MXPA03005236A

MXPA03005236A - Administracion de secuencia de acido nucleico a un animal hembra para mejorar el crecimiento en la progenie.

Info

Publication number: MXPA03005236A
Application number: MXPA03005236A
Authority: MX
Inventors: G Smith Roy
Original assignee: Baylor College Medicine
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2001-12-12
Publication date: 2005-04-08
Also published as: EP1364004A4; AU2002248194B2; PL366116A1; WO2002061037A2; EP1364004A2; BR0116472A; WO2002061037B1; AR035671A1; CN1575301A; CA2430921C; WO2002061037A3; KR20040039187A; CA2430921A1

Abstract

El crecimiento es mejorado utilizando una metodologia potencial de aumento del crecimiento para administrar una secuencia de acido nucleico, tal como GHRH o un analogo a un animal hembra, de preferencia, a traves de una ruta de administracion parenteral. Los lechones nacidos de cerdos hembra inyectados con el ADN que codifica el GHRH son mas grandes, y los efectos son demostrados en las camadas subsecuentes sin la administracion(es) adicional(es) del vector.

Description

patente Euroasiática (AM, A/, BY, Ü, KZ, MD. RU, TJ, 'G?), Para códigos de dos letras y otras abreviaturas consultar patente Europea (AT, BU. CH, CY. DI!, DK, liS, ??, FR, les notas "Gules sobre Códigos y Abreviaturas" que aparecen (ÍB, GR, IT:, IT, UJ, MC, NL. ?. Sli, TR ), patente OAPI al inicio de la Gaceta PCT. (??', BJ, c:r, ca. ci, C:M, ÜA, GN, GQ, GW, ML, MR, ?1·, SN, TD, TG). Publicada: — Sin reporte internacional de búsqueda y para volver a ser publicado el recibir este reporte.

ADMINISTRACIÓN DE SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO A UN ANIMAL HEMBRA PARA MEJORAR EL CRECIMIENTO EN LA PROGENIE La presente solicitud reclama la prioridad sobre la solicitud provisional de Patente Norteamericana No. 60/255,021 presentada el 12 de Diciembre del 2000. Campo de la Invención La presente invención se refiere generalmente a endocrinología, medicina y biología celular. Más específicamente, la presente invención se refiere a una mejora del crecimiento y funcionamiento, al estimulo de producción de hormonas de crecimiento de un animal en un nivel mayor que el asociado con el crecimiento normal; y al aumento del crecimiento utilizando la administración del ADN que codifica una hormona que libera la hormona del crecimiento en un animal hembra. Además, se refiere a la aplicación de una secuencia de nucleótidos que mejora el crecimiento, tal como una hormona de liberación de hormona del crecimiento o un análogo, regulada por un promotor especifico del músculo en el tejido muscular, utilizando particularmente técnicas de electroporación. Antecedentes de la Invención La trayectoria de producción de la hormona del crecimiento (GH) se compone de una serie de genes interdependientes cuyos productos son requeridos para el crecimiento normal. Los genes de la trayectoria GH incluyen: (1) ligandos, tales como GH, y el factor de crecimiento-l similar a la insulina (IGF-I); (2) factores de transcripción, tales como predictor de fosa 1, o pred. 1, y fosa 1; (3) agonistas y antagonistas, tales como hormona de liberación del crecimiento (GHRH) y somatostatlna, respectivamente; y (4) receptores, tales como el receptor de GHRH (GHRH-R), y el receptor de GH (GH-R). Estos genes son expresados en órganos y tejidos diferentes, incluyendo el hipotálamo, la pituitaria, el hígado y los huesos. La expresión efectiva y regulada de las trayectorias del GH es esencial para un crecimiento lineal óptimo, así como la homeostasis de los carbohidratos, proteínas, y la síntesis del GH del metabolismo de grasas y secreción de la pituitaria anterior son estimuladas por el GHRH e inhibidas por la somatostatina, ambas hormonas hipotalámicas. Son bien conocidos el rol principal de GH en el control del crecimiento somático de los humanos y otros vertebrados, y las trayectorias fisiológicamente relevantes que regulan la secreción de GH de la pituitaria. El GH aumenta la producción de IGF-I, principalmente en el hígado y otros órganos objetivo. A su vez, el IGF-I y el GH se retroalimentan en el hipotálamo y la pituitaria para inhibir el GHRH y liberar el GH. El GH tiene tanto acciones directas como indirectas en los tejidos periféricos, siendo portados los efectos indirectos principalmente por el IGF-I. Existe un espectro amplio de condiciones clínicas, tanto en los niños como en los adultos, en los cuales el crecimiento lineal (pacientes prepubertos) o la composición del cuerpo están comprometidos, y los cuales responden a una terapia de GH o GHRH. En todos los casos, el GHRH-GH-IGF-I es funcional, pero no necesariamente opera en una sensibilidad o capacidad de respuesta óptima debido a una variedad de razones posibles. La característica principal de las deficiencias del GH en los niños es la estatura corta. Se produjeron fenotipos similares por medio de defectos genéticos en diferentes puntos del eje GH (Parks et al., 1995), así como en la estatura corta deficiente, no debida al GH. Las deficiencias no debidas al GH tienen diferente etiología, tales como: (1) enfermedades genéticas, el síndrome de Turner (Jacobs et al., 1990; Skuse et al., 1999), la hipocondroplasia (Tanaka et al., 1998; Key y Gross, 1996), la enfermedad de Crohn (Savage et al., 1999); y (2) la retardación de crecimiento intrauterino (Albanese y Stanhope, 1997; Azcona et al., 1998); y (3) una insuficiencia renal crónica (Sohmiya et al., 1998; Benfleld y Kohaut, 1997). En los casos en los cuales no está afectado el GH (por ejemplo, en pacientes que tienen hormonas, genes y receptores normales), es responsable del más del 50% de los casos totales de retardo del crecimiento. En estos casos, se ha mostrado que es efectiva la terapia de GHRH o GH (Gesundheit y Alexander, 1995). La secreción reducida de GH de la pituitaria anterior ocasiona que se pierda la masa del músculo del esqueleto durante el envejecimiento, desde los 25 años hasta la senectud. Él GHRH-GH-IGF-I padece cambios dramáticos a través del envejecimiento, y en los ancianos (D'Costa et al., 1993), con un índice de producción disminuida de GH, y de la vida media de GH, una respuesta disminuida de IGF-I al estímulo del GH y el GHRH conduciendo a la pérdida de la masa del músculo del esqueleto (sarcopenia), osteoporosis, y el aumento en la grasa y disminución en la masa corporal magra (Bartke, 1998). Los estudios anteriores han mostrado que en un número importante de personas ancianas, los niveles en el suero de GH e IGFs son reducidos de manera importante en un 70% a 80% de su nivel en la adolescencia (Corpas et al., 1993; Iranmanesh et al., 1991). Se ha demostrado que el desarrollo de la sarcopenia puede ser compensado por terapia de GH. Sin embargo, ésta continúa siendo una terapia controversial en los ancianos debido a su costo y efectos colaterales frecuentes. La producción de proteínas recombinantes permite una herramienta útil para el tratamiento de estos padecimientos. Aunque la terapia de reemplazo del GH es ampliamente utilizada en pacientes con deficiencias de crecimiento y proporciona un crecimiento satisfactorio y puede tener efectos fisiológicos positivos en los niños que están siendo tratados (Rosenbaum y Saigal, 1996; Erling, 1999), esta terapia tiene varias desventajas, incluyendo un requerimiento poco práctico de administración frecuente de GH (Monti et al., 1997; Heptulla et al., 1997), y efectos secundarios no deseables (Blethen et al., Watkins, 1996; Shalet et al., 1997; Alien et al, 1997). Está bien establecido que el GHRH secretado extracranealmente, como un péptido maduro o moléculas truncadas (como se puede ver en los tumores celulares de isleta pancreática y los carcinoides localizados en diferentes partes), con frecuencia están biológicamente activos y aún pueden producir la acromegalia (Esch et al., 1982; Thorner et al., 1984). La administración a niños o adultos humanos del GHRH recombinante de GH aumenta los niveles de IGF-I, aumenta la secreción de GH proporcionalmente a la dosis de GHRH y todavía invoca una respuesta a una dosis de bolo del GHRH (Bercu y Walker, 1997). Por lo tanto, la administración del GHRH representa una alternativa más fisiológica para aumentar los niveles subnormales de GH e IGF-I (Corpas et al., 1993). Aunque la terapia de proteína GHRH capacita y estimula la secreción de GH cíclico normal, sin tener virtualmente efectos colaterales, la vida media del GHRH in vivo requiere la administración frecuente (de una a tres veces al día) intravenosa, subcutánea o intranasal (requiriendo dosis mayores de 300 veces). Por lo tanto, como tratamiento crónico, la administración de GHRH no es práctica. Sin embargo, el GHRH secretado extracranealmente como una especie de proteína procesada (Tyrl-40 ó Tyrl-Leu44), o hasta como moléculas truncadas más cortas, son biológicamente activas (Thorner et al., 1984). De una manera importante, un nivel bajo de GHRH (100 pg/ml) en el suministro de sangre estimula la secreción de GH (Corpas et al., 1993), y hace al GHRH un candidato excelente para una expresión terapéutica genética. La transferencia genética de ADN plásmido directa está basada actualmente en muchas estrategias terapéuticas genéticas emergentes, y por lo tanto, no requiere genes virales, o partículas de llpidos (Muramatsu eí al., 1998; Aihara y Miyazaki, 1998). El músculo del esqueleto es un tejido objetivo preferido, debido a que la fibra muscular tiene un período de vida largo y puede ser transducida por plásmidos de ADN circulares que se expresan por meses o años en un huésped inmunocompetente (Davis et al., 1993; Tripathy et al., 1996). Los reportes anteriores demostraron que el cADN del GHRH humano podría ser administrado a los músculos por un vector de expresión miogénico inyectable en los ratones, en donde estimula transitoriamente la secreción de GH hasta un punto modesto por un periodo de dos semanas (Draghia-Akli et al., 1997). El GHRH de tipo natural tiene una vida media relativamente corta en el sistema circulatorio, tanto en los humanos (Frohman et al., 1984), como en los animales de granja. Después de 60 minutos de incubación en el plasma, el 95% del GHRH(1 -44)NH2 está degradado, mientras que la incubación de una forma más corta de (1-40)OH de la hormona, bajo condiciones similares, muestra una degradación de solamente 77% del péptido después de 60 minutos de incubación (Frohman et al., 1989). La incorporación del cADN que codifica un análogo particular de GHRH resistente a la proteasa en el vector de terapia genética, da como resultado una molécula con una vida media más larga en el suero, una potencia aumentada, y proporciona una liberación mayor de GH en los animales que se les ha inyectado el plásmido (Draghia-Akli et al., 1999, incorporada a la presente descripción como referencia). La mutagónesis por medio del reemplazo de aminoácidos sensibles a la proteasa prolonga la vida media en el suero de la molécula hGHRH. Además, el aumento de la actividad biológica del GHRH es logrado utilizando análogos superactivos los cuales pueden aumentar su afinidad de enlace a receptores específicos (Draghia-Akli et al., 1999). Existen patentes emitidas, las cuales tratan de la administración de proteínas análogas de GHRH novedosas (Patentes Norteamericanas Nos. 5,847,066; 5,846,936; 5,792,747; 5,776,901; 5,696,089; 5,486,505; 5,137,872; 5,084,442; 5,036,045; 5,023,322; 4,839,344; 4,410,512; RE33.699), o fragmentos de GHRH péptidos que ocurren de manera natural o sintéticos (Patentes Norteamericanas Nos. 4,833,166; 4,228,158; 4,228,156; 4,226,857; 4,224,316; 4,223,021; 4,223,020; 4,223,019), con el propósito de aumentar la liberación de hormona del crecimiento. Ha sido reportado un análogo de GHRH que contiene las siguientes mutaciones (Patente Norteamericana No. 5,846,936): Tyr en la posición 1 a His; Ala en la posición 2 a Val, Leu, y otros; Asn en la posición 8 a Gln, Ser o Thr; Gly en la posición 15 a Ala o Leu; Met en la posición 27 a Nle o Leu; y Ser en la posición 28 a Asn. El análogo de GHRH el cual es el asunto materia de la solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 60/145,624, incorporada a la presente descripción como referencia, no contiene todas las substituciones de aminoácidos reportadas en la Patente Norteamericana No. 5,846,936, que son necesarias para la actividad. La invención de la Solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 60/145,624 difiere de la Patente Norteamericana No. 5,756,264 en dos aspectos. Primero, la invención de la Solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 60/145,624 se refiere a un análogo de la hormona de liberación de la hormona del crecimiento, el cual es diferente de la forma del tipo natural con modificaciones importantes las cuales mejoran su función como un secretagogo del GH: una susceptibilidad disminuida a las proteasas y una estabilidad aumentada, lo cual prolongaría la capacidad para efectuar una terapia, y una actividad biológica mejorada, la cual aumentarla la capacidad para efectuar una terapia. El análogo de la Solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 60/145,624 carece de la substitución en la posición 8 a GIn, Ser o Thr presente en el análogo GHRG de la Patente Norteamericana No. 5,756,264. Además, en un aspecto de la invención de la Solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 60/145,624, la invención utiliza un ADN que codifica el análogo de GHRH enlazado a un promotor sintético único, denominado SPc5-12 (Li et al., 1999), el cual contiene un elemento de respuesta al suero próxima (SRE) proveniente de la a-actina del esqueleto, múltiples sitios MEF-2, sitios MEF-1 y sitios de enlace TEF-1, y excede de una manera importante, las potencias de transcripción de los promotores miogénicos naturales. La exclusividad de dicho promotor sintético es una mejora importante sobre, por ejemplo, las patentes emitidas concernientes al promotor miogónico y su uso (por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,374,544) o los sistemas para la expresión miogénica de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,298,422). La Patente Norteamericana No. 5,061,690, se dirige hacia el aumento, tanto del peso en las aves como en la producción de leche, suministrando a los mamíferos hembra preñados una cantidad efectiva de hGRF o uno de sus análogos durante un período de 10 a 20 días. La aplicación de los análogos perdura a través del periodo de lactancia. Sin embargo, presentan administraciones múltiples, y no existe una descripción con respecto a la administración de la hormona de liberación de la hormona del crecimiento (o factor), como una molécula de ADN, tal como con las técnicas de terapia genética.

