CN108192903A

CN108192903A - 一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN108192903A
Application number: CN201810098175.9A
Authority: CN
Inventors: 刘森林; 周鹏; 陈伟钊
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2018-06-22
Anticipated expiration: 2038-01-31
Also published as: CN108192903B

Abstract

本发明公开一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用，属于生物技术领域。该WMN‑3基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAA结束，共包括1476个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。上述碱性木聚糖酶WMN‑3基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。本发明还公开了上述碱性木聚糖酶WMN‑3在造纸等工业中的应用。

Description

一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用。

背景技术

木聚糖是以木吡喃糖为单位的由β-1,4键连接的半纤维素，富含于阔叶树和大多数一年生植物体内。而半纤维素在自然界中含量占生物量的30％，仅次于纤维素。

木聚糖酶是将木聚糖催化水解成低聚木糖或木寡糖的酶系总称，包括多种木聚糖内切酶和外切酶，广泛分布于细菌、真菌、酵母、放线菌、反刍动物瘤胃、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中，其中细菌来源的中性或碱性木聚糖酶具有较高的耐碱性和热稳定性。木聚糖酶具有广泛的应用，在造纸工业中，可应用于纸浆漂白、废纸脱墨；在饲料行业中，木聚糖酶可降低小麦型日粮水溶性木聚糖导致的食糜黏性增高，从而提高消化酶对底物的作用效率，同时木聚糖酶可作用于不溶性非淀粉多糖，破碎植物细胞壁，并释放出营养物质；在酿酒和食品行业中应用也非常广泛，如木聚糖酶添加到面粉中，可以改善面团的持水性、稳定性和对过度发酵的耐受性，提高入炉急涨性能，增大烘烤后面包的体积，改善面包心质地，降低面包的老化速率，延长货架寿命。

根据催化域氨基酸序列及结构的相似性，木聚糖酶多被划分为糖苷水解酶10家族或第11家族。另外，第5家族、第7家族、第8家族或第43家族的木聚糖酶也有报道。大部分木聚糖酶属于F/10和G/11两大家族。G/11木聚糖酶多为单结构域，相对分子质量较小，催化产物中寡聚糖较多，而单糖较少，酶的最适作用温度为50～60℃，酶的空间结构呈“右手半握状”。F/10木聚糖酶则含有较多结构域，不仅具有催化结构域，而且还有纤维素结合结构域(Cellulose Binding Domain:CBD)，相对分子质量较大，催化产物中单糖较多，最适作用温度为60～80℃，酶的空间结构呈“碗状”。与G/11家族相比，F/10家族木聚糖酶在耐高温、耐酸和耐碱等方面更具优越性。在密码子偏好性方面，F/10木聚糖酶基因的密码子以“A”碱基为主，而G/11家族以“G/C”碱基为主。目前，工业上直接利用木聚糖酶还存在一些问题：稳定性差、底物特异性低、使用寿命短和成本高等。作为一种微生物制剂，木聚糖酶对温度、湿度和酸碱度都有一定的要求。为了适应不同饲料加工工艺及应用的需要，常需筛选耐高温的菌种，或采用基因工程及蛋白质工程手段改造木聚糖酶的属性，以满足各种因素对木聚糖酶的要求。现阶段生产的木聚糖酶均为真菌来源的木聚糖酶，这些酶的最适作用pH值普遍小于5.5。此外，木聚糖酶特异性低，直接利用效果较差，因此还应深入研究底物种类及质量浓度与木聚糖酶用量的关系，探讨不同酶制剂间的配伍效果，提高木聚糖酶的底物特异性。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种碱性木聚糖酶WMN-3基因的核苷酸序列及其氨基酸序列。本发明根据木聚糖酶保守序列设计简并引物，用PCR的方法成功克隆出碱性木聚糖酶的酶基因。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述WMN-3基因的表达载体。

本发明的另一目的在于提供含有上述WMN-3基因的大肠杆菌菌株。

本发明的再一目的在于提供上述重组碱性木聚糖酶WMN-3的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种碱性木聚糖酶WMN-3基因，所述WMN-3基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

所述碱性木聚糖酶WMN-3基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAA结束，共包括1476个核苷酸。其中，前75个核苷酸为信号肽编码序列。

上述碱性木聚糖酶WMN-3基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

碱性木聚糖酶WMN-3基因开放阅读框编码491个氨基酸，其中，MKKFLATGALALSAALCTPAMLAFG序列(前25个氨基酸)为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌时在Gly²⁵位点被切除。因此，成熟的酶蛋白从Ala²⁶开始，共计466个氨基酸，其理论分子量(MWt)为50.23kD。

一种含有本发明WMN-3基因的表达载体。

所述的表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。

本发明的WMN-3基因被插入至pET-28a(+)载体中。

本发明的WMN-3基因被插入至pET-28a(+)载体中的EcoR I和Xho I酶切位点之间；

含有本发明的WMN-3基因的大肠杆菌菌株。

所述的大肠杆菌菌株含有本发明的表达载体。

一株表达碱性木聚糖酶WMN-3的菌株，是将上述核苷酸序列构建成载体后转染到大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21 Star(DE3)得到。

一株表达碱性木聚糖酶WMN-3的菌株的制备方法，包括如下步骤：

用PCR方法从Streptomyces sp.WMN-3(CCTCC NO：M 2017477)的基因组DNA中克隆出酶基因全长，将其插入到原核表达载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET-28a-WMN-3，并转化大肠杆菌E.coli(Escherichia coli)BL21 Star(DE3)菌株；经过筛选后得到表达所述的碱性木聚糖酶WMN-3的重组大肠杆菌菌株E.coli BL21 Star(DE3)-WMN-3；

所述的PCR的所用的引物的序列：

上游引物：5′-GATGAATTCGCCCCCGGCGCTGCGCAAGATGCCAC-3′；

(下划线的序列表示的是EcoR I酶切位点)

下游引物：5′-CCGCTCGAGGTTGCAGGTAGTACCGTTGAGAACAAATG-3′；

(下划线的序列表示的是Xho I酶切位点)

所述的PCR的反应体系为：

使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以Streptomyces sp.WMN-3的基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：

ddH₂O 14μL；10×PCR Buffer 2.5μL；dNTP Mixture 2μL；上游引物2μL；下游引物2μL；模板2μL；Ex Taq酶0.5μL；Total 25μL/Sample(样品)。

