med 2,0 ml 10* DMSO i Hepes-bufret saltvann ved romtemperatur. Deretter ble "sjokk"-oppløsningen fjernet og cellene vasket med 2,0 ml DMEM. Medium inneholdende 10* Nu-serum (Collaborative Research) pluss 50 ug/ml gentamicin ble skiftet daglig. Kulturfluidene ble lagret ved -20<*>C. For bGH-bindings-analysene ble transfekterte celler inkubert I DMEM-minus-serum i 16 timer, hvoretter kulturfluidene ble fjernet og frosset ved -20*C.

Natriumdodecylsulfat (SDS)-PAGE-analyser av utskilt bGH er blitt beskrevet (Kopchick et al., DNA, 4:23-31

(1985); Kelder et al., Gene, 76:75-80 (1989). I denne studien anvendte vi et polyklonalt anti-bGH-serum for "Western" analyse.

Eksempel 3: Veksthormonreseptorbindingsstudler

Kulturmedier-manglende serum ble samlet fra celler transfektert med en pBGH-10delta6 (villtype-bGH) og mutante bGH-gener. Etter lyofilisering av kulturmediet og bGH-konsentrasjonsbestemmelser, ble konkurrerende membranbindingsstudier utført som tidligere beskrevet (Smith & Talamants, J. Biol. Chem., 262:2213-19

(1987)). Levermembranpreparatene fra C57BL/6JxSJL hybride mus av hvert kjønn (60-120 dager gamle) ble homogenisert med et Brinkman Polytron i 4 volumer (vekt/v) 0,3 M sukrose, 10 mM EDTA, 50 mM Hepes, 0,1 mM TPCK og 1 mM PMSF ved pH 8,0. Ovennevnte trinn og alle følgende protokoller ble utført ved 4°C. Homogenatet ble sentrifugert ved 20.000 x g 30 min. og supernatan-ten ble sentrifugert ved 100.000 x g i 1 time. Pelletene ble vasket en gang med 10 mM Hepes, pH 8,0 og på ny sentrifugert. Disse pelletene ble resuspendert i 10 mM Hepes, pH 8,0, til en proteinkonsentrasjon på omtrent 50 mg/ml. Membranene ble preparert I aliquoter, frosset på tørris og lagret ved -20"C. Konsentrasjonene av membranproteinet ble bestemt ved Lowry proteinanaly-sen (Lowry et al., J. Biol. Chem,, 193:265-275 (1951)).

Konkurrerende bindingsanalyser ble utført ved anvendelse av følgende protokoll. Mikrosomale membraner tilsvarende 3 mg protein ble inkubert med 30.000 cpm/tube <125>I bGH (Cambridge Medical Diagnostics) og umerket bGH varierende fra 0,3 ml analysebuffer (20 mM Hepes, 10 mM CaCl2 0,1 % BSA og 0,05 * NaN3 pH 8,0). Alle analysene ble utført i triplikater. Etter Inkube-ring over natten ved romtemperatur ble membranbundet hormon separert fra fritt hormon ved tilsetning av 1 ml iskald analysebuffer etterfulgt av sentrifugering ved 10.000 x g i 20 min. Membranpelletene ble deretter analysert for radioaktivitet. Spesifikk bundet radioaktivitet ble bestemt ved subtrasjon fra verdien produsert ved Inkubasjon av membraner med 5 pg umerket bGH (Smith og Talamants, 1987).

Effektive doser som resulterte I 50* fortrengning (ED50) av <12>^1-bGH fra membranpreparatene ble bestemt. Mutant bGH kodet for av pBGH-10delta6-G<119>R og pBGHIOdelta 6-E117L, G<1>19R, A122D viste en ED50 verdi som er lik villtype-bGH.

Eksempel 4: Produksjonspilotstudie av transgene mus

En serie linjer av transgene mus som inneholder vill-type- og mutante bGH-gener ble produsert ved standard mikroinjeksjonsteknikker (McGrane et al., 1988). DNA-ekstraksjon fra musehaler, dot blot og serumbestemmel-ser var som bestemt (McGrane et al., 1988).

