CN111154738A - 一种als突变型基因、蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种ALS突变型蛋白，所述ALS突变型蛋白的第622位氨基酸发生突变。本发明还公开了核酸或基因，其编码所述的突变型蛋白。本发明还公开了表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用以及制备及使用它们的方法。田间喷施ALS抑制剂类除草剂“百垄通”的实验结果表明，含有本发明的ALS突变蛋白的玉米2‑3叶幼苗在施用1.5 mL百垄通/L水（4.5倍推荐使用浓度）后，植株仍然正常生长发育，后期能结实，而野生型玉米2‑3叶幼苗在施用0.5 mL百垄通/L水30天后表现为叶片失绿变黄绿色、浅紫红色，整株不能生长长高，后期逐渐死亡。

Description

一种ALS突变型基因、蛋白及其应用

技术领域

本发明属于植物蛋白和植物抗除草剂领域。具体而言，本发明涉及玉米的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体蛋白，该蛋白能赋予植物尤其玉米抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂的特性。本发明公开了该蛋白的序列，以及它们在植物抗除草剂领域中的应用。

背景技术

杂草是制约农业生产稳产高产的不利因素。与传统依靠栽培措施、人工除草和机械除草等方法相比，化学除草剂的使用是一种高效的、简便的和经济的治理杂草方法。

乙酰乳酸合成酶(ALS)(也称乙酰羟酸合成酶，AHAS)抑制剂类除草剂以ALS作为靶标而导致杂草死亡，主要包括磺酰脲类(Sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮类(Imidazolinones,IMI)、三唑嘧啶类(Triazolopyrimidines,TP)、嘧啶氧(硫)苯甲酸类[Pyrimidinylthio(or oxy)–benzoates,PTB；pyrimidinyl-carboxyherbicides；PCs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮类(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones,SCT)等13类化合物。ALS抑制剂类除草剂结合ALS结合后，能够抑制其蛋白活性，从而阻止植物的生长发育。

成熟的ALS蛋白序列在不同物种间相对保守。ALS蛋白某些氨基酸突变后，既能保持其原有的生物学活性，又能让ALS抑制剂类除草剂不再与其结合，从而对ALS抑制剂类除草剂产生抗性。迄今为止，已在多种农作物(包括水稻、小麦、玉米、油菜、向日葵等)、模式植物拟南芥和上百种杂草中报道ALS氨基酸位点发生突变可以产生ALS抑制剂类除草剂抗性。

ALS突变体抗除草剂水平与ALS氨基酸突变的位置有关，还与突变后的氨基酸种类及突变氨基酸的数目有关；并且，不同遗传背景下相同位置的氨基酸变异产生的除草剂抗性效应也会存在显著差异。

目前，ALS抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难预测在某个特定遗传背景下的植物ALS蛋白突变是否会产生ALS抑制剂类除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭借一些运气，才可能发现和鉴定该植物ALS蛋白新的除草剂抗性位点，以及该突变位点的抗性水平是否具有生产应用价值。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种使植物具有除草剂抗性的ALS突变型蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种核酸或基因，其编码所述的突变型蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、载体和细胞等。

本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法和应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了判断植物是否采用本发明方法获得的鉴定方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种控制杂草的方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种ALS突变型蛋白，所述ALS突变型蛋白的第622位氨基酸发生突变。

其中，所述ALS突变型蛋白包括：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；或

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有乙酰乳酸合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

其中，本发明的ALS突变型蛋白发生突变的氨基酸包括但不仅限于以下几种突变，在以下位点突变成其他氨基酸的情况也在本发明的保护范围之内，例如：第622位氨基酸由甘氨酸突变为缬氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺。

在本发明中，具体地，本发明的ALS突变型蛋白的第622位氨基酸由甘氨酸(Gly，G)突变为天冬氨酸(Asp，D)。

本发明内容还包括一种核酸或基因，其编码所述的突变型蛋白。

本发明所述的核酸或基因，包括：

(i)其编码所述的蛋白；或

(ii)在严格条件下与(i)限定的核酸或基因的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或

(iii)其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述严格条件为：在0.1×SSC、0.1％SDS的溶液中，65℃洗膜15分钟的高度严谨的杂交条件。

在本发明中，核酸可以是DNA、RNA，其中优选为DNA。在知晓所编码蛋白序列或核酸序列的前提下，通过常规的密码子对应关系和宿主表达频率，运用PCR方法、DNA重组法或人工合成的方法，本领域技术人员有能力获得并优化编码本发明第一方面的蛋白质的核酸。一旦获得该核酸，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸。

本发明的ALS突变型基因发生突变的核苷酸包括但不仅限于以下几种突变，在以下位点突变成其他核苷酸的情况也在本发明的保护范围之内，例如：A突变为T、C、G；或C突变为T、A、G；或T突变为A、C、G；或G突变为T、C、A等等均在本发明的保护范围之内。

进一步地，本发明的ALS突变型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。具体的，本发明的DNA序列，是野生型玉米先玉335父本PH4CV自交系的ALS1基因序列的第1865位由核苷酸G变成核苷酸A。

本发明内容还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的核酸或基因。

本发明所述的ALS突变型蛋白、所述的核酸或基因，所述的表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。

其中，所述除草剂是咪唑啉酮类除草剂。

本发明内容还包括获得具有除草剂抗性的植物的方法，包括如下步骤：

1)使植物包含所述的核酸或基因；或

2)使植物表达所述的ALS突变型蛋白。

本发明所述的方法，其包括crispr基因编辑、TALEN、ZFN定点突变、转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。

