CN113943743B

CN113943743B - SlLYK4基因在增强番茄真菌性病害抗性中的应用

Info

Publication number: CN113943743B
Application number: CN202111457858.7A
Authority: CN
Inventors: 艾莹飞; 梁岩
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-12-02
Filing date: 2021-12-02
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2041-12-02
Also published as: CN113943743A

Abstract

本发明公开了SlLYK4基因在增强番茄真菌性病害抗性中的应用，具体涉及植物免疫技术领域。所述SlLYK4基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明培育的35S::SlLYK4‑GFP转基因番茄与对照相比具有明显的抗灰霉病效果，提供的所述基因SlLYK4基因或其编码的蛋白质在植物提高对真菌病原菌引起的病害中的应用，特别是在番茄植株提高对灰霉病抗性中的应用，可用于抗真菌性病害的番茄品种的选育。

Description

SlLYK4基因在增强番茄真菌性病害抗性中的应用

技术领域

本发明涉及植物免疫技术领域，具体涉及SlLYK4基因在增强番茄真菌性病害抗性中的应用。

背景技术

番茄是世界范围内广泛栽培的作物，在农业生产中占有重要的地位。但在其栽培和采后储藏过程中，常有多种病害发生，严重制约番茄产量和品质。其中番茄灰霉病是造成产量损失的主要真菌性病害，在我国各地已普遍发生，且病情呈上升趋势，已成为限制我国番茄产业发展的主要因素之一。番茄灰霉病的病原是盘菌亚门的灰葡萄孢(Botrytiscinerea Pers.Ex Fr)，是一种死体营养型病原真菌，可侵染番茄茎、叶和花组织，也可造成采后果实腐烂，发病严重时，产量损失高达50％。农业生产中，目前还没有针对该病害的番茄抗性品种，因此鉴定番茄抗灰霉基因，培育抗性品种具有重要的经济价值。

在鉴定番茄抗灰霉基因，培育抗性品种的研究道路上，研究人员已经展开了相关的研究。其中在番茄miRNA参与逆境胁迫应答调控领域展开了相关的研究，公开号为CN107164403A的申请专利公开了miR319在培育抗灰霉病植物中的应用，其将miR319在拟南芥中过表达，可显著提高拟南芥对灰霉病菌的抗性。表明miR319是一个对灰霉病菌具有较强抗性的miRNA基因。公开号为CN101289649A的申请专利公开了番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其构建包括以下四个步骤：步骤1从感染灰霉病的土壤样品中筛选到一株高效拮抗灰霉病的蜡样芽孢杆菌，该细菌命名为B-04；步骤2培养含有B-04细菌的菌液；步骤3依次用超纯水、1mM Hepes、电击缓冲液洗；步骤4通过电击的方法将β-1，3-葡聚糖酶基因转化到B-04细菌内，获得拮抗菌株B-04-glu。其发明由于是生物防治，不含有化学农药的嘧啶胺类、吡咯类以及酰胺类等成份，所以具有对非靶标生物安全的优点。

在病原菌侵染植物时，植物首先识别病原菌表面比较保守的分子，启动植物先天免疫，从而抵御病原菌的进一步入侵。而几丁质是真菌细胞壁的主要成分之一，植物识别几丁质后，诱导一系列的免疫反应，包括活性氧迸发、抗性基因表达上调和胼胝质沉积增加。因此，增加植物对几丁质的识别，从而增强几丁质诱导的下游免疫反应，是提高植物对真菌性病害抗性的一个最经济有效的方法。几丁质是由一类定位于植物细胞质膜上的受体蛋白识别，属于LysM型类受体蛋白激酶(LysM motif receptor-like protein kinase，LYK)，其结构包括一个胞外域，一个跨膜结构域和一个胞内域。拟南芥中通过遗传和生化实验发现AtLYK5是主要识别几丁质的受体，序列同源比对表明SlLYK4是番茄识别几丁质的主要受体。目前，针对SlLYK4基因在植物对广谱真菌性病害的抗性研究还未见报道。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供了SlLYK4基因在增强番茄真菌性病害抗性中的应用，为培育抗真菌性病害的番茄品种提供依据。

