CN103266118A - 一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因及其应用涉及植物基因工程技术领域。当所述基因在植物中表达时，其赋予植物对磺酰脲(SU)类除草剂的抗性，本发明以甘蓝型油菜抗SU类除草剂突变体M342为材料，通过PCR扩增，获得突变体M342中的抗性基因，序列为SEQIDNO.1；该抗性基因翻译获得蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNo.2。利用构建的植物表达载体将该基因导入对SU类除草剂无抗性的植物中，可提高转基因植物对SU类除草剂的抗性。

Description

一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因及其应用

 

技术领域

    本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地，涉及甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因及其应用。更具体地，涉及甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因核酸序列的分离、载体构建、培育具有磺酰脲类除草剂抗性植物的方法。

背景技术

作物生产过程中一类重要的生物危害是农田杂草，其不但与作物争水争肥争光，而且改变作物田间小气候，甚至有些杂草还是作物病虫害的中间寄主，加快病虫害的蔓延，严重影响了作物产量和品质。然而，人工除草又费时、费力，增加生产成本。因此，应用除草剂防治田间杂草成为人们的必然选择。

磺酰脲(SU)类除草剂是目前全球主流的除草剂品种之一。其具有许多优越的性能：（1）高效低量。磺酰脲类除草剂的活性极高，用量特别低，每公顷的施用量只需几克到几十克，因而被称为超高效除草剂；（2）杀草谱广，此类除草剂能有效地防除阔叶杂草。其中有些除草剂对禾本科杂草也有很好的除草效果；（3）土壤残留期短，基本不会影响后茬作物生长；（4）对哺乳动物毒性低，人及牲畜十分安全。研究发现，磺酰脲类除草剂的作用靶标为植物体内的乙酰乳酸合成酶（ALS）。除草剂通过与ALS形成复合物阻断底物进入酶活性位点通路，抑制支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成，导致底物α-丁酮的积累，破坏蛋白质的合成，最终导致杂草死亡（Jennifer et al.，PNAS, 2006, 103: 569-573）。目前，以ALS为靶酶开发的除草剂还包括咪唑啉酮类（IMI）、三唑嘧啶磺酰胺类（TZ）、嘧啶水杨酸类（POB）和磺酰氨羧基三唑啉酮类（SCT），这类除草剂统称为ALS抑制剂类除草剂或ALS类除草剂。通过对种子、花粉和小孢子诱变等手段，已相继获得了玉米、水稻、小麦等对ALS类除草剂具有抗性的突变体。从这些抗性突变体中，研究人员克隆到一些对ALS类除草剂具有抗性的基因（Tan S, et al., Pest Manag Sci, 2005, 61: 246-257）。在油菜中，也有2例报道从抗性突变体中获得对ALS类除草剂中的IMI类除草剂具有抗性的基因（Swanson E B, et al., Theor Appl Genet, 1989, 78: 525-530；胡茂龙等，中国农业科学，2012,45(20):4326-4334）。但是，与SU类除草剂相比，IMI类除草剂为长残留性除草剂，具有土壤残留期长和后茬敏感作物的安全性问题。此类除草剂为弱酸性特性，在土壤中既有中性态，又有阴离子态，其残留期是典型的pH依赖型。因土壤pH值不同，其吸附、淋溶、分解及残留差异较大。在高pH土壤中，阴离子态比例较大，降解迅速，随着土壤pH降低，中性态增多，被吸附量相应增加，降解缓慢，残留期延长。由于上述原因该类除草剂仅能在一熟制地区使用，是我国东北大豆产区的大豆专用除草剂，在长江流域多熟制冬油菜区未能登记发放。因此，以IMI类除草剂抗性基因转育的抗性油菜品种，均不能在我国长江流域多熟制冬油菜区推广应用。