本发明内容还包括鉴定植物的方法，其中所述植物是包含所述的核酸或基因的植物、表达所述的蛋白的植物或由所述的方法获得的植物，包括以下步骤：

1)鉴定所述植物是否包含所述的核酸或基因；或，

2)鉴定所述植物是否表达所述的蛋白。

本发明内容还包括一种控制杂草的方法，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含所述的核酸或基因或所述的表达盒、重组载体或细胞，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。

本发明内容还包括一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含所述的核酸或基因或将所述的表达盒、重组载体导入植物，导入后的植物产生除草剂抗性蛋白，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂

其中，野生型玉米先玉335父本的ALS1基因的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，野生型玉米先玉335父本的ALS2基因的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。

本发明人通过长期、艰苦的研究，利用经过EMS诱变处理的玉米成熟花粉进行授粉创建玉米突变体库植株，然后进行长期、不断地除草剂筛选，发现了一系列玉米突变体具有ALS抑制剂类除草剂抗性，包括某些已知ALS突变蛋白和本发明公开的新ALS突变蛋白，这些突变体的抗除草剂性状可稳定遗传。本发明还提供了所述的突变型核酸或基因及蛋白在植物育种中的应用，用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，本发明的突变体蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因如玉米、拟南芥、水稻等抗除草剂作物中的应用。

有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：

1)田间喷施ALS抑制剂类除草剂“百垄通”的实验结果表明，含有本发明的ALS突变蛋白的玉米2-3叶幼苗在施用1.5mL百垄通/L水(4.5倍推荐使用浓度)后，植株仍然正常生长发育，后期能结实，而野生型玉米2-3叶幼苗在施用0.5mL百垄通/L水30天后表现为叶片失绿变黄绿色、浅紫红色，整株不能生长长高，后期逐渐死亡。

2)通过农杆菌介导方法转化拟南芥，转化的含有本发明的ALS突变型基因的拟南芥成熟收种后，随即播种，对未抽薹的拟南芥幼苗喷施1mL百垄通/L水(3倍推荐使用浓度)，30天后发现非转基因拟南芥生长明显抑制不能长大甚至死亡，而转基因拟南芥生长状态良好，正常抽薹开花结实。

附图说明

图1玉米先玉335父本PH4CV自交系野生型ALS1和ALS2基因扩增电泳图；左起第一条泳道为DL5000Marker，从上往下条带大小依次是5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；左二泳道为扩增的ALS1基因片段，左三泳道为扩增的ALS2基因片段；

图2左图为百垄通除草剂筛选获得的抗性玉米突变体图，右图为抗性玉米突变体田间筛选种植图；

图3A为野生型拟南芥幼苗喷施1mL百垄通/L水30天后植株生长状况图，图3B为转基因拟南芥幼苗喷施1mL百垄通/L水30天后植株生长状况图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：玉米先玉335父本PH4CV自交系野生型ALS基因全长的克隆

NCBI公布的玉米B73基因组中有2个ALS蛋白，分别是NP_001151761.2和NP_001142174.2，它们分别对应于基因ALS1/AHAS108/GRMZM2G143008和ALS2/AHAS109/GRMZM2G143357。利用常规方法提取玉米先玉335父本PH4CV自交系野生型植株的基因组DNA，根据玉米B73基因组公布的ALS基因设计特异引物，采用Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase聚合酶(南京诺唯赞生物科技有限公司)扩增ALS基因，其中用于扩增ALS1基因全长的正向引物序列为TGAGCCACACATCCTCTGAAC，反向引物序列为GCAGCCCTAGCATTATTCCATAC；用于扩增ALS2基因全长的正向引物序列为CTTTCCCACAATCCCACTCCG，反向引物系列为TAGGCAGTGCTTGCTGAACT。反应体系如下：

PCR扩增程序如下：预变性：95度3min；30个循环：变性95度15sec；退火58度15sec，延伸72度2min；彻底延伸：72度5min。

取2μl PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期大小的片段后，剩余的PCR产物经PCR清洁试剂盒(购自Axygen公司)清洁回收后，克隆至pClone007Blunt Vertor Kit载体(购自南京擎科生物科技有限公司)，然后转化大肠杆菌。每个转化随机挑取12个大肠杆菌单克隆进行PCR检测，取PCR结果呈阳性的6个单克隆，送南京一道生物科技有限公司测序，获得玉米先玉335父本PH4CV自交系野生型ALS1和ALS2的基因序列，结果如下：

