CN104031930B - 一种提高母猪乳中营养及免疫物质含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及提高养猪效益的畜牧养殖领域，具体公开了一种提高母猪乳中营养及免疫物质含量的方法，应用体外基因转移新技术，通过在怀孕母猪肌肉组织高效表达GHRH，提高GH的水平，使母乳中初乳中乳蛋白、IgG、IL‑6的含量明显增加，其中乳蛋白的含量提高了约12.9%，IL‑6的含量提高了约112%，常乳中乳蛋白、IgG、IL‑2、IL‑6的含量也明显增加，其中乳蛋白的含量提高了约20%，IgG的含量提高了约366%，IL‑2的含量提高了约22.9%，IL‑6的含量提高了约27.35%。

Description

一种提高母猪乳中营养及免疫物质含量的方法

技术领域

本发明涉及提高养猪效益的畜牧养殖领域，更具体地，涉及一种提高母猪乳中营养及免疫物质含量的方法。

背景技术

母乳是猪繁殖过程中的基本要素，是新生仔猪唯一的营养来源。母猪乳中除水分外，还含有乳脂（三酯酰甘油、二酯酰甘油、一酯酰甘油、磷脂、脑昔脂类、神经节营脂、固醇和固醇酯及其衍生物、游离脂肪酸等）、乳蛋白（酪蛋白和乳清蛋白）、乳糖、维生素、矿物质等。乳中含有免疫物质，如乳清中的蛋白组分包括血清白蛋白(SA)、免疫球蛋白(Igs)、α-乳白蛋白(α-LA)、β-乳球蛋白(β-LG)、乳铁蛋白(LF)等对仔猪具有重要的免疫调节作用。

母猪的泌乳力是哺乳母猪生产性能的直接体现，母猪泌乳量的多少，直接影响哺乳仔猪的生长发育，进而影响仔猪的断奶窝重。而仔猪的断奶窝重是一个非常重要的选种指标，它与猪的产仔数、初生重、哺育率、哺乳期增重和断奶个体重等主要繁殖性状均呈正相关。因此，母猪的泌乳力是影响养猪业效益的关键因素。

影响母猪泌乳能力的因素有很多，如品种、营养、管理、环境等因素。因母猪在哺乳期代谢非常旺盛，营养需求较高，所以营养因素对泌乳极为重要。若母猪摄取的饲料养分达不到泌乳需要，则会动用体内已贮存的营养用来泌乳，母猪体况下降，泌乳力降低。母猪营养缺乏有两种情况：一是饲粮营养水平较低。母猪即使有足够的采食量，仍然满足不了泌乳的营养需要；二是母猪采食量少。尽管饲粮营养水平较高，能够达到哺乳母猪的饲养标准，但由于采食量少，母猪摄取的营养成分就少，不能满足泌乳需要，因此母猪泌乳量就会下降。环境因素也可以影响母猪的泌乳能力。夏季的高温会造成哺乳母猪热应激，导致哺乳母猪生产力下降。高温时母猪采食量下降、体重减轻，母猪产奶量降低。另外高温易造成母猪内分泌失调，增加患产后综合症（乳房炎- 子宫炎- 无乳综合症）的可能性，造成无乳或少乳。同时低温也会增加维持体温的能量消耗，从而降低泌乳能力。另外，猪舍的有害气体和噪音、胎次等因素也造成了泌乳力的降低。

提高母猪泌乳能力的方法目前多从品种选育、母猪群体结构的控制、加强饲养管理、营养调控等方面出发，但由于效果有限，所以由于母猪泌乳力不高引起的生产水平较低的问题十分突出。因此寻求新的提高母猪泌乳能力的方法具有有重要的实际价值和应用意义。

生长激素(growth hormone，GH)是调解动物和人生长的主要激素，具有促进生长、提高瘦肉率、抑制脂肪合成和提高免疫力的作用，在畜牧业上有着重要的应用价值。GH的水平高低主要受正性调控因子生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone，GHRH）和负性调控因子即生长激素释放抑制激素(somatostatin，SS，简称生长抑素)的调控。其中，GHRH控制着GH的脉冲式分泌，SS控制着基础分泌，且SS对GHRH有拮抗作用，影响GHRH基因的表达。GHRH于上世纪80年代首次由人的胰腺异位肿瘤中分离到，后证实在下丘脑的弓状核可分泌GHRH，并由门脉系统进入血液，后作用于脑垂体，使细胞内的cAMP和Ca²⁺浓度升高，从而促进GH的合成与释放，提高血中GH的浓度。但GHRH对母猪泌乳的影响还不清楚，特别是具体在提高母猪乳营养及免疫物质含量方面尚未见报道。