本发明提供了SlLYK4基因在增强番茄真菌性病害抗性中的应用，所述SlLYK4基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述真菌性病害为灰霉菌病害。

本发明还提供了SlLYK4基因编码的蛋白在增强番茄真菌性病害抗性中的应用，所述SlLYK4基因的蛋白编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述真菌性病害为灰霉菌病害。

本发明还提供了一种培育增强番茄作物对真菌性病害抗性的方法，在番茄作物中过表达SlLYK4基因，所述SlLYK4基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述真菌性病害为灰霉菌病害。

具体包括以下步骤：

(1)构建过表达SlLYK4基因的载体；

(2)构建含步骤(1)所述用于过表达SlLYK4基因的载体的农杆菌基因工程菌；

(3)将步骤(2)所述农杆菌基因工程菌转化到番茄组织中，筛选培养获得转基因植株。

优选的，所述用于过表达SlLYK4基因的载体为pDONR载体。

具体的，构建过表达SlLYK4基因的载体时，转录起始密码子使用35S启动子；转录终止密码子前加上GFP表达标签并去掉终止密码子，具有转基因植株蛋白鉴定作用。

本发明还利用Gateway反应构建SlLYK4基因的重组表达载体，使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始密码子前加上35S增强型启动子，增强SlLYK4基因的表达转录。在其转录终止密码子前加上GFP表达标签并去掉终止密码子，具有转基因植株蛋白鉴定作用。

优选的，所述农杆菌基因工程菌为农杆菌GV3101菌株。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)在相同病原真菌危害的情况下，本发明培育的35S::SlLYK4-GFP转基因番茄与对照相比具有明显的抗灰霉病效果，提供了所述基因SlLYK4基因或其编码的蛋白质在植物提高对真菌病原菌引起的病害中的应用，特别是在番茄植株提高对灰霉病抗性中的应用。

(2)由于几丁质诱导的先天免疫具有广谱抗病性的特点，本发明培育的35S::SlLYK4-GFP转基因番茄，理论上具有抗其它病原细菌的效果，这对番茄广谱抗性育种提供了重要的参考价值。

附图说明

图1为番茄SlLYK4基因cDNA扩增PCR电泳图；其中，各泳道分别为Marker：proteinmarker；Solyc02g089900：SlLYK4基因。

图2为融合GFP表达标签的番茄SlLYK4基因表达载体图。

图3为35S::GFP空载体转化野生型番茄后，GFP荧光蛋白的Western Blotting结果图。

图4为SlLYK4基因连接GFP报告基因的表达载体转化野生型番茄后，GFP荧光蛋白的Western Blotting结果图。

图5为WT、35S::GFP和35S::SlLYK4-GFP转基因番茄接种灰霉菌2天后表现的发病症状图；其中，A为野生型番茄；B为35S::GFP转基因番茄；C为35S::SlLYK4-GFP#1株系的转基因番茄；D为35S::SlLYK4-GFP#2株系的转基因番茄。

图6为WT、35S::GFP和35S::SlLYK4-GFP转基因番茄接种灰霉菌2天后病斑直径的统计结果图，其中“**”表示P＜0.01。

具体实施方式

实施例1

扩增番茄中SlLYK4基因的全长。

在“https://solgenomics.net/search/locus”网站中搜索，获得SlLYK4基因的序列(SlLYK4基因搜索号为Solyc02g089900)，蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。参考Gateway手册，设计正向引物：5’>ggggacaagtttgtacaaaaaagcag gctacATGAATTATTCTCATCTCATCT>3’和反向引物5’>ggggaccactttgtacaa gaaagctggtcGGGCAATCTATGTGGTGACA>3’。提取番茄叶片的RNA，通过反转录得到cDNA，用TOYOBO公司KOD高保真酶的方法将该基因全长扩增出来，SlLYK4基因的cDNA扩增PCR电泳图见图1。