然而，长江流域冬油菜区历来是我国油菜生产的主要区域，在我国油菜生产中处于主导地位。虽然我们在国内首次报道了油菜抗IMI类除草剂基因BnALS1R（胡茂龙等，中国农业科学，2012，45（20）：4326-4334），但由于IMI类除草剂的残留期较长和后茬敏感作物的安全性问题，限制了抗性基因应用于我国油菜主产区的品种改良。另外，国内其它类型的油菜抗除草剂基因基本都来自国外，受国际知识产权保护。因此，创制新型除草剂抗性基因对我国油菜抗除草剂品种选育具有十分重要意义。然而，在本发明申请之前，国内还没有公开或发表过甘蓝型油菜抗SU类除草剂基因及其应用。

发明内容

技术问题

本发明旨在弥补已有专利或技术的不足，以获得的甘蓝型油菜抗SU类除草剂突变体M342为材料，提供一种甘蓝型油菜抗SU类除草剂基因的核酸序列及其应用。

技术方案   本发明通过以下方案实现：

一种甘蓝型油菜抗SU类除草剂基因，其特征是：（1）该基因序列为SEQ ID NO.1，由1983个碱基组成，命名为BnALS3R基因，即抗SU类除草剂基因，编码甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶III。（2）与其它来源的油菜乙酰乳酸合成酶III的核酸序列相比，BnALS3R基因包含1处突变：G1988T。

上述的基因核酸序列编码的蛋白质，其特征在于：该序列为SEQ ID NO.2，由652个氨基酸残基组成，编码蛋白序列第557或等同位置处的氨基酸残基为亮氨酸。

所述的基因用于培育抗除草剂植物的方法，是利用植物表达载体将权利要求1所述的甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R导入到植物细胞或组织，获得除草剂抗性的转基因植物。所述植物为拟南芥、油菜。

有益效果

本发明的甘蓝型油菜抗SU类除草剂基因BnALS3R，可以应用转基因的方法将该基因导入其它对抗SU类除草剂无抗性的植物，提高导入目标植物对SU类除草剂的耐受性。所述目标植物为拟南芥、油菜。

本发明的甘蓝型油菜抗SU类除草剂基因BnALS3R的应用研究包括，但不限于，应用植物常规育种方法将该基因导入其它对SU类除草剂无抗性的目标植物，提高导入目标植物对SU类除草剂的耐受性。根据本发明发现的序列特征，设计分子标记，检测甘蓝型油菜抗性基因BnALS3R的存在。 

与现有技术相比，本发明具有下列优点和效果：

1）本发明是在我国油菜中首次发现的甘蓝型油菜抗SU类除草剂基因。

2）利用本发明的甘蓝型油菜抗SU类除草剂基因的核酸序列，可以提高其它对SU类除草剂无抗性的植物对SU类除草剂的耐受性。

3）由于SU类除草剂土壤残留期短，基本不会影响后茬作物生长。因此，利用本发明的SU类除草剂抗性基因BnALS3R选育的油菜新品种，均能在我国油菜生产的主产区长江流域多熟制冬油菜区推广应用。

附图说明

图1 抗性突变体M342（右）和野生型N131（左）对SU类除草剂苯磺隆的抗性表现

图2与不同来源的油菜乙酰乳酸合成酶III基因氨基酸序列比较图

Z11526，Genbank下载序列（登录号：Z11526）；

BnALS3-N131，野生型N131的ALSIII基因氨基酸部分序列；

BnALS3R-M342，油菜抗SU类除草剂突变体M342的ALSIII基因氨基酸部分序列；

星号示突变氨基酸。

图3 转EH-pCB-BnALS3R拟南芥植株PCR分子鉴定结果

M，DNA分子量标准，片段从小到大一次为200bp、500bp、800bp、1200bp、2000bp、3000bp、4500bp； 1，M342；2，野生型拟南芥植株；3-10，转EH-pCB-BnALS3R拟南芥植株。