Genene Inneholdt transkripsjonene regulatoriske sekvenser fra metallotionein I-promotere fra mus som er blitt vist å være aktiv i levervev samt andre vev fra transgene mus (Palmiter et al., Nature 300:611-615

(1982)). Avkom dannet ved mikroinjeksjonsprosedyre ble analysert for bGH-DNA ved slot blot hybridiseringsana-lyse. Muselinjer som inneholder omtrent en kopi av rekombinante bGH-DNA-sekvenser avledet fra pBGH-10delta6, (villtype), pBGH-10delta6-G<119>R, og pBGHlOde-Ita6-E11<7>L, G1<19>R, A<122>D ble dannet. Serum fra transgene dyr ble analysert for bGH-nivåer ved hjelp av Western teknikken. Alle musene som uttrykte villtype-bGH- transgenet 1 serum hadde også en tilsvarende forøket veksthastighet. Mus som uttrykte mutant bGH (G<119>R eller E117L, G119R, A122D) i serum var dramatisk og signifikant mindre. Etter åtte ukers vekst var vekstforholdet for villtype_bGH-transgene mus relativt til kontroller fra samme kull 1,5, mens forholdet for to bGH-mutante mus til kontroller fra samme kull var -0,6. Når det gjelder trippelmutanten ble det dannet 10 stammus som uttrykker det muterte bGH-genet. Vekstforholdet mellom transgene og ikke-transgene fra samme kull varierte fra 0,58 til 1,00. Grad av veksthemming var direkte relatert til serumnivåene av mutert bGH. Tre stamforeldre er blitt avlet, og disse fører egen-skapen til avkommene. Ca. 50* av disse avkommene er positive for genet og har den tilsvarende lille fenotypen .

Det er blitt demonstrert at mange aktiviteter til GH er formidlet gjennom en familie av peptider kjent som insulinlignende vekstfaktorer (IGF), spesielt IGF-1, som antas å bli primært produsert i leveren etter GH-binding til dets reseptor(er). (Se Truesch, et al., Ann. Rev. Physiol., 47:44367 (1985); Zapt, et al., Harm. Res., 24:121-130 (1986)). IGF-1 er blitt vist å redusere GH-produksjonen i hypofysen ved en klassisk negativ feedback-mekanisme. (Leung, et al., Endocrinology, 119:1489-96 (1986)). En hypotese for å forklare vekstsuppresjonen i pBGH10A6-M8-transgene mus er at bGH-M8 oppnås som en in vivo-antagonist for GH fra mus

(mGH), og som derved undertrykker produksjon av IGF-1 fra mus. Dersom dette er tilfelle, vil man vente ikke bare en reduksjon i nivåer av serum-mus-IGF-1 i bGH M8-transgene mus, men også en økning i mGH-produksjonen i hypofysen. Det er oppdaget heri at IGF-1 nivåene i serum til "små" transgene mus er ca. 50* i forhold til normale ikke-transgene mus, mens mus inneholdende vill-type-bGH (store mus) har omtrent 2x IGF-1 nivåer av ikke-transgene mus. Resultater fra lmmunblotanalyser av hele hypofysekjertler tatt fra bGH-M8-transgene mus, bGH transgene mus og deres ikke-transgene fra samme kull tyder på at hypofysekjertiene i disse vekst-un-dertrykte musene inneholder høyere nivåer av mGH relativt i forhold til deres ikke-transgene mus fra samme kull ("littermates"). mGH nivåene i bGH-transgene mus var sterkt undertrykt på grunn av at museserum IGF1-nivåene ble øket opp til 2 ganger så mye som nivåene i serum til deres ikke-transgene mus fra samme kull. Palmiter, et al., Science, 222:809-14 (1983). Disse resultatene Indikerer samlet at de endrede bGH-mole-kylene virker som en antagonist overfor endogen muse-GH. Det er derfor det første eksemplet på en in vivo veksthormonantagonist og det første eksemplet på opp-splitting av vekstfremmende og reseptorbindende aktiviteter til GH.

Eksempel 5: Screening av andre muteiner av bGH og hGH

Ved lignende prosedyrer er muteiner av bGH og hGH med endringer i tredje alfaheliks blitt dannet og testet for sekresjon i L-celler, og i valgte tilfeller, deres virkning på veksten av transgene mus med følgende resultater .