肌肉组织可以表达外源的基因，但表达效率很低，难于达到明显的作用。所以，采用提高肌肉组织表达效率的措施十分重要。MSP启动子是根据骨骼肌α-actin启动子能在肌肉组织中特异性启动外源基因表达的这一特性，将骨骼肌α-actin启动子加以改造，将E-box，MEF-2，TEF-1和SRE序列随意组合所构建的合成启动子重组库中筛选出的一种人工合成启动子，其在肌肉组织中的转录能力远远超过天然肌肉特异启动子和病毒启动子。电穿孔介导转移外源基因的方法是依据细胞生物学和免疫学等理论，采用微电子及计算机技术，通过设计特定的控制电路产生合适的脉冲电流，瞬间改变靶细胞的通透性，促进DNA、RNA等核酸及蛋白、化学小分子物质快速进入细胞，提高转染率、增强药物作用、增加表达量的效果。使用电穿孔技术增强了质粒的转移，从而可以使注射部位的肌肉成为一个生物反应器，用来持久产生和分泌蛋白质到血液循环系统中。在一次注射后电穿孔转移，相比于用腺病毒介导的基因转移，这种方法可以使蛋白质的表达水平量增加至少2-3个以上数量级，并有可能达到生理所需的水平。通过启动子的优化及电转移的方法，可以使外源基因在肌肉组织中的表达效率大大提高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中母猪泌乳能力有限、母猪生产水平较低的缺陷，提供了一种提高母猪乳中营养及免疫物质含量的方法。

本发明的第二个目的是提供pMSP-GHRH质粒在提高母猪乳中营养及免疫物质含量中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种提高母猪乳中营养及免疫物质含量的方法，即将pMSP-GHRH质粒注射入怀孕母猪的肌肉组织中，经基因转移后，测定母猪产仔后乳中乳成分和分子指标成分的变化；

所述pMSP-GHRH质粒的构建方法为：采用化学合成的方法，合成肌肉特异表达的启动子MSP，经过酶切及连接，将MSP序列克隆到PUC-57质粒，再经过酶切、连接，将MSP序列插入GHRH表达质粒中，得到肌肉特异表达的质粒pMSP-GHRH；

所述pMSP-GHRH质粒的注射剂量为2～10mg。

具体地，所述pMSP-GHRH质粒的构建方法为：采用化学合成的方法，合成肌肉特异表达的启动子MSP；所述启动子的序列如图1所示，序列长度为292bp，两端设计Kpn I和Hind III的粘性末端，将PUC-17质粒用1U的Kpn I和Hind III 37℃酶切1h，再与合成的MSP启动子用1U T4连接酶16℃连接4h，取1mL连接物转化到CaCl₂致敏的JM109，利用标准的PCR方法筛选阳性质粒，提到含MSP序列的PUC-57-MSP质粒；用上述方法用KpnI和HindIII分别对PUC-57-MSP和GHRH表达质粒pCMV-GRF进行酶切，1%琼脂糖电泳分离纯化酶切片段，用T4连接酶连接，将MSP序列插入GHRH表达质粒中，得到肌肉特异表达的质粒pMSP-GHRH，上述采用的分子克隆的方法均为公开成熟的DNA操作技术。

MSP启动子在肌肉组织中的转录能力远远超过天然肌肉特异启动子和病毒启动子，为使GHRH在肌肉组织中高效表达，发明人构建了pMSP-GHRH质粒。

所述pMSP-GHRH质粒能使母猪乳中营养和免疫物质的含量明显增加。

现有技术中记载GH在畜牧业上有重要的应用价值，母猪在泌乳期，GH的升高不仅能使体脂降解，还有利于乳腺发育及泌乳，而GH的水平高低又受GHRH的调控，因此，提高GHRH在母猪体内的表达量有助于提高母猪乳中营养物质和免疫物质的含量。

