CN107964543A - 水稻除草剂抗性als突变型蛋白、核酸及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种除草剂抗性ALS突变型蛋白，所述ALS突变型蛋白的氨基酸序列存在以下任意一种突变：其对应于水稻ALS第627位氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸，或，其对应于水稻ALS第627位氨基酸由丝氨酸变为半胱氨酸。本发明还公开了所述的核酸以及表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。本发明通过在田间喷施ALS抑制剂类除草剂“百垄通”的实验结果表明，分别含有本发明的两种具有除草剂抗性的ALS突变型蛋白的水稻3‑4叶幼苗在施用3.3mL百垄通/L水后，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型水稻3‑4叶幼苗在施用1mL百垄通/3L水30天后表现为整株死亡。
Description
技术领域
本发明属于植物蛋白和植物抗除草剂领域，涉及使植物具有除草剂抗性的水稻ALS 突变型蛋白、基因及其应用；具体而言，本发明涉及水稻的乙酰乳酸合成酶(ALS)突 变蛋白，该蛋白能赋予植物尤其水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂的特性。本发明 公开了该蛋白的序列，以及它们在植物抗除草剂领域中的应用。
背景技术
杂草是制约农业生产稳产高产的不利因素。与传统依靠栽培措施、人工除草和机械 除草等方法相比，化学除草剂的使用是一种高效的、简便的和经济的治理杂草方法。
目前，以乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂氯磺隆，成为杂草防治技术和除草剂发展中的一大突破。该类除草剂使农田除草剂的用量大为减少，具有生物活性高、杀草谱广、 选择性强、对哺乳动物毒性低等优点。现已开发的ALS抑制剂主要有磺酰脲类、咪唑 啉酮类、磺酰脲类、嘧啶水杨酸类三唑并嘧啶类、嘧啶硫代笨甲酸酯类等。虽然ALS 抑制剂优点突出，但该类除草剂作用位点单一，杂草极易对其产生抗药性。随着除草剂 长期、高频率和大面积使用，随之出现的杂草抗药性问题也日趋严重。
乙酰乳酸合成酶(ALS)(也称乙酰羟酸合成酶，AHAS；EC 4.1.3.18)是支链氨基 酸缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸合成途径中第一阶段的一种关键酶，它可催化两分子的丙 氨酸缩合产生CO2及α-乙酰乳酸，进一步合成缬氨酸与亮氨酸。另外，可催化一分子 丙氨酸与一分子α-丁酮酸缩合，产生CO2及α-乙酰-α-羟基丁酸，促使异亮氨酸的合成。 ALS抑制剂是通过对乙酰乳酸合成酶的抑制而阻断直链氨基酸的生物合成，影响蛋白质 的合成，进一步抑制细胞分裂，导致植物组织失绿、黄化，植株生长受到抑制，最后逐 渐死亡，从而达到化学除草的目的。另外，杂草被施用ALS抑制剂后，杂草体内2-酮 丁酸的积累干扰了杂草蛋白的合成和光合作用产物的运输，也是导致杂草死亡的一个原 因。
ALS抑制剂类除草剂具有选择性强、杀草谱广、低毒高效等特点，目前已大面积推广使用。但这些除草剂对一般不具有抗(耐)除草剂特性的农作物本身也产生药害，极 大限制了其使用时间和使用空间，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂才能避免 农作物遭受药害。培育抗(耐)除草剂作物品种可减少作物药害、拓宽除草剂的使用范 围。
目前，抗ALS抑制剂类的作物主要限于抗咪唑啉酮类和抗磺酰脲类。其中所有抗咪唑啉酮类的作物均是通过诱变与组织培养而成。在水稻中已知的抗ALS抑制剂突变位 点包括Gly 95、Ala 96、Ala 122、Trp 548、Ser 627、Ser 653和Gly 654。ALS突变体抗 除草剂水平与ALS氨基酸突变的位置有关，还与突变后的氨基酸种类及突变氨基酸的 数目有关。
目前，ALS抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难提前预测ALS蛋白其它氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并 凭借一些运气才可能发现ALS蛋白新的除草剂抗性位点。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供使植物具有除草剂抗性的ALS 突变型蛋白。
本发明还要解决的技术问题是提供了编码该ALS突变型蛋白的核酸以及表达盒、载 体和细胞等。
本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法和应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了判断植物是否采用本发明方法获得的鉴定方 法。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种控制杂草的方法以及一种用于保护植物 免受由除草剂引起的损伤的方法。
本发明最后解决的技术问题是提供了一种除草剂防护剂。
本发明人通过长期、艰苦的研究，分别对野生型水稻为籼型常规水稻种子华占进行 EMS突变植株长期、不断地筛选，发现了一系列ALS突变蛋白，包括前文所述的某些 已知ALS突变蛋白和新的ALS突变蛋白，其对ALS抑制剂类除草剂不敏感，从而使得 植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性。本发明在植物育种中的应用，可用于培育具有除 草剂抗性的植物，尤其是农作物，还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基 因如水稻等作物中的应用。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种除草剂抗性ALS突变型蛋白，所述ALS突变型蛋白的氨基酸序列存在以下任意一种突变：其对应 于水稻ALS第627位氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸，或，其对应于水稻ALS第627位氨 基酸由丝氨酸变为半胱氨酸。
一种除草剂抗性ALS突变型蛋白，包括：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示；或
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有乙酰乳酸合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
其中，本发明提供的除草剂抗性ALS突变型蛋白，其在氨基酸序列的第627位氨 基酸由丝氨酸变为亮氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2。
本发明还提供的除草剂抗性ALS突变型蛋白，其在氨基酸序列的第627位氨基酸由丝氨酸变为半胱氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
优选本发明的第一方面的蛋白带有Leu627或Cys627位点突变的突变株，除了本发明具有的实施方式所述的突变植株筛选或扩增方法之外，在蛋白质序列已知的情形下， 本领域技术人员有能力通过改变已知蛋白质的编码基因序列并将其导入载体，就可以制 备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的蛋白质，这些方法均为常规手段。在本发明的具 体实施方式中，本发明的具有除草剂抗性的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或 SEQ IDNO:4所示。该蛋白经过证实对咪唑啉酮类除草剂不敏感的乙酰乳酸合成酶。
其中，除草剂是咪唑啉酮类除草剂。优选地，所述咪唑啉酮类除草剂为百垄通。
本发明的第二方面还包括核酸或基因，其编码所述的除草剂抗性ALS突变型蛋白。
所述的核酸或基因，包括：
(a)其所述的蛋白的核苷酸序列；或
(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或
(c)其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示。
所述严格条件为：在0.1×SSC、0.1％SDS的溶液中，65℃洗膜15分钟的高度严 谨的杂交条件。