PCR反应体系如下：

体系	体积
		无菌水	32μL
10XPCR Buffer for KOD-Plus-Neo	5μL
		2mM dNTP	5μL
25mM MgSO<sub>4</sub>	3μL
		正向引物	1.5μL
反向引物	1.5μL
		模板cDNA	1μL
KOD-Plus-Neo	1μL
		总共	50μL

反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共28个循环，最后68℃延伸10min。

实施例2

SlLYK4基因组成型高表达(35S启动子)载体的构建。

将全长基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)与载体pDONR进行BP重组反应，将连接产物通过热激方法转化进大肠杆菌DH5α菌株，挑选阳性菌落加入到4mL含100mg/LZeocin抗性的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床中培养10-12小时。小量提取质粒，酶切和PCR鉴定正确后，送TSINGKE Biological Technology公司进行序列测定。将测序正确的质粒与pGWB5-GFP空载进行LR反应，将连接产物通过热激方法转化进大肠杆菌DH5α菌株，挑选阳性菌落加入到4mL含100mg/L抗性的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床中培养10-12小时。小量提取质粒，酶切和PCR鉴定正确后，完成35S::SlLYK4-GFP载体构建(图2)。

实施例3

将35S::SlLYK4-GFP表达载体转化番茄愈伤组织。

将成功构建的35S::SlLYK4-GFP载体通过电激方法转化进农杆菌GV1301菌株，挑选阳性菌落加入到4mL含100mg/L Kan(卡那霉素)和Rif(利福平)抗性的LB液体培养基中，在28℃，200rpm的摇床中培养10-12小时。将菌液送到百格基因科技(江苏)有限公司使用番茄组织培养的方法将基因转入到番茄愈伤组织中，再进行潮霉素抗性愈伤组织的筛选、诱导发芽及诱导生根等步骤产生T₀代转基因植株。

实施例4

转化后转基因番茄鉴定。

T₀代转基因植株自交产生后代，通过提取植物叶片总蛋白进行Western Blotting检测。将植物叶片用研磨仪磨碎，加入蛋白提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，150mMNaCl，2％TritonX-100，1×PMSF(苯甲基磺酰氟)或蛋白酶抑制剂以及1×磷酸酶抑制剂calyculin A)，PMSF和蛋白酶抑制剂现用现加。蛋白提取液与植物组织充分混匀，冰上放置30分钟，4℃12000×g离心10分钟，取上清，重复三次，获得总蛋白。加入5×蛋白上样缓冲液，沸水煮10分钟，离心后用于SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳分离胶采用浓度10％的均一胶，浓缩胶浓度为5％；其中，缩胶部分采用80V电压，分离胶部分采用100V电压。

电泳完毕后切去浓缩胶等多余部分，标记上样顺序。之后剪取与电泳凝胶大小一致的PVDF膜，用甲醇浸润活化，按海绵垫、滤纸、胶、膜、滤纸及海绵垫的顺序从负极向正极放置在电转仪上，并注意膜与胶、膜与滤纸和滤纸与胶之间不能存在气泡。装好电转装置后，转膜槽中加满转膜液，在冰浴条件下200mA转膜2小时。

电转完成后将PVDF膜取出，用3％BSA于室温封闭2小时，弃去封闭液，加入TBST清洗3遍，每次10分钟。

当膜封闭好后之后，按1:3000(v/v)稀释倍数加入GFP-HRP的抗体。4℃结合过夜。第二天用TBST清洗3遍，每次10分钟。

以1:1体积比例混合显色溶液A和B后加到膜上，在凝胶成像仪上拍照。SlLYK4蛋白大小预测为100kD(图4)，GFP蛋白大小为26kD(图3)，因此在目的大小126kD处出现特异条带，说明该基因已表达。

实施例5

灰霉菌侵染番茄离体叶片。

(1)灰霉菌的培养

将灰霉菌接种到固体CM培养基上。接种的CM培养基平板平置于25℃黑暗条件下培养7天即可用于后续实验。此时黑色菌丝达到培养皿边缘。

(2)灰霉菌侵染番茄离体叶片

使用前将培养基里的孢子用悬浮培养液(4％麦芽糖和1％蛋白胨)悬浮后经四层纱布过滤后，在显微镜下用血球计数板定量孢子浓度，番茄离体叶片需孢子悬浮液浓度为每毫升1×10⁵个孢子(即血球计数板中间所有小方格孢子总数为10)。