图4 转EH-pCB-BnALS3R拟南芥植株除草剂鉴定结果

左，未喷施苯磺隆的野生型拟南芥植株；

中，喷施苯磺隆的野生型拟南芥植株；

右，喷施苯磺隆的转基因植株。

具体实施方式

下列实施中所有方法如无特别说明均为常规方法。

（一）甘蓝型油菜抗SU类除草剂基因BnALS3R的获得

需要说明的是，利用EMS诱变和定向选育技术，我们获得了甘蓝型油菜抗SU类除草剂突变体M342（见浦惠明等，专利申请号201310054645.9）。在苯磺隆除草剂杂草防治的推荐使用浓度下，抗性突变体M342喷药后无任何药害症状，仍能正常生长（图1）。在对拟南芥、烟草、向日葵等抗性突变体的ALS基因克隆发现，ALS基因突变造成氨基酸残基位点变异，导致除草剂与ALS蛋白结合方式的改变，从而使相应植物产生对SU类除草剂抗性（Tan S, et al., Pest Manag Sci, 2005, 61: 246-257）。甘蓝型油菜为异源四倍体，基因组内共存在3个具有功能的ALS（ALSI、ALSII、ALSIII）基因（Rutledge R G, et al., Mol Gen Genet, 1991, 229: 31-40）。因此，首先要克隆突变体M342与野生型N131（公知公用，见浦惠明等，江苏农业学报，2010，26(6)：1432-1434））中的3个ALS基因，明确突变体中具体是哪个ALS基因发生的何种突变。

为此，根据NCBI上登录的3个甘蓝型油菜ALS基因BnALS1—BnALS3序列（登录号Z11524、Z11525、Z11526），分别设计3对PCR引物。BnALS1引物1：GTGGATCTAACTGTTCTTGA和引物2：AGAGATGAAGCTGGTGATC。BnALS2引物1：GAGTGTTGCGAGAAATTGCTT和引物2：TTGATTATTCTATGCTCTCTTCTG。BnALS3引物1： ATGGTTAGATGAGAGAGAGAGAG和引物2：ATGGTAAAAGACTTAGTTTCAGT。采用CTAB法提取叶片基因组DNA（胡茂龙等，中国油料作物学报, 2011, 33(4): 331-337），PCR克隆野生型与突变体BnALS1—BnALS3。按东洋纺（上海）生物科技有限公司高保真性DNA聚合酶KOD-Plus试剂盒说明书配制50μL PCR反应体系。在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行扩增，反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，共35个循环。产物经平末端加A后，在1.2%（V/W）琼脂糖凝胶电泳分离后，用北京Tiangen公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（目录号：DP209）纯化回收，连接于克隆载体pEASY-T1（购自北京TransGen生物技术有限公司），热激转化DH5α。通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定，将阳性克隆送于南京金斯瑞生物有限公司测序。

测序结果表明，突变体M342中BnALS1和 BnALS2未发生任何碱基突变，但BnALS3基因发生1处单碱基突变：G1988T，导致蛋白序列第557色氨基变为亮氨酸（图2）。将突变体M342中基因命名为BnALS3R，即抗SU类除草剂基因，其序列为SEQ ID NO.1，由1983个碱基组成，编码甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶III。BnALS3R具有编码序列表SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

（二）抗性基因BnALS3R的功能验证

1表达载体构建

根据BnALS3序列（登录号Z11526）设计引物，BnALS3引物3：5'CGCGGTACCCTCTCTCTCTCTCATCTAACCAT3'(下划线序列为KpnI 酶识别位点)和BnALS3引物4:5'CGCACTAGTCTCTCAGTACTTAGTGCGACC3'; (下划线序列为SpeI 酶识别位点)。以突变体M342的基因组DNA 为模版有上述引物3和4， PCR 扩增获得目的基因BnALS3R。PCR产物按上述 方法经回收、克隆、测序，获得带有抗性基因BnALS3R的重组T载体，命名为pE-BnALS3R。

用KpnI和SpeI双酶切pE-BnALS3R，获得含BnALS3R基因的片段回收、连接到经KpnI和SpeI双酶切处理的pCAMBIA1390 载体上(澳大利亚CAMBI公司) ，得到重组的植物表达载体，构建好的重组载体转化DHα，提取质粒用于酶切和测序检测，将检测表明正确的含有BnALS3R基因的重组载体命名为pCB-BnALS3R，用电击法将经过酶切和测序检测过的pCB-BnALS3R转化农杆菌EH105α菌株，得到重组菌株，提取质粒进行PCR 和酶切鉴定，获得带有抗性基因BnALS3R的植物表达载体重组菌株EH-pCB-BnALS3R。