在本发明中，核酸可以是DNA、RNA，其中优选为DNA。在知晓所编码蛋白序列 或核酸序列的前提下，通过常规的密码子对应关系和宿主表达频率，运用PCR方法、 DNA重组法或人工合成的方法，本领域技术人员有能力获得并优化编码本发明第一方 面的蛋白质的核酸。一旦获得该核酸，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的 细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸。优选本发明第二 方面的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示。具体的，本发明的 DNA序列，是野生型水稻为籼型常规水稻种子华占的ALS基因序列的第1879位核苷 酸由A变成核苷酸C、第1880位核苷酸由G变成核苷酸T；或者在第1879位核苷酸由 A变为T。
此外，本发明突变前的野生型水稻为籼型常规水稻种子华占，该ALS抑制剂类除草剂敏感的野生型华占水稻ALS的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸如SEQ ID NO.6所示。
本发明第三方面内容还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的核酸或基因。
本发明第四方面内容还包括所述的蛋白，核酸、表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。
本发明第五方面内容还包括一种产生除草剂抗性ALS突变型蛋白的方法，包括以下步骤：
1)获得包含所述的核酸或基因或所述的表达盒或重组载体的转基因宿主生物的细 胞或所述的细胞；
2)在能产生除草剂抗性蛋白的条件下培养权利步骤1)所述的细胞获得除草剂抗性 蛋白。
进一步地，所述转基因宿主生物的细胞包括植物细胞、动物细胞、细菌、酵母或杆状病毒。
进一步地，所述植物为水稻、烟草、拟南芥或棉花。
本发明第六方面内容还包括获得具有除草剂抗性的植物的方法，包括如下步骤：
1)使植物包含所述的核酸或基因；或
2)使植物表达所述的蛋白。
进一步地，所述的方法包括crispr基因编辑、转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。
本发明第七方面内容还包括鉴定植物的方法，其中植物是包含所述的核酸或基因的 植物、表达所述的蛋白的植物或所述的方法获得的植物，
1)测定所述植物是否包含所述的核酸或基因；或，
2)测定所述植物是否表达所述的蛋白。
本发明第八方面内容还包括一种控制杂草的方法，包括：对种植作物的大田施用有 效剂量的除草剂，所述作物包含所述的核酸或基因或所述的达盒、重组载体或细胞，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。
本发明第九方面内容还包括一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，包 括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含所述的核酸或所述的达盒、 重组载体导入植物，导入后的植物产生除草剂抗性蛋白，所述除草剂为咪唑啉酮类除草 剂。
本发明第十方面内容还包括一种除草剂防护剂，其含有所述的ALS突变型蛋白。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)本发明首次通过实验研究得出野生型水稻为籼型常规水稻种子华占的ALS基因序列的第1879位核苷酸由A变成核苷酸C、第1880位核苷酸由G变成核苷酸T；或者 在ALS基因序列第1879位核苷酸由A变为T；该基因突变得到的突变型蛋白对除草剂 具有显著的抗性功能，特别是咪唑啉酮类除草剂。
2)本发明通过在田间喷施ALS抑制剂类除草剂“百垄通”的实验结果表明，分别含有本发明的两种具有除草剂抗性的ALS突变型蛋白的水稻3-4叶幼苗在施用3.3mL百 垄通/L水(10倍推荐使用浓度)后，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型水稻3-4 叶幼苗在施用1mL百垄通/3L水(1倍推荐使用浓度)30天后表现为整株死亡。
3)本发明的含有华占抗除草剂水稻突变体-1的ALS基因的转基因水稻ALS酶活 性比野生型的ALS酶活高4.72倍，华占抗除草剂水稻突变体-2比野生型的ALS酶活高 4.52倍。
附图说明
图1百垄通除草剂筛选获得的华占抗除草剂水稻突变体-1(627位点由丝氨酸变为亮氨酸)；
图2百垄通除草剂筛选获得的华占抗除草剂水稻突变体-2(627位点由丝氨酸变为半胱氨酸)；
图3PCR扩增ALS基因结果图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次 为5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp，第2泳道为华占野生型水稻 DNA，第3泳道为华占抗除草剂水稻突变体-1的DNA，第4泳道为华占抗除草剂水稻 突变体-2的DNA，目的片段长度2091bp；
图4百垄通除草剂对野生型和抗除草剂突变体的ALS酶活性抑制的吸光值测定；
图5抗除草剂突变体的ALS基因的过量表达载体BamHI/SacI双酶切验证图；第1 泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、 250bp、100bp；第2泳道为未经酶切的重组载体，第3泳道为重组载体经BamHI/SacI 双酶切后产生的华占抗除草剂水稻突变体-1的ALS基因片段和质粒片段DNA，第4泳 道为重组载体经BamHI/SacI双酶切后产生的华占抗除草剂水稻突变体-2的ALS基因片 段和质粒片段DNA，基因片段大小符合预期，证明载体构建成功；
图6突变型ALS基因水稻PCR检测图；总共有8个泳道，第1泳道为Marker； Marker分子量从上到下依次为5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp； 第2泳道为非转基因野生型DNA，作为阴性对照，第3泳道为含有ALS突变序列的质 粒DNA为模板，作为阳性对照，第4～5泳道为转化华占抗除草剂水稻突变体-1的ALS 基因的转基因植株DNA，第6～7泳道为转化华占抗除草剂水稻突变体-2的ALS基因的 转基因植株DNA；
图7百垄通除草剂对野生型水稻和含有抗除草剂突变体ALS基因的转基因水稻的ALS酶活性抑制的吸光值测定。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理 解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：华占野生型水稻ALS基因全长的获得
利用常规方法提取籼型常规水稻种子华占的基因组DNA，该籼型常规水稻种子华占 由扬州市农业科学研究院惠赠，该华占相关亲本等信息参见中国水稻研究所 http:// www.ricedata.cn/variety/varis/607962.htm？607962，根据NCBI中日本晴 ALS基因(NCBI：XM_015770973)设计引物进行扩增，采用Takara PrimerSTAR Max DNA Polymerase聚合酶(购自Takara公司)扩增ALS基因，其反应体系如下：
2×PrimerSTAR Max Premix 10.0μl
10μM正向引物1.0μl
10μM反向引物1.0μl
20-30ng/μL华占野生型水稻基因组DNA1.0μl
补加无菌水至总体积20μl
PCR扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68度。
程序如下：预变性：98℃3min；35个循环：变性98℃10sec；延伸68℃1min；保温： 72℃10min。
取2μl PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期大小的片段后(图3)， 剩余的PCR产物经PCR清洁试剂盒(购自Axygen公司)清洁回收后，克隆至pMD19-T 载体(购自Takara公司)，然后转化大肠杆菌。每个转化随机挑取12个大肠杆菌单克 隆进行PCR检测，取PCR结果呈阳性的6个单克隆，送南京一道生物科技有限公司测 序，获得ALS基因序列，该基因片段长度为2091bp，华占野生型ALS序列基因片段的 测序结果如下：
