JP3789928B2 - 成長ホルモンアンタゴニスト - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は成長ホルモンに関する。より詳細には、ウシの成長ホルモンで動物の成長を抑制するミューテイン[muteins]に関する。こうしたアンタゴニストは「縮減成長」[reduced growth]表現型を得るように遺伝子導入された（トランスジェニック）動物に発現されることがある。
情報の開示
ウシの成長ホルモン（GH）は、下垂体前葉中で普通に産生される191個のアミノ酸からなるタンパク質である。成熟タンパク質の分子量は約22,000ダルトンだが、アミノ末端に26個の余分なアミノ酸がある前段階の成長ホルモン[pre-growth hormon]として最初は作られる。このリーダー（つまりシグナルペプチド）はウシの下垂体細胞によるホルモン分泌中に通常分割される。いくつかの型の成熟タンパク質が天然裡に発見されている。Ｎ末端は（分泌中での分割部位のバリエーションによって）変化することができ、成熟タンパク質はNH2-Ala-Phe-ProまたはNH2-Phe-Proのいずれかで始まる。さらに、126番目のアミノ酸は、ウシ集団中の対立遺伝子のバリエーションの結果、明らかにロイシンまたはバリンのいずれかであろう。
bGH（ウシ成長ホルモン）を牛へ外部から投与したときは、牛乳の生産量、飼料効率、生育速度、および脂肪依存度を向上させ、贅肉期間を短縮する。
bGHはDNA組換え技術によって産生されている。例えば米国特許第4,443,539号（イースト）、Buellの欧州特許出願第103,395号（細菌）、Krivlの欧州特許出願第193,515号（細菌）、Kopchickの欧州特許出願第161,640号（動物に移植されたカプセル内包のマウス細胞）、DeBoerの欧州特許出願第75,444号（細菌、有害二次構造を除去するために修飾した遺伝子）参照。bGHは部位特異的突然変異の生成[mutagenesis]によってbGH類似体の産生を行っている。こうして英国特許第2,073,245号のAvivは、E.coliでのMet Pro（des Ala）bGH、Arg（des Ala）bGH、Met-Glu-Gly（des Ala）bGH、およびdes（Ala1-Phe2-Pro3-Ala4）bGHの生成について記載している。BremsらのPNAS（米国）85:3367-71（1988）は、bGHの第三α-ヘリックスの疎水面に伸びるbGH突然変異体K112Lの調製について報告している。この突然変異体の96-133の断片も調製されている。bGHのタンパク質断片の生物学的作用についても研究されている。Bremsらの生化学26:7774（1987）、Swislockiらの内分泌学87:900（1970）、PaladiniらのTIBS 256（1979年11月）がある。アミノ酸96-133を含むbGHの断片はbGH1-95やbGH151-191に比較し成長促進作用において優れている。Haraらの生化学17:550（1978）、Sonenbergの米国特許第3,664,925号および第4,056,520号、ChenおよびSonenbergのJ.Biol.Chem.250:2510-14（1977）参照。
類似の結果が断片bGH（96-133）につき観察されている。GrafらのEur.J.Biochem.64:333-340（1976）、HaraらのBiochem.17:550-56（1978）参照。ペプチド断片の分析から得られた知識は、分子元来の構造が劇的に崩壊され得ることから不確実な価値しかない。
bGH類似体には、ほかの成長ホルモンの公知の類似体と同様、成長促進作用に差がある。しかし成長抑制作用を有する成長ホルモン類似体はまだこれまでに報告されていない。
何種類ものトランスジェニック動物が作られてきている。HammerらのNature 315:680-683（1985）（うさぎ、羊および豚）参照。これら動物のあるものは成長ホルモンを発現するようにさせたもので、こうしたトランスジェニック動物の増進された成長について報告されている。Palmiterらは、Nature 300:611（1982）で、マウスの受精卵の雄性前核にラットの成長ホルモンの構造遺伝子に融合させたマウスのメタロチオネイン-I遺伝子のプロモータを含有するDNA断片を微量注射している。遺伝子的に修飾された接合体から発展した遺伝子操作マウスの何匹かは、対照マウスの成長率より実質的に高い成長率を示した。（事実上、遺伝子的に修飾されたマウスは動物成長に対するホルモン効果を決定するテスト環境として機能する）Later,PalmiterらはSience 222:809（1983）で、発現性のヒト成長ホルモン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスに同様な成長促進があり得ることを示した。同様な効果は、ヒト成長ホルモン放出因子がトランスジェニックマウスに発現されるときにも見られる。Hammerら、Nature、315:413（1985）参照。
ウシ成長ホルモンはまたトランスジェニック動物にも発現されている。McGraneら、J.Biol.Chem.,263:11443-51（1988）、Kopchickら、Brazil.J.Genetics,12:37-54（1989）
しかしながら、縮減成長[reduced growth]表現型を示す外来性の遺伝子を特徴とするトランスジェニック動物は、これまで知られていない。
研究者らは、タンパク質の二次構造をその一次アミノ酸配列から予測しようとしている。Chou,Fasman、Biochemistry,13:222（1974）ポリペプチドの二次構造はポリペプチド鎖の直線部分の規則的な並び方である。最も普通に見られる二次構造は、βシートとα-ヘリックスである。ヘリックスは、エレメントあたりの起伏[rise]ｄ、ターンあたりのエレメント数ｎ、およびヘリックス軸からの各エレメント（例えばＣα原子）のマーカーポイントへの距離ｒで表すことができる。ポリペプチド中のα-ヘリックスのこれらパラメータの平均値は次の通りである。
ｎ，３.６残基／ターン
ｄ，１.５Å／残基
ｒ，２.３Å
Schulz,Schimer,Principles of Protein Structure 69（Springer-Verlag:1979）参照。α-ヘリックスは、ヘリックスの１回転により分けられるペプチドアミド残基とカルボニル基の残基とを水素結合して安定にされている。
二次構造の予測は、既知の三次元構造のタンパク質中のβシート、α-ヘリックス等中のアミノ酸の発生頻度に関する観察に基づき行われる。
発明の概要
本発明は、脊椎動物成長ホルモンに実質的に相同であるが成長抑制作用を有するタンパク質に関する。
bGH中のGly119のArg（“G119R”）、Pro（“G119P”）、Lys（“G119K”）、Trp（“G119W”）、およびLeu（“G119L”）への突然変異、およびAla122のAsp（“A122D”）への突然変異が、脊椎動物、特に哺乳類において成長抑制作用をもつミューテイン（突然変異体タンパク質またはそのペプチド断片）に起因することを発見した。この新規なホルモンは、成長抑制が望まれるときに哺乳類（およびその他の脊椎動物）、特にウシに投与することができる。本発明の１実施例では、このホルモンは外部で産生して目的物に投与する。ホルモンの大きさに鑑みて、それをコードする遺伝子を適切な宿主中に発現させることで産生するのが好ましい。このような遺伝子は、bGH遺伝子の部位特異性突然変異体の生成[mutagenesis]によって容易に調製することができる。もっともこのようなホルモンは、原生のbGH断片を変性アミノ酸担持の合成ペプチドと縮合するなど上記以外の技術で産生することもできる。
本発明の第２実施例では、この遺伝子を公知技術により哺乳類の胎児[a prenatal form]に導入するもので、この胎児は縮減成長表現型を発現するトランスジェニック哺乳類に生育されている。思うに哺乳類は、出生後に遺伝子的に修飾すること、即ち「遺伝子治療」をし得るようである。
このように成長抑制動物は、本発明の成長抑制ホルモンを薬学的方法で投与することにより、あるいは動物の出生前の生命体（胎児）または出生後の生命体に遺伝子的な形質転換を施すことによって産生することができる。
このホルモン、またはそれをコードする遺伝子は、狭い居住空間でのペット愛好者のためのペット、あるいは小土地所有農家にとっての家畜のように、空間的に制限がある研究施設で使用される小動物の産生にとって有益である。このホルモンはヒト巨人症の処方、および巨人症および小人症に関する研究にも有益である。
この研究において我々は、マウスのＬ細胞のタンパク質分泌能力と、トランスジェニック動物の成長率に（肯定的または否定的な）影響力をもつタンパク質と、の間に相互関係があることを発見した。成長をモジュレートするタンパク質を同定するためのＬ細胞分泌アッセイの使用も本発明の一部をなす。
本願における請求の範囲に記載の事項は、好ましい実施例に関する詳細な説明としてここに組み込むものとする。またここに言及された全ての特許および発表物は関係する限り、それらへの言及によりここに組み込むものとする。
【図面の簡単な説明】
図１は、bGH（G119R）のアミノ酸配列、およびその類似体をコードする遺伝子のヌクレオチド配列である。α-ヘリックスは印をつけられ、そのアミノ酸には数字が付されている。数字１は成熟タンパク質の第１番目のアミノ酸である。太字の塩基とアミノ酸は、G119R突然変異体中で突然変異生成されたものである。
図２はオリゴヌクレオチド方向性の突然変異生成の一般的ストラテジーである。pBGH10Δ6が親ベクターとして使用されている。これは５つのエキソン（四角のＩ−Ｖ）とイントロンＡとを包含するbGH遺伝子（BamHＩはBgIIIと結合）に融合されるマウスのメタロチオネインＩ転写規制配列（MT-1）を有する。この融合遺伝子はEcoRI位置でpBR322中に組み込まれた。pBR322由来の複製（ORI）、アンピシリン抵抗遺伝子（Amp）、bGH翻訳の開始コドン（ATG）および終止コドン（TAG）も示されている。５'と３'の非翻訳領域はハッチングで示されている。制限部位TthIVとXmaＩと間のヌクレオチド配列が示されている。代替突然変異が示されている。特殊なBamHI部位を作り出した一か所の沈黙状態[one silent situation]は（*）で示されている。変更のターゲットとされた主なアミノ酸残基の位置（115、117、119、122）も示されている。
図３はウシ成長ホルモンの第三α-ヘリックスの大部分の理想的な表面ネット（円柱プロット）を表わしたものである。この表面ネットは、同軸円柱紙片上に突き出すヘリックスの突出部によって作り出されるもので、その紙片をヘリックス軸に平行にカット後、紙片を平らに伸ばすことで作る。アミノ酸量は括弧内に記載されている。点線はAla122-Gly119-Asp115で形成された裂け目ないし凹部を示す。
図４は、ウシ成長ホルモンの（a）野生型、（b）突然変異体G119R、および（c）突然変異体A122Dのアミノ酸108-127の二次構造予測のプロット（α-ヘリックス、βシート、逆ターン、ランダムコイル）である。これらのプロットは「Micro-Genie」プログラムで作ったものである。
図５は受容体結合分析結果である（野生型bGH対突然変異体bGH G119R）。この図は突然変異体bGH（G119R）が、マウス肝臓メンブレンで調製の成長ホルモン受容体に対し野生型bGHよりも大きな親和性をもっていることを示す。
図６はこれら突然変異体の成長抑制効果を示すもので、対照（遺伝子導入されていない（非トランスジェニック））、G119R,G119L,G119K,G119Pの各マウスの成長率の比較である。
図７はbGHの第三α-ヘリックス（109-126）軸の図で、両親媒性的傾向を示す。疎水性アミノ酸部分は点々で埋めて示してある。グリシン部分、中性アミノ酸、は斜線を引いて示してある。残基数および親水性の値（Hopp・Woodのスケール）も示されている。
図８は、突然変異体G119Rのアルギニン-119の側鎖がある面に投影された野生型（左）bGHおよびG119R突然変異体（右）bGHの第三α-ヘリックスの側面図である。裂け目の底が矢印で示されている。
これらの図面は分子モデリングソフトウエアを使って作成した。（QUANTA and CHARMm,Polygene,Waltham,Massachusetts,USA）
好ましい実施例の詳細な説明