所述的PCR的反应条件为：

94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30Cycles；72℃7min；25℃保持。

所述的碱性木聚糖酶WMN-3在造纸等工业中的应用。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

根据酶基因序列BLAST分析结果结合酶蛋白在分子量及酶学特性等方面与己知蛋白的差异判断，碱性木聚糖酶基因WMN-3为一新发现的内切β-1,4-木聚糖酶基因。

附图说明

图1是Streptomyces sp.WMN-3菌基因组DNA电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL15000 Marker；泳道1为基因组DNA。

图2是碱性木聚糖酶WMN-3基因保守序列PCR结果的电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL1500 Marker；泳道1为WMN-3基因保守DNA序列。

图3是碱性木聚糖酶WMN-3基因的保守DNA序列与NCBI序列比对结果。

图4是碱性木聚糖酶WMN-3基因的保守DNA序列的上游PCR结果的电泳图；

其中：泳道M为takara公司的DL5000Marker；泳道1为WMN-3基因的保守DNA序列的上游PCR结果。

图5是碱性木聚糖酶WMN-3基因的保守DNA序列的下游PCR结果的电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL5000 Marker；泳道1为WMN-3基因的保守DNA序列的下游PCR结果。

图6是pET-28a(+)表达载体图谱。

图7是pET-28a(+)表达载体的多克隆位点图。

图8是碱性木聚糖酶WMN-3基因电泳图；其中：泳道M为takara公司的DL2000Marker；泳道1为WMN-3基因的PCR结果。

图9是碱性木聚糖酶WMN-3蛋白电泳图；其中：泳道M为Marker，takara公司proteinladder；泳道1为Ni柱纯化的重组目的蛋白。

图10是碱性木聚糖酶WMN-3最适反应pH的结果图。

图11是碱性木聚糖酶WMN-3最适反应温度的结果图。

图12是碱性木聚糖酶WMN-3pH稳定性的结果图。

图13是碱性木聚糖酶WMN-3温度稳定性的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1

(一)材料

1、菌种：嗜碱链霉菌，是从深圳某海岸的土样中筛选得到的产碱性木聚糖酶菌株Streptomyces sp.WMN-3，所述菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏时间：2017年9月7日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2017477。E.coli TOP10F′购自Invitrogen公司；

2、载体：连接DNA所用的载体是TaKaRa公司生产的pMD-19T Simple Vector。

3、培养基

(1)富集培养基：木聚糖8.0g，蛋白胨10g，NaC1 15g，KH₂PO₄ 1.5g，Na₂HPO₄·12H₂O9.0g，MgSO₄·7H₂O 2.0g，溶于1L ddH₂O，pH 9.0。

(2)选择培养基：木聚糖8.0g，KNO₃ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaC1 15g，KH₂PO₄1.5g，琼脂20g，溶于1L ddH₂O，pH 9.0。

(3)斜面培养基(保存菌种)：1.0％葡萄糖，0.5％蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.1％KH₂PO₄，0.02％MgCl₂，5.0％NaCl，1.0％Na₂CO₃，pH 9.0。

(4)LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂糖(固体培养基)15g，溶质溶于950mL蒸馏水中，用1M的NaOH调pH至9.0后加水至1L，121℃高压灭菌20min。

4、主要试剂：PCR所用的简并引物、特异性引物均为广州Invitrogen公司合成，木聚糖为Sigma公司生产，琼脂粉为Blowest公司生产，核酸染料GelView为BioTeke公司生产，所用试剂盒在文中分别另行标明，其余试剂均为国产分析纯。

5、仪器：AppliedBiosystems PCR仪、Eppendorf离心机、PowerPac电泳仪、SUKUN振荡摇床、YXQ-LS-50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅、电磁炉、电热恒温培养箱、电热恒温振荡水槽、台式紫外透照仪、4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱、移液枪、Dolphin-DOC成像系统等。

(二)实验方法和结果

1、采集菌株的筛选

(1)富集培养：称取1g土样，加入到100mL的无菌水中，充分摇匀，制成菌悬液，分别取1mL菌悬液接入到事先灭好菌的5mL富集培养基中，37℃富集培养48h。

(2)平板初筛：将富集培养后的菌液10倍逐级稀释，分别取稀释倍数为10^-3、10^-5、10^-7的菌悬液0.5mL涂布于含有木聚糖的碱性选择培养基平板，37℃培养48h，将透明圈较大的单菌落挑入碱性斜面培养基，如此反复多次，直至确定为纯菌为止，使用斜面培养基保藏原始菌种。

(3)本文使用其中一株透明圈较大的菌株进行研究，通过16S rDNA序列分析，确定为链霉菌属，命名为Streptomyces sp.WMN-3。

2、基因组DNA的提取

在37℃、220r/min摇瓶培养Streptomyces sp.WMN-3菌，72h后离心收集菌体，然后使用OMEGA公司的E.Z.N.A Bacterial DNA kit试剂盒进行基因组DNA提取，步骤如下：

(1)接种Streptomyces sp.WMN-3菌至20mL的LB培养基中，振荡培养1天。

(2)取1.5mL菌液置于EP管中，4,000rpm离心10min。

(3)彻底除去上清，加入180μL TE Buffer(若无可用无菌水替代)，混匀菌液；加入20μL 50mg/mL的溶菌酶，30℃放置15min。

(4)5,000rpm离心5min，沉淀细胞，弃去上清液，加入200μL Buffer BTL，搅拌、振荡以混匀细胞。

(5)可选：为了完全溶解细胞壁，尤其是革兰氏阳性菌的细胞壁，加入25～40mg的Glass Powder，振荡5min，静置使玻璃珠沉淀，将上清液转移至干净的EP管中。

(6)加入25μL Proteinase K Solution，振荡以混匀。55℃水浴振荡45min以完全溶解；如果无振荡水浴锅，则每20min左右振荡一次样本。

(7)加入5μL RNase A，上下颠倒几次以混匀，室温放置10～30min。

(8)可选：10,000rpm离心5min以沉淀不溶性碎片，将上清液小心吸入到一个无菌EP管中，不要吸入任何沉淀。

(9)加入220μL Buffer BDL，摇晃或简单振荡以混匀。65℃放置10min。(加入Buffer BDL后可能会出现细微束状沉淀物，不影响DNA的提取)