CTGCATCGCGTGTCGCCCTTTCGCCCAAACCCAGAAACCCTCGCCGCCGCCGCCGCCGCCATCACCCACCATGGCTACGACCGCCGCGGCCGCGGCCGCCACCTTGTCCGCCGCCGCGACGGCCAAGACCGGCCGTAAGAACCACCAGCGACACCACGTCCTTCCCGCTCGAGGCCGGGTGGGGGCGGCGGCGGTCAGGTGCTCGGCGGTGTCCCCGGTCACCCCGCCGTCCCCGGCGCCGCCGGCCACGCCGCTCCGGCCGTGGGGGACGGCCGAGCCCCGCAAGGGCGCGGACATCCTCGTGGAGGCGCTGGAGCGGTGCGGCGTCAGCGACGTGTTCGCCTACCCGGGCGGCGCGTCCATGGAGATCCACCAGGCGCTGACGCGCTCCCCGGTCATCACCAACCACCTCTTCCGCCACGAGCAGGGCGAGGCGTTCGCGGCGTCCGGGTACGCGCGCGCGTCCGGCCGCGTCGGGGTCTGCGTCGCCACCTCCGGCCCCGGGGCAACCAACCTCGTGTCCGCGCTCGCCGACGCGCTGCTCGACTCCGTCCCGATGGTCGCCATCACGGGCCAGGTCCCCCGCCGCATGATCGGCACCGACGCCTTCCAGGAGACGCCCATAGTCGAGGTCACCCGCTCCATCACCAAGCACAATTACCTTGTCCTTGATGTGGAGGACATCCCCCGCGTCATACAGGAAGCCTTCTTCCTCGCGTCCTCGGGCCGTCCTGGCCCGGTGCTGGTCGACATCCCCAAGGACATCCAGCAGCAGATGGCTGTGCCAGTCTGGGACACCTCGATGAATCTACCGGGGTACATTGCACGCCTGCCCAAGCCACCCGCGACAGAATTGCTTGAGCAGGTCTTGCGTCTGGTTGGCGAGTCACGGCGCCCGATTCTCTATGTCGGTGGTGGCTGCTCTGCATCTGGTGATGAATTGCGCCGGTTTGTTGAGCTGACCGGCATCCCAGTTACAACCACTCTGATGGGCCTCGGCAATTTCCCCAGTGATGATCCGTTGTCCCTGCGCATGCTTGGGATGCATGGCACGGTGTACGCAAATTATGCGGTGGATAAGGCTGACCTGTTGCTTGCATTTGGCGTGCGGTTTGATGATCGTGTGACAGGGAAAATTGAGGCTTTTGCAAGCAGGGCCAAGATTGTGCACATTGACATTGATCCAGCGGAGATTGGAAAGAACAAGCAACCACATGTGTCAATTTGCGCAGATGTTAAGCTTGCTTTACAGGGCTTGAATGCTCTGCTAGACCAGAGCACAACAAAGACAAGTTCTGATTTTAGTGCATGGCACAATGAGTTGGACCAGCAGAAGAGGGAGTTTCCTCTGGGGTACAAGACTTTTGGTGAAGAGATCCCACCGCAATATGCTATTCAGGTGCTGGATGAGCTGACGAAAGGGGAGGCAATCATCGCTACTGGTGTTGGACAGCACCAGATGTGGGCGGCACAATATTACACCTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGGCTGGTCTGGGCGCAATGGGATTTGGGCTGCCTGCTGCAGCTGGTGCTTCTGTGGCTAACCCAGGTGTCACAGTTGTTGATATTGATGGGGATGGTAGCTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGCATTGAGAACCTCCCGGTGAAGGTGATGGTGTTGAACAACCAACATTTGGGTATGGTTGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCAAATAGGGCGCATACATACTTGGGCAACCCAGAATGTGAGAGCGAGATATATCCAGATTTTGTGACTATTGCTAAAGGGTTCAATATTCCTGCAGTCCGTGTAACAAAGAAGAGTGAAGTCCGTGCCGCCATCAAGAAGATGCTCGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCACACCAGGAGCATGTGCTGCCTATGATCCCAAGTGGGGGCGCATTCAAGGACATGATCCTGGATGGTGATGGCAGGACTATGTATTAATCTATAATCTGTATGTTGGCAAAGCACCAGCCCGGCCTATGTTTGACCTGAATGACCCATAAAGAGAAGGGCGACACG CGATGCAG
实施例2：水稻抗咪唑啉酮类除草剂突变体获取过程(百垄通)
将籼型常规水稻种子华占(扬州市农业科学研究院惠赠)该华占相关亲本等信息参 见中国水稻研究所http://www.ricedata.cn/variety/varis/607962.htm？607962，
(此为M0，用清水浸泡2小时)150kg分6次用0.5-1.0％(w/w)甲磺酸乙酯(EMS) 室温下浸泡6-9小时，期间每1小时摇动一次种子；弃去EMS溶液，自来水翻动浸泡 种子5次，每次5分钟，然后用自来水冲洗种子过夜，次日进行田间播种，并进行常规 肥水管理(此为M1)。植株成熟后，种子混收、晾干，过冬保存。次年播种田间。待 水稻(此为M2)幼苗长至3-4叶期时，喷施为3.3mL百垄通/L水(“百垄通”是德国巴 斯夫公司生产一种水剂型咪唑啉酮类除草剂，推荐最低使用浓度为1mL百垄通/1.5～ 3L水)，30天后还呈正常绿色植株即为抗咪唑啉酮类除草剂的华占抗除草剂水稻突变 体-1(图1)和华占抗除草剂水稻突变体-2(图2)。两种突变体单株可正常结实，种 子成熟后，单株收种、晾干，过冬保存。
实施例3：抗咪唑啉酮类除草剂水稻突变体突变位点分析
分别取上述实施例2获得的华占抗除草剂水稻突变体-1植株和华占抗除草剂水稻突变体-2植株的叶片，提取基因组DNA，送南京一道生物科技有限公司进行基因组测 序。测序结果与华占野生型ALS基因比较，发现两种抗性水稻突变体均在ALS基因上 的627位点发生突变，在华占抗除草剂水稻突变体-1中ALS基因序列的第1879位核苷 酸由A变成核苷酸C、第1880位核苷酸由G变成核苷酸T，导致其相应编码的氨基酸 序列的第627位点由丝氨酸变为亮氨酸，即华占抗除草剂水稻突变体-1的ALS基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所 示；在华占抗除草剂水稻突变体-2中ALS基因序列第1879位核苷酸由A变为T，导致 其相应编码的氨基酸序列的第627位点由丝氨酸变为半胱氨酸。
本发明的华占抗除草剂水稻突变体-1其分类命名为水稻种子Yxl-28(Oryzasativa Indica Group Yxl-28)，该材料已于2017年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：P201802。本发明的华占抗除草剂水稻突 变体-2其分类命名为水稻种子Yxl-34(Oryza sativa Indica GroupYxl-34)，该材料已于 2017年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武 昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：P201725。
实施例4：抗咪唑啉酮类除草剂水稻突变体ALS基因克隆
分别取上述华占抗除草剂水稻突变体-1植株和华占抗除草剂水稻突变体-2植株提 取基因组DNA。根据华占野生型ALS基因序列设计扩增ALS基因全长的特异引物为： 正向引物F5’-TCGCCCAAACCCAGAAACCC-3’、反向引物R 5’-
CTCTTTATGGGTCATTCAGGTC-3’。
采用Takara PrimerSTAR Max DNA Polymerase聚合酶(购自Takara公司)扩增ALS基因，其反应体系如下：
2×PrimerSTAR Max Premix 10.0μl
10μM正向引物1.0μl
10μM反向引物1.0μl
20-30ng/μL水稻基因组DNA1.0μl
补加无菌水至总体积20μl
PCR扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68度。
程序如下：预变性：98℃3min；35个循环：变性98℃10sec；延伸68℃1min；保温： 72℃10min。