ブタ成長ホルモンの三次元構造がＸ線回折により決定され、ほかの動物の成長ホルモンの三次元構造と比較している。Abdel-Meguidら、Proc.Nat.Acad.Sci.84:6434（1987）このように研究されたほかの成長ホルモンと同様、それは逆平行関係にあるヘリックスと結び付いた４ヘリックスとして並べられる単一ドメインのタンパク質である。その４つのヘリックスは残基7-34、75-87、106-127および152-183でできている。
ウシ成長ホルモンは、アミノ酸配列レベルでブタ成長ホルモンと93％相同であり、bGHの構造は２つの配列およびブタ成長ホルモンの構造の研究から推論されている。その４つのα-ヘリックスはアミノ酸4-33、66-80、108-127、および150-179から推定されるものと報告されているが、本発明の目的のためには、bGHの第三α-ヘリックスは、アミノ酸109-126であると定義されている。そのコンフォメーションは、Chou-Fasman方式、前記（10-34、66-87、111-127、186-191）を用いたBiochemistry 16:2110（1977）でのChenとSonenbergが行った予測に合理的に一致している。
種々の脊椎動物種から単離した成長ホルモンのアミノ酸配列が多種類保存されている。ヒラメ成長ホルモンをウシ成長ホルモン等他の成長ホルモンと比較した結果、Watahikiらは、J.Biol.Chem.,264:312（1989）において、５つの保存領域を同定した。Watahikiらの保存領域GD4はウシ成長ホルモンのストレッチLKDLEEGILALMRELED、すなわち残基113-129からなる。Watahikiの図３はGHで保存された残基および成長促進作用の顕現にとり重要であると予測された残基を同定している。
ヒト胎盤性ラクトゲン-（14-191）断片にリンクしたhGH-（1-134）断片を含有する組換え分子は、完全なhGH免疫作用、ならびにウサギ肝臓から単離したGH受容体への結合親和性とを保持することが示された。Russellら、J.Biol.Chem.,256:296-300（1981）相同体走査による突然変異生成技術[homolog-scanning mutagenesis technique]を使って相同ホルモンの遺伝子断片、即ちヒト胎盤性ラクトゲンまたはヒトプロラクチン、がhGH遺伝子中を通して系統的に交換され、こうして種々のキメラホルモンが産生された。Cunninghamら、Sience,243:1330-36（1989）これら突然変異体GHと野生型bGHとのクローニング肝臓hGH受容体との結合親和性を比較した結果、受容体結合に関係するhGHには３つの不連続なポリペプチド決定基があることが結論された。これらはNH2末端、COOH末端、およびアミノ酸残基54と74間のループ内に位置していた。これら推定上の結合ドメインは、アラニン残基がそれらの領域中を通して系統的に代替されるアラニン走査による突然変異生成技術によってさらに分析された。そしてhGHの10、58、64、68、172、174、175および176の位置のアミノ酸残基がGH受容体結合にとって重要なことが明らかにされた。Cunninghamら、Science,244：1081-85（1989）
本発明は配列および二次構造において哺乳類成長ホルモンなどの脊椎動物成長ホルモン、特にウシ成長ホルモンに類似性がある成長抑制合成物（ペプチドまたはタンパク質）に関する。好ましくはこの合成物は、脊椎成長ホルモン、特にウシ成長ホルモンの第三α-ヘリックスと少なくとも約50％のアミノ酸配列における相同性[homology]を有するα-ヘリックスを包含する。原ホルモンのほかのα-ヘリックスは、もしこれが成長抑制作用を阻害することなしに行うことができるなら省いてもよい。
ウシ成長ホルモンの、その他の哺乳類動物成長ホルモンとの総体的相同性[homology]の割合は高い。ブタとは92％、ヒツジとは99％、ヒトと66％、ラットと87％である。第三α-ヘリックス（bGH 109-126に相同なアミノ酸配列）についてみると、相同性の割合は上記総体数的な数値に類似する。つまりブタと94％、ヒツジと94％、ヒトと66％、ラットと94％である。
本発明は、ウシ成長ホルモンの第三α-ヘリックスの突然変異に限定されない。そうではなくすべての哺乳類の成長ホルモン、ならびに哺乳類以外の脊椎動物の成長ホルモンの第三α-ヘリックスの突然変異を包含するもので、Watahiki（1989）中で配列が明らかにされた成長ホルモンをも包含する。即ち、ヒラメ、ブリ、マグロ、サケ、ニワトリ、ラット、ブタ、ヒツジ、ウシ、ならびにヒトの、成長ホルモンである。その他の成長ホルモンの突然変異体の発現は、それら成長ホルモンをコードする遺伝子が入手可能になったとき実施可能である。例えばGoeddel,Nature,281:544-683（1979）（hGH）参照。
ウシ成長ホルモンに実質的に相同なポリペプチドの概念は、（a）ウシ成長ホルモンのアミノ酸115、119、または122に対応するアミノ酸を交換すること、（b）脊椎動物成長ホルモン中に保存されていないウシ成長ホルモンのアミノ酸に対応するアミノ酸を交換、及び/又はアミノ酸1-95、及び/又はアミノ酸134-191をトランケーション（先端切り）[truncation]すること、によってウシ成長ホルモンとは異なる何等かのポリペプチドを含むものであると考えられる。（保存されているアミノ酸はWatahikiら（1979）で同定されている）したがって、ウシ以外の全ての脊椎動物成長ホルモンは、ウシ成長ホルモンに「実質的に相同」である。
上記合成物は、もしその合成物で処理された少なくとも一種の脊椎動物をテスト動物とした場合に（または種がそれを発現するように遺伝子的に操作されている場合に）、その動物の成長が対照動物の成長より有意的に遅いものであるなら（「有意的に」とは統計的な意味で使っている）、成長抑制的であると考えられる。成長ホルモンはかなりな程度、種間に交換しても反応する。GillらBiotechnology,3:643（1985）は組換えニワトリの、およびウシの成長ホルモンが、少年期パシフィックサーモンの成長を促進した、という報告をしている。
成長ホルモンの一定の断片は成長促進作用をもっていることが知られているが、本発明の成長抑制ペプチド（以下、「ペプチド」をタンパク質も含む概念で用いることとする）はbGHほど大きくなくてもよいことが期待される。好ましくはこのペプチドは、少なくとも１１個のアミノ酸長さ（１つのα-ヘリックスの３回転分）、一層好ましくは、少なくとも５０個のアミノ酸長さがあればよい。これらのペプチドは、例えばbGH（G119R）の、成長抑制作用を保持するが、その他の好ましくない原サイズの突然変異体の生物学的作用を欠くものがよい。またこれらペプチドは薬物動態学的により好ましい特性を持つこともできる。
付加されたアミノ酸がこの合成物をして脊椎動物の成長速度を縮減不能にしないのであれば、本発明の成長抑制ペプチドはbGHより大きくてもよい。
本願の成長抑制ペプチドの作用メカニズムは明確でないが、これらペプチドはターゲットの動物に内在産生される野生型成長ホルモンに対するアンタゴニストとして機能するものであることに間違いない。例えばbGH（G119R）とbGH（G119R,E117L,A122D）は双方が肝臓の薄膜調製に対し野生型bGHの結合を競合的に抑制することを我々は示している。したがってこの合成物は成長を抑制する終局的な結果を持つと考えられる。というのはその成長促進作用は野生型成長ホルモンの成長促進作用より実質的に小さいが（そしておそらくは無視できる程であるが）、成長ホルモン受容体の部位から内在性の原成長ホルモン（その成長刺激効果は、そうでなければもっと顕著であったろう）を取り除く[displace]ことができるからである。しかし出願人はこうした理論に拘束されるものではない。好ましくは本発明の合成物は、下記のようにラジオラベルした野生型bGHを肝臓メンブレンでの調製から取り除くという当該合成物の能力を分析した場合に野生型bGHのED50の約10倍よりも小さいED50を持つものがよい。より好ましくはこれら合成物は野生型bGHのED50に少なくとも匹敵するED50を持つ。最適には、これら合成物は、それら合成物を受ける動物に自然な成長ホルモンがするよりも高い親和性を成長ホルモン受容体に対して持つのがよい。ヒト成長ホルモン受容体の純化および特性化についてはLeungら、Nature,330:537-43（1987）参照。
好ましい成長抑制ペプチドは第三α-ヘリックスの表面形図[surface topography]を多少修正することによって特性づけることができる。野生型ウシ成長ホルモンの第三α-ヘリックス中には、アラニン-122で始まり、グリシン-119で深まり，アスパラギン酸-115で終わる表面上の１つの裂け目ないし凹部があることが図３に示されている。これまで調製した全ての突然変異体は、野生型成長促進作用を保持するものも、あるいは保持しないものも共に、成長促進作用がこの裂け目ないし凹部の存在を要求するものであって、もしそれをよりかさの大きい側鎖を伴うアミノ酸で置き換えて「ふさいで」しまえば、そのミューテインは目的物の成長を抑制することになる、という理論にも合致するものである。
α-ヘリックスを実質的に不安定化する突然変異は、成長に関係する作用全体に損失をもたらすおそれがあるから好ましくない。我々はα-ヘリックスを阻害すると期待できた一部の突然変異につき、そのような損失を観察している。
α-ヘリックス形成剤と破壊剤に関し考えてみるために、上記のChou,Fasmanを参照せよ。Glu,AlaおよびLeuは好ましいα-ヘリックス形成剤であるが、ProとGlyはα-ヘリックスの強力な破壊剤である。α-ヘリックスの強力な破壊剤を導入する置き換えは好ましくないが、ヘリックスの終わりのような特殊な場合には許容できるだろう。本発明物質の類似体の二次構造は、Garnierら、J.Biol.Chem.,120:97-120（1978）のアルゴリズムを使う「Micro Genie」コンピュータプログラムを用いて予測されている。
アミノ酸119に関しては、グリシンは最小のアミノ酸残基であると共にα-ヘリックス形成にとって最も好ましくないものである。したがってこれ以外のものならどんなアミノ酸でもα-ヘリックスを不安定化することなく該アミノ酸を置き換えることができるし、同時に上記の裂け目をふさぐことができると考えられる。G119Aが「小動物」表現型を付与すること、特に他の突然変異と関係し合って付与することは考えられ得る所であるが、このような突然変異はこの場合には本発明の範囲内のものである。しかしアラニンはその他のアミノ酸と比較すれば好ましくないものである。というのはそれは２番目に小さいアミノ酸であるし、アラニンは122の位置で原アミノ酸であるからである。より好ましくは、新しいアミノ酸はアラニンより大きいものがよい。
位置122に関しては、突然変異がα-ヘリックスを破壊しないことを条件に、アラニンをグリシン（これは既述の通り欠点がある）以外のどんなアミノ酸にでも変更することができる。プロリンも好ましくない。というのは突然変異K114P,E118P,およびL121Pはα-ヘリックスを破壊すると考えられるからである。チロシンはプロリンより高いα-ヘリックス性向を持つが、野生型アラニンよりは低いα-ヘリックス性向である。しかし位置122のアラニンは両側を強力なα-ヘリックス形成剤であるロイシンで囲まれているので、チロシンあるいはプロリンですら、置き換えることが許容できると考えられる。
位置115の修飾が我々の「裂け目」理論から示唆される。位置115のアスパラギン酸は、α-ヘリックスを破壊しない嵩の大きいアミノ酸で置き換えることができる。好ましくはこの置き換えアミノ酸はグルタミン酸よりも大きいのがよい。アミノ酸のヒスチジン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、リシン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンは実質的にグルタミン酸よりも大きい。これらのうちヒスチジン、メチオニン、ロイシン、およびトリプトファンがより好ましい。というのはこれらは嵩が大きいという利点があると同時にかなり強力なα-ヘリックス性向も持っているからである。しかし野生型グルタミン酸は全アミノ酸中で最も強力なα-ヘリックス形成剤であることに留意されたい。
位置119、122、および115のアミノ酸は独立または結合して変えることができる。置き換えがα-ヘリックスを破壊しない限り、α-ヘリックス中の別のアミノ酸を変えることも可能である。好ましくはこのような変更は同じくらいの大きさと極性を持つものと置き換えるのがよい。配列のα-ヘリックス性向を向上させるために、主要な突然変異部位の119、122及び/又は115を囲むアミノ酸を変更することが有利であろう。特にもし119、122及び/又は115での突然変異がそのヘリックスを不安定化することを期待できるならそうである。