本发明通过启动子的优化及电转移的方法，使GHRH外源基因在肌肉组织中的表达大大提高。

优选地，所述pMSP-GHRH质粒的注射剂量为2mg。

优选地，所述基因转移利用体外基因转移仪进行，基因转移的电压为30～50V，脉冲频率为3～8HZ、脉冲脉宽为20～80ms。

使用电转移技术增强了质粒的转移，从而可以使注射部位的肌肉成为一个生物反应器，用来持久产生和分泌蛋白质到血液循环系统中。在一次注射后电转移，相比于用腺病毒介导的基因转移，这种方法可以使蛋白质的表达水平量增加至少2～3个以上数量级，并有可能达到生理所需的水平。

更优选地，所述基因转移的电压为36V，脉冲频率为5HZ，脉冲脉宽为50ms。

优选地，所述怀孕母猪为怀孕80～100天的母猪。

选择怀孕80～100天的母猪作为对象的原因在于：母猪分娩的时间为113～115天，通过提前注射，可以使外源表达的GHRH对乳腺的泌乳有充分的调控时间。更优选地，所述怀孕母猪为怀孕90天的母猪。

作为一种优选方式，本发明所述提高母猪乳中营养及免疫物质含量的方法包括以下步骤：

S1. 将怀孕80～100天的长白母猪后肢肌肉注射pMSP-GHRH质粒，注射剂量为2～10mg；

S2. 经体外基因转移仪处理，基因转移的电压为30～50 V，脉冲频率3～8 HZ、脉冲脉宽20～80ms；

S3. 于妊娠母猪产仔后3天内，采集母猪初乳；产仔15天时，采集母猪常乳，测定初乳和常乳中乳成分和分子指标成分的变化。

作为一种更优选方式，本发明所述提高母猪乳中营养及免疫物质含量的方法包括以下步骤：

S1. 将怀孕90天的长白母猪后肢肌肉注射pMSP-GHRH质粒，注射剂量为2mg；

S2. 经体外基因转移仪处理，基因转移的电压为36 V，脉冲频率5 HZ、脉冲脉宽50ms；

S3. 于妊娠母猪产仔后3天内，采集母猪初乳；产仔15天时，采集母猪常乳，测定初乳和常乳中乳成分和分子指标成分的变化。

8. pMSP-GHRH质粒在提高母猪乳中营养及免疫物质含量中的应用。

特别地，在收集初乳和常乳后，部分用于检测初乳及常乳中干物质、乳蛋白、乳脂、乳糖等乳成分浓度变化，部分乳样3000r/min 离心20min，取乳上清液，检测乳上清液中IgG、IL-2、IL-6等分子指标成分变化。

本发明还提供了所述pMSP-GHRH质粒在提高母猪乳中营养及免疫物质含量中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明利用肌肉特异性表达的pMSP-GHRH质粒，并通过注射特定剂量的质粒和特定条件下的体外基因转移，使pMSP-GHRH质粒在母猪肌肉组织中高效表达，GHRH的升高使得GH水平的升高，从而使母猪乳中营养物质和免疫物质含量的升高，经检测：初乳中乳蛋白、IgG、IL-6的含量明显增加，其中乳蛋白的含量提高了约12.9%，IL-6的含量提高了约112%，常乳中乳蛋白、IgG、IL-2、IL-6的含量明显增加，其中乳蛋白的含量提高了约20%，IgG的含量提高了约366%，IL-2的含量提高了约22.9%，IL-6的含量提高了约27.35%。

本发明应用基因转移新技术，提高了母猪乳中营养及免疫物质的含量，从而改善仔猪的营养，最终达到提高养猪业经济效益的目的，具有巨大的实际应用价值。

附图说明

图1为设计的肌肉特异表达启动子的序列；

图2为质粒构建流程图；

图3为肌肉特异性表达质粒；

图4为pMSP-GHRH阳性克隆HindⅢ和KpnⅠ双酶切鉴定；M：Marker DL2000；1-4：酶切后产物；

图5为pMSP-GHRH PCR鉴定；M．DL2000 Marker ；1-2：阴性对照；3-8：pMSP-GHRH。

具体实施方式

下面通过说明书附图和具体实施例对本发明进一步具体描述。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有常规的方法，所使用的配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径可得到的配料或材料。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