(10)加入220μL纯乙醇(室温，96％～100％)，剧烈振荡20s以彻底混匀。如果此时出现任何沉淀，上下拍打10次以敲碎沉淀。

(11)将吸附柱装在2mL收集管上面，将上述样品全部转入吸附柱，包括出现的所有沉淀。10,000rpm离心1min以结合DNA，去除收集管液体。

(12)将吸附柱放在一个新的2mL收集管中，加入500μL Buffer HB洗脱，10,000rpm离心1min，弃掉收集管液体，继续使用该收集管。

(13)加入700μL Wash Buffer，10,000rpm离心1min，弃掉收集管液体，继续使用该收集管。

(14)重复步骤(13)。

(15)将吸附柱和收集管12,000rpm离心2min以尽可能除去残存乙醇，否则会影响后续DNA的获得。

(16)将吸附柱置于一个干净(无核酸酶)的1.5mL EP管中，加入50～100μL预加热(65℃)的Elution Buffer至吸附柱中央，室温放置3～5min，10,000rpm离心1min以洗提DNA，-20℃保存。

采用1％琼脂糖凝胶电泳对提取产物进行检测。结果如图1所示，能看到一条较为明显的条带，所用DNA Ladder Marker最大条带为15,000bp，基因组条带在Marker最大条带之上，说明其大小超过15,000bp，符合基因组大小要求。

2、TouchDown PCR克隆木聚糖酶基因保守序列

(1)使用PrimerPremier 5.0软件设计上下游引物。根据已知的10家族木聚糖酶保守序列设计上游简并引物WMN-3JBUP(5'-CTCTGGAAGCCNAYNCMRTSNA-3')和下游简并引物WMN-3JBDOWN(5'-GACTGGGAYGTNGTNAAYGA-3')，送去合成。

(2)使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：

然后按照以下条件进行Touchdown PCR反应：

采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。结果如图2所示。在泳道1中，有一条大小约为250bp的条带，符合已知的10家族木聚糖酶基因保守序列大小，所以对该条带进行回收。

3、Touchdown PCR产物回收

PCR产物回收使用的是Omega公司生产的Gel Extraction Kit(100)D2500-01，主要步骤如下：

(1)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，减小凝胶体积，提高DNA回收率，之后放入EP管中。(注意切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤)

(2)切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤(3)的胶块融化时间，提高DNA的回收率。称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg＝1μL进行计算，向胶块中加入等量的胶块融化液Binding Buffer。

(3)50℃溶解7～15分钟，保证溶胶要完全，否则会影响后续回收。

(4)将溶胶放入层析柱中(不超过700μL)，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。

(5)加入300μL的Binding Buffer，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。

(6)加入700μL的SPW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。

(7)重复步骤(6)。

(8)将空柱13,000rpm离心2min，以去掉残存的乙醇，否则会严重影响后续DNA的回收。

(9)弃掉收集管，换成干净的EP管，往吸附柱正中间的吸附膜小心加入15μLElution Buffer，室温静置3min，13,000rpm离心2min，不立即用的话保存于-20℃冰箱中。

4、感受态细胞制备

感受态细胞的制备使用TaKaRa公司的Competent Cell Prepatation Kit试剂盒制备，步骤如下：

(1)用接种针挑取大肠杆菌在含氨苄青霉素(AMP)的LB固体培养基上分级划线，以能够出现单菌落为宜，37℃过夜培养。

(2)挑取菌落置于含20mL液体LB培养基的三角烧瓶中，37℃、220rpm培养。

(3)测定OD值，当OD600值达到0.35～0.5时，放置冰中停止培养，若OD值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率。

(4)取1mL上述菌液于1.5mL EP管中，4,000rpm、4℃离心5min，弃上清(尽量除去上清)。

(5)在每个EP管中加入100μL冰中预冷的Solution A，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡，4,000rpm、4℃离心5min，弃上清(尽量除去上清)。

(6)在每个EP管中加入100μL冰中预冷的Solution B，轻轻弹动EP管使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。感受态细胞制备完成，若不立即使用，置于-80℃保存。

5、Touchdown PCR产物的连接、转化和测序

(1)从-80℃冰箱中取100μL感受态细胞悬液，冰中使其解冻。

(2)将4.5μL回收的PCR产物、1.5μL pMD-19T Simple Vector和4μL Solution I转化酶(TaKaRa公司生产)加入100μL感受态细胞中混匀，16℃水浴连接3h。

(3)加入连接后的重组DNA溶液轻轻摇匀，冰上放置30min。

(4)42℃水浴中放置90s，之后迅速置于冰上冷却15min。

(5)向管中加入1mL LB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃、250rpm振荡培养1h,使细菌恢复正常生长状态,以表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。

(6)取1mL上述菌液6,000rpm离心5min，去除约1mL上清，剩下的混匀。取100μL涂布于含氨苄青霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24h。

(5)用接种环挑选长出的单菌落放于1mL LB培养基(加入1μL氨苄青霉素)中，37℃、250rpm摇菌直至菌液变浑浊(4～10h)，每组选取1个送去测序。

测序得到Streptomyces sp.WMN-3木聚糖酶基因保守序列的测序结果，其序列如下：

(a)核苷酸序列如SEQ ID No：3所示(243bp)：

(b)NCBI核苷酸序列比对结果

将该核苷酸序列在NCBI数据库上进行比对(BLAST)，发现该保守序列与同为10家族的木聚糖酶(Streptomyces davawensis strain JCM 4913)具有83％的较高相似性，可推断克隆的保守序列所在的基因属于10家族木聚糖酶基因。比对结果见图3。

6、TAIL-PCR克隆木聚糖酶基因保守序列的上下游基因

(1)TAIL-PCR是为了得到Streptomyces sp.WMN-3木聚糖酶基因保守序列上游和下游的基因，使用PrimerPremier 5.0软件设计特异性引物和随机引物。根据TouchdownPCR产物测序所得到的保守序列，分别设计2组20bp左右的上下游特异性引物，每组上游特异性引物(Upstream primer，简称USP)和下游特异性引物(Downstream primer，简称DSP)各有3个嵌套的引物用于TAIL-PCR的三轮反应。同时设计出7对随机引物(Arbitrarydegenerate primer，简称AD)。保守序列和引物序列见表1。引物送去合成后，即可进行下一步实验。