准备好接种用的较大容器，在该容器内铺6张纸巾(常用嫦娥奔月方巾纸，已灭菌)，然后在嫦娥奔月纸上面铺两层纱布，倒入无菌水使纸和纱布浸湿，将多余的水倒掉至没有水流出为止。然后剪取4周龄的番茄叶片(保持叶片大小以及叶位一致)，将番茄野生型植株(WT)、35S::GFP对照以及35S::SlLYK4-GFP两个株系(#1和#2)的转基因植株各选取3株，每株3片叶片，将番茄叶片置于湿润纱布上，用浸湿的棉花覆在叶柄保持植物可以正常吸水(番茄叶片基本呈隆起状态，自然铺放叶片，避免叶背面贴到有水纱布上)。之后将孢子悬浮液接种到叶片非主脉区，每个叶片接种四个点，每个点2.5μL。接种完后覆膜保湿，将装有叶片的容器置于22℃恒温(此时光照不需太强)环境下，接种2-3天观察发病情况并进行统计。

首先用肉眼观察到35S::SlLYK4-GFP两个株系的番茄叶片上发病较轻(图5)。统计每片叶片上四个病斑的直径，可以判断35S::SlLYK4-GFP两个株系叶片上的病斑直径比对照更小(图6)，说明高表达SlLYK4基因能够抑制灰霉病在番茄上的发病。

综上，可以看出SlLYK4基因对番茄抗灰霉病具有重要作用。高表达SlLYK4基因能够显著提高番茄对灰霉菌的抗病性，是一种理想的增强植物抗真菌的基因，通过番茄组织培养转化的方法使该基因在番茄中高表达使番茄获得对真菌性病害的抗病能力，从而可以提高番茄在田间的抗病性以及番茄果实采后对真菌性病害的抗性。

序列表

<110> 浙江大学

<120> SlLYK4基因在增强番茄真菌性病害抗性中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1938