本発明は、所望のbGHアンタゴニストを産生する方法に限定されるものではない。好ましくは、これらアンタゴニストは部位特異的な突然変異生成[mutagenesis]により原第三α-ヘリックスのbGHをコードする遺伝子をまづ変え、次いでその変更した遺伝子を適切な宿主中にクローニングして、発現させることによって産生される。この遺伝子はゲノム由来のものでも、あるいはbGHメッセンジャRNAから調製したcDNAでもよく、あるいは合成体、あるいはそれらの組合せでもよい。bGHのアミノ酸配列につき、またbGH遺伝子のcDNA配列については、Millerら、J.Biol.Chem.,255:7521-24（1980）を参照。ゲノム配列についてはWoychickら、Nucleic Acids Res.,10:7197-7210（1982）参照。
宿主は、細菌、酵母、あるいは哺乳類細胞など都合のつく有機体ならどんなものでもよい。遺伝子はその宿主にファンクショナルなプロモータに操作可能にリンクされる。構造プロモータ[constitutive promoter]は総体的に、つまり多くの組織や常時的生育を通じて、遺伝子の発現を活性にする。一方、調節プロモータは一つの組織や細胞で特異的に、また生育の特定段階で、あるいは環境の変化に応じて活性化される。構造プロモータは通常、より多くの遺伝子生成物（通常はタンパク質）が要求されるとき、あるいは遺伝子生成物がたくさんの細胞や組織で要求されるときに使われる。調節プロモータは一つの遺伝子生成物が特定組織中の少数の細胞に要求されるとき、あるいは生育の所定段階で要求されるとき使われる。
その発現系は、そのアンタゴニストが培養基中に分泌されるように、あるいはその宿主細胞が高い細胞密度にまで成長して上記合成物を放出するように溶解することにより製造することができるであろう。
bGH（G119R）その他の突然変異体の精製に適する方法はLeungら、Endocrinology,119:1489-1496（1986）に記載されている。その工程は（a）硫酸アンモニウム沈殿、（b）DEAEセルロースによる分別（又はその他の同様なイオン交換カラム）、そして（c）ゲル濾過（例えばSephadex（商標）G-25及び／又はSephacryl S-200カラム）により精製するものである。成長ホルモン関連合成物の精製に適用可能な工程で上記以外のものについてはReichert,Jr.,「Purification of Anterior Pituitary Hormons:Bovine,Rat and Rabbit」Meth.Enzymol.,37:360 et seq.（Academic Press,N>Y>:1975）参照。問題のタンパク質を特異的に認識する多クローン性抗体または単クローン性抗体もこの精製工程中で使用することができる。
精製したアンタゴニストは適当な非毒性の賦形剤で固めて、例えば過成長率に特徴づけられる状態を処理するためなどの目的で、動物や人間に投与する。動物に投与する場合は、農家が簡単に使えるように薬物と飼料を適当に配合して飼料中に当該薬物を入れ込み予め作っておくのが好ましいだろう。薬効ある投与量ならびに処方は従来法により決定する。つまり実験動物に少量投与することから始めて薬効をモニターしながら徐々に投与量を増加してゆき、また系統的に投与法を変更してゆくなどである。試験的な投与は成長ホルモンおよびソマトスタチン（成長ホルモン放出インヒビター）の投与に関する臨床文献に配慮して選択する。
もう一つの実施例では、トランスジェニック動物の遺伝子的形質転換細胞へと成長した宿主細胞中にその遺伝子を導入している。成長ホルモンアンタゴニスト遺伝子を有する直線形にされたDNAを、配偶子、受精卵の前核、細胞質、２細胞胚の核、胚盤胞、あるいは胞胚腔、中に微量注射するのもよい（これらターゲットのいくつかは微量注射せずにエレクトロポーレーション[electroporation]することで得ることもできる）。あるいは、この遺伝子含有のレトロウイルスを構築して、着床前の胚、またはこのような胚と一緒になった組織培養細胞（例えば胚幹細胞）に影響させるため使用してもよい。いずれにせよ遺伝子的に修飾した接合体は、簡単なin vitro培養後にフォスターマザー[foster mother]中に植え付けられ分娩される。出産後の「遺伝子治療」についてはClineら、Nature,284:422-425（1980）;Williamson,Nature,298:416-18（1982）参照。また、遺伝子は宿主中で機能的なプロモータにリンクされてもよい。好ましくは奇形の胚ができたり胎児ができたりすることがないよう発現を制御することが望まれる。
本発明については以下の実施例でさらに記載する。
実施例１：縮減成長表現型を示す突然変異体の製造
材料および方法
プラスミド、pBGH-10Δ6、はpBGH-10から作られるが、これはbGHの完全なコード領域とイントロンAをもつ。ウシ成長ホルモンのイントロンB,CおよびDは不在である（図１）。このプラスミドは「野生型」bGHをコードし、その発現はマウスのメタロチオネインＩ転写規制配列の1700塩基対セグメントによって制御される。
プラスミドpBGH-10Δ6-G119R pBGH-10Δ6-E117L,G119R,A122DはpBGH-10Δ6から作られたもので、TthIV部位（エクソンIVの３'末端近傍にある）とXmaＩ部位（エクソンＶの５'末端近傍にある）との間のDNAを置き換える相補的オリゴヌクレオチドを用いてセグメント指向の突然変異生成により作り出される。ここに記載のこれ以外の突然変異も同様に作られる。
pBGH-10Δ6-G119Rのために使われる相補的オリゴヌクレオチドは次の通り。
pBGH-10Δ6-E117L、G119R,A122Dのために使われる相補的オリゴヌクレオチドは次の通り。
これらのオリゴヌクレオチドは次のように雑種形成される
これらのオリゴヌクレオチドはpBGH-10Δ6-G119R中の119位置でグリシンをアルギニンに交換するDNAの変更をコードする。そしてpBGH-10Δ6-E117L、G119R,A122Dにおいて、117位置でグルタミン酸をロイシンに、119位置でグリシンをアルギニンに、位置122でアラニンをアスパラギン酸に交換するDNAの変更をコードする。これらのアミノ酸は親水性（アルギニン、アスパラギン酸）または疎水性（ロイシン）（Hopp&Woods,PNAS（USA）、78:3824-28（1981）参照）、あるいは正（アルギニン）または負（アスパラギン酸）に荷電した側鎖（Kaiser&Kezdy,Science acid 223:249-55（1984）参照）、高いα-ヘリックス形成能（Chou&Fasman,Ann.Rev.Biochem.,47:251-76（1978）参照）、理想的な両親媒性α-ヘリックス生成を促進する（Margalitら、J.Immunol.,138:2213-29（1987）；Bremsら、Biochemistry 26:7774-78（1987）;上記のKaiser&Kezdy;Chenら、PNAS（USA）、87:5061-65（1990年7月）参照）ので選ばれたのである。さらにこれらのオリゴヌクレオチドデュプレックス[origonucleotide duplexes]はスクリーニング工程を簡素化する特殊なBamHI制限部位を作るように設計されたサイレント塩基対を変更するようコードする。これらのオリゴヌクレオチドはアニーリングされ通常の工程でTthVIとXmaＩ部位間にサブクローンされる（Maniatisら、Molecular Cloning（Cold Spring Harbor:（1982）））。突然変異体プラスミドDNAのものは、スクリーニング工程を簡素化するBamHI制限部位で消化することにより同定された。そのオリゴヌクレオチドはアニーリングされ通常の工程でTthVIとXmaＩ部位間にサブクローンされた（Maniatisら、Molecular Cloning（Cold Spring Harbor:（1982）））。突然変異体プラスミドDNAのものは、BamHIで消化することにより同定された。
突然変異させたウシ成長ホルモンのターゲット領域のヌクレオチド配列は、修飾したT7 DNAポリメラーゼを用いてチェインターミネーター法で決定した（Sequenase,United States Biochemical;Sangerら、PNAS（USA）、74:5463-67（1977））。手作業によるDNA配列決定のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、Dupont Coder #300 DNAシンセサイザーを使って合成し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、受動的溶離、およびエタノール沈殿による濃縮によって精製した。これら２つの突然変異体の配列分析に直接使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは、18量体（５'AAATTTGTCATAGGTCTG ３'）である。要するに２重鎖プラスミドDNAの1-3μgを0.2N NaOHの存在下で変性し、オリゴヌクレオチドプライマーの10-20pmolsを変性した鋳型にアニール（６５℃で２分間、その後３０分間徐冷）した。２段階重合は、dNTPおよびデオキシアデノシン5'-[α-35S]トリオトリホスフェート（＞1000 Ci／mmole,Amersham）の存在下でオリゴヌクレオチド開始の鎖に伸びる修飾T7 DNAポリメラーゼを使用し、次いで、ランダムに鎖伸長を切断した４種の特異的ジデオキシヌクレオシドの混合物[mixies]の各々に等量を移動させることにより行われた。各反応毎にホルムアミドターミネーションバッファーに付加した後、試料は２分間８０℃でインキュベートし、そのDNA配列は10％ポリアクリルアミド／8Ｍ尿素電気泳動およびオートラジオグラフィによって４組の断片を大きさで分留し決定した。
実施例２：培養哺乳類細胞における発現
上記のin vitro遺伝子操作プロトコルを使って２個の突然変異体bGH遺伝子がまづ作られた。１個はグリシン119をアルギニン（G119R）に変換し、１個はグルタミン酸117をロイシンに、グリシン119をアルギニンに、アラニン122をアスパラギン酸（E117L,G119R,A122D）に変換するのである。
野生型bGH DNA（pBGH10Δ）及び上記の突然変異をコードするプラスミドを培養マウスのＬ細胞中に過渡的に導入し、これをbGH発現性につき分析した。「ウエスタンアナリシス」に引き続き、約22,000ダルトンのタンパク質バンドが野生型bGHおよび上記２個の突然変異体遺伝子からのbGHに観察された。
マウスのＬ細胞が10％のカーフ血清と25μg/mlのゲンタマイシン[gentamicin（Gibco）]含有のDMEM（Gibco）中に保持された。この研究では前記トランスフェクション工程を変形したものが行われた（Lopataら、Nucleic Acids Res.,12:5707-5717（1984））。要約すると、プラスミドDNA２μgを0.2mgのDEAE-デキストラン含有の1.0mlのDMEMに加える。この溶液が前以て2.0mlのDMEMで洗浄した35-mm組織培養プレート中の約106の細胞に加えられた。37℃で１時間同細胞をインキュベーションした後、DNA-DEAE-デキストラン溶液を除去し、10％DMSO含有HEPES緩衝生理食塩水2.0mlを用いて室温にて細胞に９０秒間ショックを与えた。その後ショックさせた溶液を除去し、細胞を2.0mlのDMEMで洗浄した。10％のNu-Serum（Collaborative Research）と50μg/mlのゲンタマイシン含有の培地が毎日取り替えられた。培養液はマイナス２０℃で貯蔵した。bGH結合分析のためトランスフェクションした細胞をDMEMマイナス血清中で１６時間インキュベーションした後、培養液を除去しマイナス２０℃で冷凍した。
分泌bGHのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）PAGE分析についてはKopchickら、DNA,4:23-31（1985）;Kelderら、Gene,76:75-80（1989）に記載されている。この研究ではウエスタン分析に多クローン性anti-bGH血清を使用した。
実施例３：成長ホルモン受容体結合部位