取2μl PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期大小的片段后(图3)， 剩余的PCR产物经PCR清洁试剂盒(购自Axygen公司)清洁回收后，克隆至pMD19-T 载体(购自Takara公司)，然后转化大肠杆菌。每个转化随机挑取12个大肠杆菌单克 隆进行PCR检测，取PCR结果呈阳性的6个单克隆，送南京一道生物科技有限公司测 序，获得突变ALS基因序列，该基因片段长度为2091bp，华占抗除草剂水稻突变体-1 的ALS基因片段的测序结果如下：
CTGCATCGCGTGTCGCCCTTTCGCCCAAACCCAGAAACCCTCGCCGCCGCCGCCGCCGCCATCACCCACCATGGCTACGACCGCCGCGGCCGCGGCCGCCACCTTGTCCGCCGCCGCGACGGCCAAGACCGGCCGTAAGAACCACCAGCGACACCACGTCCTTCCCGCTCGAGGCCGGGTGGGGGCGGCGGCGGTCAGGTGCTCGGCGGTGTCCCCGGTCACCCCGCCGTCCCCGGCGCCGCCGGCCACGCCGCTCCGGCCGTGGGGGACGGCCGAGCCCCGCAAGGGCGCGGACATCCTCGTGGAGGCGCTGGAGCGGTGCGGCGTCAGCGACGTGTTCGCCTACCCGGGCGGCGCGTCCATGGAGATCCACCAGGCGCTGACGCGCTCCCCGGTCATCACCAACCACCTCTTCCGCCACGAGCAGGGCGAGGCGTTCGCGGCGTCCGGGTACGCGCGCGCGTCCGGCCGCGTCGGGGTCTGCGTCGCCACCTCCGGCCCCGGGGCAACCAACCTCGTGTCCGCGCTCGCCGACGCGCTGCTCGACTCCGTCCCGATGGTCGCCATCACGGGCCAGGTCCCCCGCCGCATGATCGGCACCGACGCCTTCCAGGAGACGCCCATAGTCGAGGTCACCCGCTCCATCACCAAGCACAATTACCTTGTCCTTGATGTGGAGGACATCCCCCGCGTCATACAGGAAGCCTTCTTCCTCGCGTCCTCGGGCCGTCCTGGCCCGGTGCTGGTCGACATCCCCAAGGACATCCAGCAGCAGATGGCTGTGCCAGTCTGGGACACCTCGATGAATCTACCGGGGTACATTGCACGCCTGCCCAAGCCACCCGCGACAGAATTGCTTGAGCAGGTCTTGCGTCTGGTTGGCGAGTCACGGCGCCCGATTCTCTATGTCGGTGGTGGCTGCTCTGCATCTGGTGATGAATTGCGCCGGTTTGTTGAGCTGACCGGCATCCCAGTTACAACCACTCTGATGGGCCTCGGCAATTTCCCCAGTGATGATCCGTTGTCCCTGCGCATGCTTGGGATGCATGGCACGGTGTACGCAAATTATGCGGTGGATAAGGCTGACCTGTTGCTTGCATTTGGCGTGCGGTTTGATGATCGTGTGACAGGGAAAATTGAGGCTTTTGCAAGCAGGGCCAAGATTGTGCACATTGACATTGATCCAGCGGAGATTGGAAAGAACAAGCAACCACATGTGTCAATTTGCGCAGATGTTAAGCTTGCTTTACAGGGCTTGAATGCTCTGCTAGACCAGAGCACAACAAAGACAAGTTCTGATTTTAGTGCATGGCACAATGAGTTGGACCAGCAGAAGAGGGAGTTTCCTCTGGGGTACAAGACTTTTGGTGAAGAGATCCCACCGCAATATGCTATTCAGGTGCTGGATGAGCTGACGAAAGGGGAGGCAATCATCGCTACTGGTGTTGGACAGCACCAGATGTGGGCGGCACAATATTACACCTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGGCTGGTCTGGGCGCAATGGGATTTGGGCTGCCTGCTGCAGCTGGTGCTTCTGTGGCTAACCCAGGTGTCACAGTTGTTGATATTGATGGGGATGGTAGCTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGCATTGAGAACCTCCCGGTGAAGGTGATGGTGTTGAACAACCAACATTTGGGTATGGTTGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCAAATAGGGCGCATACATACTTGGGCAACCCAGAATGTGAGAGCGAGATATATCCAGATTTTGTGACTATTGCTAAAGGGTTCAATATTCCTGCAGTCCGTGTAACAAAGAAGAGTGAAGTCCGTGCCGCCATCAAGAAGATGCTCGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCACACCAGGAGCATGTGCTGCCTATGATCCCACTTGGGGGCGCATTCAAGGACATGATCCTGGATGGTGATGGCAGGACTATGTATTAATCTATAATCTGTATGTTGGCAAAGCACCAGCCCGGCCTATGTTTGACCTGAATGACCCATAAAGAGAAGGGCGACACGCGATGCAG
华占抗除草剂水稻突变体-2的ALS基因片段的测序结果如下：
CTGCATCGCGTGTCGCCCTTTCGCCCAAACCCAGAAACCCTCGCCGCCGCCGCCGCCGCCATCACCCACCATGGCTACGACCGCCGCGGCCGCGGCCGCCACCTTGTCCGCCGCCGCGACGGCCAAGACCGGCCGTAAGAACCACCAGCGACACCACGTCCTTCCCGCTCGAGGCCGGGTGGGGGCGGCGGCGGTCAGGTGCTCGGCGGTGTCCCCGGTCACCCCGCCGTCCCCGGCGCCGCCGGCCACGCCGCTCCGGCCGTGGGGGACGGCCGAGCCCCGCAAGGGCGCGGACATCCTCGTGGAGGCGCTGGAGCGGTGCGGCGTCAGCGACGTGTTCGCCTACCCGGGCGGCGCGTCCATGGAGATCCACCAGGCGCTGACGCGCTCCCCGGTCATCACCAACCACCTCTTCCGCCACGAGCAGGGCGAGGCGTTCGCGGCGTCCGGGTACGCGCGCGCGTCCGGCCGCGTCGGGGTCTGCGTCGCCACCTCCGGCCCCGGGGCAACCAACCTCGTGTCCGCGCTCGCCGACGCGCTGCTCGACTCCGTCCCGATGGTCGCCATCACGGGCCAGGTCCCCCGCCGCATGATCGGCACCGACGCCTTCCAGGAGACGCCCATAGTCGAGGTCACCCGCTCCATCACCAAGCACAATTACCTTGTCCTTGATGTGGAGGACATCCCCCGCGTCATACAGGAAGCCTTCTTCCTCGCGTCCTCGGGCCGTCCTGGCCCGGTGCTGGTCGACATCCCCAAGGACATCCAGCAGCAGATGGCTGTGCCAGTCTGGGACACCTCGATGAATCTACCGGGGTACATTGCACGCCTGCCCAAGCCACCCGCGACAGAATTGCTTGAGCAGGTCTTGCGTCTGGTTGGCGAGTCACGGCGCCCGATTCTCTATGTCGGTGGTGGCTGCTCTGCATCTGGTGATGAATTGCGCCGGTTTGTTGAGCTGACCGGCATCCCAGTTACAACCACTCTGATGGGCCTCGGCAATTTCCCCAGTGATGATCCGTTGTCCCTGCGCATGCTTGGGATGCATGGCACGGTGTACGCAAATTATGCGGTGGATAAGGCTGACCTGTTGCTTGCATTTGGCGTGCGGTTTGATGATCGTGTGACAGGGAAAATTGAGGCTTTTGCAAGCAGGGCCAAGATTGTGCACATTGACATTGATCCAGCGGAGATTGGAAAGAACAAGCAACCACATGTGTCAATTTGCGCAGATGTTAAGCTTGCTTTACAGGGCTTGAATGCTCTGCTAGACCAGAGCACAACAAAGACAAGTTCTGATTTTAGTGCATGGCACAATGAGTTGGACCAGCAGAAGAGGGAGTTTCCTCTGGGGTACAAGACTTTTGGTGAAGAGATCCCACCGCAATATGCTATTCAGGTGCTGGATGAGCTGACGAAAGGGGAGGCAATCATCGCTACTGGTGTTGGACAGCACCAGATGTGGGCGGCACAATATTACACCTACAAGCGGCCACGGCAGTGGCTGTCTTCGGCTGGTCTGGGCGCAATGGGATTTGGGCTGCCTGCTGCAGCTGGTGCTTCTGTGGCTAACCCAGGTGTCACAGTTGTTGATATTGATGGGGATGGTAGCTTCCTCATGAACATTCAGGAGTTGGCATTGATCCGCATTGAGAACCTCCCGGTGAAGGTGATGGTGTTGAACAACCAACATTTGGGTATGGTTGTGCAATGGGAGGATAGGTTTTACAAGGCAAATAGGGCGCATACATACTTGGGCAACCCAGAATGTGAGAGCGAGATATATCCAGATTTTGTGACTATTGCTAAAGGGTTCAATATTCCTGCAGTCCGTGTAACAAAGAAGAGTGAAGTCCGTGCCGCCATCAAGAAGATGCTCGAGACCCCAGGGCCATACTTGTTGGATATCATCGTCCCACACCAGGAGCATGTGCTGCCTATGATCCCATGTGGGGGCGCATTCAAGGACATGATCCTGGATGGTGATGGCAGGACTATGTATTAATCTATAATCTGTATGTTGGCAAAGCACCAGCCCGGCCTATGTTTGACCTGAATGACCCATAAAGAGAAGGGCGACACGCGATGCAG
实施例5：水稻M3突变体抗咪唑啉酮类除草剂(百垄通)
将华占抗除草剂水稻突变体-1植株和华占抗除草剂水稻突变体-2植株收获的种子 播种出苗(此为M3)，待M3水稻幼苗长至3-4叶期时，喷施3.3mL百垄通/L水(推 荐最低使用浓度为1mL百垄通/3L水，相当于10倍浓度)。喷施除草剂15天后，抗性 苗M3呈正常绿色、能继续长高至20-30cm，而非抗性苗叶片失去绿色甚至部分枯黄， 植株不长高，只有5-9cm。30天后，M3抗性株均呈正常绿色植株，而喷施同样浓度除 草剂的野生型水稻都已全部枯死，表明华占抗除草剂水稻突变体-1和华占抗除草剂水稻 突变体-2至少抗10倍浓度的百垄通除草剂。
实施例6：水稻M3抗除草剂突变体的ALS酶活测定
为了验证水稻突变体的除草剂抗性是否由ALS突变所致，本发明人进行了ALS酶活性测定。测定方法参照Singh等的方法(Singh B.K.,Stidham M.A.,Shaner D.L.Assayof acetohydroxyacid synthase.Analytical Biochemistry,1988,171:173-179.)。具体的，分别 取华占野生型、华占抗除草剂水稻突变体-1、华占抗除草剂水稻突变体-2的M3植株叶 片0.2g，在研钵中用液氮研磨粉碎，加入2mL提取液(100mM K2HPO4，pH 7.5、10mM 丙酮酸钠、5mM EDTA、1mM缬氨酸、1mM亮氨酸、10mM半胱氨酸、0.1mM黄素 腺嘌呤二核苷酸、5mM氯化镁、10％(V/V)甘油、1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮)，待 提取液解冻后继续研磨1min左右。12000rpm、4℃离心30min，吸取上清液，加入硫 酸铵使之达到50％饱和度，于冰上放置半小时，12000rpm、4℃离心30min，弃上清， 将沉淀溶解于0.2mL反应缓冲液(100mM K2HPO4,pH7.0、1mM EDTA、10mM氯化 镁、100mM丙酮酸钠、1mM焦磷酸硫胺素、0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸)，分别得各 植株的ALS蛋白提取液。
在获得ALS蛋白提取液中分别加入10μL除草剂“百垄通”(水剂，有效成分240g/L)，混匀，37℃孵育1h，加0.1ml 3M硫酸终止反应，反应混合物在60℃反应孵育30分钟 便于脱羧。然后加0.4mL显色液(0.09g/L 1-萘酚和0.009g/L肌酸，用2.5M NaOH溶 解)。混合液在37℃孵育30分钟进行显色(ALS催化2个丙酮酸形成乙酰乳酸，乙酰 乳酸脱羧形成3-羟基丁酮，再与肌酸和1-萘酚形成粉红色复合物，该复合物在530nm 处有最大吸收值)，随后测定其530nm的吸光度，ALS活性用A530吸光值表示，A530 吸光值的高低反映ALS活性的高低。实验以水为对照，华占野生型、华占抗除草剂水 稻突变体-1、华占抗除草剂水稻突变体-2各测5个单株(5个平行实验)。
A530吸光值测定结果发现，当华占野生型、华占抗除草剂水稻突变体-1、华占抗除草剂水稻突变体-2的ALS提取液中没有ALS抑制剂百垄通时，它们的A530吸光值 平均值分别是1.23、1.36、1.34，表明野生型和突变体的ALS酶活性无显著性差异(图 4)；而加入ALS抑制剂百垄通后，华占野生型的A530吸光值平均值仅为0.23。而华 占抗除草剂水稻突变体-1的A530吸光值平均值为1.16，华占抗除草剂水稻突变体-2 的A530吸光值平均值为1.19，即华占野生型的ALS酶活性仅为未加入ALS抑制剂百 垄通的14％，而华占抗除草剂突变体的ALS酶活性仍有85％和89％(图4)，表明华 占抗除草剂突变体的ALS对百垄通不敏感，从而赋予了抗性。
实施例7：转基因ALS水稻抗百垄通
设计特异引物5’-CGCGGATCCATCCGAGCCACACATCGCCTC-3’和 5’-TCCCCGCGGCCTACGGAAAACAACACAC-3’，其5’分别加入BamHI和SacI酶切 修饰位点。参考实施例4的方法，通过PCR从上述华占抗除草剂水稻突变体-1和华占 抗除草剂水稻突变体-2的基因组DNA中扩增出突变ALS基因，测序正确后，用BamHI 和SacI分别双酶切突变ALS基因片段和植物表达载体pCAMBIA1301质粒(购自pcambia 公司)，酶切产物用T4-DNA酶(购自TaKaRa公司)连接，连接产物转化大肠杆菌。重 组质粒提取DNA，用BamHI和SacI双酶切验证，可以产生大的质粒片段和小的基因片 段(图5)，证明已将核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的ALS基因克 隆至植物表达载体pCAMBIA1301质粒(购自pcambia公司)中。将构建好的质粒载体转 化农杆菌EHA105，培养菌体。采用常规的农杆菌介导法转化粳型水稻日本晴(购自江 苏省农业种质资源保护与利用平台)，获得转基因植株收种后，后代植株长至3-4叶期 时，PCR检测转基因植株(图6)。PCR检测引物为正向引物35SF
5’-ATGGTTAGAGAGGCTTACGC-3’，反向引物5R
5’-AGCAACAGGTCAGCCTTATCCAC-3’，扩增片段涵括CaMV35S启动子和ALS基因 的5’端序列，大小约2kb。PCR扩增反应体系参考实施例3，PCR扩增反应程序采用两 步法，退火和延伸合为一起，采用68度。扩增程序如下：预变性：98℃3min；30个循 环：变性98℃10sec；延伸68℃2min；保温：72℃10min。经PCR鉴定呈阳性后，喷施 3.3mL百垄通/L水(10倍推荐使用浓度)，7天后，参照实施例6所述方法测定ALS 酶活性，发现转基因水稻的ALS酶活性显著高于非转基因水稻；30天后发现转基因水 稻生长状态良好，而非转基因日本晴水稻则全部枯死。比较转化华占抗除草剂水稻突变 体-1和华占抗除草剂水稻突变体-2的ALS基因的转基因水稻后代植株的ALS酶活性， 发现含有华占抗除草剂水稻突变体-1和华占抗除草剂水稻突变体-2的ALS基因的转基 因植株ALS酶活性比野生型的ALS酶活高4.72和4.52倍(图7)。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解。根据已 经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 水稻除草剂抗性ALS突变型蛋白、核酸及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1935
<212> DNA
<213> 水稻种子华占抗除草剂水稻突变体-1Yxl-28 ALS基因(AcetolactateSynthase)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1935)
<400> 1