Mutantene er beskrevet ved å gi den opprinnelige aminosyren, dets posisjon i aminosyresekvensen til bGH og erstatningsaminosyren, med aminosyren angitt ifølge den internasjonalt aksepterte enkelbokstavkoden, George, et al., Protein Seq. Data Anal., 1:27-39

(1987).

Et første sett av muterte bGH-gener resulterte, når uttrykt i transgene mus, i dyr med et vekstforhold som ligner det til mus som uttrykker villtype-bGH (dvs.-1,59 - 1,72). Disse analogene blir referert til som "fullstendig funksjonelle agonister" (Tabell 1).

Et annet sett av muterte bGH-gener som uttrykt i transgene mus, resulterte i mus med et vekstforhold som var mindre enn de dyrene som uttrykker villtype-bGH (dvs. mellom 1,29 - 1,35). Disse bGH-analogene blir referert til som "delvis funksjonelle agonister" og er oppført i Tabell II.

Et tredje sett av muterte bGH-gener, når uttrykt i transgene mus, resulterte i dyr med et vekstforhold som ligner det til ikke-transgene mus (dvs. - 1,0). Disse analogene blir referert til som "ikke-funksjonelle agonister" (Tabell III).

Et fjerde sett av muterte bGH-gener, når uttrykt i transgene mus, resulterte i mus med et vekstforhold på mellom 0,57 og 1,0 (Tabell IV). Vekstforholdet til musene var negativt korrelert med serumnivået til bGH-analogen, dvs. når serumnivået til bGH-analogen økte, ble vekstforholdet til dyrene redusert. Denne korrelasjonen er vist grafisk I Figur 13.

Disse analogene, når uttrykt overfor NIH-3T3-preadipocytter, resulterte Ikke i stimulering av preadipocytt-differensieringen, men native GH vil fremme denne dif-ferensieringen (Fig. 12). Disse analogene vil antagonisere evnen som villtype-GH har til å fremme preadipo-cyttdifferensiering (Fig. 11). Disse analogene er blitt referert til som "funksjonelle antagonister" (Tabell

IV).

Det er også heri blitt dannet transgene mus som uttrykker enten villtype-hGH, hGH G120A, hGH G120S og hGH G120W (Tabell V). Mus som uttrykker hGH G120A viser en vekstfremmet fenotype som ligner mus som uttrykker villtype-hGH (Tabell V). Denne hGH-analogen blir betegnet en "funksjonell agonist". Substitusjon av R eller W for G I posisjon 120 i hGH, og påfølgende ekspresjon i transgene mus, resulterte i dyr med et vekstforhold mellom 0,73 og 0,96 (Tabell V), og hvor nivået av serum hGH-analoger er negativt korrelert med vekstfenotypen, dvs. når serumnlvåene til disse hGH 120-analogene øker, så reduseres vekstforholdet. Denne korrelasjonen er vist i Figur 14. Som bGH analogene som virker som "funksjonelle antagonister", ble disse hGH 120-analogene betegnet som "funksjonell antagonist". Det er viktig å bemerke at glyclnresidiet i bGH i posisjon 119 er homologt med glycinresidiet i hGH i posisjon 120. De er begge beliggende i den sentrale delen av den tredje a-heliksen.

En undergruppe av bGH-analoger er presentert i Tabell VI hvor deres evne til å bli utskilt etter transfeksjon av mutert DNA inn i L-celler fra mus er blitt vurdert. Transgene dyr inneholdende disse muterte DNA er ikke blitt dannet.

Mutanten K112L, K114W viser virkningen av å utvide den hydrofobe siden av heliksen. Denne mutanten påvirker veksten av dyret i likhet med villtype-veksthormonet.

Mutasjonene K114P, E118P og L121P (og forskjellige kom-binasjoner derav) ødelegger sannsynligvis alfaheliksen (prolin er en sterk alfaheliksbryter). Den vekstrela-terte biologiske aktiviteten blir opphevet. Mutasjonen E126G er et spesialtilfelle. Glycin er en heliksbryter, men posisjon 126 er i enden av heliksen slik at den normale biologiske aktiviteten blir beholdt. Med G119P ble derimot en sterk heliksbryter erstattet med en som er enda sterkere, og alfaheliksen ble tilsynelatende bevart.

