CN104561060A - β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因及其应用,所述的基因核苷酸序列为SEQ?ID?NO.1.本发明的酶可以显著地控制梨链格孢霉孢子的萌发和芽管的伸长,并对菌丝生长具有破坏作用。通过在梨果上损伤接种和直接喷施重组酶及病原菌的实验发现:接种重组酶后梨果的病斑直径小于只接种病原菌的病斑直径,且腐烂程度也明显低于对照;梨果经酶液处理后,发病率为37.61%,防病效果为66.25%,相较于现有的β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有更好的防治效果。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,具体的涉及一种β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因及其应用。
背景技术
β-葡聚糖是一种结构性非淀粉多糖,广泛存在于禾本科植物(黑麦、大麦、小麦、燕麦和稻谷)的胚乳细胞及糊粉层中。物种不同,β-葡聚糖的含量及其所占比例会有很大区别;在相同物种中,其含量也会因生长环境的不同而有所差异。
广义的β-葡聚糖酶是指一类能分解由β-糖苷键连接构成的D-葡萄糖聚合物的酶系,主要包括昆布多糖酶(EC.3.2.1.6)、β-葡聚糖苷酶(EC.3.2.1.21)、纤维素酶(EC.3.2.1.4)、内切-β-1,2-葡聚糖酶(EC.3.2.1.71)内切β-1,3-葡聚糖酶(EC.3.2.1.39)、外切β-1,3-葡聚糖酶(EC.3.2.1.58)、内切β-1,4-葡聚糖酶(EC.3.2.1.4)、内切β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC.3.2.1.73)、外切β-1,4-葡聚糖酶(EC.3.2.1.74)和内切β-1,6-葡聚糖酶(EC.3.2.1.75),在所有这些酶中以β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶(又称地衣多糖酶)活性最高。
狭义的β-葡聚糖酶专指内切β-1,3-1,4-葡聚糖酶,其底物为β-1,3和β-1,4混和糖苷键连接的内切β-D-葡聚糖。水解内切β-D-葡聚糖时,内切β-1,3-1,4-葡聚糖酶内切水解与3-O-吡喃葡萄糖连接的β-1,4糖苷键,其产物主要为纤维三糖(3-O-β-纤维二糖-D-吡喃葡萄糖)和纤维四糖(3-O-β-纤维三糖-D-吡喃葡萄糖)。
β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶,目前主要应用于啤酒酿造和饲料工业中,近年其在生物防治方面的应用受到人们越来越多的关注。姚乌兰等首次报道了多粘类芽孢杆菌WY110β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有抗稻瘟病菌的特性。以提取的WY110菌株基因组DNA为模板进行了基因克隆和表达,为葡聚糖酶在农业生产中的应用开辟了新的研究领域。文凤云等研究发现β-1,3-1,4-葡聚 糖酶是多粘类芽孢杆菌CP7菌株抗真菌的活性组分或其中之一,为葡聚糖酶在生物防治方面的应用提供了理论依据。金志雄等[56]报道,内生枯草芽孢杆菌SWB8分泌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有抗菌和抗肿瘤细胞的活性,为抗菌和高效低毒的抗肿瘤药物的研究提供支持。
生物防治是解决病原真菌耐药性、环境污染等问题的有效方法。目前研究与应用涉及较多的是微生物菌体,但是微生物菌体的应用易受环境条件和菌剂保质期的限制,在实际生产中防效不稳、效果不够理想。而许多拮抗菌分泌的抑菌蛋白可以在体外抑制或杀死有害微生物,如果能够分离出抑菌蛋白及其编码序列,这对运用基因工程的手段开发新型生物保鲜剂将会很有价值和意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因及其应用。为了实现本发明的目的,拟采用如下技术方案。
本发明一方面涉及一种β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,其特征在于所述的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1.
本发明另一方面涉及β-1,3-1,4-葡聚糖酶,其特征在于所述的酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2.