De manera similar, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,134,120 y 5,292,721 no proporcionan técnicas con respecto a la administración de la hormona de liberación de la hormona del crecimiento como una forma de ADN. Además, estas patentes se refieren exclusivamente a las administraciones múltiples de la proteína GH recombinante en las últimas dos semanas de la gestación, y las tres semanas posteriores al alumbramiento. También, no se proporciona explicación con respecto a forma de tipo no natural alguna, tales como se proporcionan en la presente invención. La administración de la hormona del crecimiento (GH) a animales de granja, mejora la deposición del tejido magro y/o la producción de leche, mientras que aumenta la eficiencia de la alimentación(Etherton et al., 1986; Klindt et al., 1998). Estudios numerosos han mostrado que la GH reduce de manera notable la cantidad de grasa del esqueleto; y por consiguiente aumenta la calidad de los productos. Sin embargo, la administración crónica de GH tiene limitaciones prácticas y fisiológicas que mitigan potencialmente su utilidad y efectividad (Chung et al., 1985; Gopinath y Etherton, 1989). Experimentalmente, se utilizó la hormona liberadora de GH (GHRH), como una alternativa más fisiológica. Para las especies grandes, tales como de cerdo o ganado, el uso del GHRH, el estimulante ascendente de GH, es una estrategia alterna que puede aumentar no solamente el funcionamiento del crecimiento y la producción de leche, sino lo que es más importante, la eficiencia de la producción desde ambas perspectivas la práctica y la metabólica (Dubreuil et al., 1990; Farmer et al., 1992). Sin embargo, el costo alto de los póptidos recombinantes y la frecuencia de administración requerida, limitan totalmente el uso difundido de este tratamiento. Estas desventajas principales pueden ser eliminadas utilizando un método de terapia genética para dirigir la producción ectópica de GHRH, siempre que su producción pueda ser sostenida de manera crónica. La expresión especifica del tejido hipotalámico del gen GHRH no es requerida para la actividad, ya que el GHRH secretado extracranealmente puede ser biológicamente activo (Faglia et al., 1992; Melmed 1991). Un método de terapia genética para administrar GHRH es favorecido por el hecho de que el gen, el cADN y las moléculas naturales y varias moléculas mutadas están bien caracterizadas en los cerdos, el ganado y muchas otras especies, y que la determinación de la eficacia terapéutica es directa e inequívoca. La musculatura del esqueleto es un candidato perfecto para el tejido objetivo debido a que se puede llevar a cabo fácilmente una inyección intramuscular en un establecimiento industrial, las fibras del músculo tienen un período de vida largo y pueden ser transducidos por los plasmidos de ADN circulares (Bettan er a/., 2000; Everett et al., 2000). Por lo tanto, no existe la necesidad de una nueva administración y el transgón puede ser expresado de manera eficiente durante meses o años, en un huésped inmunocompetente (Wolff et al., 1992). Sumarlo de la Invención En una modalidad de la presente invención existe un método para mejorar o aumentar el crecimiento en una progenie de un animal hembra que comprende los pasos de introducción de una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de dicha progenie, en donde el vector comprende un promotor como una secuencia de nucleótidos, y una región sin traducir 3', bajo condiciones en donde es expresada la secuencia de nucléotidos y en donde la introducción de expresión del vector da como resultado el crecimiento mejorado o aumentado de la progenie. En una modalidad especifica, las células de dicho animal hembra comprenden células diploides. En otra modalidad especifica, las células de dicho animal hembra comprenden células musculares. En una modalidad especifica adicional, la secuencia de ácido nucleico codifica la hormona de liberación de la hormona del crecimiento o su análogo. En una modalidad especifica adicional, la hormona de liberación de hormona del crecimiento es la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8, o su análogo respectivo. En una modalidad especifica adicional, el promotor comprende un promotor miogónico sintético. En una modalidad adicional especifica, la región 3' sin traducir comprende una región sin traducir hGH 3', En otra modalidad especifica, el vector es introducido por medio de electroporación dentro de las células de dicho animal hembra, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo, o por ruta parenteral. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimentación o un animal de trabajo. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, puerco, vaca, oveja, cabra o gallina. En una modalidad especifica adicional el vector es seleccionado del grupo consistente de un plásmido, un vector viral, un liposoma y un lípido catiónico. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en el animal hembra en una sola administración. En una modalidad especifica adicional, la introducción ocurre durante el tercer trimestre de la gestación de la progenie. En otra modalidad especifica, el método comprende adicionalmente el paso de administración al animal hembra de un ligando para un receptor secretagogo de la hormona del crecimiento. En una modalidad especifica, la administración del ligando es oral. En una modalidad adicional de la presente Invención, se proporciona un método para aumentar los niveles de hormona del crecimiento en una progenie de un animal hembra que comprende los pasos de introducción de una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de la progenie, en donde el vector comprende un promotor, una secuencia de nucleótidos; y una región 3' sin traducir, bajo condiciones en donde la secuencia de nucleótidos expresada y en donde la introducción y expresión del vector, dan como resultado un aumento en los niveles de la hormona del crecimiento de la progenie. En una modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células diploides. En otra modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células musculares. En una modalidad especifica adicional, la secuencia de ácido nucleico codifica la hormona de liberación de hormona del crecimiento o su análogo. En una modalidad especifica adicional, la hormona de liberación de la hormona del crecimiento es la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8, o su análogo respectivo. En una modalidad especifica adicional, el promotor comprende un promotor miogónico sintético. En una modalidad especifica adicional, la región 3' sin traducir comprende una región hGH 3' sin traducir. En otra modalidad especifica, el vector es introducido dentro de la célula del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo, o por ruta parenteral. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. En una modalidad especifica adicional, el vector es seleccionado del grupo consistente de un plásmido, un vector viral, un liposoma y un lípido catiónico. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en la hembra en una sola administración. En una modalidad especifica adicional, la introducción ocurre durante el tercer trimestre de la gestación de la progenie. En otra modalidad especifica, el método comprende además, el paso de administración a la hembra de un ligando para un receptor secretagogo de la hormona del crecimiento. En otra modalidad especifica, el ligando es de administración oral. En otra modalidad de la presente invención se proporciona un método de aumento de la masa corporal magra en una progenie proveniente de un animal hembra que comprende el paso de introducción de una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de la progenie, en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos; y una región 3' sin traducir, bajo condiciones en donde es expresada la secuencia de nuclóotidos y en donde la introducción y expresión del vector dan como resultado la masa corporal magra aumentada de la progenie. En una modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células diploides. En otra modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células musculares. En una modalidad especifica adicional, la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de liberación de hormona del crecimiento o su análogo. En una modalidad especifica adicional, la hormona de liberación de la hormona del crecimiento es la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8, o su análogo respectivo. En una modalidad especifica adicional, el promotor comprende un promotor miogénico sintético. En una modalidad especifica adicional, la región 3' sin traducir comprende una región hGH 3' sin traducir. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo o por ruta parenteral. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. En una modalidad especifica adicional, el vector es seleccionado del grupo consistente de un plásmido, un vector viral, un liposoma y un llpido catiónico. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en la hembra en una sola administración. En una modalidad especifica adicional, la introducción ocurre durante el tercer trimestre de gestación de la progenie. En otra modalidad especifica, el método comprende además, el paso de administración a la hembra de un ligando para un receptor secretagogo de la hormona del crecimiento. En otra modalidad especifica, la administración del ligando es oral. En otra modalidad de la presente invención se proporciona un método para aumentar los niveles de IGF-I en una progenie proveniente de un animal hembra que comprende el paso de introducción de una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de dicha progenie, en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos; y una región 3' sin traducir, bajo condiciones en donde es expresada la secuencia de nucléotidos y en donde dicha introducción y expresión del vector dan como resultado niveles aumentados de IGF-I en la progenie. En una modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células diploides. En otra modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células musculares. En otra modalidad especifica adicional, la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de liberación de la hormona del crecimiento o su análogo. En una modalidad especifica adicional, la hormona de liberación de la hormona del crecimiento es la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8, o su análogo respectivo. En una modalidad especifica adicional, el promotor comprende un promotor miogénico sintético. En una modalidad especifica adicional, la región 3' sin traducir comprende una región hGH 3' sin traducir. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo o por ruta parenteral. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. En una modalidad especifica adicional, el vector es seleccionado del grupo consistente de un plásmido, un vector viral, un liposoma, y un lípido catiónico. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en el animal hembra en una sola administración. En una modalidad especifica adicional la introducción ocurre durante el tercer trimestre de la gestación de la progenie. En otra modalidad especifica, el método comprende además, el paso de administración a la hembra de un ligando para un receptor secretagogo de la hormona del crecimiento. En otra modalidad especifica, la administración de ligando es oral. En una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona un método para aumentar la eficiencia de la alimentación en una progenie proveniente de un animal hembra que comprende el paso de introducir una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de la progenie, en donde el vector comprende un promotor, una secuencia de nucleótidos, y una región 3' sin traducir, bajo condiciones en donde es expresada la secuencia de nucléotidos y en donde la introducción y expresión del vector dan como resultado una eficiencia aumentada de la alimentación en la progenie. En una modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células diploides. En otra modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células musculares. En una modalidad especifica adicional, la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de liberación de la hormona del crecimiento o su análogo. En una modalidad especifica adicional, la hormona de liberación de la hormona del crecimiento es la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8, o su análogo respectivo. En una modalidad especifica adicional, el promotor comprende un promotor miogénico sintético. En una modalidad especifica adicional, la región 3' sin traducir comprende una región hGH 3' sin traducir. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo o por ruta parenteral. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. En una modalidad especifica adicional, el vector es seleccionado del grupo consistente de un plasmido, un vector viral, un liposoma y un lípido catiónico. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en la hembra en una sola administración. En una modalidad especifica adicional, la introducción ocurre durante el tercer trimestre de gestación de la progenie. En otra modalidad especifica, el método comprende el paso de administración a la hembra de un ligando para un receptor secretagogo de la hormona del crecimiento. En otra modalidad especifica, la administración del ligando es oral. En otra modalidad de la presente invención, se proporciona un método para aumentar el índice de crecimiento en una progenie proveniente de un animal hembra que comprende el paso de introducir una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de la progenie, en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos; y una región 3' sin traducir, bajo condiciones en donde es expresada la secuencia de nuclóotidos y en donde la introducción del vector da como resultado un índice de crecimiento aumentado en la progenie. En una modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células diploides. En otra modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células musculares. En una modalidad especifica adicional, la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de liberación de la hormona del crecimiento o su análogo. En una modalidad especifica adicional. La hormona de liberación de la hormona del crecimiento es la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8, o su análogo respectivo. En una modalidad especifica adicional, el promotor comprende un promotor miogénlco sintético. En una modalidad especifica adicional, la región 3' sin traducir comprende una región hGH 3' sin traducir. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo o por ruta parenteral. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. En una modalidad especifica adicional, el vector es seleccionado del grupo consistente de un plásmido, un vector viral, un liposoma y un lípido catiónico. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en la hembra en una sola administración. En una modalidad especifica adicional, la introducción ocurre durante el tercer trimestre de gestación de la progenie. En otra modalidad especifica, el método comprende además, el paso de administración a la hembra de un ligando para un receptor secretagogo de la hormona del crecimiento. En otra modalidad especifica, la administración del ligando es oral. En una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona un método para aumentar la proporción de somatotrofos a otras células productoras de hormonas en una glándula pituitaria de una progenie proveniente de un animal hembra, que comprende el paso de introducción de una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de la progenie, en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos y una región 3' sin traducir, bajo condiciones en donde es expresada la secuencia de nucléotidos y en donde la introducción y expresión del vector dan como resultado una proporción aumentada de somatotrofos a otras células productoras de hormonas en la progenie. En una modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células diploides. En otra modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células musculares. En una modalidad especifica adicional, la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de liberación de la hormona del crecimiento o su análogo. En una modalidad especifica adicional, la hormona de liberación de la hormona del crecimiento es la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8, o su análogo respectivo. En una modalidad especifica adicional, el promotor comprende un promotor miogónico sintético. En una modalidad especifica adicional, la región 3' sin traducir comprende una región hGH 3' sin traducir. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo o por ruta parenteral. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. En una modalidad especifica adicional, el vector es seleccionado del grupo consistente de un plásmido, un vector viral, un liposoma y un I [pido catiónico. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en la hembra en una sola administración. En una modalidad especifica adicional, la introducción ocurre durante el tercer trimestre de la gestación de la progenie. En otra modalidad especifica, el método comprende además, el paso de administración a la hembra de un ligando para un receptor secretagogo de la hormona del crecimiento. En otra modalidad especifica, la administración de ligando es oral. En una modalidad especifica, las células productoras de hormonas son seleccionadas del grupo consistente de corticotrofos, lactotrofos y gonadotrofos. En una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona un método para demorar el alumbramiento de una progenie proveniente de un animal hembra que comprende el paso de introducción de una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de la progenie, en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos, y una región 3' sin traducir, bajo condiciones en donde es expresada la secuencia de nucleótidos y en donde la introducción y expresión del vector dan como resultado el alumbramiento demorado de la progenie. En una modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células diploides. En otra modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células musculares, En una modalidad especifica adicional, la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de liberación de la hormona del crecimiento o su análogo. En una modalidad especifica adicional, la hormona de liberación de la hormona del crecimiento es la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8, o su análogo respectivo. En una modalidad especifica adicional, el promotor comprende un promotor miogénico sintético. En una modalidad especifica adicional, la región 3' sin traducir comprende una región hGH 3' sin traducir. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo, o por ruta parenteral. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. En una modalidad especifica adicional, el vector es seleccionado del grupo consistente de un plásmido, un vector viral, un liposoma y un lípido catiónico. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en la hembra en una sola administración. En una modalidad especifica adicional, la introducción ocurre durante el tercer trimestre de la gestación de la progenie. En otra modalidad especifica, el método comprende además, el paso de administración a la hembra de un ligando para un receptor secretagogo de hormona del crecimiento. En una modalidad especifica adicional, la administración del ligando es oral. En una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona un método para aumentar la producción de leche en un animal que comprende el paso de introducción de una cantidad efectiva de un vector en las células de dicho animal, y en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos, y una región 3' sin traducir enlazada, bajo condiciones en donde es expresada la secuencia de nucleótidos y en donde la introducción y expresión del vector dan como resultado una producción aumentada de leche en el animal. En una modalidad especifica, las células del animal hembra comprenden células diploides. En otra modalidad especifica, las células del animal comprenden células musculares. En una modalidad especifica adicional, la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de liberación de la hormona del crecimiento o su análogo. En una modalidad especifica adicional, la hormona de liberación de la hormona del crecimiento es la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8, o su análogo respectivo. En una modalidad especifica adicional, el promotor comprende un promotor miogénico sintético. En una modalidad especifica adicional, la región 3' sin traducir comprende una región hGH 3' sin traducir. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo o por ruta parenteral. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. En una modalidad especifica adicional, el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. En una modalidad especifica adicional, el vector es seleccionado del grupo consistente de un plásmido, un vector viral, un liposoma y un lípido catiónico. En otra modalidad especifica, el vector es introducido en la hembra en una sola administración. En una modalidad especifica adicional, la introducción ocurre durante el tercer trimestre de gestación de la progenie. En otra modalidad especifica, el método comprende además, el paso de administración a la hembra de un ligando para un receptor secretagogo de la hormona del crecimiento. En otra modalidad especifica, la administración del ligando es oral. Otros objetos, características y ventajas adicionales podrán ser apreciados y finalmente serán comprendidos más fácilmente por medio de la lectura de la siguiente descripción y haciendo referencia a los dibujos que la acompañan que forman parte de la misma, o cualquiera de los ejemplos de las modalidades actualmente preferidas de la invención que se proporcionan con propósitos de descripción, Breve Descripción de los Dibulos Las figuras del 1A al 1C demuestran que los análogos GHRH superactivos aumentan la actividad secretagoga del GH y su estabilidad. La figura 1A es una comparación de una secuencia de aminoácidos (1-40)OH porcina de tipo natural con el HV-GHRH análogo. La figura 1B muestra el efecto de la diferencia de las especies GHRH en la liberación de GH porcino en un cultivo pituitario primario porcino. La figura 1C demuestra los cambios en la estabilidad que ocurren con el HV-GHRH y el GHRH porcino de tipo natural durante una incubación de 6 horas. Las figuras del 2A al 2E demuestran un aumento en los niveles en el suero de GHRH, GH e IGF-I por un periodo de dos meses después de una sola inyección del vector de expresión miogónica de GHRH análogo superactivo. La figura 2A ilustra las construcciones que contienen el promotor sintético SPc5-12 y el UTR 3' del GH. Como un modelo de proteína mutada, la construcción HV-GHRH fue utilizada y comparada con la proteína porcina de tipo natural como un control positivo, y con la construcción de ß-galactosidasa como control negativo. La figura 2B ilustra los niveles relativos en el suero de GHRH en los cerdos inyectados con pSP-GHRH contra un placebo inyectado a los cerdos de control. La figura 2C demuestra los niveles absolutos de GHRH en el suero en los cerdos inyectados con pSP-GHRH contra los cerdos de control corregido por el aumento de volumen sanguíneo/peso. La figura 2D muestra la variación de los niveles de GH en los cerdos inyectados con pSP-HV-GHRH. La figura 2E muestra los niveles en el plasma en el IGF-I después de la inyección intramuscular directa de las construcciones pSP-GHRH. Las figuras del 3A al 3C demuestran el efecto de los vectores de expresión GHRH miogónicos en el crecimiento de los cerdos. La figura 3A muestra el cambio en el peso promedio en los cerdos inyectados durante 2 meses con pSP-GHRH ó pSP-HV-GHRH. La figura 3B muestra la condición de la eficiencia de conversión del alimento en los cerdos inyectados con pSP-GHRH contra los controles. La figura 3C es una comparación de un cerdo inyectado con pSP-HV-GHRH y un cerdo de control inyectado con placebo, 45 días después de la inyección. La figura 4 demuestra el efecto de la inyección de diferentes cantidades de pSP-HV-GHRH en lechones de 10 días de edad. La figura 5 muestra el efecto de la inyección de cantidades diferentes de pSP-HV-GHRH en los niveles de IGF-I en lechones de 10 días de edad. La figura 6 ilustra el curso del tiempo para la Inyección del plásmido de pSP-HV-GHRH en los lechones. La figura 7 ilustra una modalidad preferida de la presente invención para un electrodo inyectable contra una modalidad alternativa de electrodos de calibre exterior. En la parte superior es una ilustración de los electrodos de calibre externo que tienen 2 placas cuadradas/lado 1.5 cm. En el fondo se encuentra una ilustración de un aparato de adaptación de 6 agujas (agujas sólidas) con agujas de 2 cm de longitud de calibre 18-26 presentes en una adaptación de un diámetro de 1 cm. La ilustración izquierda es una vista lateral y la ilustración derecha es una vista inferior. La figura 8 demuestra el peso de nacimiento de los lechones de control y del experimento. La figura 9 ilustra el peso de los lechones durante la lactancia para los animales experimentales y de control. La figura 10 muestra el peso de las crías cruzadas de control con los animales inyectados comparados con sus compañeros de carnada. La figura 11 demuestra el peso de los lechones provenientes de las crias cruzadas de los cerdos hembra tratados con GHRH comparados con los cerdos hembra de control y comparados con sus compañeros de carnada. La figura 12 ilustra un aumento general en el peso de los controles (alimentados por los cerdos hembra de control). La figura 13 es una comparación de los pesos del mercado de control y experimentales. La figura 14 ilustra los pesos de la progenie a las 3 semanas, 10 semanas y 24 semanas. La figura 15 muestra el peso muscular por peso corporal en los animales de tres semanas de edad. La figura 16 demuestra el peso de la pituitaria por el peso total de la progenie. La figura 17 muestra el análisis de ARN del GH, GHRH y PRL de la progenie, ilustrando que el GHRH actúa dentro del útero como un factor de crecimiento en la pituitaria. La figura 18 ilustra una tinción DAB de las células secretoras de GH. La figura 19 demuestra la concentración de IGF-I en la progenie a las 3 semanas, 12 semanas y 6 meses. Descripción Detallada de la Invención Aquellos expertos en la técnica apreciaran fácilmente que se le pueden hacer varias substituciones y modificaciones a la invención aquí descrita, sin salirse del alcance y espíritu de la misma. El término "un" como se usa en la presente descripción puede significar uno o más. Como se usa en las reivindicaciones, cuando es usado en conjunto con la palabra "comprende", las palabras "un" pueden significar uno o más de uno. Como se usa en la presente descripción "otro" puede significar al menos un segundo o más. El término "animal" como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier especie del reino animal. En las modalidades preferidas se refiere más específicamente a humanos, animales en su condición natural, animales utilizados como mascotas (pájaros, perros, gatos, caballos), animales utilizados para el trabajo (caballos, vacas, perros), y animales los cuales producen alimentos (gallinas, vacas, pescados), animales de granja (cerdos, caballos, vacas, ovejas, gallinas) o alimentos mismos (ranas, pollos, pescados, cangrejos, langostas, camarón, mejillones, vieiras, cabras, jabalíes, vacas, borregos, cerdos, avestruz, emú, anguila) y otros animales bien conocidos en la técnica.

El término "cantidad efectiva" como se usa en la presente descripción, es definido como la cantidad de la composición requerida para producir un efecto en un huésped el cual puede ser monitoreado utilizando varios puntos finales conocidos para aquellos expertos en la técnica. En una modalidad especifica, estos puntos finales son marcadores subrogados. El término "eficiencia de conversión del alimento" tal y como se describe en la presente invención se define como la cantidad de alimento que come el animal por día contra la cantidad de peso ganado por dicho animal. Los términos "eficiencia" o "eficiencias del alimento" como se usa en la presente descripción son intercambiables con "eficiencia de conversión del alimento". El término "deficiencias del crecimiento" como se usa en la presente descripción se define como cualquier condición de salud, condición médica o enfermedad, en la cual el crecimiento es menor que el normal. La deficiencia podría ser el resultado de una aberración que afecta directamente una trayectoria de la hormona del crecimiento (tal como el eje GHRH-GH-IGF-I), que afecta indirectamente una trayectoria de hormona del crecimiento, o que no afecta en lo absoluto una hormona del crecimiento. El término "hormona del crecimiento" como se usa en la presente descripción se define como una hormona, la cual se relaciona con el crecimiento y actúa como un mensajero químico para ejercer su acción en una célula objetivo. El término "hormona de liberación de la hormona del crecimiento" como se usa en la presente descripción se define como una hormona la cual facilita o estimula la liberación de la hormona del crecimiento. El término "análogo de la hormona de liberación de la hormona del crecimiento" como se usa en la presente descripción se define como una proteína la cual contiene mutaciones y/o eliminaciones de aminoácidos en la forma que ocurre naturalmente de la secuencia de aminoácidos (sin aminoácidos dextro o cíclicos sintéticos), pero que no ocurre naturalmente en la molécula GHRH y que todavía retiene su función para mejorar la síntesis y secreción de la hormona del crecimiento. El término "receptor secretagogo de hormona del crecimiento" (GHS-R) como se usa en la presente descripción, se define como un receptor para un compuesto sintético pequeño el cual está asociado, ya sea directa o indirectamente con la liberación de la hormona del crecimiento de la glándula pituitaria. El término "masa corporal magra" como se usa en la presente descripción se define como la masa del cuerpo de un animal atribuido a un tejido no graso, tal como el músculo. El término "ligando para un receptor secretagogo de hormona del crecimiento" como se usa en la presente descripción se define como cualquier compuesto, el cual actúa como un agonista en un receptor secretagogo de hormona del crecimiento. El ligando puede ocurrir de manera natural o ser sintético. El ligando puede ser un péptido, proteína, azúcar, carbohidrato, lípido, ácido nucleico o una combinación de los mismos. El término "miogónico" como se usa en la presente descripción se refiere específicamente al tejido muscular. El término "recién nacido" tal y como se usa en la presente descripción se refiere a un animal inmediatamente después del nacimiento y todas las etapas subsecuentes de madurez o crecimiento. El término "progenie" como se usa en la presente descripción se refiera a una progenie de un padre, en donde la progenie es un feto antes de nacer, o un recién nacido. El término "parenteral" como se usa en la presente invención se refiere a un mecanismo para la introducción de un material dentro de un animal que no sea a través del canal intestinal. En las modalidades especificas, parenteral incluye subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarraquídeo, intraperitoneal u otros. El término "farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente descripción se refiere a un compuesto en donde la administración de dicho compuesto puede ser tolerada por un mamífero receptor. El término "secretagogo" como se usa en la presente invención se refiere a una molécula natural o sintética que mejora la síntesis o secreción de una molécula regulada de manera descendente (por ejemplo el GHRH es un secretagogo para el GH). El término "somatotrofo" como se usa en la presente descripción se refiere a una célula que produce una hormona del crecimiento. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa en la presente descripción se refiere a la cantidad de un compuesto administrada, en donde dicha cantidad es importante fisiológicamente. Un agente es importante fisiológicamente si su presencia da como resultado un cambio técnico en la fisiología de un animal receptor. Por ejemplo, en el tratamiento de deficiencias del crecimiento, una composición que aumenta el crecimiento sería terapéuticamente efectiva; y en las enfermedades de consunción, una composición la cual disminuyera el índice de pérdida o aumento del crecimiento sería terapéuticamente efectiva. El término "vector" como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier vehículo que administra un ácido nucleico dentro de una célula u organismo. Los ejemplos incluyen los plásmidos, vectores virales, liposomas o Kpidos catiónicos. En una modalidad especifica, los liposomas y lípidos catiónicos son adyuvantes (vehículos) que pueden formar complejos con otros vectores para aumentar la asimilación del plásmido o los vectores virales por la célula objetivo. En una modalidad preferida, el vector comprende un promotor, una secuencia de nucleótidos, que codifican preferentemente una hormona de liberación de la hormona del crecimiento o su análogo, y una región 3' sin traducir. En otra modalidad preferida, el promotor, la secuencia de nucleótidos y la región 3' sin traducir, son enlazados de manera operable para la expresión de una célula eucariótica.