Den tredje alfaheliksen til villtype-veksthormonet di-vergerer fra en perfekt amfifil alfaheliks ved tre po-sisjoner. Ved 117 er Glu en hydrofil aminosyre i det hydrofobe området. Ved 119 er Gly en nøytral aminosyre i det hydrofile området. Ved 122 er Ala en hydrofob aminosyre i det hydrofile området. Mutasjonene E117L, G119R og A122D øker separat eller i kombinasjon den amfifile karakteren til heliksen. G119R øker i tillegg alfahelikstendensen til sekvensen.

Den opprinnelige hypotesen var at den vekstinhibitoriske aktiviteten til mutantene G119R og E117L/G119R/- A122D var assosiert med øket amf ipatisitet til den tredje alfaheliksen. Det er videre blitt utviklet bevis for at amfipatislteten til den tredje alfaheliksen er meget irrelevant for den aktiviteten. (1) Enkelt E117L, som villtype-bGH, produserte store dyr. (2) Mutant G119P produserte "små" dyr fenotypen til tross for at prolin er like hydrofil som glycin . (3) Mutant G119L produserte "små" dyr fenotypen til tross for at leucin er hydrofob og derfor bryter den hydrofile overflaten til heliksen. (4) Mutanten E111L/G119W/R125L produserte "små" dyr fenotypen til tross for at alle tre mutasjonene bryter den hydrofile overflaten til heliksen. (5) Enkelt A122D produserer et mutein som ikke har noen virkning på veksten.

I en utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse mutasjoner av den tredje alfaheliksen som resulterer i vekstinhibitorisk aktivitet, men reduserer eller lar den amfiflie karakteren til heliksen være uforandret.

Ytterligere veksthormonantagonister kan bli identifisert ved systematisk variering av kodonet som tilsvarer G119 i bGH for å uttrykke de 18 andre mutantene som har en enkelt aminosyreforandring ved denne posisjonen. Dette blir oppnådd ved syntetisering av oligonukleotider som er forskjellige fra de som er angitt i Eksempel 1 ved kodon 119 for å kode for den ønskede alternative aminosyren. Likeledes kan man endre det homologe glycinresidiet i tredje alfaheliks til andre GH, f.eks. G12<0> til hGH. Likeledes er variasjoner av kodonene som tilsvarer andre aminosyrer 1 tredje alfa-heliks til en GH undersøkt.

Eksempel 6: Antikolesterolemisk aktivitet til

veksthormonantagonister

Prosedyrer for klinisk kjemi-tester:

Blodprøver ble tatt fra musehaler. Prøvene ble ko-agulert ved romtemperatur i 5 minutter og ble deretter sentrifugert, og serumet ble samlet og frosset ved

-20'C frem til analysen. Totalkolesterol (TC), tri-glycerid (TR), glukose (GL) og blodureanitrogen (BUN) ble analysert på en Kodak Ektachem DT 60 analysator ved anvendelse av tørre, flerlagete elementer som var spesifikke for hver test. 10 pl serum ble pipettert på

individuelle objektglass spesifikke for hver test og ble analysert ved anvendelse av kolorimetrisk måling ved refleksspektrofotometrimetoder og sammenlignet med daglige kvalitetskontroll referanseprøver.

Resultater:

Det er ingen signifikant forskjell i blodglukose-, serum urea/nitrogen- og serum triglyceridnivåene mellom bGHM8-transgene mus og deres ikke-transgene mus fra samme kull. De totale serum kolesterolnivåene i bGH-M8-transgene mus blir betraktelig redusert (P<0,05) sammenlignet med deres ikke-transgene mus fra samme kull og bGH-transgene mus.

Eksempel 7: In vitro bioanalvse for veksthormonantagonistaktivitet

Studier av veksthormon har vist at det fremmer dannelsen av adipose fra preadipose 3T3-celler. Murikava, et al., Cell 29:789 (1982). Glycerofosfatdehydrogenase (GPDH) er blitt anvendt som en differensieringsmarkør for denne GH-induserte adiposeomdanningen, Wise og Green, J. Biol. Chem., 254:273-75 (1979); Nixon og Green, Endocrinology, 114:527 (1984); Pairault og Green, Proe. Nat. Acad. Sei. (USA), 76:5138 (1979).