本发明另一方面还涉及上述β-1,3-1,4-葡聚糖酶的应用,所述的应用是抗梨黑斑病中的应用。
本发明的酶可以显著地控制梨链格孢霉孢子的萌发和芽管的伸长,并对菌丝生长具有破坏作用。通过在梨果上损伤接种和直接喷施重组酶及病原菌的实验发现:接种重组酶后梨果的病斑直径小于只接种病原菌的病斑直径,且腐烂程度也明显低于对照;梨果经酶液处理后,发病率为37.61%,防病效果为66.25%,相较于现有的β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有更好的防治效果。
微生物信息
本发明所筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)J18已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号CGMCC No.3665,保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏日 期为2010年03月12日。
附图说明
图1:重组蛋白的Western Blot检测
图2:SDS-PAGE分析纯化后的重组蛋白
M:蛋白质分子量标准;1,2:亲和纯化后的重组蛋白
图3:重组酶对梨链格孢霉菌丝的抑制作用
图4:重组酶在PDA平板上对梨链格孢霉的抑制
图5:重组酶对梨黑斑病的防治
左:重组酶;右:对照(无菌水)
图6:重组酶对梨黑斑病的防治效果
左:对照(只喷施病原菌);右:重组酶处理
图7:温度对抑菌效果的影响
图8:pH对抑菌效果的影响
图9:光照对抑菌效果的影响
具体实施方式
实施例1
1.菌株的分离
从四川成都梨果园土样中筛选到一株枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)J18,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,中国微生物菌种保藏中心登记编号CGMCC No.8343。
2.试验方法
2.1引物的设计与合成
通过在GenBank文库中进行序列查找与同源性比对,根据已登录的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因序列及表达载体pET28a(+)的多克隆位点设计引物,在正反向引物5’端分别引入BamH I和Xho I酶切位点,并加入相应的保护性碱基,由上海生物工程公司合成。
引物序列如下:
上游引物G1:5′-CGGGATCCATGCAAACAGGTGGATCG-3′
下游引物G2:5′-CCGCTCGAGGCTTATTTTTTTGTATAGCGCACCC-3′
2.2β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆
2.2.1枯草芽孢杆菌(B.substilis)J18基因组DNA的提取
对枯草芽孢杆菌J18基因组DNA进行提取,按照试剂盒说明书进行。具体步骤如下:
(1)将枯草芽孢杆菌J18以1%(V/V)的接种量接种于LB培养基,在37℃条件下、200r/min振荡过夜培养。吸取10mL菌液5000r/min离心10min,保留菌体。
(2)用STE(1mM EDTA,pH8.0;10mM Tris-HCl,pH8.0;0.1M NaCl)洗涤一次,5000r/min离心10min,弃上清。
(3)加4mL TE(1mmol/L EDTA,pH8.0;10mmol/L Tris-HCl,pH8.0)悬浮沉淀,并加8μL溶菌酶溶液(50mg/mL),37℃静置20min。
(4)加10μL Rnase(10mg/mL),再加入0.5mL的10%SDS溶液,37℃静置30min。
(5)加10μL蛋白酶K(20mg/mL),37℃静置60min。
(6)加入相同体积的Tris-饱和酚溶液,混匀,8000r/min离心5min,吸取上清转移至新的1.5mLEP管中。
(7)向上清液中加入相同体积的酚:氯仿,混匀,8000r/min离心5min,吸取上清转移至新的1.5mLEP管中。