El término "síntomas de consunción" como se usa en la presente descripción se refiere a síntomas y condiciones asociadas con enfermedades de consunción o de consunción crónica. Esta solicitud está relacionada con el asunto materia de la Solicitud de Patente Norteamericana Provisional No. 60/145,624, presentada el 26 de Julio de 1999 y la Solicitud de Patente no Provisional Norteamericana No. 09/624,268, presentada el 24 de Julio del 2000, ambas incorporadas a la presente descripción como referencia. Con el fin de evaluar los efectos en el crecimiento de los vectores miogénicos de terapia genética de la hormona de liberación de la hormona del crecimiento (GHRH), se Inyectaron cerdos hembras preñadas en el último trimestre de la gestación con 10 mg de un vector que contiene un cADN de GHRH (pSP-wt-GHRH) de tipo natural o (pSP-H V-GHRH) mutado. La inyección fue seguida por electroporación. Los cerdos hembras no ¡nyectados/electroporados fueron utilizados como controles. Los lechones del cerdo hembra inyectado con GHRH fueron más grandes al momento del nacimiento (en promedio 1.65 ± 0.06 kg HV-GHRH, p < 0.00002 y 1.46 ± 0.05 kg wt-GHRH, p<0.0014, contra los controles 1.27 ± 0.02 kg). Se realizaron estudios de crianza cruzada. Al destete, los lechones de los cerdos hembra inyectados fueron más grandes que los controles. Los controles de crianza cruzada amamantados por los cerdos hembra inyectados fueron significativamente más grandes que sus compañeros de carnada. La ventaja fue mantenida, y a los 170 días posteriores al nacimiento de la progenie de los cerdos hembra inyectados promediaban 135.7 kg y 129.3 kg para los cerdos hembra inyectados con HV-GHRH y wt-GHRH, respectivamente, mientras que el peso de los controles en promedio era de 125.3 kg. Se realizaron mediciones bioquímicas múltiples en los lechones. Las proteínas totales fueron aumentadas en los lechones de los cerdos hembra inyectados, y los niveles de urea en la sangre fueron disminuidos en todos los puntos del tiempo probados, demostrando ambas constantes un catabolismo mejorado de la proteína. La concentración de creatinina fue normal, una indicación de que la función del rifión era normal. Los niveles de glucosa e insulina fueron normales. Por lo tanto, los lechones nacidos de los cerdos hembra tratados con una terapia genética utilizando una construcción de ADN plásmido que codifican el GR., mostraron un aumento en el patrón de crecimiento sobre los niveles normales hasta por lo menos 170 días posteriores al nacimiento, y son más delgados, mientras que mantienen una homeostasis normal. Este aumento se debe igualmente al aumento de la producción de leche en los cerdos hembra inyectados y la modificación del eje hipotalámico-pituitario de la progenie. Esta prueba del experimento principal demuestra que la transferencia portada por el plásmido podría ser usada para mejorar ciertas características del animal a través de las generaciones, mientras que evita los efectos secundarios relacionados con los tratamientos clásicos de proteínas. En una modalidad de la presente invención, se utiliza una secuencia de ácidos nucleicos en los métodos de la invención, la cual aumenta el crecimiento, mejora el crecimiento, aumenta la eficiencia de conversión del alimento, aumenta la masa corporal magra, aumenta los niveles de IGF-I, aumenta el índice de crecimiento, aumenta la proporción de somatrotopos a otras células productoras de hormonas, demora el nacimiento, y aumenta la producción de leche en una progenie de una hembra. En las modalidades especificas, la secuencia de ácido nucleico es una hormona de liberación de una hormona del crecimiento, una hormona del crecimiento, IGF-I, prolactina o análogos de los mismos. La hembra puede ser una madre, una hembra que nunca ha estado preñada o tenido carnadas anteriormente, o una madre subrogada, tal como impregnada por transplante fetal. Una modalidad preferida de la presente invención utiliza el análogo de la hormona de liberación de la hormona del crecimiento que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 ó SEQ ID NO:8 (wt GHRH). Como se usa en la presente invención, el término "de tipo natural" puede ser la forma endógena del GHRH de cualquier animal, o puede ser una forma ligeramente modificada de la hormona, tal como el GHRH porcino. Un experto en la técnica conoce que el GHRH endógeno tiene 44 aminoácidos, y un grupo de aminoácidos al final, siendo la denominación correcta para esa forma (1-44)NH2-GHRH. En una modalidad especifica, una forma con sólo 40 aminoácidos (que carece de los últimos 4 aminoácidos) es utilizada, la cual tampoco contiene un grupo de amida, al que nos podemos referir como (1 -40)OH-GHRH. Esta forma como se usa en la presente descripción, es a la que también nos podemos referir como tipo natural debido a que no contiene mutaciones internas si es comparada con la secuencia de tipo natural, opuesta a otras formas aquí explicadas (tal como la HV) que tienen mutaciones internas introducidas por mutagénesis dirigida en el sitio. En un aspecto, la técnica conoce que la forma 1-40 y las formas más cortas (por ejemplo, 1 a 32 ó 1 a 29) existen de manera natural en los humanos y otros mamíferos (aún en tipos diferentes de tumores que secretan GHRH), y tiene una actividad comparable con el (1-44)NH2 natural. En una modalidad preferida de la presente invención, se utiliza un GHRH con una estabilidad aumentada sobre el GHRH de tipo natural. En otras modalidades, las especies diferentes de GHRH o análogos de GHRH se encuentran dentro del alcance de la presente invención. En un objeto de la invención, los residuos codificados por el ADN no son modificados después de la traducción, debido a la naturaleza de la administración del ácido nucleico. Las siguientes especies se encuentran dentro del alcance de la presente invención. La Patente Norteamericana No. 4,223,019 describe pentapéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos NH2--Y--Z--E--G--J — COOH, en donde Y es seleccionado del grupo consistente de D-lisina y D-arginina; Z y J son seleccionados independientemente de un grupo que consiste de tirosina, triptofano y fenilalanina; y E y G son seleccionados independientemente de un grupo que contiene D-tirosina, D-triptofano y D-fenilalanina. La Patente Norteamericana No. 4,223,020 describe tetrapóptidos que tienen las siguiente secuencia de aminoácidos NH2--Y--Z--E--G--J — COOH, en donde Y y G son independientemente seleccionados de un grupo consistente de tirosina, triptofano y fenilalanina, y Z y E son seleccionados independientemente de un grupo que consiste de D-tirosina, D-triptofano y D-fenilalanina. La Patente Norteamericana No. 4,223,021 describe pentapéptidos que tienen la siguiente secuencia de aminoácidos NH2--Y--Z— E--G--J — COOH, en donde Y y G son seleccionados independientemente de un grupo que consiste de tirosina, triptofano y fenialanina; Z es seleccionado de un grupo que consiste de glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, hidroxiprolina, serina, treonina, cisteína, y metionina; y E y J son seleccionados independientemente de un grupo que consiste de D-tirosina, D-triptofano y D-fenilalanina. La Patente Norteamericana No. 4,224,316 describe pentapéptidos novedosos que tienen la siguiente secuencia de aminoácidos NH2-Y-Z-E-G-J-COOH, en donde Y y E son seleccionados independientemente de un grupo que consiste de D-tirosina, D-triptofano y D-fenilalanina; Z y G son seleccionados independientemente de un grupo que consiste de tirosina, triptofano y fenilalanina; y J es seleccionado de un grupo consistente de glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, hidroxiprolina, serina, treonina, cisteína, metionina, ácidos aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, arginina, y lisina. La Patente Norteamericana No. 4, 226,857 describe pentapéptidos que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos NH2-Y-Z-E-G-J-COOH, en donde Y y G son seleccionados independientemente de un grupo consistente de tirosina, triptofano y fenilalanina; Z y J son seleccionados independientemente de un grupo que consiste de D-tirosina, D-triptofano y D-fenilalanina; y E es seleccionado de un grupo que consiste de glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, hidroxiprolina, serina, treonina, cistelna, metionina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina e histidina. La Patente Norteamericana No. 4,228,155 describe pentapéptidos que tienen la siguiente secuencia de aminoácidos NH2-Y-Z-E-G-J-COOH, en donde Y es seleccionado de un grupo consistente de tirosina, D-tirosina, triptofano, D-triptofano, fenilalanina y D-fenilalanina; Z y E son seleccionados independientemente de un grupo que consiste de D-tirosina, D-triptofano, y D-fenilalanina; G es seleccionado de un grupo consiste de lisina y arginina; y J es seleccionado de un grupo consistente de glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, hidroxiprolina, cerina, treolina, cisterna y metionina. La Patente Norteamericana No. 4,228,156 describe tripóptidos que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos NH2-Y-Z-E-COOH, en donde Y y Z son independientemente seleccionados de un grupo que consiste de D-tirosina, D-triptofano y D-fenilalanina; y E es seleccionado de un grupo consistente de tirosina, triptofano y fenilalanina. La Patente Norteamericana No. 4,228,158 describe pentapéptidos que tienen la siguiente secuencia de aminoácidos NH2-Y-Z-E-G-J-COOH, en donde Y y G son seleccionados independientemente de un grupo que consiste de tirosina, triptofano y fenilalanina, Z y E son seleccionados independientemente de un grupo que consiste de D-tirosina, D-triptofano y D-fenilalanina; y J es seleccionado de un grupo consistente de aminoácidos naturales y la configuración D de los mismos. La Patente Norteamericana No. 4,833,166 describe un póptido sintético que tiene la fórmula H-Asp-Pro-Val-Asn-lle-Arg-Ala-Phe-Asp-Asp-Val-Leu-Y en donde Y es OH ó NH2, o una sal no toxica de los mismos, y un péptido sintético A que tiene la fórmula H-Val-Glu-Pro-Gly-Ser-Leu-Phe-Leu-Val- Pro-Leu-Pro-Leu-Leu-Pro- Va l-His-Asp-Phe-Val-GIn-GIn-Phe-Ala-Gly-lle-Y en donde Y es OH ó NH2, o una sal no toxica de los mismos. Draghia-Akli et al. (1997) utilizan un fragmento 228-bp de un hGHRH el cual codifica un péptido de señal de 31 aminoácidos y un GHRH humano péptido maduro completo GHRH (1-44)OH (Tyr1 Leu44) descrito originalmente por Mayo et al. (1995). Guillemin et al. (1982) también determina la secuencia del factor de liberación de la hormona del crecimiento pancreático humano (hpGRF). Modalidades adicionales de la presente invención incluyen: (1) un método para mejorar el funcionamiento de crecimiento en una progenie; (2) un método para estimular la producción de hormona del crecimiento en una progenie en un nivel mayor que el asociado con el crecimiento normal; y (3) un método para aumentar el crecimiento en una progenie. Todos estos métodos incluyen el paso de introducción de un vector plásmido en la madre de la progenie durante la gestación de la progenie o durante una preñez previa, en donde dicho vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos tal como una que codifica la SEQ ID NO:1 ó SEQ ID NO:8; y una región 3' sin traducir enlazada de manera operativa secuencialmente en las distancias apropiadas para la expresión funcional. En una modalidad específica adicional, se proporciona un método para estimular la producción de la hormona del crecimiento en una progenie en un nivel mayor que el asociado con el crecimiento normal, comprendiendo el método la introducción en la madre de la progenie durante la gestación de la progenie de una cantidad efectiva de un vector, comprendiendo el vector un promotor, una secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO:1 ó SEQ ID NO:8; y una región 3' sin traducir enlazada de manera operativa secuencialmente en las distancias apropiadas para la expresión funcional. Un nivel mayor que el asociado con el crecimiento normal incluye el crecimiento basal, inherente de un animal con una deficiencia relacionada con el crecimiento, o de un animal con niveles de crecimiento similares a otros animales similares en la población, incluyendo aquellos que no tienen deficiencias relacionadas con el crecimiento. En una modalidad preferida se proporciona un método para aumentar el crecimiento en un animal que comprende, la introducción en el animal de una cantidad efectiva de un vector, comprendiendo dicho vector un promotor; una secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID NO:1 ó SEQ ID NO:8; y una región 3' sin traducir enlazado de manera operativa secuencialmente en las d istancias apropiadas para la expresión funcional . El animal cuyo creci miento es au mentado puede tener o puede no tener una deficiencia de crecimiento. Es u n objeto de la presente invención aumentar el crecimiento y/o el índice de crecimiento de u n an imal , de preferencia de una progenie de u na madre. En una modalidad preferida, el crecimiento y/o Ind ice de crecimiento de un animal es afectado para largos plazos, tales como plazos mayores de unas cuantas semanas o mayores de unos cuantos meses. En una modalidad especifica, esto se logra mediante la administración de la hormona de liberación de la hormona del crecimiento dentro de la madre de la progenie, preferentemente en una forma de ácido nucleico. En una modalidad preferida el ácido nucleico de G H R H es manten ido como un episoma en u na cél ula del músculo. En una modal idad especifica, el aumento en G HRH afecta la glándula pituitaria aumentando el n ú mero de células productoras de hormona del crecimiento y de este modo, cambia su linaje celular. En una modalidad especifica se aumenta la proporción de somatotrofos (cél u las productoras de hormona del crecimiento) en relación con otras células prod uctoras de hormonas en la pituitaria, tales como los corticotrofos , lactotrofos, gonadotrofos, etc. En una modalidad especifica el aumento en la hormona del crecimiento relacionado con el aumento en el número de células productoras de hormona del creci miento , se refleja en un aumento de los niveles de IG F-I . En otra modal idad especifica el aumento en los niveles de hormona del crecimiento está asociado con un aumento en la masa corporal magra y un aumento en el índice de crecimiento de la progenie. En otra modalidad especifica el aumento en la masa corporal magra está relacionada con el aumento en el crecimiento lineal del esqueleto. En una modalidad especifica adicional, se aumenta la eficiencia de conversión del alimento de la progenie. En otra modalidad especifica, el nacimiento de la progenie es demorado, y en una modalidad preferida éste está asociado con un índice de crecimiento aumentado mejorado del feto, En una modalidad preferida el promotor es un promotor miogónico sintético y una región hGH 3' sin traducir se encuentra en la región 3' sin traducir. Sin embargo, la región 3' sin traducir puede ser de cualquier gen natural o sintético. En una modalidad especifica de la presente invención se utilizó un promotor sintético denominado SPc5-12 (L¡ et al., 1999) (SEQ ID NO:6), el cual contiene un elemento de respuesta al suero próxima (SRE) proveniente de la a-actina del esqueleto, sitios MEF-2 múltiples, sitios MEF-1 y sitios de enlace TEF-1, y excede en una gran proporción las potencias de transcripción de los promotores miogónicos naturales. En una modalidad preferida, el promotor utilizado en la invención no tiene el corte o la reducción de la actividad de una manera Importante, por medio de la maquinaria o factores celulares endógenos. Otros elementos, incluyendo los sitios de enlace del factor de trans actuación y los aumentadores pueden ser utilizados de acuerdo con esta modalidad de la invención. En una modalidad alternativa, se utiliza un promotor miogónico natural y un experto en la técnica conoce la forma de obtener dichas secuencias del promotor de las bases de datos que incluyen, la base de datos del GenBank incluyendo el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) o el sitio NCBI PubMed. Un experto en la técnica conoce que estos sitios Web a Nivel Mundial pueden ser utilizados para obtener secuencias o literatura importante relacionada con la presente invención. En una modalidad especifica la región hGH 3' sin traducir (SEQ ID NO:7) es utilizada en un vector de ácido nucleico, tal como un plásmido. En las modalidades especificas dicho vector es seleccionado del grupo consistente de un plásmido, un vector viral, un liposoma, o un lípido catiónico. En modalidades adicionales especificas, dicho vector es introducido en las células miogénicas o en el tejido muscular. En una modalidad especifica adicional el animal es un humano, un animal de mascota, un animal de trabajo o un animal de alimento. Además de la modalidad especifica de introducción de la construcción en el animal por medio del vector plásmido, se pueden utilizar también sistemas administración para la transfección de ácidos nucleicos en animales o sus células conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar métodos diferentes a los métodos virales y no virales. Los expertos en la técnica reconocen que un sistema programado para las formas no virales del ADN o ARN requiere cuatro componentes: 1) el ADN o ARN de interés; 2) una porción que reconoce y se enlaza a un receptor de la superficie celular o antlgeno; 3) una porción de enlace del ADN; y 4) una porción Ktica que hace posible el transporte del complejo desde la superficie celular hasta el citoplasma. Además, los Mposomas y los lípidos catiónicos pueden ser utilizados para administrar las combinaciones genéticas terapéuticas para lograr el mismo efecto. Los vectores virales potenciales incluyen los vectores de expresión derivados debidos, tales como el adenovirus, el vaccinia virus, el herpes virus, el virus de papiloma bovino. Además, pueden ser empleados los vectores del episoma. Otros vectores de ADN y sistemas transportadores son conocidos en la técnica. Un experto en la técnica reconoce que los vectores de expresión derivados de varios plásmidos bacteriales, retrovirus, adenovirus, herpes o de los viruses por vaccinia pueden ser administrados para administrar las secuencias de nucleótidos a un órgano objetivo, tejido o población celular. Los métodos que son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, pueden ser utilizados para construir los vectores recombinantes, los cuales expresan el gen que codifica el análogo de la hormona de liberación de la hormona del crecimiento. La expresión transitoria puede durar por un mes o más, con un vector que no se duplica, y puede ser más larga si los elementos de duplicación apropiados son una parte del sistema del vector. Es un objeto de la presente invención que una sola administración de una hormona de liberación de la hormona del crecimiento sea suficiente para períodos de gestación múltiples y también proporciona una terapia que mejora los funcionamientos de los lechones hasta el peso del mercado, como el crecimiento aumentado, y la composición de cuerpo cambiada. Ácidos Nucleicos 1. Vectores El término "vector" es utilizado para referirnos a una molécula de ácido nucleico transportadora en la cual se puede insertar una secuencia de ácido nucleico para la introducción en una célula en donde el vector puede ser duplicado y la secuencia de ácido nucleico puede ser expresada. Una secuencia de ácido nucleico puede ser "exógena" lo cual significa que es extraña a la célula dentro de la cual está siendo introducido el vector, o que la secuencia es homóloga a una secuencia en la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped, en la cual generalmente no se encuentra la secuencia. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, viruses (bacteriófagos, viruses de animales, viruses de plantas) y cromosomas artificiales (por ejemplo, YACs), Un experto en la técnica estará bien equipado para construir un vector a través de las técnicas recombinantes estándar, las cuales se describen en las publicaciones de Maniatis et al., 1988 y Ausubel et al., 1994, ambas incorporadas a la presente descripción como referencia. El término "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte del producto del gen con capacidad de ser transcrito. En una modalidad especifica, la secuencia de ácido nucleico codifica parte o todo el GHRH. En algunos casos, las secuencias de ARN son traducidas entonces en una proteína, polipéptido o póptido. En otros casos, estas secuencias no son traducidas, por ejemplo, la producción de moléculas antisentido o ribocimas. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de "secuencias de control" las cuales se refieren a las secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente, la traducción de una secuencia de codificación enlazada de manera operable en un organismo huésped particular. Además de las secuencias de control que rigen la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión, pueden contener secuencias de ácido nucleico que sirven para otras funciones también y que se han descrito anteriormente. En una modalidad preferida, el vector de la presente invención es un plásmido el cual comprende un promotor miogónico sintético (especifico del músculo), una secuencia de nucleótidos que codifican una hormona de liberación de la hormona del crecimiento o su análogo, y una región 3' sin traducir. En modalidades alternativas, los vectores son vectores virales, tales como vectores asociados adeno, un adenovirus, o un retrovirus. En modalidades alternativas, pueden ser utilizados el promotor alfa actina del esqueleto, el promotor de cadena ligera de miosina, el promotor citomegalovirus, o el promotor SV 40. En otras modalidades alternativas, se pueden utilizar en el vector hormonas de crecimiento humano, hormona del crecimiento bovino , SV 40 o regiones 3' si n traducir de alfa actina del esqueleto. a . Promotores y Aumentadores U n "promotor" es u na secuencia de control que es una región de una secuencia de ácido nucleico en la cual están controlados el inicio y el índice de transcripción . Puede contener elementos genéticos en los cuales las proteínas reg u ladoras y las moléculas se pueden en lazar, tales como la poli merasa de ARN y otros factores de transcripción . Las frases "colocado operativamente" , "enlazado operativamente", "bajo control", y "bajo control de transcripción" significan q ue un promotor se encuentra en una localización y/u orientación funciona l correcta en relación con la secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio de la transcri pción y/o expresión de dicha secuencia. U n promotor puede ser, o no, utilizado en conjunto con un "au mentador" el cual se refiere a u na secuencia reg uladora de actuación cis, i nvolucrada en la activación de la transcripción de una secuencia de ácido n ucleico. U n promotor puede ser u na de las secuencias que codifican natu ralmente local izadas hacia arriba del segmento de cod ificación y/o exón . A dicho promotor nos podemos referir como un "endógeno". De un modo similar, un aumentador puede ser uno asociado naturalmente con una secuencia de ácido nucleico, localizado ya sea abajo o arriba de dicha secuencia . Alternativamente, se ganarán ciertas ventajas colocando el segmento codificador de ácido nucleico bajo el control de un promotor heterólogo o recombinante, el cual se refiere a un promotor que no está asociado normalmente con una secuencia de ácido nucleico en su ambiente natural. Un aumentador recombinante o heterólogo se refiere también a un aumentador que no está asociado normalmente con una secuencia de ácido nucleico en su ambiente natural. Dichos promotores aumentadores pueden incluir promotores aumentadores de otros genes, y promotores o aumentadores aislados de cualquier otra célula procariótica, viral o eucariótica, y promotores o aumentadores que no "ocurren naturalmente", por ejemplo, que contiene elementos diferentes de regiones reguladoras de transcripción diferentes y/o mutaciones que alteran la expresión. Además de producir sintéticamente las secuencias de ácido nucleico de los promotores y aumentadores, las secuencias pueden ser producidas utilizando la clonación recombinante y/o la tecnología de amplificación de ácido nucleico, incluyendo PCR™, en relación con las composiciones aquí descritas (ver la Patente Norteamericana No. 4,683,202, la Patente Norteamericana No. 5,928,906, cada una de ellas incorporada a la presente descripción como referencia). Además, están contempladas, las secuencias de control que dirigen la transcripción y/o la expresión de las secuencias dentro de organelas no nucleares, tales como la mitocondria, la cloroplastos y similares, los cuales pueden ser utilizados también. Naturalmente, será importante emplear un promotor y/o aumentador que dirija de manera efectiva la expresión del segmento de ADN en el tipo de célula, organela y organismo seleccionado para la expresión. Aquellos expertos en la técnica de la biología molecular, generalmente conocen el uso de los promotores, aumentadores, y las combinaciones de tipo celular para la expresión de la proteína, por ejemplo, consultar Sambrook et al. (1989), incorporado a la presente descripción como referencia. Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos del tejido, inducibles y/o bajo las condiciones apropiadas para dirigir un alto nivel de expresión del segmento de ADN introducido tal, que sea ventajoso en una producción de larga escala de proteínas y/o póptidos recombinantes. El promotor puede ser heterólogo o endógeno. En una modalidad especifica, el promotor es un promotor miogénico sintético, tal y como lo describe L¡ et al. (1999). La identidad de los promotores o elementos específicos del tejido, así como los ensayos para caracterizar su actividad, son bien conocidos para los expertos en la técnica. Los ejemplos de dichas regiones incluyen el gen LIMK2 humano (Nomoto et al. 1999), el gen 2 de receptor de somatostatina (Kraus et al. 1998), el gen de enlace de ácido retinoico epididimal múrido (Lareyre et al., 1999), el CD4 humano (Zhao-Emonet et al., 1998) el colágeno alfa2 (XI) de ratón (Tsumaki, er al., 1998), el gen receptor D1A de dopamina (Lee, et al., 1997), el factor II de crecimiento similar a la insulina (Wu et al., 1997), la molécula 1 de adhesión celular endotelial de plaquetas humanas (Almendro et al., 1996). b. Inicio de las Señales y los Sitios de Enlace Internos del Ribosoma. También puede ser requerida una señal de iniciación especifica para la traducción eficiente de las secuencias de codificación. Estas señales incluyen un codón de inicio ATG o secuencias adyacentes. Se pueden necesitar las señales de control de traducción exógena, incluyendo el codón de iniciación ATG,. Un experto en la técnica tendría la capacidad de determinar esto fácilmente y proporcionar las señales necesarias. Es bien conocido que el codón de inicio puede ser "en el cuadro" dentro del cuadro de lectura de la secuencia codificadora deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Las señales de control de traducción exógena y los codones de iniciación pueden ser, ya sea naturales o sintéticos. La eficiencia de la expresión puede ser mejorada mediante la inclusión de elementos aumentadores de transcripción apropiados. En ciertas modalidades de la invención, el uso de los elementos de los sitios de entrada del ribosoma internos (IRES) son utilizados para crear genes múltiples, o policistrónicos, mensajes. Los elementos IRES pueden derivar el modelo de exploración del ribosoma de la traducción dependiente del Cap metilado 5' e iniciar la traducción en los sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Han sido descritos los elementos IRES de dos miembros de la familia picornavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988), así como un IRES del mensaje mamífero (Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos IRES pueden ser enlazados a marcos heterológos de lectura abierta. Los marcos de lectura abierta múltiples pueden ser transcritos juntos, separado cada uno por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierta es accesible a los ribosomas para la traducción eficiente. Los genes múltiples pueden ser expresados de manera eficiente utilizando un solo promotor/aumentador para transcribir un solo mensaje (ver la Patente Norteamericana No. 5,925,565 y la Patente Norteamericana No. 5,935,819, ambas incorporadas a la presente descripción como referencia). c. Sitios de Clonación Múltiples Los vectores pueden incluir sitios de clonación múltiple (MCS), los cuales son una región de ácido nucleico que contiene sitios de enzima de restricción múltiple, y cada uno de los cuales puede ser utilizado en conjunto con la tecnología recombinante estándar para digerir el vector, (ver Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, y Cocea, 1997, incorporados a la presente descripción como referencia). El término "digestión de la enzima de restricción" se refiere a la disosiación catalítica de la molécula de ácido nucleico con una enzima que funciona solamente en localizaciones especificas en una molécula de ácido nucleico. Muchas de estas enzimas de restricción se encuentran en el mercado. El uso de dichas enzimas es ampliamente entendido por aquellos expertos en la técnica. Con frecuencia, un vector es llnealizado o fragmentado utilizando una enzima que se corta dentro del MCS para hacer posible que las secuencias exógenas sean ligadas al vector. El "ligado" se refiere al proceso de formación de los enlaces de fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico, los cuales pueden estar, o no, contiguos entre ellos. Las técnicas que comprenden las enzimas de restricción en las reacciones de ligado son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica de la tecnología recombinante. d. Sitios de Empalme La mayor parte de las moléculas de ARN eucarióticas transcritas pasarán por un empalme del ARN para remover los intrones de los transcritos primarios. Los vectores que contienen secuencias eucarióticas genómicas pueden requerir un donante y/o un sitio de empalme aceptador para asegurar el procesamiento apropiado del trascrito de la proteína de expresión (ver Chandier et al., 1997, incorporado a la presente descripción como referencia), e. Señales de Poliadenilación En la expresión, uno generalmente incluirá una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación correcta del trascrito. La naturaleza de la señal de poliadenilación no se considera que sea crucial para la práctica exitosa de la invención, y/o se puede utilizar cualquiera de dichas secuencias. Las modalidades preferidas incluyen la señal de poliadenilación SV 40 y/o la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina o humana, conveniente y/o funcional o que se sabe que funciona bien en varias células objetivo. También está contemplado como un elemento del cassette de expresión, un sitio de terminación de transcripción. Estos elementos pueden servir para mejorar los niveles del mensaje y/o minimizar la lectura a través del cassette en otras secuencias. f. Orígenes de la Duplicación Con el objeto de propagar un vector en una célula huésped, éste puede contener uno o más orígenes de sitios de duplicación (frecuentemente denominados "orí"), el cual es una secuencia de ácido nucleico especifica en la cual se inicia la duplicación. Alternativamente, se puede emplear una secuencia de duplicación autónoma (ARS) si la célula huésped es una levadura. g. Marcadores Seleccionares y Clasificables En ciertas modalidades de la invención, las células contienen construcciones de ácido nucleico de la presente invención, una célula puede ser identificada in vitro o in vivo, incluyendo un marcador en el vector de expresión. Dichos marcadores conferirían un cambio identifícable a la célula, permitiendo la identificación fácil de las células que contiene el vector de expresión. Generalmente, un marcador que se puede seleccionar es uno que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador que se puede seleccionar positivo es aquel en el cual la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador que se puede seleccionar negativo, es uno el cual su presencia evita su selección. Un ejemplo de un marcador que se puede seleccionar positivo, es un marcador de resistencia al fármaco. Generalmente, la inclusión de un marcador de selección del fármaco ayuda en la clonación e identificación de los transformantes, por ejemplo, los genes que confieren resistencia a la neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina, e histidinol son marcadores selecciónateles útiles. Además, también están contemplados los marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de los transformantes basada en la implementación de condiciones, incluyendo los marcadores que se pueden clasificar, tales como el GFP, cuya base es un análisis colorimétrico, . Alternativamente, pueden ser utilizadas las enzimas que se pueden clasificar, tales como la cinasa de timidina, el virus del herpes simple (tk) o la acetiltransferasa de cloramfenicol (CAT). Un experto en la técnica también conocería la manera de emplear los marcadores inmunológicos, posiblemente en conjunto con el análisis de FACS. El marcador utilizado no se considera que sea importante, siempre que tenga la capacidad de ser expresado simultáneamente con el ácido nucleico que codifica el producto del gen. Los ejemplos adicionales de los marcadores que se pueden seleccionar o clasificar son bien conocidos para un experto en la técnica. 2. Células Huésped Como se usa en la presente descripción, el término "célula", "línea celular", y "cultivo celular" pueden ser utilizados de manera intercambiable. Todos estos términos incluyen también su progenie, la cual son todas y cada una de las generaciones posteriores. Debe quedar entendido que puede no ser idéntica toda la progenie, debido a mutaciones deliberadas o accidentales. En el contexto de la expresión de la secuencia de ácido nucleico heterólogo, la "célula huésped" se refiere a una célula procariótica o eucariótica e incluye cualquier organismo transformable que tenga la capacidad de duplicar un vector y/o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula huésped puede ser, y ha sido, utilizada como un receptor para los vectores. Una célula huésped puede ser "transfectada" o "transformada", lo cual se refiere a un proceso por medio del cual el ácido nucleico exógeno es transferido o introducido dentro de la célula huésped. Una célula transformada incluye las células sujeto primaria y su progenie. Las células huésped pueden ser derivadas de procariotes o eucariotes, dependiendo de si el resultado deseado es la duplicación del vector o la expresión de parte o todas las secuencias de ácido nucleico codificadas por el vector, Están disponibles líneas celulares y cultivos numerosos para su uso como células huésped, y pueden ser obtenidas a través del American Type Culture Collection (ATCC), la cual es una organización que sirve como un archivo para los cultivos vivos y materiales genéticos (www.atcc.org). Un huésped apropiado puede ser determinado por un experto en la técnica, basado en la estructura del vector y el resultado deseado. Por ejemplo, un plásmido o cósmido puede ser introducido en una célula huésped procariótica para la duplicación de muchos vectores. Las células bacteriales utilizadas como células huésped para la duplicación de vectores y/o la expresión incluyen las células DH5a, JM 109, y KC8, asi como un número de células huésped bacteriales que se consiguen en el mercado tales como SURE® células competentes y SOLOPACKa Células de Oro (STRATAGENE®, La Jolla). Alternativamente, las células bacteriales tales como la célula LE392 de E. coli podrían ser usadas como células huésped para los viruses de los fagos. Los ejemplos de las células huésped eucarióticas para la duplicación y/o expresión de un vector incluyen HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos, y PC12. Muchas células huésped de diferentes tipos celulares y organismos se pueden conseguir y serían conocidas para aquellos expertos en la técnica. De un modo similar, se puede utilizar un vector viral en conjunto con, ya sea una sola célula huésped eucariótica o procariótica, particularmente una que permita la duplicación o expresión del vector. Algunos vectores pueden emplear secuencias de control para permitir que sean duplicados y/o expresados, tanto en células procarióticas como eucarióticas. Un experto en la técnica podría entender además las condiciones bajo las cuales incubar todas las células huésped anteriormente descritas, con el fin de mantenerlas y para permitir la duplicación de un vector. También son entendidas y conocidas las técnicas y condiciones que permitirían la producción en larga escala de los vectores, así como la producción de los ácidos nucleicos codificados por los vectores y sus polipéptidos, proteínas o póptidos. 3. Sistemas de Expresión Existen numerosos sistemas de expresión que comprenden al menos parte o todas las composiciones explicadas anteriormente. Los sistemas basados en procariotes y/o eucariotes pueden ser empleados para utilizarlos con la presente invención para producir secuencias de ácido nucleico o sus polipéptidos, proteínas y péptidos. Muchos de dichos sistemas se encuentran disponibles ampliamente en el mercado. El sistema de baculovirus/cólula de insecto puede producir un alto nivel de la proteína de un segmento de ácido nucleico heterólogo, tal y como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,871,986, 4,879,236, ambas incorporadas a la presente descripción como referencia y los cuales pueden ser comprados, por ejemplo, bajo el nombre de MAXBAC® 2.0 en INVITROGEN®, y BACPACK™ SISTEMA DE EXPRESIÓN DE BACULOVIRUS DE CLONTECH®. Otros ejemplos de los sistemas de expresión incluyen el Sistema de Expresión del Mamífero Inducible de CONTROL COMPLETO DE STRATAGENE®, el cual comprende un receptor inducible de ecdisona sintético o su sistema de expresión pET, un Sistema de Expresión de E. coli. Otro ejemplo de un sistema de expresión inducible, se consigue en INVITROGEN®1 el cual lleva el sistema T-REX™ (expresión regulada por tetraciclina), un sistema de expresión de mamífero inducible que utiliza un promotor CMV de longitud completa. El INVITROGEN® también proporciona un sistema de expresión de levadura llamado el sistema de expresión Pichia methanolica, el cual está diseñado para la producción de alto nivel de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica de Pichia methanolica. Un experto en la técnica sabrá la forma de expresar un vector, tal como una construcción de expresión, para producir una secuencia de ácido nucleico o sus polipóptidos, proteínas o póptidos. Mutagénesis En donde es empleada, la mutagénesis, será llevada a cabo por una variedad de procedimientos mutagónicos estándar. La mutación es el proceso por medio del cual ocurren los cambios en la cantidad o estructura de un organismo. La mutación puede comprender la modificación de la secuencia de nucleótidos de un solo gen, lotes de genes, o un cromosoma completo. Los cambios en los genes simples pueden ser la consecuencia de las mutaciones de punto las cuales comprenden la eliminación, adición o substitución de una sola base de nucleótidos dentro de una secuencia de ADN, o pueden ser la secuencia de cambios que comprende la inserción o eliminación de cantidades grandes de nucleótidos. Las mutaciones se pueden originar de manera espontánea como el resultado de eventos tales como errores en la fidelidad de la duplicación del ADN, o el movimiento de los elementos genéticos que se pueden transportar (transposons) dentro del genoma. Las mutaciones son inducidas también después de la exposición a mutagenes físicos o químicos. Dichos agentes que inducen la mutación incluyen radiaciones de ionización, luz ultravioleta y una adaptación diversa de químicos, tales como agentes de alquilación e hidrocarburos aromáticos policíclicos, todos ellos con capacidad de interactuar ya sea directa o indirectamente (generalmente después de alguna biotransformación metabólica) con los ácidos nucleicos. Las lesiones en el ADN inducidas por dichos agentes ambientales puede conducir a las modificaciones de las secuencias básicas cuando el ADN afectado es duplicado o reparado y por lo tanto, a una mutación. Las mutaciones también pueden ser dirigidas en el sitio a través del uso de métodos de fijación de objetivos particulares. Mutagénesis Dirigida en el Sitio La mutagénesis especifica del sitio guiada a la estructura representa una herramienta poderosa para la disección y el diseño de las interacciones del ligando de la protetna. (Wells, 1996, Braisted et al., 1996). La técnica proporciona la preparación y la prueba de las variantes de la secuencia introduciendo uno o más cambios de la secuencia de nucleótidos en el ADN seleccionado. La mutagénesis especifica del sitio utiliza secuencias de oligonucleótidos especificas, las cuales codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes sin modificar. De este modo, una secuencia cebadora está provista con un tamaño y complejidad suficientes para formar un duplicado estable en ambos lados de la unión de eliminación que está siendo atravesada. Un cebador de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos de longitud es el preferido, con aproximadamente de 5 a 10 residuos en ambos lados de la unión de la secuencia que está siendo alterada. La técnica emplea generalmente un vector bacteriófago que existe, tanto en una forma de un solo hilo como de hilo doble. Los vectores útiles en la mutagénesis dirigida en el sitio incluyen vectores tales como el fago M13. Estos vectores de fago se encuentran en el mercado y su uso es generalmente conocido para aquellos expertos en la técnica. Los plásmidos de hilo doble son también empleados rutinariamente en la mutagénesis dirigida en el sitio, éstos eliminan el paso de la transferencia del gen de interés de un fago a un plásmido. En general, primero se obtiene un vector de un solo hilo, y se fusiona con un vector de hilo doble, el cual se incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica la protelna o el elemento genético deseados. El cebador de oligonucleótido que porta la secuencia mutada deseada, preparado sintéticamente luego es recocido con una preparación de ADN de un solo hilo, tomando en cuenta el grado de disparidad cuando se seleccionan las condiciones de hibridación. El producto hibridado es sometido a las enzimas de polimerización de ADN, tales como la polimerasa I de E. coli (fragmento Klenow) con el objeto de completar la síntesis de un hilo que porta la mutación. Por lo tanto, se forma un heterodúplex, en donde un hilo codifica la secuencia original sin mutar, y el segundo hilo porta la mutación deseada. Este vector heterodúplex es entonces utilizado para transformar las células huésped apropiadas tales como células de E. coli y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que portan la distribución de la secuencia mutada. La información extensa sobre el significado funcional y el contenido de la información de un residuo de proteínas determinado, puede ser obtenida de una manera mejor mediante la mutagénesis por saturación en la cual se examinan todas las 19 substituciones de aminoácidos. La desventaja de este método es que la logística de la mutación de la saturación de residuos múltiples es desalentadora (Warren et al., 1996 Brown et al., 1995; Short et al., 1995; Wong et al., 1996; Hilton et al., 1996). Se deben de estudiar cientos y posiblemente hasta miles de mutaciones especificas del sitio. Sin embargo, las técnicas mejoradas hacen mucho más directa la producción de la selección rápida de los mutantes. Ver también las Patentes Norteamericanas Nos. 5,798,208 y 5,830,650 para una descripción de la mutagénesis "sobre la marcha". Otros métodos de mutagénesis dirigida en el sitio se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,220,007; 5,284,760; 5,354,670; 5,366,878; 5,389,514; 5,635,377; y 5,789,166. Dosificación y Formulación La composición (ingredientes activos: en este caso, los vectores que comprenden un promotor; una secuencia de nucleótidos que codifican la SEQ ID NO:1 ó SEQ ID NO:8: y una región 3' sin traducir enlazada de manera operativa y secuencialmente en las distancias apropiadas para la expresión funcional) de esta invención pueden ser formulada y administrada para afectar una variedad de condiciones de deficiencia de crecimiento por cualesquiera medios que producen el contacto del ingrediente activo con el sitio de acción de los agentes en el cuerpo de un animal. La composición de la presente invención es definida como un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el compuesto de la invención, la cual es un análogo de la secuencia de aminoácidos aquí descrita. Dicha composición es administrada en una cantidad suficiente para generar una cantidad terapéuticamente efectiva de dicho compuesto. Un experto en la técnica reconoce que el término "administrado" ? "introducido" puede ser utilizado de manera intercambiable. Los compuestos pueden ser administrados por cualesquiera medios convencionales disponibles para utilizarlos en conjunto con productos farmacéuticos, ya sea como ingredientes activos o terapéuticos individuales o en combinación de ingredientes activos terapéuticos. En una modalidad preferida, el ingrediente activo es administrado solo o en un regulador, tal como PBS, pero puede ser administrado con un vehículo farmacéutico seleccionado en base a la ruta de administración seleccionada y la práctica farmacéutica estándar. Dichas composiciones farmacéuticas pueden ser utilizadas para propósitos terapéuticos o de diagnostico en medicina clínica, tanto humana como veterinaria. Por ejemplo, son útiles en el tratamiento de los padecimientos relacionados con el crecimiento, tales como enanismo hipopituitario, que es el resultado de anormalidades en la producción de la hormona del crecimiento. Además, pueden ser usados también para estimular el crecimiento o mejorar la eficiencia de conversión de los alimentos en los animales criados para la producción de carne, para mejorar la producción de leche, y para estimular la producción de huevo. La dosificación administrada será una cantidad terapéuticamente efectiva del ingrediente activo y por supuesto , variará dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del ingred iente activo particular y su modo y ruta de administración ; el tipo de ani mal; la edad del receptor; el sexo del receptor; la condición reprod uctiva del receptor; la salud del receptor; el peso del receptor; la naturaleza y el grado de los síntomas; el tipo de trata miento concurrente ; la frecuencia del tratamiento; y el efecto deseado. Las dosificaciones apropiadas de los vectores de la invención que van a ser administrados, variarán a lgo dependiendo del sujeto individual y de otros parámetros . El practicante experimentado podrá determinar las dosificaciones adecuadas basado en los niveles de circulación conocidos de la hormona del crecimiento asociada con el crecimiento normal y la actividad de liberación de la hormona del crecimiento del vector. Como es bien conocido en la técn ica , el tratamiento de una hembra o madre para produci r ani males más grandes, necesitará dosis variables de individuo a individ uo , depend iendo del grado de los n iveles requeridos del au mento de la producción de la hormona del creci miento. Por lo tanto, se proporciona, de acuerdo con la presente i nvención , un método para au mentar el creci miento de una progenie la cual comprende la administración a una hembra o madre de la progenie de u na cantidad del análogo de la presente invención , la cual sea suficiente para aumentar la producción de la hormona del creci miento a n iveles mayores a los n iveles asociados con el crecimiento normal. Los niveles de hormona del crecimiento varían considerablemente entre los individuos y, para cualquier individuo determinado, los niveles de la hormona del crecimiento en circulación varía considerablemente durante el curso de un día. También se proporciona un método para aumentar el índice de crecimiento en animales, administrando una cantidad suficiente del análogo GHRH de la invención para estimular la producción de la hormona del crecimiento en un nivel mayor que el nivel asociado con el crecimiento normal. Administración de Terapia Genética En donde sea apropiado, los vectores de terapia genética pueden ser formulados en preparaciones en formas sólida, semisólida, líquida o gaseosa, por los medios conocidos en la técnica, para su ruta de administración respectiva, los medios conocidos en la técnica pueden ser utilizados para evitar la liberación y absorción de la composición hasta que alcanza al órgano objetivo, o para asegurar la liberación programada de la composición. Deberá ser empleada una forma farmacéuticamente aceptable que no afecte las composiciones de la presente invención. En las formas de dosificación farmacéutica, las composiciones pueden ser utilizadas solas o en una asociación apropiada, así como en combinación con otros compuestos farmacéuticamente activos. Por consiguiente, la composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrada por diferentes rutas y a diferentes sitios del cuerpo de un animal, para lograr un efecto particular (ver por ejemplo la publicación de Rosenfeld et al., en (1991); Rosenfeld et al., (1991a); Jaffe et al., (1992). Un experto en la técnica reconocerá que aunque se puede usar más de una ruta de administración, una ruta particular puede proporcionar una reacción más efectiva e inmediata que otra ruta. La administración local sistémica puede ser lograda mediante la administración que comprende la aplicación o instilación de la formulación dentro de las cavidades del cuerpo, inhalación o insuflación de un aerosol, o por medio de la introducción parenteral, que comprende la administración intramuscular, intravenosa, peritoneal, subcutánea, intradérmica, así como la administración tópica. Una aspecto en la técnica reconoce que se pueden utilizar diferentes métodos de administración para administrar un vector dentro de una célula. Los ejemplos incluyen: (1) métodos que utilizan medios físicos, tales como la electroporación (electricidad), una pistola genética (fuerza física) o la aplicación de grandes volúmenes de un líquido (presión); y (2) un método en donde el vector forma un complejo con otra entidad, tal como un liposoma, o una molécula trasportadora. Por consiguiente, la presente invención proporciona una método para transferir un gen terapéutico a un huésped, el cual comprende la administración del vector de la presente invención, preferentemente como parte de una composición, utilizando cualquiera de las rutas de administración anteriormente mencionadas o rutas alternativas conocidas por aquellos expertos en la tócnica, y apropiada para una aplicación particu lar. La transferencia genética efectiva de un vector a u na célu la huésped de acuerdo con la presente invención puede ser monitoreada en términos de un efecto terapéutico (por ejemplo , el al ivio de u n síntoma asociado con la enfermedad particular q ue está siendo tratada ), o, además, por evidencia del gen transferido o la expresión del gen dentro del h uésped (por ejemplo, utilizando una reacción de cadena de pol imerasa , en conjunto con la elaboración de secuencias, las H ibridaciones de Norte o Sur, o los ensayos de trascripción para detectar el ácido nucleico en las célu las huésped , o utilizando anál isis de i n munoti nción , la protección portada por el anticuerpo , estudios de mARN o la vida media de la proteína o ensayos particularizados para detectar proteína o el pol ipóptido codificado por el ácido nucleico transferido, o impactando en un nivel o una función de vida a d icha transferencia). Estos métodos aqu í descritos de ninguna manera son i nclusivos todos , y aquellos expertos en la técn ica podrán apreciar métodos adicionales que se pueden adaptar para una aplicación específica. Además, la cantidad efectiva de las composiciones puede ser aproximada más a través de la analogía con compuestos conocidos para ejercer el efecto deseado. Adicionalmente, la dosis real y el prog rama pueden variar dependiendo si las composiciones son administradas en combi nación con otras composiciones farmacéuticas , o depend iendo de d iferencias interindividuales de las farmacoci néticas, la disposición de los fármacos y el metabolismo. De un modo similar, las cantidades pueden variar en las aplicaciones in vitro dependiendo de la linea celular particular utilizada (por ejemplo, basado en el número de receptores del vector presentes en la superficie de la célula o la capacidad para duplicarse en dicha línea celular, del vector particular empleado para la transferencia genética). Además, la cantidad del vector que va a ser agregada por célula variará probablemente con la longitud y estabilidad del gen terapéutico insertado en el vector, así como la naturaleza de la secuencia y es particularmente un parámetro que necesita ser determinado de manera empírica, y puede ser alterado debido a factores que no son inherentes a los métodos de la presente invención (por ejemplo, el costo asociado con la síntesis). Un experto en la técnica puede hacer fácilmente cualesquiera ajustes necesarios de acuerdo con las exigencias de la situación particular. Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ejemplo, y no pretenden limitar el alcance de la invención de manera alguna. EJEMPLO 1 Los análogos GHRH super-activos aumentan la actividad del secretagogo GH y la estabilidad El GHRH tiene una vida media relativamente corta de aproximadamente 12 minutos en el sistema circulatorio, tanto de humanos (Forman et al., 1984), como de cerdos. Empleando los análogos de GHRH que prolongan su vida media biológica y/o mejoran su actividad secretagoga de GH, se logra una secreción aumentada de GH. Los mutantes de GHRH fueron generados mediante mutagenósis dirigida en el sitio. El Gly15 fue substituido por Ala15 para aumentar la conformación a-helicoidal y la estructura anfifílica para disminuir la disociación por las enzimas similares a tripsina (Su et al., 1991). Los análogos de GHRH con substituciones Ala15 muestran una afinidad mayor de 4 a 5 veces para el receptor GHRH (Campbell et al., 1991). Para reducir la pérdida de la actividad biológica debida a la oxidación del Met, con formas ligeramente más estables utilizando las moléculas con una terminal-COOH libre (Cúbica et al., 1989), se realizó la substitución de et27 y Ser28 por Leu27 y Asn28. Por lo tanto, se formó un muíante de substitución de aminoácidos triple indicado como GHRH-15/27/28. La peptidasa dipeptidilo IV es la encima degradadora principal del gen GHRH en el suero (Walter et al., 1980; Martín et al., 1993). Se crearon substratos de dipeptidasa más pobres tomando el GHRH 15/27/28 y luego reemplazando Ile2 por Ala2 (GHRH-TI), o por Val2 (GHRH-TV), o convirtiendo Tyr1 y Ala2 en His1 y Val2 [GHRH-HV (FIG.1A); HIV2A15L27N28]. EJEMPLO 2 Construcciones de ADN En una modalidad específica, se utilizó en la presente invención un plásmido de la SEQ ID NO:9 (pSPc5-12-HV-GHRH), en otra modalidad específica, se utiliza, un vector plásmido en donde el plásmido comprende una estructura de pVC0289 (SEQ ID NO:10); un promotor, tal como de la SEQ ID NO:6; un cADN de GHRH, tal como HV-GHRH porcino (el cADN de HV-GHRH mutado ) (SEQ ID NO:11); y un UTR 3', tal como el GH humano (SEQ ID NO:7). Para probar la potencia biológica del cADN de GHRH porcino mutado, se diseñaron vectores plásmidos que tenían una capacidad de dirigir el nivel más alto de la expresión del gen específico del músculo del esqueleto por medio de un promotor de músculo sintético recientemente descrito SPc5-12, el cual contiene un elemento de respuesta del suero próxima a la a-actina del esqueleto, múltiples sitios MEF-2, sitios MEF-1, y sitios de enlace TEF-1 (Li et al, 1999). La fracción 228-bp del GHRH porcino, que codifica el póptido de señal de 31 aminoácidos y el péptido maduro completo del GHRH (Tyrl-Gly40) porcino y/o los mutantes de GHRH seguidos por la región 3' sin traducir del cADN del GH humano, fueron incorporados en los vectores de expresión miogónicos de GHRH por medios bien conocidos en la técnica. El plásmido pSPc5-12 contiene un fragmento 360bp Sacl/BamHI del promotor sintético SPc5-12 (Li et al., 1999) en los sitios Sacl/BamHI de la estructura Psk-GHRH (Draghia-Akli et al., 1997). Se obtuvieron cADNs del GHRH porcino del tipo natural y mutados mediante la mutagónesis dirigida en el sitio del cADN del GHRH humano, utilizando el equipo del Sistema de Mutagónesis in vitro de Sitios II Alterados (Promega; Madison, Wl). El cADN del GHRH humano fue subclonado como un fragmento BamHI-Hind III dentro de los sitios correspondientes del vector Promega pALTER y la mutagónesis se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cADN porcino de tipo natural fue obtenido a partir del cADN humano cambiando los aminoácidos humanos 34 y 38, utilizando el cebador de la SEQ ID NO:2: 5'-AGGCAGCAGGGAGAGAGGAACCAAGAGCAAGGAGCATA ATGACTGC-AG-3'. Las mutaciones de HV porcinas se hicieron con el cebador de la SEQ ID NO:3: 5'-ACCCTCAGGATGCGGCGGCACGTAGATGCCATCTTCACCAAC-3'. La mutación 15Ala porcina se hizo con el cebador de la SEQ ID NO:4: 5'-CGGAAGGTGCTGGCCCAGCTGTCCGCC-3'. La mutación 27Leu28A se hizo con el cebador de la SEQ ID NO:5: 5'-CTGCTCCAGGACATCCTGAACAGGCAGCAGGGAGAG-3', Las siguientes mutagénesis de los clones resultantes se formó en secuencias para confirmar la exactitud y fueron subclonados posteriormente en los sitios BamHI/Hind III del pSK-GHRH descrito en este ejemplo, por métodos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. EJEMPLO 3 Cultivo celular y transfecclón Se llevaron a cabo experimentos, tanto en un cultivo de la pituitaria anterior de cerdos, como en cultivos del mioblasto primario de los pollos con un éxito Igual. Sin embargo, las cifras demuestran datos generados con los cultivos de la pituitaria anterior de cerdo. Los cultivos de mioblasto de pollo primario fueron obtenidos de la manera siguiente. Se cultivaron los tejidos embrionarios del pollo, disectados libres de piel y cartílago y disociados mecánicamente. La suspensión celular fue pasada a través de estopilla y papel para lentes, y colocados en placas en una densidad de 1 x 108 a 2 x 108/ platos de cultivo de plástico de 100 mm. Las poblaciones celulares que permanecieron en suspensión se colocaron en placas en una densidad de 2 x 106 a 3 x 106 células/platos de plástico de 100 mm recubiertos con colágeno, y fueron incubados a una temperatura de 37°C en un ambiente de C02 al 5%. Las células entonces fueron incubadas 24 horas antes de la transfección a una densidad de 1.5 x 10e/plato de 100 mm en un Medio Esencial Mínimo (MEM) suplementados con un Suero de Caballo Inactivado al 10% Callente (HIHS), extracto de embrión de pollo al 5% (CEE) (Gibco BRL; Grand Island, N.Y), y gentamicina. Para detalles adicionales, consultar las publicaciones de Draghia-Aklin et al., 1997 y Bergsma et al., 1986 el cultivo de pituitaria anterior de cerdo fue obtenido esencialmente tal y como lo describieron (Tañer et al., 1990). Brevemente, el tejido de pituitaria fue disociado bajo condiciones enzimáticas, colocado en platos de plástico por un tiempo suficiente para permitir el enlace. Entonces las células fueron enjuagadas y expuestas al medio de incubación antes de los experimentos. Para detalles adicionales consultar Tanner et al. (1990). Las células fueron transfectadas con 4pg de un plásmido por plato de 100 mm, utilizando lipofectamina, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la transfección, el medio fue cambiado por MEM, el cual contenía HIHS al 2% y CEE al 2% para permitir que se diferenciaran las células. El medio y las células fueron cultivados 72 horas posteriores a la diferenciación. La eficiencia de la transfección fue estimada por medio de la histoquímica de ß-galactosidasa de las placas de control que eran del 10%. Un día antes de la recolección, las células fueron lavadas dos veces en Solución Salina de Hank's Balanceada (HBSS) y el medio fue cambiado por MEM, albúmina de suero bovino al 0.1%. el medio acondicionado fue tratado agregando el 0.25 de volumen de ácido trifluoroacético al 1%, y 1mM defenilmetilsulfonilfluoruro, congelado a una temperatura de -80°C, liofilizado, purificado en una columna C-18 Sep-Columns (Península Laboratories, Belmont, CA), se volvió a liofilizar y se utilizó en los radioinmunoensayos y se suspendió nuevamente en un medio acondicionado para el cultivo de la pituitaria anterior primaria de cerdo. EJEMPLO 4 Los análogos GHRH superactivos aumentan la actividad secretagoga del GH y la estabilidad Se transfectaron mioblastos del esqueleto igual que en el ejemplo 3, siendo purificadas cada una de las construcciones y las porciones de GHRH a partir de las células del medio de cultivo acondicionado y las células fueron probadas para determinar su secreción de hormona del crecimiento en los cultivos de célula pituitaria anterior porcina. Como se muestra en la figura 1B, los medios recolectados después de 24 horas y cuantificados por el radioinmunoensayo de GH porcino específico, mostraron que las ganancias modestas en la secreción de GH que ascienden desde aproximadamente el 20% hasta el 50% para las especies de GHRH modificadas (GH15/27/28; GHRH-TI; GHRH-TV), sobre el GHRH porcino de tipo natural. Solamente uno de los cuatro mutantes, el GHRH-HV, tuvo un aumento substancial en la actividad secretagoga del GH, en el cual los niveles de GH porcino se elevaron de los valores de la línea de base de 200ng/ml hasta 1600 ng/ml (figura 1B). EJEMPLO 5 Incubación de la molécula HV-GHRH en el plasma El plasma porcino conjuntado fue recolectado de los cerdos de control, y guardado a una temperatura de 80°C. Se preparó el HV-GHRH sintetizado químicamente por síntesis de póptidos. El plasma porcino fue descongelado y centrifugado, colocado a una temperatura de 37°C y se permitió que se equilibrara. El muíante de GHRH fue disuelto en una muestra de plasma a una concentración final de 100 pg/ml. Inmediatamente después de la adición del mutante GHRH, y 15, 30, 60, 120 y 240 minutos después, se retiró 1ml de plasma y fue acidificado por 1ml de TFA IM. El plasma acidificado fue purificado en columnas C18 SEP-Pak de afinidad, liofilizado y analizado por HPLC utilizando un sistema de administración de sistema múltiple Walters 600, un procesador inteligente de muestras Walters del tipo 717, y un espectro monitor Walters 490 (Walters Associates, Millipore Corp., Milford, MA). La detección se llevó a cabo en 214nm. El porcentaje del péptido degradado en estos puntos del tiempo fue medido mediante la medición del pico integrado. La estabilidad del GHRH de tipo natural y el análogo GHRH-HV entonces fue probada en el plasma porcino, mediante la incubación de péptidos de GHRH, seguida por la extracción de la fase sólida y el análisis por HPLC. Tal y como se muestra en la figura 1C, el 95% del GHRH de tipo natural (1-44)HN2 fue degradado dentro de un periodo de 60 minutos de incubación en el plasma. En contraste, la incubación de GHRH-HV en el plasma porcino mostró que por lo menos el 75% de los polipéptidos estaban protegidos contra la disociación enzimática de 4 a 6 horas de incubación. Por lo tanto, bajo condiciones idénticas, una porción mayor de GHRH-HV permaneció intacta, mientras que el GHRH de tipo natural fue degradado completamente, indicando un aumento considerable en la estabilidad del GHRH-HV a las proteasas del suero (figura 1C). EJEMPLO 6 Estudios en animales Tres grupos de cinco animales de cruza híbrida con una edad de 3 a 4 semanas (Yorkshire, Landrace, Hampshire y Duroc) fueron utilizados en el estudio de GHRH. Estos animales fueron alejados individualmente, y tuvieron acceso libre al agua, y el 6% de su dieta de peso corporal (alimento para cerdos o proteína al 24% Producers Cooperativa Association, Bryan, TX). Los animales fueron pesados cada tercer día, a las 8:30 a.m., y el alimento fue agregado posteriormente, los animales fueron mantenidos de acuerdo con la guía NIH, USDA, y las instrucciones de la Ley de Bienestar de Animales. EJEMPLO 7 Inyección intramuscular de ADN plásmido en porcinos Las preparaciones del plásmido libre de endotóxinas (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) de pSPc5-12hv-GHRH, pSPc5-12-wt-GHRH y pSPc5-12bgal fueron diluidos en PBS (pH 7.4) a 1mg/ml. Los animales fueron asignados de una manera equilibrada a uno de los tratamientos. Los cerdos fueron anestesiados con isoflurano, (concentración del 2 al 6% para la inducción, y del 1 al 3% para el mantenimiento). Los catéteres de la yugular fueron implantados con procedimientos quirúrgicos para retirar sangre en los animales en los días 3, 7, 14, 21, 28, 45 y 65 posteriores a la inyección. Mientras estaban anestesiados, se les inyectaron 10 mg del plásmido directamente en el músculo semitendinoso de los cerdos. Dos minutos después de la inyección, el músculo inyectado fue colocado entre un conjunto de calibradores, y electroporados utilizando las condiciones optimizadas de 200V/cm con 4 impulsos de 60 milisegundos (Aihara et al., 1998). A los 65 días posteriores a la inyección, los animales fueron sacrificados y los órganos internos y el músculo inyectado recolectados, pesados, congelados en nitrógeno líquido y almacenados a una temperatura de -80°C. Los esqueletos fueron pesadas y analizadas por activación de neutrones. Y fue medida la grasa del lomo.