实施例1

一、pMSP-GHRH质粒的构建

采用化学合成的方法，合成肌肉特异表达的启动子。所述启动子的序列如图1所示，序列长度为292bp，两端设计Kpn I和Hind III的粘性末端，将PUC-17质粒用1U的Kpn I和Hind III 37℃酶切1h，再与合成的MSP启动子用1U T4连接酶16℃连接4h，取1mL连接物转化到CaCl₂致敏的JM109，利用标准的PCR方法筛选阳性质粒，提到含MSP序列的PUC-57-MSP质粒；用上述方法用KpnI和HindIII分别对PUC-57-MSP和GHRH表达质粒pCMV-GRF进行酶切，1%琼脂糖电泳分离纯化酶切片段，用T4连接酶连接，将MSP序列插入GHRH表达质粒中，得到肌肉特异表达的质粒pMSP-GHRH，所述pMSP-GHRH质粒的构建流程如图2。上述采用的分子克隆的方法均为公开成熟的DNA操作技术。

二、pMSP-GHRH质粒的提取

根据Birnboim和Doly菌体裂解方法，称取-72℃保存的菌体4g，重悬于40mL溶液N( 50mmol/L Tris，10mmol/L EDTA，RNaseA 40 Lg/mL，pH8.1)中。然后添加80mL溶液O(0.12 mol/L NaOH，1%十二烷基磺酸钠(SDS))，于室温下对菌体裂解5～10min。使用40mL3mol/L的醋酸钾溶液，于4℃中和裂解液30min。然后将裂解液以6724r/min(8000g)离心15min，取上清液；将上清液经过0.145/0.122Lm囊式过滤器过滤。部分过滤澄清液体直接进行色谱纯化，部分澄清液体加入1/20体积含20%的Triton溶液(750mmol/L NaCl，50mmol/LTris，20% Triton X-100或Triton X-114， pH7.10)，稍作搅拌混合后，于4℃静止1h，然后进行色谱纯化。

将装填好的510mL离子交换色谱柱(215cm×116cm)接入Biologic色谱系统。用0.13mol/L NaOH清洗色谱柱，用5倍柱体积含500mmol/L NaCl，50mmol/L Tris，15% (体积分数)异丙醇和0.115% (体积分数)非离子表面活性剂的缓冲液(pH7.10)平衡色谱柱，将处理好的样品置于冰水浴中(0～4℃)用蠕动泵进行上样，保持温度为10～13℃。然后用含625mmol/L NaCl，50mmol/L Tris和15%异丙醇的缓冲液(pH7.10)淋洗色谱柱至基线平稳。接着用1.125mol/L NaCl，50mmol/LTris 和15%(体积分数)异丙醇缓冲液(pH8.15)进行洗脱，线性流速为120cm/h，按照254nm紫外吸收曲线分峰收集。对照组样品不进行非离子表面活性剂处理，而且用于平衡色谱柱的缓冲液中不添加非离子表面活性剂，其他条件同实验组一样。将洗脱液收集入离心管中，加入等体积的异丙醇沉淀质粒。

三、pMSP-GHRH质粒的灭菌

将异丙醇沉淀获得的质粒用75%乙醇浸泡30min灭菌，无菌生理盐水洗涤3次，再用无菌生理盐水悬浮。

四、pMSP-GHRH质粒的注射及电转移

将胎次在2～3胎的20头怀孕90天的母猪（长白猪）随机分成2组，第一组注射生理盐水1mL，第二组注射浓度为2mg/mL的质粒1mL，注射部位为后肢肌肉。后经体外基因转移仪处理，转移电压为36V，脉冲频率5HZ，脉冲脉宽50ms；于妊娠母猪产仔后3天内，采集母猪初乳；产仔15天时，采集母猪常乳，部分用于检测初乳及常乳中干物质、乳蛋白、乳脂、乳糖等乳成分浓度变化；部分乳样3000r/min 离心20min，取乳上清液，检测乳上清液中IgG，IL-2，IL-6等分子指标成分变化。

其中，乳清IgG的测定方法为：

（1）配制标准品：0、0.58、2.34、9.38、37.5、150µg/mL，所述标准品为猪乳IgG冻干品；

（2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，每个标准品和空白卡建议做复孔；每个样品根据自己的数量来决定，能使用复孔的尽量使用复孔；

（3）加样：分别设标准品孔、待测样品孔（用前稀释500倍）；每孔分别加标准品或待测样品50µL；设置一个空白孔不加任何液体；

（4）每孔加入酶结合物50µL（空白孔不加），轻轻震荡混匀，覆上新的板贴，37℃温育40h；

（5）弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液（将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释25倍备用)，静置2min后弃去，如此重复5次，拍干；