(8)向上清液中加入1/5体积、浓度为10mol/L的醋酸铵和2倍体积无水乙醇,颠倒混合,静置10min,离心沉淀DNA。用70%乙醇洗涤,吸干,加500μLTE溶解DNA,-20℃保存。
2.2.2β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因PCR扩增
以提取的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)J18的基因组DNA为模板,G1和G2为引物进行PCR扩增,在0.2mL的PCR小管中加入以下成分。
PCR反应体系(20μL)如下:
PCR扩增程序:95℃5min;95℃45s,61℃50s,72℃90s,共进行30个循环;循环结束后,72℃延伸10min;4℃保存。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
2.2.3琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
(1)1.0%琼脂糖凝胶制备
将0.2g琼脂糖加入到20mL的1×TAE缓冲液(PH8.0)中,混匀以后放入微波炉中加热,直至琼脂糖全部溶解。待琼脂糖冷却以后,温度大约为40℃-60℃,吸取1μL的Gelred染料加入琼脂糖后混匀。选取适当的梳子插到制胶板上,把融化的琼脂糖倒入制胶槽中。待胶完全凝固后,小心拔去梳子,将带有琼脂糖凝胶的电泳板放入电泳槽中。
(2)上样:取5μL PCR产物和1μL6×DNA Buffer,混匀,加到点样孔里。
(3)电泳:在稳定电压90V条件下电泳30min。
(4)成像:将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中拍照保存。切下扩增目的基因片段的胶。
2.2.4目的基因片段的回收
将PCR扩增目的基因片段的胶用小量胶回收试剂盒进行回收,实验具体 方法参照试剂盒的说明书。通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测回收情况,来估计DNA浓度
2.2.5目的基因片段与克隆载体pMD18-T的连接
按照TaKaRa(大连)公司的T-A克隆载体连接试剂盒说明书步骤将目的基因片段与克隆载体pMD18-T连接。
连接体系(5μL)如下:
回收目的基因片段 1~3μL
pMD18-T 1μL
ddH2O 补足到5μL
离心混匀,16℃过夜连接。
2.2.6大肠杆菌感受态细胞的制备
(1)取-80℃冻存的菌株于固体LB平板上划线,37℃培养箱中过夜培养;
(2)挑取平板上生长良好的单菌落,接种于3mL LB液体培养基的试管中,37℃,200r/min振荡过夜培养;
(3)取1mL的菌液接种于50mL的LB液体培养基中,37℃,200r/min下振荡培养至OD600约为0.3-0.5之间(即细菌生长处于指数生长前期到中期的阶段);
(4)取出5mL菌液于10mL离心管中,在冰上放置30min。4℃,5000r/min下离心10min,弃上清,收集菌体;
(5)向菌体沉淀中加入5mL4℃预冷的CaCl2(0.1mol/L)溶液,轻轻悬浮菌体,冰浴60min;
(6)将悬浮的菌体4℃,5000r/min离心10min,弃上清;
(7)向沉淀的菌体中加入500μL预冷的CaCl2(0.1mol/L)溶液轻轻悬浮,每管分装200μL,于-80℃保存,即为制备好的感受态细胞。
2.2.7载体pMD18-T连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞
(1)取预先制备好的-80℃保存的E.coli DH5α感受态细胞,至于冰上解冻,待完全解冻后,加入5μL的连接产物,轻轻混匀,冰浴30min;
(2)在42℃下热激90s,迅速置于冰中,继续冰浴2min;
(3)向热激后的感受态细胞中加入LB液体培养基800μL,37℃,130r/min缓摇孵育2h;
(4)将培养后的菌液4000r/min离心2min,弃部分上清,悬浮菌体。
(5)将剩余菌液100μL涂布到含有Amp的LB平板上(已涂过X-gal和IPTG),37℃培养箱正放培养30min后,倒置培养16h,长出转化子。