EJEMPLO 8 La inyección en el músculo de pSP-HV-GHRH aumenta los niveles de GHRH; GH e IGF-I porcino en 2 meses. Fue determinada la capacidad del vector pSP-HV-GHRH resistente a la proteasa optimizado para facilitar la expresión a largo plazo del GHRH y estimular los niveles de GH e IGF-I secretados. Los mapas esquemáticos del pSP-HV-GHRH, así como la construcción de tipo natural, el pSP-wt-GHRH, así como el control de tipo natural y el promotor miogénico sintético E. Coli., el vector de expresión de 3-galactosidasa, el pSP-ß gal, como el control de placebo se muestran en la figura 2A. Cerdos machos castrados de tres semanas de edad fueron anestesiados y se les insertó un catéter en la vena yugular para permitir la recolección de muestras de sangre sin la incomodidad de los animales. Los vectores de expresión plásmida del ADN (10 mg de ADN depSP-HV-GHRH; pSP-ß gal) fueron inyectados directamente en el músculo semitendinoso, el cual fue entonces electroporado (ver ejemplo 7). EJEMPLO 9 Mediciones de GHRH, GH e IGF-I porcino El GHRH porcino fue medido por medio del sistema de ensayo heterólogo humano (Península Laboratories, Belmont, Ca). La sensibilidad del ensayo es de 1 pg/tubo. El GH porcino en el plasma fue medido con un procedimiento de anticuerpo específico doble RIA(The Pennsylvania State University). La sensibilidad del ensayo es de 4ng/tubo. El IGF-I porcino fue medido mediante el ensayo humano heterólogo (Diagnostic System Lab., Webster, TX). Los datos son analizados utilizando el paquete de análisis estadístico Microsoft Excel. Los valores mostrados en las figuras son el promedio ± s.e.m. Los valores p específicos fueron obtenidos mediante la comparación, utilizando la prueba t del estudiante. Un valor p < 0.05 es establecido como el nivel de la importancia estadística. En los cerdos inyectados en el músculo semitendinoso con pSP-HV-GHRH, los niveles de GHRH fueron aumentados en el día 7 posterior a la inyección (figura 2B). Y estuvieron el 150% arriba de los niveles de control en el día 14 (652.4±77 pg/ml versus 419.6+ 3pg/ml). La expresión del pSP-HV-GHRH alcanzó su máximo para los 60 días que fue de aproximadamente niveles de 2 a 3 veces mayores que los valores de control inyectados con placebo. La cantidad absoluta de GHRH en el suero, corregida por el peso corporal aumentado entre el día 0 y el día 60 (el volumen sanguíneo tomado en cuenta para el 8% del peso corporal total), secretado por los cerdos inyectados con pSP-HV-GHRH fue 3 veces mayor que los valores de control inyectados con placebo (1426.49±10.47 ng versus 266.84+25.45ng) (figura 2C). Los animales inyectados con pSP-GHRH de tipo natural, los cuales habían sido inyectados en el músculo semitendinoso, solamente mostraron un aumento modesto en sus niveles de GHRH iniciando a los 45 días posteriores a la inyección, pero aumentaron 2 veces a los 60 días posteriores a la inyección (779.36ng), un nivel suficiente para provocar un efecto biológico. Los animales jóvenes tienen niveles muy altos de GH que disminuye gradualmente con la edad. Las muestras de sangre, tomadas cada 15 minutos por un período de 24 horas después de los días 7 y 14 posteriores a las inyecciones iniciales, fueron analizados para determinar los niveles de pGH, los cuales fueron extrapolados para el cambio total del contenido de pGH. Los cerdos inyectados con pSP-HV-GHRH (figura 2D) mostraron un aumento en su contenido de GH evidente en el día 7 posterior a la inyección (variación delta HV = + 1.52, peso = -4.42 versus control =-3ng/ml) y 14 días después de la inyección (variación delta = +1.09, peso = -4.42 versus control = -6.88ng/ml). Otra indicación de los niveles sistémicos aumentados de GH serían los niveles elevados de IGF-I. Los niveles de IGF-I porcino empezaron a aumentar en los sueros inyectados por pSP-HV-GHRH aproximadamente 3 después de la inyección (figura 2E). A los 21 días, estos animales promediaron aproximadamente un aumento de tres veces los niveles en el suero de IGF-I, el cual fue mantenido por 60 días (p < 0.03). En comparación, los cerdos inyectados con el vector de expresión pSP-HV-GHRH de tipo natural, solamente tuvieron un aumento del 40% en sus niveles de IGF-I en circulación (p = 0.39), tal y como se muestra en la figura 2E. EJEMPLO 10 Los vectores de expresión miogónica GHRH aumentan el crecimiento de los cerdos EL GH porcino secretado en la circulación sistémica después de la inyección intramuscular de los vectores de expresión pSP-GHRH miogénicos, aumentan el crecimiento en 65 días en los cerdos machos jóvenes castrados. Se realizaron las mediciones de la composición tanto in vivo a los 30 y 65 días posteriores a la inyección (densitometría, K40) o después de la muerte (órganos, esqueleto, grasa del cuerpo, disección directa seguida por la cámara de activación de neutrones). Los animales inyectados con pSP-GHRH de tipo natural tuvieron un promedio de 21.5% más peso que los controles de placebo (37.125kg vs. 29.375kg), mientras que los cerdos inyectados con pSP-HV-GHRH eran más pesados en un 37.8% (41.775kg; p = 0.014), tal y como se muestra en la figura 3A. La eficiencia de conversión de alimentos también fue mejorada por un 20% en los cerdos inyectados con las construcciones de GHRH, cuando fueron comparados con los controles (0.267 kg de alimento/dla por cada kg de ganancia de peso en los cerdos inyectados con pSP-HV-GHRH, y 0.274 kg en los cerdos inyectados con pSP-wt-GHRH contra 0.334 kg en los cerdos inyectados con pSP-ß gal (figura 3B). Los estudios de composición del cuerpo por medio de densitometría, la cámara de potasio K40, y la cámara de activación de neutrones, mostraron un aumento proporcional de todos los componentes del cuerpo en los animales inyectados con GHRH, sin signos de organomegalia, la proporción relativa de la grasa corporal y la patología asociada. Una fotografía del cerdo de control inyectado con placebo, y un cerdo inyectado con pSP-HV- GHRH después de 45 días, se muestra en la figura 3C. El perfil metabólico de los cerdos inyectados con pSP-HV-GHRH mostrado en la tabla 1, indica una disminución importante en los niveles de urea en el suero, pSP-GHRH y pSP-HV-GHRH, respectivamente (9 ±0.9mg/dl) en los controles 8.3 ±1mg/dl y 6.875+ 0.5mg/dl en los cerdos ¡nyectados)(p =0.006), indicando el catabolismo disminuido del aminoácido. El nivel de glucosa en el suero fue similar entre los controles y los cerdos inyectados con GHRH plásmido (99.2± 8mg/dl) en los cerdos de control, 104.8±6.9mg/dl en los cerdos inyectados con pSP-HV-GHRH 97.5 ± 4.8mg/dl en los animales inyectados con pSP-GHRH de tipo natural (p < 0.27). No se encontraron otros cambios metabólicos. TABLA 1: EL PERFIL METABÓLICO DE LOS CERDOS INYECTADOS CON GHRH Y LOS CONTROLES (VALORES EN MG/ML).