玉米自交系PH4CV的野生型ALS1/AHAS108/GRMZM2G143008序列(2444bp)：

TGAGCCACACATCCTCTGAACAAAAGCAGGGAGGCCTCCACGCACATCCCCCTTTCTCCCACTCCGTGTCCGTGGCACTCACCCCAAACCCTCGCGCCGCCTCCGAGACAGCCGCCGCAACCATGGCCACCGCCGCCGCCGCGTCTACCGCGCTCACTGGCGCCACTACCGCTGCGCCCAAGGCGAGGCGCCGGGCGCACCTCCTGGCCACCCGCCGCGCCCTCGCCGCGCCCATCAGGTGCTCAGCGGCGTCACCCGCCATGCCGATGGCTCCCCCGGCCACCCCGCTCCGGCCGTGGGGCCCCACCGAGCCCCGCAAGGGCGCCGACATCCTCGTCGAGTCCCTCGAGCGCTGCGGCGTCCGCGACGTCTTCGCCTACCCAGGCGGCGCGTCCATGGAGATCCACCAGGCACTCACCCGCTCCCCCGTCATCGCCAACCACCTCTTCCGCCACGAGCAAGGGGAGGCCTTTGCGGCCTCCGGCTACGCGCGCTCCTCGGGCCGCGTCGGCGTCTGCATCGCCACCTCCGGCCCCGGCGCCACCAACCTAGTCTCCGCGCTCGCCGACGCGCTGCTCGATTCCGTCCCCATGGTCGCCATCACGGGACAGGTGCCGCGACGCATGATTGGCACCGACGCCTTCCAGGAGACGCCCATCGTCGAGGTCACCCGCTCCATCACCAAGCACAACTACCTGGTCCTCGACGTCGACGACATCCCCCGCGTCGTGCAGGAGGCTTTCTTCCTCGCCTCCTCTGGTCGACCGGGGCCGGTGCTTGTCGACATCCCCAAGGACATCCAGCAGCAGATGGCGGTGCCTGTCTGGGACAAGCCCATGAGTCTGCCTGGGTACATTGCGCGCCTTCCCAAGCCCCCTGCGACTGAGTTGCTTGAGCAGGTGCTGCGTCTTGTTGGTGAATCGCGGCGCCCTGTTCTTTATGTTGGCGGTGGCTGCGCAGCATCTGGTGAGGAGTTGCGACGCTTTGTGGAGCTGACTGGAATCCCGGTCACAACTACTCTTATGGGCCTCGGCAACTTCCCCAGCGACGACCCACTGTCTCTGCGCATGCTAGGTATGCATGGGACGGTGTATGCAAATTATGCAGTGGATAAGGCCGATCTGTTGCTTGCATTTGGTGTGCGGTTTGATGATCGCGTGACAGGGAAGATTGAGGCTTTTGCAAGCAGGGCTAAGATTGTGCACGTTGATATTGATCCTGCTGAGATTGGCAAGAACAAGCAGCCACATGTGTCCATCTGTGCAGATGTTAAGCTTGCTTTGCAGGGCATGAATGCTCTTCTTGAAGGAAGCACATCAAAGAAGAGCTTTGACTTTGGCTCATGGAACGATGAGTTGGATCAGCAGAAGAGGGAATTCCCCCTTGGGTATAAAACATCTAATGAGGAGATCCAGCCACAATATGCTATTCAGGTTCTTGATGAGCTGACGAAAGGCGAGGCCATCATCGGCACAGGTGTTGGGCAGCACCAGATGTGGGCGGCACAGTACTACACTTACAAGCGGCCAAGGCAGTGGTTGTCTTCAGCTGGTCTTGGGGCTATGGGATTTGGTTTGCCGGCTGCTGCTGGTGCTTCTGTGGCAAACCCAGGTGTCACTGTTGTTGACATCGATGGAGATGGTAGCTTTCTCATGAACGTTCAGGAGCTAGCTATGATCCGAATTGAGAACCTCCCGGTGAAGGTCTTTGTGCTAAACAACCAGCACCTGGGGATGGTGGTGCAGTGGGAGGACAGGTTCTATAAGGCCAACAGAGCGCACACATACTTGGGAAACCCAGAGAATGAAAGTGAGATATATCCAGATTTCGTGACGATCGCCAAAGGGTTCAACATTCCAGCGGTCCGTGTGACAAAGAAGAACGAAGTCCGCGCAGCGATAAAGAAGATGCTCGAGACTCCAGGGCCGTACCTCTTGGATATAATCGTCCCACACCAGGAGCATGTGTTGCCTATGATCCCTAGTGGTGGGGCTTTCAAGGATATGATCCTGGATGGTGATGGCAGGACTGTGTACTGATCTAAAATCCAGCAAGCAACTGATCTAAAATCCAGCAAGCACCGCCTCCCTGCTAGTACAAGGGTGATATGTTTTATCTGTGTGATGTTCTCCTGTGTTCTATCCTTTTTTGTAGGCCGTCAGCTATCCGTTATGGTAATCCTATGTAGCTTCCGACCTTGTAATTGTGTAGTCTGTTGTTTTCCTTCTGGCATGTGTCATAAGAGATCATTTAAGTGCCTTTTGCTACATATAAATAAGATAATAAGCACTGCTATGCAGTGGTTCTGAATTGGCTTCTGTTGCCAAATTTAAGTGTCCAACTGGTCCTTGCTTTTGTTTTCGCTATTTTTTTCCCTTTTTTAGTTATTATTATATTGGTAATTTCAACTCAACATATGATGTATGGAATAATGCTAGGGCTGC