血清を欠いている培養液をpBGH-10Δ6（野生型bGH）でトランスフェクションした細胞および突然変異体bGH遺伝子から採集した。該培養基の凍結乾燥およびbGH濃度決定をした後、前記したようにして競合的メンブレン結合の研究を行った（Smith&Talamants,J.Biol.Chem.,262:2213-19（1987））。雄雌いずれもの60〜120日齢のC57BL/6JxSJLハイブリッドマウスから得た肝臓メンブレン標本を0.3Mのスクロース、10mMのEDTA,50mMのHEPES,0.1mMのTPCKおよび1mMのPMSFの４volumes（w/v）中にpH8.0でBrinkman Polytronとホモジナイズした。上記工程および次に述べるプロトコル全部が４℃で行われた。ホモジネートを20,000xgで30分間遠心機にかけ、表面の浮遊物を100,000xgで1時間遠心機にかけた。そのペレットを10mM HEPES、pH8.0で一度洗浄し、再度遠心機にかけた。これらのペレットを再度10mM HEPES、pH8.0で懸濁し、約50mg/mlのタンパク質濃度にした。メンブレンを分別し、ドライアイス上で凍結し、マイナス２０℃で貯蔵した。メンブレンのタンパク質濃度はLowryのタンパク質分析（Lowryら、J.Biol.Chem.,193:265-275（1951））で決定した。
競合結合分析を次のプロトコルを用いて行った。３mgsタンパク質に相当するミクロソームのメンブレンを0.3ml分析緩衝液（20mM HEPES,10mM CaCl2 0.1％BSAおよび0.05％NaN3 pH8.0）からの30,000cpm/tube 125I bGH（Cambridge Medical Diagnostics）と無ラベルのbGHとでインキュベートした。全て分析は３度行った。室温で一晩インキュベーション後、１mlの氷のように冷たい分析緩衝液を添加し、その後20分間10,000xgで遠心機にかけることでメンブレン結合ホルモンをフリーなホルモンから分離した。次にメンブレンペレットを放射能[radioactivity]につき分析した。特異的に結合した放射能は、5μgの無ラベルのbGH（Smith and Talamants,1987）を有するメンブレンをインキュベートすることによって得た値から引き算することによって決定した。
メンブレン標本から125I-bGHの50％置換（ED50）をもたらした効果的な服用量が決定された。pBGH-10Δ6-G117RおよびpBGH10Δ6-E117L,G119R,A122Dによりコードされた突然変異体bGHは、野生型bGHと同等（トリプル突然変異体）あるいはより高い（G119R）ED50値を示した。
実施例４：トランスジェニックマウスの生成
野生型bGH遺伝子および突然変異体bGH遺伝子含有のトランスジェニックマウス群を一般的な微量注射法技術（McGraneら、1988）で生成した。マウスの尾、ドット ブロット[dot blots]および血清測定からDNA抽出[DNA extraction]することについては記述されている（McGraneら、1988）。
こうした遺伝子は、トランスジェニックマウスの肝臓組織その他の組織中で作用するマウスメタロチオネインＩプロモーターの転写制御配列を有する（Palmiter et al.,Nature,300:611-615（1982））。微量注射法で作られた子は、スロットブロットハイブリダイザーション[slot blot hybridization]分析によってbGH DNAにつき分析した。pBGH-10Δ6、（野生型）、pBGH-10Δ6-G119RおよびpBGH10Δ6-E117L,G119R,A122Dから出た組換えbGH DNA配列のおよそ１コピーを有するマウスラインが作り出された。トランスジェニック動物の血清をウエスタン技術によりbGHレベルにつき分析した。血清中に野生型bGHの転移遺伝子[transgene]を発現するマウスは全て、それ相応の促進された成長率を有していた。血清中に突然変異体bGH（G119R，またはE117L,G119R,A122D）を発現するマウスは劇的に、また有意的に小さかった。野生型bGHトランスジェニックマウスの対照リターメーツ[littermates]に対しての成長率は1.5であったが、対照リターメーツに対する２匹のbGH突然変異体マウスの成長率は約0.6であった。トリプル突然変異体の場合は、突然変異bGH遺伝子を発現する10匹のファウンダーマウスを作った。トランスジェニックリターメーツと非トランスジェニックリターメーツ間の成長率は0.58から1.00であった。成長抑制の度合は突然変異されたbGHの血清レベルに直接関係していた。この特徴を子に伝える３匹のファウンダーを育成したが、その子の約５０％はその遺伝子をもち、それ相応の小型表現型を有する。
野生型bGHと比較したときマウスの肝臓メンブレンへのbGH-M8（トリプル突然変異体）の結合親和性に変化は見られなかったから、bGHが明白な成長促進性および受容体結合性ドメインをもっていると考えられる。第三α-ヘリックスと共にあるbGH（bGH-M8）中の３つの代替突然変異体が、１個もしくは２個以上の臨界アミノ酸を変えたか、あるいはこの潜在的成長促進性ドメインの局所的コンフォーメーションを変えたかして、そのためbGH成長促進作用が減少させられたものと思われる。GH遺伝子ファミリーとその他の遺伝子ファミリーのメンバーからの生成物とのアミノ酸配列を比較することによって、Glu-117,Gly-119およびAla-122がGH遺伝子ファミリーの生成物中に相対的に保存されているが示されている（上記Watahiki,et al.,（1989））。
Ala-122はニワトリその他非霊長類の哺乳類のGHにのみ保存されているのに対し、Glu-117は哺乳類のGHにのみ保存されている。Gly-119はプロラクチン、胎盤性ラクトゲンなどのGH遺伝子ファミリーの全メンバーの生成物中に保存されている。したがってこれらアミノ酸はGHの生物学的作用にとって重要なものであろう。
GHの種々の活動はインシュリン様成長因子（IGF）として知られるペプチドのファミリー、特にGHがその受容体へ結合した後、主として肝臓中に生成されると考えられているIGF-Iを介して行われていることが分かっている。（Truesch,et al.,Ann.Rev.Physiol.,47:443-67（1985）;Zapt,et al.,harm.Res.,24:121-130（1986））IGF-Iは古典的な負のフィードバック機構により下垂体におけるGH生成を減少させることが示されている。（Leung,et al.,Endocrinology,119:1489-96（1986））。pBGH10Δ6-M8トランスジェニックマウスにはなぜ成長抑制が生ずるのかを説明する一つの仮説は、bGH-M8がマウスGH（mGH）に対するin vivoアンタゴニストとして作用し、したがってマウスIGF-Iの生成を抑制するのだというものである。もしこの仮説が正しいとすると、bGH M8トランスジェニックマウス中で血清マウスIGF-Iレベルでの減少だけでなく、下垂体におけるmGH生成の増加をも期待できることになる。bGH-M8トランスジェニックマウス、bGHトランスジェニックマウス、これらの非トランスジェニックリターメーツから取った全脳下垂体のイムノブロット分析の予備結果は、これら成長抑制マウスの脳下垂体が、対照の非トランスジェニックリターメーツに比較しより高いレベルのmGHを有していることを示唆している。逆にbGHトランスジェニックマウスのmGHレベルは、大きく抑制された。これはbGHトランスジェニックマウスの血清中のマウスIGF-Iレベルが、対照の非トランスジェニックリターメーツの血清中のレベルの２倍も増加していたからである。Palmiter,et al.,Science,222:809-14（1983）もし我々の仮説が正しいなら、我々の知る限り初めてのin vivo成長ホルモンアンタゴニストであり、GHの成長促進性作用と受容体結合性作用との連結を分離させた初めての例である。
実施例５：bGHのその他のミューテインのスクリーニング
類似の工程を経て第三α-ヘリックスに変化のあるbGHのミューテインを調整し、L細胞中での分泌状態をテストした。選択的ケースの場合はトランスジェニックマウスの成長に及ぼす影響についてもテストした。その結果は次の通り。
突然変異体は、もとのアミノ酸、ならびにbGHのアミノ酸配列中のその位置、および交換アミノ酸を、アミノ酸につき国際的に認められた一文字表記で示すことによって記載している。Georgeら、Protein Seq.Data Anal.,1-27-39（1987）
突然変異体K112L,K114Wはヘリックスの疎水面を拡張する効果を示す。この突然変異体は野生型成長ホルモンがするのと同様に動物の成長に大きく影響する。
突然変異体K114P,E118PおよびL121P（およびこれらの種々の組合せ）は明らかにα-ヘリックスを破壊する（プロリンは強力なα-ヘリックス破壊剤である）。成長に関連する生物学的活性は廃棄されている。突然変異体E126Gは特例である。つまりグリシンはヘリックス破壊剤だが、位置126はそのヘリックスの末端にあるので、通常の生物学的活動は保持される。G119Pについても同様である。強力なヘリックス破壊剤１個がそれよりも強力な破壊剤で置換されている。
野生型成長ホルモンの第三α-ヘリックスは３カ所で完全両親媒性α-ヘリックスから分岐している。第一に117位置でGluは疎水面において親水性アミノ酸である。第二に119位置でGlyは親水面で中性アミノ酸である。第三に122位置でAlaは親水面で疎水性アミノ酸である。突然変異体E117L,G119R,A122Dは単独であるいは組合わさってヘリックスの両親媒性を増強させる。またG119Rは配列のα-ヘリックス傾向を強化している。
我々の当初の仮説では、突然変異体G119RおよびE117L/G119R/A122Dの成長抑制作用は、増強された第三α-ヘリックスの両親媒性に関連する筈のものだった。しかしその後、第三α-ヘリックスの両親媒性はその作用には大半無関係であるという証拠を示すことになった。
（1）野生型bGHのような、単一E117Lは大動物を産生する。
（2）プロリンはグリシンのように親水性ではあるが、突然変異体G119Pは、小動物表現型を産生する。
（3）ロイシンは疎水性であり、したがってヘリックスの親水面を阻害するが、突然変異体G119Lは小動物表現型を産生する。
（4）突然変異体E111L/G119W/R125Lは、それら３つとも全てヘリックスの親水面を阻害するのであるが、小動物表現型を産生する。
このように１実施例では本発明は、成長抑制作用をもたらす第三α-ヘリックスの突然変異に関するが、そのヘリックスの両親媒性を減少させたり変化させたりしないものである。
要するに、残基119および122は成長性反応にとって重要なものであるが、これら残基の変更は受容体結合に影響しないということである。残基114、118および121にヘリックス破壊剤を挿入してヘリックスを破壊すると、成長に影響する作用および、培養マウス細胞における分泌作用の双方が阻止された。残基112、114、117および121は成長性反応にとって重要でない、少なくともヘリックスが破壊されない限り重要でないと思われる。
付加的な成長ホルモンアンタゴニストは、bGH中のG119に対応するコドンを系統的に変化させることによって同定することができるであろうし、その位置におけるアミノ酸１個を変更させた他の１８個の突然変異体を発現するようにすることもできよう。これは所望の変更アミノ酸をコードするようにコドン119で実施例１に述べたものとは別のオリゴヌクレオチドを合成することによって容易に達成することができる。また同様にしてbGHのアミノ酸115および122に対応するコドンのバリエーション、あるいはさらに異なるアミノ酸も研究することができる。
以下の表は、候補として挙げることができる突然変異体を同定するのに助けとなろう。
αヘリックス度についてはSchulzとSchirmerのPrinciplesof Protein Structure,表６−１（1979）参照。アミノ酸の量についてはCreightonのProteins:Structures and Molecular Proteins、表１−１（1983）参照。Creightonの表１−２もアミノ酸の詳細な結合構造について参考になる。上記表中の注の“sm”とは「小動物」のこと、“big”とは「大動物」のこと、“null”とは「成長に影響なし」のことである。
本発明は成長ホルモンに関する。より詳細には、ウシの成長ホルモンで動物の成長を抑制するミューテイン[muteins]に関する。こうしたアンタゴニストは「縮減成長」[reduced growth]表現型を得るように遺伝子導入された（トランスジェニック）動物に発現されることがある。