Denne analysen er blitt tilpasset for å bestemme om en bGH-mutant virker som en GH-antagonist. Både bGH og bGH-M8 blir bundet til reseptorene på disse preadipocyttene med en Kd-verdi på 10 mM. Når eksponert for den native sekvensen til bovint veksthormon (30 pM) og dyrket i 7 dager, differensieres preadipocyttene og GPDH-aktiviteten blir stimulert. Dersom bGH-mutanten blir tilsatt til dyrkningsmediet Inneholdende villtype-bGH, er det en doseavhengig reduksjon i GPDH-aktivitet og derfor sannsynligvis i adiposeomdanningen (Fig. 11).

Denne analysen er et hensiktsmessig screenings-redskap for identifisering av potensielle GH-antagonister.

Eksempel 8:

Mus som er transgene for vllltype-bGH-genet er kjent for å utvikle progressiv alvorlig glomerulosklerose og øket glomerulær størrelse. Doi, et al., Am. J. Path., 137:541-52 (199 ); Resce, et al., Lab. Invest., 65:601-5 (1991); Doi, et al., Am. J. Path., 131:398-403

(1988); se også Stewart, et al., Endocrinology, 130:405-414 (1992). Dette er ikke bare en funksjon av kroppsstørrelse, Idet bGH-Mll-mus (dvs. L121P, E126G mutanter), hvor mutant bGH Ikke øker veksten, også utviser glomerulosklerose. I bGH-M8 (G119R)-mus, som hadde redusert serum IGF-I, kroppsstørrelse og glomerulær størrelse relativt til ikke-transgene mus, var glomerulosklerose fraværende.

Oppsummering av vekstforholdsammenllgninger mellom transgene mus som uttrykker bGH-analoger og deres ikke-transgene mus fra samme kull i alder 6 til 8 uker er vist.

TABELL 1. Transgene mus som uttrykker følgende bGH-analoger utviser fenotyper som ligner de til transgene mus som uttrykker villtype-bGH (vi har betegnet disse analogene "fullstendig funksjonelle agonister")<*>

<*> Det er ingen korrelasjon mellom serumnivåer til disse bGH-analogene og vekstfenotypene. Disse muterte bGH-genene blir uttrykt i muse L-celler og utsklllings-mønsteret er likt det til villtype-bGH.

TABELL II. Transgene mus som uttrykker følgende bGH-analoger utviser fenotyper som er mindre enn transgene mus som uttrykker villtype-bGH, men større enn ikke-transgene mus (disse analogene er betegnet "delvis funk-sjonelle agonister")<M>

<*> Det er ingen korrelasjon mellom serumnivåene til disse bGH-analogene og vekstfenotypene. Disse muterte bGH-genene blir uttrykt i og utskilt av muse L-celler med mønster som ligner villtype-bGH.

For tabellene I-VI er karakterisering av et mutein som "funksjonell" eller "ikke-funksjonell" i sammenheng med dets virkning på veksten.

TABELL III. Transgene mus som uttrykker følgende bGH-analoger utviser fenotyper som ligner deres Ikke-transgene mus fra samme kull (vi har betegnet disse analogene som "lkke-funksjonelle agonister")*1

<*> Det er ingen korrelasjon mellom nivåene av bGH-analoger i serum og vekstfenotyper. Disse muterte bGH-genene blir uttrykt i og utskilt av muse L-celler med unntagelse av bGH-K114P, E118P og bGH-L121P, E126G som ikke blir utskilt av muse L-celler.

TABELL IV. Transgene mus som uttrykker følgende bGH-analoger utviser fenotyper som er mindre enn de til Ikke-transgene mus fra samme kull (disse analogene er betegnet som "funksjonelle antagonister")<*1>

TABELL V. Oppsummering av transgene mus som uttrykker hGH-gener kodende for enkelte aminosyresubstitusjoner i posisjon 120<*> (hGH-G120A er en "full-funksjonell agonist". hGH-Gl2OR og hGH-G120W virker som "funksjonelle antagonister")

<*> bGH Gly 119 er 1 en posisjon som er ekvivalent til hGH Gly 120. Vi refererer til hGH Gly 120 i samsvar med litteraturen. <**> Nivået for vekstsuppresjon er korrelert med serumnivåene til hGH-analogene (se Fig. 14).