表1 Streptomyces sp.WMN-3保守序列及用于TAIL-PCR的引物

名称	序列(5′-3′)
		保守序列	如SEQ ID No：3所示(243bp)
WMN-3-USP1	ACTCAACGGACTGGATCAACG
		WMN-3-USP2	GATGTTCGCATTACCGAAC
WMN-3-USP3	TGCTTTGCCCTGGAACG
		WMN-3-DSP1	CGACGATTCTCTGGAAGCCG
WMN-3-DSP2	GTCAGCGGCACGGGCAGCA
		WMN-3-DSP3	ACCAAGCACCCGCTGGAAGA
AD1	AGTGNWGWANCAACG
		AD2	WGTGNAGAWNCAGASA
AD3	TNCSAGTWTGGWSTT
		AD4	CTWSNTACTNCTNTGC
AD5	TCWGNCTTANTANGT
		AD6	TGAGNAGWANSTNAGA
AD7	NGWCSAGWGANATGAA

(2)TAIL-PCR克隆上游基因

使用Takara的PCR Amplification Kit试剂盒，以基因组DNA为模板，按照如下反应体系配制PCR反应液：

然后按照以下条件进行第一轮TAIL-PCR反应：

第二轮TAIL-PCR反应体系同第一轮，但是将第一轮反应的PCR产物用ddH₂O稀释100倍后作为模板DNA，USP1换为USP2，反应条件如下：

第三轮TAIL-PCR反应体系同第一轮，但是将第二轮反应的PCR产物用ddH₂O稀释100倍后作为模板DNA，USP2换为USP3，反应条件同第二轮反应的一样。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮PCR产物进行检测。

通过3个嵌套的上游特异性引物和随机引物AD3进行TAIL-PCR，克隆出Streptomyces sp.WMN-3木聚糖酶基因保守序列的上游基因，其PCR产物电泳图如图4所示。从图4中可以看出，经过3轮PCR，泳道1出现的明显条带只有一条，大小约为600bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列上游基因。通过PCR产物回收、连接、转化并测序。

经过测序，Streptomyces sp.WMN-3木聚糖酶基因保守序列上游基因测序结果如下(728bp)：其核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。

(3)TAIL-PCR克隆下游基因

反应体系、反应条件同上游基因的克隆，相应的上游特异性引物换为下游特异性引物。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮PCR产物进行检测。

通过3个嵌套的下游特异性引物和随机引物AD1进行TAIL-PCR，克隆出Streptomyces sp.WMN-3木聚糖酶基因保守序列的下游基因，其PCR产物电泳图如图5所示。从图5中可以看出，经过3轮PCR，此时出现的明显条带只有一条，大小约为750bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列下游基因。通过PCR产物回收、连接、转化并测序。

经过测序，Streptomyces sp.WMN-3木聚糖酶基因保守序列下游基因测序结果如下(711bp)：其核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。

7、获得Streptomyces sp.WMN-3木聚糖酶基因全长序列

根据TAIL-PCR克隆得到的保守序列上下游基因的测序结果进行拼接，得到Streptomyces sp.WMN-3木聚糖酶基因全长序列。其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

碱性木聚糖酶基因序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框以起始密码子ATG开始而以终止密码子TAA结束，共包括1476个核苷酸。其中，前75个核苷酸为信号肽编码序列。

碱性木聚糖酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

经DNAssist Version 2.2软件分析得到，碱性木聚糖酶基因开放阅读框编码491个氨基酸，其中，前25个氨基酸为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌时在Gly²⁵位点被切除。因此，成熟的酶蛋白有共计466个氨基酸，其理论分子量(MWt)为50.23 kD。

根据序列分析结果结合酶蛋白在分子量及酶学特性等方面的差异判断，碱性木聚糖酶基因WMN-3为一新发现的内切β-1,4-木聚糖酶基因。

实施例2

(一)材料

1、菌种：嗜碱链霉菌Streptomyces sp.WMN-3菌株(CCTCC NO：M 2017477)。宿主菌E.coli BL21 Star(DE3)、E.coli TOP10F′均购自Invitrogen公司；

2、载体：大肠杆菌表达载体pET-28a(+)(Novagen，Kan^R)购自Novagen公司；载体图谱见图6，其多克隆位点图见图7。

3、培养基及缓冲液

(1)选择培养基：木聚糖8.0g/L，KNO₃ 1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，NaC1 15g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0；

(2)LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加琼脂15～20g/L，pH 9.0，121℃高压灭菌20min。

(3)TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl，pH8.0，1mmol/L EDTA，pH8.0。

(4)碱裂解液I、II、III(质粒提取)：碱裂解液I：葡萄糖50mmol/L，Tris-HCl(pH8.0)25mmol/L，EDTA 10mmol/L。每瓶约100mL，灭菌后4℃贮存。碱裂解液II：NaOH 0.2mmol/L，SDS 1％(w/v)。溶液不可贮存，现用现配。碱裂解液III：乙酸钾5mmol/L，冰乙酸11.5％(v/v)。

4、主要试剂：Acrylamide、N,N-甲叉双丙烯酰胺由Serva进口分装。DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA分子量标记、T4连接酶为宝生物公司产品；Lysozyme(DNase RNase non-detected，>70,000U/mg)、IPTG、一步法快速制备感受态细胞试剂盒(SSCS)为上海生工生物工程公司产品；蛋白分子量标记为Fermentas(MBI)公司产品；PCR引物合成由上海生工完成，DNA序列测定由Invitrogen公司完成；基因提取试剂盒、PCR产物片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Omega公司产品。

5、仪器：Thermal cycler PCR仪为Applied Biosystems By Life Technologies公司、DNA及蛋白电泳系统为Bio-rad公司产品；分光光度计及微量分光光度计为PharmaciaBiotech公司产品；Thermomixer comfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为Eppendorf公司产品；低温高速离心机为Sigma公司产品；Dolphin-DOC凝胶成像系统为美国WEALTEC公司产品；恒温摇床及恒温水浴锅为WAGEN公司产品。

(二)实验方法和结果

1、目的基因的分离

采用PCR的方法从Streptomyces sp.WMN-3菌中分离目的基因。在37℃，220r/min摇瓶培养Streptomyces sp.WMN-3菌，72h后离心收集菌体，然后利用The E.Z.N.ABacterial DNA Kit试剂盒提取基因组总DNA。根据目的基因，设计引入EcoR I和Xho I酶切位点(下划线)的PCR引物：

所述的PCR的所用的引物的序列：

上游引物：5′-GATGAATTCGCCCCCGGCGCTGCGCAAGATGCCAC-3′；

(下划线的序列表示的是EcoR I酶切位点)

下游引物：5′-CCGCTCGAGGTTGCAGGTAGTACCGTTGAGAACAAATG-3′；

(下划线的序列表示的是Xho I酶切位点)

