CN105219774B

CN105219774B - 猪胰岛素特异性表达启动子pip2及其应用

Info

Publication number: CN105219774B
Application number: CN201510653817.3A
Authority: CN
Inventors: 蒋钦杨; 韦玲静; 严雪瑜; 郭亚芬; 兰干球
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2015-10-10
Filing date: 2015-10-10
Publication date: 2019-04-30
Anticipated expiration: 2035-10-10
Also published as: CN105219774A

Abstract

本发明属于分子遗传学技术领域，尤其涉及一种猪胰岛素特异性表达启动子PIP2及其应用。一种猪胰岛素特异性表达启动子PIP2，所述的猪胰岛素启动子PIP2具有SEQ ID No.1所示的序列。本发明的猪胰岛素启动子PIP2可为转基因调控我国小型猪胰腺β细胞功能研究和糖尿病模型制备提供依据；本发明从中国地方猪品种中分离的猪胰岛素启动子PIP2能够特异性调控目的基因在胰腺组织中表达，为转基因调控猪β细胞功能的动物模型建立奠定了基础。

Description

猪胰岛素特异性表达启动子PIP2及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学技术领域，尤其涉及一种猪胰岛素特异性表达启动子PIP2及其应用。

背景技术

W.Yang等调查显示，我国20岁以上成年人糖尿病患病率为9.7％，总人口数达9240万，其中2型糖尿病患者占糖尿病人口总数的90％以上。2型糖尿病病理特征表现为：以胰岛素抵抗为主，伴胰岛素分泌不足，至以胰岛素分泌不足伴随胰岛素抵抗(WHO 1999标准)。血糖浓度的稳定与胰腺组织β细胞分泌的胰岛素密切相关，因此构建β细胞功能受损的动物模型显得尤为重要。随着技术的发展，通过转基因制备具有不同特征的2型糖尿病模型更能满足实际需求。大鼠、小鼠和人的胰岛素启动子已用于胰岛特定类型的细胞靶向表达。大鼠胰岛素基因(INS2)启动子已广泛应用于不同品种小鼠胰腺β细胞目的基因表述。然而，J.Martin等研究表明，大鼠胰腺启动子调控大脑特定区域的异位表达可能导致在β细胞和神经细胞中出现表型。

小鼠模型和人类之间存在诸多差异，使其获得的数据用于人类疾病防治和治疗策略制订等方面存在局限。小型猪在形态学、解剖学、生理学、染色体结构和基因组序列等方面与人具有较高的相似性，尤其是猪的饮食结构和食品代谢等方面与人及其相似，使其在糖尿病研究中得到广泛应用。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种猪胰岛素特异性表达启动子PIP2及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种猪胰岛素特异性表达启动子PIP2，其具有SEQ ID No.1所示的序列。

本发明提供了一种猪胰岛素特异性表达启动子PIP2引物对，所述的猪胰岛素特异性表达启动子PIP2引物对具有SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的序列。

本发明还提供了所述的猪胰岛素特异性表达启动子PIP2或所述的猪胰岛素特异性表达启动子PIP2引物对在猪遗传改良和转基因表达中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明的猪胰岛素特异性表达启动子PIP2可为转基因调控我国小型猪胰腺β细胞功能研究和糖尿病模型制备提供依据。

2.本发明从中国地方猪品种中分离的猪胰岛素特异性表达启动子PIP2能够特异性调控目的基因在胰腺组织中表达，为转基因调控猪β细胞功能的动物模型建立奠定了基础。

附图说明

图1为启动子PIP2的PCR扩增电泳图；

其中：M为Marker2000；泳道1-3为PCRproduct of PIP2；泳道4为negativecontrol。

图2为PMD18-T-PIP2的菌液PCR产物电泳图；

其中：M为Marker2000；泳道1-3为PCRproductsof PIP2；泳道4为negativecontrol。

图3为启动子PIP2测序BLAST结果。

图4为启动子PIP2序列分析；

其中：划线部分为转录启动子区，方框部分为TATA盒和GC盒。

图5为双酶切产物电泳图；

其中：M为Marker2000；泳道1-3为pMD18-T-PIP2双酶切；泳道4-6为EGFP-1双酶切。

图6为EGFP-1-PIP2双酶切电泳图；

其中；M-Marker5000；泳道1-2为EGFP-1-PIP2质粒双酶切。

图7为转染前细胞状态；

其中：A为PK-15；B为C2C12；C为βTC-6。

图8为转染48h后细胞形态以及表达情况观察；

其中：A、B、C为EGFP-1-PIP2分别转染βTC-6、C2C12、PK15的细胞；D、E、F为EGFP-C1分别转染βTC-6、C2C12、PK15的细胞；G、H、J为EGFP-1分别转染βTC-6、C2C12、PK15的细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：