（6）显色：每孔底物溶液90µL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15～30min；

（7）终止：每孔加入终止液50µL，终止反应（此时蓝色转为黄色）；

（8）测定：以空白调零，450nm波长依次测量各孔的吸光度（OD值）；测定应在加入终止液后10分钟内进行；

（9）根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

其中，乳清IL-2的测定方法为：

（1）配制标准品：0、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1000pg/mL，所述标准品为猪乳IL-2冻干品；

（2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白卡建议做复孔；每个样品根据自己的数量来决定，能使用复孔的尽量使用复孔；

（3）加样：分别设标准品孔、待测样品孔；每孔分别加标准品或待测样品100µL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2h；

（4）弃去液体，甩干，不用洗涤；

（5）每孔加入生物素标记抗体工作液（临用前按100倍稀释）100µL，覆上新的板贴，37℃温育1h；

（6）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液（将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释25倍备用)，静置2min后弃去，如此重复3次，拍干；

（7）每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin）工作液（临用前按100倍稀释）100µL，覆上新的板贴，37℃温育1h；

（8）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液（将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释25倍备用)，静置2min后弃去，如此重复5次，拍干；

（9）显色：每孔底物溶液90µL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15～30min；

（10）终止：每孔加入终止液50µL，终止反应（此时蓝色转为黄色）；

（11）测定：以空白调零，450nm波长依次测量各孔的吸光度（OD值）；测定应加入终止液后10min内进行；

（12）根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

其中，乳清IL-6的测定方法为：

（1）配制标准品：0、1.25、2.5、5、10、20、40、80pg/mL，所述标准品为猪乳IL-6冻干品；

（2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白卡建议做复孔；每个样品根据自己的数量来决定，能使用复孔的尽量使用复孔；

（3）加样：分别设标准品孔、待测样品孔；每孔分别加标准品或待测样品100µL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2h；

（4）弃去液体，甩干，不用洗涤；

（5）每孔加入生物素标记抗体工作液（临用前按100倍稀释）100µL，覆上新的板贴，37℃温育1h；

（6）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液（将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释25倍备用)，静置2min后弃去，如此重复3次，拍干；

（7）每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin）工作液（临用前按100倍稀释）100µL，覆上新的板贴，37℃温育1h；

（8）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液（将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释25倍备用)，静置2h后弃去，如此重复5次，拍干；

（9）显色：每孔底物溶液90µL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15～30min；

（10）终止：每孔加入终止液50µL，终止反应（此时蓝色转为黄色）；

（11）测定：以空白调零，450nm波长依次测量各孔的吸光度（OD值）；测定应加入终止液后10min内进行；

（12）根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

经检测，母猪初乳中乳蛋白、IgG、IL-6的含量明显增加，其中乳蛋白的含量提高了约12.9%，IL-6的含量提高了约112%，常乳中乳蛋白、IgG、IL-2、IL-6的含量明显增加，其中乳蛋白的含量提高了约20%，IgG的含量提高了约366%，IL-2的含量提高了约22.9%，IL-6的含量提高了约27.35%。具体结果见表1。

表1 2mg GHRH表达质粒对母猪乳成分的影响

注：各数据均用T-test分析，采 用均值±标准误表示（Mean±S.E.），*为差异显著（P<0.05），**为差异极显著（P<0.01）。

对比例1

其他步骤同实施例1，不同的是采用怀孕100天的母猪，注射剂量为4mg质粒，基因转移仪处理，转移电压为50V，脉冲频率8HZ，脉冲脉宽30ms；具体结果见表2。

经检测，母猪初乳中乳蛋白、IgG、IL-2、IL-6的含量明显增加，其中乳蛋白的含量提高了约14.5%，IL-2的含量提高了32.5%，IL-6的含量提高了约68.4%，常乳中IgG、IL-2、IL-6的含量明显增加，其中IgG的含量提高了约252%，IL-2的含量提高了约23.8%，IL-6的含量提高了约11.6%。具体结果见表2。

