CN114262711B

CN114262711B - 番茄SlRIPK基因在增强番茄抗病性中的应用

Info

Publication number: CN114262711B
Application number: CN202210055375.2A
Authority: CN
Inventors: 王冉; 梁岩
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-01-18
Filing date: 2022-01-18
Publication date: 2022-11-29
Anticipated expiration: 2042-01-18
Also published as: CN114262711A

Abstract

本发明公开了番茄SlRIPK基因在增强番茄抗病性中的应用。本发明研究发现番茄SlRIPK基因过表达能够增强番茄抗病性，能够用于培育具有抗病能力的番茄新品种。本发明研究发现番茄SlRIPK基因过表达能够增强番茄抗病性，特别是对于真菌灰葡萄孢菌侵染引起的灰霉病和细菌胡萝卜软腐果胶杆菌侵染引起的软腐病均具有很好的抑制作用，能够用于培育具有抗病能力的番茄新品种。

Description

番茄SlRIPK基因在增强番茄抗病性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及番茄SlRIPK基因在增强番茄抗病性中的应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)是茄科茄属番茄亚属的多年生草本植物，属于全世界广泛栽培的蔬菜之一，是极其重要的经济作物。但在其栽培过程中，常有多种病害发生，严重制约番茄产量和品质。据调查在我国为害番茄的病害有40多种，其中，危害日趋严重、面积日趋扩大、且造成明显减产的病害有十多种，目前这些病害已成为番茄高产稳产的一大障碍。造成番茄产量损失的主要真菌性病害是番茄灰霉病，病原是盘菌亚门的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，是一种死体营养型病原真菌，可侵染番茄茎、叶、花以及果实组织，发病严重时，产量损失高达50％。番茄主要细菌性病害是软腐病，病原是胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)，是一种死体营养型病原细菌，主要为害番茄的茎、叶和果实，发病不限于田间，运输途中和贮藏期间为害更为严重。

实践证明，培育抗病品种是防治病害的一项经济有效的措施。由于自然界中植物同时面临不同病害的侵染，因此，农业生产中亟需培育可抵抗不同病害的广谱抗病品种。我国开展番茄抗病育种研究至今已二十多年，针对不同的病害，已培育推广了一系列抗病品种，但仍然缺少针对多种病害的番茄广谱抗病品种。因此，在植物抗病理论成果指导之下，积极利用广谱抗病基因进行育种改良，培育作物广谱抗病新品种是防控病害保证番茄品质的有效方法，并且具有重要的经济价值。

植物通过多层次的免疫系统抵抗病原菌的入侵，而活性氧迸发在多层次免疫系统中都起着重要的作用，它不仅可以直接抑制病原菌生长，还可以通过加固细胞壁限制病原菌入侵，也可以作为信号分子诱导气孔关闭和系统获得抗性等其它免疫反应。植物抗病过程中活性氧迸发主要是由呼吸爆发氧化物同系酶RBOH产生(Kadota Y,et al.,.Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during plant immunity.Plant CellPhysiol,56,1472-1480(2015).)。一些植物胞内受体激酶通过磷酸化RBOH蛋白，从而调控多层免疫系统活性氧迸发(Li P,et al.The receptor-like cytoplasmic kinase RIPKregulates broad-spectrum ROS signaling in multiple layers of plant immunesystem.Mol Plant,14,1652-1667(2021).)。

发明内容

本发明研究发现番茄SlRIPK基因过表达能够增强番茄抗病性，能够用于培育具有抗病能力的番茄新品种。

番茄SlRIPK基因在增强番茄抗病性中的应用。优选的，番茄抗病性对应的病害为灰霉病或软腐病。其中，番茄SlRIPK基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明又提供了一种番茄育种方法，在番茄作物中过表达番茄SlRIPK基因。

优选的，所述的番茄育种方法，包括以下步骤：

(1)构建过表达番茄SlRIPK基因的载体；

(2)构建包含步骤(1)所述载体的农杆菌基因工程菌；

(3)将步骤(2)所述农杆菌基因工程菌转化到番茄组织中，筛选培养获得过表达番茄SlRIPK基因的转基因植株。

其中，番茄SlRIPK基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤(1)中克隆番茄SlRIPK基因的中间载体为pDONR/Zeo，过表达番茄SlRIPK基因的终载体为pGWB5(Gateway binary vector 5)。