2.2.8重组E.coli DH5α克隆子质粒的提取
挑取白色阳性克隆菌落接种到含Amp的LB液体培养基中,37℃,200r/min过夜培养,用小量质粒快速提取试剂盒提取质粒,具体方法参照试剂盒说明书进行。
2.2.9阳性克隆质粒的鉴定与测序
以阳性克隆质粒为模板,用原引物进行PCR扩增,反应体系及反应程序参照2.2.2,再进一步通过限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切鉴定是否为阳性克隆子。将阳性克隆委托上海生工公司测序。
2.3β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的序列分析
将测序所得基因序列利用NCBI网站上的Blast X工具、ExPASy数据库的ProtParam在线分析工具、DNAMAN、Clustal W、MEGA等软件对J18菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因核苷酸序列及氨基酸序列进行分析。将核苷酸序列提交稀有密码子在线分析工具Rare Codon Calculato分析其大肠杆菌稀有密码子的数量和位置,同时利用Graphical Codon Usage Analyzer分析系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行密码子偏好性分析。通过位于ExPASy数据库的ProtScale工具对β-1,3-1,4-葡聚糖酶的疏水性进行分析,为它的功能域和结构域的划分提供可靠依据。
2.4重组表达载体pET28a(+)-bgl的构建
2.4.1阳性克隆质粒和表达载体pET28a(+)的双酶切
用限制性内切酶BamH I和Xho I分别对表达载体pET28a(+)和阳性克隆质粒进行双酶切。
酶切反应体系(20μL)如下:
离心混匀,37℃酶切3h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收目的基因片段,然后使用DNA小量凝胶回收试剂盒回收,具体步骤详见试剂盒说明书。
2.4.2目的基因与表达载体pET28a(+)的连接
将上述酶切及纯化后的目的基因片段与表达载体pET28a(+)样品各取4μL进行电泳,利用紫外投射仪来大致估测浓度。按照摩尔浓度比为DNA片段:表达载体=3∶1的比例进行连接。
连接体系(10μL)如下:
离心混匀,反应体系于16℃恒温水浴中过夜连接16h。
2.4.3表达载体pET28a(+)连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞
将连接产物转入表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中的方法参照克隆宿主菌E.coli DH5α,详见2.2.2.7。转化后的产物涂布到含有Kan抗生素(50μg/mL)的LB琼脂平板上,37℃培养箱正放培养30min后,倒置培养16h,长出转化子。
2.4.4阳性克隆鉴定
从培养好的平板上挑取单菌落过夜培养,提取重组质粒,通过PCR和质粒双酶切进行鉴定,通过1%琼脂糖凝胶电泳检测是否出现目的基因大小的片 段。构建的重组表达载体命名为pET28a(+)-bgl。
2.5重组酶的诱导表达
2.5.1重组蛋白的诱导表达
(1)将pET28a(+)-bgl工程菌和含有pET28a(+)空质粒的对照菌株分别接种于3mL含Kan(50μg/mL)的LB液体培养基中,37℃、200r/min振荡培养过夜,作种子液。
(2)以1.0%接种量将种子液接种到装有50mL含Kan(50μg/mL)的LB液体培养基的150mL三角瓶中,37℃、200r/min振荡培养2-3h至OD600值在0.4-0.6之间,加入IPTG诱导剂,诱导终浓度为1mM,于28℃、200r/min诱导表达。
(3)诱导4h后取菌液1mL,8000r/min离心10min,弃上清,用20μL磷酸缓冲液重悬沉淀,然后加入5×SDS缓冲液,100℃煮沸10min,然后进行SDS-PAGE。