Glucosa Urea Creatlnlna Protelna Total Control T9.2 ±4.8 ?±0.? 0.82±0.06 4.6±0.22 pSP-wt-GHRH 37.5±8 8.3±1 0.83±0.056 4.7T±0.35 pSP-wt-GHRH 1G4.8±6.9 6.875±0.5 0.78±0.04 4.88±0.23 EJEMPLO 11 Experimentos con diferentes niveles de pSP-HV-GHRH Para investigar adicionalmente los efectos del pSP-HV-GHRH el crecimiento de los lechónos, se inyectaron grupos de 2 lechones a los 10 días posteriores al nacimiento con pSP-HV-GHRH (2 mg, 1 mg, 100 microgramos) utilizando electrodos nuevos con una distribución de seis agujas inyectables. Estos electrones fueron probados con posterioridad, y tuvieron una eficiencia mayor de 10 veces que los electrodos de calibre conocidos en la técnica. Por lo tanto, los electrodos de agujas se utilizan preferentemente en los métodos de la presente invención. Tal y como se muestra en la figura 4, el grupo inyectado con 100 microgramos del plásmido presentaron la mejor curva de crecimiento, con diferencias estadísticamente importantes con respecto a los controles después de 50 días de edad. Un animal del grupo inyectado con 3 mg desarrolló anticuerpos y mostró un patrón de crecimiento disminuido de manera importante.

También, se inyectaron grupos de 2 lechones con la dosis indicada de pSP-HV-GHRH 10 días después del nacimiento. Los valores IGF-I iniciaron a elevarse 10 días después de la inyección, y a los 45 días de la inyección, los cerdos inyectados con 100 microgramos del plásmido promediaron un IGF-I de 10.62 veces mayor que los controles. Los cerdos inyectados con 1 mg promediaron 7.94 más que los controles, y los cerdos inyectados con 3 mg promediaron 1.16 veces más que los valores de control. Por lo tanto, en una modalidad específica, se inyectaron dosis inferiores de pSP-HV-GHRH. En una modalidad específica, se utilizaron aproximadamente 100 microgramos (.1 miligramos) del plásmido. En otra modalidad específica se inyectaron de aproximadamente 200 a 300 microgramos. Y en una modalidad adicional se administraron de 50 a 100 microgramos. EJEMPLO 12 Comparaciones de edad con el pSP-HV-GHRH Para optimizar la edad de los lechones para la inyección del pSP-HV-GHRH, se inyectaron grupos de 2 lechones iniciando en el momento del nacimiento con 2 mg de pSP-HV-GHRH. Como se muestra en la figura 6, el grupo inyectado 14 días después del nacimiento presentó la mejor curva de crecimiento, con diferencias estadísticas importantes comparadas con el control en cada punto del tiempo. Un animal del grupo inyectado a los 21 días desarrolló anticuerpos y mostró una disminución importante en el patrón de crecimiento. Es posible que exista una resistencia a la insulina, si son tratados demasiado pronto (por ejemplo, aproximadamente de 10 a 14 días de edad). En una modalidad específica, la terapia es más efectiva cuando niveles de GH e IGF-I son los más bajos (aproximadamente 10 a 14 días de vida), y puede ser contraproducente cuando los niveles de GHRH son normalmente altos. En una modalidad específica existió una disminución en el número de anticuerpos producidos contra el GHRH modificado en un animal preñado en comparación con un animal no preñado, debido a que los sistemas de vigilancia inmunológicos son reducidos durante el tiempo que los animales están preñados. EJEMPLO 13 Modalidades específicas En resumen, un punto del tiempo óptimo para la inyección es 14 días después del nacimiento (un promedio de 8 libras más pesados que los controles (p <0.04) a los 40 días posteriores a la inyección). Una dosificación preferida para la inyección de 100 microgramos de plásmídos en un volumen de 2 a 5 mi (un promedio de 6 libras más pesados que los controles (p <0.02) a los 40 días posteriores a la inyección). Las constantes hormonales y bioquímicas son normales (IGF-I, IGF-BP3, insulina, urea, glucosa, proteínas totales, creatinina) en la progenie de un cerdo hembra 1 (curso del tiempo) y un cerdo hembra 2 (curva de dosis) y en correlación con el aumento de peso, sin efectos colaterales dañinos. Los estudios de composición del cuerpo de los experimentos anteriores mostraron que el HV-GHRH determinó un aumento uniforme de todos los compartimentos del cuerpo (una composición corporal similar a los controles pero más grande), mientras que los de wt-GHRH determinaron un aumento en la masa corporal magra y una disminución en la grasa. Debido a que los aumentos en la hormona del crecimiento pueden resultar en un aumento en la temperatura corporal, en una modalidad preferida, los cerdos hembra son inyectados bajo condiciones en donde la temperatura es de aproximadamente 16.67°C (62°F) hasta aproximadamente 26.67°C (80°F). EJEMPLO 14 La inyección de vectores de GHRH miogénlcos en cerdos hembras preñados antes del primer alumbramiento Los efectos del ensayo de crecimiento de los vectores de GHRH miogénicos, los cerdos hembras preñados fueron Inyectados con 10 mg de un vector que contiene un GHRH en el último trimestre de la gestación. En este ejemplo específico, el cerdo (362.880 kg (~800 libras)) fue inyectado con 10 mg de un vector pSP-HV-GHRH a los 90 dfas de la gestación la primera vez que quedó preñada. Los métodos de administración pueden ser cualesquiera de los métodos conocidos en la técnica. En una modalidad específica, el plásmido es administrado en el ejemplo 7 con la excepción de que fue utilizado un electrodo de calibre para la electroporación (figura 7). El electrodo tiene seis agujas de calibre 22 las cuales son de 2 cm de longitud y las cuales se encuentran en un soporte circular de plástico de 1 cm de diámetro. La tabla 2 demuestra el peso (kg) con el paso del tiempo con lechones nacidos de un cerdo hembra inyectado con pSP-HV-GHRH (p2) mediante electroporación a los 90 días de la gestación. La tabla 3 demuestra el peso (kg) de los animales de control nacidos de un cerdo hembra no inyectado (p3) en la misma fecha. En la tabla 4 muestran los datos de composición del cuerpo (%grasa/BW/d promedio) de los lechones del cerdo hembra inyectado con pSP-HV-GHRH y el cerdo hembra no inyectado. Esta tabla representa la proporción relativa de grasa peso corporal y muestra que los lechones del cerdo hembra inyectado tenían el 18.5% menos de grasa por unidad de peso. Los cerdos p2/1 y p2/6 fueron sacrificados antes que los datos de la composición corporal fueran obtenidos. La bioquímica de los lechones fue similar a la demostrada para la segunda carnada de este cerdo hembra (ver ejemplo ). Los valores p son muy importantes en todos los puntos del tiempo. Estas tablas muestran claramente que los lechones nacidos del cerdo hembra inyectado con pSP-HV-GHRH durante su gestación pesaron significativamente más que los lechones nacidos del cerdo hembra de control. Sin limitar el alcance de la invención y sin imponer restricciones a los límites y metas de la invención, los solicitantes consideran que el GHRH inyectado en las células musculares es secretable pasado a través de la placenta. Como un resultado de los efectos hipertróficos e hiperplásticos del GHRH en la pituitaria, existe un número aumentado de GH que liberan las células de la pituitaria. EJEMPLO 15 La segunda carnada del cerdo hembra inyectado La tabla 5 demuestra los datos de peso de la segunda carnada del cerdo hembra inyectado con pSP-HV-GHRH durante la primera vez que fue preñada.