2转基因植物的分子鉴定和BnALS3R的功能验证

培养获得的重组菌株EH-pCB-BnALS3R，利用农杆菌侵染花序法(flower dipping)转化拟南芥。T0代中在培养基上经抗生素筛选后，获得T1代植株移栽到盆钵中，置于人工培养箱中生长。待植株生长到3叶一心时，用SU类除草剂苯磺隆喷药处理。处理前取叶片提取DNA，用BnALS3引物1： ATGGTTAGATGAGAGAGAGAGAG和引物2：ATGGTAAAAGACTTAGTTTCAGT 为引物，PCR分子检测转基因植株。

PCR反应体系包括: DNA模板2.0μL（10 ng/μL），引物的各2. 0 μL（10 μmol /L），10×酶反应缓冲液2μL，MgC1₂(25mmol/ L)1.2μL，dNTP(2.5 mmol/ L )1.6μL，Taq酶(5 U/L)0.1μL，加水至20uL；PCR反应程序为94^oC预变性5 min，94^oC变性30 s，60^oC退火30 s，72^oC延伸2 min，共35个循环；然后72 ^oC 延伸5min，12^oC 冷却10min 后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。扩增产物在质量比浓度为1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察。

结果表明，获得8株PCR检测阳性的植株，如图3所示。这8株转EH-pCB-BnALS3R的植株除草剂鉴定结果表明，喷药后均能正常生长，而非转基因拟南芥植株全部枯死（图4）。由此，获得了具有SU类除草剂抗性的转基因拟南芥，验证了突变体M342中的抗性基因BnALS3R具有抗SU类除草剂的功能。