玉米自交系PH4CV的野生型ALS2/AHAS109/GRMZM2G143357序列(2021bp)：CTTTCCCACAATCCCACTCCGTGCCAGGTGCCACCCTCCCCAAGCCCTCGCGCCGCCTCCGAGACAGCCGCCCGCAACCATGGCCACCGCCGCCACCGCGGCCGCCGCGCTCACCGGCGCCACTACCGCTACGCCCAAGTCGAGGCGCCGAGCCCACCACTTGGCCACCCGGCGCGCCCTCGCCGCGCCCATCAGGTGCTCAGCGTTGTCACGCGCCACGCCGACGGCTCCCCCGGCCACTCCGCTACGTCCGTGGGGCCCCAACGAGCCCCGCAAGGGCTCCGACATCCTCGTCGAGGCTCTCGAGCGCTGTGGCGTCCGTGACGTCTTCGCCTACCCCGGCGGCGCATCCATGGAGATCCACCAGGCACTCACCCGCTCCCCCGTCATCGCCAACCACCTCTTCCGCCACGAACAAGGGGAGGCCTTCGCCGCCTCCGGCTACGCGCGCTCCTCGGGCCGCGTTGGCGTCTGCATCGCCACCTCCGGCCCCGGCGCCACCAACCTAGTCTCTGCGCTCGCAGACGCGTTGCTCGACTCCGTCCCCATTGTCGCCATCACGGGACAGGTGCCGCGACGCATGATTGGCACCGACGCCTTTCAGGAGACGCCCATCGTCGAGGTCACCCGCTCCATCACCAAGCACAACTACCTGGTCCTCGACGTCGACGACATCCCCCGCGTCGTGCAGGAGGCCTTCTTCCTCGCATCCTCTGGTCGCCCGGGGCCGGTGCTTGTTGACATCCCCAAGGACATCCAGCAGCAGATGGCGGTGCCGGCCTGGGACACGCCCATGAGTCTGCCTGGGTACATCGCGCGCCTTCCCAAGCCTCCCGCGACTGAATTTCTTGAGCAGGTGCTGCGTCTTGTTGGTGAATCACGGCGCCCTGTTCTTTATGTTGGCGGTGGCTGTGCAGCATCAGGTGAGGAGTTGTGCCGCTTTGTGGAGTTGACTGGAATCCCAGTCACAACTACTCTTATGGGCCTTGGCAACTTCCCCAGCGACGACCCACTGTCACTGCGCATGCTTGGTATGCATGGCACAGTGTATGCAAATTATGCAGTGGATAAGGCCGATCTGTTGCTTGCATTTGGTGTGCGGTTTGATGATCGTGTGACAGGGAAAATTGAGGCTTTTGCAGGCAGAGCTAAGATTGTGCACATTGATATTGATCCTGCTGAGATTGGCAAGAACAAGCAGCCACATGTGTCCATCTGTGCAGATGTTAAGCTTGCTTTGCAGGGCATGAATACTCTTCTGGAAGGAAGCACATCAAAGAAGAGCTTTGACTTCGGCTCATGGCATGATGAATTGGATCAGCAAAAGAGGGAGTTTCCCCTTGGGTATAAAATCTTCAATGAGGAAATCCAGCCACAATATGCTATTCAGGTTCTTGATGAGTTGACGAAGGGGAAGGCCATCATTGCCACAGGTGTTGGGCAGCACCAGATGTGGGCGGCACAGTATTACACTTACAAGCGGCCAAGGCAGTGGCTGTCTTCAGCTGGTCTTGGGGCTATGGGATTTGGTTTGCCGGCTGCTGCTGGTGCTGCTGTGGCCAACCCAGGTGTCACTGTTGTTGACATCGACGGAGATGGTAGCTTCCTCATGAACATTCAGGAGCTAGCTATGATCCGTATTGAGAACCTCCCAGTCAAGGTCTTTGTGCTAAACAACCAGCACCTCGGGATGGTGGTGCAGTGGGAGGACAGGTTCTATAAGGCCAATAGAGCACACACATTCTTGGGAAACCCAGAGAACGAAAGTGAGATATATCCAGATTTTGTGGCAATTGCCAAAGGGTTCAACATTCCAGCAGTCCGTGTGACAAAGAAGAGCGAAGTCCATGCAGCAATCAAGAAGATGCTTGAGGCTCCAGGGCCGTACCTCTTGGATATAATCGTCCCGCACCAGGAGCATGTGTTGCCTATGATCCCTAGTGGTGGGGCTTTCAAGGATATGATCCTGGATGGTGATGGCAGGACTGTGTATTGATCTAAAGTTCAGCAAGCACTGCCTA

实施例2：玉米抗咪唑啉酮类除草剂突变体获取过程

玉米先玉335父本PH4CV自交系种于田间，在授粉季节，在雌穗吐丝前套袋；待雌穗花丝长至5-8cm左右，用剪刀将花丝从顶部0.5cm左右处剪除，迅速套袋，然后挂牌做标记便于次日进行授粉，同时在当天下午，将雄穗套袋，次日收集套袋雄穗的花粉，加入0.067％(V/V)EMS-石蜡油溶液，不间断摇动40分钟，然后将花粉溶液倒在花丝上，授粉果穗套袋。田间进行常规的水肥管理。共计授粉玉米果穗9200个，收获8986个果穗，脱粒保存，此为M1种子。M1种子播种繁殖获取M2种子。取部分M2种子约1100斤以及300粒野生型种子，均匀地散播在田间，幼苗在2-3叶片时，喷施为1.5mL百垄通/L水(“百垄通”是德国巴斯夫公司生产一种水剂型咪唑啉酮类除草剂，推荐最低使用浓度为1mL百垄通/1.5～3L水)，30天后还呈正常绿色并能长高的植株即为抗咪唑啉酮类除草剂的玉米突变植株(图2)，不抗除草剂的幼苗则生长受到抑制，植株矮小，叶片变淡黄色、浅紫红色。共计获得抗除草剂的单株2株，移栽后给予精细管理获取自交果穗。

实施例3：抗咪唑啉酮类除草剂玉米突变体突变位点分析

分别提取上述实施例2获得的抗除草剂玉米突变植株和野生型植株的基因组DNA，扩增玉米基因组中的两个ALS靶基因，扩增方法、引物序列及扩增体系同实施例1。测序结果发现：该2株抗除草剂突变植株在ALS1基因编码框的第1865bp由G到A的点突变，从而导致该基因编码的蛋白质第622位氨基酸由甘氨酸(Gly，G)变为天冬氨酸(Asp，D)，即突变植株的ALS1基因突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的ALS1蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。而ALS2基因均无突变。本发明的抗除草剂玉米突变植株其分类命名为玉米Zea mays L.PH4CVF18-1，该生物材料已于2018年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：P201823。