步骤(1)中构建过表达番茄SlRIPK基因的载体时，使用35S启动子；番茄SlRIPK基因的转录终止端连接有GFP蛋白的编码基因，从而GFP蛋白与番茄SlRIPK蛋白融合表达。

步骤(2)中农杆菌基因工程菌构建使用的农杆菌为农杆菌GV3101菌株。

本发明研究发现番茄SlRIPK基因过表达能够增强番茄抗病性，特别是对于真菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起的灰霉病和细菌胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)侵染引起的软腐病均具有很好的抑制作用，能够用于培育具有抗病能力的番茄新品种。

附图说明

图1为番茄SlRIPK基因cDNA扩增PCR电泳图。

图2为融合GFP表达标签的番茄SlRIPK基因表达载体图。

图3为35S::GFP空载体转化野生型番茄后，GFP荧光蛋白的Western Blotting结果图。

图4为SlRIPK基因连接GFP报告基因的表达载体转化野生型番茄后，GFP荧光蛋白的Western Blotting结果图。

图5为35S::GFP和35S::SlRIPK-GFP转基因番茄接种灰葡萄孢菌2天后表现的发病症状图。

图6为35S::GFP和35S::SlRIPK-GFP转基因番茄接种灰葡萄孢菌2天后病斑直径的统计结果图，其中“**”表示P＜0.01，其中“***”表示P＜0.001。

图7为35S::GFP和35S::SlRIPK-GFP转基因番茄接种胡萝卜软腐果胶杆菌(LMG2404-LUX，luxCDABE标记的发光细菌)1天后表现的发病症状图。

图8为35S::GFP和35S::SlRIPK-GFP转基因番茄接种胡萝卜软腐果胶杆菌(LMG2404-LUX)1天后发光强度的统计结果图，其中“**”表示P＜0.01。

具体实施方式

实施例1

扩增番茄中SlRIPK基因的全长。

在“https://solgenomics.net/search/locus”网站中搜索，获得SlRIPK基因的序列(SlRIPK基因搜索号为Solyc07g041940)，蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。参考Gateway手册，设计正向引物：5’>ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctacatgaagattggatgggaatc>3’和反向引物5’>ggggaccactttgtacaagaaagctggtcggatctcttgaaaccatttt>3’。提取番茄叶片的RNA，通过反转录得到cDNA，用TOYOBO公司KOD高保真酶的方法将该基因全长扩增出来，SlRIPK基因的cDNA扩增PCR电泳图见图1。

PCR反应体系如下表1所示。

表1 PCR反应体系

反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共28个循环；最后68℃延伸10min。

实施例2

SlRIPK基因组成型高表达(35S启动子)载体的构建。

将全长基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)与载体pDONR/Zeo进行BP重组反应，将连接产物通过热激方法转化进大肠杆菌DH5a菌株，挑选阳性菌落加入到4mL含100mg/LZeocin抗性的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床中培养10-12小时。小量提取质粒，酶切和PCR鉴定正确后，送TSINGKE Biological Technology公司进行序列测定。将测序正确的质粒与pGWB5空载进行LR反应，将连接产物通过热激方法转化进大肠杆菌DH5a菌株，挑选阳性菌落加入到4mL含100mg/L抗性的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床中培养10-12小时。小量提取质粒，酶切和PCR鉴定正确后，完成35S::SlRIPK-GFP载体构建(图2)。

实施例3

将35S::SlRIPK-GFP表达载体转化番茄愈伤组织。

将成功构建的35S::SlRIPK-GFP载体通过电激方法转化进农杆菌GV1301菌株，挑选阳性菌落加入到4mL含100mg/L Kan(卡那霉素)和Rif(利福平)抗性的LB液体培养基中，在28℃，200rpm的摇床中培养10-12小时。将菌液送到百格基因科技(江苏)有限公司使用番茄组织培养的方法将基因转入到番茄愈伤组织中，再进行潮霉素抗性愈伤组织的筛选、诱导发芽及诱导生根等步骤产生T₀代转基因植株。

实施例4

转化后转基因番茄鉴定。

T₀代转基因植株自交产生后代，通过提取植物叶片总蛋白进行Western Blotting检测。将植物叶片用研磨仪磨碎，加入蛋白提取缓冲液[50mM Tris-HCl pH7.5，150mMNaCl，2％TritonX-100，1×PMSF(苯甲基磺酰氟)或蛋白酶抑制剂]，PMSF和蛋白酶抑制剂现用现加。蛋白提取液与植物组织充分混匀，冰上放置30分钟，4℃12 000g离心10分钟，取上清，重复三次，获得总蛋白。加入5×蛋白上样缓冲液，沸水煮10分钟，离心后用于SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳分离胶采用浓度10％的均一胶，浓缩胶浓度为5％；其中，浓缩胶部分采用80V电压，分离胶部分采用100V电压。