1.1试验材料

1.1.1试验样品

广西巴马小型猪血液样品采自广西大学巴马小型猪封闭猪场。

1.1.2菌株及克隆载体

DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；不含启动子的EGFP-1载体为广西大学动物遗传实验室保存。

1.1.3主要试剂及来源

2×ES Tap聚合酶购自北京康为世纪生物科技有限公司；

SnaBI、XbaI限制性内切酶、pMD18-T vector、T4连接酶购自TaKaRa公司；

基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒、小提质粒抽提试剂盒购自杭州博日(BioFlux)生物有限公司；

小提去内毒素质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司；

氨苄霉素、卡那霉素、氯化钠、氯化钾购自上海华舜生物技术有限公司；

胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、氯化钠：德国OXOID；

DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司；

细胞转染试剂、细胞培养基和FBS购自Gibco公司。

1.1.4试剂的配制

(1)LB液体培养基：称取胰蛋白胨2.0g，酵母浸出物1.0g，氯化钠2.0g，ddH₂O定容200mL，NaOH溶液调PH值7.0，高压灭菌后保存于4℃冰箱备用。

(2)琼脂平板的制作：称取胰蛋白胨2.5g，酵母浸出物1.25g，氯化钠2.5g，琼脂粉3.75g，ddH₂O定容250mL，调PH值到7.0后高压灭菌40分钟，稍稍冷却后按1：1000的比例加入100mg/mL的氨苄青霉素或卡那青霉素，以10mL一个的量倒板于玻璃平板内，完全凝固后保存于4℃冰箱。

(3)100mg/mL氨苄青霉素\卡那霉素储存液：称取1g氨苄青霉素溶于10mLddH₂O中，分装后保存于-20℃冰箱。

1.2试验方法

1.2.1 DNA提取

巴马小型猪血液样品DNA抽提按照DNA提取试剂盒说明书进行。

1.2.2引物的设计与合成

根据GenBank中已发表的普通猪胰岛素启动子2(PIP2)基因序列(序列号：AY044828.1)，设计一对特异性引物(Primer-F:5’-TACGTAGCCTTGCACACCCTCTCA-3’；Primer-R:5’-GGATCCACAGCTGGTCCCAGAGGG-3’。上下游引物的5’端分别添加SnaB I和XbaI酶切位点(划线部分)，所扩增的片段约为853bp，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增

以巴马小型猪基因组DNA为模板，扩增PIP2启动子序列，PCR反应体系为20.0μL：基因组DNA 1.0μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL，PCR Taq酶10.0μL(3mM Mg²⁺)，ddH₂O 8.0μL。反应程序：94℃预变性2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃延伸2min。终产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4目的片段连接T载体

PCR产物的回收纯化按照博日(BioFlux)胶回收试剂盒说明进行。将回收的PIP2片段连接至pMD18-T Vector，连接反应体系见表1。

表1连接反应液的组成

将连接反应液混匀、封口，于16℃连接10h以上。

1.2.5重组质粒的转化

从-80℃冰箱内取出DH5α感受态细菌握融。

将连接液注入50μL感受态细胞中混匀，在冰上静置30min。

42℃的水浴中热激活1min，避免晃动。

快速将EP管置于冰上冷却5min。

加入500μL无抗生素的普通LB液体培养基，37℃，200rpm摇床培养1小时。

用无菌弯头玻璃棒将100μL菌液铺于含氨苄青霉素(AMP)的琼脂平板，37℃正面放置15～30min后，倒置培养过夜。

观察培养的平板是否有菌落生长。16h后从平板上分别挑取单个菌落于1mL含有氨苄青霉素(AMP)的LB培养液中，37℃，200rpm振荡培养5小时。

1.2.6重组质粒鉴定

以培养的菌液为模板，PCR扩增体系、程序同1.2.3。然后将PCR鉴定为阳性的菌液分别送上海英骏和深圳华大公司测序。

1.2.7质粒的双酶切

阳性菌液抽提质粒操作方法按照杭州博日(BioFlux)质粒提取试剂盒说明书进行。SnaBI和XbaI限制性内切酶酶切pMD18-T-PIP2重组质粒和EGFP-1质粒，反应体系见表2，在37℃放置4h。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

表2 pMD18-T-PIP2重组质粒的双酶切

1.2.8双酶切产物的纯化

PIP2和EGFP-1的双酶切产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，目的片段进行胶回收纯化，操作方法同1.2.4。

