CN103031309B - 一种抗菌蛋白has1编码基因的克隆、表达及其应用 - Google Patents
一种抗菌蛋白has1编码基因的克隆、表达及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103031309B CN103031309B CN201210553669.4A CN201210553669A CN103031309B CN 103031309 B CN103031309 B CN 103031309B CN 201210553669 A CN201210553669 A CN 201210553669A CN 103031309 B CN103031309 B CN 103031309B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- has1
- expression
- encoding gene
- gene
- antimicrobial protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 108090000320 Hyaluronan Synthases Proteins 0.000 title claims abstract description 29
- 102000003918 Hyaluronan Synthases Human genes 0.000 title abstract description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title abstract description 15
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 title abstract 5
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 241000226724 Sporisorium scitamineum Species 0.000 claims description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 23
- 101150085382 HAS1 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 abstract description 12
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 abstract description 11
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 abstract description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 4
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 abstract 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 8
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 8
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000000433 anti-nutritional effect Effects 0.000 description 5
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000726221 Gemma Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010061926 Purulence Diseases 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 3
- NLJVXZFCYKWXLH-DXTIXLATSA-N 3-[(3r,6s,9s,12s,15s,17s,20s,22r,25s,28s)-20-(2-amino-2-oxoethyl)-9-(3-aminopropyl)-3,22,25-tribenzyl-15-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-6-(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,18,21,24,27-nonaoxo-12-propan-2-yl-1,4,7,10,13,16,19,23,26-nonazabicyclo[26.3.0]hentriacontan Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N1)=O)CC(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 NLJVXZFCYKWXLH-DXTIXLATSA-N 0.000 description 2
- 102100037926 Divergent protein kinase domain 2A Human genes 0.000 description 2