SEQ ID NO.1

CTCTCTCTCTCTCATCTAACCATGGCGGCGGCAACATCGTCTTCTCCGATCTCCTTAACCGCTAAACCTTCTTCCAAATC

CCCTCTACCCATTTCCAGATTCTCCCTTCCCTTCTCCTTAACCCCACAGAAACCCTCCTCCCGTCTCCACCGTCCACTCG

CCATCTCCGCCGTTCTCAACTCACCCGTCAATGTCGCACCTGAAAAAACCGACAAGATCAAGACTTTCATCTCCCGCTAC

GCTCCCGACGAGCCCCGCAAGGGTGCTGATATCCTCGTGGAAGCCCTCGAGCGTCAAGGCGTCGAAACCGTCTTCGCTTA

TCCCGGAGGTGCCTCCATGGAGATCCACCAAGCCTTGACTCGCTCCTCCACCATCCGTAACGTCCTCCCCCGTCACGAAC

AAGGAGGAGTCTTCGCCGCCGAGGGTTACGCTCGTTCCTCCGGCAAACCGGGAATCTGCATAGCCACTTCGGGTCCCGGA

GCTACCAACCTCGTCAGCGGGTTAGCCGACGCGATGCTTGACAGTGTTCCTCTCGTCGCCATCACAGGACAGGTCCCTCG

CCGGATGATCGGTACTGACGCGTTCCAAGAGACGCCAATCGTTGAGGTAACGAGGTCTATTACGAAACATAACTATCTGG

TGATGGATGTTGATGACATACCTAGGATCGTTCAAGAAGCATTCTTTCTAGCTACTTCCGGTAGACCCGGACCGGTTTTG

GTTGATGTTCCTAAGGATATTCAGCAGCAGCTTGCGATTCCTAACTGGGATCAACCTATGCGCTTGCCTGGCTACATGTC

TAGGCTGCCTCAGCCACCGGAAGTTTCTCAGTTAGGCCAGATCGTTAGGTTGATCTCGGAGTCTAAGAGGCCTGTTTTGT

ACGTTGGTGGTGGAAGCTTGAACTCGAGTGAAGAACTGGGGAGATTTGTCGAGCTTACTGGGATCCCTGTTGCGAGTACG

TTGATGGGGCTTGGCTCTTATCCTTGTAACGATGAGTTGTCCCTGCAGATGCTTGGCATGCACGGGACTGTGTATGCTAA

CTACGCTGTGGAGCATAGTGATTTGTTGCTGGCGTTTGGTGTTAGGTTTGATGACCGTGTCACGGGAAAGCTCGAGGCGT

TTGCGAGCAGGGCTAAGATTGTGCACATAGACATTGATTCTGCTGAGATTGGGAAGAATAAGACACCTCACGTGTCTGTG

TGTGGTGATGTAAAGCTGGCTTTGCAAGGGATGAACAAGGTTCTTGAGAACCGGGCGGAGGAGCTCAAGCTTGATTTCGG

TGTTTGGAGGAGTGAGTTGAGCGAGCAGAAACAGAAGTTCCCGTTGAGCTTCAAAACGTTTGGAGAAGCCATTCCTCCGC

AGTACGCGATTCAGGTCCTAGACGAGCTAACCCAAGGGAAGGCAATTATCAGTACTGGTGTTGGACAGCATCAGATGTGG

GCGGCGCAGTTTTACAAGTACAGGAAGCCGAGGCAGTGGCTGTCGTCCTCAGGACTCGGAGCTATGGGTTTCGGACTTCC

TGCTGCGATTGGAGCGTCTGTGGCGAACCCTGATGCGATTGTTGTGGACATTGACGGTGATGGAAGCTTCATAATGAACG

TTCAAGAGCTGGCCACAATCCGTGTAGAGAATCTTCCTGTGAAGATACTCTTGTTAAACAACCAGCATCTTGGGATGGTC

ATGCAATTGGAAGATCGGTTCTACAAAGCTAACAGAGCTCACACTTATCTCGGGGACCCGGCAAGGGAGAACGAGATCTT

CCCTAACATGCTGCAGTTTGCAGGAGCTTGCGGGATTCCAGCTGCGAGAGTGACGAAGAAAGAAGAACTCCGAGAAGCTA

TTCAGACAATGCTGGATACACCTGGACCGTACCTGTTGGATGTCATCTGTCCGCACCAAGAACATGTGTTACCGATGATC

CCAAGTGGTGGCACTTTCAAAGATGTAATAACCGAAGGGGATGGTCGCACTAAGTACTGAGAG

SEQ ID NO.2

MAAATSSSPISLTAKPSSKSPLPISRFSLPFSLTPQKPSSRLHRPLAISAVLNSPVNVAPEKTDKIKTFISRYAPDEPRKGADILVEALERQGVETVFAYPGGASMEIHQALTRSSTIRNVLPRHEQGGVFAAEGYARSSGKPGICIATSGPGATNLVSGLADAMLDSVPLVAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVMDVDDIPRIVQEAFFLATSGRPGPVLVDVPKDIQQQLAIPNWDQPMRLPGYMSRLPQPPEVSQLGQIVRLISESKRPVLYVGGGSLNSSEELGRFVELTGIPVASTLMGLGSYPCNDELSLQMLGMHGTVYANYAVEHSDLLLAFGVRFDDRVTGKLEAFASRAKIVHIDIDSAEIGKNKTPHVSVCGDVKLALQGMNKVLENRAEELKLDFGVWRSELSEQKQKFPLSFKTFGEAIPPQYAIQVLDELTQGKAIISTGVGQHQMWAAQFYKYRKPRQWLSSSGLGAMGFGLPAAIGASVANPDAIVVDIDGDGSFIMNVQELATIRVENLPVKILLLNNQHLGMVMQLEDRFYKANRAHTYLGDPARENEIFPNMLQFAGACGIPAARVTKKEELREAIQTMLDTPGPYLLDVICPHQEHVLPMIPSGGTFKDVITEGDGRTKY

SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  江苏省农业科学院

 

 

<120>  一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因及其应用

 