情報の開示
ウシの成長ホルモン（GH）は、下垂体前葉中で普通に産生される191個のアミノ酸からなるタンパク質である。成熟タンパク質の分子量は約22,000ダルトンだが、アミノ末端に26個の余分なアミノ酸がある前段階の成長ホルモン[pre-growth hormon]として最初は作られる。このリーダー（つまりシグナルペプチド）はウシの下垂体細胞によるホルモン分泌中に通常分割される。いくつかの型の成熟タンパク質が天然裡に発見されている。Ｎ末端は（分泌中での分割部位のバリエーションによって）変化することができ、成熟タンパク質はNH2-Ala-Phe-ProまたはNH2-Phe-Proのいずれかで始まる。さらに、126番目のアミノ酸は、ウシ集団中の対立遺伝子のバリエーションの結果、明らかにロイシンまたはバリンのいずれかであろう。
bGH（ウシ成長ホルモン）を牛へ外部から投与したときは、牛乳の生産量、飼料効率、生育速度、および脂肪依存度を向上させ、贅肉期間を短縮する。
bGHはDNA組換え技術によって産生されている。例えば米国特許第4,443,539号（イースト）、Buellの欧州特許出願第103,395号（細菌）、Krivlの欧州特許出願第193,515号（細菌）、Kopchickの欧州特許出願第161,640号（動物に移植されたカプセル内包のマウス細胞）、DeBoerの欧州特許出願第75,444号（細菌、有害二次構造を除去するために修飾した遺伝子）参照。bGHは部位特異的突然変異の生成[mutagenesis]によってbGH類似体の産生を行っている。こうして英国特許第2,073,245号のAvivは、E.coliでのMet Pro（des Ala）bGH、Arg（des Ala）bGH、Met-Glu-Gly（des Ala）bGH、およびdes（Ala1-Phe2-Pro3-Ala4）bGHの生成について記載している。BremsらのPNAS（米国）85:3367-71（1988）は、bGHの第三α-ヘリックスの疎水面に伸びるbGH突然変異体K112Lの調製について報告している。この突然変異体の96-133の断片も調製されている。bGHのタンパク質断片の生物学的作用についても研究されている。Bremsらの生化学26:7774（1987）、Swislockiらの内分泌学87:900（1970）、PaladiniらのTIBS 256（1979年11月）がある。アミノ酸96-133を含むbGHの断片はbGH1-95やbGH151-191に比較し成長促進作用において優れている。Haraらの生化学17:550（1978）、Sonenbergの米国特許第3,664,925号および第4,056,520号、ChenおよびSonenbergのJ.Biol.Chem.250:2510-14（1977）参照。
類似の結果が断片bGH（96-133）につき観察されている。GrafらのEur.J.Biochem.64:333-340（1976）、HaraらのBiochem.17:550-56（1978）参照。ペプチド断片の分析から得られた知識は、分子元来の構造が劇的に崩壊され得ることから不確実な価値しかない。
bGH類似体には、ほかの成長ホルモンの公知の類似体と同様、成長促進作用に差がある。しかし成長抑制作用を有する成長ホルモン類似体はまだこれまでに報告されていない。
何種類ものトランスジェニック動物が作られてきている。HammerらのNature 315:680-683（1985）（うさぎ、羊および豚）参照。これら動物のあるものは成長ホルモンを発現するようにさせたもので、こうしたトランスジェニック動物の増進された成長について報告されている。Palmiterらは、Nature 300:611（1982）で、マウスの受精卵の雄性前核にラットの成長ホルモンの構造遺伝子に融合させたマウスのメタロチオネイン-I遺伝子のプロモータを含有するDNA断片を微量注射している。遺伝子的に修飾された接合体から発展した遺伝子操作マウスの何匹かは、対照マウスの成長率より実質的に高い成長率を示した。（事実上、遺伝子的に修飾されたマウスは動物成長に対するホルモン効果を決定するテスト環境として機能する）Later,PalmiterらはSience 222:809（1983）で、発現性のヒト成長ホルモン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスに同様な成長促進があり得ることを示した。同様な効果は、ヒト成長ホルモン放出因子がトランスジェニックマウスに発現されるときにも見られる。Hammerら、Nature、315:413（1985）参照。
ウシ成長ホルモンはまたトランスジェニック動物にも発現されている。McGraneら、J.Biol.Chem.,263:11443-51（1988）、Kopchickら、Brazil.J.Genetics,12:37-54（1989）
しかしながら、縮減成長[reduced growth]表現型を示す外来性の遺伝子を特徴とするトランスジェニック動物は、これまで知られていない。
研究者らは、タンパク質の二次構造をその一次アミノ酸配列から予測しようとしている。Chou,Fasman、Biochemistry,13:222（1974）ポリペプチドの二次構造はポリペプチド鎖の直線部分の規則的な並び方である。最も普通に見られる二次構造は、βシートとα-ヘリックスである。ヘリックスは、エレメントあたりの起伏[rise]ｄ、ターンあたりのエレメント数ｎ、およびヘリックス軸からの各エレメント（例えばＣα原子）のマーカーポイントへの距離ｒで表すことができる。ポリペプチド中のα-ヘリックスのこれらパラメータの平均値は次の通りである。
ｎ，３.６残基／ターン
ｄ，１.５Å／残基
ｒ，２.３Å
Schulz,Schimer,Principles of Protein Structure 69（Springer-Verlag:1979）参照。α-ヘリックスは、ヘリックスの１回転により分けられるペプチドアミド残基とカルボニル基の残基とを水素結合して安定にされている。
二次構造の予測は、既知の三次元構造のタンパク質中のβシート、α-ヘリックス等中のアミノ酸の発生頻度に関する観察に基づき行われる。
発明の概要
本発明は、脊椎動物成長ホルモンに実質的に相同であるが成長抑制作用を有するタンパク質に関する。
bGH中のGly119のArg（“G119R”）、Pro（“G119P”）、Lys（“G119K”）、Trp（“G119W”）、およびLeu（“G119L”）への突然変異、およびAla122のAsp（“A122D”）への突然変異が、脊椎動物、特に哺乳類において成長抑制作用をもつミューテイン（突然変異体タンパク質またはそのペプチド断片）に起因することを発見した。この新規なホルモンは、成長抑制が望まれるときに哺乳類（およびその他の脊椎動物）、特にウシに投与することができる。本発明の１実施例では、このホルモンは外部で産生して目的物に投与する。ホルモンの大きさに鑑みて、それをコードする遺伝子を適切な宿主中に発現させることで産生するのが好ましい。このような遺伝子は、bGH遺伝子の部位特異性突然変異体の生成[mutagenesis]によって容易に調製することができる。もっともこのようなホルモンは、原生のbGH断片を変性アミノ酸担持の合成ペプチドと縮合するなど上記以外の技術で産生することもできる。
本発明の第２実施例では、この遺伝子を公知技術により哺乳類の胎児[a prenatal form]に導入するもので、この胎児は縮減成長表現型を発現するトランスジェニック哺乳類に生育されている。思うに哺乳類は、出生後に遺伝子的に修飾すること、即ち「遺伝子治療」をし得るようである。
このように成長抑制動物は、本発明の成長抑制ホルモンを薬学的方法で投与することにより、あるいは動物の出生前の生命体（胎児）または出生後の生命体に遺伝子的な形質転換を施すことによって産生することができる。
このホルモン、またはそれをコードする遺伝子は、狭い居住空間でのペット愛好者のためのペット、あるいは小土地所有農家にとっての家畜のように、空間的に制限がある研究施設で使用される小動物の産生にとって有益である。このホルモンはヒト巨人症の処方、および巨人症および小人症に関する研究にも有益である。
この研究において我々は、マウスのＬ細胞のタンパク質分泌能力と、トランスジェニック動物の成長率に（肯定的または否定的な）影響力をもつタンパク質と、の間に相互関係があることを発見した。成長をモジュレートするタンパク質を同定するためのＬ細胞分泌アッセイの使用も本発明の一部をなす。
本願における請求の範囲に記載の事項は、好ましい実施例に関する詳細な説明としてここに組み込むものとする。またここに言及された全ての特許および発表物は関係する限り、それらへの言及によりここに組み込むものとする。
【図面の簡単な説明】
図１は、bGH（G119R）のアミノ酸配列、およびその類似体をコードする遺伝子のヌクレオチド配列である。α-ヘリックスは印をつけられ、そのアミノ酸には数字が付されている。数字１は成熟タンパク質の第１番目のアミノ酸である。太字の塩基とアミノ酸は、G119R突然変異体中で突然変異生成されたものである。
図２はオリゴヌクレオチド方向性の突然変異生成の一般的ストラテジーである。pBGH10Δ6が親ベクターとして使用されている。これは５つのエキソン（四角のＩ−Ｖ）とイントロンＡとを包含するbGH遺伝子（BamHＩはBgIIIと結合）に融合されるマウスのメタロチオネインＩ転写規制配列（MT-1）を有する。この融合遺伝子はEcoRI位置でpBR322中に組み込まれた。pBR322由来の複製（ORI）、アンピシリン抵抗遺伝子（Amp）、bGH翻訳の開始コドン（ATG）および終止コドン（TAG）も示されている。５'と３'の非翻訳領域はハッチングで示されている。制限部位TthIVとXmaＩと間のヌクレオチド配列が示されている。代替突然変異が示されている。特殊なBamHI部位を作り出した一か所の沈黙状態[one silent situation]は（*）で示されている。変更のターゲットとされた主なアミノ酸残基の位置（115、117、119、122）も示されている。
図３はウシ成長ホルモンの第三α-ヘリックスの大部分の理想的な表面ネット（円柱プロット）を表わしたものである。この表面ネットは、同軸円柱紙片上に突き出すヘリックスの突出部によって作り出されるもので、その紙片をヘリックス軸に平行にカット後、紙片を平らに伸ばすことで作る。アミノ酸量は括弧内に記載されている。点線はAla122-Gly119-Asp115で形成された裂け目ないし凹部を示す。
図４は、ウシ成長ホルモンの（a）野生型、（b）突然変異体G119R、および（c）突然変異体A122Dのアミノ酸108-127の二次構造予測のプロット（α-ヘリックス、βシート、逆ターン、ランダムコイル）である。これらのプロットは「Micro-Genie」プログラムで作ったものである。
図５は受容体結合分析結果である（野生型bGH対突然変異体bGH G119R）。この図は突然変異体bGH（G119R）が、マウス肝臓メンブレンで調製の成長ホルモン受容体に対し野生型bGHよりも大きな親和性をもっていることを示す。
図６はこれら突然変異体の成長抑制効果を示すもので、対照（遺伝子導入されていない（非トランスジェニック））、G119R,G119L,G119K,G119Pの各マウスの成長率の比較である。
図７はbGHの第三α-ヘリックス（109-126）軸の図で、両親媒性的傾向を示す。疎水性アミノ酸部分は点々で埋めて示してある。グリシン部分、中性アミノ酸、は斜線を引いて示してある。残基数および親水性の値（Hopp・Woodのスケール）も示されている。
図８は、突然変異体G119Rのアルギニン-119の側鎖がある面に投影された野生型（左）bGHおよびG119R突然変異体（右）bGHの第三α-ヘリックスの側面図である。裂け目の底が矢印で示されている。
これらの図面は分子モデリングソフトウエアを使って作成した。（QUANTA and CHARMm,Polygene,Waltham,Massachusetts,USA）
好ましい実施例の詳細な説明
ブタ成長ホルモンの三次元構造がＸ線回折により決定され、ほかの動物の成長ホルモンの三次元構造と比較している。Abdel-Meguidら、Proc.Nat.Acad.Sci.84:6434（1987）このように研究されたほかの成長ホルモンと同様、それは逆平行関係にあるヘリックスと結び付いた４ヘリックスとして並べられる単一ドメインのタンパク質である。その４つのヘリックスは残基7-34、75-87、106-127および152-183でできている。