- 101710081910 Divergent protein kinase domain 2A Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021006 Tyrothricin Proteins 0.000 description 2
- 241000221566 Ustilago Species 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 244000037671 genetically modified crops Species 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960003281 tyrothricin Drugs 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000221778 Fusarium fujikuroi Species 0.000 description 1
- 241000233732 Fusarium verticillioides Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000009335 monocropping Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抗菌蛋白编码基因HAS1基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。该序列是以生防菌株HAS为研究对象，经过对其抑菌机理的研究得到的，然后以菌株HAS的基因组DNA为模板，并用特异性表达引物进行PCR法扩增得到其编码基因的全表达序列，随后构建了原核表达载体进行表达，并以甘蔗黑穗病菌为靶标进行了表达产物抑菌实验，结果表明其表达产物同样具有抗甘蔗黑穗病菌的能力，通过网上比对表明该抗菌蛋白是一种新的抗菌蛋白，编码该抗菌蛋白的基因序列可为今后的抗病育种提供新材料。
Description
技术领域
本发明涉及微生物产生的对植物病原菌存在抑菌活性的新抗菌蛋白，更具体地说，涉及一种来源于微生物的新抗菌蛋白的鉴定和应用。本发明是建立在生防菌株HAS对甘蔗黑穗病菌具有很好抑制作用的基础之上。
背景技术
甘蔗黑穗病是由Ustilago scitaminea Sydow. 引起的一种真菌病害，属担子菌纲黑粉菌属。该病害最早是在1877年南非纳塔尔发现，随后在东半球的亚洲和非洲的大部分国家均有报道。1940年在美洲阿根廷发生，随后西半球也发生该病害。20世纪70-90年代，夏威夷、弗罗里达、摩洛哥、澳大利亚等国家、地区也相继有该病害发生的报道。中国于1932年在广州发现该病害，之后各地也都出现该病。特别是近年来，随着蔗种无性繁殖栽培技术的推广，蔗种频繁引进调运，蔗田长期连作同一品种以及宿根蔗年限的逐渐延长，造成甘蔗黑穗病在我国广西、云南、广东、福建、海南等省蔗区发生日趋严重，造成的损失多达10-30%，严重的宿根蔗几乎绝收。
甘蔗黑穗病危害严重，但对其的防治效果不理想。生物防治因对环境友好和易于使用而在其它作物病害上已部分地发挥作用，但用于甘蔗黑穗病病害的防治一直停滞不前。国内外也有利用微生物对甘蔗黑穗病菌孢子进行作用的报道。国外，Sinha和Singh报道四种真菌（Fusarium moniliforme [Gibberella fujikuroi] var. subglutinans, Aspergillus niger, A.flavus and Penicilliumsp.）对甘蔗黑穗病的黑鞭的产生和对冬孢子萌发的抑制作用。国内，广西大学廖咏梅等采集甘蔗苗期、生长期的甘蔗土壤、健株及病株的种蔗、叶、茎、芽、根和土壤中分离筛选到一些对黑穗病菌有抑制作用的菌株，并利用相关基因序列设计特异性引物，探讨得到相关抑制因子的基因。但未见用生物防治措施有效控制黑穗病的系统报道。迄今为止，尚未见到利用微生物及其生防制剂成功用于防治甘蔗黑穗病的相关报导。
发明内容
本发明目的在于提供一种抗菌蛋白编码基因HAS1基因序列及其在防治甘蔗黑穗病方面的应用。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种抗菌蛋白编码基因HAS1基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，具体如下：
长度：750bp
类型：核酸
链型：双链
形态：线性
分子类型：基因组DNA
序列描述：
ATGGCGAAACCACTATCAAAGGGGGGAATTTTGATGAAAAAAGTATTGATTGCAGGTGCAGTAGGAACAGCAGTTCTTTTCGGAACCCTTTCATCAGGTATACCAGGCTTACCAGCGGCAGACGCTCAAGTCGCAAAAGCAGCATCCCAGCTGCCTAACGGAATCGGCGGCCGTGCCTACCTGAACAGTACGGGCGCCGTTTTTACAGCTAAAATCACGCTTCCTGAAACTGTCAAAAATAACGACTCGGTCTCTACTCCCTATATTTATTCAGGCTTTAGGGCATCAAGCGGAACTGAAGCCGATATCGGGCTTCAGTACAGCAAACAATACAACGTCTGGAAGCCCCTCATGAAGGTTGGGTCCAAAAATGAAGAAACGTACATCGAAGGAAAAGATAAATTCACATACAATAAAGGCTTCCGCCCTGGAAGCACAGTCCAAATGACAATCTATAAAAATTTAAGCGGCAATACGCGCATGACCCTTTGGGGAACGAACAATGACGGCTACACCGGAAGGATTATCACAGAAATTCAAGGAACCAACATCGGCACGATTTCAAAATGGAAAACCCTTGCTACCGCGGCTGTTTCGTATGAAAGCCAGCGTGATGCGATCAAAGCAACCTTTTCGACATCTTTTAACAACATCACAATCGACAATAAAGCCGTCACTCCTGTGGTAGATACACAGGATTTCGCAAAGGTTTCAGTTGCAGGAAATAACGTTACGATCTCTGTTAATAAA。