TABLA 5: COMPOSICIÓN DEL CUERPO DEL LECHÓN CON EL PASO DEL TIEMPO No se proporcionaron administraciones posteriores de GHRH al cerdo hembra desde o durante la gestación de la segunda carnada. Desde el nacimiento la segunda carnada es más grande (el promedio del peso para los lechones en el nacimiento de otros cerdos hembra aumentó en un ambiente similar fue de 1.71 kg; promoviendo estos lechones un peso de 2.181 kg al momento del nacimiento). A los 21 días, la suma de todos los pesos de los lechones de la carnada característicos para la reproducción, y el promedio es de ~ 130 libras (-59 kg), y los lechones del cerdo hembra inyectado anteriormente con pSP-HV-GHRH suman 174 libras (-79 kg). La ventaja fue mantenida, a los 77 días posteriores al nacimiento los pesos fueron el promedio de 11 a 15 libras (de 5.5 a 6 kg) mayores/por cerdo comparados con los mejores de la carnada, las cuales son cantidades bien conocidas en la técnica. A los 169 días posteriores al nacimiento, los animales Inyectados tenían un promedio de 22 libras (10 kg) más grandes que los controles, p < 0.0007. Los cerdos hembras fueron anestesiados solamente para el procedimiento de inyección/electroporación y para ellos, se utilizó TELAZOL® (una mezcla de clorhidrato de tiletamina y clorhidrato de zolazepam) en una dosis de 2.2 mg/kg. Para los lechones, se utilizó una combinación de HCI cetamina/xilazina para la anestesia durante la evaluación de la composición del cuerpo, cuando los lechones deben de permanecer acostados todavía en sus lomos en una máquina de Densitometría de rayos-X Dual (DEXA) aproximadamente 15 minutos. Específicamente, se utilizó cetamina 20 mg/kg + xilazina 1 mg/kg (la dosis regular de xilazina es de 2 mg/kg). En otra modalidad específica, se administró otro anestésico diferente conocido en la técnica, tal como cetamina 15 mg/kg + acepromazina mg/kg. En una modalidad adicional no fue necesaria la anestesia en los lechones para tomar la sangre, inyectarlos etc. Debido a que esos cerdos y algunos otros animales son generalmente sensibles a diferentes tipos de anestésicos y podrían morir después de la anestesia por los cambios importantes en su proceso termoregulatorio (hipo ó hipertermia, está última es la más frecuente), en algunas ocasiones se les administró atropina. La atropina es un medicamento anticolinérgico que es utilizado frecuentemente antes de la anestesia y se considera que facilita el secado de las secreciones y reduce la cantidad de anestésico requerido, evita las arritmias cardiacas durante el procedimiento, y aumenta la comodidad del animal durante la recuperación de la anestesia, con una disminución en la frecuencia de episodios térmicos anormales no deseados. En una modalidad específica, se presenta un tratamiento previo con atropina en una dosis de 0.05 mg/kg (subcutánea). Se pueden utilizar otros fármacos similares conocidos en la técnica, como alternativos a la atropina. Se tomaron mediciones bioquímicas múltiples de los lechones. Las tablas de la 6 a la 12 proporcionan datos relacionados con estas mediciones. El experimento de insulina (tabla 6) fue medido 5-25-00. El promedio de todos los grupos de control anteriores probados es de 6.8 µ?/ml, y el promedio de los lechones experimentales es de 4.785 µ?/ml, sin importancia estadística (p=0.07), TABLA 6: Concentración de Ins u lina en Lec hónos día 25 cerdo 1 4.3827 cerdo 2 4.131 cerdo 3 4.017T cerdo 4 5 7899 cerdo 5 4.42T7 cerdo 7 4.3076 cerdo T 4.1648 cerdo 9 T.0921 cerdo 10 4.9527 Promedio 4.78501 STDEV 0.71397 SE 0.23799 El ensayo de IGF-I fue realizado en 5-25-00 (ver tabla 7). El promedio de los g rupos experimentales desde 145.509 ng/ml y el promed io de todos los grupos de control anteriores probados es de 53.08 ng/ml. Por lo tanto , el valor p es muy importante (p < 0.0001 ). Debido a que el GH estimula la producción y la liberación de IGF-I , el ensayo de I G F-I i ndica los aumentos en los niveles de G HRH y generalmente es utilizado en la técnica como tal .

Tabla 7: Concentración de IGF- en los Lechones dial día 10 día 18 día 25 cerdo 1 2T0.46 118.63 185.01 35T.02 cerdo 2 2T5.7 115.62 117.99 172.28 cerdo 3 109.27 77.389 200.75 10T.9T cerdo 4 94.689 36.746 93.7T5 65.113 cerdo 5 155.98 95.946 138.24 179.3 cerdo 7 171.41 19.463 213.29 226.43 cerdo 8 178.3 101.55 98.478 1T5.88 cerdo 9 104.86 78.872 84.7 77.214 cerdo 10 262.4 131.36 206.23 138.99 Promedio A 181.4521 86.1751 148.7203 165.6908 STDEV 74.91415 37.61337 52.67175 87.9T 9T SE 24.97138 12.53779 17.55725 29.32165 Para la tabla 8, se probó el IGF-BP3 (proteína 3 de enlace IGF). En un ensayo radioinmunométrico (IRMA) en 5-25-00. El ensayo IRMA emplea un ensayo radioinmunométrico de dos sitios (ver Miles LEM, Lipschitz DA, Bieber CP y Cook JD: Medición de ferritina en el suero por un ensayo radioinmunométrico de 2 sitios) (see Miles LEM, Lipschitz DA, Bieber CP and Cook JD: Measurement of serum ferritin by a 2-site immunoradiometric assay) Analyt Biochem 61: páginas 209 a 224, 1974). El ensayo IRMA es un ensayo no competitivo en el cual la muestra analítica que va a ser medida es "emparedada'' entre dos anticuerpos. El primer anticuerpo es inmovilizado en las paredes dentro de los tubos. El otro anticuerpo es radio marcado para la detección. La muestra para análisis presente en las incógnitas, estándares y controles, está enlazada por ambos de los anticuerpos para formar un complejo "emparedado". Los materiales no enlazados son removidos, vertiendo y lavando los tubos. Las mediciones de la tabla 8 comprenden el factor de corrección x 50. La tabla 8 demuestra el promedio del grupo experimental que es de 238.88, mientras que el promedio de todos los grupos de control anteriores probados es de 205.44 ng/ml. Existe una diferencia específica con p <0.048. Tabla 8: Concentración de IGF-BP3 en los Lechonas La tabla 9 demuestra la concentración total de proteína (g/dl). El promedio del grupo experimental es de 5.3 g/dl, mientras que el promedio de todos los grupos de control anteriores probados es de 4.03 g/dl. Existe una importancia estadística importante muy alta, con p < 0.0001.

Tab la 9 : Conce ntración Total de Proteína en los Lech ones dia l día 10 día 1B día 25 cerdo 1 5.7 5.9 G.H. 5.5 cerdo 2 5.3 5.T 5.5 5 cerdo 3 5.2 5.3 5.3 5.4 cerdo 4 5.3 5.5 4.6 5.4 cerdo 5 5.8 5.3 5 5.4 cerdo 7 5.6 5.4 5.3 5.2 cerdo 8 4.5 5 G.H. 4 cerdo T 5.3 5.1 5.3 5.2 cerdo 10 6.3 5 5.2 5.5 Promedio 5.44444 5.34444 5.21429 5.1777T STDEV 0.4T52T 0.29627 0.20354 0.471 1 1 SE 0.16509 0.0987T 0.06795 0,15704 La Tabla 1 0 demuestra las concentraciones de creatinina (mg/dl). El promedio del gru po experimental es de 0.936 mg/dl , mientras que el promedio de todos los grupos de control anteriores probado es de 0.982 mg/dl. No existe u na i mportancia estad ística (p <0.34), lo cual indica una función normal del riñón .

Tabla 10: Concentración de Creatinina en los Lechones dia 1 día 10 día 18 día 25 cerdo 1 0.75 0.96 G.H. 1.14 cerdo 2 0.73 1.03 0.98 1.46 cerdo 3 0.69 0.92 0.95 1.1 cerdo 4 0.65 0.94 1.18 1.18 cerdo 5 0.T4 0.8 0.91 0.92 cerdo 7 0.72 0.93 1.02 1.12 cerdo 8 0.68 0.9 0.83 1.2 cerdo 9 0.68 0.87 1 1.07 cerdo 10 0.74 1.02 1.02 1.03 promedio 0.69778 0.93 0 98T25 1.13556 STDEV 0.0393 0.07124 0.101 13 0.14783 SE 0.0131 0.02375 0.03371 0.04928 La Tabla 11 demuestra el BUN (niveles de urea en la sangre) (mg/dl). El promedio del grupo experimental es de 3,88 mg/dl, mientras que el promedio de todos los grupos anteriores de control de la prueba es de 8.119 mg/dl. No existe una importancia estadística notable, con p<0.0012.

Tabla 11: Concentración de BUN en los Lechones dial día10 día 18 día 25 cerdo 1 4 3 5 4 cerdo 2 4 3 3 6 cerdo 3 6 T 5 7 cerdo 4 5 3 4 5 cerdo 5 3 2 3 3 cerdo 7 3 3 3 3 cerdo 8 2 3 5 7 cerdo 9 3 3 4 4 cerdo 10 3 3 3 4 promedio 3.6T6T7 3.22222 3.88889 4.77778 STDEV 1.22474 1.09291 0.927T6 1.56347 SE 0.40825 0.3643 0.30932 0.52116 La Tabla 12 muestra las concentraciones de glucosa (mg/dl). El promedio del grupo experimental es de 123,23 mg/dl, mientras que el promedio de todos los grupos de control anteriores de la prueba es de 122.8 mg/dl. No existe importancia estadística (p <0.67). El término G.H. permanece para la hemolisis bruta en estas muestras para determinar que la constante bioquímica no fue posible.

Tabla 12: Concentración de Glucosa en los Lechónos día 1 dia 10 día 18 día 25 cerdo 1 117 115 G.H. 115 cerdo 2 112 137 130 1 19 cerdo 3 133 138 143 115 cerdo 4 125 127 132 90 cerdo 5 115 123 133 120 cerdo 7 114 120 123 115 cerdo T 12T 123 G.H. 116 cerdo 9 1 18 129 124 1 19 cerdo 10 1 2 134 136 1 12 promedio 122.4444 127.3333 131.5714 113.4444 STDEV 9.98888 7 88987 8.T0066 9.15302 SE 3.32963 2.62996 2.30022 3.05101 Como demuestran todas estas tablas, el IGF, I GF-BP3 son au mentados (como resultado del estím ulo del eje G H ) la urea y las proteínas totales son disminuidas y aumentadas respectivamente (lo cual es u n signo de un catabolismo mejorado de la proteína) mientras que la insulina y la glucosa se mantienen normales. Los niveles normales de insulina y glucosa es una ventaja para la presente invención , debido a que las terapias clásicas de GH crean una situación similar a la "diabetes", con hiperglucemia. La creatinina , la cual fue normal en este experimento, es un parámetro para medir la fu nción renal, la cual puede ser dañada algunas veces en los animales que se encuentran bajo cond iciones metabólicas no apropiadas. Por lo tanto, en una modal idad específica, los lec ones nacidos en em barazos subsecuentes múltiples a la preñez, en la cual el cerdo hembra fue inyectado primero con pSP-HV-GHRH muestran un aumento en el crecimiento sobre todo los niveles o animales nacidos de cerdos hembras no inyectados con el ADN que codifica el GHRH de forma alguna. La gestación en los cerdos dura aproximadamente 114 dias, y permite que el tiempo para la lactancia no sea mayor que el de dos carnadas por año. En una modalidad específica, la administración del ácido nucleico que codifica GHRH en las hembras o la madre está asociada con un aumento de aproximadamente el 25% al 50% de las células productoras de GH. En una modalidad alternativa, un cerdo hembra no preñado es inyectado antes de la preñez. En otra modalidad alternativa, en vez de la administración del vector pSP-HV-GHRH de la presente invención, se pueden utilizar otros análogos de la hormona de liberación de la hormona del crecimiento, los cuales son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se utiliza el GHRH de tipo natural. Los experimentos se llevan a cabo de modo similar a las enseñanzas aquí proporcionadas. En otra modalidad, las pituitarias de los lechones son recolectadas después de sacrificarlos y se prueban los cambios en el contenido de la pituitaria. Es decir, los lechones serán sacrificados y las pituitarias recolectadas cuando llegan al peso del mercado (~100kg). Los ensayos incluyen el contenido relativo de la pituitaria de los diferentes tipos de células secretoras de hormonas (y la proporción relativa de células que secretan la hormona del crecimiento, prolactina, la hormona estimulante de los folículos (FSH), etc.) EJEMPLO 16 Experimentos Adicionales En una modalidad específica, más cerdos hembra, tales como aproximadamente 20, son inyectados con tratamientos iguales o similares a los que se proporcionan en los Ejemplos 14 y 15. Se prueban cantidades múltiples de plásmidos, tales como desde 100 microgramos hasta 10 miligramos, con grupos de 5 cerdos hembras utilizados por tratamiento. Los descendientes son comparados con la progenie de los cerdos hembra no inyectados. En una modalidad específica estos experimentos se llevan a cabo en una granja de modo que los datos podrían ser estandarizados con los de la literatura. EJEMPLO 17 Experimentos de Optimización Con el fin de determinar los tiempos óptimos de inyección durante la primera preñez, se utilizaron ratas preñadas. La gestación de la ratas dura aproximadamente 21 días. Las hembras preñadas son inyectadas iniciando del día 5 al día 18 de la gestación, y su progenie es probada en diferentes puntos del tiempo después del nacimiento. Los experimentos específicos incluyen el peso, la composición del cuerpo y el contenido relativo de la pituitaria de los diferentes tipos de células secretoras de hormonas (proporción relativa de células que secretan la hormona del crecimiento, prolactina, FSH, etc.) EJEMPLO 18 Métodos para Aumentar la Producción de Leche En una modalidad de la presente invención, se proporciona un método para aumentar la producción de leche (denominada también lactancia) que comprende el paso de introducir una cantidad efectiva de un vector en las células del animal bajo condiciones en donde es expresada la secuencia de nucleótidos que codifica la hormona de liberación de la hormona del crecimiento, en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos que codifican la hormona de liberación de la hormona del crecimiento; y una región 3' sin traducir enlazada de manera operativa para la expresión funcional de la secuencia de nucleótidos, en donde la introducción y expresión del vector dan como resultado un aumento de la producción de leche del animal. En una modalidad especifica el animal es un humano, vaca, cerdo, cabra, u oveja. La introducción del vector comprende un GHRH dentro de un animal por los métodos descritos anteriormente que aumenta la producción de leche del animal. En una modalidad especifica, el animal es una hembra o una madre o una hembra preñada. En otra modalidad específica, la progenie de la hembra o madre crece más rápido en aproximadamente las dos primeras semanas debido al aumento en la producción de leche en la hembra o madre. Como se explicó anteriormente, el aumento en la producción de leche ocurre al momento de una sola inyección de ácido nucleico que codifica un GHRH dentro de un animal. Un experto en la técnica conoce la manera de medir los aumentos en la producción de leche, tales como en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,061,690; 5, 134,120; y 5,292,721 o en la publicación de Peel et al. en J. Nutr., 1981, páginas 111: 1662. Las muestras de leche son expresadas manualmente al momento del parto (calostro) y en el día 13 y el día 20 de lactación. Se administra una inyección intramuscular de 40 IU de oxitoxina (excepto para la recolección de calostro) y dos glándulas por cerdo hembra son ordeñadas tan rápido como sea posible, hasta que ya no tienen más leche. Las muestras de las dos glándulas son mezcladas completamente y los alícuotas son depositados en dos frascos con un agente conservador, tal como el dicromato de potasio. Los frascos son congelados hasta el análisis. La grasa de la leche, la materia seca y las proteínas son determinadas de acuerdo con procedimientos estándares en la técnica, tales como los procedimientos A.O.A.C. (1980). En una modalidad específica la lactosa de la leche es analizada por medio de un analizador semi-automático (analizador industrial modelo 27, Yellow Springs Instrument Co., Inc., Yellow Springs, Ohio), un procedimiento enzimático (procedimiento de operación No. OP- 025, Monsanto Co. St. Louis, Mo.). La leche producida de cada uno de los cerdos hembra es determinada en los días 13 y 20, en una modalidad específica, pesando los lechónos en intervalos de una hora antes y después de la ingestión tal y como lo describen Lewis et al. (1978) y Mahan et al. (1971). Se tiene cuidado de evitar o tomar en cuenta las pérdidas de orina y fecales durante este tiempo. En un momento específico los dos períodos de alimentación iniciales son utilizados para aclimatar al cerdo hembra y a la carnada y no están incluidos en la computación de la producción diaria de leche. La producción de leche es calculada multiplicando por cuatro la producción obtenida durante las 6 horas siguientes. EJEMPLO 19 Otras Modalidades En otra modalidad de la presente invención, los ligandos para el receptor secretagogo de la hormona del crecimiento (GHS-R) proporcionan un resultado similar a la administración de un ácido nucleico de GHRH. Un experto en la técnica sabe de los muchos ligandos de GHS.R de diferentes tipos estructurales conocidos en la técnica, y todos los cuales funcionan a través del GHS-R. Los ejemplos incluyen el MK-0677 de Merck (Whitehouse Station, NJ), GHRP-6 (para revisión consultar Bowers, 1998) y ghrelin, un ligando endógeno (Kojima et al., 1999; Dieguez y Casanueva, 2000). Otros incluyen hexarelina (Europeptides), L-692,943 (Merck & Co.; Whitehouse Station, NJ), NN703 (Novo Nordisk; Bagsvaerd, Dinamarca) o cualquier compuesto el cual actúa como un agonista en el receptor GHS-R, y todos ellos son bien conocidos para los expertos en la técnica (ver por ejemplo, Pong et al. (1996); Haward et al. (1996); o Smith et al. (1997).

Un experto en la técnica sabe que el GHS-R se encuentra arriba del GHRH y aumenta la liberación de GHRH de la glándula pituitaria. En una modalidad especifica un ligando GHS-R es administrado oralmente (tal como agregándolo al alimento o al agua para beber), el cual amplificaría los efectos del GHRH al causar la liberación del GH de la glándula pituitaria. En esta modalidad, la administración del ácido nucleico del GHRH de la presente invención, obtendría una mejora agregada. Sin limitar el alcance de la presente invención, los inventores proponen que un mecanismo probable de acción es que el GHRH adicional produce aumentos en la expresión de la fosa-1 (un factor de transcripción. involucrado en el desarrollo de las células productoras de GH, somatotropos, en la pituitaria anterior durante la embriogónesis). La activación del GHS-T también aumenta la expresión de la fosa-1. La expresión de la fosa-1 también es aumentada por cAMP, y los ligandos GHS-R aumentan la cantidad de cAMP formado en respuesta al GHRH. Por lo tanto, es probable que los cerdos cuando nacen tengan una concentración aumentada de los somatotrofos. De ahí, los cerdos producen más GH. Por lo tanto, en una modalidad específica, la administración de ácido nucleico de GHRH de la presente invención, es administrada en combinación con por lo menos un ligando GHS-R. El ligando GHS-R es administrado en una composición farmacéuticamente aceptable.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la descripción indican los niveles de aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Las patentes y publicaciones están incorporadas a la presente descripción como referencia hasta el mismo punto hasta el cual cada publicación individual fue indicada específica e individualmente para ser incorporada como referencia. EJEMPLO 20 Efectos Múltiples de los Cerdos Hembra y la Progenie con la Administración de GHRH En un objeto de la presente invención, un GHRH producido ectópicamente en un animal preñado, por ejemplo, pasa a través de la placenta a la progenie y mejora la producción de GH a largo plazo de la progenie, la cual entonces exhibe un crecimiento aumentado y una composición del cuerpo cambiada. Al mismo tiempo, los cerdos hembra inyectados producen mas leche de una manera importante. Para la evaluación de los efectos del crecimiento de la progenie de una inyección de vector miogónico GHRH en un mamífero grande, y los efectos de la administración de GHRH en la lactancia de cerdos hembra, seis cerdos hembra preñados, fueron inyectados con 10 mg de ADN plásmido de pSP-HV-GHRH (N = 4) o pSP-wt-GHRH (n=2) a los 95 días de gestación. Recientemente, se logró un progreso importante para el uso de la expresión del gen ectópico en los músculos, utilizando la técnica de electroporación para mejorar la asimilación del plásmido in vivo, tanto en roedores como en animales grandes (Bettan et al., 2000; Draghia-Akli et al., 1999;Mir et al., 1999). En este caso, la inyección de plásmido fue seguida por electroporación utilizando un electrodo de adaptación de 6 agujas y las condiciones que aquí se describieron y (Draghia-Akli et al,, 1999). Seis cerdos hembra fueron usados como controles. Los animales tuvieron sus alumbramientos en intervalos de 24 horas entre ellos. Se analizaron un total de 132 lechones en los estudios posteriores. Es conocido que el tratamiento con el GHRH recombinante proporcionado como inyecciones 2 semanas antes del parto, aumenta el peso de los lechones a los 13 días, y al destete y mejora la supervivencia del cerdo (Etienne et al., 1992). En este caso, los lechones de los cerdos hembra inyectados con GHRH fueron significativamente más grandes al momento del nacimiento (en promedio 1.65 ± 0.06 kg HV-GHRH, p < 0.00002 y 1.46 ± 0.05 kg wt-GHRH, p<0.0014, contra los controles 1.27 ± 0.02 kg) (figura 8). Los lechones fueron destetados a los 21 días y analizados hasta el peso para el momento del sacrificio, a los 170 días posteriores al nacimiento. Los lechones fueron provenientes de cerdos hembra inyectados en donde en promedio fueron 18% más grandes al destete (Figura 9). La mitad de cada carnada fue criada cruzada con cualesquiera de los cerdos hembra de control (lechones provenientes de los cerdos hembra inyectados) o cerdos hembra inyectados (lechones de los cerdos hembra de control). De un modo interesante, los controles de cría cruzados con los animales inyectados fueron significativamente más grandes, (hasta de aproximadamente un 12.2%) que sus compañeros de carnada, p < 0.02 (figura 10). Este cambio en el peso en los animales de control de cría cruzada con los animales con GHRH indica la producción de leche aumentada de manera significativa en los cerdos hembra inyectados. Sin embargo, los lechones provenientes de la cría cruzada de cerdos hembra tratados con GHRH con los cerdos hembra de control tienen una tendencia a ser más pequeños (hasta del 5.8%) que sus compañeros de carnada (Figura 11), pero los valores no fueron importantes estadísticamente, una indicación de que la progenie de los animales tratados con GHRH tuvo cambios endógenos en su eje hipotalamico-pituitario, con un crecimiento aumentado. El aumento general sobre los controles (alimentados en los cerdos hembra de control) es ilustrado en la figura 12. La ventaja fue mantenida hasta el peso del mercado; a los 170 días, los pesos fueron en promedio 135.7 ± 1.89 kg y 129.3 ± 2.17 kg para los animales inyectados con HV-GHRH y wt-GHRH, respectivamente, mientras que el peso de los controles fue en promedio de 125.3 ± 1.74 kg (figura 13). La diferencia de peso fue estadísticamente importante en cada momento del tiempo, con valores p entre 0.05 y 10"B. Se realizaron mediciones bioquímicas múltiples (Tablas 13a y 13b). Como un signo del anabolismo aumentado, la concentración total de proteína y de albúmina (g/dl) mostró un aumento en el grupo experimental. Las proteínas totales aumentaron en un 8%, mientras que la albúmina aumento en un 7.5%, con diferencias menores en los puntos del tiempo probados (a los 50 y 170 días después del nacimiento) (Tabla 13a y Tabla 13b).