电泳完毕后切去浓缩胶等多余部分，标记上样顺序。之后剪取与电泳凝胶大小一致的PVDF膜，用甲醇浸润活化，按海绵垫、滤纸、胶、膜、滤纸及海绵垫的顺序从负极向正极放置在电转仪上，并注意膜与胶、膜与滤纸和滤纸与胶之间不能存在气泡。装好电转装置后，转膜槽中加满转膜液，在冰浴条件下200mA转膜2小时。

电转完成后将PVDF膜取出，用3％BSA于室温封闭2小时，弃去封闭液，加入TBST清洗3遍，每次10分钟。

当膜封闭好之后，按1:3000(v/v)稀释倍数加入GFP-HRP的抗体。4℃结合过夜。第二天用TBST清洗3遍，每次10分钟。

以1:1体积比例混合显色溶液A和B后加到膜上，在凝胶成像仪上拍照。SlRIPK蛋白大小预测为48.78kD，GFP蛋白大小为26kD(图3)，因此，在目的大小74kD处出现特异条带(图4)，说明该基因已表达。

实施例5

灰葡萄孢菌侵染番茄离体叶片。

(1)灰葡萄孢菌的培养

将灰葡萄孢菌接种到固体CM培养基上。接种的CM培养基平板平置于25℃黑暗条件下培养7天即可用于后续实验。此时黑色菌丝达到培养皿边缘。

(2)灰葡萄孢菌侵染番茄离体叶片

使用前将培养基里的孢子用悬浮培养液(4％麦芽糖和1％蛋白胨)悬浮后经四层纱布过滤后，在显微镜下用血球计数板定量孢子浓度，番茄离体叶片需孢子悬浮液浓度为每毫升1×10⁵个孢子(即血球计数板中间所有小方格孢子总数为10)。

准备好接种用的较大容器，在该容器内铺6张纸巾(常用嫦娥奔月方巾纸，已灭菌)，然后在嫦娥奔月纸上面铺两层纱布，倒入无菌水使纸和纱布浸湿，将多余的水倒掉至没有水流出为止。然后剪取4周龄的番茄叶片(保持叶片大小以及叶位一致)，将番茄35S::GFP对照的两个株系(#34和#42)以及35S::SlRIPK-GFP两个株系(#6和#12)的转基因植株各选取3株，每株3片叶片，将番茄叶片置于湿润纱布上，用浸湿的棉花覆在叶柄保持植物可以正常吸水(番茄叶片基本呈隆起状态，自然铺放叶片，避免叶背面贴到有水纱布上)。之后将孢子悬浮液接种到叶片非主脉区，每个叶片接种四个点，每个点2.5μL。接种完后覆膜保湿，将装有叶片的容器置于22℃恒温(此时光照不需太强)环境下，接种2-3天观察发病情况并进行统计。

首先用肉眼观察到35S::SlRIPK-GFP两个株系的番茄叶片上发病较轻(图5)。统计每片叶片上四个病斑的直径，可以判断35S::SlRIPK-GFP两个株系叶片上的病斑直径比对照更小(图6)，说明高表达SlRIPK基因能够抑制灰霉病在番茄上的发病。

实施例6

胡萝卜软腐果胶杆菌LMG2404-LUX菌株侵染番茄离体叶片。

1)将LMG2404-LUX菌株在含100mg/L Kan(卡那霉素)抗性的LB固体培养基上活化。

2)挑取单菌落用含100mg/L Kan(卡那霉素)抗性的LB液体培养基摇菌，注意用空白的无抗培养基做对照。

3)将摇好的菌进行转接，摇至OD₆₀₀值1—1.5为宜，取1mL的菌液在3000g离心10min，用50mM MgSO₄将菌液重悬，浓度调至OD₆₀₀＝0.6，约1×10⁹CFU/mL。