TABELL VI. Oppsummering av muterte bGH-gener uttrykt I muse L-celle uten transgene mus.

Claims (23)

1. Veksthormonantagonistpeptid eller -protein med minst 11 aminosyrer, karakterisert ved at det omfatter en mutert alfaheliks som er vesentlig homolog med, men ikke identisk med, den tredje alfaheliks til et referanse-veksthormon (hGH, flg. 1), og humant veksthormon hGH selektert fra gruppen bestående av bovint veksthormon (bGH) og humant veksthormon (hGH) og som dannes av aminosyrene hovedsakelig tilsvarende posisjonene 106-129 i den naturlig forekommende formen, hvor minst en av forskjellene fra den tredje alfaheliks i bGH eller hGH er ved et residie som tilsvarer residiet 119 til vill-type bGH eller 120 til villtype hGH, idet nevnte peptid eller protein kan antagonisere minst én biologisk aktivitet til veksthormonet fra virveldyr, og som er et protein forskjellig fra: (a) enkeltsubstitusjonen bGH-mutantene G119P, G119K, G119L og G119R, (b) trippelsubstitusjonen bGH-mutantene E117L, G119R, A122D, eller (c) hGH-mutanten Y111V, L113I, D116Q, E118K, E119R, G120L, Q122E, T123G, G126L, R127I, E129S.

2. Peptid eller protein ifølge krav 1,karakterisert ved at alfaheliksen er forskjellig fra den tredje alfaheliks hos bGH eller hGH, ved én eller flere mutasjoner som resulterer I vekstinhibitorisk aktivitet som likevel reduserer den amfifile karakteren til heliksen, eller lar denne være uendret.

3. Peptid eller protein ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte peptid eller protein i det vesentlige er homologt med et referanse-veksthormon selektert fra gruppen bestående av bovint veksthormon og humant veksthormon.

4. Peptid eller protein ifølge krav 2,karakterisert ved at aminosyren tilsvarende aminosyre 119 til villtype-bGH eller aminosyre 120 til villtype-hGH, blir valgt fra gruppen bestående av alle de naturlig forekommende aminosyrene med unntagelse av glycin og alanin.

5. Peptid eller protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at det er forskjellig fra villtype-bGH og fra villtype-hGH ved minst to substitusjoner, der en av disse substitusjonene er at residiet som tilsvarer residiet 119 av villtype-bGH eller residiet 120 av villtype-hGH, er prolin.

6. Peptid eller protein ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at resldlen som korrespon-derer til residie 119 hos villtype-bGH eller 120 hos vill-type-hGH, er tryptofan.

7. Peptid eller protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at det er forskjellig fra villtype-bGH og fra villtype-hGH ved minst to substitusjoner, der en av disse substitusjonene er at residiet som tilsvarer residiet 119 av villtype-bGH eller residiet 120 av villtype-hGH, er leucin.

8. Peptid eller protein ifølge krav 5 eller 7, karakterisert ved at minst en av de ytterligere substitusjoner er en substitusjon som øker affiniteten til GH-reseptormolekylet.

9. Peptid eller protein ifølge hvilket som helst av kravene 1-8, karakterisert ved at nevnte referanseveksthormon er humant veksthormon.

10. Peptid eller protein ifølge hvilket som helst av kravene 1-8, karakterisert ved at nevnte referanseveksthormon er bovint veksthormon.

11. Vektor, karakterisert ved at det inneholder en DNA-sekvens som koder for peptidet eller proteinet ifølge hvilket som helst av kravene 1-10, og som ytterligere omfatter en promoter operativt koblet til nevnte gen.

12. Vertcelle, karakterisert ved at den er transformert med og kan uttrykke det rekomblnante DNA-molekylet ifølge krav 11.