实施例4突变体的ALS酶活测定

为了验证玉米突变体的除草剂抗性是否由ALS突变所致，本发明人进行了ALS酶活性测定。测定方法参照Singh等的方法(Singh B.K.,Stidham M.A.,Shaner D.L.Assay ofacetohydroxyacid synthase.Analytical Biochemistry,1988,171:173-179.)。具体的，分别取玉米先玉335父本PH4CV自交系野生型植株和抗除草剂玉米突变体M2植株的叶片0.2g，在研钵中用液氮研磨粉碎，加入2mL提取液(100mM K2HPO4，pH 7.5、10mM丙酮酸钠、5mM EDTA、1mM缬氨酸、1mM亮氨酸、10mM半胱氨酸、0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸、5mM氯化镁、10％(V/V)甘油、1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮)，待提取液解冻后继续研磨1min左右。12000rpm、4℃离心30min，吸取上清液，加入硫酸铵使之达到50％饱和度，于冰上放置半小时，12000rpm、4℃离心30min，弃上清，将沉淀溶解于0.2mL反应缓冲液(100mM K2HPO4,pH7.0、1mM EDTA、10mM氯化镁、100mM丙酮酸钠、1mM焦磷酸硫胺素、0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸)，分别得各植株的ALS提取液。

在0.2mL ALS提取液中分别加入5μL除草剂“百垄通”(水剂，有效成分240g/L)，混匀，37℃孵育1h，加0.1ml 3M硫酸终止反应，反应混合物在60℃反应孵育30分钟便于脱羧。然后加0.4mL显色液(0.09g/L 1-萘酚和0.009g/L肌酸，用2.5M NaOH溶解)。混合液在37℃孵育30分钟进行显色(ALS催化2个丙酮酸形成乙酰乳酸，乙酰乳酸脱羧形成3-羟基丁酮，再与肌酸和1-萘酚形成粉红色复合物，该复合物在530nm处有最大吸收值)，随后测定其530nm的吸光度，ALS活性用A530吸光值表示，A530吸光值的高低反映ALS活性的高低。实验以水为对照。

A530吸光值测定结果发现，当野生型和突变体的ALS提取液中没有ALS抑制剂百垄通时，它们的A530吸光值均在1.16-1.29间，表明野生型和突变体的ALS酶活性无显著性差异；而加入ALS抑制剂百垄通后，野生型的A530吸光值仅为0.45，突变体的A530吸光值为1.08-1.45间，即野生型的ALS酶活性仅为对照的36％左右，而突变体的相对ALS酶活性仍有92-112％左右，表明突变体植株的突变ALS对百垄通不敏感，从而赋予了抗性。

实施例5突变体序列转化拟南芥的功能验证

设计特异引物5’-ATAGGATCCATGGCCACCGCCGCCGCCGCGTCT-3’和5’-ACGGAGCTCTCAGTACACAGTCCTGCCATCACC-3’，其5’分别加入BamHI和SacI酶切修饰位点。按实施例1方法，通过PCR从实施例3的玉米突变体的基因组DNA中扩增出突变ALS基因，测序正确后，用BamHI和SacI分别双酶切突变ALS基因片段和植物表达载体pCAMBIA2301质粒(购自pcambia公司)，酶切产物用T4-DNA酶(购自TaKaRa公司)连接，连接产物转化大肠杆菌。重组质粒提取DNA，用BamHI和SacI双酶切验证连接成功。将构建好的质粒载体转化农杆菌EHA105，培养农杆菌菌体，通过农杆菌介导方法转化拟南芥(Clough S,Bent A.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant Journal,1998,16(6):735-743.)，转化的拟南芥成熟收种后，随即播种，对未抽薹的拟南芥幼苗喷施1mL百垄通/L水(3倍推荐使用浓度)，30天后发现非转基因拟南芥生长明显抑制不能长大甚至死亡(图3A)，而转基因拟南芥生长状态良好，正常抽薹开花结实(图3B)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附专利要求极其任何等同物给出。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种ALS突变型基因、蛋白及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1917

<212> DNA

<213> 抗除草剂玉米突变植株ALS1 cds序列(Zea mays L.PH4CVF18-1)