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 1

atgaattatt ctcatctcat ctttgttttt accatcattc ttgcttattc ctctgtttca 60

attcttgcac aacagcctta ttttggaact ggaacaaatg actgcagcag ccaagatacc 120

tccacttctg cttttgggta tttatgcaat ggcgttaacc gtacttgcca atcttatttg 180

accttcagat ctcaaccccc tttcaatact gtgtcctcaa tctcttcttt actcggtgct 240

aatccttcac agctctctca gctcaattct gtttctcaaa atgctacctt taacaccaat 300

caaatggttc ttgttcctgt cacttgttct tgttcaggtc agttttatca atcaaatgca 360

tcttatgtta tcagaaggga tgatagtttc ttgaatattg caatgaatac cttacaagga 420

ttgtcaactt gccaagctat caacgcggag aacagtgaac aagctaacaa tcttgttgtt 480

ggttcaagaa ttaatgttcc tctgcgatgt gcttgtccta cacaaaacca aactaataat 540

ggtacaaatt atctgcttac ttatttgatt gcttctgggg aatttgtttc ctttattagt 600

gataaatttg gggtggattt tagggcaact cttgctgcta atagtatacc agaagatgct 660

cctactgtct ttccaaatac tactctatta gttcctttat cgaccccacc tttgagttcc 720

caagttgctg gaccatctcc accaccgcct cctgcgacaa caccaacacc acctgctgtc 780

cctgtatcgg agagcagctc gaacaaaact tggatatatg ttgtcgctgg tgttgttgga 840

ggacttgttg ctttgtgtat tctgggggtg gttgttttct ttttgttttt caggaaaaag 900

gaaaagaaag ctgatccaca gtttgtttct gaaagctttg aagctgttga gaaaccgtcg 960

aataagaaag ttgaagaaga atcagaggag tttttggaaa gtttatccag catagctcaa 1020

tctgttaagg tttacaagtt tgaagaggtt aaagcagcca cagaaaattt cagtcctaca 1080

tgtttgatta agggatctgt ttatcggggc acgataaatg gggattttgc tgctataaag 1140

aaaatgagtg gtgatgtatc aaaggaaatt aatttgttga gcaaaatcaa tcattttaat 1200

cttattagtc tatcgggaat ttgttttcat gatggtcact ggtatcttgt atatgaatat 1260

gctgccaatg gaccattaag tgattggata tgtcaccata atggtgagca gaagtcacta 1320

agttgggcac aaagagtaca aatttctttt gatgtggcta caggacttaa ctatctccat 1380

agctacacat ccccacctca tgttcacaag gatttaaacg gtgataatat acttcttgat 1440

ggtgatttaa gagccaagat tgctaacttt ggtctagcaa ggtcagcaga tggacaagaa 1500

ggtgagtttg cattgacaag gcacatagtt gggacccaag gctacatggc acctgagtat 1560

ttggagaatg ggctagtctc accgaagctg gatgtctatg cattgggagt tctgttgctg 1620

gagattctca ccgggaaaga agtttccgct ttatatgaag gttcaaacac aaacttggct 1680

gagttgttga tcccggtgct taatgatgat aatgcaaagg agagtttgag caacttcgtt 1740

gacccttctc tgcaagggaa gtaccctgtg gaacttgctt ttgccatggt cagattgatc 1800

gataactgcc taatgaaaga tccctcacat cgccctaata cggatgagat tgtgcaatct 1860

gtttcaagaa ttatgacagc cacacactca tgggaaacgt catttagcac ttcagtgtca 1920

ccacatagat tgccctag 1938

<210> 2

<211> 645

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 2

Met Asn Tyr Ser His Leu Ile Phe Val Phe Thr Ile Ile Leu Ala Tyr

1 5 10 15

Ser Ser Val Ser Ile Leu Ala Gln Gln Pro Tyr Phe Gly Thr Gly Thr

20 25 30

Asn Asp Cys Ser Ser Gln Asp Thr Ser Thr Ser Ala Phe Gly Tyr Leu

35 40 45

Cys Asn Gly Val Asn Arg Thr Cys Gln Ser Tyr Leu Thr Phe Arg Ser

50 55 60

Gln Pro Pro Phe Asn Thr Val Ser Ser Ile Ser Ser Leu Leu Gly Ala

65 70 75 80

Asn Pro Ser Gln Leu Ser Gln Leu Asn Ser Val Ser Gln Asn Ala Thr

85 90 95

Phe Asn Thr Asn Gln Met Val Leu Val Pro Val Thr Cys Ser Cys Ser

100 105 110

Gly Gln Phe Tyr Gln Ser Asn Ala Ser Tyr Val Ile Arg Arg Asp Asp

115 120 125

Ser Phe Leu Asn Ile Ala Met Asn Thr Leu Gln Gly Leu Ser Thr Cys

130 135 140

Gln Ala Ile Asn Ala Glu Asn Ser Glu Gln Ala Asn Asn Leu Val Val

145 150 155 160

Gly Ser Arg Ile Asn Val Pro Leu Arg Cys Ala Cys Pro Thr Gln Asn

165 170 175