所述的抗菌蛋白编码基因HAS1基因序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
长度：250
类型：氨基酸
链型：单链
形态：线性
分子类型：蛋白
序列描述：
MAKPLSKGGILMKKVLIAGAVGTAVLFGTLSSGIPGLPAADAQVAKAASQLPNGIGGRAYLNSTGAVFTAKITLPETVKNNDSVSTPYIYSGFRASSGTEADIGLQYSKQYNVWKPLMKVGSKNEETYIEGKDKFTYNKGFRPGSTVQMTIYKNLSGNTRMTLWGTNNDGYTGRIITEIQGTNIGTISKWKTLATAAVSYESQRDAIKATFSTSFNNITIDNKAVTPVVDTQDFAKVSVAGNNVTISVNK。
一种原核表达载体，它含有上述抗菌蛋白编码基因HAS1的基因序列。
所述抗菌蛋白编码基因HAS1基因序列在防治甘蔗黑穗病方面的应用，及在转基因作物育种中的应用。
本发明在研究微生物对甘蔗黑穗病进行生物防治时，成功分离到一株对甘蔗黑穗病菌有较好抑制作用和防治效果的生防菌株，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS，已于2012年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCC NO.6590。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS菌株，分离自我国海南省蔗区的甘蔗根际土壤，经形态学、培养性状、常规生理生化和16S rDNA序列鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的一个新菌株，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS。本发明所提供的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS的基本生物学特性为：革兰氏阳性短杆菌，菌体大小约0.7～0.9×1.8～2.4 μm之间，产生芽孢，芽孢中生，圆形，周生鞭毛、具运动性。在LB培养基上初期菌落浅白色，圆形，表面湿润，脓状，难挑起；后期菌落淡黄色，边缘不整，表面褶皱，挑起褶皱带起脓状丝。
本发明通过对生防菌株HAS抑菌机理进行研究，成功分离到一种抗菌蛋白，并通过其氨基酸测序结果推到出其核苷酸序列，进行特异性表达引物的设计，获得了其全长基因编码序列。通过原核表达证明该编码基因表达的蛋白存在生物活性，通过网上比对，该编码基因序列同枯草芽孢杆菌基因组序列同源性达99%，是一个没有注释功能的编码基因序列，因此暂把该编码基因命名为HAS1，新的抗菌蛋白命名为抗菌蛋白HAS1。
对于甘蔗黑穗病的防治，到目前为止还没有一种有效的防治措施，抗病育种被认为是一种最为有效的方法，但由于抗原材料的缺乏，进展缓慢。本发明的技术方案一是发现了一个新的抗菌蛋白，二是可以为今后的抗病育种提供一个新的抗原材料。
附图说明
图1为抗菌蛋白HAS1编码基因HAS1的PCR扩增，图中M为Marker，1、2、3为PCR扩增产物；
图2为原核表达载体pET32a-HAS1结构图；
图3为编码序列的网上比对结果，其结果表明该序列为枯草芽孢杆菌基因组序列的一部分，但没有注释功能，即是一个未知功能的序列；
图4为抗菌蛋白HAS1编码基因HAS1的原核表达，泳道1和2为空白载体；泳道3为Marker；泳道4、5、6、7、8、9、10分别为加入IPTG诱导2、3、4、5、6、7、8h后的表达结果；
图5为表达产物对甘蔗黑穗病菌的抑制活性，左为原始表达载体表达后的产物（用作对照），右为构建有HAS1基因序列的表达载体表达产物；由图可看出在右侧的表达产物周围有一明显抑制甘蔗黑穗病菌的抑菌圈，而左侧的对照组没有，这充分说明该表达产物具有抑制甘蔗黑穗病菌的能力，具有生物抑菌活性；
图6为HAS1蛋白的网上同已知毒蛋白的比对结果，其结果表明，HAS1蛋白与已知的毒蛋白没有相似性，可以不经改造直接使用的蛋白；
图7为HAS1蛋白同网上有致敏性蛋白的比对结果，结果表明该蛋白同致敏性蛋白的相似性为0，该蛋白没有致敏性；
图8为HAS1蛋白同网上有抗营养因子的蛋白的比对结果，结果表明该蛋白没有抗营养因子的特性。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1
1、植物病原真菌拮抗菌的筛选及其鉴定