4)准备好接种用的较大容器，在该容器内铺6张纸巾(常用嫦娥奔月方巾纸，已灭菌)，然后在嫦娥奔月纸上面铺两层纱布，倒入无菌水使纸和纱布浸湿，将多余的水倒掉至没有水流出为止。然后剪取4周龄的番茄叶片(保持叶片大小以及叶位一致)，将番茄35S::GFP对照的两个株系(#34和#42)以及35S::SlRIPK-GFP两个株系(#6和#12)的转基因植株各选取3株，每株3片叶片，将番茄叶片置于湿润纱布上，用浸湿的棉花覆在叶柄保持植物可以正常吸水(番茄叶片基本呈隆起状态，自然铺放叶片，避免叶背面贴到有水纱布上)。之后用注射器针头在叶片的正面轻轻扎一个小孔，每片叶片扎两个孔，位于对角处，每个针孔滴5μl悬浮液。接种完后覆膜保湿，将装有叶片的容器置于28℃恒温环境下，接种1天观察发病情况并进行统计。

首先用单光子成像计数仪HRPCS5(购自英国Photek公司)测定荧光信号，观察到35S::SlRIPK-GFP两个株系的番茄叶片上发病较轻(图7)。统计每片叶片上2个病斑的荧光强度，可以判断35S::SlRIPK-GFP两个株系叶片上的荧光强度比对照更小(图8)，说明高表达SlRIPK基因能够抑制软腐病在番茄上的发病。

综上，可以看出SlRIPK基因对番茄抗灰霉病以及软腐病都具有重要作用。高表达SlRIPK基因能够显著提高番茄对灰葡萄孢菌以及软腐病的抗病性，是一种理想的增强植物广谱抗病性的基因，通过番茄组织培养转化的方法使该基因在番茄中高表达使番茄获得对多种病害的抗病能力，从而可以提高番茄在田间的广谱抗病性，具有重要的价值。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 番茄SlRIPK基因在增强番茄抗病性中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1305

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 1

atgaagattg gatgggaatc acttgttcct agctgtatta aatcacatga aaattcgaaa 60

aaaaatccaa aaatggtaaa agtgtccgtt acaaaacaaa tctcttttca tgggatacct 120

gtatcggatc ttagttcatc caccatatcc tcagatcttt ctatctccct tgctggttca 180

aatattcatg cctttacaca acaagaactt agagtgatca cacaaaactt ctccacgagt 240

aatttcattg gtgaaggagg gtttgggcca gttcacaaag gattcattga tgataaactt 300

agacctaatg ctattaaagc tcagcctgtt gctgttaaaa acctcgattt agatggttca 360

caaggtcata gagaatggct gacagaagtg atatttcttg gacaattgag gcatccacat 420

ctagtgaagt tgattggata ttgttgtgaa gaagataaca gattgctagt gtatgaatac 480

atgcctagag gaagcttgga gaatcaactt tttagaagat attcagtatc ccttccatgg 540

tcaacgagga tgaaaatagc cattggtgct gctaaaggtc ttgcttttct ccatgaagct 600

aaaaaacctg tcatttatcg cgatttcaag gcttcaaaca ttttgttaga ctccgattat 660

actgctaaac tctcagattt tggacttgca aaagatggtc cagaaggaga tgacacacac 720

gtctcaactc gagtcatggg aacacatggt tatgctgctc ctgaatacat catgaccggt 780

catttgactg cagctagtga tgtatacagc ttcggagtag tactattaga gcttctaacg 840

ggtagaagat ctgtagacaa aggtcgtcca catagagaac aaaacttggt agattgggca 900

agaccacaac taaaagatcc tcgaaaacta cgtagaataa tggatccaag gctcgaaggt 960

atgtactcag aagaaggagt tcaaaaggca gcattagtag cttatcaatg cctaagccac 1020

aggccaaaag ctagaccaga tatgagtaat gtggtgacaa ctttagaacc tttaaaggac 1080

tatgaagata actcaatggt aacatttgtg tacacagctc caacagatga tcaacaagtc 1140

aaacaaatta cgagtgcaag tccacatcat catcaccaaa aacaacaaca ccataatcat 1200

aagagaagaa gtactccttc gtcgccaacc attcactctg aaacaacaat acacaagaga 1260

ttaactccaa attcaccatt gcaaaatggt ttcaagagat cctag 1305

<210> 2

<211> 434

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum L.)