(4)剩余菌液4℃下8000r/min离心20min,收集菌体。先用生理盐水清洗一次菌体,再用无菌水清洗一次,相同条件下离心。
(5)菌体用5mL Lysis buffer缓冲液重悬,然后超声波破碎菌体(冰浴,400w,超声3s,停3s,共超声27min)。菌体超声破碎后,4℃、12000r/min离心20min,收集上清和沉淀,用SDS-PAGE进行重组蛋白的可溶性分析。取出上清液进行重组蛋白的纯化。
2.5.2诱导条件优化
重组蛋白是否能够表达及其表达量的多少与很多因素有关,其中最主要的因素有以下几方面:菌液起始浓度、IPTG浓度、诱导时间及诱导温度。
(1)菌液起始浓度的优化:设定IPTG浓度为1.0mmol/L,调整菌液起始OD600分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2,28℃诱导培养5h。
(2)IPTG浓度的优化:设定菌液起始OD600=0.4-0.6,调整IPTG终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5mmol/L,28℃诱导培养5h。
(3)诱导时间的优化:设定IPTG浓度1.0mmol/L,菌液起始OD600=0.4-0.6,28℃分别培养0、1、2、3、4、5、6、7h。
(4)诱导温度的优化:设定IPTG浓度1.0mmol/L,菌液起始 OD600=0.4-0.6,28℃、30℃、38℃诱导培养5h。
表达产物利用SDS-PAGE检测,并使用凝胶分析软件BandScan5.0对重组蛋白表达量进行分析。
2.5.3SDS-PAGE电泳
(1)按照说明书将玻璃板和凝胶模具等组装起来。
(2)配制15%的电泳分离胶(见表2.3)。吸取正确体积的30%Acr/Bis、10%过硫酸铵、2M Tris-HCl(pH8.8)、TEMED、10%SDS和蒸溜水加入一个干净的小烧杯中,轻轻混匀,在两块玻璃板间加入分离胶,预留浓缩胶空间,加入ddH2O封闭。室温放置30min,弃去上层ddH2O,用滤纸吸出残留ddH2O;
(3)配制5%的电泳浓缩胶(见表2.3)。吸取确定体积的30%Acr/Bis、10%过硫酸铵、2M Tris-HCl(pH6.8)、TEMED、10%SDS和蒸溜水加入一个干净的小烧杯中混匀,向玻璃板夹缝中加入浓缩胶,之后将样品梳迅速插入凝胶内,室温静置使其完全聚合。
(4)当凝胶完全聚合后,将梳子小心拔出,ddH2O清洗加样槽,除去未聚合的丙烯酰胺。将玻璃胶板放入电泳槽中,向电泳槽中注入电泳缓冲液。
(5)在1.5mL离心管中加入20μL蛋白质样品和5μL5×样品buffer,混合后加热煮沸10min,离心,用移液枪将样品加入加样孔中。
(6)电泳:接通电源,设定合适的电泳参数。本试验起始电压设置为80V,待溴酚蓝染色剂前行至分离胶时更换为120V,待溴酚蓝跑到凝胶底部停止电泳。
(7)电泳完毕,将凝胶放入染色液的托盘中震荡染色约2h,染色液回收再利用;然后将凝胶用蒸馏水漂洗数次,然后放入脱色液中脱色,直到显现出清晰的条带。
表1SDS-PAGE凝胶配制表
2.5.4免疫印迹Western Blot检测
(1)采用恒压将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。
(2)在电泳结束前20min前,取两个大培养皿分别倒入转膜缓冲液和甲醇。
(3)将PAGE胶切下来,浸泡在甲醇中;将PVDF膜剪成和PAGE胶一般大小,浸泡在转膜缓冲液中;剪6张滤纸和PAGE胶相同大小,浸入转膜缓冲液。
(4)在透明玻璃板上铺一层转膜缓冲液,把PAGE胶放在玻璃板上,用玻璃棒在PAGE胶上滚动赶出所以气泡。
(5)将PAGE胶、PVDF膜和滤纸按三明治形状铺好,将PAGE胶和PVDF膜夹在中间,保持湿润和无气泡。
(6)将电泳槽冲洗干净,用镊子将三明治至于转印仪上。恒压90V电转1h。
(7)转膜结束后,取出PVDF膜,用去离子水稍加漂洗,取出浸于封闭液中进行包被,可以4℃封闭过夜或者室温摇1h。
(8)包被结束后,用封闭液将一抗稀释1000倍加于膜上,摇晃孵育1h。
(9)一抗孵育结束后,用TBST漂洗,每次5min,洗5次。