1.2.9胶回收产物的T4连接

将纯化后的双酶切产物T4连接，连接体系见表3。

表3连接反应液的组成

将连接反应液混匀、封口，于16℃水浴连接10h以上。

1.2.10重组质粒的转化

除了将原来的抗生素氨苄青霉素(AMP)改为卡那霉素(Kna)外，其余同步骤1.2.5～1.2.6的操作。将初步鉴定为阳性菌液分别送上海英骏和深圳华大生物工程有限公司进行测序。

1.2.11重组质粒的双酶切鉴定

将菌液PCR鉴定为阳性的菌液提取质粒，操作方法按照天根小量质粒提取试剂盒说明书进行。用SnaBI和XbaI限制性内切酶对EGFP-1-PIP2重组质粒进行双酶切，反应体系同表2。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.12去内毒素质粒的提取

操作过程按照OMEGA公司小提大量去内毒素试剂盒的说明书进行。

1.2.14重组质粒转染细胞

将构建好的EGFP-1-PIP2载体、不含启动子的EGFP-1载体和含启动子的EGFP-C1载体分别转染PK-15、C2C12和βTC-6细胞，转染时细胞需处在70％融合的对数生长期，以保证转染效率。转染方法如下：

(1)转染前24h以合适的细胞密度接种到6孔板中。

(2)500μL Opti-MEM无血清培养基加入约含有2.5μg去内毒素质粒和2.5μL的Plus^TMReagent溶液，混匀，静置5～10min。

(3)上述溶液加入10μL Lipofectamine^TM LTX Reagent溶液混匀，室温孵育25min。

(4)将6well板中的细胞用PBS漂洗两遍后，加入2mL新鲜培养液。

(5)将孵育好的混合液逐滴加入6well板中混匀。在37℃，5％的CO2培养箱中继续培养24～72h。

利用日本NIKON公司的80i正置荧光显微镜分别在转染后的48h观察各组细胞的荧光强度。

1.3结果分析

1.3.2 PCR扩增结果

PCR扩增猪胰岛素启动子(PIP2)序列，终产物在1％琼脂糖凝胶中电泳并观察结果。电泳结果如图1所示，扩增片段的大小与预期结果一致。

1.3.3 PMD18-T-PIP2重组质粒鉴定结果

1.3.3.1菌液PCR鉴定

以菌液为模板进行PCR扩增，获得的PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。图2结果显示挑取的3个单个菌落均为阳性。

1.3.3.2测序鉴定结果

如图3所示，PIP2的测序序列与GenBank发表的普通猪PIP2基因BLAST比对，其同源性为99％，存在7处碱基差异，从起始密码子ATG(+1)上游-447处G突变为A，-533处A突变为G，-672～-673处C碱基缺失，-692和-694处N突变为G，-808处G突变为A。

1.3.4启动子核心序列分析

用Neural Network Promoter Prediction分析这段序列，发现其存在1个转录启动区，Score值为1.00(详见图4)。对启动核心元件分析表明，在起始密码子ATG(+1)上游存在一个TATA-box(-245～-250位点)和一个GC-box(-514～-519位点)。

1.3.5 PMD18-T-PIP2双酶切

将PMD18-T-PIP2和EGFP-1载体质粒分别用SnaBI和XbaI内切酶酶切。电泳结果如图5所示，泳道1、2、3为PMD18-T-PIP2的双酶切结果，有两个条带，一条为pMD18-T空载，另一条为PIP2目的条带；泳道4、5、6为EGFP-1的双酶切结果。

1.3.6 EGFP-1-PIP2双酶切鉴定

将构建的重组质粒用SnaBI和XbaI双酶切，获得大小为853bp的目的片段(详见图6)，表明PIP2序列已被插入到EGFP-1中。

1.3.7重组质粒质量检测结果

利用核酸仪测得重组质粒EGFP-1质粒及阳性对照EGFP-C1质粒的浓度分别为700ng/μL、800ng/μL和1346.8ng/μL，均达到了细胞转染要求的浓度，可用于下一步的转染实验。

1.3.8转染前细胞形态观察

转染前一天以合适的细胞密度传代至60mm的培养皿中，转染前观察细胞的生长情况，若细胞生长状态良好，并达到70％融合的对数生长期，即可用于进行细胞的转染实验(详见图7)。

1.3.9细胞转染结果检测

利用日本NIKON公司的80i正置荧光显微镜在转染后48h观察各组细胞的荧光强度，结果如图8所示，由图可见EGFP-1-PIP2组和EGFP-C1组细胞均发荧光，细胞形态清晰，细胞核明显，而EGFP-1组和水空白对照组未见有荧光。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims

1.一种猪胰岛素特异性表达启动子PIP2在猪遗传改良和转基因表达中的应用，其特征在于：所述的猪胰岛素特异性表达启动子PIP2为SEQ ID No.1所示的序列；扩增所述的猪胰岛素特异性表达启动子PIP2的引物对为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示的序列。