表2 4mg GHRH表达质粒对母猪乳成分的影响

注：各数据均用T-test分析，采用均值±标准误表示（Mean±S.E.），*为差异显著（P<0.05），**为差异极显著（P<0.01）。

对比例2

其他步骤同实施例1，不同的是采用怀孕80天的母猪，注射剂量为6mg质粒，基因转移仪处理，转移电压为80V，脉冲频率3HZ，脉冲脉宽80ms。

经检测，母猪初乳中乳蛋白、IgG、IL-2、IL-6的含量明显增加，其中乳蛋白的含量提高了约17.2%，IL-2的含量提高了35.63%，IL-6的含量提高了约75.96%，常乳中IgG、IL-2、IL-6的含量明显增加，其中IgG的含量提高了约322%，IL-2的含量提高了约26.79%。具体结果见表3。

表3 6mg GHRH表达质粒对母猪乳成分的影响

对比例3

其他步骤同实施例1，不同的是采用怀孕85天的母猪，注射剂量为8mg质粒，基因转移仪处理，转移电压为40V，脉冲频率6HZ，脉冲脉宽40ms。

经检测，母猪初乳中乳蛋白、IgG、IL-2、IL-6的含量明显增加，其中乳蛋白的含量提高了约26.37%，IL-2的含量提高了42.35%，IL-6的含量提高了约76.53%，常乳中IgG、IL-2、IL-6的含量明显增加，其中IgG的含量提高了约328%，IL-2的含量提高了约33.44%，IL-6的含量提高了约18.1%。具体结果见表4。

表4 8mg GHRH表达质粒对母猪乳成分的影响

从实施例1和对比例1～3可知，无论是初乳还是常乳，其乳中各个免疫和营养物质提高的含量各不相同，实施例1中乳蛋白、IgG、IL-2、IL-6含量较高，且质粒的注射剂量最小（2mg），其体外转移时的参数较小，在生产和实际应用中，综合考虑投入成本和收益，可以确定实施例1所述技术方案所得到的母猪乳中免疫和营养物质含量提高最多。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种提高母猪乳中营养及免疫物质含量的方法

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 292

<212> DNA

<213> MSP启动子

<400> 1

aagcttcacc attcctcacg acacccaaat atggcgacgg gtggtaagga gtggcgagat 60

ttttattgag gggtggtaag gagtgggttg tggacgacgg acggcgctct aaaaataact 120

cccgcgagat ttttattgag gggtggtaag gagtggacac ccaaatatgg cgacggcacc 180

attcctcacc tgtgggttta taccgctgcc ccggggccgc attcctgggg gccgggcggt 240

gctcccgccc gcctcgataa aaggctccgg ggccggcggc ggcccaggta cc 292

Claims (6)

1.pMSP-GHRH质粒在提高母猪乳中乳蛋白、IgG、IL-6含量中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将pMSP-GHRH质粒注射入怀孕母猪的肌肉组织中，经体外基因转移后，测定母猪产仔后乳中乳成分和分子指标成分的变化；

所述pMSP-GHRH质粒的构建方法为：采用化学合成的方法，合成肌肉特异表达的启动子MSP，经过酶切及连接，将MSP序列克隆到PUC-57质粒，再经过酶切、连接，将MSP序列插入GHRH表达质粒中，得到肌肉特异表达的质粒pMSP-GHRH；

所述pMSP-GHRH质粒的注射剂量为2～10mg；所述基因转移利用体外基因转移仪进行，基因转移的电压为30～50V，脉冲频率为3～8HZ、脉冲脉宽为20～80ms；所述怀孕母猪为怀孕80～100天的母猪。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述pMSP-GHRH质粒的注射剂量为2mg。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述基因转移利用体外基因转移仪进行，基因转移的电压为36V，脉冲频率为5HZ、脉冲脉宽为50ms。

5.根据权利要求2至4任一项所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 将怀孕80～100天的长白母猪后肢肌肉注射pMSP-GHRH质粒，注射剂量为2～10mg；

S2. 经体外基因转移仪处理，基因转移的电压为30～50 V，脉冲频率3～8 HZ、脉冲脉宽20～80ms；

S3. 于妊娠母猪产仔后3天内，采集母猪初乳；产仔15天时，采集母猪常乳，测定初乳和常乳中乳成分和分子指标成分的变化。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 将怀孕90天的长白母猪后肢肌肉注射pMSP-GHRH质粒，注射剂量为2mg；

S2. 经体外基因转移仪处理，基因转移的电压为36 V，脉冲频率5 HZ、脉冲脉宽50 ms；

S3. 于妊娠母猪产仔后3天内，采集母猪初乳；产仔15天时，采集母猪常乳，测定初乳和常乳中乳成分和分子指标成分的变化。