(10)结合二抗,用封闭液将二抗稀释10000倍,摇晃孵育1h,同样TBST洗涤5次,每次5min。
(11)用镊子将PVDF膜夹出,吸去过多液体,置于洁净的保鲜膜上。按比例配好发光剂,滴加到PVDF膜上,浸泡5min,吸去多余发光剂,在暗室曝光,根据曝光条带判断蛋白的表达结果。
2.6重组酶的纯化
2.6.1重组酶的制备
操作方法如2.5.1。
2.6.2重组酶的纯化
(1)装柱:将1mL50%Ni-NTA His·bind树脂填料装入空的层析柱中,树脂自然沉降;用3倍柱体积的无菌水冲洗树脂(树脂沉降后体积为一个柱体积);用结合缓冲液洗柱,打开层析柱底塞,让液体流出,重复2次。
(2)将4mL重组酶的粗提液通过0.45μm滤器过滤后加入层析柱中,把层析柱平放在冰上,摇晃结合60min。
(3)用4mL漂洗缓冲液洗柱3次,每次5min。
(4)用1mL洗脱缓冲液洗柱5次,每次10min,收集洗脱液体(之前可做预实验观察结果,若杂蛋白及目的蛋白洗脱不彻底,可提高各洗脱液中咪唑的量);将收集的样品进行SDS-PAGE鉴定。
(5)将收集的洗脱液装在截留分子量为8000-14000的透析袋中,用PBS缓冲液4℃透析24小时,每8小时换一次透析液;最后分装,-20℃保存。
2.7重组酶抗真菌活性测定
2.7.1重组酶对梨链格孢霉孢子萌发的影响
在两个无菌管中均加入100μL梨链格孢霉孢子悬液和800μL的PDA液体培养基,然后分别加入100μL分离纯化并除菌的重组酶(60μg/mL)和100μL灭菌去离子水作为对照。28℃、200r/min倾斜震荡培养8h。在光学显微镜下每个处理观察100个孢子的萌发状态并测量芽管长度。实验重复3次。实验数据应用SPSS17.0软件进行方差分析(P<0.05)。
2.7.2重组酶对梨链格孢霉菌丝的抑制作用
在两个无菌管中均加入100μL梨链格孢霉孢子悬液和800μL的PDA液体培养基,28℃、180r/min倾斜震荡培养。待孢子萌发(孢子芽管长度大于孢子的短半径视为萌发)后分别加入100μL除菌的重组酶和100μL的无菌去离子水(空白对照),培养8h和16h后,在光学显微镜下观察孢子菌丝的形态。
2.7.3重组酶对梨链格孢霉的抑制作用
从培养4d的梨链格孢霉PDA平板培养基上,取一个直径为5mm的菌块转接于另一个PDA培养平板中央,28℃培养至菌落大小为4cm左右时,在菌 落前方0.5cm处呈等边三角形放置3个直径为5mm的无菌滤纸片,在滤纸片上分别滴加分离纯化后的重组酶10μL、20μL,以无菌去离子水作对照,28℃培养48h,观察抑菌效果。
2.7.4重组酶对梨黑斑病的防治效果
2.7.4.1在梨上损伤接种重组酶和病原菌
为了鉴定重组酶在梨果体内对梨黑斑病菌的抑制作用,把重组酶直接作用在受伤的梨果上。取无病无伤,大小和成熟度相似的雪花梨,用NaClO溶液(2%)消毒后,在梨果腰部打4个直径为5mm×3mm(深)的孔。在孔内滴加100μL重组酶溶液,室温下放置2h后接种20μL病原菌孢子悬液;以接种病原菌前滴加100μL无菌去离子水的梨果作为对照。自然晾干后将不同处理的梨果放在塑料盆内,用塑料薄膜封口保持95%的湿度,于室温下贮藏,7d后观察梨果的发病情况并测量梨果的病斑直径。每个处理6个梨果,实验重复3次。
2.7.4.2在梨上喷施重组酶和病原菌
取无病无伤、大小和成熟度相似的雪花梨,在重组酶溶液中浸果30s,把梨果放在塑料盆内,2h后喷施50mL的病原菌孢子悬液,晾干后用塑料薄膜保湿,之后室温下贮藏30d。以只喷施病原菌孢子悬液的处理为对照,统计梨果的发病情况。每个处理30个梨果,重复3次。
病果分级标准
0级:无病斑 1级:病斑直径≤1.0cm
2级:病斑直径1.1~2.0cm 3级:病斑直径2.1~3.0cm
4级:病斑直径3.1~4.0cm 5级:病斑直径≥4.1cm
病情指数=∑(各级腐烂数×该级代表数)/(总数×最高级代表数)
防效%=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%
2.8重组酶的特性研究
2.8.1温度对重组酶抑菌活性的影响
将重组酶经30、35、40、45、50、55、60、65、70℃分别处理30min,采用平板对峙法检测其抑菌效果,设未处理样品的抑菌活性为100%计算相对抑 菌活性。