所述的PCR的反应体系为：

所述的PCR的反应条件为：

然后按照以下条件进行Touchdown PCR反应：

采用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

反应完成后，取8μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。由图8可见，PCR扩增产物的大小约为1500bp，与WMN-3基因大小相符。将PCR产物回收、连接、转化并送Invitrogen公司进行测序鉴定。测序结果表明所扩增的序列与目的基因的序列一模一样。

2、重组质粒的构建

将克隆得到WMN-3基因经EcoR Ⅰ和Xho I双酶切后与采用同样酶切的大肠杆菌表达载体pET-28a(+)连接，得到重组质粒pET-28a-WMN-3。

连接反应体系如下：

16℃水浴中连接过夜后转化感受态细胞(连接反应中基因和质粒的摩尔比为9：1)。

3、E.coli TOP10F′和E.coli BL21 Star(DE3)感受态细胞的制备

(a)接种E.coli TOP10F′和E.coli BL21 Star(DE3)至LB培养基中，240r/min、37℃培养过夜；

(b)吸取0.1mL菌液至10mL LB培养基中，300r/min、37℃培养至OD600达0.5～0.7；

(c)吸取1mL OD600达0.5～0.7的菌液至1.5mL离心管中，12000r/min离心2min，彻底去除上清；

(d)加入100μL冰预冷的SSCS(一步法快速制备感受态细胞试剂盒，上海生工生物工程公司产品)，轻悬菌体即制成感受态细胞。可立即转化或于-70℃冻存。

4、转化E.coli TOP10F′感受态细胞

(a)10μL连接产物与100μL感受态细胞混匀，冰浴30min；

(b)42℃水浴90秒，冰浴2min；

(c)加入1mL LB培养基，混匀，37℃180r/min温浴1h；

(d)3000r/min离心1min，吸底部沉淀200μL至LB(含选择抗生素Kan，终浓度为50μg/mL)平板，用涂布器涂匀，37℃培养过夜。同时做两个对照：

对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。

对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μL菌液涂布于不含抗生素的LB平板上。

5、转化子的培养及检测

(a)转化16h后，观察实验组的平板，看是否长出菌落(没有的话就继续培养或者重新做转化)，然后用标记笔在培养皿的背面该菌落处划上圆圈，并标记“1”、“2”等数字，以便识别；

(b)在无菌条件下，向试管中加入5mL LB液体培养基，然后再往其中加入5μL的1000×卡那霉素溶液，使其终浓度为50μg/mL。随后在试管上标记“1”、“2”等数字；

(c)利用接种环，小心地将相应数字编号的菌落挑落进相应的试管中，混合均匀；

(d)将试管放入温控摇床，37℃、200rpm振荡培养16～24h；

(e)16h后，观察试管中的LB液体培养基是否变混浊(若无菌生长就继续培养或者重新转化)，在无菌条件下，在两个洁净的EP管中分别加入500μL的菌液和500μL 60％的甘油，混合均匀，并标记相应的数字，然后用封口膜将EP管封好，其中一管用于保留菌种之用，另一管为测序做准备，将两个EP管都放入-80℃贮存，剩余的菌液放入4℃冰箱中保存备用；

(f)利用菌液PCR的方法进行检测。

模板用1μL菌液代替，用上游引物EcoR I和下游引物Xho I进行PCR反应，再将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，将阳性克隆菌株经鉴定后甘油保存，送公司进行测序。

6、重组质粒的中量制备

使用Omega Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒，制备重组质粒，步骤如下：

(a)挑取抗性平板上的重组菌落至50mL LB(含选择抗生素Kan，终浓度为50μg/mL)液体培养基中，200r/min、37℃培养过夜。(b)将1～5mL培养液12000r/min离心3min，弃上清，收集菌体。(c)将菌体加入250μL冰预冷的裂解液Ⅰ中，剧烈振荡，将细胞完全打散；(d)加入250μL裂解液Ⅱ，轻柔反复颠倒数次(切勿涡旋振荡)后，室温静置2min；(e)加入350μL裂解液Ⅲ，盖紧管口，立即颠倒数次，直至出现白色絮状沉淀；(f)微量离心机12000r/min、4℃冷冻高速离心5min，上清液移至另一离心管中；(g)将离心管置入离心机，12000r/min、室温离心10min；上清转入一支新管中；(h)将试剂盒中的Akibaiin Column安置于CollectionTube中；(i)将离心管中的上清液转移至Akibaiin Column中，注意别吸入沉淀，12000r/min离心1min，弃去滤液；(j)加入500μL HB Buffer至Akibaiin Column中，12000r/min离心1min，弃去滤液；(k)加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min，弃去滤液；(l)重复加入700μL的DNA Wash buffer，然后10000rpm离心1min，弃去滤液；(m)再用12000rpm离心2min以除尽剩余的Wash buffer；(n)将Akibaiin Column放入一个洁净的EP管中，然后在Akibaiin Column膜的中央处加入30～50μL的Elution Buffer，室温放置2min，10000rpm离心1min将重组质粒pET-28a-WMN-3抽提下来。采用1％琼脂糖凝胶电泳对质粒回收产物进行检测。

7、E.coli BL21 Star(DE3)的转化

(a)将从重组E.coli TOP10F′中提取的质粒100μg与100μL感受态细胞混匀，冰浴30min。42℃水浴90秒，冰浴2min。

(b)加入1mL LB培养基，混匀，37℃、180r/min温浴1h。

(c)3000r/min离心1min，吸底部沉淀200μL至LB(含选择抗生素Kan，终浓度为50μg/mL)平板，用涂布器涂匀，37℃培养过夜。

经过筛选后得到可以高效表达的重组大肠杆菌菌株E.coli BL21 Star(DE3)-WMN-3。从E.coli BL21 Star(DE3)-WMN-3菌株中提取质粒为模板，用上游引物EcoR I和下游引物Xho I进行PCR反应，将PCR产物回收、连接、转化并送Invitrogen公司进行测序鉴定。测序结果表明重组质粒所携带的基因序列与目的基因的序列一模一样。可见，pET-28a-WMN-3重组质粒已经成功转入E.coli BL21 Star(DE3)。