菌株筛选：称取5克根际土壤（我国海南省临高县甘蔗黑穗病发生严重的地块中甘蔗植株的根际土壤），放入有100ml无菌水的三角瓶中，在摇床上剧烈振荡30min后，静置15min。取1ml稀释至10-4、10-5、10-6浓度梯度，从各浓度梯度悬浮液中取0.1ml，用无菌涂棒涂于LB培养基（配方为：每升含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉12g，pH7.0～7.2）平板上，30℃恒温培养箱倒置培养，连续观察3天，挑取菌落形态不同的菌株再次划线纯化保存备用。在倒好的PDA平板表面涂布甘蔗黑穗病菌冬孢子，在超净工作台内晾干后，用无菌牙签点接筛选纯化后的菌株进行对峙培养，筛选抑菌作用最强（抑菌活性最强）的菌株，结果得到一株对甘蔗黑穗病菌有很强拮抗作用的菌株，将该菌株命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS，其已于2012年 9月 19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.6590。
菌株HAS的基本生物学特性：革兰氏阳性短杆菌，菌体大小约0.7～0.9×1.8～2.4 μm之间，产生芽孢，芽孢中生，圆形，周生鞭毛、具运动性。在LB培养基上初期菌落浅白色，圆形，表面湿润，脓状，难挑起；后期菌落淡黄色，边缘不整，表面褶皱，挑起褶皱带起脓状丝。
菌株16S rDNA保守序列的测定：将筛选得到的菌株（枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HAS）的基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA序列通用引物P0、P6作为引物，PCR扩增出约1.5kb左右的产物片段，测序结果表明扩增出的序列长度为1518个碱基；将该序列通过互联网比对( http: / /www. ncbi.nlm. nih. gov/blast/B last. cgi) , 扩增的片段序列与枯草芽孢杆菌的16S rDNA 部分序列的同源性达98%以上，确定该菌株归属为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
2、菌株HAS抑菌功能蛋白的分离
将菌株HAS在LB培养基平板上活化，然后接种于LB液体培养基中，在37℃恒温振荡培养箱中170rpm下培养36h，除菌体，在上清液中加入硫酸铵至硫酸铵饱和度80%，4℃冰箱内静置过夜后离心收集蛋白，用0.01M PBS（磷酸缓冲液，pH7.0）溶解蛋白后将蛋白液分为两份，一份直接用来做抑菌试验，另一份100℃水浴30分钟后离心除去变性蛋白，做抑菌实验并进行PAGE电泳，结果经100℃水浴30分钟后的那份蛋白液同不经处理的蛋白液具有基本相同的抑菌作用，PAGE电泳后得到单一条带的蛋白带，将该蛋白带切下来后送去测序，得到一个同源性为58%的氨基酸序列，同时推导出其核苷酸序列。
3、抗菌蛋白HAS1编码基因的克隆
通过网上比对，设计引物如下：
HASF： 5’-TAAGGATCCATGGCGAAACCACTATCAAAG-3’
HASR: 5’-GGAGAGCTCTTATTTATTAACAGAGATCG-3’
以菌株HAS基因组DNA为模板，扩增菌株HAS的抗菌蛋白HAS1编码基因片段。预期扩增片段大小为750bp左右。PCR反应体系25μL，内含10×buffer(含1.5 mmol/L Mg2+)2.5μL、dNTPs(2.5 mmol/L each)2μL、HASF(10μmol/L)1μL、HASR(10μmol/L)1μL、Taq酶(5 U/μL)0.15μL、模板DNA 1μL、ddH2O 17.35μL。PCR反应程序为：94℃ 3min，94℃ 1min，53℃ 50s，72℃1min，30个循环，最后72℃下延伸 10min。所得到的PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测，将得到的纯化PCR产物克隆到pMD-19T载体中，转入大肠杆菌DH5α，挑阳性克隆并送上海生工生物有限公司测序。对测序结果序列进行分析，得到了抗菌蛋白HAS1编码基因的全长序列，为一个750bp长片段的完整ORF阅读框，编码249个氨基酸，结果见图1和2。
将该序列用BLAST软件在线分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）进行同源性测定，以确定该编码序列的同源序列，同时寻找其有关序列的相关信息，比对结果见图3。
经过比较其有关序列信息，该基因序列为枯草芽孢杆菌全基因组序列的一部分，同时该有关序列的信息表明，该基因是一段没有被注释功能的基因，表明该编码基因表达的产物可能是一个未注释功能的新的抗菌蛋白。
4、抗菌蛋白HAS1编码基因的原核表达及功能验证
提取阳性克隆质粒pMD19-T/HAS1，经BamH I和Sac I双酶切后电泳回收小片段，将实验室保存的原核表达载体pET32a质粒同样经BamH I和Sac I双酶切后电泳回收大片段，使用连接试剂盒将得到的小片段和大片段进行连接、转化入大肠杆菌表达细胞BL21（DE3），挑取阳性菌落，摇菌提取质粒进行酶切验证，将证实为阳性克隆的菌落接种于装有200ml新鲜无菌的LB液体培养基（内含Amp+50μmol/mL和IPTG0.01μmol/mL）的三角瓶中进行扩大培养，在37℃恒温摇床上170rpm振荡培养8小时后离心除去菌体，加硫酸铵至80%饱和度，静置过夜后12000rpm离心收集蛋白，用2ml0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）充分溶解，同时以转入表达载体pET32a的大肠杆菌表达细胞BL21（DE3）的菌落的培养基收集蛋白为对照，在混有甘蔗黑穗病菌孢子的固体LB平板上，放置两个灭菌的牛津杯，分别加入上述收集到的两种蛋白液各100μL，在28℃恒温培养箱中培养72小时，做抑制甘蔗黑穗病菌的对峙培养试验。结果表明，加入抗菌蛋白HAS1编码基因的原核表达产物的牛津杯周围出现明显的抑制圈，表明该蛋白液对甘蔗黑穗病菌有抑制活性，而对照组没有，这充分表明了抗菌蛋白的生物抑菌活性，结果见图4和5。