atg gct acg acc gcc gcg gcc gcg gcc gcc acc ttg tcc gcc gcc gcg 48
Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Leu Ser Ala Ala Ala
1 5 10 15
acg gcc aag acc ggc cgt aag aac cac cag cga cac cac gtc ctt ccc 96
Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro
20 25 30
gct cga ggc cgg gtg ggg gcg gcg gcg gtc agg tgc tcg gcg gtg tcc 144
Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser
35 40 45
ccg gtc acc ccg ccg tcc ccg gcg ccg ccg gcc acg ccg ctc cgg ccg 192
Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro
50 55 60
tgg ggg acg gcc gag ccc cgc aag ggc gcg gac atc ctc gtg gag gcg 240
Trp Gly Thr Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala
65 70 75 80
ctg gag cgg tgc ggc gtc agc gac gtg ttc gcc tac ccg ggc ggc gcg 288
Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala
85 90 95
tcc atg gag atc cac cag gcg ctg acg cgc tcc ccg gtc atc acc aac 336
Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn
100 105 110
cac ctc ttc cgc cac gag cag ggc gag gcg ttc gcg gcg tcc ggg tac 384
His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr
115 120 125
gcg cgc gcg tcc ggc cgc gtc ggg gtc tgc gtc gcc acc tcc ggc ccc 432
Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro
130 135 140
ggg gca acc aac ctc gtg tcc gcg ctc gcc gac gcg ctg ctc gac tcc 480
Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser
145 150 155 160
gtc ccg atg gtc gcc atc acg ggc cag gtc ccc cgc cgc atg atc ggc 528
Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly
165 170 175
acc gac gcc ttc cag gag acg ccc ata gtc gag gtc acc cgc tcc atc 576
Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile
180 185 190
acc aag cac aat tac ctt gtc ctt gat gtg gag gac atc ccc cgc gtc 624
Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val
195 200 205
ata cag gaa gcc ttc ttc ctc gcg tcc tcg ggc cgt cct ggc ccg gtg 672
Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val
210 215 220
ctg gtc gac atc ccc aag gac atc cag cag cag atg gct gtg cca gtc 720
Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val
225 230 235 240
tgg gac acc tcg atg aat cta ccg ggg tac att gca cgc ctg ccc aag 768
Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys
245 250 255
cca ccc gcg aca gaa ttg ctt gag cag gtc ttg cgt ctg gtt ggc gag 816
Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu
260 265 270
tca cgg cgc ccg att ctc tat gtc ggt ggt ggc tgc tct gca tct ggt 864
Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly
275 280 285
gat gaa ttg cgc cgg ttt gtt gag ctg acc ggc atc cca gtt aca acc 912
Asp Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr
290 295 300
act ctg atg ggc ctc ggc aat ttc ccc agt gat gat ccg ttg tcc ctg 960
Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu
305 310 315 320
cgc atg ctt ggg atg cat ggc acg gtg tac gca aat tat gcg gtg gat 1008
Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp
325 330 335
aag gct gac ctg ttg ctt gca ttt ggc gtg cgg ttt gat gat cgt gtg 1056
Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val
340 345 350
aca ggg aaa att gag gct ttt gca agc agg gcc aag att gtg cac att 1104
Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile
355 360 365
gac att gat cca gcg gag att gga aag aac aag caa cca cat gtg tca 1152
Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser
370 375 380
att tgc gca gat gtt aag ctt gct tta cag ggc ttg aat gct ctg cta 1200
Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu
385 390 395 400
gac cag agc aca aca aag aca agt tct gat ttt agt gca tgg cac aat 1248
Asp Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn
405 410 415
gag ttg gac cag cag aag agg gag ttt cct ctg ggg tac aag act ttt 1296
Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe
420 425 430
ggt gaa gag atc cca ccg caa tat gct att cag gtg ctg gat gag ctg 1344
Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu
435 440 445
acg aaa ggg gag gca atc atc gct act ggt gtt gga cag cac cag atg 1392
Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met
450 455 460
tgg gcg gca caa tat tac acc tac aag cgg cca cgg cag tgg ctg tct 1440
Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser
465 470 475 480
tcg gct ggt ctg ggc gca atg gga ttt ggg ctg cct gct gca gct ggt 1488
Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly
485 490 495
gct tct gtg gct aac cca ggt gtc aca gtt gtt gat att gat ggg gat 1536
Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp
500 505 510
ggt agc ttc ctc atg aac att cag gag ttg gca ttg atc cgc att gag 1584
Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu
515 520 525
aac ctc ccg gtg aag gtg atg gtg ttg aac aac caa cat ttg ggt atg 1632
Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met
530 535 540
gtt gtg caa tgg gag gat agg ttt tac aag gca aat agg gcg cat aca 1680
Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr
545 550 555 560
tac ttg ggc aac cca gaa tgt gag agc gag ata tat cca gat ttt gtg 1728
Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val
565 570 575
act att gct aaa ggg ttc aat att cct gca gtc cgt gta aca aag aag 1776
Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys
580 585 590
agt gaa gtc cgt gcc gcc atc aag aag atg ctc gag acc cca ggg cca 1824
Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro
595 600 605
tac ttg ttg gat atc atc gtc cca cac cag gag cat gtg ctg cct atg 1872
Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met
610 615 620
atc cca ctt ggg ggc gca ttc aag gac atg atc ctg gat ggt gat ggc 1920
Ile Pro Leu Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly
625 630 635 640
agg act atg tat taa 1935
Arg Thr Met Tyr
<210> 2
<211> 644
<212> PRT
<213> 水稻种子华占抗除草剂水稻突变体-1Yxl-28 ALS基因(AcetolactateSynthase)
<400> 2
Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Leu Ser Ala Ala Ala
1 5 10 15
Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro
20 25 30
Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser
35 40 45
Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro
50 55 60
Trp Gly Thr Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala
65 70 75 80
Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala
85 90 95
Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn
100 105 110
His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr
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Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro
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Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser
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Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly
165 170 175
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115 120 125
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<212> DNA
<213> 水稻种子华占野生型ALS基因(Acetolactate Synthase)
<220>
<221> CDS
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Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro
20 25 30
Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser
35 40 45
Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro
50 55 60
Trp Gly Thr Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala
65 70 75 80
Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala
85 90 95
Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn
100 105 110
His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr
115 120 125
Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro
130 135 140
Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser
145 150 155 160
Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly
165 170 175
Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile
180 185 190
Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val
195 200 205
Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val
210 215 220
Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val
225 230 235 240
Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys
245 250 255
Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu
260 265 270
Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly
275 280 285
Asp Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr
290 295 300
Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu
305 310 315 320
Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp
325 330 335
Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val
340 345 350
Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile
355 360 365
Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser
370 375 380
Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu
385 390 395 400
Asp Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn
405 410 415
Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe
420 425 430
Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu
435 440 445
Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met
450 455 460
Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser
465 470 475 480
Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly
485 490 495
Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp
500 505 510
Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu
515 520 525
Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met
530 535 540
Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr
545 550 555 560
Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val
565 570 575
Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys
580 585 590
Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro
595 600 605
Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met
610 615 620
Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly
625 630 635 640
Arg Thr Met Tyr
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgcggatcca tccgagccac acatcgcctc 30
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccccgcggc ctacggaaaa caacacac 28
Claims (13)
1.一种除草剂抗性ALS突变型蛋白，其特征在于，所述ALS突变型蛋白的氨基酸序列存在以下任意一种突变：其对应于水稻ALS第627位氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸，或，其对应于水稻ALS第627位氨基酸由丝氨酸变为半胱氨酸。
2.一种除草剂抗性ALS突变型蛋白，包括：
（a）其氨基酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示；或
（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有乙酰乳酸合成酶活性的由（a）衍生的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白，其中除草剂是咪唑啉酮类除草剂。
4.核酸或基因，其编码权利要求1~3任一项所述的蛋白。
5.根据权利要求4所述的核酸或基因，包括：
（a）其编码权利要求1~3任一项所述的蛋白的核苷酸序列；或
（b）在严格条件下与（a）限定的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或
（c）其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示。
6.表达盒、重组载体或细胞，其含有权利要求4或5所述的核酸或基因。
7.权利要求1~3任一项所述的蛋白，权利要求4或5所述的核酸，权利要求6所述的表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。
8.一种产生除草剂抗性ALS突变型蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）获得包含权利要求4所述的核酸或基因或权利要求6所述的表达盒或重组载体的转基因宿主生物的细胞或权利要求6所述的细胞；
2）在能产生除草剂抗性蛋白的条件下培养权利步骤1）所述的细胞获得除草剂抗性蛋白。
9.获得具有除草剂抗性的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）使植物包含权利要求4或5所述的核酸；或
2）使植物表达权利要求1~3之任一所述的蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，其包括crispr基因编辑、转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。
11.鉴定植物的方法，其中植物是包含权利要求4或5所述的核酸或基因的植物、表达权利要求1~3之任一所述的蛋白的植物或权利要求9~10之任一所述的方法获得的植物，其特征在于，包括以下步骤：
1) 测定所述植物是否包含权利要求4或5所述的核酸或基因；或，
2) 测定所述植物是否表达权利要求1~3之任一所述的蛋白。
12.一种控制杂草的方法，其特征在于，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含权利要求4所述的核酸或基因或权利要求6所述的达盒、重组载体或细胞，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。
13.一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含权利要求4所述的核酸或基因或权利要求6所述的达盒、重组载体导入植物，导入后的植物产生除草剂抗性蛋白，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。
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