8、重组大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)的诱导表达

(a)将筛选得到的阳性菌株E.coli BL21 Star(DE3)-WMN-3接种到装有10mL LB培养基的摇瓶中培养过夜。

(b)取过夜培养菌液100μL接种到装有50mL LB培养基的250mL摇瓶中培养。

(c)待OD值达到0.6时加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导。

(d)于23℃诱导12小时后进行取样的。取1mL发酵液离心，去除上清液，加入100μLpH 6.0PBS缓冲液，重悬后液氮反复冻融使细胞破碎，10000r/min高速离心2min，将适量经IPTG诱导的细胞破碎液上清加入到50mL平衡缓冲液(0.05mol/L Tris-HCL，0.2mol/LNaCL，pH8.0)中，上样流过螯合了Ni离子的琼脂糖凝胶柱，再用平衡液平衡UV值基线后，用咪唑洗脱液(0.05mol/L Tris-HCL，0.2mol/L NaCL，0.5M咪唑，pH8.0)进行梯度洗脱，(20mM，50mM，100mM，400mM)，仪器自动收集，5mL/管。结果，发现在50mM洗脱时出现酶活峰，收集并透析，经适当浓缩，得到碱性木聚糖酶WMN-3的纯酶液；进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(见图9)。泳道1中看出纯化的WMN-3蛋白的大小约为50KD，与理论值基本一致。

9、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

以Sambrook等的实验方法为基础，分离胶、浓缩胶浓度分别为12％和5％，电极缓冲液为pH 8.3 Tris-Gly缓冲液，考马斯亮蓝染色。

(a)聚丙烯酰胺凝胶的配制

分离胶的配制：

浓缩胶的配制：

(b)将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15～30min；

样品处理：将样品加入等量的2×Loading buffer，100℃加热3～5min，煮沸完毕后，立即放入到冰浴或者冷水中，使其冷却。然后12000rpm离心10min，取上清作分析；

(c)上样：将15μL样品加入到孔道中，并在其中一个孔道中加入5μL的预染蛋白Marker；

(d)电泳：在电泳槽中加入电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止；

(e)染色：将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4～6h；

(f)脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。

SDS-PAGE电泳结果如图9所示，泳道1可见到分子量约为50KD的明显条带，表明Streptomyces sp.WMN-3碱性木聚糖酶WMN-3基因在大肠杆菌中得到高效表达。

实施例3碱性木聚糖酶的酶学性质研究

(一)实验方法

1、最适反应pH及pH稳定性

取适量实施例2获得的碱性木聚糖酶的纯酶液，分别加入不同pH值的1％木聚糖溶液，按常规方法测定酶活力。同时，分别将纯酶液置于不同的预定pH条件下37℃保存60min，再按常规方法测定其剩余酶活力。

2、最适反应温度和温度稳定性

取适量实施例2获得的碱性木聚糖酶的纯酶液，分别置于不同预定温度条件下反应20min，测定其酶活力。同时，将纯酶液分别置于不同预定温度条件下保温60min，然后测定其剩余酶活力。

3、金属离子、表面活性剂和金属螯合物对酶活力的影响

取适量实施例2获得的碱性木聚糖酶的纯酶液，分别置于终浓度为10mM的各种金属离子以及0.2％、0.5％EDTA，0.01％、0.05％SDS(十二烷基磺酸钠)中，按照常规方法测定其酶活力。

(二)实验结果

1、最适反应pH

取适量纯酶液，分别加入不同pH值的1％木聚糖溶液，按常规方法测定酶活力，结果如图10所示。由图10可见，WMN-3酶的最适反应pH为8，为一碱性木聚糖酶。WMN-3的最适反应pH为8(以最适pH时的酶活力为100％)，该酶在pH5～9范围内相对酶活均大于60％，在酸性pH2～4酶活低于40％，pH>8酶活开始下降，但下降趋势较平稳，pH10仍有51％酶活，说明该酶在中性及碱性条件下都能发挥很好的作用。

2、最适反应温度

取适量纯酶液，分别置于不同预定温度条件下反应20min，测定其酶活力，结果如图11所示。由图11可见，WMN-3酶的最适反应温度为55℃。WMN-3反应的最适温度为55℃(以最适温度时的酶活力为100％)，50℃和60℃条件下，相对酶活分别为90％、94％。

3、pH稳定性

取适量纯酶液分别置于不同的预定pH条件下37℃保存60min，再按常规方法测定其剩余酶活力。结果(如图12)表明，该酶在pH6～10范围内，剩余酶活均有80％以上，说明该酶在弱酸至弱碱范围内能保持良好的稳定性。

4、温度稳定性

取适量纯酶液分别置于不同的预定温度条件下(20℃～70℃)保温60min，然后测定其酶活力。结果(如图13)表明，该酶40℃以下具有较好稳定性。该酶在低于40℃条件下温育60min酶活力基本保持不变，温度高于40℃该酶稳定性缓慢下降，70℃剩余酶活仍有62％。

5、金属离子、表面活性剂和金属螯合物对酶活力的影响

把纯化得到的WMN-3酶分别置于终浓度为10mM的各种金属离子，37℃保存30min后按照常规方法测定其酶活力，结果如表2所示。结果表明，Zn²⁺对酶活力基本无影响；Ag⁺和Li⁺对酶活有一定程度的促进作用；Ca²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Ni²⁺和Mg²⁺对酶活有微弱促进作用；而Al³⁺、Cu²⁺和Co²⁺则对酶活有部分抑制作用。SDS和螯合剂EDTA对碱性木聚糖酶的酶活性影响甚微。可见该酶具有耐多种金属离子的优良特性，符合造纸等工业用酶的基本要求。

表2金属离子、表面活性剂和金属螯合剂对碱性木聚糖酶WMN-3活力的影响

化学试剂	浓度	相对酶活(％)
			对照	-	100
Ni²⁺	10mM	108.72
			Ca²⁺	10mM	108.67
Zn²⁺	10mM	100.2
			Cu²⁺	10mM	50.26
Co²⁺	10mM	87.05
			Li⁺	10mM	114.45
Ag⁺	10mM	122.51
			Fe³⁺	10mM	108.63
Mg²⁺	10mM	108.76
			Al³⁺	10mM	67.61
Mn²⁺	10mM	104.35
			SDS	0.01％	98.84
SDS	0.05％	92.12
			EDTA	0.2％	97.63
EDTA	0.5％	93.98