5、抗菌蛋白HAS1的毒理学分析
以OECD文件为参考，以抗菌蛋白HAS1蛋白为目标，在NCBI中检索已知毒蛋白与其氨基酸相似性进行比较，其结果见图6。从图中可知，抗菌蛋白HAS1为一个新的抗菌蛋白，其编码基因与已知的毒蛋白相似性极低，具有毒性的可能性极小。
根据http://ambl.lsc.pku.edu.cn的资料，对抗菌蛋白HAS1的致敏性进行评估，结果也没有发现与致敏序列相似的序列（No Signigicant Similarity was found）（http://ambl.lsc.pku.edu.cn），（见图7）。
同样以OECD文件为参考，以抗菌蛋白HAS1为目标，在NCBI中检索已知抗营养因子与其氨基酸相似性进行比较，其结果见图8。从图中可知，新的抗菌蛋白HAS1编码的基因序列同已知的抗营养因子无相似性。
综上分析可知，抗菌蛋白HAS1为无毒、无过敏性、无抗营养因子的新型抗菌蛋白，因此其可以作为一种新的抗原材料用在转基因作物的育种上。
Claims (4)
1.一种抗菌蛋白编码基因HAS1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种抗菌蛋白编码基因HAS1基因，其特征在于，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种原核表达载体，它含有权利要求1所述抗菌蛋白编码基因HAS1的基因。
4.权利要求1所述抗菌蛋白编码基因HAS1基因在防治甘蔗黑穗病方面的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210553669.4A CN103031309B (zh) | 2012-12-19 | 2012-12-19 | 一种抗菌蛋白has1编码基因的克隆、表达及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210553669.4A CN103031309B (zh) | 2012-12-19 | 2012-12-19 | 一种抗菌蛋白has1编码基因的克隆、表达及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103031309A CN103031309A (zh) | 2013-04-10 |
| CN103031309B true CN103031309B (zh) | 2014-05-14 |
Family
ID=48018710
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210553669.4A Expired - Fee Related CN103031309B (zh) | 2012-12-19 | 2012-12-19 | 一种抗菌蛋白has1编码基因的克隆、表达及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103031309B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105925498B (zh) * | 2016-04-21 | 2019-06-25 | 华南农业大学 | 一株假单胞菌属菌株st4及其在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用 |
| CN111269295B (zh) * | 2020-03-09 | 2022-03-22 | 河北农业大学 | 一种新型抗菌肽及其制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1929735A (zh) * | 2004-02-06 | 2007-03-14 | 拜尔作物科学有限公司 | 植物保护组合物及其用途 |
| WO2008075453A1 (ja) * | 2006-12-19 | 2008-06-26 | Mitsui Chemicals, Inc. | 有害生物防除組成物 |
-
2012
- 2012-12-19 CN CN201210553669.4A patent/CN103031309B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1929735A (zh) * | 2004-02-06 | 2007-03-14 | 拜尔作物科学有限公司 | 植物保护组合物及其用途 |
| WO2008075453A1 (ja) * | 2006-12-19 | 2008-06-26 | Mitsui Chemicals, Inc. | 有害生物防除組成物 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 廖咏梅等.甘蔗黑穗病菌拮抗细菌的筛选及鉴定.《广西农业生物科学》.2004,(第03期),197-201. |