 

<130>  0

 

 

<160>  4    

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  1983

<212>  DNA

<213>  甘蓝型油菜抗SU类除草剂突变体M342

 

 

<220>

<221>  BnALS3R基因

<222>  (1)..(1983)

<223> 

 

 

 

<400>  1

ctctctctct ctcatctaac catggcggcg gcaacatcgt cttctccgat ctccttaacc     60

 

gctaaacctt cttccaaatc ccctctaccc atttccagat tctcccttcc cttctcctta    120

 

accccacaga aaccctcctc ccgtctccac cgtccactcg ccatctccgc cgttctcaac    180

 

tcacccgtca atgtcgcacc tgaaaaaacc gacaagatca agactttcat ctcccgctac    240

 

gctcccgacg agccccgcaa gggtgctgat atcctcgtgg aagccctcga gcgtcaaggc    300

 

gtcgaaaccg tcttcgctta tcccggaggt gcctccatgg agatccacca agccttgact    360

 

cgctcctcca ccatccgtaa cgtcctcccc cgtcacgaac aaggaggagt cttcgccgcc    420

 

gagggttacg ctcgttcctc cggcaaaccg ggaatctgca tagccacttc gggtcccgga    480

 

gctaccaacc tcgtcagcgg gttagccgac gcgatgcttg acagtgttcc tctcgtcgcc    540

 

atcacaggac aggtccctcg ccggatgatc ggtactgacg cgttccaaga gacgccaatc    600

 

gttgaggtaa cgaggtctat tacgaaacat aactatctgg tgatggatgt tgatgacata    660

 

cctaggatcg ttcaagaagc attctttcta gctacttccg gtagacccgg accggttttg    720

 

gttgatgttc ctaaggatat tcagcagcag cttgcgattc ctaactggga tcaacctatg    780

 

cgcttgcctg gctacatgtc taggctgcct cagccaccgg aagtttctca gttaggccag    840

 

atcgttaggt tgatctcgga gtctaagagg cctgttttgt acgttggtgg tggaagcttg    900

 

aactcgagtg aagaactggg gagatttgtc gagcttactg ggatccctgt tgcgagtacg    960

 

ttgatggggc ttggctctta tccttgtaac gatgagttgt ccctgcagat gcttggcatg   1020

 

cacgggactg tgtatgctaa ctacgctgtg gagcatagtg atttgttgct ggcgtttggt   1080

 

gttaggtttg atgaccgtgt cacgggaaag ctcgaggcgt ttgcgagcag ggctaagatt   1140

 

gtgcacatag acattgattc tgctgagatt gggaagaata agacacctca cgtgtctgtg   1200

 

tgtggtgatg taaagctggc tttgcaaggg atgaacaagg ttcttgagaa ccgggcggag   1260

 

gagctcaagc ttgatttcgg tgtttggagg agtgagttga gcgagcagaa acagaagttc   1320

 

ccgttgagct tcaaaacgtt tggagaagcc attcctccgc agtacgcgat tcaggtccta   1380

 

gacgagctaa cccaagggaa ggcaattatc agtactggtg ttggacagca tcagatgtgg   1440

 

gcggcgcagt tttacaagta caggaagccg aggcagtggc tgtcgtcctc aggactcgga   1500

 

gctatgggtt tcggacttcc tgctgcgatt ggagcgtctg tggcgaaccc tgatgcgatt   1560

 

gttgtggaca ttgacggtga tggaagcttc ataatgaacg ttcaagagct ggccacaatc   1620

 

cgtgtagaga atcttcctgt gaagatactc ttgttaaaca accagcatct tgggatggtc   1680

 

atgcaattgg aagatcggtt ctacaaagct aacagagctc acacttatct cggggacccg   1740

 

gcaagggaga acgagatctt ccctaacatg ctgcagtttg caggagcttg cgggattcca   1800

 

gctgcgagag tgacgaagaa agaagaactc cgagaagcta ttcagacaat gctggataca   1860

 

cctggaccgt acctgttgga tgtcatctgt ccgcaccaag aacatgtgtt accgatgatc   1920

 

ccaagtggtg gcactttcaa agatgtaata accgaagggg atggtcgcac taagtactga   1980

 

gag                                                                 1983

 