2.8.2pH值对重组酶抑菌活性的‘影响
配制pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液,高压灭菌后处理重组酶,4℃下静置8h,采用平板对峙法检测其抑菌效果,设最高抑菌活性为100%计算相对抑菌活性。
2.8.3光照对重组酶抑菌活性的影响
将重组酶放入培养皿中,在800Lx光强下照射6、12、18、24、30、36h,采用平板对峙法检测其抑菌效果,设未照射样品的抑菌活性为100%计算相对抑菌活性。
2.8.4金属离子对重组酶抑菌活性的影响
重组酶中加入几种常见金属离子(Zn2+,Ni2+,Mn2+,Na+,Fe2+,K+,Mg2+,Cu2+和Ca2+),最终浓度均为1mmol/L,采用平板对峙法检测其抑菌效果,以未加金属离子样品的抑菌活性为100%计算相对抑菌活性。
3结果与分析
3.1β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆
以枯草芽孢杆菌(B.substilis)J18的基因组DNA为模板,G1和G2为引物进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,可清晰见到约650bp大小的特异条带,DNA片段大小与预期结果相符,说明通过PCR的方法成功扩增出β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因。
3.2阳性克隆质粒的鉴定
PCR产物经胶回收试剂盒回收后,与克隆载体pMD18-T连接,然后转化E.coli DH5α感受态,从转化子中提取质粒。PCR产物与pMD18-T连接后的重组质粒命名为pMD18T-bgl,对该质粒进行PCR和双酶切鉴定。PCR得到一条650bp的条带,双酶切得到大小约为650bp和2700bp左右的两条特异条带,与预计大小吻合。鉴定结果表明重组质粒pMD18T-bgl构建成功。
3.3重组表达载体的构建
重组质粒pMD18T-bgl和表达载体pET28a(+)经BamH I和Xho I双酶切后, 连接得到重组表达载体pET28a(+)-bgl,转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。
3.4重组表达载体的鉴定
对阳性重组表达载体pET28(+)-bgl进行PCR和双酶切鉴定。PCR显示一条650bp的特异条带,双酶切得到大小约为650bp和5600bp左右的两条特异条带,与预计大小一致。鉴定结果表明重组表达载体pET28a(+)-bgl构建成功。
3.5重组酶的诱导表达
pET28a(+)表达载体采用T7启动子融合表达。T7启动子是目前大肠杆菌中最强的启动子,T7启动子只有在T7噬菌体RNA聚合酶的作用下才能被启动,T7噬菌体RNA聚合酶基因通过溶原途径,整合在E.coli BL21(DE3)大肠杆菌lacUV5启动子之下。在IPTG的诱导下,lacUV5启动子导致合成大量的外源基因的mRNA,促使目的基因的表达。
3.6重组酶的SDS-PAGE检测
将pET28a(+)-bgl工程菌和含有pET28a(+)空载质粒的对照菌株同时进行培养和诱导。对照菌株诱导前后蛋白表达没有明显变化,而pET28a(+)-bgl工程菌经诱导后有一条分子量约为27kDa的新生蛋白带(图3)。β-1,3-1,4葡聚糖酶的理论分子量约为24.3kDa,加上其N端由36个氨基酸编码的6个His标签(分子量约为3kDa),可以推测表达的重组蛋白分子量与带有His标签的β-1,3-1,4葡聚糖酶的理论分子量大小相一致。因此可知,该重组蛋白在受体菌株E.coli BL21(DE3)中得到了表达。
3.7免疫印迹Western-Blot检测
将重组蛋白进行SDS-PAGE后转印PVDF膜,进行Western Blot检测,以Anti-his为一抗,HRP标记的羊抗鼠重组蛋白G作为二抗。由图1可知,在27kDa处有一条特异性条带,其大小与预测的重组蛋白是一致的,而对照菌株没有检测到任何条带,表明己成功表达目的蛋白。