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 碱性木聚糖酶WMN-3基因的核苷酸序列

<400> 1

atgaagaagt tccttgcgac gggcgcgcta gctctttctg cggcgctgtg cacccctgca 60

atgttggctt ttggcgcccc cggcgctgcg caagatgcca caccacaagc ttcgcccggt 120

attgggcatg attttgagcc gctgcgcgac gctgcggagc gctctggccg tacctttggg 180

gtggcttatg caccacattt agcggacagc gacagtcaat acaagcaaat cgttgaacga 240

gaattttcca tgatcactgc agaaaacgct atgaaatggg atgcaaccca gccacaacgt 300

gggcagttca cgtgggcagg ggctgattcg gtcgttcagt tcgccaagga caatgacgct 360

gaggtgtacg gccacacact ggtgtggcac tctcagcttc cccagtgggc ggcgtcaatc 420

actgacccag ctgaattgcg gaccgtcatg gttgaccaca tcaacagtgt tgccggacgc 480

tacgcaggtg acattgcagc atgggatgtt gtgaatgaag ctttcgaggg cgacgggact 540

cgccgccagt ctgtcttcca gcgggtgctt ggtgacggat acatcgaaga ggctttccgt 600

gctgcccgtg ccgctgaccc gtcagctcag ctgtgcatta acgactactc aacggactgg 660

atcaacgcga agtccacggc catctacaac ttggtgaagg acttcaagga acgcggtgtc 720

cccatcgact gtgttggttt ccagtcgcac ttaatcgttg gacaggtccc aactaatttc 780

caacaaaact tgcaacggtt tgtggatctc ggggttgatg ttcgcattac cgaactagat 840

attcgtatgg cgacaccacc aactgccgcg aaccttgcaa cgcaggctga ggactaccgc 900

aaggtattcc aggcctgctg gaacgttgat ggctgcaccg gggtaactat atggggcatc 960

acagatgcct actcttggat accgcaggtg ttcgcaggtg agggtgctgc tttgccctgg 1020

aacgatgact attccacaaa agcggctctc actgaacttg cgacagtgat gggggcgcaa 1080

ccagcgtcca caactgaccc aacagatccg accgatccaa ctgacccaac agatccgacc 1140

gatccaactg atccaccaag cgatgcggta tgcaccgttg taccgcaggt caactcatgg 1200

aacacgggct acaccgcaaa cctcactatc cgcaacactg gtgacactcc aatcaacgga 1260

tgggagctca gcatcggatt gccccaaggg caccaactca gccaaggttg gtcggcgcag 1320

ttctcgcagt ctggtcaaac cctgatcgct tctaacgcag cgtggaacgg aacgttagcg 1380

cccggagcca gcgttgaggt tggtttcaac gcaacgcatc aaggaacgct tgggcaactt 1440

ggcccatttg ttctcaacgg tactacctgc aactaa 1476

<210> 2

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 碱性木聚糖酶WMN-3基因编码的蛋白质的氨基酸序列

<400> 2

Met Lys Lys Phe Leu Ala Thr Gly Ala Leu Ala Leu Ser Ala Ala Leu

1 5 10 15

Cys Thr Pro Ala Met Leu Ala Phe Gly Ala Pro Gly Ala Ala Gln Asp

20 25 30

Ala Thr Pro Gln Ala Ser Pro Gly Ile Gly His Asp Phe Glu Pro Leu

35 40 45

Arg Asp Ala Ala Glu Arg Ser Gly Arg Thr Phe Gly Val Ala Tyr Ala

50 55 60

Pro His Leu Ala Asp Ser Asp Ser Gln Tyr Lys Gln Ile Val Glu Arg

65 70 75 80

Glu Phe Ser Met Ile Thr Ala Glu Asn Ala Met Lys Trp Asp Ala Thr

85 90 95

Gln Pro Gln Arg Gly Gln Phe Thr Trp Ala Gly Ala Asp Ser Val Val

100 105 110

Gln Phe Ala Lys Asp Asn Asp Ala Glu Val Tyr Gly His Thr Leu Val

115 120 125

Trp His Ser Gln Leu Pro Gln Trp Ala Ala Ser Ile Thr Asp Pro Ala

130 135 140

Glu Leu Arg Thr Val Met Val Asp His Ile Asn Ser Val Ala Gly Arg

145 150 155 160

Tyr Ala Gly Asp Ile Ala Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Glu

165 170 175

Gly Asp Gly Thr Arg Arg Gln Ser Val Phe Gln Arg Val Leu Gly Asp

180 185 190

Gly Tyr Ile Glu Glu Ala Phe Arg Ala Ala Arg Ala Ala Asp Pro Ser

195 200 205

Ala Gln Leu Cys Ile Asn Asp Tyr Ser Thr Asp Trp Ile Asn Ala Lys

210 215 220

Ser Thr Ala Ile Tyr Asn Leu Val Lys Asp Phe Lys Glu Arg Gly Val

225 230 235 240

Pro Ile Asp Cys Val Gly Phe Gln Ser His Leu Ile Val Gly Gln Val

245 250 255

Pro Thr Asn Phe Gln Gln Asn Leu Gln Arg Phe Val Asp Leu Gly Val

260 265 270

Asp Val Arg Ile Thr Glu Leu Asp Ile Arg Met Ala Thr Pro Pro Thr

275 280 285

Ala Ala Asn Leu Ala Thr Gln Ala Glu Asp Tyr Arg Lys Val Phe Gln

290 295 300

Ala Cys Trp Asn Val Asp Gly Cys Thr Gly Val Thr Ile Trp Gly Ile

305 310 315 320

Thr Asp Ala Tyr Ser Trp Ile Pro Gln Val Phe Ala Gly Glu Gly Ala

325 330 335

Ala Leu Pro Trp Asn Asp Asp Tyr Ser Thr Lys Ala Ala Leu Thr Glu

340 345 350

Leu Ala Thr Val Met Gly Ala Gln Pro Ala Ser Thr Thr Asp Pro Thr

355 360 365

Asp Pro Thr Asp Pro Thr Asp Pro Thr Asp Pro Thr Asp Pro Thr Asp

370 375 380

Pro Pro Ser Asp Ala Val Cys Thr Val Val Pro Gln Val Asn Ser Trp

385 390 395 400

Asn Thr Gly Tyr Thr Ala Asn Leu Thr Ile Arg Asn Thr Gly Asp Thr

405 410 415

Pro Ile Asn Gly Trp Glu Leu Ser Ile Gly Leu Pro Gln Gly His Gln

420 425 430

Leu Ser Gln Gly Trp Ser Ala Gln Phe Ser Gln Ser Gly Gln Thr Leu

435 440 445

Ile Ala Ser Asn Ala Ala Trp Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser

450 455 460

Val Glu Val Gly Phe Asn Ala Thr His Gln Gly Thr Leu Gly Gln Leu

465 470 475 480

Gly Pro Phe Val Leu Asn Gly Thr Thr Cys Asn

485 490

<210> 3

<211> 243

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 碱性木聚糖酶WMN-3基因保守序列的核苷酸序列

<400> 3

tgggacgtcg taaacgaagc tttcgagggc gacgggactc gccgccagtc tgtcttccag 60

cgggtgcttg gtgacggata catcgaagag gctttccgtg ctgcccgtgc cgctgacccg 120

tcagctcagc tatgcattaa cgactactca acggactgga tcaacgcgaa gtccacggcc 180

atctacaact tggtgaagga cttcaaggaa cgcggtgtcc ccatgcactg tatcggcttc 240

cag 243

<210> 4

<211> 728

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 碱性木聚糖酶WMN-3基因保守序列上游基因的核苷酸序列

<400> 4

tgctttgccc tggaacgatg actattccac aaaagcggct ctcactgaac ttgcgacagt 60

gatgggggcg caaccagcgt ccacaactga cccaacagat ccgaccgatc caactgaccc 120

aacagatccg accgatccaa ctgatccacc aagcgatgcg gtatgcaccg ttgtaccgca 180

ggtcaactca tggaacacgg gctacaccgc aaacctcact atccgcaaca ctggtgacac 240

tccaatcaac ggatgggagc tcagcatcgg attgccccaa gggcaccaac tcagccaagg 300

ttggtcggcg cagttctcgc agtctggtca aaccctgatc gcttctaacg cagcgtggaa 360

cggaacgtta gcgcccggag ccagcgttga ggttggtttc aacgcaacgc atcaaggaac 420

gcttgggcaa cttggcccat ttgttctcaa cggtactacc tgcaactaac ccacattgag 480

aacggcttct gccgtcctca actcatcgag cggcctcaaa cctccttttc tgaaggtttg 540

aggccgctct cacgatgggg agcagtaacg acctcaaccc tgatttcgac gtaaaacccc 600

atggggagat gcatactgca ttctctcgtc atgcagaaat caccacccta ccggtcggtc 660

gataatcacg atagagcatc gtttcccgca cagtagtaac aaggggtcag ttgtggacgc 720

tggttgcg 728

<210> 5

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 碱性木聚糖酶WMN-3基因保守序列下游基因的核苷酸序列

<400> 5

accaagcacc cgctggaaga cagactggcg gcgagtcccg tcgccctcga aagcttcatt 60

cacaacatcc catgctgcaa tgtcacctgc gtagcgtccg gcaacactgt tgatgtggtc 120

aaccatgacg gtccgcaatt cagctgggtc agtgattgac gccgcccact ggggaagctg 180

agagtgccac accagtgtgt ggccgtacac ctcagcgtca ttgtccttgg cgaactgaac 240

gaccgaatca gcccctgccc acgtgaactg cccacgttgt ggctgggttg catcccattt 300

catagcgttt tctgcagtga tcatggaaaa ttctcgttca acgatttgct tgtattgact 360

gtcgctgtcc gctaaatgtg gtgcataagc caccccaaag gtacggccag agcgctccgc 420

agcgtcgcgc agcggctcaa aatcatgccc aataccgggc gaagcttgtg gtgtggcatc 480

ttgcgcagcg ccgggggcgc caaaagccaa cattgcaggg gtgcacagcg ccgcagaaag 540

agctagcgcg cccgtcgcaa ggaacttctt catcacagat ttatccgttc tggcaggttg 600

tgccgttgag ggtgaaggag gtaggggatg aatgtgcccc attgtgggtc ccgttgaacc 660

cgatcgtgac gctggccccg ggggccaccg tccccattcc acgcagcatt c 711

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR所用的引物的上游引物

<400> 6

gatgaattcg cccccggcgc tgcgcaagat gccac 35

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCR所用的引物的下游引物

<400> 7

ccgctcgagg ttgcaggtag taccgttgag aacaaatg 38

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 保守序列的上游简并引物WMN-3JBUP

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 8

ctctggaagc cnayncmrts na 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 保守序列的下游简并引物WMN-3JBDOWN

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 9

gactgggayg tngtnaayga 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WMN-3-USP1

<400> 10

actcaacgga ctggatcaac g 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WMN-3-USP2

<400> 11

gatgttcgca ttaccgaac 19

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WMN-3-USP3

<400> 12

tgctttgccc tggaacg 17

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WMN-3-DSP1

<400> 13

cgacgattct ctggaagccg 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WMN-3-DSP2

<400> 14

gtcagcggca cgggcagca 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> WMN-3-DSP3

<400> 15

accaagcacc cgctggaaga 20

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD1

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 16

agtgnwgwan caacg 15

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD2

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 17

wgtgnagawn cagasa 16

<210> 18

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 18

tncsagtwtg gwstt 15

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD4

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 19

ctwsntactn ctntgc 16

<210> 20

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD5

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 20

tcwgncttan tangt 15

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD6

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 21

tgagnagwan stnaga 16

<210> 22

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AD7

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 22

ngwcsagwga natgaa 16

Claims

1.一种碱性木聚糖酶WMN-3，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

2.编码权利要求1所述的碱性木聚糖酶WMN-3的基因，其特征在于：所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

3.一种含有权利要求2所述的基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：权利要求2所述的基因被插入至pET-28a(+)载体中。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：权利要求2所述的基因被插入至pET-28a(+)载体中的EcoR I和Xho I酶切位点之间。

7.一种表达碱性木聚糖酶WMN-3的菌株，其特征在于：是将权利要求2所述的基因的核苷酸序列构建成载体后转染到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 Star(DE3)得到。

8.根据权利要求7所述的表达碱性木聚糖酶WMN-3的菌株，其特征在于：所述的载体为权利要求3～6任一项所述的表达载体。

9.根据权利要求7或8所述的表达碱性木聚糖酶WMN-3的菌株，其特征在于包括如下步骤：

用PCR方法从Streptomyces sp.WMN-3的基因组DNA中克隆出权利要求2所述的碱性木聚糖酶WMN-3的酶基因全长，将其插入到原核表达载体pET-28a(+)中，得到重组质粒pET-28a-WMN-3，并转化大肠杆菌E.coli BL21 Star(DE3)菌株；经过筛选后得到表达所述的碱性木聚糖酶WMN-3的重组大肠杆菌菌株E.coli BL21 Star(DE3)-WMN-3。

10.权利要求1所述的碱性木聚糖酶WMN-3在造纸工业中的应用。