 

<210>  2

<211>  652

<212>  PRT

<213>  甘蓝型油菜抗SU类除草剂突变体M342

 

 

<220>

<221>  BnALS3R基因编码的蛋白质

<222>  (1)..(652)

<223> 

 

 

 

<400>  2

 

Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro Ile Ser Leu Thr Ala Lys Pro

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser

            20                  25                  30         

 

 

Leu Thr Pro Gln Lys Pro Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala Ile

        35                  40                  45             

 

 

Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Glu Lys Thr Asp

    50                  55                  60                 

 

 

Lys Ile Lys Thr Phe Ile Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val Glu Thr

                85                  90                  95     

 

 

Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu

            100                 105                 110        

 

 

Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly

        115                 120                 125            

 

 

Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys Pro Gly

    130                 135                 140                 

 

 

Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly

145                 150                 155                 160

 

 

Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly

                165                 170                 175    

 

 

Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro

            180                 185                 190        

 

 

Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Met

        195                 200                 205            

 

 

Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala

    210                 215                 220                

 

 

Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys Asp Ile

225                 230                 235                 240

 

 

Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met Arg Leu Pro

                245                 250                 255    

 

 

Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser Gln Leu Gly

            260                 265                 270        

 

 

Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val Leu Tyr Val

        275                 280                 285            

 

 

Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg Phe Val Glu

    290                 295                 300                

 

 

Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr

305                 310                 315                 320

 

 

Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met His Gly Thr

                325                 330                 335    

 

 

Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe

            340                 345                 350        

 

 

Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala

        355                 360                 365            

 

 

Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly

    370                 375                 380                

 

 

Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala

385                 390                 395                 400

 

 

Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu Leu Lys

                405                 410                 415    

 

 

Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln Lys Gln Lys

            420                 425                 430        

 

 

Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr

        435                 440                 445            

 

 

Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Gln Gly Lys Ala Ile Ile Ser

    450                 455                 460                

 

 

Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr Lys Tyr

465                 470                 475                 480

 

 

Arg Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly

                485                 490                 495    

 

 

Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Asp Ala

            500                 505                 510        

 

 

Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln

        515                 520                 525            

 

 

Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Leu Leu

    530                 535                 540                

 

 

Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Leu Glu Asp Arg Phe

545                 550                 555                 560

 

 

Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu

                565                 570                 575    

 

 

Asn Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Gln Phe Ala Gly Ala Cys Gly Ile

            580                 585                 590        

 

 

Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala Ile Gln

        595                 600                 605            

 

 

Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Cys Pro

    610                 615                 620                

 

 

His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Thr Phe Lys

625                 630                 635                 640

 

 

Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr

                645                 650        

 

 

<210>  3

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  BnALS3引物3

<222>  (1)..(32)

<223> 

 

 

 

<400>  3

cgcggtaccc tctctctctc tcatctaacc at                                   32

 

 

<210>  4

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  BnALS3引物4

<222>  (1)..(30)

<223> 

 

 

 

<400>  4

cgcactagtc tctcagtact tagtgcgacc                                      30

Claims (4)

1.一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因，其特征是：

（1）该基因序列为SEQ ID NO.1，由1983个碱基组成，命名为BnALS3R基因，即抗磺酰脲类除草剂基因，编码甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶III；

（2）与其它来源的油菜乙酰乳酸合成酶III的核酸序列相比，BnALS3R基因包含1处突变：G1988T。

2.权利要求1所述的基因编码的蛋白质，其特征在于：该序列为SEQ ID NO.2，由652个氨基酸残基组成，编码蛋白序列第557或等同位置处的氨基酸残基为亮氨酸。

3.权利要求1所述的基因用于培育抗除草剂植物的方法，是利用植物表达载体将权利要求1所述的甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R导入到植物细胞或组织，获得除草剂抗性的转基因植物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述植物为拟南芥、油菜。

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