3.8诱导表达条件的优化
优化试验结果表明,J18菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶工程菌的最佳诱导条件为:在菌液起始浓度OD600达0.4-0.6后加入终浓度为1mmol/L的诱导剂IPTG开始 诱导,28℃震荡培养4h后目的蛋白的表达量达到最大值。
3.9重组酶的纯化
利用浓度为250mmol/L咪唑的洗脱缓冲液把目的蛋白洗脱出来,通过SDS-PAGE电泳分析纯化效果(图2)。BandScan5.0软件对SDS-PAGE电泳图分析显示,经纯化后的目的蛋白量占蛋白总量的86.81%,纯化效果较好。
3.10重组酶对梨链格孢霉孢子萌发的影响
重组酶处理梨链格孢霉孢子8h后,在显微镜下观察到与对照相比病原菌孢子萌发率显著从99.08%降低到27.95%,芽管长度由218.34μm显著降低到66.57μm(如表2)。
表2重组酶对梨链格孢霉孢子的影响
注:单因素方差分析(P<0.05)
3.11重组酶对梨链格孢霉菌丝生长的抑制作用
由图3可以看出,梨链格孢霉孢子在PDA液体培养基中萌发后,用重组酶处理8h后,孢子变黑,菌丝生长缓慢并且出现畸变和菌丝顶端膨胀的现象,而对照组的菌丝生长正常,没有出现畸变。处理16h后,菌丝膨胀状态更加明显,并且出现破裂等现象。
3.12重组酶对梨链格孢霉的抑制作用
由图4可以看出,重组酶在PDA平板上对梨链格孢霉的生长表现出明显抑制活性,在滴加有重组酶附近的地方呈凹进状,而对照处的菌丝生长正常。
3.13在梨上损伤接种重组酶和病原菌
7d后观察梨果的发病情况并测量梨果的病斑直径(图5)。在纯化重组酶存在的情况下,由链格孢霉引起的病斑直径(直径6.12mm)明显小于只接种病原菌的病斑直径(直径13.37mm),且腐烂程度也明显低于对照。
3.5.4.2在梨上喷施重组酶和病原菌
30d后统计梨果的发病情况(图6),梨果经重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶液处理后,发病率和病情指数都明显下降,其发病率为33.61%,比对照下降32.33%,防病效果为66.25%。
4重组酶的特性研究
4.1温度对重组酶抑菌活性的影响
由图7可以看出:重组酶在55℃以下处理30min后抑菌活性与对照相比差异不显著,超过55℃抑菌活性开始缓慢下降,至65℃时相对抑菌活性为57.13%,70℃时相对抑菌活性仍有14.91%。
4.2pH值对重组酶抑菌活性的影响
由图8可知,在pH3.0-9.0范围内,抑菌活性因pH的不同而变化。当pH小于6.0时,抑菌活性随pH增加而升高;当pH大于6.0时,抑菌活性随pH的增加而降低;在5.0-8.0之间仍然处于较高的抑菌活性状态。
4.3光照对重组酶抑菌活性的影响
重组酶在800Lx的光照条件下处理,随着时间的延长,抑菌活性缓慢降低,处理48h后,其抑菌活性较未处理时仅降低14.91%,这表明光照对重组酶的抑菌活性影响不大(如图9)。
4.4金属离子对重组酶抑菌活性的影响
经过不同金属离子处理后,重组酶的抑菌活性变化见表3。浓度为1mmol/L的不同金属离子对重组酶的抑菌活性影响不大,仅有一些离子如Ca2+、Mn2+和Cu2+能够增强重组酶的抑菌活性,而Fe2+和Zn2+对重组酶活性有抑制作用。
表3金属离子对重组酶抑菌活性的影响
以上所述是本发明的优选实施例,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰, 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,其特征在于所述的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2.一种β-1,3-1,4-葡聚糖酶,其特征在于所述的酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
3.上述β-1,3-1,4-葡聚糖酶的应用,所述的应用是抗梨黑斑病中的应用。
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