<400> 2

Met Lys Ile Gly Trp Glu Ser Leu Val Pro Ser Cys Ile Lys Ser His

1 5 10 15

Glu Asn Ser Lys Lys Asn Pro Lys Met Val Lys Val Ser Val Thr Lys

20 25 30

Gln Ile Ser Phe His Gly Ile Pro Val Ser Asp Leu Ser Ser Ser Thr

35 40 45

Ile Ser Ser Asp Leu Ser Ile Ser Leu Ala Gly Ser Asn Ile His Ala

50 55 60

Phe Thr Gln Gln Glu Leu Arg Val Ile Thr Gln Asn Phe Ser Thr Ser

65 70 75 80

Asn Phe Ile Gly Glu Gly Gly Phe Gly Pro Val His Lys Gly Phe Ile

85 90 95

Asp Asp Lys Leu Arg Pro Asn Ala Ile Lys Ala Gln Pro Val Ala Val

100 105 110

Lys Asn Leu Asp Leu Asp Gly Ser Gln Gly His Arg Glu Trp Leu Thr

115 120 125

Glu Val Ile Phe Leu Gly Gln Leu Arg His Pro His Leu Val Lys Leu

130 135 140

Ile Gly Tyr Cys Cys Glu Glu Asp Asn Arg Leu Leu Val Tyr Glu Tyr

145 150 155 160

Met Pro Arg Gly Ser Leu Glu Asn Gln Leu Phe Arg Arg Tyr Ser Val

165 170 175

Ser Leu Pro Trp Ser Thr Arg Met Lys Ile Ala Ile Gly Ala Ala Lys

180 185 190

Gly Leu Ala Phe Leu His Glu Ala Lys Lys Pro Val Ile Tyr Arg Asp

195 200 205

Phe Lys Ala Ser Asn Ile Leu Leu Asp Ser Asp Tyr Thr Ala Lys Leu

210 215 220

Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Asp Gly Pro Glu Gly Asp Asp Thr His

225 230 235 240

Val Ser Thr Arg Val Met Gly Thr His Gly Tyr Ala Ala Pro Glu Tyr

245 250 255

Ile Met Thr Gly His Leu Thr Ala Ala Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly

260 265 270

Val Val Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly Arg Arg Ser Val Asp Lys Gly

275 280 285

Arg Pro His Arg Glu Gln Asn Leu Val Asp Trp Ala Arg Pro Gln Leu

290 295 300

Lys Asp Pro Arg Lys Leu Arg Arg Ile Met Asp Pro Arg Leu Glu Gly

305 310 315 320

Met Tyr Ser Glu Glu Gly Val Gln Lys Ala Ala Leu Val Ala Tyr Gln

325 330 335

Cys Leu Ser His Arg Pro Lys Ala Arg Pro Asp Met Ser Asn Val Val

340 345 350

Thr Thr Leu Glu Pro Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Asn Ser Met Val Thr

355 360 365

Phe Val Tyr Thr Ala Pro Thr Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Ile Thr

370 375 380

Ser Ala Ser Pro His His His His Gln Lys Gln Gln His His Asn His

385 390 395 400

Lys Arg Arg Ser Thr Pro Ser Ser Pro Thr Ile His Ser Glu Thr Thr

405 410 415

Ile His Lys Arg Leu Thr Pro Asn Ser Pro Leu Gln Asn Gly Phe Lys

420 425 430

Arg Ser

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta catgaagatt ggatgggaat c 51

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggaccact ttgtacaaga aagctggtcg gatctcttga aaccatttt 49

Claims

1.过表达番茄SlRIPK基因在增强番茄抗病性中的应用，

番茄抗病性对应的病害为灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的番茄灰霉病或胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）引起的番茄软腐病，

番茄SlRIPK基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.一种番茄育种方法，其特征在于，在番茄作物中过表达番茄SlRIPK基因，番茄SlRIPK基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

3.根据权利要求2所述的番茄育种方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建过表达番茄SlRIPK基因的载体；

（2）构建包含步骤（1）所述载体的农杆菌基因工程菌；

（3）将步骤（2）所述农杆菌基因工程菌转化到番茄组织中，筛选培养获得过表达番茄SlRIPK基因的转基因植株。

4.根据权利要求3所述的番茄育种方法，其特征在于，步骤（1）中过表达番茄SlRIPK基因的终载体为pGWB5。

5.根据权利要求3所述的番茄育种方法，其特征在于，步骤（1）中构建过表达番茄SlRIPK基因的载体时，使用35S启动子；番茄SlRIPK基因的转录终止端连接有GFP蛋白的编码基因，从而GFP蛋白与番茄SlRIPK蛋白融合表达。

6.根据权利要求3所述的番茄育种方法，其特征在于，步骤（2）中农杆菌基因工程菌构建使用的农杆菌为农杆菌GV3101菌株。