ウシ成長ホルモンは、アミノ酸配列レベルでブタ成長ホルモンと93％相同であり、bGHの構造は２つの配列およびブタ成長ホルモンの構造の研究から推論されている。その４つのα-ヘリックスはアミノ酸4-33、66-80、108-127、および150-179から推定されるものと報告されているが、本発明の目的のためには、bGHの第三α-ヘリックスは、アミノ酸109-126であると定義されている。そのコンフォメーションは、Chou-Fasman方式、前記（10-34、66-87、111-127、186-191）を用いたBiochemistry 16:2110（1977）でのChenとSonenbergが行った予測に合理的に一致している。
種々の脊椎動物種から単離した成長ホルモンのアミノ酸配列が多種類保存されている。ヒラメ成長ホルモンをウシ成長ホルモン等他の成長ホルモンと比較した結果、Watahikiらは、J.Biol.Chem.,264:312（1989）において、５つの保存領域を同定した。Watahikiらの保存領域GD4はウシ成長ホルモンのストレッチLKDLEEGILALMRELED、すなわち残基113-129からなる。Watahikiの図３はGHで保存された残基および成長促進作用の顕現にとり重要であると予測された残基を同定している。
ヒト胎盤性ラクトゲン-（14-191）断片にリンクしたhGH-（1-134）断片を含有する組換え分子は、完全なhGH免疫作用、ならびにウサギ肝臓から単離したGH受容体への結合親和性とを保持することが示された。Russellら、J.Biol.Chem.,256:296-300（1981）相同体走査による突然変異生成技術[homolog-scanning mutagenesis technique]を使って相同ホルモンの遺伝子断片、即ちヒト胎盤性ラクトゲンまたはヒトプロラクチン、がhGH遺伝子中を通して系統的に交換され、こうして種々のキメラホルモンが産生された。Cunninghamら、Sience,243:1330-36（1989）これら突然変異体GHと野生型bGHとのクローニング肝臓hGH受容体との結合親和性を比較した結果、受容体結合に関係するhGHには３つの不連続なポリペプチド決定基があることが結論された。これらはNH2末端、COOH末端、およびアミノ酸残基54と74間のループ内に位置していた。これら推定上の結合ドメインは、アラニン残基がそれらの領域中を通して系統的に代替されるアラニン走査による突然変異生成技術によってさらに分析された。そしてhGHの10、58、64、68、172、174、175および176の位置のアミノ酸残基がGH受容体結合にとって重要なことが明らかにされた。Cunninghamら、Science,244：1081-85（1989）
本発明は配列および二次構造において哺乳類成長ホルモンなどの脊椎動物成長ホルモン、特にウシ成長ホルモンに類似性がある成長抑制合成物（ペプチドまたはタンパク質）に関する。好ましくはこの合成物は、脊椎成長ホルモン、特にウシ成長ホルモンの第三α-ヘリックスと少なくとも約50％のアミノ酸配列における相同性[homology]を有するα-ヘリックスを包含する。原ホルモンのほかのα-ヘリックスは、もしこれが成長抑制作用を阻害することなしに行うことができるなら省いてもよい。
ウシ成長ホルモンの、その他の哺乳類動物成長ホルモンとの総体的相同性[homology]の割合は高い。ブタとは92％、ヒツジとは99％、ヒトと66％、ラットと87％である。第三α-ヘリックス（bGH 109-126に相同なアミノ酸配列）についてみると、相同性の割合は上記総体数的な数値に類似する。つまりブタと94％、ヒツジと94％、ヒトと66％、ラットと94％である。
本発明は、ウシ成長ホルモンの第三α-ヘリックスの突然変異に限定されない。そうではなくすべての哺乳類の成長ホルモン、ならびに哺乳類以外の脊椎動物の成長ホルモンの第三α-ヘリックスの突然変異を包含するもので、Watahiki（1989）中で配列が明らかにされた成長ホルモンをも包含する。即ち、ヒラメ、ブリ、マグロ、サケ、ニワトリ、ラット、ブタ、ヒツジ、ウシ、ならびにヒトの、成長ホルモンである。その他の成長ホルモンの突然変異体の発現は、それら成長ホルモンをコードする遺伝子が入手可能になったとき実施可能である。例えばGoeddel,Nature,281:544-683（1979）（hGH）参照。
ウシ成長ホルモンに実質的に相同なポリペプチドの概念は、（a）ウシ成長ホルモンのアミノ酸115、119、または122に対応するアミノ酸を交換すること、（b）脊椎動物成長ホルモン中に保存されていないウシ成長ホルモンのアミノ酸に対応するアミノ酸を交換、及び/又はアミノ酸1-95、及び/又はアミノ酸134-191をトランケーション（先端切り）[truncation]すること、によってウシ成長ホルモンとは異なる何等かのポリペプチドを含むものであると考えられる。（保存されているアミノ酸はWatahikiら（1979）で同定されている）したがって、ウシ以外の全ての脊椎動物成長ホルモンは、ウシ成長ホルモンに「実質的に相同」である。
上記合成物は、もしその合成物で処理された少なくとも一種の脊椎動物をテスト動物とした場合に（または種がそれを発現するように遺伝子的に操作されている場合に）、その動物の成長が対照動物の成長より有意的に遅いものであるなら（「有意的に」とは統計的な意味で使っている）、成長抑制的であると考えられる。成長ホルモンはかなりな程度、種間に交換しても反応する。GillらBiotechnology,3:643（1985）は組換えニワトリの、およびウシの成長ホルモンが、少年期パシフィックサーモンの成長を促進した、という報告をしている。
成長ホルモンの一定の断片は成長促進作用をもっていることが知られているが、本発明の成長抑制ペプチド（以下、「ペプチド」をタンパク質も含む概念で用いることとする）はbGHほど大きくなくてもよいことが期待される。好ましくはこのペプチドは、少なくとも１１個のアミノ酸長さ（１つのα-ヘリックスの３回転分）、一層好ましくは、少なくとも５０個のアミノ酸長さがあればよい。これらのペプチドは、例えばbGH（G119R）の、成長抑制作用を保持するが、その他の好ましくない原サイズの突然変異体の生物学的作用を欠くものがよい。またこれらペプチドは薬物動態学的により好ましい特性を持つこともできる。
付加されたアミノ酸がこの合成物をして脊椎動物の成長速度を縮減不能にしないのであれば、本発明の成長抑制ペプチドはbGHより大きくてもよい。
本願の成長抑制ペプチドの作用メカニズムは明確でないが、これらペプチドはターゲットの動物に内在産生される野生型成長ホルモンに対するアンタゴニストとして機能するものであることに間違いない。例えばbGH（G119R）とbGH（G119R,E117L,A122D）は双方が肝臓の薄膜調製に対し野生型bGHの結合を競合的に抑制することを我々は示している。したがってこの合成物は成長を抑制する終局的な結果を持つと考えられる。というのはその成長促進作用は野生型成長ホルモンの成長促進作用より実質的に小さいが（そしておそらくは無視できる程であるが）、成長ホルモン受容体の部位から内在性の原成長ホルモン（その成長刺激効果は、そうでなければもっと顕著であったろう）を取り除く[displace]ことができるからである。しかし出願人はこうした理論に拘束されるものではない。好ましくは本発明の合成物は、下記のようにラジオラベルした野生型bGHを肝臓メンブレンでの調製から取り除くという当該合成物の能力を分析した場合に野生型bGHのED50の約10倍よりも小さいED50を持つものがよい。より好ましくはこれら合成物は野生型bGHのED50に少なくとも匹敵するED50を持つ。最適には、これら合成物は、それら合成物を受ける動物に自然な成長ホルモンがするよりも高い親和性を成長ホルモン受容体に対して持つのがよい。ヒト成長ホルモン受容体の純化および特性化についてはLeungら、Nature,330:537-43（1987）参照。
好ましい成長抑制ペプチドは第三α-ヘリックスの表面形図[surface topography]を多少修正することによって特性づけることができる。野生型ウシ成長ホルモンの第三α-ヘリックス中には、アラニン-122で始まり、グリシン-119で深まり，アスパラギン酸-115で終わる表面上の１つの裂け目ないし凹部があることが図３に示されている。これまで調製した全ての突然変異体は、野生型成長促進作用を保持するものも、あるいは保持しないものも共に、成長促進作用がこの裂け目ないし凹部の存在を要求するものであって、もしそれをよりかさの大きい側鎖を伴うアミノ酸で置き換えて「ふさいで」しまえば、そのミューテインは目的物の成長を抑制することになる、という理論にも合致するものである。
α-ヘリックスを実質的に不安定化する突然変異は、成長に関係する作用全体に損失をもたらすおそれがあるから好ましくない。我々はα-ヘリックスを阻害すると期待できた一部の突然変異につき、そのような損失を観察している。
α-ヘリックス形成剤と破壊剤に関し考えてみるために、上記のChou,Fasmanを参照せよ。Glu,AlaおよびLeuは好ましいα-ヘリックス形成剤であるが、ProとGlyはα-ヘリックスの強力な破壊剤である。α-ヘリックスの強力な破壊剤を導入する置き換えは好ましくないが、ヘリックスの終わりのような特殊な場合には許容できるだろう。本発明物質の類似体の二次構造は、Garnierら、J.Biol.Chem.,120:97-120（1978）のアルゴリズムを使う「Micro Genie」コンピュータプログラムを用いて予測されている。
アミノ酸119に関しては、グリシンは最小のアミノ酸残基であると共にα-ヘリックス形成にとって最も好ましくないものである。したがってこれ以外のものならどんなアミノ酸でもα-ヘリックスを不安定化することなく該アミノ酸を置き換えることができるし、同時に上記の裂け目をふさぐことができると考えられる。G119Aが「小動物」表現型を付与すること、特に他の突然変異と関係し合って付与することは考えられ得る所であるが、このような突然変異はこの場合には本発明の範囲内のものである。しかしアラニンはその他のアミノ酸と比較すれば好ましくないものである。というのはそれは２番目に小さいアミノ酸であるし、アラニンは122の位置で原アミノ酸であるからである。より好ましくは、新しいアミノ酸はアラニンより大きいものがよい。
位置122に関しては、突然変異がα-ヘリックスを破壊しないことを条件に、アラニンをグリシン（これは既述の通り欠点がある）以外のどんなアミノ酸にでも変更することができる。プロリンも好ましくない。というのは突然変異K114P,E118P,およびL121Pはα-ヘリックスを破壊すると考えられるからである。チロシンはプロリンより高いα-ヘリックス性向を持つが、野生型アラニンよりは低いα-ヘリックス性向である。しかし位置122のアラニンは両側を強力なα-ヘリックス形成剤であるロイシンで囲まれているので、チロシンあるいはプロリンですら、置き換えることが許容できると考えられる。
位置115の修飾が我々の「裂け目」理論から示唆される。位置115のアスパラギン酸は、α-ヘリックスを破壊しない嵩の大きいアミノ酸で置き換えることができる。好ましくはこの置き換えアミノ酸はグルタミン酸よりも大きいのがよい。アミノ酸のヒスチジン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、リシン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンは実質的にグルタミン酸よりも大きい。これらのうちヒスチジン、メチオニン、ロイシン、およびトリプトファンがより好ましい。というのはこれらは嵩が大きいという利点があると同時にかなり強力なα-ヘリックス性向も持っているからである。しかし野生型グルタミン酸は全アミノ酸中で最も強力なα-ヘリックス形成剤であることに留意されたい。
位置119、122、および115のアミノ酸は独立または結合して変えることができる。置き換えがα-ヘリックスを破壊しない限り、α-ヘリックス中の別のアミノ酸を変えることも可能である。好ましくはこのような変更は同じくらいの大きさと極性を持つものと置き換えるのがよい。配列のα-ヘリックス性向を向上させるために、主要な突然変異部位の119、122及び/又は115を囲むアミノ酸を変更することが有利であろう。特にもし119、122及び/又は115での突然変異がそのヘリックスを不安定化することを期待できるならそうである。