TABLA 13a La concentración de creatinina (mg/d l) fue normal (0.936 mg/dl contra los controles 0.982 mg/d l, p < .34), lo cual indica una función normal del ri ñón. Las concentraciones de glucosa fueron normales en todos los momentos del tiempo de la prueba (Tablas 14a y 14b).

TABLA 14a Día SO Glucosa Control 99.3T +/- 12.03 WT-GHRH T8.5 +/- 10.11 valor p p<0.76483343 HV-GHRH T8.41 +/- 0.T3 valor p p<0.67921581 Dfa 170 Insulina Glucosa Control 14.79 +/-T.23 78.68 +/- 19.01 WT 10.16 +/-2.13 81.14 +/- 8.90 valor P p<000548803 p<0.49606217 HV 15.55+/- 11.64 81.11 +/- 10.52 valor P p<0.76677483 p<0.44978079 Los niveles de insulina fueron normales. El nivel normal de insulina y glucosa es una ventaja debido a que las terapias clásicas de GH crean una situación similar a la "diabetes", con hiperglucemia (Pursel et al., 1990). El índice de supervivencia durante el estudio completo fue significativamente más alto en la progenie de los cerdos hembra tratados (Tabla 15). La mortalidad se redujo de manera importante en el grupo tratado. TABLA 18 A diferencia de las inyecciones con somatotropina recombinante porcina (rpST) que podría producir úlceras hemorrágicas, vacuolaciones del hígado y el riñon y hasta la muerte de los cerdos hembra (Smith et al., 1991), la terapia genética de GHRH es bien tolerada, y no se observaron efectos colaterales en los animales. Deberá observarse que el crecimiento aumentado obtenido en la progenie de los animales tratados, en donde no está presente el plásmido GHRH. Los plásmidos que contienen hGH específico del tipo de tejido/fibra regulado fueron utilizados previamente para la administración y la producción estable del GH en el ganado, y los huéspedes que tenían deficiencias en GH, ya sea por inyección intravenosa portada por liposoma o transferencia de mioblastos o transgónesis (Dahler et al., 1994; Pursel et al., 1990; Barr y Leiden, 1991). Sin embargo, estas técnicas tienen desventajas importantes, ya que impiden que sean usadas en una operación de larga escala y/o en alimentos para animales: 1) la toxicidad posible o la respuesta inmunológica asociada con la administración del liposoma ; 2) la necesidad de una manipulación ex vivo extensa en el método de mioblastos transfectados; y/o 3) el riesgo de efectos colaterales importantes o la eficiencia de la transgénesis (Mililer et al., 1989; Dhawan et al., 1991). Comparada con estas técnicas, la inyección de ADN plásmido es simple y efectiva, sin complicaciones relacionadas con el sistema de administración o la expresión excesiva. Los datos aquí proporcionados muestran que se logra la potencia biológica mejorada en la progenie de animales grandes inyectados con el plásmido GHRH, con niveles fisiológicos aumentados de producción y secreción de GH, una mortalidad y mordidez disminuidas. Los cerdos hembra tratados muestran una producción de leche significativamente más grande. Los lechónos de la progenie no experimentaron efectos colaterales algunos de la terapia y tuvieron perfiles bioquímicos normales, sin patología u organomegalia asociados. La mejora profunda en el crecimiento indica que la expresión ectópica de los vectores miogénicos de GR, probablemente reemplazará los regímenes clásicos de terapia de GH y puede estimular el GH de una manera fisiológicamente más apropiada. La molécula HV-GHRH, la cual muestra un alto grado de estabilidad, y la actividad secretoria del GH en los cerdos, puede ser útil en otros mamíferos, ya que las proteasas del suero que degradan GHRH son similares en la mayor parte de los animales. Los párrafos siguientes describen materiales y métodos para este Ejemplo. Construcciones de ADN. El plásmido pSPc5-12 contiene un fragmento 360 bp de Sacl/BamHI del promotor sintético SPc5-12 en los sitios Sacl/BamHI de la estructura Psk-GHRH (Draghia-Akli et al., 1997). El GHRH porcino del tipo natural fue obtenido por medio de la mutagónesis directa del cADN de GHRH humano (1-40)OH en las posiciones 34: Ser a Arg, 38: Arg a Glu; el ADN de HV-GHRH porcino mutado fue obtenido por medio de mutagónesis dirigida en el sitio del cADN de GHRH humano (1-40)OH en las posiciones 1: Tir a His,2 Ala a Val, 15: Gli a Ala, 27: Met a Leu, 28: Ser a Asn, 34: Ser a Arg, 38: Arg a Glu (El Sistema de Mutagónesis in vitro de los Sitios ? y Alterados, Promega, Madison, Wl), y clonados en los sitios BamHI/Hind III del pSP-GHRH. El cADN del GHRH fue seguido por la región 3' sin traducir la hormona del crecimiento humano, para crear el pSPc5-12-wt-GHRH y el pSPc5-12-HV-GHRH. El plásmido de control contenía el gen de beta-galactosidasa E coli bajo el control del mismo promotor sintético para producir pSP-bgal. Estudios en animales. Se utilizaron en estos estudios de GHRH la línea PIC 22 de la primera carnada de los cerdos hembra con un peso aproximado de 365 kg. Los animales se llevaron a la instalación de la granja a los 87 días de gestación, y se alojaron individualmente en instalaciones para el parto individual donde permanecieron hasta el final de los 25 días del período de lactancia, con un acceso libre al agua y al alimento. El experimento inició en Marzo y la primera carnada nació en Abril y fue analizada hasta mediados de Octubre. El edificio de la granja estaba equipado con un sistema de enfriamiento que pudo mantener la temperatura máxima de 2 a 5°C menor que la temperatura del exterior durante el tiempo de calor. Las temperaturas máximas promedio para el mes de Julio, Agosto y Septiembre fueron de 40.6°C, 41.6°C, y 36.6°C, respectivamente. Los animales se mantuvieron de acuerdo con la Guía NIH, USDA, y con las instrucciones de la Ley de Bienestar de Animales. Inyección intramuscular del ADN plásmido en los porcinos. Se diluyeron la preparación de plásmido libre de endotoxinas de pSPc5- 12-HV-GHRH y pSPc5-12-wt-GHRH (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, EUA) en PBS pH = 7.4 a 1mg/ml. Cada cerdo hembra fue asignado a uno de los tratamientos. Cuatro cerdos hembra fueron inyectados con pSPc5-12-HV-GHRH, dos cerdos hembra fueron inyectados con pSPc5-12-wt-GHRH y 6 cerdos hembra fueron utilizados como controles. A los 95 días de gestación, los animales fueron anestesiados ligeramente utilizando telazol 2.2 mg/kg. Se inyectó un total de 10 mg del plásmido directamente en el músculo semitendinoso izquierdo de los cerdos. Dos minutos después, el músculo inyectado fue electroporado utilizando electrodos inyectables de adaptación de 6 agujas, con un diámetro de 1 cm, calibre 22, y una longitud de 2 cm, utilizando las siguientes condiciones: 6 impulsos, campo alterno entre las agujas, 200V/cm, 60 milisegundos/pulso, tal y como lo describen (Draghia-Akli et al., 1999; Aihara y Miyazai, 1998). Estudios de crías cruzadas. Inmediatamente después del nacimiento de cada carnada fue dividida en dos grupos. La mitad de cada carnada permaneció con su propia madre, y la mitad de la carnada fue criada cruzada con otro grupo diferente (por ejemplo, los lechones de control fueron criados cruzados con los animales inyectados con HV- o wt-, los lechones nacidos de los cerdos inyectados con HV o wt fueron criados cruzados con los animales de control, y el peso fue registrado semanalmente. Dieta. Después del destete a los 21 días, los lechones fueron alimentados durante 60 días con Nutrena al 18% Pig Starter Medicado con 1.012% de Lisina (Cargill, Minneapolis, MN). Posteriormente, los cerdos fueron alimentados con Custom Mix Pig Starter 24% de proteínas con 1.4% de lisina durante 45 días. La mezcla acostumbrada de 22.7% de protetna con 1.4% de lisina por 45 días, y luego se mantuvieron con una Mezcla Normal con el 20% de proteína con el 1.2% de lisina (Cargill, Minneapolis, MN) durante el resto del estudio. Bioquímica. El suero fue recolectado a los 50 días y a los 170 días después del nacimiento, y fue analizado por un laboratorio independiente (Antech Diagnostics, Irvine, CA). IGF-I RIA Porcino. El IGF-I porcino fue medido mediante un ensayo de IGF-I humano heterólogo (Diagnostic System Lab., Webster, TX). RIA de Insulina Porcina. La insulina porcina fue medida por un ensayo humano heterólogo (Lineo Research Inc.; St. Charles, Missouri). La sensibilidad del ensayo fue de 2 microU/ml. Datos de composición del cuerpo. Los pesos fueron medidos en las mismas básculas calibradas (certificadas para que tuvieran una exactitud de ± .2kg, y un coeficiente de variación de 0.3%) en todo el estudio, dos veces por semana. Estadísticas. Los datos son analizados utilizando el paquete de análisis estadístico Microsoft Excel. Los valores mostrados en las cifras son el promedio ± s.e.m. Los valores p específicos serán obtenidos mediante la comparación utilizando la prueba t de los Estudiantes. Un p < .05 fue ajustado como el nivel de importancia estadística. Ejemplo 21 Efectos Múltiples en las Ratas Tratadas con GHRH La secreción de la hormona del crecimiento (GH) es estimulada por el secretagogo GH natural, la hormona de liberación de hormona del crecimiento (GHRH), e inhibida por la estomatostatina (SS), ambas hormonas hipotalámicas (Thorner et al., 1995). Los pulsos GH son un resultado de la secreción GHRH que está asociada con una disminución o retiro de la secreción de somatostatina. Además, el mecanismo generador de pulso parece estar programado por una retroalimentación negativa de GH. Adicionalmente, el ghrelin, un péptido nuevo inicialmente aislado del estomago de la rata, ha sido reconocido como un regulador importante de la secreción GH y la homeostasis de la energía. Ghrelin es el ligando endógeno del receptor secretagogo de la hormona del crecimiento y su actividad liberadora de GH in vivo depende del GHRH (Hataya et al., 2001). En los mamíferos adultos sanos, el GH es liberado en un patrón pulsátil distintivo altamente regulado, el cual ocurre de 4 a 8 veces dentro de las 24 horas, y tiene una importancia profunda por su actividad biológica (Argente et al., 1996). El patrón episódico de secreción se relaciona con la inducción óptima de los efectos psicológicos en un nivel periférico (Veldurs, 1998). La expresión, procesamiento, y/o liberación de las isoformas de GH y la proporción relativa entre ellos se encuentran bajo un control diferencial durante la etapa de crecimiento y desarrollo (Araburo et al., 2000).

La regulación y diferenciación de los somatotrofos también depende de los procesos de paracrina dentro de la pituitaria misma y comprende los factores de crecimiento y varios neuropéptidos, por ejemplo, el póptido vasoactivo intestinal (Rawlings et al., 1995), angiotensina 2, endotelina (Tomic et al., 1999), y activina (Billesbup et al., 1990). La expresión efectiva y regulada del GH y la trayectoria del factor I de crecimiento similar a la insulina (IGF-I) es esencial para el crecimiento lineal óptimo, la homeostasis de los carbohidratos, proteínas, y metabolismo de grasas y para proporcionar un balance de nitrógeno positivo (Murray y Shalet, 2000). El GHRH, GH, ghrelin, y la prolactina (PRL) y el IGF-I juegan un rol importante en la regulación de las respuestas inmunológicas humorales y celulares en situaciones fisiológicas, así como en situaciones patológicas (Geffner et al., 1997; Hattori et al., 2001). La expresión específica del tejido hipotalámico del gen GHRH no es requerida para la actividad, ya que el GHRH secretado extracranealmente, puede ser activo biológicamente (Faglia et al., 1992; Melmed, 1991). El estímulo patológico del GHRH (independientemente de su fuente, proveniente de los modelos transgónicos a los tumores pancreáticos) de actividad GH, puede dar como resultado la proliferación, hiperplasia, y adenoma de las células adenohipofisiales (Asa et al., 1992; Sano et al., 1988). Sin embargo, todavía no se conocen los efectos a largo plazo de un tratamiento de GHRH sostenido en la progenie de los animales que reciben la terapia.

Como se ha mostrado anteriormente la expresión ectópica de un GHRH de porcino resistente a la proteasa del suero novedoso dirigida por un plásmido de expresión que fue controlado por un promotor específico del músculo sintético, promovió niveles altos de GH e IGF-I en los cerdos después de la administración por medio de la inyección intramuscular y la electroporación ¡n vivo (Lopez-Calderon et al., 1999). Los propósitos del experimento descritos en este Ejemplo fueron evaluar el GHRH administrado por la terapia genética de ADN de plásmido para aumentar el crecimiento y cambiar la composición del cuerpo en la progenie de animales tratados durante el último trimestre de la gestación. En la modalidad especifica, el GHRH producido ectópicamente en los animales preñados, pasa a través de la placenta de la progenie, determina la hiperplasia pituitaria y aumenta la producción a largo plazo del GH, en la progenie, la cual entonces exhibiría un crecimiento aumentado y una composición corporal cambiada. Para evaluar los efectos del crecimiento de la progenie de una inyección de vector miogénico GHRH en un animal, se inyectaron ratas preñadas con 30 µg del ADN plásmido pSP-HV-GHRH ó pSP-pgal, a los 16 días de gestación. La inyección fue seguida por la electroporación, para mejorar la asimilación del plásmido. Todos los animales nacieron entre los 20 y 22 días de gestación. El número promedio de la progenie en las carnadas fue similar entre grupos (tratado (T), n = 10.8 cachorros/carnada; controles (C) n = 11.75 cachorros/carnada). El número de cachorros fue ecualizado entre las mad res con 1 0 cachorros/madre. A las dos semanas posteriores al parto, el peso promedio de los cachorros había aumentado un 9% por el g rupo tratado: T = 31 .47 ± 0.52 g vs. C = 28.86 ± 0.75 g , p < 0.014. Al destete, los pesos habían aumentado de un manera i mporta nte en la progenie T: hembra T (TF) promediaron 51 , 97 ± 0.83 g contra las hembras de control (CF) 47.07 ± 4.4 g , p < 0.043, y los machos tratados promediaron 60.89 ± 1 .02 g contra los machos de control (CM ) 49.85 ± 4.9 g , p < 0.001 (figura 14). La ventaja fue manten ida hasta las 1 0 semanas de edad , y la diferencia de peso se volvió i nsignificante a las 24 semanas. Ambos sexos ten ían hipertrofia muscular a las 3 semanas de edad con d iferencias i mportantes en el gastrocnemius (G) la tibia anterior (TA) músculo/peso (figura 1 5). La h ipertrofia TF del músculo fue mantenida a través del estudio, mientras que los machos no mostraron sig nos de h ipertrofia muscular después de 10 semanas de edad . Este cambio probablemente es atribuido a los cambios en los asteroides sexuales en la madurez de los machos, pero desencadenaron los efectos del G H fisiológicamente aumentado en el músculo del esqueleto. Las glándulas pitu itarias fueron d ísectadas dentro de los primeros minutos posteriores a la muerte y pesados. La proporción de peso de la pituitaria al peso total del cuerpo fue au mentada de manera i mportante hasta las 12 semanas posteriores al nacimiento , predominantemente en IF (figura 16). El aumento en el peso de la pituitaria se debe más probablemente a la hiperplasia de los somatotrofos, ya que es bien conocido que el GH H tiene la capacidad de estimular la síntesis y secreción de GH de la pituitaria anterior y tiene un efecto hipertrófico específico en los somatotrofos (Morel et al., 1999; urray et al., 2000). Esto es soportado por la evidencia hormonal (figura 17) e histológica (figura 18). El análisis Northern blot de la forma de pituitarias de los animales inyectados mostró un aumento considerable en el mARN del GH y el PRL, combinado con una disminución de los niveles mARN de GHRH de las ratas endógenas. Con técnicas histológicas, un anticuerpo GH anti-rata específico ilustra el número de aumento de los somatotrofos. Una indicación de los niveles sistémicos de GHRH y GH aumentado, es un aumento en la concentración del IGF-I en el suero. El IGF-I en el suero de la rata fue significativamente más alto en la progenie de ratas inyectadas con pSP-HV-GHRH hasta las 24 semanas posteriores al nacimiento, con un p < 0.05 en todos los puntos probados (figura 19). Se recolectaron y pesaron los órganos (pulmones, corazón, hígado, riñón, estómago, intestinos, glándulas adrenales, gónadas, cerebro). No se observó patología asociada en ninguno de los animales. Entre las técnicas no virales para la transferencia genética in vivo, la inyección directa del ADN plásmido en los músculos es simple, no es costosa y segura, pero las aplicaciones de esta metodología ha sido limitada por los niveles de expresión relativamente bajos de los vectores de expresión de ADN transferidos . En u na modalidad específica , con el objeto de obtener la regulación del crecimiento y la regu lación del cuerpo por terapia genética , fue necesario utilizar un innovador, en donde los animales objetivo son tratados directamente, pero ellos tienen características biológicas mejoradas debidas al tratamiento de las madres preñadas. Otra mejora im portante del vector plásmido, tal como el que aqu í se descri be, fue el empleo de un gen que codifica un aná logo GHRH más estable, HV-G HRH (Draghia-Akli et al . , 1999). La transferencia terapéutica electrogenótica permite que los genes sean transferidos de manera eficiente y expresados en los órganos o tejidos deseados, y tiene la capacidad de proporcionar la expresión a largo plazo después de u na sola administración . El método puede representar un n uevo método para una transferencia altamente efectiva de ácido nucleico que no requiera genes o partículas virales. Para las especies grandes, tales como cerdos o ganado, el uso del G H RH , el estimulante ascendente de GH , es u na estrategia alterna que puede aumentar, no solamente el funcionamiento del creci miento o la producción de leche, sino lo que es más importante, la eficiencia de la producción desde las perspectivas , tanto prácatica como metabólica (Dubreuil et al. , 1990). Sin embargo, el alto costo de los péptidos recombinantes y la frecuencia requerida de admi n istración limitan actualmente el uso difu ndido de este tratamiento . Estas desventajas mayores pueden ser el i minadas utilizando el método de transferencia de ácido n ucleico para dirigir la producción ectópica de GHRH, particularmente, cuando su producción es sostenida crónicamente. Por lo tanto, el crecimiento mejorado del animal ocurrió en la progenie después de una sola inyección electroporada de un plásmido que expresa un cADN de una hormona de liberación de la hormona del crecimiento mutada (GHRH), en los músculos de la tibia anterior de las ratas preñadas adultas. Los ratones recién nacidos (F1) fueron significativamente más grandes al momento del nacimiento. Los estudios del peso longitudinal y la composición del cuerpo mostraron una diferencia entre los dos sexos, con la edad. Las mediciones hormonales y bioquímicas concordaron con el patrón de crecimiento. El F1 tuvo glándulas pituitarias más grandes, con hiperplasias de somatotrofos y aumentó el contenido de GH. Los niveles de IGF-I en el plasma del F1 fueron significativamente más elevados. En resumen, estos descubrimientos novedosos demuestran que el GHRH podría ser utilizado para mejorar ciertas características de los animales a través de todas las generaciones después de la terapia genética basada en plásmidos. Los siguientes párrafos describen los experimentos utilizados en este ejemplo. Construcciones de ADN. El plásmido pSPc5-12 contiene un fragmento 360bp Sacl/BamHI del promotor sintético SPc5-12 (Li et al., 1999) en los sitios Sacl/BamHI de la estructura pSK-GHRH (Draghia-Akli et al., 1999). Los cADN del GHRH de porcino mutado fueron obtenidos mediante mutagónesis dirigida en el sitio del cADN del GHRH humano (Sistema de Mutagénesis in vitro de los Sitios II Alterados, Promega, Madison, Wl). El fragmento 228-bp mutado del GHRH porcino (parte del exon 2, todo el exon 3 y parte del exón 4), lo cual codifica el péptido de señal de 31 aminoácidos y un GHRH de porcino mutado (1-40)OH, se caracterizan por las siguientes substituciones de aminoácidos: Gly15 a Ala, Met27 a Leu y Ser28 a Asn, y la conversión de Tyr1 a His, y Ala2 a Val. Este fragmento fue clonado en los sitios BamHI/ Hind III del pSK-GHRH. El hGH pA es una región 3' sin traducir y una poliseñal (A) del gen GH humano. Los plásmidos fueron cultivados en DH5a E. coli (Gibco BRL, Carlsbad, CA). Las preparaciones del plásmido libre de endotoxina (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, EUA) fueron diluidas en PBS, pH 7.4 a 1 mg/ml. Invección intramuscular del plásmido v electroporación. Se alojaron ratas hembras Wistar adulto preñadas con el tiempo, y se cuidaron en una instalación para los animales Baylor College of Medicine, Houston, TX. Los animales fueron obtenidos bajo condiciones ambiéntales de 10 horas de luz/14 horas oscuridad, de acuerdo con la gula NIH, USDA y las instrucciones de la Ley de Bienestar de Animales, y el protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. El experimento se repitió dos veces. En el día 16 de la gestación, los animales (n = grupo 20) fueron pesados y anestesiados utilizando una combinación de 42.8 mg/ml de cetamina, 8.2 mg/ml de xilazina y 0.7 mg/ml de acepromazina, administrados intramuscularmente en una dosis de 0.5 a 0.7 ml/kg. El músculo de la tibia anterior izquierda de las ratas fue inyectado con 30 mg de pSP-HV-GHRH en 100 mi de PBS utilizando jeringas de insulina de 0.3 ce (Becton-Dickinson, Frankiin Lakes, NJ). Los animales de control fueron inyectados con PBS. Para ambos grupos, la inyección fue seguida por la electroporación por calibre, tal y como se describió (Draghia-Akli et al., 1999). Brevemente, dos minutos después de la inyección, la pata de la rata fue conectada entre un electrodo de dos agujas, de 1 cm de largo, calibre 26, 1 cm entre las agujas (Genetronics, San Diego, CA) y los pulsos eléctricos fueron aplicados al área. Se aplicaron en una orientación tres pulsos de 60-ms a un voltaje de 100 V/cm, y luego el campo eléctrico fue invertido, y se aplicaron tres pulsos más en la dirección opuesta. Los pulsos fueron generados con un Electro Square Porator T-820 / (Genetronics, San Diego, CA). Estudios de la progenie. Todas las ratas inyectadas dieron a luz de los 20 a los 22 días de gestación. En un primer estudio 240 progenies, y en el segundo estudio 60 progenies fueron analizadas desde el nacimiento hasta el 5 mes de edad (nacimiento, y semanas 2, 3, 6, 8, 12, 16, 22 posteriores al nacimiento). Los pesos corporales fueron registrados en estos momentos del tiempo utilizando la misma balanza calibrada. Al final del experimento, la composición del cuerpo fue realizada post-mortem. La sangre fue recolectada, centrifugada inmediatamente a una temperatura de 0°C, y almacenada a una temperatura de -80°C antes del análisis. Se extirparon los órganos (corazón, hígado, bazo, riñón, pituitaria, cerebro, adrenales, músculos del esqueleto - tibia anterior (TA), gastrocnemius (G), el soleó (S), y extensor digitorum longus (EDL), esqueleto, la grasa de los animales inyectados y los controles fue extraída, pesada en una balanza analítica y congelada en nitrógeno líquido. Se midió y se registro la longitud de la tibia. Análisis Northern blot de la pituitaria. Las pituitarias fueron congeladas inmediatamente y homogenizadas en solución D, y extractadas. 20 mg del ARN total fueron tratados con DNasa I, separados por tamaños en gal de agarosa formaldehído 1.5% transferidos a una membrana de nylon. Las membranas fueron hibridizadas con una muestra de cADN GHRH específica marcada 32P por preparación aleatoria. Radioinmunoensayo del IGF-I de la rata. El IGF-I de la rata fue medido por un radioinmunoensayo específico (Diagnostic System Laboratories, Webster, Texas). La sensibilidad del ensayo fue de 0.8 ng/ml; la variación intra-ensayo e inter-ensayo fue de 2.4% y 4.1% respectivamente. Estadísticas. Los valores mostrados en las figuras son el promedio ± s.e.m. valores específicos p obtenidos por comparación utilizando la prueba t del Estudiante o el análisis ANOVA. Se estableció un p<0.05 como el nivel de significancia estadística. REFERENCIAS CITADAS DOCUMENTOS DE PATENTE NORTEAMERICANA Patente Norteamericana No. 5,847,066 emitida el 8 de Diciembre de 1998, inventores nombrados Coy et al.