<400> 1

atggccaccg ccgccgccgc gtctaccgcg ctcactggcg ccactaccgc tgcgcccaag 60

gcgaggcgcc gggcgcacct cctggccacc cgccgcgccc tcgccgcgcc catcaggtgc 120

tcagcggcgt cacccgccat gccgatggct cccccggcca ccccgctccg gccgtggggc 180

cccaccgagc cccgcaaggg cgccgacatc ctcgtcgagt ccctcgagcg ctgcggcgtc 240

cgcgacgtct tcgcctaccc aggcggcgcg tccatggaga tccaccaggc actcacccgc 300

tcccccgtca tcgccaacca cctcttccgc cacgagcaag gggaggcctt tgcggcctcc 360

ggctacgcgc gctcctcggg ccgcgtcggc gtctgcatcg ccacctccgg ccccggcgcc 420

accaacctag tctccgcgct cgccgacgcg ctgctcgatt ccgtccccat ggtcgccatc 480

acgggacagg tgccgcgacg catgattggc accgacgcct tccaggagac gcccatcgtc 540

gaggtcaccc gctccatcac caagcacaac tacctggtcc tcgacgtcga cgacatcccc 600

cgcgtcgtgc aggaggcttt cttcctcgcc tcctctggtc gaccggggcc ggtgcttgtc 660

gacatcccca aggacatcca gcagcagatg gcggtgcctg tctgggacaa gcccatgagt 720

ctgcctgggt acattgcgcg ccttcccaag ccccctgcga ctgagttgct tgagcaggtg 780

ctgcgtcttg ttggtgaatc gcggcgccct gttctttatg ttggcggtgg ctgcgcagca 840

tctggtgagg agttgcgacg ctttgtggag ctgactggaa tcccggtcac aactactctt 900

atgggcctcg gcaacttccc cagcgacgac ccactgtctc tgcgcatgct aggtatgcat 960

gggacggtgt atgcaaatta tgcagtggat aaggccgatc tgttgcttgc atttggtgtg 1020

cggtttgatg atcgcgtgac agggaagatt gaggcttttg caagcagggc taagattgtg 1080

cacgttgata ttgatcctgc tgagattggc aagaacaagc agccacatgt gtccatctgt 1140

gcagatgtta agcttgcttt gcagggcatg aatgctcttc ttgaaggaag cacatcaaag 1200

aagagctttg actttggctc atggaacgat gagttggatc agcagaagag ggaattcccc 1260

cttgggtata aaacatctaa tgaggagatc cagccacaat atgctattca ggttcttgat 1320

gagctgacga aaggcgaggc catcatcggc acaggtgttg ggcagcacca gatgtgggcg 1380

gcacagtact acacttacaa gcggccaagg cagtggttgt cttcagctgg tcttggggct 1440

atgggatttg gtttgccggc tgctgctggt gcttctgtgg caaacccagg tgtcactgtt 1500

gttgacatcg atggagatgg tagctttctc atgaacgttc aggagctagc tatgatccga 1560

attgagaacc tcccggtgaa ggtctttgtg ctaaacaacc agcacctggg gatggtggtg 1620

cagtgggagg acaggttcta taaggccaac agagcgcaca catacttggg aaacccagag 1680

aatgaaagtg agatatatcc agatttcgtg acgatcgcca aagggttcaa cattccagcg 1740

gtccgtgtga caaagaagaa cgaagtccgc gcagcgataa agaagatgct cgagactcca 1800

gggccgtacc tcttggatat aatcgtccca caccaggagc atgtgttgcc tatgatccct 1860

agtgatgggg ctttcaagga tatgatcctg gatggtgatg gcaggactgt gtactga 1917

<210> 2

<211> 638

<212> PRT

<213> 抗除草剂玉米突变植株ALS1 cds序列(Zea mays L.PH4CVF18-1)

<400> 2

Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Thr

1 5 10 15

Ala Ala Pro Lys Ala Arg Arg Arg Ala His Leu Leu Ala Thr Arg Arg

20 25 30

Ala Leu Ala Ala Pro Ile Arg Cys Ser Ala Ala Ser Pro Ala Met Pro

35 40 45

Met Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro Trp Gly Pro Thr Glu Pro

50 55 60

Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ser Leu Glu Arg Cys Gly Val

65 70 75 80

Arg Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln

85 90 95

Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Ala Asn His Leu Phe Arg His Glu

100 105 110

Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Arg

115 120 125

Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val

130 135 140

Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile

145 150 155 160

Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu

165 170 175

Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu

180 185 190

Val Leu Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Val Val Gln Glu Ala Phe Phe

195 200 205

Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys

210 215 220

Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val Trp Asp Lys Pro Met Ser

225 230 235 240

Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys Pro Pro Ala Thr Glu Leu

245 250 255

Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu Ser Arg Arg Pro Val Leu

260 265 270

Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ser Gly Glu Glu Leu Arg Arg Phe

275 280 285

Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr Thr Leu Met Gly Leu Gly

290 295 300

Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu Arg Met Leu Gly Met His

305 310 315 320

Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu

325 330 335

Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Ile Glu Ala

340 345 350

Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Val Asp Ile Asp Pro Ala Glu

355 360 365

Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys

370 375 380

Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Ala Leu Leu Glu Gly Ser Thr Ser Lys

385 390 395 400

Lys Ser Phe Asp Phe Gly Ser Trp Asn Asp Glu Leu Asp Gln Gln Lys

405 410 415

Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Ser Asn Glu Glu Ile Gln Pro

420 425 430

Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Lys Gly Glu Ala Ile

435 440 445

Ile Gly Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr

450 455 460

Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ala Gly Leu Gly Ala

465 470 475 480

Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro

485 490 495

Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Leu Met Asn

500 505 510

Val Gln Glu Leu Ala Met Ile Arg Ile Glu Asn Leu Pro Val Lys Val

515 520 525

Phe Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Val Gln Trp Glu Asp

530 535 540

Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Glu

545 550 555 560

Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val Thr Ile Ala Lys Gly Phe

565 570 575

Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys Asn Glu Val Arg Ala Ala

580 585 590

Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Ile Ile

595 600 605

Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Asp Gly Ala

610 615 620

Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly Arg Thr Val Tyr

625 630 635

<210> 3

<211> 2444

<212> DNA

<213> 玉米自交系PH4CV的野生型ALS1/AHAS108/GRMZM2G143008序列(Zea mays)