| 甘蔗黑穗病菌拮抗细菌的筛选及鉴定;廖咏梅等;《广西农业生物科学》;20040930(第03期);197-201 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103031309A (zh) | 2013-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Phoma stem canker disease on oilseed rape (Brassica napus) in China is caused by Leptosphaeria biglobosa ‘brassicae’ | |
| CN102010466B (zh) | 植物抗性相关蛋白myb及其编码基因与应用 | |
| Cho et al. | Endophytic bacterial communities in ginseng and their antifungal activity against pathogens | |
| CN105670958B (zh) | 一株低温生防菌株及其应用 | |
| CN102676416B (zh) | 一株水稻纹枯病菌生防菌rs-bc及微生物菌剂与制备方法和应用 | |
| CN104195061B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN102816773B (zh) | 水稻OsWRKY28转录因子基因在改良植物抗病性中的应用 | |
| Zhang et al. | Enhancing plant disease suppression by Burkholderia vietnamiensis through chromosomal integration of Bacillus subtilis chitinase gene chi113 | |
| CN105255915A (zh) | 拟南芥AtGDSL基因在油菜抗菌核病及促进种子萌发中的应用 | |
| Huang et al. | Efficacy of sludge and manure compost amendments against Fusarium wilt of cucumber | |
| Tantirungkij et al. | Assessment of endophytic yeast diversity in rice leaves by a culture-independent approach | |
| CN108795830B (zh) | 一种埃吉类芽孢杆菌（Paenibacilluselgii）SWL-W8及其应用 | |
| CN105950506A (zh) | 一株用于防治番茄青枯病的解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN105585619A (zh) | 与水稻籽粒粒长和粒重相关蛋白及其编码基因gl3-3与应用 | |
| CN102899280B (zh) | 枯草芽孢杆菌has及其在防治甘蔗黑穗病中的应用 | |
| Motlagh et al. | The effect of Trichoderma spp. isolates on some morphological traits of canola inoculated with Sclerotinia sclerotiorum and evaluation of their efficacy in biological control of pathogen | |
| Zhu et al. | Colonization, ALP activity and plant growth promotion of native and exotic arbuscular mycorrhizal fungi at low pH | |
| CN103031309B (zh) | 一种抗菌蛋白has1编码基因的克隆、表达及其应用 | |
| Wasike et al. | Genetic diversity of indigenous Bradyrhizobium nodulating promiscuous soybean [Glycine max (L) Merr.] varieties in Kenya: impact of phosphorus and lime fertilization in two contrasting sites | |
| CN110499254B (zh) | 一种抗盐碱赭曲霉菌株w1及其菌剂和应用 | |
| CN114517172B (zh) | 一株马胃葡萄球菌及其在防治果蔬灰霉病上的应用 | |
| CN106831965A (zh) | 大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdCP1及其应用 | |
| CN102851250A (zh) | 一株根际拮抗细菌多粘类芽孢杆菌yc0136及其应用 | |
| CN113528355B (zh) | 一种拮抗马铃薯多种病原真菌的木霉菌及其应用 | |
| Darmadi et al. | First study on Fusarium equiseti: causes Fusarium wilt in tomato crop in Bali, Indonesia. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140514 |