Patente Norteamericana No. 5,846,936 emitida el 8 de Diciembre de 1998, inventores nombrados Félix et al. Patente Norteamericana No. 5,792,747 emitida el 11 de Agosto de 1998, inventores nombrados Schally et al. Patente Norteamericana No. 5,776,901 emitida el 7 de Julio de 1998, inventores nombrados Bowers et al. Patente Norteamericana No. 5,756,264 emitida el 26 de Mayo de 1998, inventores nombrados Schwartz et al. Patente Norteamericana No. 5,696,089 emitida el 9 de Diciembre de 1997, inventores nombrados Félix et al. Patente Norteamericana No. 5,486,505 emitida el 23 de Enero de 1996, inventores nombrados Bowers et al. Patente Norteamericana No. 5,292,721 emitida el 8 de Marzo de 1994, inventores nombrados Boyd et al. Patente Norteamericana No. 5,137,872 emitida el 11 de Agosto de 1992, inventores nombrados Seely et al. Patente Norteamericana No. 5,134,210 emitida el 28 de Julio de 1992, inventores nombrados Boyd et al. 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Claims

144 REIVINDICACIONES 1. - Un método para mejorar o aumentar el crecimiento de una progenie de un animal hembra que comprende el paso de introducir una cantidad efectiva de un vector en las células de dicho animal hembra antes o durante la gestación de la progenie, en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos, una región 3' sin traducir bajo condiciones en donde la secuencia de nucleótidos es expresada y en donde la introducción y expresión del vector da como resultado un crecimiento mejorado o aumentado de la progenie. 2. - El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde en dichas células del animal hembra comprenden células diploides. 3.- El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde las células del animal hebra comprenden células musculares. 4. - El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos codifica una hormona de liberación de la hormona de crecimiento o subanálogo. 5. - El método tal y como se describe en la reivindicación 4, en donde la hormona de liberación de la hormona de crecimiento es la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:8, ó su análogo respectivo. 6. - El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde el promotor comprende un promotor miogónico sintético. 7. - El método tal y como se describe en la reivindicación 1, 145 en donde la región 3' sin traducir comprende una región hGH3' sin traducir. 8. - El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo, por ruta parenteral o una combinación de los mismos. 9. - El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. 10. - El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. 11. - El vector tal y como se describe en la reivindicación 1 , en donde el vector es un plásmido, un vector viral, un liposoma, un lípido catiónico o una combinación de los mismos. 12. - El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde el vector introducido en la hembra en una sola administración. 13.- El método tal y como se describe en la reivindicación 1, en donde la introducción ocurre durante el tercer trimestre de la gestación de dicha progenie. 14.- El método tal y como se describe en la reivindicación 1, el cual comprende además el paso de administrar a dicha hembra un ligando para un receptor secretagogo de la hormona de crecimiento. 146 15. - El método tal y como se describe en la reivindicación 14, en donde la administración del ligando es oral. 16. - Un método para aumentar los niveles de la hormona de crecimiento en una progenie de un animal hembra que comprende el paso de introducir una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de la progenie, en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos, y una región 3' sin traducir bajo condiciones en donde la secuencia de nucleótidos es expresada, y en donde la introducción y expresión del vector da como resultado niveles aumentados de la hormona de crecimiento en la progenie. 17. - El método tal y como se describe en la reivindicación 16, en donde las células del animal hembra comprenden células diploides. 18.- El método tal y como se describe en la reivindicación 16, en donde las células del animal hembra comprenden las células musculares. 19 - El método tal y como se describe en la reivindicación 16, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de liberación de la hormona de crecimiento o su análogo. 20. - El método tal y como se describe en la reivindicación 19, en donde la hormona de liberación de la hormona de crecimiento es la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, o su análogo respectivo. 21. - El método tal y como se describe en la reivindicación 16, en donde el promotor comprende un promotor miogénico sintético. 147 22 - El método tal y como se describe en la reivindicación 16, en donde la región 3' sin traducir comprende una región hGH3' sin traducir. 23.- El método tal y como se describe en la reivindicación 16, en donde el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo, con ruta parenteral o una combinación de los mismos. 24 - El método tal y como se describe en la reivindicación 16, en donde el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. 25.- El método tal y como se describe en la reivindicación 16, en donde el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. 26.- El vector tal y como se describe en la reivindicación 16, en donde el vector es un plásmido, un vector viral, un liposoma, un lípido catiónico o una combinación de los mismos. 27. - El método tal y como se describe en la reivindicación 16, en donde el vector es introducido en la hembra en una sola administración. 28. - El método tal y como se describe en la reivindicación 16, en donde la introducción ocurre durante el tercer trimestre de la gestación de la progenie. 29. - El método tal y como se describe en la reivindicación 16, el cual comprende además el paso de administrar a dicha hembra un 148 ligando para un receptor secretagogo de la hormona de crecimiento. 30. - El método tal y como se describe en la reivindicación 29, en donde la administración del ligando es oral. 31. - Un método para aumentar la masa corporal magra en una progenie de un animal hembra que comprende el paso de introducir una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de la progenie, en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos, y una región 3' sin traducir, bajo condiciones en donde la secuencia de nucleótidos es expresada y en donde la introducción y expresión del vector da como resultado una masa corporal magra aumentada en la progenie. 32. - El método tal y como se describe en la reivindicación 31, en donde las células del animal hembra comprenden células diploides. 33. - El método tal y como se describe en la reivindicación 31, en donde las células del animal hembra comprenden células musculares. 34. - El método tal y como se describe en la reivindicación 31, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de liberación de la hormona de crecimiento o su análogo. 35. - El método tal y como se describe en la reivindicación 34, en donde la hormona de liberación de la hormona de crecimiento es la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, o su análogo respectivo. 36.- El método tal y como se describe en la reivindicación 31, 149 en donde el promotor comprende un promotor miogénico sintético. 37.- El método tal y como se describe en la reivindicación 31, en donde la región 3' sin traducir comprende una región hGH2' sin traducir. 38.- El método tal y como se describe en la reivindicación 31, en donde el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo, por ruta parenteral, o una combinación de los mismos. 39.- El método tal y como se describe en la reivindicación 31, en donde el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. 40. - El método tal y como se describe en la reivindicación 31, en donde el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. 41. - El vector tal y como se describe en la reivindicación 31, en donde el vector es seleccionado del grupo consistente de un plásmido, un vector viral, un liposoma, un lípido catiónico o una combinación de los mismos. 42 - El método tal y como se describe en la reivindicación 31, en donde el vector es introducido en la hembra en una sola administración, 43.- El método tal y como se describe en la reivindicación 31, en donde la introducción ocurre durante el tercer trimestre de gestación de la progenie. 150 44. - El método tal y como se descri be en la reivi ndicación 31 , el cual comprende además el paso de administrar a la hembra un ligando para u n receptor secretagogo de la hormona de crecimiento. 45. - El método tal y como se describe en la reivind icación 44 , en donde la admi nistración del ligando es oral . 46. - Un método para au mentar los niveles de IGF-I en u na progenie de u n an imal hembra que comprende el paso de introducir una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de la progenie, y en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos y una región 3' sin trad ucir, bajo condiciones en donde la secuencia de n ucleótidos es expresada , y en donde la introducción y expresión del vector da como resultado niveles au mentados de I G F-I en dicha progenie. 47.- El método tal y como se describe en la reivi ndicación 46, en donde las células del animal hembra comprenden células diploides . 48. - El método tal y como se descri be en la reivindicación 46 , en donde las cél ulas del animal hem bra comprenden células musculares. 49. - El método tal y como se describe en la reivindicación 46 , en donde la secuencia de ácido nucleico cod ifica una hormona de liberación de la hormona de crecimiento o su análogo . 50. - El método tal y como se descri be en la reivi ndicación 49, en donde la hormona de liberación de la hormona de crecimiento es 151 la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, o su análogo respectivo. 51. - El método tal y como se describe en la reivindicación 46, en donde el promotor comprende un promotor miogénico sintético. 52. - El método tal y como se describe en la reivindicación 46, en donde la región 3' sin traducir, comprende una región hGH3' sin traducir. 53. - El método tal y como se describe en la reivindicación 46, en donde el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo, por ruta parenteral, o una combinación de los mismos. 54. - El método tal y como se describe en la reivindicación 46, en donde el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. 55.- El método tal y como se describe en la reivindicación 46, en donde el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. 56. - El vector tal y como se describe en la reivindicación 46, en donde el vector es un plásmido, un vector viral, un liposoma, un lípido catiónico o una combinación de los mismos. 57. - El método tal y como se describe en la reivindicación 46, en donde el vector es introducido en la hembra en una sola administración, 58. - El método tal y como se describe en la reivindicación 46, en donde la introducción ocurre durante el tercer trimestre de 152 gestación de la progenie. 59.- El método tal y como se describe en la reivindicación 46, el cual comprende además el paso de administrar a dicha hembra un ligando para un receptor secretagogo de la hormona de crecimiento. 60.- El método tal y como se describe en la reivindicación 59, en donde la administración del ligando es oral. 61 - Un método para aumentar la eficiencia en el alimento en una progenie de un animal hembra que comprende el paso de introducir una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de la progenie, y en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de nuecleótidos, una región 3' sin traducir, bajo condiciones en donde la secuencia de nucleótidos es expresada y en donde la introducción y la expresión del vector da como resultado una eficiencia del alimento aumentada en dicha progenie. 62. - El método tal y como se describe en la reivindicación 61, en donde las células del animal hembra comprenden células diploides. 63. - El método tal y como se describe en la reivindicación 61, en donde las células del animal hembra comprenden células musculares. 64. - El método tal y como se describe en la reivindicación 61, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de liberación de la hormona de crecimiento o su análogo. 65.- El método tal y como se describe en la reivindicación 64, 153 en donde la hormona de liberación de la hormona de crecimiento es la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, o su análogo respectivo. 66.- El método tal y como se describe en la reivindicación 61, en donde el promotor comprende un promotor miogénico sintético. 67 - El método tal y como se describe en la reivindicación 61, en donde la región 3' sin traducir es una región hGH3' sin traducir. 68. - El método tal y como se describe en la reivindicación 61, en donde el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo, por ruta parenteral, o una combinación de los mismos. 69. - El método tal y como se describe en la reivindicación 61, en donde el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo 70.- El método tal y como se describe en la reivindicación 61, en donde el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. 71. - El vector tal y como se describe en la reivindicación 61, en donde el vector es un plásmido, un vector viral, un liposoma, un lípido catiónico o una combinación de los mismos. 72. - El método tal y como se describe en la reivindicación 61, en donde el vector es introducido en el animal hembra en una sola administración. 73. - El método tal y como se describe en la reivindicación 61, en donde la introducción ocurre durante el tercer trimestre de 154 gestación de la progenie. 74.- El método tal y como se describe en la reivi ndicación 61 , el cual comprende además el paso de administra r a dicha hembra un l igando para u n receptor secretagogo de la hormona de creci miento . 75. - El método tal y como se describe en la reivindicación 74 , en donde la administración del ligando es oral . 76. - Un método para aumentar el índice de crecimiento en una progenie de u n an imal hembra que comprende el paso de introducir u na cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de la progenie, en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de n ucleótidos; y una región 3' sin trad ucir, bajo condiciones en donde la secuencia de n ucleótidos es expresada y en donde la i ntroducción y expresión del vector da como resultado un índice de crecimiento aumentado en la progenie. 77. - El método tal y como se descri be en la reivi ndicación 76, en donde las cél ulas del animal hembra comprenden células diploides . 78. - El método tal y como se describe en la reivindicación 76 , en donde las células del an i mal hembra comprenden células musculares. 79. - El método tal y como se describe en la reivi ndicación 76, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de liberación de la hormona de crecimiento o su análogo. 80. - El método tal y como se describe en la reivindicación 79 , 155 en donde la hormona de liberación de la hormona de crecimiento es la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, o su análogo respectivo, 81.- El método tal y como se describe en la reivindicación 76, en donde el promotor comprende un promotor miogénico sintético. 82.- El método tal y como se describe en la reivindicación 76, en donde la región 3' sin traducir es una región hGH3' sin traducir. 83. - El método tal y como se describe en la reivindicación 76, en donde el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo, por ruta parenteral, o una combinación de los mismos. 84. - El método tal y como se describe en la reivindicación 76, en donde el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. 85.- El método tal y como se describe en la reivindicación 76, en donde el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. 86. - El vector tal y como se describe en la reivindicación 76, en donde el vector es un plásmido, un vector viral, un liposoma, un lípido catiónico, o una combinación de los mismos. 87. - El método tal y como se describe en la reivindicación 76, en donde el vector es introducido en el animal hembra en una sola administración. 88. - El método tal y como se describe en la reivindicación 76, en donde la introducción ocurre durante el tercer trimestre de 156 gestación de la progenie. 89.- El método tal y como se describe en la reivindicación 76, el cual comprende además el paso de administrar a dicha hembra un ligando para un receptor secretagogo de la hormona de crecimiento. 90.- El método tal y como se describe en la reivindicación 89, en donde la administración del ligando es oral. 91. - Un método para aumentar la proporción de somatotrofos a otras células productoras de hormonas en una glándula pituitaria de una progenie de un animal hembra, en donde el método comprende el paso de introducir una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de la progenie, en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de ácido nucleico y una región 3' sin traducir, bajo condiciones en donde la secuencia de nucleótidos es espesada y donde la introducción y la expresión del vector da como resultado una proporción de somatotrofos a otras células productoras de hormonas en una glándula pituitaria de la progenie. 92. - El método tal y como se describe en la reivindicación 91, en donde las células del animal hembra comprenden células diploides, 93. - El método tal y como se describe en la reivindicación 91, en donde las células del animal hembra comprenden células musculares. 94. - El método tal y como se describe en la reivindicación 91, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de 157 liberación de la hormona de crecimiento o su análogo. 95.- El método tal y como se describe en la reivindicación 94, en donde la hormona de liberación de la hormona de crecimiento es la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:8, o su análogo respectivo. 96.- El método tal y como se describe en la reivindicación 91, en donde el promotor comprende un promotor miogénico sintético. 97. - El método tal y como se describe en la reivindicación 91, en donde la región 3' sin traducir es una región hGH3' sin traducir. 98. - El método tal y como se describe en la reivindicación 91, en donde el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo, por ruta parenteral, o una combinación de los mismos. 99. - El método tal y como se describe en la reivindicación 91, en donde el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. 100. - El método tal y como se describe en la reivindicación 91, en donde la hembra es un animal seleccionado del grupo consistente de un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra y gallina. 101.- El vector tal y como se describe en la reivindicación 91, en donde el vector es un plasmido, un vector viral, un liposoma, un llpido catiónico o una combinación de los mismos. 102.- El método tal y como se describe en la reivindicación 91, en donde el vector es introducido en la hembra en una sola administración. 158 103. - El método tal y como se describe en la reivindicación 91, en donde la introducción ocurre durante el tercer trimestre de gestación de la progenie. 104. - El método tal y como se describe en la reivindicación 91, el cual comprende además el paso de administrar a la hembra un ligando para un receptor secretagogo de la hormona de crecimiento. 105 - El método tal y como se describe en la reivindicación 104, en donde la administración del ligando es oral. 106. - El método tal y como se describe en la reivindicación 91, en donde las células productoras de hormonas son seleccionadas del grupo consistente de corticotrofos, lactotrofos y gonadotrofos. 107. - Un método para demorar el nacimiento de una progenie de un animal hembra que comprende el paso de introducir una cantidad efectiva de un vector en las células del animal hembra antes de o durante la gestación de la progenie, en donde le vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos; y una región 3' sin traducir, en condiciones en donde la secuencia de nucleótidos es expresada y en donde la introducción y expresión del vector da como resultado el nacimiento demorado de la progenie. 108 - El método tal y como se describe en la reivindicación 107, en donde las células del animal hembra comprenden células diploides. 109.- El método tal y como se describe en la reivindicación 107, en donde las células del animal hembra comprenden células musculares. 159 110. - El método tal y como se describe en la reivindicación 107, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de liberación de la hormona de crecimiento o su análogo. 111. - El método tal y como se describe en la reivindicación 110, en donde la hormona de liberación de la hormona de crecimiento es la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, o su análogo respectivo. 112. - El método tal y como se describe en la reivindicación 107, en donde el promotor comprende un promotor miogónico sintético. 113 - El método tal y como se describe en la reivindicación 107, en donde la región 3' sin traducir es una región hGH3' sin traducir. 114 - El método tal y como se describe en la reivindicación 107, en donde el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo, por ruta parenteral, o una combinación de los mismos. 115. - El método tal y como se describe en la reivindicación 107, en donde el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. 116. - El método tal y como se describe en la reivindicación 107, en donde el animal hembra es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. 160 117. - El vector tal y como se describe en la reivindicación 107, en donde el vector es un plásmido, un vector viral, un liposoma, un Ifpido catiónico o una combinación de los mismos. 118. - El método tal y como se describe en la reivindicación 107, en donde el vector es introducido en el animal hembra en una sola administración. 119. - El método tal y como se describe en la reivindicación 107, en donde la introducción ocurre durante el tercer trimestre de gestación de la progenie. 120.- El método tal y como se describe en la reivindicación 107, el cual comprende además el paso de administrar al animal hembra un ligando para un receptor secretagogo de la hormona de crecimiento. 121. - El método tal y como se describe en la reivindicación 120, en donde la administración del ligando es oral. 122. - Un método para aumentar la producción de leche en un animal que comprende el paso de introducir una cantidad efectiva de un vector en las células del animal, en donde el vector comprende un promotor; una secuencia de nucleótidos, una región 3' sin traducir, bajo condiciones en donde la secuencia de nucleótidos es expresada y en donde la introducción y expresión del vector da como resultado la producción aumentada de leche en el animal. 123 - El método tal y como se describe en la reivindicación 122, en donde las células del animal comprenden células diploides. 124.- El método tal y como se describe en la reivindicación 161 122, en donde las células del animal comprenden células musculares. 125 - El método tal y como se describe en la reivindicación 122, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica una hormona de liberación de la hormona de crecimiento o su análogo. 126.- El método tal y como se describe en la reivindicación 125, en donde la hormona de liberación de la hormona de crecimiento es la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, o su análogo respectivo. 127.- El método tal y como se describe en la reivindicación 122, en donde el promotor comprende un promotor miogénico sintético. 128. - El método tal y como se describe en la reivindicación 122, en donde la región 3' sin traducir comprende una región hGH3' sin traducir. 129. - El método tal y como se describe en la reivindicación 122, en donde el vector es introducido en las células del animal hembra por medio de electroporación, a través de un vector viral, en conjunto con un vehículo, por ruta parenteral, o una combinación de los mismos. 130. - El método tal y como se describe en la reivindicación 122, en donde el animal hembra es un humano, un animal de mascota, un animal de granja, un animal de alimento o un animal de trabajo. 131.- El método tal y como se describe en la reivindicación 162 122, T? donde el animal es un humano, cerdo, vaca, oveja, cabra o gallina. 132 - El vector tal y como se describe en la reivindicación 122, en donde el vector es un plásmido, un vector viral, un liposoma, un Kpido catiónico o una combinación de los mismos. 133 - El método tal y como se describe en la reivindicación 122, en donde el vector es introducido en el animal en una sola administración. 134. - El método tal y como se describe en la reivindicación 122, en donde la introducción ocurre durante el tercer trimestre de gestación de la progenie. 135. - El método tal y como se describe en la reivindicación 122, el cual comprende además el paso de administrar a la hembra un ligando para un receptor secretagogo de la hormona de crecimiento. 136. - El método tal y como se describe en la reivindicación 135, en donde la administración de ligando es oral.