本発明は、所望のbGHアンタゴニストを産生する方法に限定されるものではない。好ましくは、これらアンタゴニストは部位特異的な突然変異生成[mutagenesis]により原第三α-ヘリックスのbGHをコードする遺伝子をまづ変え、次いでその変更した遺伝子を適切な宿主中にクローニングして、発現させることによって産生される。この遺伝子はゲノム由来のものでも、あるいはbGHメッセンジャRNAから調製したcDNAでもよく、あるいは合成体、あるいはそれらの組合せでもよい。bGHのアミノ酸配列につき、またbGH遺伝子のcDNA配列については、Millerら、J.Biol.Chem.,255:7521-24（1980）を参照。ゲノム配列についてはWoychickら、Nucleic Acids Res.,10:7197-7210（1982）参照。
宿主は、細菌、酵母、あるいは哺乳類細胞など都合のつく有機体ならどんなものでもよい。遺伝子はその宿主にファンクショナルなプロモータに操作可能にリンクされる。構造プロモータ[constitutive promoter]は総体的に、つまり多くの組織や常時的生育を通じて、遺伝子の発現を活性にする。一方、調節プロモータは一つの組織や細胞で特異的に、また生育の特定段階で、あるいは環境の変化に応じて活性化される。構造プロモータは通常、より多くの遺伝子生成物（通常はタンパク質）が要求されるとき、あるいは遺伝子生成物がたくさんの細胞や組織で要求されるときに使われる。調節プロモータは一つの遺伝子生成物が特定組織中の少数の細胞に要求されるとき、あるいは生育の所定段階で要求されるとき使われる。
その発現系は、そのアンタゴニストが培養基中に分泌されるように、あるいはその宿主細胞が高い細胞密度にまで成長して上記合成物を放出するように溶解することにより製造することができるであろう。
bGH（G119R）その他の突然変異体の精製に適する方法はLeungら、Endocrinology,119:1489-1496（1986）に記載されている。その工程は（a）硫酸アンモニウム沈殿、（b）DEAEセルロースによる分別（又はその他の同様なイオン交換カラム）、そして（c）ゲル濾過（例えばSephadex（商標）G-25及び／又はSephacryl S-200カラム）により精製するものである。成長ホルモン関連合成物の精製に適用可能な工程で上記以外のものについてはReichert,Jr.,「Purification of Anterior Pituitary Hormons:Bovine,Rat and Rabbit」Meth.Enzymol.,37:360 et seq.（Academic Press,N>Y>:1975）参照。問題のタンパク質を特異的に認識する多クローン性抗体または単クローン性抗体もこの精製工程中で使用することができる。
精製したアンタゴニストは適当な非毒性の賦形剤で固めて、例えば過成長率に特徴づけられる状態を処理するためなどの目的で、動物や人間に投与する。動物に投与する場合は、農家が簡単に使えるように薬物と飼料を適当に配合して飼料中に当該薬物を入れ込み予め作っておくのが好ましいだろう。薬効ある投与量ならびに処方は従来法により決定する。つまり実験動物に少量投与することから始めて薬効をモニターしながら徐々に投与量を増加してゆき、また系統的に投与法を変更してゆくなどである。試験的な投与は成長ホルモンおよびソマトスタチン（成長ホルモン放出インヒビター）の投与に関する臨床文献に配慮して選択する。
もう一つの実施例では、トランスジェニック動物の遺伝子的形質転換細胞へと成長した宿主細胞中にその遺伝子を導入している。成長ホルモンアンタゴニスト遺伝子を有する直線形にされたDNAを、配偶子、受精卵の前核、細胞質、２細胞胚の核、胚盤胞、あるいは胞胚腔、中に微量注射するのもよい（これらターゲットのいくつかは微量注射せずにエレクトロポーレーション[electroporation]することで得ることもできる）。あるいは、この遺伝子含有のレトロウイルスを構築して、着床前の胚、またはこのような胚と一緒になった組織培養細胞（例えば胚幹細胞）に影響させるため使用してもよい。いずれにせよ遺伝子的に修飾した接合体は、簡単なin vitro培養後にフォスターマザー[foster mother]中に植え付けられ分娩される。出産後の「遺伝子治療」についてはClineら、Nature,284:422-425（1980）;Williamson,Nature,298:416-18（1982）参照。また、遺伝子は宿主中で機能的なプロモータにリンクされてもよい。好ましくは奇形の胚ができたり胎児ができたりすることがないよう発現を制御することが望まれる。
本発明については以下の実施例でさらに記載する。
実施例１：縮減成長表現型を示す突然変異体の製造
材料および方法
プラスミド、pBGH-10Δ6、はpBGH-10から作られるが、これはbGHの完全なコード領域とイントロンAをもつ。ウシ成長ホルモンのイントロンB,CおよびDは不在である（図１）。このプラスミドは「野生型」bGHをコードし、その発現はマウスのメタロチオネインＩ転写規制配列の1700塩基対セグメントによって制御される。
プラスミドpBGH-10Δ6-G119R pBGH-10Δ6-E117L,G119R,A122DはpBGH-10Δ6から作られたもので、TthIV部位（エクソンIVの３'末端近傍にある）とXmaＩ部位（エクソンＶの５'末端近傍にある）との間のDNAを置き換える相補的オリゴヌクレオチドを用いてセグメント指向の突然変異生成により作り出される。ここに記載のこれ以外の突然変異も同様に作られる。
pBGH-10Δ6-G119Rのために使われる相補的オリゴヌクレオチドは次の通り。
突然変異させたウシ成長ホルモンのターゲット領域のヌクレオチド配列は、修飾したT7 DNAポリメラーゼを用いてチェインターミネーター法で決定した（Sequenase,United States Biochemical;Sangerら、PNAS（USA）、74:5463-67（1977））。手作業によるDNA配列決定のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、Dupont Coder #300 DNAシンセサイザーを使って合成し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、受動的溶離、およびエタノール沈殿による濃縮によって精製した。これら２つの突然変異体の配列分析に直接使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは、18量体（５'AAATTTGTCATAGGTCTG ３'）である。要するに２重鎖プラスミドDNAの1-3μgを0.2N NaOHの存在下で変性し、オリゴヌクレオチドプライマーの10-20pmolsを変性した鋳型にアニール（６５℃で２分間、その後３０分間徐冷）した。２段階重合は、dNTPおよびデオキシアデノシン5'-[α-35S]トリオトリホスフェート（＞1000 Ci／mmole,Amersham）の存在下でオリゴヌクレオチド開始の鎖に伸びる修飾T7 DNAポリメラーゼを使用し、次いで、ランダムに鎖伸長を切断した４種の特異的ジデオキシヌクレオシドの混合物[mixies]の各々に等量を移動させることにより行われた。各反応毎にホルムアミドターミネーションバッファーに付加した後、試料は２分間８０℃でインキュベートし、そのDNA配列は10％ポリアクリルアミド／8Ｍ尿素電気泳動およびオートラジオグラフィによって４組の断片を大きさで分留し決定した。
実施例２：培養哺乳類細胞における発現
上記のin vitro遺伝子操作プロトコルを使って２個の突然変異体bGH遺伝子がまづ作られた。１個はグリシン119をアルギニン（G119R）に変換し、１個はグルタミン酸117をロイシンに、グリシン119をアルギニンに、アラニン122をアスパラギン酸（E117L,G119R,A122D）に変換するのである。
野生型bGH DNA（pBGH10Δ）及び上記の突然変異をコードするプラスミドを培養マウスのＬ細胞中に過渡的に導入し、これをbGH発現性につき分析した。「ウエスタンアナリシス」に引き続き、約22,000ダルトンのタンパク質バンドが野生型bGHおよび上記２個の突然変異体遺伝子からのbGHに観察された。
マウスのＬ細胞が10％のカーフ血清と25μg/mlのゲンタマイシン[gentamicin（Gibco）]含有のDMEM（Gibco）中に保持された。この研究では前記トランスフェクション工程を変形したものが行われた（Lopataら、Nucleic Acids Res.,12:5707-5717（1984））。要約すると、プラスミドDNA２μgを0.2mgのDEAE-デキストラン含有の1.0mlのDMEMに加える。この溶液が前以て2.0mlのDMEMで洗浄した35-mm組織培養プレート中の約106の細胞に加えられた。37℃で１時間同細胞をインキュベーションした後、DNA-DEAE-デキストラン溶液を除去し、10％DMSO含有HEPES緩衝生理食塩水2.0mlを用いて室温にて細胞に９０秒間ショックを与えた。その後ショックさせた溶液を除去し、細胞を2.0mlのDMEMで洗浄した。10％のNu-Serum（Collaborative Research）と50μg/mlのゲンタマイシン含有の培地が毎日取り替えられた。培養液はマイナス２０℃で貯蔵した。bGH結合分析のためトランスフェクションした細胞をDMEMマイナス血清中で１６時間インキュベーションした後、培養液を除去しマイナス２０℃で冷凍した。
分泌bGHのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）PAGE分析についてはKopchickら、DNA,4:23-31（1985）;Kelderら、Gene,76:75-80（1989）に記載されている。この研究ではウエスタン分析に多クローン性anti-bGH血清を使用した。
実施例３：成長ホルモン受容体結合部位
血清を欠いている培養液をpBGH-10Δ6（野生型bGH）でトランスフェクションした細胞および突然変異体bGH遺伝子から採集した。該培養基の凍結乾燥およびbGH濃度決定をした後、前記したようにして競合的メンブレン結合の研究を行った（Smith&Talamants,J.Biol.Chem.,262:2213-19（1987））。雄雌いずれもの60〜120日齢のC57BL/6JxSJLハイブリッドマウスから得た肝臓メンブレン標本を0.3Mのスクロース、10mMのEDTA,50mMのHEPES,0.1mMのTPCKおよび1mMのPMSFの４volumes（w/v）中にpH8.0でBrinkman Polytronとホモジナイズした。上記工程および次に述べるプロトコル全部が４℃で行われた。ホモジネートを20,000xgで30分間遠心機にかけ、表面の浮遊物を100,000xgで1時間遠心機にかけた。そのペレットを10mM HEPES、pH8.0で一度洗浄し、再度遠心機にかけた。これらのペレットを再度10mM HEPES、pH8.0で懸濁し、約50mg/mlのタンパク質濃度にした。メンブレンを分別し、ドライアイス上で凍結し、マイナス２０℃で貯蔵した。メンブレンのタンパク質濃度はLowryのタンパク質分析（Lowryら、J.Biol.Chem.,193:265-275（1951））で決定した。
競合結合分析を次のプロトコルを用いて行った。３mgsタンパク質に相当するミクロソームのメンブレンを0.3ml分析緩衝液（20mM HEPES,10mM CaCl2 0.1％BSAおよび0.05％NaN3 pH8.0）からの30,000cpm/tube 125I bGH（Cambridge Medical Diagnostics）と無ラベルのbGHとでインキュベートした。全て分析は３度行った。室温で一晩インキュベーション後、１mlの氷のように冷たい分析緩衝液を添加し、その後20分間10,000xgで遠心機にかけることでメンブレン結合ホルモンをフリーなホルモンから分離した。次にメンブレンペレットを放射能[radioactivity]につき分析した。特異的に結合した放射能は、5μgの無ラベルのbGH（Smith and Talamants,1987）を有するメンブレンをインキュベートすることによって得た値から引き算することによって決定した。
メンブレン標本から125I-bGHの50％置換（ED50）をもたらした効果的な服用量が決定された。pBGH-10Δ6-G117RおよびpBGH10Δ6-E117L,G119R,A122Dによりコードされた突然変異体bGHは、野生型bGHと同等（トリプル突然変異体）あるいはより高い（G119R）ED50値を示した。
実施例４：トランスジェニックマウスの生成
野生型bGH遺伝子および突然変異体bGH遺伝子含有のトランスジェニックマウス群を一般的な微量注射法技術（McGraneら、1988）で生成した。マウスの尾、ドット ブロット[dot blots]および血清測定からDNA抽出[DNA extraction]することについては記述されている（McGraneら、1988）。