Gln Thr Asn Asn Gly Thr Asn Tyr Leu Leu Thr Tyr Leu Ile Ala Ser

180 185 190

Gly Glu Phe Val Ser Phe Ile Ser Asp Lys Phe Gly Val Asp Phe Arg

195 200 205

Ala Thr Leu Ala Ala Asn Ser Ile Pro Glu Asp Ala Pro Thr Val Phe

210 215 220

Pro Asn Thr Thr Leu Leu Val Pro Leu Ser Thr Pro Pro Leu Ser Ser

225 230 235 240

Gln Val Ala Gly Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Thr Pro Thr

245 250 255

Pro Pro Ala Val Pro Val Ser Glu Ser Ser Ser Asn Lys Thr Trp Ile

260 265 270

Tyr Val Val Ala Gly Val Val Gly Gly Leu Val Ala Leu Cys Ile Leu

275 280 285

Gly Val Val Val Phe Phe Leu Phe Phe Arg Lys Lys Glu Lys Lys Ala

290 295 300

Asp Pro Gln Phe Val Ser Glu Ser Phe Glu Ala Val Glu Lys Pro Ser

305 310 315 320

Asn Lys Lys Val Glu Glu Glu Ser Glu Glu Phe Leu Glu Ser Leu Ser

325 330 335

Ser Ile Ala Gln Ser Val Lys Val Tyr Lys Phe Glu Glu Val Lys Ala

340 345 350

Ala Thr Glu Asn Phe Ser Pro Thr Cys Leu Ile Lys Gly Ser Val Tyr

355 360 365

Arg Gly Thr Ile Asn Gly Asp Phe Ala Ala Ile Lys Lys Met Ser Gly

370 375 380

Asp Val Ser Lys Glu Ile Asn Leu Leu Ser Lys Ile Asn His Phe Asn

385 390 395 400

Leu Ile Ser Leu Ser Gly Ile Cys Phe His Asp Gly His Trp Tyr Leu

405 410 415

Val Tyr Glu Tyr Ala Ala Asn Gly Pro Leu Ser Asp Trp Ile Cys His

420 425 430

His Asn Gly Glu Gln Lys Ser Leu Ser Trp Ala Gln Arg Val Gln Ile

435 440 445

Ser Phe Asp Val Ala Thr Gly Leu Asn Tyr Leu His Ser Tyr Thr Ser

450 455 460

Pro Pro His Val His Lys Asp Leu Asn Gly Asp Asn Ile Leu Leu Asp

465 470 475 480

Gly Asp Leu Arg Ala Lys Ile Ala Asn Phe Gly Leu Ala Arg Ser Ala

485 490 495

Asp Gly Gln Glu Gly Glu Phe Ala Leu Thr Arg His Ile Val Gly Thr

500 505 510

Gln Gly Tyr Met Ala Pro Glu Tyr Leu Glu Asn Gly Leu Val Ser Pro

515 520 525

Lys Leu Asp Val Tyr Ala Leu Gly Val Leu Leu Leu Glu Ile Leu Thr

530 535 540

Gly Lys Glu Val Ser Ala Leu Tyr Glu Gly Ser Asn Thr Asn Leu Ala

545 550 555 560

Glu Leu Leu Ile Pro Val Leu Asn Asp Asp Asn Ala Lys Glu Ser Leu

565 570 575

Ser Asn Phe Val Asp Pro Ser Leu Gln Gly Lys Tyr Pro Val Glu Leu

580 585 590

Ala Phe Ala Met Val Arg Leu Ile Asp Asn Cys Leu Met Lys Asp Pro

595 600 605

Ser His Arg Pro Asn Thr Asp Glu Ile Val Gln Ser Val Ser Arg Ile

610 615 620

Met Thr Ala Thr His Ser Trp Glu Thr Ser Phe Ser Thr Ser Val Ser

625 630 635 640

Pro His Arg Leu Pro

645

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta catgaattat tctcatctca tct 53

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggaccact ttgtacaaga aagctggtcg ggcaatctat gtggtgaca 49

Claims

1.过表达SlLYK4基因在增强番茄真菌性病害抗性中的应用，其特征在于，所述SlLYK4基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述真菌性病害为灰霉菌病害。

2. 过表达SlLYK4基因编码的蛋白质在增强番茄真菌性病害抗性中的应用，其特征在于，所述SlLYK4基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述真菌性病害为灰霉菌病害。

3. 一种增强番茄作物对真菌性病害抗性的方法，其特征在于，在番茄作物中过表达SlLYK4基因，所述SlLYK4基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述真菌性病害为灰霉菌病害。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建过表达SlLYK4基因的载体；

（2）构建含步骤（1）所述用于过表达SlLYK4基因的载体的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）基因工程菌；

（3）将步骤（2）所述农杆菌基因工程菌转化到番茄组织中，筛选培养获得转基因植株。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述用于过表达SlLYK4基因的载体为pDONR载体。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，构建过表达SlLYK4基因的载体时，转录起始密码子前使用35S启动子；转录终止后加上GFP表达标签。

7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）基因工程菌为农杆菌GV3101菌株。