13. Fremgangsmåte for å produsere et veksthormonantagonistpeptid eller -protein, karakterisert ved at den omfatter å transformere en celle som bærer med en ekspresjonsvektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for et peptid eller protein Ifølge hvilket som helst av kravene 1-10, og nevnte protein blir produsert i en egnet eller gjenvinnbar form.

14. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter peptidet eller proteinet ifølge hvilket som helst av kravene 1-10, og en farmasøytisk akseptabelt bærer.

15. Anvendelse av et veksthormonantagonistpeptid eller -protein på minst 11 aminosyrer, som omfatter en mutert alfaheliks som i det vesentlige er homolog med, men ikke identisk til, den tredje alfaheliks av et referanseveksthormon (bGH, fig. 1) og humant veksthormon hGH selektert fra gruppen bestående av bovint veksthormon (bGH) og humant veksthormon (hGH) og som dannes av aminosyrene hovedsakelig tilsvarende posisjonene 106-129 i den naturlige forekommende formen, hvor minst én av forskjellene fra den tredje alfaheliks i bGH eller hGH er ved et residie korresponderende til residie 119 hos villtype-bGH eller 120 hos villtype-hGH, hvor nevnte peptid eller protein er istand til å antagonisere minst den biologiske aktiviteten til et humant eller animalsk veksthormon, og er et peptid eller protein annet enn: (a) enkeltsubstitusjonen bGH-mutantene G119P, G119K, G119L og G119R, eller (b) trlppelsubstitusjonen bGH-mutanten E117L, G119R, A122D, for fremstilling av en sammensetning for å forebygge eller behandle en tilstand hos nevnte menneske eller dyr som er kjennetegnet ved nivået av nevnte biologiske aktivitet som overskytende.

16. Anvendelse av et rekombinant DNA-molekyl istand til å uttrykke 1 en egnet vertcelle et veksthormonantagonistpeptid eller -protein på minst 11 aminosyrer, som omfatter en mutert alfaheliks som i det vesentlige er homolog med, men ikke identisk til, den tredje alfaheliksen til et referanse-veksthormon (bGH, fig. 1) selektert fra gruppen bestående av bovint veksthormon (bGH) og humant veksthormon (hGH) og som dannes av aminosyrene hovedsakelig tilsvarende posisjonene 106-129 i den naturlig forekommende formen, hvor minst én av forskjellene fra den tredje alfaheliksen i bGH eller hGH er ved et residie korresponerende til residie 119 hos villtype-bGH eller 120 villtype-hGH, hvor nevnte peptid eller protein er istand til å antagonisere i det minste den biologiske aktiviteten til et menneske- eller dyrevektshormon, og at peptidet eller proteinet er et annet enn: (a) enkeltsubstitusjon~bGH-mutantene G119P, G119K, G119L og G119R, eller (b) trippelsubstitusjon-bGH-mutanten E117L, G119R, A122D, for fremstilling av en sammensetning for å forebygge eller behandle en tilstand hos nevnte mennekse eller dyr som er kjennetegnet ved at nivået av nevnte biologiske aktivitet er overskytende.

17. Anvendelse ifølge krav 15 eller 16, hvor alfaheliksen er forskjellig fra den tredje alfahelisken til bGH eller hGH ved én eller flere mutasjoner som resulterer i vekstinhibitorisk aktivitet og allikevel reduserer den amfifile karakteren til heliksen eller lar denne forbil uendret.

18. Anvendelse ifølge krav 15 eller 16, hvor den biologiske aktiviteten er stimuleringen for vekst, og peptidet eller proteinet har en vekstinhibitorisk effekt.

19. Anvendelse ifølge krav 15 eller 16, hvori tilstanden er diabetes.

20. Anvendelse ifølge krav 19, hvori den biologiske aktiviteten forårsaker ødeleggelse i mikrovaskulære vev slik som retinalt endotelvev.

21. Anvendelse ifølge krav 19, hvori den biologiske aktiviteten bidrar til utvikling av glomerulosclerose.

22. Anvendelse Ifølge krav 15 eller 16, hvori tilstanden er overskuddsnivåer av serumkolesterol og peptidet eller proteinet har en hypokolesterolemisk effekt.

23. Anvendelse ifølge krav 15 eller 16, hvori den biologiske aktiviteten er tumorgen.