こうした遺伝子は、トランスジェニックマウスの肝臓組織その他の組織中で作用するマウスメタロチオネインＩプロモーターの転写制御配列を有する（Palmiter et al.,Nature,300:611-615（1982））。微量注射法で作られた子は、スロットブロットハイブリダイザーション[slot blot hybridization]分析によってbGH DNAにつき分析した。pBGH-10Δ6、（野生型）、pBGH-10Δ6-G119RおよびpBGH10Δ6-E117L,G119R,A122Dから出た組換えbGH DNA配列のおよそ１コピーを有するマウスラインが作り出された。トランスジェニック動物の血清をウエスタン技術によりbGHレベルにつき分析した。血清中に野生型bGHの転移遺伝子[transgene]を発現するマウスは全て、それ相応の促進された成長率を有していた。血清中に突然変異体bGH（G119R，またはE117L,G119R,A122D）を発現するマウスは劇的に、また有意的に小さかった。野生型bGHトランスジェニックマウスの対照リターメーツ[littermates]に対しての成長率は1.5であったが、対照リターメーツに対する２匹のbGH突然変異体マウスの成長率は約0.6であった。トリプル突然変異体の場合は、突然変異bGH遺伝子を発現する10匹のファウンダーマウスを作った。トランスジェニックリターメーツと非トランスジェニックリターメーツ間の成長率は0.58から1.00であった。成長抑制の度合は突然変異されたbGHの血清レベルに直接関係していた。この特徴を子に伝える３匹のファウンダーを育成したが、その子の約５０％はその遺伝子をもち、それ相応の小型表現型を有する。
野生型bGHと比較したときマウスの肝臓メンブレンへのbGH-M8（トリプル突然変異体）の結合親和性に変化は見られなかったから、bGHが明白な成長促進性および受容体結合性ドメインをもっていると考えられる。第三α-ヘリックスと共にあるbGH（bGH-M8）中の３つの代替突然変異体が、１個もしくは２個以上の臨界アミノ酸を変えたか、あるいはこの潜在的成長促進性ドメインの局所的コンフォーメーションを変えたかして、そのためbGH成長促進作用が減少させられたものと思われる。GH遺伝子ファミリーとその他の遺伝子ファミリーのメンバーからの生成物とのアミノ酸配列を比較することによって、Glu-117,Gly-119およびAla-122がGH遺伝子ファミリーの生成物中に相対的に保存されているが示されている（上記Watahiki,et al.,（1989））。
Ala-122はニワトリその他非霊長類の哺乳類のGHにのみ保存されているのに対し、Glu-117は哺乳類のGHにのみ保存されている。Gly-119はプロラクチン、胎盤性ラクトゲンなどのGH遺伝子ファミリーの全メンバーの生成物中に保存されている。したがってこれらアミノ酸はGHの生物学的作用にとって重要なものであろう。
GHの種々の活動はインシュリン様成長因子（IGF）として知られるペプチドのファミリー、特にGHがその受容体へ結合した後、主として肝臓中に生成されると考えられているIGF-Iを介して行われていることが分かっている。（Truesch,et al.,Ann.Rev.Physiol.,47:443-67（1985）;Zapt,et al.,harm.Res.,24:121-130（1986））IGF-Iは古典的な負のフィードバック機構により下垂体におけるGH生成を減少させることが示されている。（Leung,et al.,Endocrinology,119:1489-96（1986））。pBGH10Δ6-M8トランスジェニックマウスにはなぜ成長抑制が生ずるのかを説明する一つの仮説は、bGH-M8がマウスGH（mGH）に対するin vivoアンタゴニストとして作用し、したがってマウスIGF-Iの生成を抑制するのだというものである。もしこの仮説が正しいとすると、bGH M8トランスジェニックマウス中で血清マウスIGF-Iレベルでの減少だけでなく、下垂体におけるmGH生成の増加をも期待できることになる。bGH-M8トランスジェニックマウス、bGHトランスジェニックマウス、これらの非トランスジェニックリターメーツから取った全脳下垂体のイムノブロット分析の予備結果は、これら成長抑制マウスの脳下垂体が、対照の非トランスジェニックリターメーツに比較しより高いレベルのmGHを有していることを示唆している。逆にbGHトランスジェニックマウスのmGHレベルは、大きく抑制された。これはbGHトランスジェニックマウスの血清中のマウスIGF-Iレベルが、対照の非トランスジェニックリターメーツの血清中のレベルの２倍も増加していたからである。Palmiter,et al.,Science,222:809-14（1983）もし我々の仮説が正しいなら、我々の知る限り初めてのin vivo成長ホルモンアンタゴニストであり、GHの成長促進性作用と受容体結合性作用との連結を分離させた初めての例である。
実施例５：bGHのその他のミューテインのスクリーニング
類似の工程を経て第三α-ヘリックスに変化のあるbGHのミューテインを調整し、L細胞中での分泌状態をテストした。選択的ケースの場合はトランスジェニックマウスの成長に及ぼす影響についてもテストした。その結果は次の通り。
突然変異体K112L,K114Wはヘリックスの疎水面を拡張する効果を示す。この突然変異体は野生型成長ホルモンがするのと同様に動物の成長に大きく影響する。
突然変異体K114P,E118PおよびL121P（およびこれらの種々の組合せ）は明らかにα-ヘリックスを破壊する（プロリンは強力なα-ヘリックス破壊剤である）。成長に関連する生物学的活性は廃棄されている。突然変異体E126Gは特例である。つまりグリシンはヘリックス破壊剤だが、位置126はそのヘリックスの末端にあるので、通常の生物学的活動は保持される。G119Pについても同様である。強力なヘリックス破壊剤１個がそれよりも強力な破壊剤で置換されている。
野生型成長ホルモンの第三α-ヘリックスは３カ所で完全両親媒性α-ヘリックスから分岐している。第一に117位置でGluは疎水面において親水性アミノ酸である。第二に119位置でGlyは親水面で中性アミノ酸である。第三に122位置でAlaは親水面で疎水性アミノ酸である。突然変異体E117L,G119R,A122Dは単独であるいは組合わさってヘリックスの両親媒性を増強させる。またG119Rは配列のα-ヘリックス傾向を強化している。
我々の当初の仮説では、突然変異体G119RおよびE117L/G119R/A122Dの成長抑制作用は、増強された第三α-ヘリックスの両親媒性に関連する筈のものだった。しかしその後、第三α-ヘリックスの両親媒性はその作用には大半無関係であるという証拠を示すことになった。
（1）野生型bGHのような、単一E117Lは大動物を産生する。
（2）プロリンはグリシンのように親水性ではあるが、突然変異体G119Pは、小動物表現型を産生する。
（3）ロイシンは疎水性であり、したがってヘリックスの親水面を阻害するが、突然変異体G119Lは小動物表現型を産生する。
（4）突然変異体E111L/G119W/R125Lは、それら３つとも全てヘリックスの親水面を阻害するのであるが、小動物表現型を産生する。
このように１実施例では本発明は、成長抑制作用をもたらす第三α-ヘリックスの突然変異に関するが、そのヘリックスの両親媒性を減少させたり変化させたりしないものである。
要するに、残基119および122は成長性反応にとって重要なものであるが、これら残基の変更は受容体結合に影響しないということである。残基114、118および121にヘリックス破壊剤を挿入してヘリックスを破壊すると、成長に影響する作用および、培養マウス細胞における分泌作用の双方が阻止された。残基112、114、117および121は成長性反応にとって重要でない、少なくともヘリックスが破壊されない限り重要でないと思われる。
付加的な成長ホルモンアンタゴニストは、bGH中のG119に対応するコドンを系統的に変化させることによって同定することができるであろうし、その位置におけるアミノ酸１個を変更させた他の１８個の突然変異体を発現するようにすることもできよう。これは所望の変更アミノ酸をコードするようにコドン119で実施例１に述べたものとは別のオリゴヌクレオチドを合成することによって容易に達成することができる。また同様にしてbGHのアミノ酸115および122に対応するコドンのバリエーション、あるいはさらに異なるアミノ酸も研究することができる。
以下の表は、候補として挙げることができる突然変異体を同定するのに助けとなろう。
Claims (13)
- 脊椎動物の成長ホルモンのアミノ酸配列において、少なくとも、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）の主要な天然型の１１９位にあるグリシンに対応するアミノ酸を、天然型のグリシンと相違するアミノ酸に置換したアミノ酸配列からなり、脊椎動物のインビボまたはインビトロで成長ホルモン受容体アンタゴニスト活性を有し、脊椎動物中で成長抑制活性を有する、非天然の第３α−ヘリックスを含む非天然型のタンパク質であって、
上記ウシ成長ホルモンの天然型の１１９位のグリシンに対応するグリシンがプロリンで１個だけ置換されている天然型の哺乳類またはその他の脊椎動物の完全長成長ホルモンを除き、さらに、
Ｙ１１１Ｖ、Ｌ１１３Ｉ、Ｋ１１５Ｅ、Ｄ１１６Ｑ、Ｅ１１８Ｋ、Ｅ１１９Ｒ、Ｇ１２０Ｌ、Ｑ１２２Ｅ、Ｔ１２３Ｇ、Ｇ１２６Ｌ、Ｒ１２７ＩおよびＥ１２９Ｓのすべての置換を有し、かつ他に置換がないヒト成長ホルモンに対応するタンパク質を除く、
タンパク質。 - 前記グリシンと相違するアミノ酸がアルギニンである、請求項１に記載のタンパク質。
- 前記グリシンと相違するアミノ酸がトリプトファンである、請求項１に記載のタンパク質。
- 前記グリシンと相違するアミノ酸がリジンである、請求項１に記載のタンパク質。
- 前記グリシンと相違するアミノ酸がロイシンである、請求項１に記載のタンパク質。
- 脊椎動物の成長ホルモンのアミノ酸配列において、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）の主要な天然型の１１９位にあるグリシンに対応するアミノ酸のみが置換されたアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
- 脊椎動物の成長ホルモンのアミノ酸配列が、哺乳類の成長ホルモンのアミノ酸配列である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。
- 脊椎動物の成長ホルモンのアミノ酸配列が、ウシの成長ホルモンのアミノ酸配列である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。
- プロモータに操作可能に連結された遺伝子を有する複数の細胞を含むヒト以外のトランスジェニック脊椎動物であって、上記遺伝子は、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする配列を含むことを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック脊椎動物。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする配列を含む遺伝子を含んだ組み換えＤＮＡ分子であって、脊椎動物中での成長抑制活性を有する医薬として使用される組み換えＤＮＡ分子。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質を含有することを特徴とする、成長ホルモン活性を阻害、または減少させることによって改善することができる症状を治療するための医薬。
- ウシ成長ホルモンの主要な天然型のアミノ酸配列において以下の置換が導入されたアミノ酸配列からなる変異型ウシ成長ホルモン：
（A）１１７位のグルタミン酸のロイシンへの置換
（B）１１９位のグリシンのアルギニンへの置換、及び
（C）１２２位のアラニンのアスパラギン酸への置換。 - ウシ成長ホルモンの主要な天然型のアミノ酸配列において以下の置換が導入されたアミノ酸配列からなる変異型ウシ成長ホルモン：
（A）１１７位のグルタミン酸のロイシンへの置換
（B）１１９位のグリシンのトリプトファンへの置換、及び
（C）１２５位のアルギニンのロイシンへの置換。
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