<400> 3

tgagccacac atcctctgaa caaaagcagg gaggcctcca cgcacatccc cctttctccc 60

actccgtgtc cgtggcactc accccaaacc ctcgcgccgc ctccgagaca gccgccgcaa 120

ccatggccac cgccgccgcc gcgtctaccg cgctcactgg cgccactacc gctgcgccca 180

aggcgaggcg ccgggcgcac ctcctggcca cccgccgcgc cctcgccgcg cccatcaggt 240

gctcagcggc gtcacccgcc atgccgatgg ctcccccggc caccccgctc cggccgtggg 300

gccccaccga gccccgcaag ggcgccgaca tcctcgtcga gtccctcgag cgctgcggcg 360

tccgcgacgt cttcgcctac ccaggcggcg cgtccatgga gatccaccag gcactcaccc 420

gctcccccgt catcgccaac cacctcttcc gccacgagca aggggaggcc tttgcggcct 480

ccggctacgc gcgctcctcg ggccgcgtcg gcgtctgcat cgccacctcc ggccccggcg 540

ccaccaacct agtctccgcg ctcgccgacg cgctgctcga ttccgtcccc atggtcgcca 600

tcacgggaca ggtgccgcga cgcatgattg gcaccgacgc cttccaggag acgcccatcg 660

tcgaggtcac ccgctccatc accaagcaca actacctggt cctcgacgtc gacgacatcc 720

cccgcgtcgt gcaggaggct ttcttcctcg cctcctctgg tcgaccgggg ccggtgcttg 780

tcgacatccc caaggacatc cagcagcaga tggcggtgcc tgtctgggac aagcccatga 840

gtctgcctgg gtacattgcg cgccttccca agccccctgc gactgagttg cttgagcagg 900

tgctgcgtct tgttggtgaa tcgcggcgcc ctgttcttta tgttggcggt ggctgcgcag 960

catctggtga ggagttgcga cgctttgtgg agctgactgg aatcccggtc acaactactc 1020

ttatgggcct cggcaacttc cccagcgacg acccactgtc tctgcgcatg ctaggtatgc 1080

atgggacggt gtatgcaaat tatgcagtgg ataaggccga tctgttgctt gcatttggtg 1140

tgcggtttga tgatcgcgtg acagggaaga ttgaggcttt tgcaagcagg gctaagattg 1200

tgcacgttga tattgatcct gctgagattg gcaagaacaa gcagccacat gtgtccatct 1260

gtgcagatgt taagcttgct ttgcagggca tgaatgctct tcttgaagga agcacatcaa 1320

agaagagctt tgactttggc tcatggaacg atgagttgga tcagcagaag agggaattcc 1380

cccttgggta taaaacatct aatgaggaga tccagccaca atatgctatt caggttcttg 1440

atgagctgac gaaaggcgag gccatcatcg gcacaggtgt tgggcagcac cagatgtggg 1500

cggcacagta ctacacttac aagcggccaa ggcagtggtt gtcttcagct ggtcttgggg 1560

ctatgggatt tggtttgccg gctgctgctg gtgcttctgt ggcaaaccca ggtgtcactg 1620

ttgttgacat cgatggagat ggtagctttc tcatgaacgt tcaggagcta gctatgatcc 1680

gaattgagaa cctcccggtg aaggtctttg tgctaaacaa ccagcacctg gggatggtgg 1740

tgcagtggga ggacaggttc tataaggcca acagagcgca cacatacttg ggaaacccag 1800

agaatgaaag tgagatatat ccagatttcg tgacgatcgc caaagggttc aacattccag 1860

cggtccgtgt gacaaagaag aacgaagtcc gcgcagcgat aaagaagatg ctcgagactc 1920

cagggccgta cctcttggat ataatcgtcc cacaccagga gcatgtgttg cctatgatcc 1980

ctagtggtgg ggctttcaag gatatgatcc tggatggtga tggcaggact gtgtactgat 2040

ctaaaatcca gcaagcaact gatctaaaat ccagcaagca ccgcctccct gctagtacaa 2100

gggtgatatg ttttatctgt gtgatgttct cctgtgttct atcctttttt gtaggccgtc 2160

agctatccgt tatggtaatc ctatgtagct tccgaccttg taattgtgta gtctgttgtt 2220

ttccttctgg catgtgtcat aagagatcat ttaagtgcct tttgctacat ataaataaga 2280

taataagcac tgctatgcag tggttctgaa ttggcttctg ttgccaaatt taagtgtcca 2340

actggtcctt gcttttgttt tcgctatttt tttccctttt ttagttatta ttatattggt 2400

aatttcaact caacatatga tgtatggaat aatgctaggg ctgc 2444

<210> 4

<211> 2021

<212> DNA

<213> 玉米自交系PH4CV的野生型ALS2/AHAS109/GRMZM2G143357序列(Zea mays)

<400> 4

ctttcccaca atcccactcc gtgccaggtg ccaccctccc caagccctcg cgccgcctcc 60

gagacagccg cccgcaacca tggccaccgc cgccaccgcg gccgccgcgc tcaccggcgc 120

cactaccgct acgcccaagt cgaggcgccg agcccaccac ttggccaccc ggcgcgccct 180

cgccgcgccc atcaggtgct cagcgttgtc acgcgccacg ccgacggctc ccccggccac 240

tccgctacgt ccgtggggcc ccaacgagcc ccgcaagggc tccgacatcc tcgtcgaggc 300

tctcgagcgc tgtggcgtcc gtgacgtctt cgcctacccc ggcggcgcat ccatggagat 360

ccaccaggca ctcacccgct cccccgtcat cgccaaccac ctcttccgcc acgaacaagg 420

ggaggccttc gccgcctccg gctacgcgcg ctcctcgggc cgcgttggcg tctgcatcgc 480

cacctccggc cccggcgcca ccaacctagt ctctgcgctc gcagacgcgt tgctcgactc 540

cgtccccatt gtcgccatca cgggacaggt gccgcgacgc atgattggca ccgacgcctt 600

tcaggagacg cccatcgtcg aggtcacccg ctccatcacc aagcacaact acctggtcct 660

cgacgtcgac gacatccccc gcgtcgtgca ggaggccttc ttcctcgcat cctctggtcg 720

cccggggccg gtgcttgttg acatccccaa ggacatccag cagcagatgg cggtgccggc 780

ctgggacacg cccatgagtc tgcctgggta catcgcgcgc cttcccaagc ctcccgcgac 840

tgaatttctt gagcaggtgc tgcgtcttgt tggtgaatca cggcgccctg ttctttatgt 900

tggcggtggc tgtgcagcat caggtgagga gttgtgccgc tttgtggagt tgactggaat 960

cccagtcaca actactctta tgggccttgg caacttcccc agcgacgacc cactgtcact 1020

gcgcatgctt ggtatgcatg gcacagtgta tgcaaattat gcagtggata aggccgatct 1080

gttgcttgca tttggtgtgc ggtttgatga tcgtgtgaca gggaaaattg aggcttttgc 1140

aggcagagct aagattgtgc acattgatat tgatcctgct gagattggca agaacaagca 1200

gccacatgtg tccatctgtg cagatgttaa gcttgctttg cagggcatga atactcttct 1260

ggaaggaagc acatcaaaga agagctttga cttcggctca tggcatgatg aattggatca 1320

gcaaaagagg gagtttcccc ttgggtataa aatcttcaat gaggaaatcc agccacaata 1380

tgctattcag gttcttgatg agttgacgaa ggggaaggcc atcattgcca caggtgttgg 1440

gcagcaccag atgtgggcgg cacagtatta cacttacaag cggccaaggc agtggctgtc 1500

ttcagctggt cttggggcta tgggatttgg tttgccggct gctgctggtg ctgctgtggc 1560

caacccaggt gtcactgttg ttgacatcga cggagatggt agcttcctca tgaacattca 1620

ggagctagct atgatccgta ttgagaacct cccagtcaag gtctttgtgc taaacaacca 1680

gcacctcggg atggtggtgc agtgggagga caggttctat aaggccaata gagcacacac 1740

attcttggga aacccagaga acgaaagtga gatatatcca gattttgtgg caattgccaa 1800

agggttcaac attccagcag tccgtgtgac aaagaagagc gaagtccatg cagcaatcaa 1860

gaagatgctt gaggctccag ggccgtacct cttggatata atcgtcccgc accaggagca 1920

tgtgttgcct atgatcccta gtggtggggc tttcaaggat atgatcctgg atggtgatgg 1980

caggactgtg tattgatcta aagttcagca agcactgcct a 2021

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> ALS1的上游引物(Artificial Sequence)

<400> 5

tgagccacac atcctctgaa c 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> ALS1的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 6

gcagccctag cattattcca tac 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> ALS2的上游引物(Artificial Sequence)

<400> 7

ctttcccaca atcccactcc g 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> ALS2的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 8

taggcagtgc ttgctgaact 20

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 拟南芥特异性上游引物(Artificial Sequence)

<400> 9

ataggatcca tggccaccgc cgccgccgcg tct 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 拟南芥特异性下游引物(Artificial Sequence)

<400> 10

acggagctct cagtacacag tcctgccatc acc 33

Claims (12)

1.一种ALS突变型蛋白，其特征在于，所述ALS突变型蛋白的第622位氨基酸发生突变。

2.根据权利要求1所述的一种ALS突变型蛋白，其特征在于，所述ALS突变型蛋白包括：

（a）其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；或

（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有乙酰乳酸合成酶活性的由（a）衍生的蛋白质。

3.一种核酸或基因，其编码权利要求1~2任一项所述的突变型蛋白。

4.根据权利要求3所述的核酸或基因，包括：

（i）其编码权利要求1~2任一项所述的蛋白；或

（ii）在严格条件下与（i）限定的核酸或基因的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或

（iii）其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.表达盒、重组载体或细胞，其含有权利要求3或4所述的核酸或基因。

6.权利要求1或2所述的ALS突变型蛋白、权利要求3或4所述的核酸或基因，权利要求5所述的表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述除草剂是咪唑啉酮类除草剂。

8.获得具有除草剂抗性的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）使植物包含权利要求3或4所述的核酸或基因；或

2）使植物表达权利要求1或2所述的ALS突变型蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其包括crispr基因编辑、TALEN、ZFN定点突变、转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。

10.鉴定植物的方法，其中所述植物是包含权利要求3或4所述的核酸或基因的植物、表达权利要求1~2之任一所述的蛋白的植物或由权利要求8~9之任一所述的方法获得的植物，其特征在于，包括以下步骤：

1) 鉴定所述植物是否包含权利要3或4所述的核酸或基因；或，

2) 鉴定所述植物是否表达权利要求1~2之任一所述的蛋白。

11.一种控制杂草的方法，其特征在于，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含权利要求3或4所述的核酸或基因或权利要求5所述的表达盒、重组载体或细胞，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。

12.一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含权利要求3或4所述的核酸或基因或将权利要求5所述的表达盒、重组载体导入植物，导入后的植物产生除草剂抗性蛋白，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。

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